JP2017529065A

JP2017529065A - Ｅｇｆｒ−標的製剤に対する感受性予測用の新規なバイオマーカー及びその用途

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Publication number: JP2017529065A
Application number: JP2017504725A
Authority: JP
Inventors: テウォンキム; ドンフンジン; スンウホン; ジェヒムン; ジェシクシン; イヨンファン; ジョンヒキム; ハルムイ; ウンキョンチェ; スンミキム; スアジュン; スンヒハ; デヒイ; ウンユンイ; スルイ; ジュンシンイ; ジェリュンイ; ヨンサンホン; キュピョキム; ジョンウンキム
Original assignee: ジアサンファウンデーション
Priority date: 2014-07-29
Filing date: 2015-07-29
Publication date: 2017-10-05
Anticipated expiration: 2035-07-29
Also published as: JP2020178706A; ES2750832T3; KR20180034366A; KR20160014563A; US11008622B2; JP7369672B2; EP3176268B1; EP3176268A4; US20210292849A1; CN107517590A; JP6779858B2; KR101942890B1; US20190127802A1; WO2016018087A1; US20210292848A1; CN107517590B; EP3176268A1

Abstract

【課題】本発明は、EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor；上皮成長因子受容体)-標的製剤に対する感受性を予測するための新規なバイオマーカー及びその用途に関する。【解決手段】より詳細には、RON(Recepteur d'Origine Nantais)遺伝子を含む、EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)-標的製剤に対する感受性予測用バイオマーカーと; 前記バイオマーカーの遺伝子の発現水準; 又は、前記遺伝子のタンパク質の発現或いは活性水準を測定する製剤を含む、EGFR-標的製剤に対する感受性予測用組成物と; 前記遺伝子の発現又は前記遺伝子のタンパク質の発現或いは活性抑制剤を有効成分として含む、EGFR-標的製剤に対する感受性増進用組成物と; 前記組成物を含むEGFR-標的製剤に対する感受性予測用キットと; EGFR-標的製剤に対する感受性予測方法と；を提供する。本発明によれば、本発明は、大腸ガンでのEGFR-標的製剤に対する感受性予測効果が優れているので、本発明は大腸ガン治療に有用に利用され得る。【選択図】図１ａ

Description

本発明は、大韓民国保健福祉部の支援下で課題番号1420030により行われたものであって、前記課題の研究管理専門機関はガン征服推進研究開発事業団、研究事業名は“ガン征服推進研究開発事業”、研究課題名は“大腸ガン患者におけるセツキシマブ(cetuximab)抵抗性を克服する新しい治療法の開発及び生物標識者(Biomarker)の発掘”、主管機関はソウル牙山(アサン)病院、研究期間は2014年05月01日〜2017年04月30日である。

本発明は、大韓民国保健福祉部の支援下で課題番号HI06C0868により行われたものであって、前記課題の研究管理専門機関は韓国保健産業振興院、研究事業名は“先導型特性化研究事業”、研究課題名は“受容体チロシンキナーゼ(Receptor Tyrosine Kinase; RTK)を標的にする革新抗ガン剤の開発”、主管機関はソウル牙山病院の先導型ガン研究事業団、研究期間は2011年12月01日〜2016年11月30日である。

本発明は、EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor；上皮成長因子受容体)-標的製剤に対する感受性予測用の新規なバイオマーカー及びその用途に関する。

一般的に、抗ガン療法において、抗ガン剤を投与した時の生体の反応性は、薬剤の標的になるガン細胞の該薬剤に対する感受性に大きく依存する。このようなガン細胞の薬剤に対する感受性は、ガン細胞毎に大きく異なっている。このような感受性の違いは、該薬剤の標的分子又はそれに関連する因子の量的又は質的な差、或いは薬剤耐性の獲得などに起因する。このような背景を根拠にして、標的になるガン細胞が薬剤に対して感受性を呈する場合に、特異的に現われるガン細胞の遺伝的変化を確認し得ると、早期に薬剤の効果判定、治療法の確立、新しい治療法の選択などが可能になって、極めて有益である。また、治療に先立って生体組織片などにより取得されたガン組織から、通常の方法に従ってガン細胞を分離した後、薬剤処理を実施して、該ガン細胞が薬剤感受性を持つか否かを前記変化により測定すれば、該薬剤による治療が有効であるかどうかを予め予測することができるため、臨床的に非常に有用である。

一般的にKRAS、NRAS又はBRAF 遺伝子における変異は、腫瘍細胞から変形されたシグナリング特徴を有するタンパク質を作り出し、このような変異は、上皮成長因子受容体をターゲットにする治療抗体、例えばセツキシマブ(cetuximab)又はパニツムマブ(panitumumab)を用いるガン治療において、成功的でない結果に繋がると知られている(Amado、Wolf et al. 2008; Karapetis、Khambata-Ford et al. 2008; Di Nicolantonio、Martini et al. 2008; Loupakis、Ruzzo et al. 2009; Lievre、 Bachet et al. 2006)。

しかし、このような変異ではないKRAS、NRAS又はBRAF野生型の遺伝子型を持つガン患者の場合にも、セツキシマブ(cetuximab)などのような標的抗ガン製剤の抗ガン効果が大きくないことが多い。

セツキシマブ(Cetuximab)は、再組合せの抗-EGFRヒト/マウスキメリックモノクローナル抗体(MoAb)であって、抗体-依存性細胞毒性及び化学療法並びに放射線療法に対して腫瘍細胞を敏感化させるものと知られている(Graham J、et al.、Nat Rev Drug Discov. Jul2004;3(7):549-50.; Kimura H、et al.、Cancer Sci. Aug 2007;98(8):1275-80.; Kurai J、et al.、Clin Cancer Res. Mar 1 2007;13(5):1552-61.; Dittmann K、et al.、Radiother Oncol. Aug 2005;76(2):157-61.)。このような利点を有しており、単独療法或いは化学療法及び/又は放射線療法との併行療法としてセツキシマブを用いる臨床的利点が、頭部と頚部ガン及び転移性結腸ガンにおいて証明されたことがある(Marshall J. et al.、Cancer. Sep．15 2006;107(6):1207-18)。

一方、RON(Recepteur d’Origine Nantais)は、c-MET系列に属するタンパク質受容体であって、肝から分泌され大食細胞の作用を調節する血清タンパク質MSP(macrophage-stimulating protein；マクロファージ刺激タンパク質)の受容体である(Zhou YQ、He C、Chen YQ、Wang D、Wang MH: Altered expression of the RON receptor tyrosine kinase in primary human colorectal adenocarcinomas: generation of different splicing RON variants and their oncogenic potential。Oncogene 2003、22(2):186-197)。RONの発現は、乳ガン及び大腸・直腸ガンで異常に調節されており、特に、大腸・直腸ガンの転移と密接に関連付けられている。例えば、RONに結合する単一クローン抗体(モノクローナル抗体)IMC-41A10が細胞転移と腫瘍形成を阻害することが報告されるにつれて、RON阻害剤が抗ガン及びガン転移に優れた効能を見せることができるだろう。

即ち、抗ガン剤は、耐性と毒性とについて個人差が大きく、同一の患者であっても約半数以上で耐性を見せる問題があるため、適合する治療反応性標識者(marker)を用いた選別は、抗ガン剤治療の画期的な進歩をもたらすことができる。そのため、特定の遺伝子に応じる個別抗ガン剤の治療反応性に関する研究が、最近になって持続的に活発に展開されている。

しかし、特定の薬剤に対する生体反応関連要素の複合的作用、治療剤及び投与方式の多様性、並びに、膨大な試料確保の困難さから、未だ刮目に値する成果が微弱な現状である。

このような状況下で、本発明者等は、大腸ガンにおいて抗ガン剤であるEGFR-標的製剤に対する感受性を予測することができる方法を開発するために、EGFR-標的製剤のうちの一つであるセツキシマブ(Cetuximab)の大腸ガンにおける感受性を予測するバイオマーカーとして、RON遺伝子及び/又はタンパク質の活性様相を分析したし、その結果、大腸ガン細胞においてRON遺伝子及び/又はタンパク質の活性様相に応じてEGFR-転写活性(transactivation)-関連遺伝子であるAdam11、Adam32、FZD4、GPER及びGPR101遺伝子に影響を及ぼして、EGFR-標的製剤であるセツキシマブの薬物感受性による細胞死滅の程度が異なっていることを確認することで、本発明を完成するに至った。

それで、本発明の目的は、EGFR-標的製剤に対する感受性予測用バイオマーカーを提供することにある。

また、本発明の他の目的は、EGFR-標的製剤に対する感受性予測用組成物を提供することにある。

さらに、本発明のさらに他の目的は、EGFR-標的製剤に対する感受性予測用キットを提供することにある。

さらに、本発明のさらに他の目的は、EGFR-標的製剤に対する感受性増進剤を提供することにある。

なお、本発明のさらに他の目的は、EGFR-標的製剤に対する感受性予測方法を提供することにある。

なお、本発明のさらに他の目的は、EGFR-標的製剤に対する感受性増進剤及びEGFR-標的製剤を有効成分として含む、ガンの予防又は治療用薬学的組成物を提供することにある。

なおさらに、本発明のさらに他の目的は、EGFR-標的製剤に対する感受性増進剤及びEGFR-標的製剤を、対象に共同投与する段階を含む、EGFR-標的製剤に対する感受性の増進方法を提供することにある。

本発明のEGFR-標的製剤に対する感受性予測用バイオマーカーを用いると、個々の患者の前記感受性を治療の開始前に確実に判定することができるため、治療効果の高い抗ガン剤の選択が可能になる。また、効果が得られない抗ガン剤の使用を回避することができるため、不要な副作用を回避することができる。

ヒト大腸ガン細胞株でのRONタンパク質活性化の有無を示す。 RON遺伝子のみによって変化する遺伝子の分析結果を示す。 RON活性化に応じるEGFR転写活性(transactivation)-関連遺伝子のリアルタイム(real-time)PCR分析の結果を示す。 RON活性化によりEGFR転写活性-関連遺伝子のRT-PCR発現分析の結果を示す。 RON抑制によるEGFR転写活性-関連遺伝子のリアルタイムPCR 分析の結果を示す。 RON活性化に応じるEGFRタンパク質活性の分析結果を示す。 RON活性化に応じるEGFRのリン酸化誘導の結果を示す。 RON抑制によるEGFRタンパク質活性変化の分析結果を示す。 RON抑制によるEGFRリガンド(ligand)依存的EGFR活性変化の分析結果を示す。 RONタンパク質とEGFRタンパク質間の内因性(endogenous)細胞内結合の分析結果を示す。 RONタンパク質とEGFRタンパク質間の外因性(exogenous)細胞内結合の分析結果を示す。インビボ・プルダウンアッセイ(in vivo pull-down assay)によるRONタンパク質と結合するEGFRタンパク質ドメインの分析結果を示す。インビトロ・プルダウンアッセイ(in vitro pull-down assay)によるRONタンパク質と結合するEGFRタンパク質ドメインの分析結果を示す。コンピューターモデリング(computer modeling)を用いたEGFRタンパク質と結合するRONタンパク質結合部位の予測分析の結果を示す。 EGFRタンパク質と結合するRONタンパク質結合部位の分析結果を示す。 EGFRタンパク質と結合するRONタンパク質結合部位に応じるEGFR活性の分析結果を示す。 RON活性型タンパク質の有無に応じるリガンド依存的EGFR活性有無の分析結果を示す。 RONのリガンド依存的活性の有無に応じるリガンド依存的EGFR活性有無の分析結果を示す。 RON活性抑制によるEGFRの活性抑制とセツキシマブに対するEGFR活性抑制の分析結果を示す。 RON活性の有無に応じるセツキシマブ細胞死滅の分析結果を示す。 RON発現の抑制後、セツキシマブによる細胞死滅の分析結果を示す。 RON発現の抑制後、セツキシマブによる下位シグナル機序の分析結果を示す。 RON活性の抑制後、セツキシマブによる細胞死滅の分析結果を示す。 RON活性の有無に応じるセツキシマブによる細胞死滅の分析結果を示す。 RON活性の有無に応じるセツキシマブによる細胞成長抑制の分析結果を示す。 RONノックアウト同種遺伝子(knockout isogenic)細胞株でのセツキシマブによる細胞死滅の分析結果を示す。 RONノックアウト同種遺伝子細胞株でのセツキシマブによる細胞成長抑制の分析結果を示す。 RONノックアウト同種遺伝子細胞株を用いたインビボ異種移植(in vivo xenograft)モデルでの、RONの存在有無に応じるセツキシマブの腫瘍抑制効能の分析結果を示す。 RON活性のある細胞株において、RON抗体抗ガン剤とセツキシマブとを併用処理した結果を示す。大腸ガン患者組織(セツキシマブの処方を受けた患者)において、RON活性を分析した結果を示す。

