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JP2016128451A - 遺伝子操作した樹状細胞および癌の治療のための使用 - Google Patents

遺伝子操作した樹状細胞および癌の治療のための使用 Download PDF

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秀穂 岡田
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Abstract

【課題】インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の機能を有するタンパク質を条件的に発現するためのベクターを含む、哺乳動物の腫瘍治療用の薬学的組成物の提供。【解決手段】アデノウイルス等のベクターが遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、該遺伝子スイッチが、（１）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存的転写因子をコードする少なくとも１つの転写因子配列、及び（２）該リガンド依存的転写因子によって活性化するプロモーターに連結された、ＩＬ−１２の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、該ＩＬ−１２の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、野生型ヒトＩＬ−１２と少なくとも８５％同一のタンパク質をコードし、かつ該薬学的組成物が、ＲＧ−１１５８１９等のリガンドと使用するためのものである、薬学的組成物。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、癌の治療のための遺伝子療法の分野に関する。一つの態様において、本発明
は、インターロイキン-12（IL-12）を条件的に発現するための樹状細胞の遺伝子操作およ
び治療のための細胞の使用に関する。別の態様において、本発明は、インターロイキン-1
2（IL-12）および/またはインターフェロン-アルファ（IFN-アルファ）を条件的に発現す
るための樹状細胞の遺伝子操作および治療のための細胞の使用に関する。
背景
様々な特許、特許出願、および出版物を本明細書において引用し、その開示は全体が参
照により本明細書に組み入れられる。しかし、本明細書におけるいかなる参照文献の引用
も、そのような参照文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であるとの容認で
あると解釈されるべきではない。
インターロイキン-12（IL-12）は、防御免疫応答および腫瘍形成の抑制を含むが、それ
らに限定されるわけではない、いくつかの生物学的プロセスへの寄与に関係するI型サイ
トカインファミリーのメンバーである（Abdi et al., 2006; Adorini, 1999; Adorini, 2
001; Adorini et al., 2002; Adorini et al., 1996; Akhtar et al., 2004; Akiyama et
al., 2000; Al-Mohanna et al., 2002; Aliberti et al., 1996; Allavena et al., 199
4; Alli and Khar, 2004; Alzona et al., 1996; Amemiya et al., 2006; Araujo et al.
, 2001; Arulanandam et al., 1999; Athie et al., 2000; Athie-Morales et al., 2004
; Bertagnolli et al., 1992; Bhardwaj et al., 1996; Biedermann et al., 2006; Brun
da and Gately, 1994; Buchanan et al., 1995; Romani et al., 1997; Rothe et al., 1
996; Satoskar et al., 2000; Schopf et al., 1999; Thomas et al., 2000; Tsung et a
l., 1997; Wolf et al., 1994; Yuminamochi et al., 2007）。増えつつある一連の証拠
は、IL-12はヒト疾患（例えば、癌）を制御するための有望な標的でありうることを示唆
している。
IL-12は、1型抗腫瘍NK細胞、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞におけるその強力な支持活性
に基づいて癌治療薬として依然として有望であるという事実（Trinchieri, 2003）にもか
かわらず、患者において報告された組換えヒトIL-12（rhIL-12）の毒性（Atkins et al.,
1997）は、臨床適用のためのGMP等級のrhIL-12の供給源が限られていることと合わせて
、IL-12に基づく治療アプローチの成功を妨げている。したがって、遺伝子療法アプロー
チはより安全で、筋道の立った治療選択肢であろうというのは妥当と考えられる。事実、
組換えウイルスに基づくIL-12 cDNA（Sangro et al., 2004；Triozzi et al., 2005）も
しくは組換えプラスミドに基づくIL-12 cDNA（Heinzerling et al., 2005）、またはIL-1
2遺伝子を改変した自己線維芽細胞（Kang et al., 2001）の腫瘍内または腫瘍周囲送達を
行う、第I相臨床試験は安全でよく耐容されることが明らかにされている。
しかし、これらの遺伝子療法を受けている黒色腫または様々な癌の患者における客観的
臨床反応は希少であり、変わりやすく、一過的であり、かつ多くは治療部位に焦点を合わ
せている（Heinzerling et al., 2005；Kang et al., 2001；Sangro et al., 2004；Trio
zzi et al., 2005）。疾患の消散が部分的または完全な症例において、腫瘍浸潤性リンパ
球の頻度増大（Heinzerling et al., 2005；Sangro et al., 2004）および循環中の腫瘍
特異的CD8+ T細胞のレベル上昇（Heinzerling et al., 2005）が認められており、これら
の患者における抗原特異的T細胞のクロスプライミングの改善に一致している。
加えて、いくつかの残存する問題、例えば、DCに基づくIL-12遺伝子療法に関連する予
測不可能な毒性および腫瘍内投与後の治療的DC.IL12移動におけるIL-12依存的制限の可能
性が生じている。さらに、治療の有効性にとって最も重要な、形質導入DCにおけるIL-12
産生のタイミングに関するさらなる問題もある（Murphy et al., 2005）。
特定のT細胞のクロスプライミングは、IL-12の自然であるが制御された供給源として役
立つ樹状細胞（DC）によって最もうまく達成される（Berard et al., 2000）ため、DCに
基づくIL-12遺伝子療法の前臨床試験におけるすぐれた有効性が最近報告され、非常に興
味が持たれている（Satoh et al., 2002；Tatsumi et al., 2003；Yamanaka et al., 200
2）。例えば、マウスモデルにおいて、IL-12p70を産生するよう遺伝子操作されたDC（組
換えアデノウイルス感染により）の腫瘍内（i.t.）注入は、腫瘍拒絶と共に、広く反応性
の腫瘍特異的CD8+ T細胞レパートリーのクロスプライミングを劇的に改善することが示さ
れた（Tatsumi et al., 2003）。CMVに基づくプロモーター下でのmIL-12をコードする組
換えアデノウイルス（rAd.cIL12、（Tatsumi et al., 2003））の過去の使用を考慮する
と、遺伝子操作されたDCによるIL-12の産生は構成的であり、したがって初期の腫瘍病変
内および後期の腫瘍流入領域リンパ節内のこのサイトカインの免疫学的影響を、治療転帰
に関して解決することはできなかった。したがって、IL-12を条件的に発現するために遺
伝子操作されたDCが必要とされている。本発明は、そのような細胞の使用について有望な
治療結果を提供する。
本発明は、条件的プロモーター制御下でIL-12の機能を有するタンパク質をコードする
組換えベクターを提供する。一つの態様において、ベクターは、ジアシルヒドラジンなど
の可溶性低分子リガンド、例えば、RG-115819、RG-115830またはRG-115932の提供により
条件的に活性化されうるプロモーターによって駆動されるIL-12p70をコードするアデノウ
イルスベクターである。このベクターはDCからのIL-12の発現の制御を可能にする（rAD.R
heoIL12）。
一つの態様において、本発明は、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む
、IL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現するためのベクターであって、該遺伝
子スイッチは、プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存的転写因子をコードす
る少なくとも1つの転写因子配列、および（2）該リガンド依存的転写因子によって活性化
するプロモーターに連結された、IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌク
レオチドを含む、ベクターを提供する。別の態様において、本発明は、遺伝子スイッチを
コードするポリヌクレオチドを含む、IL-12および/またはIFN-アルファの機能を有するタ
ンパク質を条件的に発現するためのベクターであって、該遺伝子スイッチは、プロモータ
ーに機能的に連結された、リガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因
子配列、および（2）該リガンド依存的転写因子によって活性化するプロモーターに連結
された、IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および/または
IFN-アルファの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター
に関する。
例えば、本発明は、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、IL-12の機
能を有するタンパク質を条件的に発現するためのベクターであって、ここでポリヌクレオ
チドは、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存的転写因子をコードす
る少なくとも1つの転写因子配列、および（2）該リガンド依存的転写因子によって活性化
するプロモーターに連結された、IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌク
レオチドを含む、ベクターを提供する。本発明は、遺伝子スイッチをコードするポリヌク
レオチドを含む、IL-12および/またはIFN-アルファの機能を有するタンパク質を条件的に
発現するためのベクターであって、ここでポリヌクレオチドは、（1）プロモーターに機
能的に連結された、リガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列
、および（2）該リガンド依存的転写因子によって活性化するプロモーターに連結された
、IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および/またはIFN-ア
ルファの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクターも提供
する。
本発明はさらに、IL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現する組換えベクター
、例えば、rAd.RheoIL12でDCを改変することにより、IL-12の機能を有するタンパク質を
条件的に発現するDCの集団を生成する方法を提供する。別の態様において、本発明は、IL
-12および/またはIFN-アルファの機能を有するタンパク質を条件的に発現する組換えベク
ターでDCを改変することにより、IL-12および/またはIFN-アルファの機能を有するタンパ
ク質を条件的に発現するDCの集団を生成する方法を提供する。
一つの態様において、本発明は、IL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現する
樹状細胞の集団を生成する方法であって、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド
を含むベクターであって、該遺伝子スイッチは、（1）プロモーターに機能的に連結され
た、リガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、および（2）該
リガンド依存的転写因子によって活性化するプロモーターに連結された、IL-12の機能を
有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを樹状細胞に導入するこ
とにより、該樹状細胞の少なくとも一部を改変する段階を含む方法を提供する。別の態様
において、本発明は、IL-12および/またはIFN-アルファの機能を有するタンパク質を条件
的に発現する樹状細胞の集団を生成する方法であって、遺伝子スイッチをコードするポリ
ヌクレオチドを含むベクターであって、該遺伝子スイッチは、（1）プロモーターに機能
的に連結された、リガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、
および（2）該リガンド依存的転写因子によって活性化するプロモーターに連結された、I
L-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および/またはIFN-アル
ファの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを樹状細胞
に導入することにより、該樹状細胞の少なくとも一部を改変する段階を含む方法を提供す
る。
例えば、本発明は、IL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現する樹状細胞の集