以下、本発明について、より詳細に説明する。

本発明の一態様によれば、本発明は、RON(Recepteur d’Origine Nantais、NM_002447.1)遺伝子を含む、EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)-標的製剤に対する感受性予測用バイオマーカー又はバイオマーカー組成物を提供する。

本発明の最も大きな特徴は、RON遺伝子の活性及びその産物である活性型タンパク質をバイオマーカーとして用いて、EGFR-標的製剤に対する感受性を予測することにある。

本発明のバイオマーカーは、EGFR-標的製剤である抗ガン剤に対する感受性の指標になり得、抗ガン剤に対する感受性マーカーとしての正確性及び信頼度も卓越しているので、ガンの発生、発展及び/又は転移の治療に利用され得る。

本明細書中で使用されている用語“感受性”は、個々の患者のガンに対して特定の薬物が効果を現わすか否かを意味している。

本明細書中において感受性を言及中に使用されている用語“敏感性”は、当該薬物に対して敏感に反応して薬物の効能が作用することを意味しており、本明細書中においては感受性と混用される。

本明細書中において感受性を言及中に使用されている用語“抵抗性”は、当該薬物に対して敏感に反応せずに薬物の効能が作用しないことを意味している。

例えば、前記特定の薬物は主として抗ガン剤であり、これらの抗ガン剤には、ガンの種類に応じて効果を現わす場合と、効果を現わさない場合とがある。また、有効なものと認められている種類のガンであっても、個々の患者に応じて効果を現わす場合と、効果を現わさない場合とがあることが知られている。このような個々の患者のガンに対して抗ガン剤が効果を現わすか否かを、抗ガン剤感受性であると言う。よって、本発明に従って、治療の開始前に効果を期待し得る患者(反応者)と、効果を期待し得ない患者(無反応者)とを予測し得ると、有効性及び安全性の高い化学療法を実現することができる。

本明細書中で使用されている用語“予測”は、本願において対象患者が薬物又は薬物セットに対して有利に又は不利に反応する可能性を称するのに使用される。一実施の態様において、予測はこのような反応の程度に関するものである。例えば、予測は、患者が処置後、例えば特定の治療剤の処置及び/又は原発性腫瘍の手術的除去及び/又は特定期間の間の化学療法後に、ガンが再発することなく生存するか否か、及び/又は生存確率に関するものである。本発明の予測は、大腸ガン患者に対する一番適切な治療方式を選択することで、治療を決める上で臨床的に使用され得る。本発明の予測は、患者が治療処置、例えば与えられた治療的な処置、例えば与えられた治療剤又は組合物の投与、手術的介入、化学療法などに有利に反応するか否か、又は、治療的処置後に患者の長期生存が可能であるかどうかを予測する上で有用な道具である。

本発明の望ましい具現例によれば、本発明のバイオマーカーは、KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog、遺伝子銀行(Gene Bank)登載番号NM_033360.2)、NRAS(neuroblastoma RAS viral(v-ras) oncogene homolog、遺伝子銀行登載番号NP_002515.1)、BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B、遺伝子銀行登載番号NP_004324.2)、EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor、遺伝子銀行登載番号U48722.1)、Adam11(ADAM metallopeptidase domain 11、遺伝子銀行登載番号NM_002390.4)、Adam32(ADAM metallopeptidase domain 32、遺伝子銀行登載番号NM_145004.5)、FZD4(Frizzled family receptor 4、遺伝子銀行登載番号NM_012193.2)、GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1、NM_001505.2)、及び、GPR101(G protein-coupled receptor 101、遺伝子銀行登載番号NM_054021.1)遺伝子からなる群より選択された1種以上の遺伝子をさらに含む。

また、本発明の望ましい具現例によれば、本発明のバイオマーカーは、KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog、NM_033360.2)、NRAS
(neuroblastoma RAS viral (v-ras)oncogene homolog、NP_002515.1)、又は、BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B、NP_004324.2)遺伝子が野生型の場合、EGFR-標的製剤に対する感受性を予測することで、KRAS、NRAS又はBRAF変異を有するガン細胞には所望の効果が得られない場合に適用することができる。

即ち、本発明においては、本バイオマーカーであるRON、KRAS、NRAS又はBRAF 遺伝子を用いて、KRAS、NRAS又はBRAF 野生型遺伝子を有するガン細胞又はガンを有する客体を対象にして、細胞内の前記遺伝子が野生型に存在するかどうかを確認し、前記RON遺伝子の発現水準、又は、そのタンパク質の発現或いは活性水準が、正常(もしくは、野生型遺伝子及び/又はタンパク質の発現水準)に比べて低発現又は低活性化された場合、EGFR-標的製剤に対する感受性があると判定し; 前記RON遺伝子の発現水準、又は、そのタンパク質の発現或いは活性水準が、正常に比べて高発現又は高活性化された場合、EGFR-標的製剤に対する抵抗性があると判定することができる。

また、前記Adam11(ADAM metallopeptidase domain 11、NM_002390.4)、
Adam32(ADAM metallopeptidase domain 32、NM_145004.5)、FZD4(Frizzled family receptor 4、NM_012193.2)、GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1、 NM_001505.2)、GPR101(G protein-coupled receptor 101、 NM_054021.1)遺伝子は、EGFR転写活性-関連遺伝子であって、本発明のバイオマーカーであるRON遺伝子の活性及びその産物である活性型タンパク質に応じて発現が誘導されるので、前記RON遺伝子によるEGFR-標的製剤に対する感受性を予測するバイオマーカーとして含まれ得る。

また、前記EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor、遺伝子銀行登載番号U48722.1)遺伝子は、本発明のバイオマーカーであるRON遺伝子の活性及びその産物である活性型タンパク質に応じて活性化が誘導又は増加されるので、前記RON遺伝子によるEGFR-標的製剤に対する感受性を予測するバイオマーカーとして含まれ得る。

本発明の他の態様によれば、本発明は、RON(Recepteur d’Origine Nantais、遺伝子銀行登載番号NM_002447.1)遺伝子の発現水準; 又は、そのタンパク質の発現或いは活性水準を測定する製剤を含む、EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor
)-標的製剤に対する感受性予測用組成物を提供する。

本発明の望ましい具現例によれば、本発明の組成物は、KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog、遺伝子銀行登載番号 NM_033360.2)、NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras)oncogene homolog、遺伝子銀行登載番号NP_002515.1)、BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B、遺伝子銀行登載番号NP_004324.2)、EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor、遺伝子銀行登載番号U48722.1)、Adam11(ADAM metallopeptidase domain 11、遺伝子銀行登載番号NM_002390.4)、Adam32(ADAM metallopeptidase domain 32、遺伝子銀行登載番号NM_145004.5)、FZD4(Frizzled family receptor 4、遺伝子銀行登載番号NM_012193.2)、GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1、 NM_001505.2)、及び、GPR101(G protein-coupled receptor 101、遺伝子銀行登載番号NM_054021.1)遺伝子からなる群より選択された1種以上の遺伝子の発現水準; 又は、前記遺伝子のタンパク質の発現或いは活性水準を測定する製剤をさらに含む。

また、本発明の望ましい具現例によれば、本発明の組成物は、KRAS(V-Ki-ras2
Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog、NM_033360.2)、NRAS(neuroblastoma RAS viral(v-ras) oncogene homolog、NP_002515.1)、又は、BRAF(v-raf murine sarcom a viral oncogene homolog B、 NP_004324.2)遺伝子が野生型の場合、EGFR-標的製剤に対する感受性を予測するものであって、KRAS、NRAS又はBRAF変異を有するガン細胞には所望の効果が得られない場合に適用することができる。

また、本発明の望ましい具現例によれば、前記EGFR-標的製剤は、ACTH(adrenocorticotropic hormone)生成腫瘍、急性リンパ球性又はリンパ芽球性白血病、急性又は慢性のリンパ球性白血病、急性非リンパ球性白血病、膀胱ガン、脳腫瘍、乳ガン、子宮頸ガン、慢性骨髓性白血病、リンパ腫、子宮内膜症、食道ガン、膀胱ガン、ユーイング肉腫(Ewing's sarcoma)、舌ガン、ホプキンスリンパ腫、カポジ肉腫、腎ガン、肝(肝臓)ガン、肺ガン、中皮腫、多発性骨髓腫、神経芽細胞腫、非ホプキンスリンパ腫、骨肉腫、卵巣ガン、乳腺ガン、前立腺ガン、膵腸ガン、大腸ガン、ペニスガン、網膜芽細胞腫(retinoblastoma)、皮膚ガン、胃ガン、甲状腺ガン、子宮ガン、精巣ガン、ウィルムス腫瘍及び栄養膜腫瘍(Trophoblastoma)からなる群より選択された1種以上のガンに対する治療剤である。より望ましくは、ACTH生成腫瘍、急性リンパ球性又はリンパ芽球性白血病、急性又は慢性のリンパ球性白血病、急性非リンパ球性白血病、膀胱ガン、脳腫瘍、乳ガン、子宮頸ガン、慢性骨髓性白血病、腸ガン、Tゾーンリンパ腫、子宮内膜症、食道ガン、胆汁膀胱ガン、ユーイング肉腫(Ewing's sarcoma)、頭部及び頚部ガン、舌ガン、ホプキンスリンパ腫、カポジ肉腫、腎ガン、肝(肝臓)ガン、肺ガン、中皮腫、多発性骨髓腫、神経芽細胞腫、非ホプキンスリンパ腫、骨肉腫、卵巣ガン、神経芽細胞腫、乳腺ガン、子宮頸ガン、前立腺ガン、膵腸ガン、大腸ガン、ペニスガン、網膜芽細胞腫、皮膚ガン、胃ガン、甲状腺ガン、子宮ガン、精巣ガン、ウィルムス腫瘍、又は栄養膜腫瘍(Trophoblastoma)であり、最も望ましくは大腸ガンである。

本明細書中で使用されている用語“大腸ガン(colon cancer)”は、直腸ガン、結腸ガン及び肛門ガンを通称することを意味している。

また、本発明のEGFR-標的製剤は、抗ガン剤を意味しており、抗ガン効果を現わす限り、如何なるEGFR-標的製剤も適用することができ、望ましくは、セツキシマブ(cetuximab)、ゲフィチニブ(gefitinib)、エルロチニブ(erlotinib)、パニツムマブ(panitumumab)、PKI-166、EKB-569、HKI-272(WAY-177820)、イコチニブ(icotinib)、ブリガチニブ(brigatinib)、アファチニブ(afatinib)、ラパチニブ(lapatinib)、カネルチニブ(canertinib)、AEE788、XL647、及び、ザクティマ(Zactima)からなる群より選択された1種以上である。より望ましくは、セツキシマブ(cetuximab)、ゲフィチニブ(gefitinib)、エルロチニブ(erlotinib)又はパニツムマブ(panitumumab)であり、最も望ましくはセツキシマブ(cetuximab)である。