団を生成する方法であって、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含むベクタ
ーであって、ここでポリヌクレオチドは、（1）プロモーターに機能的に連結された、リ
ガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、および（2）該リガン
ド依存的転写因子によって活性化するプロモーターに連結された、IL-12の機能を有する
タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを樹状細胞に導入することによ
り、該樹状細胞の少なくとも一部を改変する段階を含む方法を提供する。本発明は、IL-1
2および/またはIFN-アルファの機能を有するタンパク質を条件的に発現する樹状細胞の集
団を生成する方法であって、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含むベクタ
ーであって、ここでポリヌクレオチドは、（1）プロモーターに機能的に連結された、リ
ガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、および（2）該リガン
ド依存的転写因子によって活性化するプロモーターに連結された、IL-12の機能を有する
タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および/またはIFN-アルファの機能を有する
タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを樹状細胞に導入することによ
り、該樹状細胞の少なくとも一部を改変する段階を含む方法を提供する。
本発明は、IL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現する組換えベクター、例え
ば、rAd.RheoIL12ベクターで、IL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現するよう
改変されたDCの集団も提供する。rAD.RheoIL12に感染させたDCは、活性化リガンドの提供
後にのみ高レベルのIL-12を産生することが明らかにされている。別の態様は、IL-12の機
能および/またはIFN-アルファの機能を有するタンパク質を条件的に発現する組換えベク
ターで、IL-12の機能を有するタンパク質および/またはIFN-アルファの機能を有するタン
パク質を条件的に発現するよう改変されたDCの集団を提供する。有用なリガンドには、RG
-115830、RG-115932、RG-115819、RSL1、および他のジアシルヒドラジンが含まれるが、
それらに限定されるわけではない。
一つの態様において、本発明は、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む
ベクターを含むインビトロで遺伝子操作した樹状細胞であって、該遺伝子スイッチは、プ
ロモーターに機能的に連結された、リガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つ
の転写因子配列、および（2）該リガンド依存的転写因子によって活性化するプロモータ
ーに連結された、IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む
、樹状細胞を提供する。別の態様において、本発明は、遺伝子スイッチをコードするポリ
ヌクレオチドを含むベクターを含むインビトロで遺伝子操作した樹状細胞であって、該遺
伝子スイッチは、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存的転写因子を
コードする少なくとも1つの転写因子配列、および（2）該リガンド依存的転写因子によっ
て活性化するプロモーターに連結された、IL-12の機能を有するタンパク質をコードする
ポリヌクレオチド、および/またはIFN-アルファの機能を有するタンパク質をコードする
ポリヌクレオチドを含む、樹状細胞を提供する。
例えば、本発明は、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含
むインビトロで遺伝子操作した樹状細胞であって、ここでポリヌクレオチドは、（1）プ
ロモーターに機能的に連結された、リガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つ
の転写因子配列、および（2）該リガンド依存的転写因子によって活性化するプロモータ
ーに連結された、IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む
、樹状細胞を提供する。本発明は、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む
ベクターを含むインビトロで遺伝子操作した樹状細胞であって、ここでポリヌクレオチド
は、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存的転写因子をコードする少
なくとも1つの転写因子配列、および（2）該リガンド依存的転写因子によって活性化する
プロモーターに連結された、IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオ
チド、および/またはIFN-アルファの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオ
チドを含む、樹状細胞を提供する。
本発明は、IL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現する組換えベクター、例え
ば、rAd.RheoIL12ベクターで、IL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現するよう
改変されたDCの集団を含む薬学的組成物も提供する。別の態様において、本発明は、IL-1
2の機能を有するタンパク質および/またはIFN-アルファの機能を有するタンパク質を条件
的に発現する組換えベクターで、IL-12の機能を有するタンパク質および/またはIFN-アル
ファの機能を有するタンパク質を条件的に発現するよう改変されたDCの集団を含む薬学的
組成物を提供する。
本発明は、黒色腫または神経膠腫などの癌の治療も提供する。IL-12遺伝子療法は、組
換えcDNAベクターとして適用した場合に、動物モデル試験において抗腫瘍効果を示してい
る（Faure et al., 1998；Sangro et al., 2005）が、遺伝子を改変したDCの状況で適用
した場合にさらに効果的であった（Satoh et al., 2002；Svane et al., 1999；Tatsumi
et al., 2003；Yamanaka et al., 2002）。しかし、これまで、プラスミドまたはウイル
スベクターを用いるIL-12遺伝子療法のヒト第I相試験は、癌の環境において持続性の客観
的臨床反応を達成することはできていない（Heinzerling et al., 2005；Kang et al., 2
001；Sangro et al., 2004；Triozzi et al., 2005）。本明細書に記載のDCのIL-12遺伝
子療法（IFN-アルファと共に、または伴わず）は有望な治療法を提供する。
一つの態様において、本発明は、哺乳動物の腫瘍の治療法であって、（a）樹状細胞が
、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み、ここでポリヌク
レオチドは、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存的転写因子をコー
ドする少なくとも1つの転写因子配列、および（2）該リガンド依存的転写因子によって活
性化するプロモーターに連結された、IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリ
ヌクレオチドを含む、インビトロで遺伝子操作した該樹状細胞の集団を、腫瘍微環境に腫
瘍内投与する段階、および（b）リガンド依存的転写因子を活性化するリガンドの有効量
を、該哺乳動物に投与する段階を含み；それによりIL-12の機能を有するタンパク質の発
現を誘導し、該腫瘍を治療する方法を提供する。
例えば、本発明は、哺乳動物の腫瘍の治療法であって：
（a）IL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現するよう、インビトロで樹状細胞を
遺伝子操作する段階；
（b）該インビトロで遺伝子操作した樹状細胞を腫瘍微環境に腫瘍内投与する段階；およ
び
（c）活性化リガンドの治療的有効量を該哺乳動物に投与する段階を含み、
それによりIL-12の機能を有するタンパク質の発現を誘導し、該腫瘍を治療する方法を提
供する。
さらなる態様において、本発明は、哺乳動物の腫瘍の治療法であって、（a）樹状細胞
が、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み、ここでポリヌ
クレオチドは、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存的転写因子をコ
ードする少なくとも1つの転写因子配列、および（2）該リガンド依存的転写因子によって
活性化するプロモーターに連結された、IL-12の機能を有するタンパク質および/またはIF
N-アルファの機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、インビトロ
で遺伝子操作した樹状細胞の集団を、腫瘍微環境に腫瘍内投与する段階、および（b）活
性化リガンドの治療的有効量を該哺乳動物に投与する段階を含み；それによりIL-12の機
能を有するタンパク質および/またはIFN-アルファの機能を有するタンパク質の発現を誘
導し、該腫瘍を治療する方法を提供する。
例えば、本発明は、哺乳動物の腫瘍の治療法であって：
（a）IL-12の機能を有するタンパク質および/またはIFN-アルファの機能を有するタンパ
ク質を条件的に発現するよう、インビトロで樹状細胞を遺伝子操作する段階；
（b）該インビトロで遺伝子操作した樹状細胞を腫瘍微環境に腫瘍内投与する段階；およ
び
（c）活性化リガンドの治療的有効量を該哺乳動物に投与する段階を含み、
それによりIL-12の機能を有するタンパク質および/またはIFN-アルファの機能を有するタ
ンパク質の発現を誘導し、該腫瘍を治療する方法を提供する。
本発明は、遺伝子操作したDCに基づく治療法の有効性を評価する方法であって、治療開
始前に患者におけるIFN-γの発現または活性のレベルを測定し、それにより対照レベルを
もとめ、その後IL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現するよう遺伝子操作したD
Cおよび活性化リガンドの有効量を投与し、次いでIFN-γの発現のレベルを測定して試験
レベルをもとめ、対照レベルと試験レベルを比較して治療法が有効であるかどうかを調べ
ることによる方法も提供する。
一つの態様において、本発明は、患者におけるインビトロで遺伝子操作した樹状細胞に
よる治療法の有効性を評価する方法であって：
（a）それを必要としている該患者からインビトロで遺伝子操作した樹状細胞の投与前に
得た、第一の生体試料中のインターフェロン-ガンマ（IFN-γ）の発現のレベルもしくは
活性のレベルまたは両方を測定し、それにより対照レベルをもとめる段階；
（b）それを必要としている患者に、IL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現する
ようインビトロで遺伝子操作した樹状細胞を投与する段階；
（c）それを必要としている該患者に、活性化リガンドの有効量を投与する段階；
（d）それを必要としている該患者からインビトロで遺伝子操作したDCおよび活性化リガ
ンドの投与後に得た、第二の生体試料中のIFN-γの発現のレベルもしくは活性のレベルま
たは両方を測定し、それにより試験レベルをもとめる段階；および
（e）IFN-γの対照レベルと試験レベルを比較し、ここで対照レベルに比べてIFN-γの発
現、活性または両方の試験レベルの上昇は、それを必要としている該患者において治療法
が有効であることを示す方法を提供する。
別の態様において、本発明は、樹状細胞においてインターロイキン-12（IL-12）の機能
を有するタンパク質の条件的発現を誘導する方法であって：（1）それを必要としている
哺乳動物に、本発明のインビトロで遺伝子操作した樹状細胞の集団の有効量を投与する段
階；および（2）それを必要としている該哺乳動物に、リガンド依存的転写因子を活性化
するリガンドの有効量を投与する段階を含む方法を提供する。
臨床での実行に先立ち、BALB/cマウスのCMS4肉腫モデルで行った以前の試験を拡大し、
Ad.cIL12であらかじめ感染させた同系の骨髄由来DCの腫瘍内送達（構成的発現）は、有効
な腫瘍拒絶を引き起こすことが観察された（Tatsumi et al., 2003）。拒絶はCMS4腫瘍に
対する全身のCD8+ T細胞による免疫に関連していた（Tatsumi et al., 2003）。