本明細書中において特別な断りがない限り、本明細書中で使用される表現“遺伝子の発現水準; 又は、前記遺伝子のタンパク質の発現或いは活性水準の測定”は、当該試料内で検出しようとする対象を検出することを意味している。

本発明において、検出しようとする対象は、試料内の当該遺伝子のmRNA及び/又はタンパク質である。つまり、遺伝子の転写産物であるRNA又は遺伝子産物であるタンパク質(望ましくは、活性型)を検出することで、前記遺伝子の発現有無を確認することができる。

RNA又はタンパク質の検出は、通常的には、試料からRNA又はタンパク質を抽出し、その抽出物中のRNA又はタンパク質を検出することで実施することができる。このようなRNA又はタンパク質の検出は、免疫分析学的方法、ハイブリッド化反応及び増幅反応により測定され得るが、それに限定されることなく、当業界において公知になった多様な技術を用いて容易に実施することができる。

また、本発明の望ましい具現例によれば、前記遺伝子の発現水準を測定する製剤は、前記遺伝子のmRNAに特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、プライマー対又はプロブを含む。

前記mRNAの発現有無を測定する製剤は、前記遺伝子に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、プライマー対、プロブ及びそれらの組合せからなる群より選択される。つまり、核酸の検出は、遺伝子を暗号化する核酸分子、又は前記核酸分子の相補物にハイブリッド化される一つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する増幅反応によリ行われ得る。

例えば、プライマーを用いたmRNAの検出は、PCRのような増幅方法を使用して、遺伝子配列を増幅した後、当該分野にて公知の方法で遺伝子増幅の有無を確認することで行われ得る。

また、本発明の望ましい具現例によれば、前記タンパク質の発現或いは活性水準を測定する製剤は、前記タンパク質に特異的に結合する抗体、ペプチド又はヌクレオチドを含む。

前記タンパク質の発現或いは活性水準を測定する製剤は、前記タンパク質に対して特異的に結合する抗体を意味しており、多クロン抗体、単クロン抗体、再組合せ抗体及びそれらの組合せを全て含む。

前記抗体は、多クロン抗体、単クロン抗体、再組合せ抗体、並びに、2個の全長軽鎖及び2個の全長重鎖を有する完全な形態だけではなく、さらに、抗体分子の機能的な断片、例えば、Fab、F(ab')、F(ab')2及びFvを全て含む。抗体生産は、本発明の属する分野にて広く公知になった技術を用いて容易に製造することができ、製造されて商業的に販売される抗体を用いることができる。

本発明の組成物は、上述した遺伝子の発現有無を測定する製剤のみならず、抗原-抗体複合体の形成を定量的に又は定性的に測定可能にするラベル、免疫学的分析に使用される通常的な道具、試薬などをさらに含むことができる。

抗原-抗体複合体の形成を定性的に又は定量的に測定可能にするラベルとしては、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子(microparticle)、酸化還元分子及び放射性同位元素などがあり、必ずそれに限定されるものではない。検出ラベルとして利用可能な酵素としては、β-グルクロニダーゼ、β-D-グルコシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼとGDPase、RNase、グルコースオキシダーゼとルシフェラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ホスホエノールピルビン酸デカルボキシラーゼ、β-ラクタマーゼなどがあり、それに限定されない。蛍光物としては、フルオレシン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルデヒド、フルオレスカミンなどがあり、それに限定されない。リガンドとしては、ビオチン誘導体などがあり、それに限定されない。発光物としては、アクリジニウムエステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼなどがあり、それに限定されない。微小粒子としては、コロイド金、着色されたラテックスなどがあり、それに限定されない。酸化還元分子としては、フェロセン、ルテニウム錯化合物、ビオロゲン、キノン、Tiイオン、Csイオン、ジイミド、1,4-ベンゾキノン、ハイドロキノン、K₄W(CN)⁸、[Os(bpy)₃]²⁺、[RU(bpy)₃]²⁺、 [MO(CN)₈]^4-などがあり、それに限定されない。放射性同位元素としては、³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、³⁶Cl、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁸⁶Reなどがあり、それに限定されない。

前記道具又は試薬の一例として、適合する担体、溶解剤、洗浄剤、緩衝剤、安定化剤などが含まれるが、それに限定されない。標識物質が酵素の場合には、酵素活性を測定し得る基質及び反応停止剤を含むことができる。担体は、可溶性担体、不溶性担体があり、可溶性担体の一例として、当該分野にて公知の生理学的に許容される緩衝液、例えばPBSがあり、不溶性担体の一例として、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサカライド、その他紙、硝子、金属、アガロース及びそれらの組合せであり得る。

本発明の組成物は、上述したバイオマーカーを用いるので、重複する内容は、本明細書があまり複雑になることを避けるために、その記載を省略する。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記組成物を含む、EGFR-標的製剤に対する感受性予測用キットを提供する。

前記キットには、前記遺伝子の発現; 又は、前記遺伝子のタンパク質の発現或いは活性水準を測定する製剤のみならず、免疫学的分析に使用される当該分野にて一般的に使用される道具、試薬などが含まれ得る。

前記道具又は試薬の一例として、適合する担体、検出可能なシグナルを生成し得る標識物質、発色団(chromophores)、溶解剤、洗浄剤、緩衝剤、安定化剤などが含まれるが、それに限定されない。標識物質が酵素の場合には、酵素活性を測定し得る基質及び反応停止剤を含むことができる。担体は、可溶性担体、不溶性担体があり、可溶性担体の一例として、当該分野にて公知の生理学的に許容される緩衝液、例えばPBSがあり、不溶性担体の一例として、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサカライド、ラテックスに金属をメッキした磁性微粒子のような高分子、その他紙、硝子、金属、アガロース及びそれらの組合せであり得る。

本発明のキットは、上述したバイオマーカー及び組成物を構成として含むので、重複する内容は、本明細書があまり複雑になることを避けるために、その記載を省略する。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、RON(Recepteur d’Origine Nantais、NM_002447.1)遺伝子の発現; 又は、前記遺伝子のタンパク質の発現或いは活性抑制剤を有効成分として含む、対象のEGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)-標的製剤に対する感受性増進剤又は感受性増進用組成物を提供する。

本発明の望ましい具現例によれば、前記対象は、KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog、 NM_033360.2)、NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras)oncogene homolog、 NP_002515.1)、又は、BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B、 NP_004324.2)遺伝子が野生型の場合、EGFR-標的製剤に対する感受性を予測するものであって、KRAS、NRAS又はBRAF変異を有するガン細胞には所望の効果が得られない場合に適用することができる。

本発明によれば、KRAS、NRAS又はBRAF 野生型遺伝子を有し、RON遺伝子の活性及びその産物である活性型タンパク質が発現されるガン細胞は、そのようでないガン細胞に比べて、セツキシマブによるガン細胞の死滅率が顕著に劣れる結果を示す。

また、本発明において、KRAS、NRAS又はBRAF 野生型遺伝子を有し、RON遺伝子の活性及びその産物である活性型タンパク質が発現されるガン細胞に、RON遺伝子の発現; 又は、タンパク質の発現或いは活性を抑制させた場合、セツキシマブによるガン細胞の死滅率が顕著に増加する結果を示す。

したがって、これはKRAS、NRAS又はBRAF 野生型(正常)遺伝子の存在(正常遺伝子の正常な発現及び機能);及びRON遺伝子の発現抑制がセツキシマブに対するガン細胞の感受性を増進させるということを提示し、それに基づいて、本発明は、対象のEGFR-標的製剤に対する卓越した感受性増進の効果を提供する。

本発明の感受性増進剤又は増進用組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。本発明にて使用され得る薬学的に許容可能な担体は、通常的な賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、その他添加剤、例えば、安定剤、緩和剤、乳化剤などを選択して使用することができる。例えば、賦形剤として、微結晶セルロース、乳糖(ラクトース)、低置換度ヒドロキシセルロースなどが使用され得、崩壊剤として、デンプングリコール酸ナトリウム、無水リン酸一水素カルシウムなどが使用され得る。結合剤としては、ポリビニルピロリドン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースなどが使用され得、滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、二酸化ケイ素、タルクなどより選択して使用することができる。

本発明において、KRAS、NRAS又はBRAF 野生型遺伝子の存在及びRON遺伝子の発現抑制は、EGFR-標的製剤の処理時、ガン細胞の成長を減少させる。

前記RON遺伝子の発現は、RON遺伝子のmRNAに特異的に結合する siRNA(small interference RNA)、shRNA(short hairpin RNA)、miRNA(microRNA)、リボザイム(ribozyme)、DNAzyme、PNA(peptide nucleic acids)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、アブタマー、天然抽出物及び化学物質からなる群より選択された1種以上により抑制される。

より望ましくは、前記遺伝子のmRNAに特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、アブタマー、siRNA(small interference RNA)、shRNA(short hairpin RNA)又はmiRNA(microRNA)であり、最も望ましくは、siRNA又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

本明細書中で使用されている用語“siRNA”は、二本鎖のRNAがダイサー(Dicer)により切断されて生成される21~25ヌクレオチドサイズのRNA小片であって、相補的な配列を有するmRNAに特異的に結合して発現を抑制するものを言う。本発明の目的上、RONmRNAに特異的に結合して前記遺伝子の発現を抑制することを意味している。siRNAは、化学的に又は酵素学的に合成され得る。siRNAの製造方法としては特に限定されることなく、当業界にて公知の方法を使用することができる。

本発明の望ましい具現例によれば、前記siRNAは、配列番号13の塩基配列を含む。

本明細書中で使用されている用語“アンチセンスオリゴヌクレオチド”は、前記miRNAに相補的に結合して発現を抑制する塩基配列であって、それに限定されることはないが、アンチセンス RNA、アンチセンスDNA及びアンタゴニスト(antagonist)mRNAを含む。

本発明の方法は、上述したバイオマーカーの発現水準を用いて、EGFR-標的製剤に対する感受性を増進させるので、重複する内容は、本明細書があまり複雑になることを避けるために、その記載を省略する。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、上述したEGFR-標的製剤に対する感受性増進剤及びEGFR-標的製剤を有効成分として含む、EGFR シグナル伝達経路の調節異常に関連した疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。

本発明において、前記EGFR シグナル伝達経路の調節異常に関連した疾患は、ガン、アテローム性動脈硬化症、肺纎維症、腎纎維症及び再生、肝疾患、アレルギー疾患、炎症疾患、自己免疫疾患、脳血管疾患、心血管疾患、又は気管移植に関連した症状であり、望ましくはガンである。

即ち、本発明のEGFR-標的製剤に対する感受性増進剤であるRON(Recepteur d’Origine Nantais、NM_002447.1)遺伝子の発現; 又は、前記遺伝子のタンパク質の発現或いは活性抑制剤は、抗ガン剤に対する感受性を増加させ、これらの抗ガン剤とともに投与される場合、抗ガン剤の抗ガン作用を増加させることで、ガンの治療をさらに容易にすることができる。

本発明の組成物による改善、予防又は治療対象疾病である“ガン(cancer)”は、細胞が正常な成長限界を無視して分裂及び成長する攻撃的(aggressive)特性、周辺組織に侵透する浸透的(invasive)特性、及び体内の他の部位へ広がる転移的(metastatic)特性を有する細胞による疾病を総称する意味である。本明細書中において、前記ガンは、悪性腫瘍(malignant tumor)と同一の意味としても使用される。