E1およびE3領域が除去され、RheoSwitch(登録商標) Therapeutic System (RTS)-IL-12成分がE1領域に置き換わっている、ベクターrAd.RheoIL12の構造を示す図である。「IL12」と表示されたボックスは、IRESで分離されたIL-12p40およびIL-12p35コード配列を表す。 遺伝子操作したDCはRG-115830存在下でIL-12タンパク質を条件的に発現することを示す図である。 遺伝子操作したDCはRG-115830存在下でIL-12タンパク質を条件的に発現することを示す図である。 遺伝子操作したDCはRG-115830存在下でIL-12タンパク質を条件的に発現することを示す図である。 黒色腫微環境に投与した遺伝子操作DCは、RG-115830を定着した第7日目のB16皮下腫瘍を有するC57Bl/6マウスにDC注入の24時間以内に腹腔内注入すると、腫瘍の退縮を引き起こすことを示す図である。 RG-115830をDC注入後第1〜5日目に投与した場合に腫瘍退縮が起こったが、第1から2日目または第1から3日目にのみ投与した場合には起こらなかったことを示す図である。 RG-115830をDC注入後第1〜5日目に投与した場合に腫瘍退縮が起こったが、第1から2日目または第1から3日目にのみ投与した場合には起こらなかったことを示す図である。 遺伝子操作したDCは、DC注入の24時間以内に活性化リガンドを腹腔内注入した後、腫瘍および腫瘍流入領域リンパ節において生存延長を示し、48時間および72時間の時点のリガンドではそれぞれDCの生存がはるかに少ない、およびまったくないことを示す図である。 遺伝子操作したDCは、その注入の24時間以内に活性化リガンドを提供すれば、抗B16 CD8+ T細胞の強い末梢活性化を促進することを示す図である。 以前に黒色腫が治癒したすべてのマウスは、腫瘍のない動物を第45日目（最初のB16攻撃後）に関連するB16黒色腫細胞またはMC38結腸癌細胞で再攻撃した場合に、B16腫瘍細胞に対しては特異的防御を示すが、MC38結腸癌細胞に対しては防御作用がないことを示す図である。 腹腔内または経口経路でのリガンド投与によって誘導される治療上の利益を示す図である。 腹腔内または経口経路でのリガンド投与によって誘導される治療上の利益を示す図である。 腹腔内または経口経路でのリガンド投与によって誘導される治療上の利益を示す図である。 マウス神経膠腫（GL261）にRTS制御下でIL-12および/またはIFN-アルファをコードするポリヌクレオチドを形質導入した樹状細胞を腫瘍内注入した結果としての、マウスの生存のカプラン・マイヤープロットを示す図である。この図の略語は以下のとおりである：Ad-IFNaはIFN-アルファを構成的に発現するアデノウイルスベクターであり；Ad-RTS-IFNaはRTS制御下でIFN-アルファをコードするアデノウイルスベクターであり；Ad-RTS-IFNaリガンドなしは活性化リガンドが存在しない、RTSおよびIFN-アルファを含むアデノウイルスベクターであり；Ad-IFNa/IL-12はIFN-アルファおよびIL-12をコードするアデノウイルスベクターを形質導入したDCに相当し；かつAd-RTS-IFNa/IL-12はRTS制御下でIFN-アルファおよびIL-12をコードする2つのアデノウイルスベクターを形質導入したDCに相当する。 アデノウイルスベクターAd-RTS-hIL-12の地図を示す図である。 異なるMOIおよびウイルス吸収期間でアデノウイルスベクターAd-RTS-mIL-12を形質導入したヒト樹状細胞によるIL-12産生を示す図である。異なるMOIおよび異なるウイルス吸収期間でのヒトDCのアデノウイルス形質導入は、MOI＝500で3時間のウイルス吸収により、これらの細胞の効率的な形質導入を示した。活性化薬物（「AD」または「活性化リガンド」）は、これらの形質導入したヒト樹状細胞においてIL-12発現を誘導した。 異なるIL-12含有アデノウイルスベクターの効果の比較を示す図である。SP1-RheoIL-12変異体はRheoswitch含有変異体のうちで最も有効であった。Sp1-RheoIL-12は、AdEasy-1ベクター主鎖をRAPAdベクター主鎖（ViraQuest）で置き換えたという点で、oldRheoIL-12と異なる。同様に、TTR-RheoIL-12は、合成最小プロモーターおよびSp1結合部位に代わる、Gal4結合部位の下流のTTR最小プロモーターを含み、ベクター主鎖がRAPAd（ViraQuest）であるという点で、oldRheoIL-12と異なる。図10が示すとおり、B16黒色腫のサイズ縮小において、Sp1-RheoIL-12はoldRheoIL-12と同等で、TTR-RheoIL-12よりも効果的であった。 以前に組換えアデノウイルスRheoswitch誘導性IL-12を含む樹状細胞で処置したマウスの再攻撃後に、B16黒色腫形成が見られないことを示す図である。これは、B16免疫マウスにB16細胞を最初の接種から45日後に再接種した場合、B16黒色腫は最大25日まで成長が妨げられたことを示している。マウス樹状細胞をB6マウスの骨髄から、rmIL-4およびrmGM-CSFを含む完全培地（RPMI-1640、10％FBS）中で7日間培養することにより生成した。次いで、CD11c陽性樹状細胞を、特異的MACSビーズを製造者のプロトコル（Miltenyi Biotech）に従い用いて単離し、MOI＝100でrAd.IL-12（RheoIL-12対SP1対TTR）を用いて24時間感染させた後、10E6 DCを定着した第9日目のB16黒色腫にs.c.注入した（1群あたりマウス5匹、右側腹部の腫瘍）。マウスを、DC注入後第0〜4日目に活性化リガンドRG-115830（50マイクロリットルのDMSO中30mg/kg）を1日1回i.p.注入することにより処置し、または処置しなかった。腫瘍サイズを3〜4日に1回モニターし、直交する直径の積としてmm2で報告している。治療関連の防御の特異性を評価するために、すべての腫瘍がない動物を、最初のB16腫瘍攻撃後第45日目に、左側腹部に10E5 B16黒色腫細胞と右側腹部にMC38結腸癌細胞で再攻撃した。MC38腫瘍は形成されたが、B16腫瘍は形成されなかった。 B16黒色腫マウスモデルにおけるB16腫瘍中に注入した樹状細胞の数（10E5、10E6、10E7）およびリガンド投与の期間の長さ（6日間または13日間）の間の比較ならびに結果としての腫瘍退縮を示す図である。13日間1日1回のリガンド投与および10E7樹状細胞の組み合わせが、25日間を通じての腫瘍退縮誘導において最も有効であった。 B16黒色腫マウスモデルにおけるB16腫瘍中に注入した樹状細胞の数（10E5、10E6、10E7）およびリガンド投与の期間の長さ（6日間または13日間）の間の比較ならびに結果としての腫瘍退縮を示す図である。13日間1日1回のリガンド投与および10E7樹状細胞の組み合わせが、25日間を通じての腫瘍退縮誘導において最も有効であった。 本明細書に記載の治療法は衰弱による動物の有害な体重減少に関連していなかったことを示す図である。衰弱および体重減少はしばしば、IL-12に応答してアップレギュレートされることが知られている高レベルのインターフェロン-ガンマおよびTNF-アルファに関連している。 以前に組換えアデノウイルスRheoswitch(登録商標)誘導性IL-12を含む樹状細胞および活性化リガンドRG-115932で処置したマウスの再攻撃後に、B16黒色腫形成が見られないことを示す図である。B16黒色腫を5匹の同系B6マウスの右側腹部皮下に7日間定着させた。第7日目に、DC.SP1-IL-12（MOI＝100でSP1最適スイッチを用いて感染させた骨髄由来DC）を105個、106個または107個の用量で腫瘍内（i.t.）注入した。RG-115932をDC注入の日に開始して（その後1日1回6日間または13日間のいずれか）i.p.注入により提供した。各コホートは5匹の動物を含み、腫瘍の成長を3〜4日に1回モニターし、平均サイズ（直交する測定値の積に基づく平方mm）で報告している。個々の動物の体重も腫瘍測定時に評価した（図13）。任意の治療によって疾患がなくなったすべての動物を、第50日目（最初のB16腫瘍接種後）に元の腫瘍の反対の側腹部（左側腹部）に105個のB16黒色腫細胞と右側腹部に105個のMC38結腸癌細胞で再攻撃した。腫瘍の成長を3〜4日に1回モニターし、未処置（非治療）動物で観察された成長（図12参照）と比較した。したがって、図14は、B16黒色腫は、B16免疫マウスにB16細胞を再接種した場合に、最大24日まで成長が妨げられたことを示している。図14は、B16未処置マウスは、MC38免疫マウスおよびMC38未処置マウスと同様、腫瘍形成から防御されなかったことも示している。MC38は当技術分野において公知の結腸癌である。これは組換えアデノウイルスRheoswitch(登録商標)誘導性IL-12を含む樹状細胞の元のB16腫瘍への注入によって引き起こされた免疫化の特異性を示している。 Ad-RTS-mIL-12を形質導入したマウス樹状細胞における活性化薬物（RG-115932）用量依存的IL-12発現を示す図である。 Ad-RTS-mIL-12を形質導入したHT1080細胞におけるRG-115932の存在または非存在に対するmIL-12発現のオン/オフ反応を示す図である。 活性化薬物（AD）存在下または非存在下でアデノウイルスを形質導入したDCの腫瘍内注入による免疫化に対するCD8+ T細胞応答は、抗腫瘍応答に対応していることを示す図である。 RTS制御下でヒトIL-12をコードするアデノウイルスベクターを形質導入した3名のボランティアからのヒトDCにおけるヒトIL-12誘導を示す図である。
配列の詳細な説明
SEQ ID NO：1は野生型マウスIL-12 p35遺伝子の全長ヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO：2は野生型マウスIL-12 p40遺伝子の全長ヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO：3は野生型ヒトIL-12 p35遺伝子の全長ヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO：4は野生型ヒトIL-12 p40遺伝子の全長ヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO：5は野生型マウスIL-12 p35タンパク質の全長ポリペプチド配列である。
SEQ ID NO：6は野生型マウスIL-12 p40タンパク質の全長アミノ酸配列である。
SEQ ID NO：7は野生型ヒトIL-12 p35タンパク質の全長アミノ酸配列である。
SEQ ID NO：8は野生型ヒトIL-12 p40タンパク質の全長アミノ酸配列である。
SEQ ID NO：9はショウジョウバエにおいて見いだされたエクジソン応答エレメントのDN
A配列である。
SEQ ID NO：10はキイロショウジョウバエにおいて見いだされたエクジソン応答エレメ
ントのDNA配列である。
SEQ ID NO：11はキイロショウジョウバエにおいて見いだされたエクジソン応答エレメ
ントのDNA配列である。
SEQ ID NO：12はホーミングエンドヌクレアーゼ（HE）酵素におけるI-SceI制限部位で
ある。
SEQ ID NO：13はヒトIL-12コード配列を含むアデノウイルスベクター：Ad-RTS-hIL-12
（SP1-RheoIL-12）のDNA配列である。
インターフェロンアルファ（IFN-アルファ）のアミノ酸配列は公共のデータベースから
アクセッション番号AAA52724として入手可能で、その配列は参照により本明細書に組み入
れられる。Capon et al., Mol. Cell. Biol. 5, 768-779 (1985)も参照されたい。
発明の詳細な説明
特に定義されない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語、表記および他
の科学用語または専門用語は、本発明が属する分野の技術者によって一般に理解される意
味を有することが意図される。いくつかの場合には、明瞭のためならびに/または容易な
参照および理解のために、一般に理解される意味を有する用語を本明細書において定義し
、本明細書におけるそのような定義の包含は、当技術分野において一般に理解されるもの
に対する実質的相違を意味すると必ずしも解釈されるべきではない。分子生物学の用語お
よび/または方法および/またはプロトコルの一般に理解される定義は、Rieger et al., G
lossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New
York, 1991；Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994；Sambrook et
al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001)およびAusubel et al.,
Current Protocols in Molecular Biology (1994)において見いだすことができる。適宜
、市販のキットおよび/または試薬の使用を含む方法は一般に、特に記載がない限り、製
造者の手引きおよび/またはプロトコルおよび/またはパラメーターに従って実施する。
本発明の目的のために、「単離された」なる用語は、その元の環境（それが天然に存在
する環境）から取り出された生物材料（細胞、核酸またはタンパク質）を示す。例えば、
植物または動物において天然状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、そ
れが天然に存在する隣接核酸から分離された同じポリヌクレオチドは「単離された」と考
えられる。
生物材料に適用される「精製された」なる用語は、その材料が、他の化合物の存在を排
除して、絶対的純粋さを示す形で存在することを要求するものではない。それよりも、こ
の用語は相対的な定義である。
「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」は交
換可能に用いられ、一本鎖の形、または二本鎖らせんのいずれかで、リボヌクレオシド（
アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「RNA分子」）もしくはデオキシリ
ボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、または
デオキシシチジン；「DNA分子」）のリン酸エステルポリマー型、またはホスホロチオエ
ートおよびチオエステルなどの、その任意のホスホエステル類縁体を意味する。二本鎖DN
A-DNA、DNA-RNAおよびRNA-RNAらせんが可能である。核酸分子、特にDNAまたはRNA分子な
る用語は、分子の一次および二次構造だけを意味し、任意の特定の三次型に限定すること
はない。したがって、この用語は、特に直鎖または環状DNA分子（例えば、制限断片）、
プラスミド、スーパーコイルDNAおよび染色体において見られる二本鎖DNAを含む。特定の
二本鎖DNA分子の構造を議論する際に、本明細書において配列は、DNAの非転写鎖（すなわ
ち、mRNAに相同の配列を有する鎖）にそって5'から3'方向の配列だけを示すという通常の
慣習に従って記載してもよい。「組換えDNA分子」とは、分子生物学的操作を受けたDNA分
子である。DNAには、cDNA、ゲノムDNA、プラスミドDNA、合成DNA、および半合成DNAが含
まれるが、それらに限定されるわけではない。
ポリヌクレオチド配列に適用される「断片」なる用語は、参照核酸に比べて長さが短く
、共通部分上に、参照核酸と同じヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を意味する。
本発明のそのような核酸断片は、適当な場合には、核酸断片がその成分である、より大き