本発明の組成物が適用され得るガンは、乳ガン(breast cancer)、肺ガン(lung cancer)、胃ガン(stomach cancer)、肝(肝臓)ガン(liver cancer)、血液ガン(blood cancer)、骨ガン(bone cancer)、膵腸ガン(pancreatic cancer)、皮膚ガン(skin cancer)、頭部又は頚部ガン(head or neck cancer)、皮膚又は眼球の黒色腫(cutane ous or intraocular melanoma)、子宮肉腫(uterine sarcoma)、卵巣ガン(ovarian cancer)、直腸ガン(rectal cancer)、肛門ガン(anal cancer)、大腸ガン(colon cancer)、卵管ガン(fallopian tube carcinoma)、子宮内膜ガン(endometrial
carcinoma)、子宮頸ガン(cervical cancer)、小腸ガン(small intestine cancer)、
内分泌ガン(endocrine cancer)、甲状腺ガン(thyroid cancer)、副甲状線ガン
(parathyroid cancer)、腎ガン(adrenal cancer)、軟組織腫瘍(soft tissue tumor)、尿道ガン(urethral cancer)、前立腺ガン(prostate cancer)、気管支ガン(bronchogenic cancer)、骨髓ガン(bone marrow tumor)などを含むが、それに限定されるものではない。

望ましくは、本発明の組成物は、大腸ガン(colon cancer)の予防又は治療に適用することができる。

本明細書中における用語“予防” は、疾患又は疾病を保有していると診断されたことはないが、このような疾患又は疾病にかかりやすい傾向のある動物において、疾患又は疾病の発生を抑制することを意味している。本明細書における用語“治療”は、(i)疾患又は疾病の発展の抑制; (ii)疾患又は疾病の軽減; 及び、(iii)疾患又は疾病の除去を意味している。

また、本発明の組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。

本発明の薬学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、それに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他にも、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適合する薬剤学的に許容される担体及び製剤は、 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed.、1995)に詳細に記載されている。

本発明の薬学的組成物の適合する投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因により多様に処方され得る。

一方、本発明の薬学的組成物の投与量は、望ましくは、一日当りに0.001〜1、000mg/kg(体重)である。

本発明の薬学的組成物は、経口又は非経口で投与することができ、非経口で投与される場合、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与することができる。本発明の薬剤学的組成物は、適用される疾患の種類に応じて投与経路が決定されることが望ましい。

本発明の組成物に含まれる有効成分である増進剤内の当該遺伝子又はそのタンパク質の発現抑制剤の濃度は、治療の目的、患者の状態、必要期間、疾患の危重度などを考慮して決定し、特定範囲の濃度に限定されない。

本発明の薬学的組成物は、当該発明の属する技術の分野にて通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法に従って、薬剤学的に許容される担体及び/又は賦形剤を用いて製剤化することで、単位容量形態で製造するか、又は多容量容器内に入れて製造することができる。そのとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態でもあり得、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。

本発明の組成物は、上述した感受性増進剤及び抗ガン剤であるEGFR-標的製剤を用いて、ガン細胞の細胞死を向上させるので、重複する内容は、本明細書があまり複雑になることを避けるために、その記載を省略する。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、
(a)対象から生物学的試料を用意する段階と;
(b)前記生物学的試料内のRON(Recepteur d’Origine Nantais、NM_002447.1)
遺伝子の発現水準; 又は、前記遺伝子のタンパク質の発現或いは活性水準を測定する段階と;
(c)前記(b)段階で測定した水準の確認結果に基づいて、前記対象のEGFR-標的製剤に対する感受性を判定する段階と;
を含む、EGFR-標的製剤に対する感受性予測方法を提供する。

本発明の望ましい具現例によれば、前記対象は、KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog、 NM_033360.2)、NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog、NP_002515.1)、又は、BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B、 NP_004324.2)野生型遺伝子を有する。

本発明の予測方法は、対象患者から生物学的試料を獲得し、前記試料内で上述した遺伝子からなるグループより選択される1個又は複数個の遺伝子の発現有無を測定した後、正常試料と比較して、記載された遺伝子又はタンパク質の発現或いは活性が抑制されたか減少された場合に、当該試料がEGFR-標的製剤に対して感受性があると判定する工程と; 記載された遺伝子又はタンパク質の発現或いは活性が増加されたか向上された場合に、当該試料がEGFR-標的製剤に対して抵抗性があると判定する工程と；を含んでなる。

本発明の予測方法は、試料内における特定の遺伝子又はタンパク質の発現(望ましくは、活性型)有無を、ガン細胞の抗ガン剤に対する感受性の指標とすることを特徴とする。

本発明の望ましい具現例によれば、前記(b)段階において、EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor、遺伝子銀行(Gene Bank)登載番号U48722.1)、Adam11
(ADAM metallopeptidase domain 11、NM_002390.4)、Adam32(ADAM metallopeptidase domain 32、NM_145004.5)、FZD4(Frizzled family receptor 4、NM_012193.2)、GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1、 NM_001505.2)、NM_001505.2)、GPR101(G protein-coupled receptor 101、NM_054021.1)遺伝子及びそれらの組合せからなる群より選択されたいずれか一つの遺伝子の発現水準; 又は、前記遺伝子のタンパク質の発現或いは活性水準を追加的に(さらに)測定する。

本発明の望ましい具現例によれば、前記(c)段階において、RON遺伝子の発現水準; 又は、そのタンパク質の発現或いは活性水準が、正常に比べて低発現又は低活性化された場合、対象のEGFR-標的製剤に対する感受性(敏感性)があると判定する。

本発明の望ましい具現例によれば、前記(c)段階において、RON遺伝子の発現水準; 又は、そのタンパク質の発現或いは活性水準が、正常に比べて高発現又は高活性化された場合、対象のEGFR-標的製剤に対する抵抗性があると判定する。

本発明の望ましい具現例によれば、前記Adam11、Adam32、FZD4、GPER、 GPR101遺伝子及びそれらの組合せからなる群より選択されたいずれか一つの遺伝子の発現水準; 又は、前記遺伝子のタンパク質の発現或いは活性水準が、正常に比べて低発現の場合、対象のEGFR-標的製剤に対する感受性(敏感性)があると判定する。

より詳細には、本発明の前記(c)段階は、前記(b)段階で測定した発現水準の結果に基づいて、KRAS、NRAS又はBRAF 野生型遺伝子を有し、RON遺伝子の活性及びその産物である活性型タンパク質の水準が、正常(野生型)の値に比べて抑制及び/又は減少されたと確認された場合、対象患者より獲得された当該腫瘍細胞が、抗ガン剤であるEGFR-標的製剤に対して感受性があると判定するものである。その時、追加的に、前記Adam11、Adam32、FZD4、GPER、GPR101遺伝子及びそれらの組合せからなる群より選択されたいずれか一つの遺伝子の発現水準; 又は、前記遺伝子のタンパク質の発現或いは活性水準を測定し、正常(野生型)の値に比べて抑制及び/又は減少されたと確認された場合、対象患者より獲得された当該腫瘍細胞が、抗ガン剤であるEGFR-標的製剤に対して感受性(敏感性)があると判定するものである。

本明細書中において前記遺伝子の発現水準を言及中に使用されている用語“低発現”又は“低活性”は、バイオマーカーが異常プロセス、疾患或いは個体内のその他病態を示すかその兆候である場合、健康な又は正常な個体或いは比較対象の個体より獲得された生物学的試料から検出されるバイオマーカーの値、もしくは、水準範囲よりも低い生物学的試料内のバイオマーカーの値或いは水準のことを称する。
また、バイオマーカーの“正常” 発現水準或いは値と比較して、“差動(differential)水準”或いは“差動値”を有するか、“異なって発現された”ものとして称され得、発現において定量的差異だけではなく定性的差異の両方を含む。

本発明の望ましい具現例によれば、前記RON遺伝子の発現水準; 又は、前記遺伝子のタンパク質の発現或いは活性水準の測定は、前記遺伝子のスプライシング変異体(Splicing variant)又は突然変異(Mutant)の存在有無の測定をさらに含む。

本発明によれば、前記遺伝子の変異体又は前記遺伝子内の一つ以上の変異の存在は、前記遺伝子の発現様相の変化を誘発して、EGFR-標的製剤に対する感受性に影響を及ぼすことができる(実施例3を参照)。

本明細書中で使用されている用語“変異体(variant)は”、当該遺伝子が選択的スプライシング(alternative splicing)によりエクソン部位が削除されて生成されたRON isoformを意味しており、真核生物において遺伝子発現調節の重要な過程のうちの一つである、選択的スプライシング(alternative splicing)によってRONの活性程度は調節される。

本発明において用いたRONΔ155(又はRON Delta 155)、RONΔ160(又はRON Delta 160)及びRONΔ165(又はRON Delta 165)は、このようなスプライシングによるエクソンのスキッピング(skipping)により生成される形態であって、リガンド(ligand)が無くても構造的にいつも活性化されている。

本発明によれば、このようなRONの選択的スプライシング(Alternative splicing)機作(メカニズム)によってエクソンが欠失されているスプライシング変異体は、その発現有無に応じて薬物に対する感受性が異なっている。

本明細書中で使用されている用語“突然変異(mutant)”又は“変異”は、当該遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸配列が塩基置換、欠失、挿入、増幅及び再配列されたことを含む。ヌクレオチド変異は、参照配列(例えば、野生型配列)に対するヌクレオチド配列の変化(例えば、1個以上のヌクレオチドの挿入、欠失、逆位又は置換、例えば、単一ヌクレオチド多型性(SNP))のことを称する。この用語は、さらに、異ならせて表さなかったら、ヌクレオチド配列の補体での相当する変化をも含む。ヌクレオチド変異は、体細胞突然変異又は配線多型性であり得る。

また、アミノ酸変異は、参照配列(例えば、野生型配列)に比べて、アミノ酸配列の変化(例えば、1個以上のアミノ酸の挿入、置換又は欠失、例えば内部欠失又はN-或いはC-末端の末端切断(truncation))のことを称する。

本発明の一実施例において、前記突然変異は、1 個のアミノ酸が置換されたE387A及びH424L点突然変異(point mutant)である。

また、本発明においては、RONタンパク質のアミノ酸 E387 部位とH424 部位がEGFRタンパク質と結合し得る部位であることを確認した。

前記変異の検出は、当業界にて広く公知になっている技術を用いて、標的分子クローニング及び配列分析により行われ得る。例えば、DNA配列分析; 対立遺伝子-特異的ヌクレオチド混入検定及び対立遺伝子-特異的プライマー延長検定(例えば、対立遺伝子-特異的PCR、対立遺伝子-特異的ライゲーション連鎖反応(LCR)及びギャップ-LCR)を初めとするプライマー延長検定; 対立遺伝子-特異的オリゴヌクレオチド混成化検定(例えば、オリゴヌクレオチドライゲーション検定); 切断剤からの保護を用いて、核酸二重らせん内のミスマッチされた塩基を検出する切断保護検定; MutSタンパク質結合分析; 変異体及び野生型核酸分子の移動性を比較する電気泳動分析; 変性-勾配ゲル電気泳動(DGGE、例えば文献[Myers et al. (1985) Nature 313:495]におけると同じ); ミスマッチされた塩基対におけるRNase切断の分析; ヘテロ二重らせんDNAの化学的又は酵素的切断の分析; 質量分光測定法(例えば、MALDITOF); 遺伝的ビット分析(GBA); 5'ヌクレアーゼ検定(例えば、タックマン(TaqMan); 及び、分子ビーコンを使用する検定を含むが、それに限定されない。