いポリヌクレオチドに含まれていてもよい。そのような断片は、本発明の核酸の少なくと
も6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、5
1、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、50
0、720、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、またはそれ以上の連続するヌクレ
オチドの長さの範囲のオリゴヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。
本明細書において用いられる「単離核酸断片」とは、合成、非天然または改変ヌクレオ
チド塩基を任意に含む、一本鎖または二本鎖のRNAまたはDNAのポリマーを意味する。DNA
のポリマーの形の単離核酸断片は、cDNA、ゲノムDNAまたは合成DNAの1つまたは複数のセ
グメントからなっていてもよい。
「遺伝子」とは、転写のみによって（例えば、生物活性RNA種）、または転写および翻
訳によって（例えば、ポリペプチド）生成される機能性分子を含む、機能性分子をコード
するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。「遺伝子」なる用語は、cDNAおよ
びゲノムDNA核酸を含む。「遺伝子」は、コード配列の前の調節配列（5'非コード配列）
および後の調節配列（3'非コード配列）を含む、特定のRNA、タンパク質またはポリペプ
チドを発現する核酸断片も意味する。「天然遺伝子」とは、それ自身の調節配列を有する
、天然に見いだされる遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」とは、天然には一緒に見られ
ない調節および/またはコード配列を含む、天然遺伝子ではない任意の遺伝子を意味する
。したがって、キメラ遺伝子は、異なる源由来の調節配列およびコード配列、または同じ
源由来であるが、天然に見いだされるものとは異なる様式で配列された調節配列およびコ
ード配列を含みうる。キメラ遺伝子は、異なる源由来のコード配列および/または異なる
源由来の調節配列を含みうる。「内因性遺伝子」とは、生物のゲノム内のその天然の位置
における天然遺伝子を意味する。「外来」遺伝子または「異種」遺伝子とは、宿主生物に
おいて通常は見られないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入された遺伝子を意味する
。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことが
できる。「導入遺伝子」は、形質転換法によってゲノムに導入された遺伝子である。例え
ば、インターロイキン-12（IL-12）遺伝子はIL-12タンパク質をコードする。IL-12は、ジ
スルフィド結合によって連結されて完全に機能性のIL-12p70を生成する、35-kDサブユニ
ット（p35）および40-kDサブユニット（p40）のヘテロ二量体である。IL-12遺伝子はp35
およびp40サブユニットの両方をコードする。
「異種DNA」とは、細胞、または細胞の染色体部位に天然には位置しないDNAを意味する
。異種DNAは細胞にとって外来性の遺伝子を含みうる。
「ゲノム」なる用語は、染色体ならびにミトコンドリア、葉緑体およびウイルスDNAま
たはRNAを含む。
核酸分子は、この核酸分子の一本鎖型が他の核酸分子に、温度および溶液イオン強度の
適当な条件下でアニールしうる場合に、cDNA、ゲノムDNA、またはRNAなどの別の核酸分子
に「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知で、Sa
mbrook et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual., Second Edition, Cold S
pring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)、特にその中の第11章およ
び表11.1に例示されている。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの
「ストリンジェンシー」を決定する。
ストリンジェンシー条件は、密接に関係する生物からの機能性酵素を複製する遺伝子な
どの高度に類似の断片に対し、遠い関係の生物からの相同配列などの中等度に類似の断片
についてスクリーニングするために調節することができる。相同核酸の予備的スクリーニ
ングのために、Tm＝55°に対応する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、
例えば、5×SSC、0.1％SDS、0.25％ミルク、およびホルムアミドなし；または30％ホルム
アミド、5×SSC、0.5％SDSを用いることができる。中等度のストリンジェンシーハイブリ
ダイゼーション条件はより高いTm、例えば、40％ホルムアミド、5Xまたは6×SSCに対応す
る。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、最高のTm、例えば、50％ホル
ムアミド、5×または6×SSCに対応する。
ハイブリダイゼーションは、2つの核酸が相補配列を含むことを必要とするが、ハイブ
リダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが可能である。
「相補的」なる用語は、互いにハイブリダイズ可能なヌクレオチド塩基間の関係を記載す
るために用いる。例えば、DNAに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシン
はグアニンに相補的である。したがって、本発明は本明細書において開示するまたは用い
る完全な配列ならびにそれらの実質的に類似の核酸配列に相補的な単離核酸断片も含む。
本発明の一つの態様において、ポリヌクレオチドをTm＝55℃でのハイブリダイゼーショ
ン段階を含み、前述の条件を用いる、ハイブリダイゼーション条件を用いることによって
検出する。他の態様において、Tmは60℃、63℃、または65℃である。
ハイブリダイゼーション後の洗浄もストリンジェンシー条件を決定する。1つの条件は
、6ｘSSC、0.5％SDS、室温で15分間（min）で開始し、次いで2×SSC、0.5％SDS、45℃で3
0minを繰り返し、次いで0.2×SSC、0.5％SDS、50℃で30minを2回繰り返す、一連の洗浄を
用いる。好ましいストリンジェントな条件はより高い温度を用い、ここで0.2×SSC、0.5
％SDS中での最終の2回の30分間洗浄の温度を60℃に上げる以外は、洗浄は前述のものと同
じである。別の好ましい高度にストリンジェントな条件は、0.1×SSC、0.1％SDS、65℃で
の2回の最終洗浄を用いる。
核酸をハイブリダイズさせるための適当なストリンジェンシーは、当技術分野において
周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。2つのヌクレオチド配列
間の類似性および相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッド
のためのTm値は高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いTmに対
応）は、以下の順に低下する：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。長さ100ヌクレオチドよ
りも大きいハイブリッドについて、Tmを計算するための式が誘導されている（Sambrook e
t al., supra, 9.50-0.51参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドでのハイ
ブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長
さがその特異性を決定する（Sambrook et al., supra, 11.7-11.8参照）。
本発明の一つの態様において、ポリヌクレオチドを、500mM未満の塩中、少なくとも37
℃でのハイブリダイゼーション段階および2×SSPE中、少なくとも63℃の温度での洗浄段
階を含むハイブリダイゼーション条件を用いることによって検出する。別の態様において
、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション段階のために200mM未満の塩
および少なくとも37℃を含む。さらなる態様において、ハイブリダイゼーション条件は、
ハイブリダイゼーションおよび洗浄の両方の段階のために2×SSPEおよび63℃を含む。
別の態様において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約10ヌクレオチドで
ある。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最短の長さは少なくとも約15ヌクレオチ
ド；例えば、少なくとも約20ヌクレオチド；例えば、少なくとも30ヌクレオチドである。
さらに、当業者であれば、温度および洗浄液の塩濃度は、プローブの長さなどの因子に応
じて適宜調節しうることを理解するであろう。
「プローブ」なる用語は、相補的な一本鎖標的核酸と塩基対をなして二本鎖分子を形成
しうる、一本鎖核酸分子を意味する。
本明細書において用いられる「オリゴヌクレオチド」なる用語は、ゲノムDNA分子、cDN
A分子、プラスミドDNAまたはmRNA分子にハイブリダイズ可能な短鎖核酸を意味する。オリ
ゴヌクレオチドは、例えば、32P-ヌクレオチドまたはビオチンなどの標識が共有結合され
ているヌクレオチドで標識することができる。標識オリゴヌクレオチドは、核酸の存在を
検出するためのプローブとして用いることができる。オリゴヌクレオチド（その1つまた
は両方が標識されていてもよい）は、核酸の全長または断片をクローニングするため、DN
A配列決定のため、または核酸の存在を検出するための、PCRプライマーとして用いること
ができる。オリゴヌクレオチドは、DNA分子と三重らせんを形成するために用いることも
できる。一般に、オリゴヌクレオチドを合成により、好ましくは核酸合成機上で調製する
。したがって、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合などの非天然ホスホエステル類
縁体結合で調製することができる。
「プライマー」とは、標的核酸配列にハイブリダイズして、適当な条件下でDNA合成の
ための開始点として役立ちうる二本鎖核酸領域を作る、オリゴヌクレオチドを意味する。
そのようなプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応において、またはDNA配列決定のために
用いてもよい。
「ポリメラーゼ連鎖反応」はPCRと略記され、特定の核酸配列を酵素的に増幅するため
のインビトロ法を意味する。PCRは一連の温度周期の繰り返しを含み、各周期は次の3つの
段階を含む：標的分子の鎖を分離するための鋳型核酸の変性、一本鎖PCRオリゴヌクレオ
チドプライマーの鋳型核酸へのアニーリング、およびアニールしたプライマーのDNAポリ
メラーゼによる伸長。PCRは、標的分子の存在を検出する、および定量的または半定量的
条件下で、核酸の出発プール内のその標的分子の相対量を定量する手段を提供する。
「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応」はRT-PCRと略記され、1つまたは複数のRNA分子から1
つまたは複数の標的cDNA分子を酵素的に生成し、続いて前述の1つまたは複数の標的cDNA
分子内の1つまたは複数の特定の核酸配列を酵素的に増幅するためのインビトロ法を意味
する。RT-PCRは、標的分子の存在を検出する、および定量的または半定量的条件下で、核
酸の出発プール内のその標的分子の相対量を定量する手段も提供する。
DNA「コード配列」とは、ポリペプチドをコードし、適当な調節配列の制御下に置かれ
ると、インビトロまたはインビボで細胞内でポリペプチドに転写および翻訳されうる、二
本鎖DNA配列を意味する。「適当な調節配列」とは、コード配列の上流（5'非コード配列
）、その中、または下流（3'非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、RNA
プロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響をおよぼす、ヌクレオチド配列を意味す
る。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配
列、RNAプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム-ループ構造を含みうる。
コード配列の境界は5'（アミノ）末端の開始コドンおよび3'（カルボキシ）末端の翻訳停
止コドンによって決定される。コード配列には、原核生物配列、mRNAからのcDNA、ゲノム
DNA配列、および合成DNA配列さえ含まれうるが、それらに限定されるわけではない。コー
ド配列が真核生物細胞における発現を意図される場合、ポリアデニル化シグナルおよび転
写終止配列は、通常、コード配列に対して3'側に位置することになる。
「オープンリーディングフレーム」はORFと略記され、ATGまたはAUGなどの翻訳開始シ
グナルまたは開始コドン、および終止コドンを含み、かつ潜在的にポリペプチド配列に翻
訳されうる、DNA、cDNA、またはRNAのいずれかのある長さの核酸配列を意味する。
本明細書において「ヘッドトゥーヘッド」なる用語は、2つのポリヌクレオチド配列の
互いに対する方向を記載するために用いる。2つのポリヌクレオチドは、1つのポリヌクレ
オチドのコード鎖の5'末端が他方のポリヌクレオチドのコード鎖の5'末端に隣接している
ときにヘッドトゥーヘッド方向に位置し、それにより各ポリヌクレオチドの転写の方向は
他方のポリヌクレオチドの5'末端から離れる向きに進行する。「ヘッドトゥーヘッド」な
る用語は(5')-(5')と略記してもよく、また記号(←→)または(3'←5'5'→3')で示しても
よい。
本明細書において「テイルトゥーテイル」なる用語は、2つのポリヌクレオチド配列の
互いに対する方向を記載するために用いる。2つのポリヌクレオチドは、1つのポリヌクレ
オチドのコード鎖の3'末端が他方のポリヌクレオチドのコード鎖の3'末端に隣接している