本明細書中で使用されている用語“生物学的試料”とは、本発明のバイオマーカーの発現が検出され得る個体から得られる全試料を意味している。

本発明の望ましい具現例によれば、前記生物学的試料は、唾液(saliva)、生検(biopsy)、血液、皮膚組織、液体培養物、糞便及び小便からなる群より選択されたいずれか一つであり、特にそれに限定されることなく、本発明の技術の分野にて通常的に使用される方法で処理して用意することができる。

本発明の方法は、上述したバイオマーカーを用いて感受性があると判定するので、重複する内容は、本明細書があまり複雑になることを避けるために、その記載を省略する。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、上述したEGFR-標的製剤に対する感受性増進剤及びEGFR-標的製剤を、対象に共同投与する段階を含む、EGFR-標的製剤に対する感受性の増進方法を提供する。

本発明の方法は、上述した感受性増進剤及び抗ガン剤であるEGFR-標的製剤を用いて感受性を増進させるので、重複する内容は、本明細書があまり複雑になることを避けるために、その記載を省略する。

以下で、実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨に従って本発明の範囲がこれらの実施例により限定されないことは、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者にとって自明であるだろう。

実験方法及び条件
免疫沈降法(immunoprecipitation)
大腸ガン細胞株において、RON活性型を分析するために、大腸ガン細胞株溶解液500μgを、抗-RON抗体1μgと混合した後、4℃で12時間の間培養し、その後、 Protein-Sepharose bead(Santa Cruz Biotehcnology、Santa Cruz、CA、USA)20μlを添加した後、2時間の間追加反応した。免疫沈降物を、緩衝液(Nondiet
P-40 lysis buffer)で5回洗浄した後、2XSDSサンプル溶液20μl を添加して加熱し、その後、anti-RON(Santa Cruz Biotechonology)、anti-phospho-Tyrosine(Cell Signaling、Beverly、CA、USA)抗体を用いてウエスタンブロットを行った。

内因性RONとEGFRとの相互作用を分析する目的で、HCT-8細胞株の溶解液300μgと抗-RON抗体1μg或いは抗-rabbit IgG抗体1μgを混合した後、4℃で12時間の間培養し、その後、Protein-Sepharose bead(Santa Cruz Biotehcnology、Santa Cruz、CA、USA)20μlを添加した後、2時間の間追加反応した。免疫沈降物を緩衝液(Nondiet P-40 lysis buffer)で5回洗浄した後、2XSDSサンプル溶液20μlを添加して加熱し、その後、anti-RON(Santa Cruz Biotechonology)、anti-EGFR(Cell Signaling、Beverly、CA、USA)抗体を用いてウエスタンブロットを行った。外因性 RONとEGFRとの相互作用を分析する目的で、RONタンパクそのものを発現していない LoVo大腸ガン細胞株に、RON活性型であるΔ160遺伝子型を形質感染(transfection)した後、48時間の後に細胞液を収去して、細胞液300μgと抗-RON抗体1μg 或いは抗-rabbit IgG 抗体1μgを混合し、その後、4℃で12時間の間培養した後、Protein-Sepharose bead(Santa Cruz Biotehcnology、Santa Cruz、CA、USA)20μlを添加した後、2時間の間追加反応した。免疫沈降物を緩衝液(Nondiet P-40 lysis buffer)で5回洗浄した後、2XSDSサンプル溶液20μlを添加して加熱し、その後、anti-RON(Santa Cruz Biotechonology)、anti-EGFR(Cell Signaling、Beverly、CA、USA)抗体を用いてウエスタンブロットを行った。

マイクロアレイ分析
RONを、タンパク質を発現していないColo320HSR大腸ガン細胞株に、RON活性型であるΔ160及び/又はc-METを発現する構造物(plasmid)で、48時間の間形質感染させた。その後、細胞の溶解物をマイクロアレイ分析した。

遺伝子の過発現及び抑制方法
RONとEGFRとの外因性相互作用を分析する目的で、RONタンパク質を発現していないLoVo大腸ガン細胞株に、RON活性型であるΔ160を発現する構造物で、48時間の間形質感染した。

RONとEGFRとの内因性相互作用を分析する目的で、RONが活性化されているHCT-8大腸ガン細胞株に、RON siRNA(small interfering RNA)で、48時間の間形質感染した。

前記RON siRNA配列(配列番号13)は、次の通りである:
5'-ACUUUGUAGAGGAGUUUGAUU-3'。

RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)及びリアルタイムPCR
RT-PCR(逆転写-PCR)を行うために、RONを発現していないColo320HSR大腸ガン細胞株と、RON活性型であるRONΔ160を発現する構造物とで、48時間の間形質感染させた細胞株、RONが活性化されているKM12C大腸ガン細胞株に、RON siRNAを用いて48時間形質感染させた細胞株から、トリゾール(Trizol)(Cat.#15596-026、Life technologies^TM)を用いて、それぞれRNAを抽出した。抽出されたRNAは、RT-PCR Kit(AccuPower RT PreMix、Bioneer)を用いて、 cDNAに合成した。当該遺伝子の発現程度の差は、合成されたcDNA、遺伝子特異的なプライマーを用いて、PCR(AccuPower PCRPreMix、Bioneer)で確認したし、リアルタイムPCR(LightCycler 480 SYBR Green、Roche)を用いて定量化した。

ウエスタンブロット
ウエスタンブロットを行うために、各細胞から分離したタンパク質をSDS-
PAGEを通じて分離した後、それをメンブレン(PolyScreen membranes(New England Nuclear、Boston、MA、USA)に移した後、多様な抗体(anti-phospho RON(MyBio Source、San Diego、California、USA))、anti-phospho Tyrosine、anti-EGFR、anti-phospho EGFR(Cell signaling Technology、Beverly、MA、USA)、anti-RON及びanti-r-tubulin(Santa Cruz Biotechnology)を用いて、4℃で12時間の間反応させ、その後、 1XTBS-T緩衝液で10分間 3回洗浄した。適切な抗rabbit-HRP或いは抗mouse-HRP secondary抗体を、常温で2時間反応させた後に、1XTBS-T緩衝液で10分間 3回洗浄し、その後、ECL solution(Amersham、Buckinghamshire、UK)を使用してタンパク質の発現を検証した。

phospho-RTKアレイ
RONタンパク質を発現していないColo320HSR細胞株に、RON活性型であるΔ160 構造物を48時間の間形質感染した後、細胞溶解物を収去した。収去された細胞溶解物50μgとHuman phospho-RTK array kit(R&D Systems、Inc、Minneapolis、MN、USA)に含まれているメンブレンと4℃で12時間の間反応させた後、TBS-T緩衝液で3回ずつ洗浄し、その後、anti-phospho-Tyrosine HRP抗体を、常温で2時間の間反応させた後、TBS-T緩衝液で3回ずつ洗浄した。その後、メンブレンをECL solution(Amersham、Buckinghamshire、UK)を使用して、RTK(Receptor tyrosine kinase)タンパク質の発現変化を検証した。

抗ガン剤処理
RONが活性化されていないCaCo2及びLIM1215大腸ガン細胞株と、活性化されているKM12C細胞株とに、セツキシマブ(Cetuximab)(Merck & Co.、Inc、NJ、USA)を、5、10、20μg/mlで48時間の間処理した後、細胞液を収去して、トリパンブルー計数法(trypan blue counting)を実施した(図3a)。

RONが活性化されているKM12C大腸ガン細胞株に、RON siRNAを48時間の間処理した後、Cetuximab 20μg/mlで48時間処理した後、細胞液を収去して、トリパンブルー計数法を実施した。

阻害剤処理
RONが活性化されているKM12C大腸ガン細胞株に、RON阻害剤(LY2801653)3 μMとEGFR標的製剤(cetuximab)20μg/mlとを48時間処理した。処理後に、細胞溶解物を収去して、トリパンブルー計数法を実施した。

また、RON-ターゲット抗体抗ガン剤であるナルナツマブ(Narnatumab)
(Creative Diagnostic #TAB-184 Anti-Human RON Therapeutic Antibody)とEGFR 標的製剤(cetuximab)100μg/mlとを、48時間処理した。処理後、前記と同じ方法で細胞死滅の誘導程度を確認した。

突然変異(point mutant)の製作
突然変異の製作は、Muta-Direct mutagenesisキット(IntRON、Cat No. 15071)を用いて、キットより提供する指針に従って実施した。突然変異の製作(Mutagenesis)に使用されたプライマー配列は、次の通りである:

RON(E387A); Forward: 5'-GGA GCG CTG TTG TGC ATC CCC AGT CCA TCC-3'、 Reverse: 5'-GGA TGG ACT GGG GAT GCA CAA CAG CGC TCC-3’、RON (H424L); Forward: 5'-ACA CCA GCT GCC GCC TCT TCC CTC TGC TGG-3'、Reverse: 5'-CCA GCA GAG GGA AGA GGC GGC AGC TGG TGT-3'、RON (K1114M); Forward: 5'-AAT GTG CCA TCA TGT CAC TAA GTC G-3'、Reverse: 5'-CGA CTT AGT GAC ATG ATG GCA CAT T-3'、EGFR (D813N); Forward: 5'-TTG GTG CAC CGC AAC CTG GCA GCC AGG-3'、Reverse: 5'-CCT GGC TGC CAG GTT GCG GTG CAC CAA-3'。

前記プライマーとMuta-direct enzymeとを用いて、mutationの進行後、E-Coliに形質転換(transformation)を進行した。ColoniesからDNAを抽出した後、シーケンシング分析方法を通じて変異(mutation)の有無を確認した。

大腸ガン細胞株或いは大腸ガン患者組織でのRON活性の分析
RON活性の分析のために、細胞株又は大腸ガン患者組織からタンパク質を抽出(RIPA bufferを使用する)した後、20μgの細胞及び50μgの大腸ガン患者組織に、
phospho-RON 抗体(Mybiosource、MBS462024、dilution factor 1:1000)を用いて活性の有無を確認した。

また、RON 抗体(santa cruz; sc-322、Lot#G1514、2μgで2日間インキュベーション(incubation))で免疫沈降をした後(細胞株と大腸ガン患者組織300μgを使用する)、ホスホチロシン(phospho-Tyrosine)抗体(Cell signaling;9411、dilution factor 1:1000)でリン酸化(phosphorylation)の有無を確認した。RON活性型(form)であるRONΔ155及びRONΔ160(alternative splicing form)を確認するために、大腸ガン細胞株或いは大腸ガン患者組織からトリゾール(Trizol)試薬でRNAを抽出した。

cDNAの合成後、2種のプライマーを使用して分析を行った。

先ずは、RONΔ155及びRONΔ160を区別するためにデザインしたプライマーを使用したし、前記プライマーは次の通りである:
Forward: 5'-CTCTGGGGACCAGGTTTTCC-3’、
Reverse: 5'-ACCATCAATGGCAGGGAGTG-3'。
RT-PCRの条件は、94℃で5 分、94℃で30 秒、63℃で30 秒、72℃で1 分30 秒のように37 サイクル(cycles)を実施したし、72℃で10 分間延長させた。RON野生型の場合は1552bp、RONΔ155の場合は1078bp、RONΔ160の場合は1225bpで確認された。

それをもう一度(再度)確認するために、既存の文献に報告されていたプライマーを使用したし、前記プライマーは次の通りである:
Forward: 5'-TGG TCA GTA GCA GCT TCT CA-3'、
Reverse: 5'-AGG CAG CAG GAT ACC AAG GA-3'。
RT-PCRの条件は、94℃で5分、94℃で30秒、57℃で45秒、72℃で1分のように38 サイクルを実施したし、72℃で10分間延長させた。RON野生型の場合は1.6kb、RONΔ160の場合は1.3kb、RONΔ155の場合は1.1kbで確認された。

実施例1. RONタンパク質の活性有無に応じるEGFRの活性
1-1. ヒト大腸ガン細胞株でのRONタンパク質活性型の存在有無
本発明者等は、RONタンパク質が活性化又は非活性化されている大腸ガン細胞株を選別する目的で、全19種のヒト大腸ガン細胞株において、RONリン酸化をウエスタンブロッティング(Western blotting)を用いて確認した。

このようなリン酸化されたRONタンパク質は、RON活性型タンパク質であると見做した。

その結果、図1aに示したように、18種の細胞株のうちで、4 個の細胞株(HT-29、KM12C、KM12L4、SW1417)において、RONのリン酸化タンパク質の発現が観察され、これらの4 個の細胞株がRON活性を有することが分かる。

一方、LoVo、Colo320HSR大腸ガン細胞株においては、RONタンパク質そのものが存在しないことを示す。

1-2. DNA マイクロアレイ分析を用いたRONタンパク質活性化に応じる遺伝子の発現分析
本発明者等は、RONタンパク質が存在しないColo320HSR細胞株でのRON発現に応じる遺伝子の発現様相を分析する目的で、RONタンパク質が存在しないColo320HSR細胞株に、MET及びRON活性化型であるΔ160遺伝子を同時に過発現させた後、マイクロアレイを実施した。

RON遺伝子の過発現は、RON遺伝子又はタンパク質の活性化であると見做した。

図1bに示したように、RON活性化のみによって変化する遺伝子を、MET遺伝子だけ過発現させたサンプル群の遺伝子と比較して分析したところ、EGFRに関連した5個の遺伝子(Adam11、Adam32、FZD4、GPER、GPR101)が、RONにより変化する遺伝子に同定された。

1-3. 大腸ガン細胞株でのRON活性化に応じるEGFR転写活性(transactivation)-関連遺伝子のリアルタイムPCR(real-time polymerase chain reaction)分析
本発明者等は、RON活性化に応じるEGFR転写活性-関連遺伝子発現の変化様相を分析する目的で、RONが発現しない Colo320HSR大腸ガン細胞株に、RON活性化型であるΔ160遺伝子を過発現させた後、RONにより発現が変化すると推定されるEGFR転写活性に関与する5個の遺伝子(Adam11、Adam32、FZD4、GPER、GPR101)に対して、リアルタイムPCRを実施した。

その結果、図1cに示したように、RON過発現によって、Adam11、Adam32、FZD4、GPER、GPR101遺伝子の発現が有意に増加することが観察された。

1-4. 大腸ガン細胞株でのRON活性化に応じるEGFR転写活性-関連遺伝子のRT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)分析
本発明者等は、RON活性化に応じるEGFR転写活性-関連遺伝子発現の変化様相を分析する目的で、RONが発現しないColo320HSR大腸ガン細胞株に、RON遺伝子の活性化型であるΔ160遺伝子を過発現させた後、RONにより発現が変化すると推定されるEGFR転写活性に関与する5個の遺伝子(Adam11、Adam32、FZD4、GPER、GPR101)に対して、PCRを実施した。

その結果、図1dに示したように、RON活性化によって、Adam11、Adam32、FZD4、GPER、GPR101遺伝子の発現が、RON遺伝子の活性化型であるΔ160遺伝子を過発現させたサンプル群のみにおいて、有意に増加することが観察された。

1-5. RON活性を抑制させた大腸ガン細胞株でのEGFR転写活性-関連遺伝子のリアルタイムPCR分析
本発明者等は、RON抑制によるEGFR転写活性-関連遺伝子発現の変化様相を分析する目的で、RONが活性化されているKM12C大腸ガン細胞株に、siRNA技法を使用してRON活性を人為的に抑制させた後に、EGFR転写活性-関連遺伝子(Adam11、 Adam32、FZD4、GPER、GPR101)の発現を、リアルタイム(real-time)PCRで分析した。

その結果、図1eに示したように、RON活性化の抑制によって、FZD4、GPR101遺伝子が有意に減少することを確認した。

1-6. RON活性化によるEGFRタンパク質活性の分析
上述したように、実施例1-2(図1b)において同定され、実施例1-3〜1-5(図1c〜図1e)において検証されたEGFR転写活性(transactivation)-関連遺伝子の発現が、RON活性化によることが確認された。それから、本発明者等は、実際RON活性化に応じてEGFRタンパク質の活性化が誘導されるかを確認するために、RONが発現されないColo320HSR大腸ガン細胞株に、RON活性化型であるΔ160遺伝子を過発現させた後、ウエスタンブロッティングを用いて、EGFRのリン酸化タンパク質発現の有無を確認した。

その結果、図1fに示したように、RONが活性化された場合、EGFRのリン酸化タンパク質が増加することが観察された(a)し、RON活性化型であるΔ160遺伝子を過発現させた後、RTK-protein arrayを通じて、EGFRのリン酸化が誘導されることが確認された。よって、RONの活性化に応じてEGFRの活性が誘導されることが分かった。

実施例2. RON活性の有無に応じるEGFR活性の変化
2-1. RONタンパク質の活性化によるEGFRタンパク質の活性化
本発明者等は、RON活性化によるEGFRタンパク質の活性化を確認する目的で、RONが発現しないLoVo及びColo320HSR大腸ガン細胞株に、RON遺伝子の活性化型であるΔ160遺伝子を過発現させた後、ウエスタンブロットを実施した。

その結果、図2aに示したように、RON活性化に応じてEGFRの活性が増加されることを確認した。

2-2. RON抑制によるEGFRタンパク質の活性変化
本発明者等は、RONタンパク質の活性化によるEGFRタンパク質の活性変化を確認する目的で、RONが発現され活性化されているKM12C及びHT29大腸ガン細胞株に、siRNA技法を使用してRONを人為的に抑制させた後、ウエスタンブロットを実施してEGFRのリン酸化誘導を確認した。

その結果、図2bに示したように、RON抑制に応じてEGFRの活性も同様に減少されることを確認した。

2-3. RON抑制によるEGFRリガンド(ligand)依存的EGFR活性変化
本発明者等は、EGFR リガンド(ligand)依存的EGFR活性変化を確認する目的で、RONが発現され活性化されているKM12C大腸ガン細胞株に、siRNA技法を使用して RONを抑制させた後、EGFRの活性を誘導するEGF リガンド(ligand)処理時間に応じるEGFRのリン酸化程度をウエスタンブロットで確認した。

その結果、図2cに示したように、RONの抑制に応じてEGFにより誘導されたEGFRのリン酸化が減少されて、活性が減少されることを確認した。

実施例3. RONタンパク質の活性化に応じるセツキシマブ(cetuximab)の薬物感受性分析
3-1. RONタンパク質とEGFRタンパク質間の内因性(endogenous)細胞内結合分析
本発明者等は、RONが活性化されていないCaCO2大腸ガン細胞株及びRONが活性化されているKM12C大腸ガン細胞株の細胞内RONタンパク質とEGFRタンパク質間結合の有無を分析するために、RON 抗体を用いて、免疫沈降法(immunoprecipitation)でRONタンパク質とEGFRタンパク質間結合の有無を観察した。

その結果、図3aに示したように、RONの活性のないCaCO2細胞においては、RONタンパク質とEGFRタンパク質との結合がなされていなく、RONの活性のあるKM12C細胞においては、RONタンパク質とEGFRタンパク質との結合がなされていることが分かる。

3-2. RONタンパク質とEGFRタンパク質間の外因性(exogenous)細胞内結合分析
本発明者等は、RONが活性化されていない大腸ガン細胞株CaCO2に、RON正常型遺伝子とEGFR正常型遺伝子とをそれぞれ過発現させたものと、RON正常型遺伝子とEGFR正常型遺伝子とを同時に過発現させた後、RON抗体を用いて免疫沈降法(immunoprecipitation)でRONタンパク質とEGFRタンパク質間結合の有無を観察した。

その結果、図3bに示したように、RON正常型遺伝子とEGFR 正常型遺伝子とを同時に過発現させた場合、RONタンパク質とEGFRタンパク質との結合がなされることが分かる。

3-3. インビボ・プルダウンアッセイ(in vivo pull-down assay)によるRONタンパク質と結合するEGFRタンパク質ドメイン(domain)分析
本発明者等は、大腸ガン細胞株ではないRONとEGFRとの発現がない293T細胞株に、RONタンパク質とEGFRのキナーゼドメイン(kinase domain)タンパク質及びEC(細胞外ドメイン)タンパク質を、それぞれ過発現させたものと、RONとEGFRのキナーゼドメインタンパク質を同時に過発現させた後、RON抗体を用いて、免疫沈降法(immunoprecipitation)でRONタンパク質と結合するEGFRのドメイン(domain)を観察した。

その結果、図3cに示したように、RONとEGFRのEC タンパク質が結合することが分かる。

3-4. インビトロ・セルフリー・プルダウンアッセイ(in vitro cell free pull-down assay)によるRONタンパク質と結合するEGFRタンパク質ドメイン分析
本発明者等は、RONタンパク質とEGFRのEC(extracellular domain; 細胞外ドメイン)タンパク質との結合を再確認するために、インビトロ・セルフリー・プルダウンアッセイを用いて、RON正常型タンパク質と活性型Δ160タンパク質とを、それぞれEGFRのキナーゼドメインタンパク質とEC(extracellular domain)タンパク質とに反応させて、結合の有無を観察した。

その結果、図3dに示したように、RONの正常型タンパク質と活性型Δ160タンパク質との両方が、EGFRのECタンパク質と結合することが分かる。

3-5. コンピューターモデリング(Computer modeling)を用いたEGFRタンパク質と結合するRONタンパク質結合部位の予測分析
本発明者等は、EGFRタンパク質と結合するRONの重要結合部位を分析するために、コンピューターモデリングシステムを用いて、EGFRタンパク質の構造とRONタンパク質の構造とを代入して、EGFRと結合するRONの結合部位を予測した。

その結果、図3eに示したように、RONタンパク質のアミノ酸E387部位とH424部位とが、EGFRタンパク質と結合し得る部位であると予測分析された。

3-6. EGFRタンパク質と結合するRONタンパク質の結合部位の分析
本発明者等は、EGFRタンパク質と結合するRONの重要結合部位を分析するために、 RONとEGFRの発現がない293T細胞株に、RON正常型遺伝子及び活性型Δ160とRONのE387A及びH424L点突然変異(point mutant)遺伝子をそれぞれ過発現させ、EGFR遺伝子と同時に過発現させた後、RON抗体を用いて、免疫沈降法(immunoprecipitation)で正常型、活性型、突然変異型RONンパク質とEGFRタンパク質間の結合を観察した。

その結果、図3fに示したように、RONの正常型、活性型及びE387A突然変異型のみにおいて結合することが確認されたし、RONのH424L突然変異型においてはEGFRタンパク質が結合しないことが分かる。

3-7. EGFRタンパク質と結合するRONタンパク質の結合部位に応じるEGFR活性の分析
本発明者等は、EGFRタンパク質と結合するRONの結合部位に応じてEGFR活性の有無を分析するために、RONとEGFRの発現がない293T細胞株に、RON正常型遺伝子及び活性型Δ160遺伝子と、実施例3〜6(図3f)において確認したH424L突然変異遺伝子とをそれぞれ過発現させ、EGFR正常型遺伝子を同時に過発現させて、EGFRの活性をウエスタンブロットでEGFRのリン酸化を確認した。

その結果、図3gに示したように、EGFR活性型突然変異(EGFR del19)におけると同様に、EGFR正常型とRONの活性型Δ160遺伝子を同時に過発現した所のみにおいてEGFRのリン酸化が誘導され、RONの正常型及びH424L突然変異型においては、EGFRのリン酸化が誘導されないことが確認されて、EGFRの活性はRONの活性化有無に応じて活性が現われることが分かる。