ときにテイルトゥーテイル方向に位置し、それにより各ポリヌクレオチドの転写の方向は
他方のポリヌクレオチドに向かって進行する。「テイルトゥーテイル」なる用語は(3')-(
3')と略記してもよく、また記号(→←)または(5'→3'3'←5')で示してもよい。
本明細書において「ヘッドトゥーテイル」なる用語は、2つのポリヌクレオチド配列の
互いに対する方向を記載するために用いる。2つのポリヌクレオチドは、1つのポリヌクレ
オチドのコード鎖の5'末端が他方のポリヌクレオチドのコード鎖の3'末端に隣接している
ときにヘッドトゥーテイル方向に位置し、それにより各ポリヌクレオチドの転写の方向は
他方のポリヌクレオチドと同じ方向に進行する。「ヘッドトゥーテイル」なる用語は(5')
-(3')と略記してもよく、また記号(→→)または(5'→3'5'→3')で示してもよい。
「下流」なる用語は、参照ヌクレオチド配列に対して3'側に位置するヌクレオチド配列
を意味する。特に、下流ヌクレオチド配列は一般に、転写開始点に続く配列に関する。例
えば、遺伝子の翻訳開始コドンは転写の開始部位の下流に位置する。
「上流」なる用語は、参照ヌクレオチド配列に対して5'側に位置するヌクレオチド配列
を意味する。特に、上流ヌクレオチド配列は一般に、コード配列または転写開始点の5'側
に位置する配列に関する。例えば、ほとんどのプロモーターは転写の開始部位の上流に位
置する。
「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」なる用語は交換可能に用いられ、二本
鎖DNA内の特定のヌクレオチド配列内に結合し、それを切断する酵素を意味する。
「相同組換え」とは、別のDNA分子への外来DNA配列の挿入、例えば、染色体へのベクタ
ーの挿入を意味する。好ましくは、ベクターは相同組換えのための特定の染色体部位を標
的とする。特定の相同組換えのために、ベクターは、染色体の配列に対して十分に長い相
同性領域を含み、ベクターの染色体への相補的結合および組み込みを可能とするであろう
。より長い相同性領域、およびより大きい配列類似性は、相同組換えの効率を増加させう
る。
当技術分野において公知のいくつかの方法を用いて、本発明のポリヌクレオチドを増幅
させてもよい。いったん適当な宿主系および増殖条件が確立すれば、組換え発現ベクター
を増幅させ、多量に調製することができる。本明細書において記載するとおり、用いうる
発現ベクターには、少数であるが例を挙げれば、以下のベクターまたはその誘導体が含ま
れるが、それらに限定されるわけではない：ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスな
どのヒトまたは動物ウイルス；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルス；酵母ベクター；バ
クテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、ならびにプラスミドおよびコスミドDNA
ベクター。
「ベクター」とは、核酸の宿主細胞へのクローニングおよび／または導入のための任意
の媒体を意味する。ベクターは、別のDNAセグメントを結合させて、結合したセグメント
の複製を行いうるレプリコンであってもよい。「レプリコン」とは、インビボでDNA複製
の自律ユニットとして機能する、すなわち、それ自身の制御下で複製することができる、
任意の遺伝因子（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を意味
する。「ベクター」なる用語は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで核酸を細胞に
導入するためのウイルスおよび非ウイルス媒体の両方を含む。当技術分野において公知の
多数のベクターを用いて、核酸を操作し、応答エレメントおよびプロモーターを遺伝子に
組み込むなどしてもよい。可能なベクターには、例えば、ラムダ誘導体などのバクテリオ
ファージ、またはpBR322もしくはpUCプラスミド誘導体などのプラスミド、またはBluescr
iptベクターを含む、例えば、プラスミドまたは改変ウイルスを含む。本発明において有
用なベクターの別の例は、国際公開公報第2007/038276号に記載のUltraVector(商標) Pro
duction System（Intrexon Corp., Blacksburg, VA）である。例えば、適当なベクターへ
の応答エレメントおよびプロモーターに対応するDNA断片の挿入は、相補的付着末端を有
する選択したベクターに適当なDNA断片を連結することによって達成することができる。
または、DNA分子の末端を酵素的に修飾してもよく、またはヌクレオチド配列（リンカー
）をDNA末端に連結することによって任意の部位を生成してもよい。そのようなベクター
は、マーカーを細胞ゲノムに組み込んだ細胞の選択を提供する、選択マーカー遺伝子を含
むように操作することができる。そのようなマーカーは、マーカーによってコードされる
タンパク質を組み込み、それを発現する宿主細胞の同定および／または選択を可能にする
。
ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、細胞、ならびに生きている動物対
象における多様な遺伝子送達適用で用いられている。用いることができるウイルスベクタ
ーには、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックス、バキュロウイルス、ワクシニ
ア、単純ヘルペス、エプスタイン-バー、アデノウイルス、ジェミニウイルス、およびカ
ウリモウイルスベクターが含まれるが、それらに限定されるわけではない。非ウイルスベ
クターには、プラスミド、リポソーム、荷電脂質（サイトフェクチン）、DNA-タンパク質
複合体、およびバイオポリマーが含まれる。核酸に加えて、ベクターは、1つまたは複数
の調節領域、および/または核酸導入の結果（いずれの組織への導入、発現の持続時間な
ど）を選択、測定、およびモニターするのに有用な選択マーカーを含んでいてもよい。
「プラスミド」なる用語は、細胞の中心的代謝の一部ではなく、通常は環状二本鎖DNA
分子の形である、遺伝子をしばしば有する染色体外因子を意味する。そのような因子は任
意の源に由来する、一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAの、直鎖状、環状またはスーパーコ
イルの、自律複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であって
もよく、ここでいくつかのヌクレオチド配列は、適当な3'非翻訳配列と共にプロモーター
断片および選択された遺伝子産物のためのDNA配列を細胞に導入することができる、独特
の作成物に連結または組み換えられている。
「クローニングベクター」とは、別の核酸セグメントを結合させて、結合したセグメン
トの複製を行いうる、プラスミド、ファージまたはコスミドなどの、連続して複製する核
酸、好ましくはDNAの単位長さであって、複製起点を含む、「レプリコン」を意味する。
クローニングベクターは、1つの細胞型で複製することができ、もう1つにおいて発現する
ことができる（「シャトルベクター」）。クローニングベクターは、興味対象の配列を挿
入するためのベクターおよび/または1つ以上の複数のクローニング部位を含む、細胞の選
択のために用いうる1つまたは複数の配列を含んでいてもよい。
「発現ベクター」なる用語は、宿主への形質転換に続いて挿入された核酸配列の発現を
可能とするように設計されたベクター、プラスミドまたは媒体を意味する。クローン化遺
伝子、すなわち、挿入された核酸配列は、通常はプロモーター、最小プロモーター、エン
ハンサーなどの制御因子の制御下におかれる。所望の宿主細胞において核酸の発現を駆動
するのに有用な、開始制御領域またはプロモーターは数多くあり、当業者にはよく知られ
ている。これらの遺伝子の発現を駆動することができる実質的にいかなるプロモーターも
発現ベクターにおいて用いることができ、これにはウイルスプロモーター、細菌プロモー
ター、動物プロモーター、哺乳動物プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモータ
ー、組織特異的プロモーター、病因または疾患関連プロモーター、発生特異的プロモータ
ー、誘導性プロモーター、光調節プロモーター；CYC1、HIS3、GAL1、GAL4、GAL10、ADH1
、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、アルカリ性ホスファターゼプ
ロモーター（サッカロミセス属（Saccharomyces）における発現で有用）；AOX1プロモー
ター（ピチア属（Pichia）における発現で有用）；β-ラクタマーゼ、lac、ara、tet、tr
p、lPL、lPR、T7、tac、およびtrcプロモーター（大腸菌（Escherichia Coli）における
発現で有用）；光調節、種子特異的、花粉特異的、子房特異的、カリフラワーモザイクウ
イルス35S、最小CMV 35S、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（CsVMV）、クロロフィルa/b
結合タンパク質、リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ、苗条特異的、根特異的、
キチナーゼ、ストレス誘導性、イネツングロ桿状ウイルス、植物スーパープロモーター、
ジャガイモロイシンアミノペプチダーぜ、硝酸レダクターゼ、マンノピンシンターゼ、ノ
パリンシンターゼ、ユビキチン、ゼインタンパク質、およびアントシアニンプロモーター
（植物細胞における発現で有用）；SV40初期（SV40e）プロモーター領域、ラウス肉腫ウ
イルス（RSV）の3'末端反復配列（LTR）に含まれるプロモーター、アデノウイルス（Ad）
のE1Aのプロモーターまたは主要後期プロモーター（MLP）遺伝子、サイトメガロウイルス
（CMV）初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（HSV）チミジンキナーゼ（TK）プロモ
ーター、バキュロウイルスIE1プロモーター、伸長因子1アルファ（EF1）プロモーター、
ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーター、ユビキチン（Ubc）プロモーター、ア
ルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン-Lプロモーターの調節配列および転写制
御領域、ユビキタスプロモーター（HPRT、ビメンチン、α-アクチン、チューブリンなど
）、中間フィラメント（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、GFAPなど）のプロ
モーター、（MDR、CFTRまたは第VIII因子型などの）治療遺伝子のプロモーター、病因ま
たは疾患関連プロモーター、ならびに、膵臓腺房細胞で活性なエラスターゼI遺伝子制御
領域；膵臓ベータ細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域、リンパ細胞で活性な免疫グロ
ブリン遺伝子制御領域、精巣、乳房、リンパ系および肥満細胞で活性なマウス乳癌ウイル
ス制御領域；肝臓で活性なアルブミン遺伝子、Apo AIおよびApo AII制御領域、肝臓で活
性なアルファ-フェトタンパク質遺伝子制御領域、肝臓で活性なアルファ1-アンチトリプ
シン遺伝子制御領域、骨髄系細胞で活性なベータ-グロビン遺伝子制御領域、脳内の乏突
起神経膠細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、骨格筋で活性なミオシ
ン軽鎖-2遺伝子制御領域、および視床下部で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制
御領域、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ビリンプロモーター、脂肪酸結合腸タンパク
質のプロモーター、平滑筋細胞α-アクチンのプロモーターなどの、組織特異性を示し、
トランスジェニック動物で用いられているプロモーターを含むが、それらに限定されるわ
けではない、当技術分野において公知の動物および哺乳動物プロモーターが含まれるが、
それらに限定されるわけではない。加えて、これらの発現配列は、エンハンサーまたは調
節配列などの付加によって修飾してもよい。
ベクターは、当技術分野において公知の方法、例えば、トランスフェクション、電気穿
孔法、微量注入、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポ
フェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはDNAベクター輸送体によって
、所望の宿主細胞に導入してもよい（例えば、Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963 (199
2)；Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621 (1988)；およびHartmut et al., カナダ特許
出願第2,012,311号参照）。
本発明のポリヌクレオチドは、リポフェクションによってインビボで導入することもで
きる。過去１０年の間に、インビトロでの核酸のカプセル化およびトランスフェクション
のためのリポソームの使用が増大してきた。リポソームによるトランスフェクションで生
じる困難および危険を制限するように設計された合成カチオン脂質を用いて、マーカーを
コードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製することが
できる（Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:7413 (1987)；Mackey et al
., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027 (1988)；およびUlmer et al., Science 259:17
45 (1993)）。カチオン脂質の使用は、負に荷電した核酸のカプセル化を促進し、また、
負に荷電した細胞膜との融合も促進しうる（Felgner et al., Science 337:387 (1989)）
。核酸の転移のために特に有用な脂質化合物および組成物は、国際公開公報第95/18863号
、国際公開公報第96/17823号、および米国特許第5,459,127号に記載されている。外来遺
伝子をインビボで特定の器官に導入するためのリポフェクションの使用は、特定の実用的
利点を有する。特定の細胞へのリポソームの分子標的指向は利点の1つの領域を表す。ト
ランスフェクションを特定の細胞型に向けるのは、膵臓、肝臓、腎臓および脳などの細胞
異種性を持つ組織において特に好ましいことが明らかである。脂質を、標的指向の目的で
他の分子に化学的に結合させてもよい（Mackey et al. 1988, supra）。標的指向ペプチ
ド、例えば、ホルモンもしくは神経伝達物質、および抗体などのタンパク質、または非ペ
プチド分子を化学的にリポソームにカップリングさせることができよう。
カチオンオリゴペプチド（例えば、国際公開公報第95/21931号）、DNA結合タンパク質
由来ペプチド（例えば、国際公開公報第96/25508号）、またはカチオンポリマー（例えば
、国際公開公報第95/21931号）などの他の分子も、インビボで核酸のトランスフェクショ
ンを促進するのに有用である。
ベクターを裸のDNAプラスミドとしてインビボで導入することも可能である（米国特許
第5,693,622号、第5,589,466号および第5,580,859号参照）。受容体仲介性DNA送達アプロ
ーチも用いることができる（Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147 (1992)；およびWu
et al., J. Biol. Chem. 262:4429 (1987)）。
「トランスフェクション」なる用語は、細胞による外来または異種のRNAまたはDNAの取
り込みを意味する。外来または異種のRNAまたはDNAが細胞内部に導入された場合、細胞は
そのようなRNAまたはDNAによって「トランスフェクトされている」。トランスフェクトさ
れたRNAまたはDNAが表現型の変化をもたらす場合、細胞は外来または異種のRNAまたはDNA
によって「形質転換されている」。形質転換RNAまたはDNAは染色体DNAに組み込まれ（共
有結合され）、細胞のゲノムを形成することができる。
「形質転換」とは、宿主生物のゲノムに核酸断片を導入し、その結果、遺伝的に安定な
遺伝がもたらされることを意味する。形質転換された核酸断片を含む宿主生物を「トラン
スジェニック」または「組換え」または「形質転換」生物という。
加えて、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、その増幅または発現が求
められる細胞宿主における複製のための1つまたは複数の起点、マーカーまたは選択マー
カーを含んでいてもよい。
「選択マーカー」なる用語は、マーカー遺伝子の効果、すなわち、抗生物質に対する抵
抗性、除草剤に対する抵抗性、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどに基づいて選択す
ることができる同定因子、通常は、抗生物質または化学物質抵抗性遺伝子を意味し、ここ
でこの効果を用いて興味対象の核酸の遺伝を追跡し、かつ／または興味対象の核酸を受け
継いだ細胞もしくは生物を同定する。当技術分野において公知で、用いられる選択マーカ
ー遺伝子の例には、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン
、ハイグロマイシン、ビアラフォス除草剤、スルホンアミドなどに対する抵抗性を提供す
る遺伝子；および表現型マーカーとして用いられる遺伝子、すなわち、アントシアニン調
節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などが含まれる。
「レポーター遺伝子」なる用語は、レポーター遺伝子の効果に基づいて同定することが
できる同定因子をコードする核酸を意味し、ここでこの効果を用いて興味対象の核酸の遺
伝を追跡し、興味対象の核酸を受け継いだ細胞もしくは生物を同定し、かつ／または遺伝
子発現の誘導もしくは転写を測定する。当技術分野において公知で、用いられるレポータ
ー遺伝子の例には、ルシフェラーゼ（Luc）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、クロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β-ガラクトシダーゼ（LacZ）、β-グル
クロニダーゼ（Gus）などが含まれる。選択マーカー遺伝子はレポーター遺伝子と考える
こともできる。
「プロモーター」および「プロモーター配列」は交換可能に用いられ、コード配列また
は機能的RNAの発現を制御することができるDNA配列を意味する。一般に、コード配列はプ
ロモーター配列の3'側に位置する。プロモーターは天然遺伝子からその全体が由来しても
よく、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる因子で構成されても
よく、または合成DNAセグメントを含でいてもよい。当業者であれば、異なるプロモータ
ーは、異なる組織もしくは細胞型において、または発生の異なる段階において、または異
なる環境もしくは生理学的状態に応答して、遺伝子の発現を指令しうることが理解される
。遺伝子をほとんどの細胞型においてほとんどの時点で発現させるプロモーターは、一般
には「構成的プロモーター」と呼ばれる。遺伝子を特定の細胞型で発現させるプロモータ
ーは、一般には「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」と呼ばれ
る。遺伝子を発生または細胞分化の特定の段階で発現させるプロモーターは、一般には「
発生特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」と呼ばれる。プロモー
ターを誘導する物質、生体分子、化学物質、リガンド、光などでの細胞の暴露または処理
に続いて誘導され、遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「誘導性プロモーター」
または「調節性プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完
全には規定されていないため、異なる長さのDNA断片が同一のプロモーター活性を有しう
ることがさらに理解されている。
プロモーター配列は、典型的には、転写開始部位によってその3'末端に境があり、上流
（5'方向）に伸びて、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始させるの
に必要な最少数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内には、転写開始部位
（例えば、ヌクレアーゼS1での地図作成によって都合よく規定される）、ならびにRNAポ
リメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出されるであ
ろう。
コード配列は、RNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写し、次いでそれがトランス-
RNAスプライシングされ（コード配列がイントロンを含む場合）、コード配列によってコ
ードされるタンパク質に翻訳される場合、細胞中で転写および翻訳制御配列の「制御下」
にある。
「転写および翻訳制御配列」とは、宿主細胞におけるコード配列の発現を提供する、プ
ロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのDNA調節配列を意味する。真核生物細
胞において、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。
「応答エレメント」なる用語は、転写因子のDNA結合ドメインとの相互作用を通じて仲
介されたプロモーターに対する応答性を付与する1つまたは複数のシス作用性DNAエレメン
トを意味する。このDNAエレメントはその配列が回文構造（完全または不完全）であって
もよく、または可変数のヌクレオチドによって分離された配列モチーフもしくは半部位で
構成されてもよい。半部位は類似または同一であり、直接または逆転反復いずれかとして
、または1つの半部位もしくは直列に隣接する半部位の多量体として配列されうる。応答
エレメントは、この応答エレメントが組み込まれる細胞または生物の性質に応じて異なる
生物から単離された最小プロモーターを含んでいてもよい。転写因子のDNA結合ドメイン
は、リガンド存在下または非存在下で、応答エレメントのDNA配列に結合して、この応答
エレメントの調節下で下流の遺伝子の転写を開始または抑制する。天然エクジソン受容体
の応答エレメントのDNA配列の例には、
Figure 2016128451
（Cherbas et. al., Genes Dev. 5:120 (1991)参照）；
Figure 2016128451
、ここでN(n)は1つまたは複数のスペーサーヌクレオチドでありえ（SEQ ID NO：10）（D'
Avino et al., Mol. Cell. Endocrinol. 113:1 (1995)参照）；および
Figure 2016128451
（Antoniewski et al., Mol. Cell Biol. 14:4465 (1994)参照）が含まれる。
「機能的に連結された」なる用語は、一方の機能が他方によって影響されるような、1
つの核酸断片上の核酸配列の結合を意味する。例えば、プロモーターがコード配列の発現
に影響しうる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモ
ーターはコード配列と機能的に連結している。コード配列は、センスまたはアンチセンス
向きに調節配列に機能的に連結することができる。
本明細書において用いられる「発現」なる用語は、核酸またはポリヌクレオチド由来の
センス（mRNA）またはアンチセンスRNAの転写および安定な蓄積を意味する。発現は、mRN
Aのタンパク質またはポリペプチドへの翻訳も意味しうる。
「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」なる用語は、特定の制
限部位において、または相同組換えによって、核酸またはポリヌクレオチドに挿入するこ
とができるDNAのセグメントを意味する。DNAのセグメントは、興味対象のポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳のため
に適切な読み枠においてカセットの挿入を確実とするように設計される。「形質転換カセ
ット」とは、興味対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレ
オチドに加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有する特定のベクタ
ーをいう。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセットおよび形質転換カセッ
トは、宿主細胞における興味対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現増
強を可能とするエレメントも含みうる。これらのエレメントには、プロモーター、最小プ
ロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列
などが含まれうるが、それらに限定されるわけではない。
本発明の目的のために、「遺伝子スイッチ」なる用語は、プロモーターと結合している
応答エレメントと、応答エレメントおよびプロモーターが組み込まれている遺伝子の発現
を1つまたは複数のリガンドの存在下で調節する、リガンド依存的転写因子に基づく系と
の組み合わせを意味する。「遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド」なる用語は
、プロモーターと結合している応答エレメントと、1つまたは複数のリガンド存在下で、
応答エレメントおよびプロモーターが組み込まれている遺伝子の発現を調節する、リガン
ド依存的転写因子に基づく系をコードするポリヌクレオチドとの組み合わせを意味する。
遺伝子スイッチに関して、「エクジソン受容体に基づく」なる用語は、天然または合成
エクジソン受容体リガンド結合ドメインの少なくとも機能性部分を含み、エクジソン受容
体リガンド結合ドメインに結合するリガンドに応答しての遺伝子発現を調節する、遺伝子
スイッチを意味する。エクジソン応答系の例は米国特許第7,091,038号および第6,258,603
号に記載されている。一つの態様において、系はRheoSwitch(登録商標) Therapeutic Sys
tem（RTS）で、これは、図1に例示される構成的プロモーターの下で発現される、2つの融
合タンパク質、すなわちGal4 DNA結合ドメインと融合した突然変異を誘発されたエクジソ
ン受容体（EcR）のDEFドメインおよびVP 16転写活性化ドメインと融合したキメラRXRのEF
ドメインを含む。
「調節する」なる用語は、核酸または遺伝子の発現を誘導し、減少させ、または阻害し
、その結果、タンパク質またはポリペプチド産生をそれぞれ誘導し、減少させまたは阻害
することを意味する。
本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主細胞において遺伝子の発現を駆動す
るのに適した少なくとも1つのプロモーターをさらに含んでいてもよい。
本発明の態様において用いうるエンハンサーには、SV40エンハンサー、サイトメガロウ
イルス（CMV）エンハンサー、伸長因子1（EF1）エンハンサー、酵母エンハンサー、ウイ
ルス遺伝子エンハンサーなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
終止制御領域、すなわち、ターミネーターまたはポリアデニル化配列も好ましい宿主本
来の様々な遺伝子に由来しうる。任意に、終止部位は必要でないこともあるが、含まれれ
ば最も好ましい。本発明の一つの態様において、終止制御領域は合成配列、合成ポリアデ
ニル化シグナル、SV40後期ポリアデニル化シグナル、SV40ポリアデニル化シグナル、ウシ
成長ホルモン（BGH）ポリアデニル化シグナル、ウイルスターミネーター配列などからな
ってもよく、またはそれらに由来してもよい。
「3'非コード配列」または「3'非翻訳領域（UTR）」なる用語は、コード配列の下流（3
'）に位置するDNA配列を意味し、ポリアデニル化［ポリ(A)］認識配列およびmRNAプロセ
シングまたは遺伝子発現に影響をおよぼすことができる調節シグナルをコードする他の配