実施例4. RON活性に応じるEGFRの活性有無の分析
4-1. RON活性型タンパク質の有無に応じるリガンド(ligand)-依存的EGFRの活性有無の分析
本発明者等は、RONとEGFRの発現がない293T細胞株に、EGFRの正常型タンパク質とEGFRのキナーゼ抑制(kinase dead)タンパク質をそれぞれ過発現させた後、RONの活性化型であるΔ160タンパク質の存在有無に応じて、EGFRのリガンド(ligand)であるEGFによるEGFRの活性有無を分析した。

その結果、図4aに示したように、RONの活性化型であるΔ160が存在しない場合には、EGFによりEGFRの正常型タンパク質のみにおいてEGFRの活性化が確認され、RONの活性化型であるΔ160 タンパク質が存在している場合には、EGF及びEGFRキナーゼ抑制(kinase dead)タンパク質と無関係に、EGFRの活性化が観察され、そのことから、RONの活性化型であるΔ160が、EGFRのリガンド-非依存的にEGFRの活性化を誘導することが分かる。

4-2. RONのリガンド-依存的活性の有無に応じるリガンド-依存的EGFRの活性有無の分析
本発明者等は、RONとEGFRの発現がない293T細胞株に、EGFRの正常型タンパク質とEGFRのキナーゼ抑制(kinase dead)タンパク質とをそれぞれ過発現させた後、 RONの活性を誘導するリガンドであるMSPの存在有無に応じて、EGFRのリガンドであるEGFによるEGFRの活性有無を分析した。

その結果、図4bに示したように、RONの活性を誘導するリガンドであるMSPが存在しない場合、EGFによりEGFRの正常型タンパク質のみにおいてEGFRの活性化が確認されたし、RONの活性を誘導するリガンドであるMSPが存在している場合には、EGF及びEGFRキナーゼ抑制(kinase dead)タンパク質と無関係に、EGFRの活性化が観察され、そのことから、RONの活性を誘導するリガンドであるMSPによりRONが活性型になると、EGFRのリガンド-非依存的にEGFRの活性化を誘導することが分かる。

また、図4cに示したように、RONΔ155/K1114N(kinase dead RON mutantであって、kinase activity抑制型)とEGFRとを一緒に過発現させたところ、RON活性化型だけ過発現させた場合と比較して、EGFRの活性が減少することを確認することができた。

実施例5. RON活性に応じるセツキシマブに対するEGFR活性及び関連性の分析
5-1. RON活性抑制によるEGFRの活性抑制及びセツキシマブ(cetuximab)に対するEGFR活性抑制の分析
表5に示したように、KM12C大腸ガン細胞株は、KRAS、NRAS、BRAF野生型
遺伝子型を有し、セツキシマブに対して抵抗性があるものと知られている(Todd M. et al、Dual Pharmacological Targeting of the MAP Kinase and PI3K/mTOR Pathway in Preclinical Models of Colorectal Cancer。PLOS 2014、Volume 9、Issue 11、e113037)。

前もって、本発明者等は、このようなKM12C大腸ガン細胞株においてRONが活性化されていることを、実施例1-1において確認したことがある。

それで、RON活性抑制によるEGFRの活性抑制及びセツキシマブ(cetuximab)に対するEGFR活性抑制を分析するために、上述したように、KRAS、NRAS、BRAF野生型の遺伝子型を有し、セツキシマブに対して抵抗性があり、RONが活性化されているKM12C大腸ガン細胞株において、RONをsiRNA技法で人為的に抑制させた後、セツキシマブを時間別に処理して、EGFRの活性化程度をウエスタンブロットで観察した。

その結果、図5aに示したように、RONを抑制していないKM12C細胞株においては、セツキシマブを処理しても、時間が経過するにつれて、EGFRの活性が減少されてから再度増加する一方、RONをsiRNAで抑制しセツキシマブを処理したKM12C 細胞株においては、EGFRの活性が急激に減少されて再度は増加しないことが確認され、RONの存在有無に応じてセツキシマブに対するEGFRの活性が調節されることが分かる。

5-2. RONの活性有無に応じるセツキシマブ細胞死滅の分析
表6に示したように、CaCo-2大腸ガン細胞株は、KRAS、NRAS、BRAF野生型の遺伝子型を有し、セツキシマブに対して敏感性があるものと知られている
(Giovanni B. et al、Antitumoral Efficacy of the Protease Inhibitor Gabexate Mesilate in Colon Cancer Cells Harbouring KRAS、BRAF and PIK3CA Mutations。PLOS 2012、Volume 7、Issue 7、e41347)。

前もって、本発明者等は、このようなCaCo-2大腸ガン細胞株においてRONが活性化されていないことを、実施例1-1において確認したことがある。

それで、セツキシマブの処理時、RONの活性有無に応じる細胞死滅の程度を分析するために、上述したように、KRAS、NRAS、BRAF野生型の遺伝子型を有し、セツキシマブに対して敏感性があり、RONが活性化されていないCaCo-2大腸ガン細胞株と、LIM1215細胞株と、RONが活性化されており、セツキシマブに抵抗性を持つKM12C大腸ガン細胞株でのセツキシマブの反応性を確認するために、トリパンブルー細胞計数法(trypan blue cell counting)で細胞死滅を分析した。

その結果、図5bに示したように、RONが活性化されていないCaCo-2細胞株とLIM1215細胞株とは、セツキシマブによる細胞死滅が観察される反面に、RONが活性化されているKM12C細胞株は、セツキシマブによる細胞死滅が観察されないため、抵抗性を持つことが分かる。

5-3. RON発現の抑制後におけるセツキシマブによる細胞死滅の分析
本発明者等は、RONが活性化されており、セツキシマブに抵抗性を持つKM12C大腸ガン細胞株に、RONをsiRNA技法で人為的に抑制させた後、セツキシマブを処理し、トリパンブルー細胞計数法(trypan blue cell counting)で細胞死滅を分析した。

その結果、図5cに示したように、RONを抑制した場合、セツキシマブに対する感受性が増加されて、細胞死滅が増加することが分かる。

5-4. RON発現の抑制後におけるセツキシマブによる下位シグナル機序の分析
本発明者等は、RONが活性化されており、セツキシマブに抵抗性を持つKM12C大腸ガン細胞株に、RONをsiRNA技法で人為的に抑制させた後、セツキシマブを処理し、ウエスタンブロットで下位シグナル機序を観察した。

その結果、図5dに示したように、RONの発現を抑制しセツキシマブを処理したグループにおいて、細胞の生存に重要な役目をするp-ERKタンパク質が減少され、アポトーシス(apoptosis)標識タンパク質である分裂したカスパーゼ-3(Cleaved Casp-3)が増加することが分かる。

5-5. RON活性の抑制後におけるセツキシマブによる細胞死滅の分析
本発明者等は、RONが活性化されており、セツキシマブに抵抗性を持つKM12C大腸ガン細胞株に、RONの活性を抑制し得る阻害剤LY2801653とセツキシマブとをそれぞれ処理したグループと、LY2801653とセツキシマブとを併用処理したグループとに対し、トリパンブルー細胞計数法(trypan blue cell counting)で細胞死滅を分析した。

その結果、図5eに示したように、RONの活性阻害剤LY2801653とセツキシマブとを併用処理したグループにおいて、細胞死滅が増加することが分かる。

5-6. RONの活性有無に応じるセツキシマブによる細胞死滅の分析
本発明者等は、RONが活性化されていなく、セツキシマブに敏感性を持つCaCo-2と、SW48大腸ガン細胞株に、RONの活性化型であるΔ160とΔ155を過発現させた後、セツキシマブに対する細胞死滅を観察した。

その結果、図5fに示したように、セツキシマブに敏感性を呈したCaCo-2とSW48細胞株が、RONの活性化型であるΔ160とΔ155とを過発現させた場合、セツキシマブにより細胞死滅が抑制されて、抵抗性を見せることが分かる。

5-7. RONの活性有無に応じるセツキシマブによる細胞成長抑制の分析
本発明者等は、RONが活性化されていなく、セツキシマブに敏感性を持つCaCo-2大腸ガン細胞株に、RONの活性化型であるΔ160遺伝子を過発現させ、コロニー形成(colony formation)方法でセツキシマブに対する細胞成長を観察した。

その結果、図5gに示したように、セツキシマブによりコロニーの数が減少された親CaCo-2(CaCo-2 parent)細胞株が、RONの活性化型であるΔ160遺伝子を過発現させた場合、セツキシマブを処理しても、コロニーの数がほとんど減少されることなく、RONの活性化型であるΔ160タンパク質によりセツキシマブに対する細胞成長の抵抗性を見せることが分かる。

5-8. RONノックアウト同種遺伝子(knockout isogenic)細胞株でのセツキシマブによる細胞死滅の分析
本発明者等は、RONが活性化されており、セツキシマブに抵抗性を持つKM12C大腸ガン細胞株に、RONをCRISPR/Cas9技法を用いて、RON遺伝子をノックアウト(Knockout)させた細胞株を製作し、セツキシマブに対する細胞死滅と細胞成長の分析をするために、RONノックアウトの効率の良い#1クローン(clone)に、セツキシマブを濃度別に処理して細胞死滅を観察した。

その結果、図5hに示したように、親細胞株(parent)に比べて細胞死滅が増加することが確認され、RONをノックアウトさせた場合は、セツキシマブによる敏感性が増加することが分かる。

5-9. RONノックアウト同種遺伝子(knockout isogenic)細胞株でのセツキシマブによる細胞成長抑制の分析
本発明者等は、RONが活性化されており、セツキシマブに抵抗性を持つKM12C大腸ガン細胞株に、RONをCRISPR/Cas9技法を用いてRON遺伝子をノックアウトさせた細胞株を用いて、セツキシマブに対する細胞成長をコロニー形成方法で観察した。

その結果、図5iに示したように、親細胞株(parent)に比べてコロニーの数が減少されることが確認され、RONをノックアウトさせた場合は、セツキシマブによる敏感性が増加することが分かる。

実施例6. RONノックアウト同種遺伝子(knockout isogenic)細胞株を用いたインビボ異種移植(in vivo xenograft)モデルでのRON存在有無に応じるセツキシマブの腫瘍抑制効能の分析
本発明者等は、RONが活性化されており、セツキシマブに抵抗性を持つKM12C大腸ガン細胞株に、RONをCRISPR/Cas9 技法を用いてRON遺伝子をノックアウトさせた細胞株を用いたインビボ異種移植モデルにおいて、セツキシマブによる腫瘍抑制の効能を観察した。

その結果、図6に示したように、親細胞株(parent)に比べて、RONノックアウト異種移植(knockout xenograft)マウスにおいて、腫瘍の大きさが著しく減少されることが観察され、 RONの活性化をノックアウトさせた場合は、セツキシマブによるインビボ(in vivo)敏感性が増加することが分かる。

よって、RONの活性化は、EGFR-標的製剤であるセツキシマブに対する感受性予測用バイオマーカーとしての可能性を見せる。

実施例7. RON抗体抗ガン剤とセツキシマブとの併用処理による細胞死滅誘導の確認
本発明者等は、RON抗体抗ガン剤とセツキシマブとの併用処理による細胞死滅誘導を確認した。

その結果、図7に示したように、RONをターゲットにする抗体抗ガン剤であるナルナツマブ(Narnatumab)とセツキシマブとを併用処理した時、細胞死滅が誘導されることを確認した。その時、タンパク質の発現変化を確認したところ、EGFRとRONの活性が抑制され、ERKの活性が抑制されることを確認した。