列を含んでいてもよい。ポリアデニル化シグナルは、通常はmRNA前駆体の3'末端へのポリ
アデニル酸鎖の付加に影響することによって特徴付けられる。
「調節領域」とは、第二の核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味する。調節領域は
、特定の核酸（相同領域）の発現を天然で担う配列を含んでいてもよく、または異なるタ
ンパク質もしくは合成タンパク質（異種領域）の発現を担う異なる起源の配列を含んでい
てもよい。特に、この配列は特異的または非特異的様式で、かつ誘導または非誘導様式で
、遺伝子の転写を刺激または抑制する、原核生物、真核生物もしくはウイルス遺伝子の配
列または誘導された配列であり得る。調節領域は、複製起点、RNAスプライス部位、プロ
モーター、エンハンサー、転写終止配列、およびポリペプチドを標的細胞の分泌経路へと
向かわせるシグナル配列を含む。
「異種源」からの調節領域とは、発現された核酸と天然では関連しない調節領域を意味
する。異種調節領域には、異なる種からの調節領域、異なる遺伝子からの調節領域、ハイ
ブリッド調節配列、および天然では生じないが当業者によって設計される調節配列が含ま
れる。
「RNA転写産物」とは、DNA配列のRNAポリメラーゼが触媒する転写から得られる産物を
意味する。RNA転写産物がDNA配列の完全な相補的コピーである場合、これは一次転写産物
というか、またはこれは一次転写産物の転写後プロセシングに由来するRNA配列であって
もよく、成熟RNAという。「メッセンジャーRNA（mRNA）」とは、イントロンが無く、細胞
によってタンパク質に翻訳することができるRNAをいう。「cDNA」とは、mRNAに相補的で
あり、それに由来する二本鎖DNAを意味する。「センス」RNAとは、mRNAを含み、したがっ
て、細胞によってタンパク質に翻訳することができるRNA転写産物を意味する。「アンチ
センスRNA」とは、標的一次転写産物またはmRNAの全てまたは一部に相補的であって、標
的遺伝子の発現を阻止するRNA転写産物を意味する。アンチセンスRNAの相補性は、特定の
遺伝子転写産物の任意の部分、すなわち、5'非コード配列、3'非コード配列、またはコー
ド配列におけるものでありうる。「機能的RNA」とは、アンチセンスRNA、リボザイムRNA
、または翻訳されていないが、細胞プロセスに対して影響を有する他のRNAを意味する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は交換可能に用いられ、共有結
合したアミノ酸残基からなるポリマー化合物を意味する。
「単離ポリペプチド」、「単離ペプチド」または「単離タンパク質」とは、通常はその
天然状態においてそれと関連する化合物（例えば、他のタンパク質またはポリペプチド、
核酸、炭水化物、脂質）を実質的に含まないポリペプチドまたはタンパク質を意味する。
「単離された」とは、他の化合物との人工的もしくは合成的混合物、または生物活性に干
渉せず、かつ例えば、不完全な精製、安定剤の添加、もしくは薬学的に許容される製剤へ
の調合によって存在しうる不純物の存在を排除することを意味しない。
「置換突然変異体ポリペプチド」または「置換突然変異体」は、野生型または天然ポリ
ペプチドに対して、少なくとも1つの野生型または天然アミノ酸の異なるアミノ酸による
置換を含む、突然変異体ポリペプチドを意味することが理解されるであろう。置換突然変
異体ポリペプチドは、1つだけの野生型または天然アミノ酸置換を含んでいてもよく、「
点突然変異体」または「単一点突然変異体」ポリペプチドといってもよい。または、置換
突然変異体ポリペプチドは、野生型または天然ポリペプチドに対して、複数の野生型また
は天然アミノ酸の複数のアミノ酸による置換を含んでいてもよい。本発明にしたがい、置
換突然変異を含むグループH核内受容体リガンド結合ドメインポリペプチドは、野生型ま
たは天然グループH核内受容体リガンド結合ドメインポリペプチドに対して、少なくとも1
つの野生型または天然アミノ酸の異なるアミノ酸による置換を含む。
置換突然変異体ポリペプチドが複数の野生型または天然アミノ酸の置換を含む場合、こ
の置換は置換のために欠失されたのと同じ数の野生型もしくは天然アミノ酸、すなわち、
2つの非野生型もしくは非天然アミノ酸で置き換えられた2つの野生型もしくは天然アミノ
酸、または置換のために欠失されたのと同じでない数の野生型アミノ酸、すなわち、1つ
の非野生型アミノ酸で置き換えられた2つの野生型アミノ酸（置換＋欠失突然変異）、も
しくは3つの非野生型アミノ酸で置き換えられた2つの野生型アミノ酸（置換＋挿入突然変
異）のいずれかを含みうる。
置換突然変異体は、参照ポリペプチド配列内で置き換えられたアミノ酸残基および数、
ならびに新しい置換アミノ酸残基を示すための、略記命名法を用いて記載してもよい。例
えば、ポリペプチドの20番目（20th）のアミノ酸残基が置換されている置換突然変異体は
、「x20z」と略記してもよく、ここで「x」は置き換えられるアミノ酸であり、「20」は
ポリペプチド内のアミン酸残基の位置または数であり、「z」は新しい置換アミノ酸であ
る。したがって、交換可能に「E20A」または「Glu20Ala」と略記された置換突然変異体は
、変異体がポリペプチドの20位にグルタミン酸（当技術分野において一般に「E」または
「Glu」と略記される）の代わりにアラニン残基（当技術分野において一般に「A」または
「Ala」と略記される）を含むことを示す。
置換突然変異体は、インビトロ部位特異的突然変異誘発（Hutchinson et al., J. Biol
. Chem. 253:6551 (1978)；Zoller et al., DNA 3:479 (1984)；Oliphant et al., Gene
44:177 (1986)；Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:710 (1986)）、TA
B(登録商標)リンカー（Pharmacia）の使用、制限エンドヌクレアアーゼ消化/断片欠失お
よび置換、PCR仲介/オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発などを含むが、それらに限定
されるわけではない、当技術分野において公知の任意の突然変異誘発技術によって作成し
うる。部位特異的突然変異誘発のためにPCRに基づく技術が好ましい（Higuchi, 1989, ”
Using PCR to Engineer DNA”, in PCR Technology: Principles and Applications for
DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Chapter 6, pp. 61-70参照）。
ポリペプチドに適用される「断片」なる用語は、そのアミノ酸配列が参照ポリペプチド
の配列よりも短く、かつこれらの参照ポリペプチドの全部分にわたり、同一のアミノ酸配
列を含むポリペプチドを意味する。そのような断片は、適当な場合には、それらがその一
部であるより大きなポリペプチドに含まれていてもよい。本発明のポリペプチドのそのよ
うな断片は、少なくとも2、3、4、5、6、8、10、13、14、15、16、17、18、19、20、21、
22、25、26、30、35、40、45、50、100、200、240、もしくは300またはそれ以上のアミノ
酸の長さを有していてもよい。
ポリペプチドまたはタンパク質の「変種」とは、ポリペプチドまたはタンパク質に由来
し、かつそのポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも1つの生物学的特性を保持する
任意の類縁体、断片、誘導体、または突然変異体を意味する。ポリペプチドまたはタンパ
ク質の異なる変種が天然に存在することもある。これらの変種は、タンパク質をコードす
る構造遺伝子のヌクレオチド配列の差によって特徴づけられる対立遺伝子による変形物で
あってもよく、またはディファレンシャルスプライシングもしくは翻訳後修飾を含んでい
てもよい。当業者であれば、1つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、付加または置き換え
を有する変種を生成することができる。これらの変種は、特に、（a）1つまたは複数のア
ミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸で置換された変種、（b）1つまたは複数のア
ミノ酸がポリペプチドまたはタンパク質に付加された変種、（c）1つまたは複数のアミノ
酸が置換基を含む変種、および（d）ポリペプチドまたはタンパク質が血清アルブミンな
どの別のポリペプチドと融合した変種を含みうる。遺伝的（抑制、欠失、突然変異など）
、化学的および酵素的技術を含む、これらの変種を得るための技術は当業者には公知であ
る。一つの態様において、変種ポリペプチドは少なくとも約14のアミノ酸を含む。
「相同性」なる用語は、2つのポリヌクレオチドまたは2つのポリペプチド部分の間の同
一性のパーセントを意味する。1つの部分からの配列ともう1つからの配列との間の対応は
、当技術分野において公知の技術によって決定することができる。例えば、相同性は、配
列情報を整列させ、かつ容易に入手できるコンピュータプログラムを用いることによって
、2つのポリペプチド分子間の配列情報の直接的比較によって決定することができる。ま
たは、相同性は、相同領域の間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドの
ハイブリダイゼーションと、続く一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化および消化された断
片のサイズ測定によって決定することができる。
本明細書において用いられる「相同な」なる用語は、すべてのその文法上の形式および
つづりの変形において、スーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリ
ー）からのタンパク質および異なる種からの相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖など
）を含む、「共通の進化起源」を有するタンパク質の間の関係を意味する（Reeck et al.
, Cell 50:667 (1987)）。そのようなタンパク質（およびそのコードする遺伝子）は、そ
の高い配列類似性の程度によって反映される配列相同性を有する。しかしながら、通常の
用法および本出願において、「相同な」なる用語は、「高度に」などの副詞で修飾された
場合、配列類似性を意味することもあり、共通の進化起源を意味しない。
したがって、「配列類似性」なる用語は、すべてのその文法上の形式において、共通の
進化起源を有しても有していなくてもよいタンパク質の核酸またはアミノ酸配列間の同一
性または対応の程度を意味する（Reeck et al., Cell 50:667 (1987)参照）。一つの態様
において、ヌクレオチドの少なくとも約50％（例えば、少なくとも約75％、90％、または
95％）がDNA配列の規定の長さにわたってマッチする場合、2つのDNA配列は「実質的に相
同」または「実質的に類似」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクで入手で
きる標準的なソフトウェアを用いて配列を比較することによって、またはその特定のシス
テムのために規定された、例えば、ストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼ
ーション実験において同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件の規定
は当業者の技術の範囲内である（例えば、Sambrook et al., 1989, supra参照）。
本明細書において用いられる「実質的に類似」とは、1つまたは複数のヌクレオチド塩
基の変化の結果、1つまたは複数のアミノ酸が置換されるが、DNA配列によってコードされ
るタンパク質の機能的特性には影響しない核酸断片を意味する。「実質的に類似」とは、
1つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、アンチセンスまたは共抑制技術による遺伝
子発現の改変を仲介する核酸断片の能力に影響しない核酸断片も意味する。「実質的に類
似」とは、得られた転写産物の機能的特性に実質的に影響しない1つまたは複数のヌクレ
オチド塩基の欠失または挿入などの、本発明の核酸断片の修飾も意味する。したがって、
本発明は特定の例示的配列以上のものを含むことが理解される。提案された修飾はそれぞ
れ、コードされた産物の生物活性の保持の評価と同様に、当業者の日常的技術の範囲内で
ある。
さらに、当業者であれば、本発明に含まれる実質的に類似の配列は、ストリンジェント
な条件（0.1×SSC、0.1％SDS、65℃、および2×SSC、0.1％SDSで洗浄と、続く0.1×SSC、
0.1％SDS）下で、本明細書において例示した配列とハイブリダイズするそれらの能力によ
っても規定されることを理解するであろう。本発明の実質的に類似の核酸断片は、そのDN
A配列が本明細書に報告した核酸断片のDNA配列と少なくとも約70％、80％、90％または95
％同一であるものである。
約40％を超えるアミノ酸が同一であるか、または60％を超えるアミノ酸が類似である（
機能的に同一である）場合に、2つのアミノ酸配列は「実施的に相同」または「実質的に
類似」である。好ましくは、同様または相同な配列は、例えば、GCG（Genetics Computer
Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）パイ
ルアッププログラムを用いるアラインメントによって同定される。
「対応する」なる用語は、本明細書において、正確な位置が類似性または相同性が測定
される分子と同一であるかまたは異なるかに関わらず、同様または相同な配列を意味する
ために用いられる。核酸またはアミノ酸配列アラインメントはスペースを含みうる。した
がって、「対応する」なる用語は、配列類似性を意味し、アミノ酸残基またはヌクレオチ
ド塩基の番号付けを意味しない。
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」は、当業者による配列の手動評価に
よるか、またはBLAST（Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., J. Mol.