実施例8. セツキシマブ反応性の有無とRON活性との関係分析
本発明者等は、セツキシマブ反応性の有無とRON活性との関係を分析した。

その結果、図8に示したように、実際の大腸ガン患者たちは、RON活性型(p-RON positive)及びEGFR活性型(P-EGFR positive)であると確認され(左側グラフ)、さらに、実際の大腸ガン患者(double positive)のうちでセツキシマブの処方を受けた患者は、RON活性の有無に応じてセツキシマブに対して異なる感受性を呈すると確認された。

Claims

RON(Recepteur d’Origine Nantais、遺伝子銀行(Gene Bank)登載番号NM_002447.1)遺伝子を含む、
EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)-標的製剤に対する感受性予測用バイオマーカー。
前記バイオマーカーは、KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog、遺伝子銀行(Gene Bank)登載番号NM_033360.2)、NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras)oncogene homolog、遺伝子銀行登載番号NP_002515.1)、BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B、遺伝子銀行登載番号NP_004324.2)、EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor、遺伝子銀行登載番号U48722.1)、Adam11(ADAM metallopeptidase domain 11、遺伝子銀行登載番号NM_002390.4)、Adam32(ADAM metallopeptidase domain 32、遺伝子銀行登載番号NM_145004.5)、FZD4(Frizzled family receptor 4、遺伝子銀行登載番号NM_012193.2)、GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1、NM_001505.2)、及びGPR101(G protein-coupled receptor 101、遺伝子銀行登載番号NM_054021.1)遺伝子からなる群より選択された1種以上の遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のEGFR-標的製剤に対する感受性予測用バイオマーカー。
前記バイオマーカーは、KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog、遺伝子銀行(Gene Bank)登載番号NM_033360.2)、NRAS
(neuroblastoma RAS viral (v-ras)oncogene homolog、遺伝子銀行登載番号NP_
002515.1)、又はBRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B、遺伝子銀行登載番号NP_004324.2)遺伝子が野生型の場合であることを特徴とする、請求項２に記載のEGFR-標的製剤に対する感受性予測用バイオマーカー。
前記RON遺伝子の発現水準; 又は、そのタンパク質の発現或いは活性水準が、正常に比べて低発現又は低活性化された場合、EGFR-標的製剤に対する感受性があると判定することを特徴とする、請求項１に記載のEGFR-標的製剤に対する感受性予測用バイオマーカー。
前記RON遺伝子の発現水準; 又は、そのタンパク質の発現或いは活性水準が、正常に比べて高発現又は高活性化された場合、EGFR-標的製剤に対する抵抗性があると判定することを特徴とする、請求項１に記載のEGFR-標的製剤に対する感受性予測用バイオマーカー。
RON(Recepteur d’Origine Nantais、遺伝子銀行登載番号NM_002447.1)遺伝子の発現水準; 又は、そのタンパク質の発現或いは活性水準を測定する製剤を含む、
EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)-標的製剤に対する感受性予測用組成物。
前記組成物は、KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog、遺伝子銀行(Gene Bank)登載番号NM_033360.2)、NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras)oncogene homolog、遺伝子銀行登載番号NP_002515.1)、BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B、遺伝子銀行登載番号NP_004324.2)、EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor、遺伝子銀行登載番号U48722.1)、Adam11(ADAM metallopeptidase domain 11、遺伝子銀行登載番号NM_002390.4)、Adam32(ADAM metallopeptidase domain 32、遺伝子銀行登載番号NM_145004.5)、FZD4(Frizzled family receptor 4、遺伝子銀行登載番号NM_012193.2)、GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1、NM_001505.2)、及び、GPR101(G protein-coupled receptor 101、遺伝子銀行登載番号NM_054021.1)遺伝子からなる群より選択された1種以上の遺伝子の発現水準; 又は、前記遺伝子のタンパク質の発現或いは活性水準を測定する製剤をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載のEGFR-標的製剤に対する感受性予測用組成物。
前記組成物は、KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog、遺伝子銀行登載番号NM_033360.2)、NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras)oncogene homolog、遺伝子銀行登載番号NP_002515.1)、又はBRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B、遺伝子銀行登載番号NP_004324.2)遺伝子が野生型の場合であることを特徴とする、請求項７に記載のEGFR-標的製剤に対する感受性予測用組成物。
前記EGFR-標的製剤は、ACTH(adrenocorticotropic hormone)生成腫瘍、急性リンパ球性又はリンパ芽球性白血病、急性又は慢性のリンパ球性白血病、急性非リンパ球性白血病、膀胱ガン、脳腫瘍、乳ガン、子宮頸ガン、慢性骨髓性白血病、リンパ腫、子宮内膜症、食道ガン、膀胱ガン、ユーイング肉腫(Ewing's sarcoma)、舌ガン、ホプキンスリンパ腫、カポジ肉腫、腎ガン、肝(肝臓)ガン、肺ガン、中皮腫、多発性骨髓腫、神経芽細胞腫、非ホプキンスリンパ腫、骨肉腫、卵巣ガン、乳腺ガン、前立腺ガン、膵腸ガン、大腸ガン、ペニスガン、網膜芽細胞腫(retinoblastoma)、皮膚ガン、胃ガン、甲状腺ガン、子宮ガン、精巣ガン、ウィルムス腫瘍及び栄養膜腫瘍(Trophoblastoma)からなる群より選択された1種以上に対する治療剤であることを特徴とする、請求項６に記載のEGFR-標的製剤に対する感受性予測用組成物。
前記EGFR-標的製剤は、セツキシマブ(cetuximab)、ゲフィチニブ(gefitinib)、エルロチニブ(erlotinib)、パニツムマブ(panitumumab)、PKI-166、EKB-569、HKI-272(WAY-177820)、イコチニブ(icotinib)、ブリガチニブ(brigatinib)、アファチニブ(afatinib)、ラパチニブ(lapatinib)、カネルチニブ(canertinib)、AEE788、XL647、及び、ザクティマ(Zactima)からなる群より選択された1種以上であることを特徴とする、請求項６に記載のEGFR-標的製剤に対する感受性予測用組成物。
前記遺伝子の発現水準を測定する製剤は、前記遺伝子のmRNAに特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、プライマー対又はプロブを含むことを特徴とする、請求項６又は７に記載のEGFR-標的製剤に対する感受性予測用組成物。
前記タンパク質の発現或いは活性水準を測定する製剤は、前記タンパク質に特異的に結合する抗体、ペプチド又はヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項６又は７に記載のEGFR-標的製剤に対する感受性予測用組成物。
前記RON遺伝子の発現水準; 又は、そのタンパク質の発現或いは活性水準が、正常に比べて低発現又は低活性化された場合、EGFR-標的製剤に対する敏感性があると判定することを特徴とする、請求項６に記載のEGFR-標的製剤に対する感受性予測用組成物。
前記RON遺伝子の発現水準; 又は、そのタンパク質の発現或いは活性水準が、正常に比べて高発現又は高活性化された場合、EGFR-標的製剤に対する抵抗性があると判定することを特徴とする、請求項６に記載の EGFR-標的製剤に対する感受性予測用組成物。
請求項6又は7に記載の組成物を含む、
EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)-標的製剤に対する感受性予測用キット。
RON(Recepteur d’Origine Nantais、遺伝子銀行(Gene Bank)登載番号NM_002447.1)遺伝子の発現; 又は、前記遺伝子のタンパク質の発現或いは活性を抑制する抑制剤を有効成分として含む、
対象のEGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)-標的製剤に対する感受性増進剤。
前記対象は、KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog、遺伝子銀行(Gene Bank)登載番号NM_033360.2)、NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras)oncogene homolog、遺伝子銀行登載番号NP_002515.1)、又は、BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B、遺伝子銀行登載番号NP_004324.2)遺伝子が野生型であることを特徴とする、請求項１６に記載のEGFR-標的製剤に対する感受性増進剤。
前記抑制剤は、siRNA(small interference RNA)、shRNA(short hairpin RNA)、miRNA(microRNA)、リボザイム(ribozyme)、DNAzyme、PNA(peptide nucleic acids)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、アブタマー、天然抽出物及び化学物質からなる群より選択された1種以上であることを特徴とする、請求項１６に記載のEGFR-標的製剤に対する感受性増進剤。
前記siRNAは、配列番号13の塩基配列を含むことを特徴とする、請求項１８に記載の EGFR-標的製剤に対する感受性増進剤。
(a)対象から生物学的試料を用意する段階と;
(b)前記生物学的試料内のRON(Recepteur d’Origine Nantais、遺伝子銀行(Gene Bank)登載番号NM_002447.1)遺伝子の発現水準; 又は、前記遺伝子のタンパク質の発現或いは活性水準を測定する段階と;
(c)前記(b)段階で測定した水準確認の結果に基づいて、前記対象のEGFR-標的製剤に対する感受性又は抵抗性を判定する段階と;
を含むEGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)-標的製剤に対する感受性予測方法。
前記(b)段階においてKRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog、遺伝子銀行(Gene Bank)登載番号NM_033360.2)、NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras)oncogene homolog、遺伝子銀行登載番号NP_002515.1)、BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B、遺伝子銀行登載番号NP_004324.2)、EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor、遺伝子銀行登載番号U48722.1)、Adam11(ADAM metallopeptidase domain 11、遺伝子銀行登載番号NM_002390.4)、Adam32(ADAM metallopeptidase domain 32、遺伝子銀行登載番号NM_145004.5)、FZD4(Frizzled family receptor 4、遺伝子銀行登載番号NM_012193.2)、GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1、 NM_001505.2)、及び、GPR101(G protein-coupled receptor 101、遺伝子銀行登載番号NM_054021.1)遺伝子からなる群より選択された1種以上の遺伝子の発現水準; 又は、前記遺伝子のタンパク質の発現或いは活性水準を測定する段階；をさらに含むことを特徴とする、請求項２０に記載の予測方法。
前記KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog、遺伝子銀行(Gene Bank)登載番号NM_033360.2)、NRAS(neuroblastoma RAS viral (v-ras)oncogene homolog、遺伝子銀行登載番号NP_002515.1)、又はBRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B、遺伝子銀行登載番号NP_004324.2)遺伝子は、野生型の場合であることを特徴とする、請求項２１に記載の予測方法。
前記(c)段階において、RON遺伝子の発現水準; 又は、そのタンパク質の発現或いは活性水準が、正常に比べて低発現又は低活性化された場合、対象のEGFR-標的製剤に対する感受性があると判定することを特徴とする、請求項２０に記載の予測方法。
前記(c)段階において、RON遺伝子の発現水準; 又は、そのタンパク質の発現或いは活性水準が、正常に比べて高発現又は高活性化された場合、対象のEGFR-標的製剤に対する抵抗性があると判定することを特徴とする、請求項２０に記載の予測方法。
前記Adam11、Adam32、FZD4、GPER及びGPR101遺伝子からなる群より選択された1種以上の遺伝子の発現水準; 又は、前記遺伝子のタンパク質の発現或いは活性水準が、正常に比べて低発現の場合、対象のEGFR-標的製剤に対する感受性があると判定することを特徴とする、請求項２１に記載の予測方法。
前記RON遺伝子の発現水準; 又は、前記遺伝子のタンパク質の発現或いは活性水準の測定は、前記遺伝子のスプライシング変異体(Splicing variant)又は突然変異(Mutant)の存在有無の測定をさらに含むことを特徴とする、請求項２０に記載の予測方法。
請求項１６乃至１９のいずれか一項に記載の感受性増進剤及びEGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)-標的製剤を有効成分として含む、
ガンの予防又は治療用薬学的組成物。
請求項１６乃至１９のいずれか一項に記載の感受性増進剤及びEGFR-標的製剤を、対象に共同投与する段階を含む、
EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)-標的製剤に対する感受性の増進方法。