Biol. 215:403 (1993)）；ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で利用可能）などのアルゴリズムを
用いるコンピューター自動配列比較および同定によって、そのポリペプチドまたは遺伝子
を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド
配列を含む。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列が公知のタンパク質または遺伝子に相
同であると推定的に同定するには、10以上の連続アミノ酸または30以上のヌクレオチドの
配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、20〜30の連続ヌクレオチドを
含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、遺伝子同定（例えば、サザンハイブリ
ダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラーク
のインサイチューハイブリダイゼーション）の配列−依存的方法で用いてもよい。加えて
、12〜15塩基の短いオリゴヌクレオチドをPCRにおける増幅プライマーとして用いて、プ
ライマーを含む特定の核酸断片を得てもよい。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的
部分」は、その配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するのに十分な配
列を含む。
当技術分野において公知の「同一性パーセント」なる用語は、配列を比較することによ
って決定される、複数のポリペプチド配列または複数のポリヌクレオチド配列間の関係を
意味する。当技術分野において、「同一性」とは、場合によっては、そのような一連の配
列間のマッチによって決定される、ポリペプチドまたポリヌクレオチド配列間の配列関連
性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、Computational Molecular Biolog
y (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988)；Biocomputing: Inf
ormatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993)
；Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G.
, eds.) Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology
(von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987)；およびSequence Analysis Primer (Gri
bskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991)に記載のものを
含むが、それらに限定されるわけではない、公知の方法によって容易に計算することがで
きる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列の間で最良のマッチを与え
るように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公に入手可能なコンピュー
タプログラムに編集されている。配列アラインメントおよび同一性パーセントの計算は、
LASERGENEバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのMegalignプログラム
（DNASTAR Inc., Madison, WI）などの配列分析ソフトウェアを用いて行ってもよい。配
列の多重アラインメントは、アラインメントのClustal法（Higgins et al., CABIOS. 5:1
51 (1989)）をデフォルトパラメーター（GAP PENALTY＝10、GAP LENGTH PENALTY＝10）で
用いて行ってもよい。Clustal法を用いる対のアラインメントのデフォルトパラメーター
を選択しうる：KTUPLE 1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5およびDIAGONALS SAVED＝5。
「配列分析ソフトウェア」なる用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のため
に有用な任意のコンピューターアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを意味する。
「配列分析ソフトウェア」は、市販されているか、または独立して開発してもよい。典型
的な配列分析ソフトウェアには、プログラムのGCGスイート（Wisconsin Package Version
9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI）、BLASTP、BLASTN、BLASTX（Alts
chul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)）、およびDNASTAR（DNASTAR, Inc. 1228 S
. Park St. Madison, WI 53715 USA）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
本出願の文脈内で、配列分析ソフトウェアを分析に用いる場合、特に記載がない限り、分
析の結果は参照されたプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解されるであろう
。本明細書において用いられる「デフォルト値」とは、最初に初期化した時にソフトウェ
アに元々ロードされた値またはパラメーターの任意の組を意味することになる。
DNAの配列に関連する「化学的に合成された」とは、構成要素ヌクレオチドがインビト
ロで組み立てられたことを意味する。DNAの手動化学合成はよく確立された手法を用いて
行ってもよく、またはいくつかの市販の機械の1つを用いて自動化学合成を行うこともで
きる。したがって、遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の
最適化に基づく最適遺伝子発現となるように調整することができる。当業者であれば、コ
ドン利用が宿主に好都合なコドンに偏る場合、首尾よい遺伝子発現の確率を理解するであ
ろう。好ましいコドンの決定は、配列の情報が入手可能な場合には、宿主細胞に由来する
遺伝子の調査に基づくことができる。
本明細書において用いられる、複数の個々に操作可能な遺伝子調節システムは、a）選
択された濃度において、そのそれぞれのリガンドによる所与のシステムそれぞれの調節の
結果、そのシステムの遺伝子の発現の大きさが測定可能に変化し、かつb）その変化が、
実際の調節の同時性または連続性に関わらず、細胞、組織、または生物において同時に操
作可能なすべての他のシステムの発現の変化と統計学的有意に異なる場合、「直交してい
る」と言われる。好ましくは、それぞれ個別に操作可能な遺伝子調節システムの調節は、
細胞、組織、または生物におけるすべての他の操作可能なシステムよりも少なくとも2倍
大きい、例えば、少なくとも5倍、10倍、100倍、または500倍大きい遺伝子発現の変化を
起こす。理想的には、選択された濃度におけるそのそれぞれのリガンドによる所与のシス
テムそれぞれの調節の結果、そのシステムの遺伝子の発現の大きさが測定可能に変化し、
細胞、組織、または生物において操作可能なすべての他のシステムの発現の測定可能な変
化は起きない。そのような場合、多重誘導性遺伝子調節システムは「十分に直交している
」と言われる。有用な直交リガンドおよび直交受容体に基づく遺伝子発現システムは米国
特許第2002/0110861 Aに記載されている。
「外来遺伝子」なる用語は、対象にとって外来性の遺伝子、すなわち、対象に形質転換
プロセスを通じて導入された遺伝子、内因性の突然変異した遺伝子の非突然変異版または
内因性の非突然変異遺伝子の突然変異版を意味する。形質転換の方法は本発明にとって重
要ではなく、当業者には公知の対象に適した任意の方法でありうる。外来遺伝子は、逆転
写酵素などによりDNA中間体を通じて機能しうるDNAまたはRNAの形で対象に導入される、
天然または合成いずれかの遺伝子でありうる。そのような遺伝子は標的細胞に導入する、
対象に直接導入する、または形質転換細胞の対象への導入により間接的に導入することが
できる。
「治療的生成物」なる用語は、そのような生成物が発現される宿主細胞に有益な機能を
付与する、治療的ポリペプチドまたは治療的ポリヌクレオチドを意味する。治療的ポリペ
プチドには、長さ3アミノ酸の小さいペプチド、単鎖または複数鎖タンパク質、および融
合タンパク質が含まれうるが、それらに限定されるわけではない。治療的ポリヌクレオチ
ドには、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小さい干渉RNA、リボザイム、およびRNA外部
ガイド配列が含まれうるが、それらに限定されるわけではない。治療的生成物は天然配列
、合成配列または天然および合成配列の組み合わせを含んでいてもよい。
「エクジソン受容体複合体」なる用語は、一般に、核内受容体ファミリーの少なくとも
2つのメンバーである、エクジソン受容体（「EcR」）およびウルトラスピラクル（「USP
」）タンパク質を有するヘテロ二量体タンパク質複合体を意味する（Yao et al., Nature
366:476 (1993))；Yao et al., Cell 71:63 (1992)参照）。機能的EcR複合体はイムノフ
ィリンなどのさらなるタンパク質を含んでいてもよい。転写因子（DHR38、ベータFTZ-1ま
たは他の昆虫ホモログなど）として公知の核内受容体ファミリーのタンパク質のさらなる
メンバーは、EcRおよび/またはUSPのリガンド依存的または非依存的パートナーであって
もよい。EcR複合体はEcRタンパク質と、ウルトラスピラクルタンパク質の脊椎動物ホモロ
グ、レチノイン酸X受容体（「RXR」）タンパク質またはUSPおよびRXRのキメラとのヘテロ
二量体でもありうる。EcR複合体なる用語は、EcRタンパク質またはUSPのホモ二量体複合
体も含む。
EcR複合体は、EcRを含むが、複合体の他のタンパク質を除外することはない、複合体の
タンパク質の1つに結合した活性エクジステロイドまたは非ステロイドリガンドによって
活性化することができる。本明細書において用いられる「リガンド」なる用語は、EcRに
基づく遺伝子スイッチに適用されるとおり、遺伝子スイッチを活性化してその中でコード
されるポリペプチドの発現を刺激する能力を有する、可溶性低分子をいう。リガンドの例
には、エクジソン、20-ヒドロキシエクジソン、ポナステロンA、ムリステロンAなどのエ
クジステロイド、9-シス-レチノイン酸、レチノイン酸の合成類縁体、米国特許第6,013,8
36号；第5,117,057号；第5,530,028号；および第5,378,726号ならびに米国特許公開出願
第2005/0209283号および第2006/0020146号に開示されているものなどのN,N'-ジアシルヒ
ドラジン；米国特許公開出願第2004/0171651号に記載のオキサジアゾリン；欧州特許出願
第461,809号に開示されているものなどのジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン；米国
特許第5,225,443号に開示されているものなどのN-アルキル-N,N'-ジアロイルヒドラジン
；欧州特許出願第234,994号に開示されているものなどのN-アシル-N-アルキルカルボニル
ヒドラジン；米国特許第4,985,461号に記載のものなどのN-アロイル-N-アルキル-N'-アロ
イルヒドラジン；米国特許公開出願第2004/0049037号に記載のものなどのアミドケトン；
および3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシ-N-イソブチル-ベンズアミド、8-O-アセチルハ
ルパギド、オキシステロール、22(R)ヒドロキシコレステロール、24(S)ヒドロキシコレス
テロール、25-エポキシコレステロール、T0901317、5-アルファ-6-アルファ-エポキシコ
レステロール-3-スルフェート（ECHS）、7-ケトコレステロール-3-スルフェート、ファメ
ソール、胆汁酸、1,1-ビホスホン酸エステル、幼若ホルモンIIIなどを含む他の類似の材
料が含まれるが、それらに限定されるわけではない。本発明において有用なジアシルヒド
ラジンリガンドの例には、RG-115819（3,5-ジメチル-安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル
-プロピル)-N'-(2-メチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド）、RG-115932（(R)-3,5-
ジメチル-安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N'-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒ
ドラジド）、およびRG-115830（3,5-ジメチル-安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N'-(2
-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド）が含まれる。本発明の実施において有用
なその他のジアシルヒドラジンについては、2008年5月29日提出の米国特許出願第12/155,
111号、および2008年5月29日提出のPCT/US2008/006757を参照されたい。
EcR複合体は、すべてのメンバーがアミノ末端トランス活性化ドメイン（「TA」）、DNA
結合ドメイン（「DBD」）、およびヒンジ領域によって分離されたリガンド結合ドメイン
（「LBD」）の存在によって特徴付けられる、核内受容体スーパーファミリーのメンバー
であるタンパク質を含む。このファミリーのいくつかのメンバーは、LBDのカルボキシ末
端側に別のトランス活性化ドメインを有していてもよい。DBDは、その間が2つのアミノ酸
モティーフである2つのシステイン亜鉛フィンガー、エクジソン応答エレメントに対する
特異性を付与するP-ボックスおよびD-ボックスの存在によって特徴付けられる。これらの
ドメインは天然、修飾、または異種受容体タンパク質の異なるドメインのキメラのいずれ
であってもよい。
外来遺伝子、応答エレメント、およびEcR複合体を構成するDNA配列を古細菌、大腸菌、
枯草菌（Bacillus subtilis）、もしくは他の腸内細菌などの原核細胞、または植物もし
くは動物細胞などの真核細胞に組み込んでもよい。しかし、遺伝子によって発現されるタ
ンパク質の多くは細菌中で間違って処理されるため、真核細胞が好ましい。細胞は単細胞
または多細胞生物の形でありうる。外来遺伝子、応答エレメント、および受容体複合体の
ヌクレオチド配列を、RNA分子として、好ましくはタバコモザイクウイルスなどの機能的
ウイルスRNAの形で組み込むこともできる。真核細胞のうち、脊椎動物細胞は本来、EcRに
対する本発明のリガンドへの応答を付与する分子を欠くため、これらが好ましい。その結
果、脊椎動物細胞は本発明のリガンドに対して「実質的に非感受性」である。したがって
、本発明において有用なリガンドは、形質転換細胞、またはまるごとの生物に対して、無
視できる生理学的または他の影響を有することになる。したがって、細胞は、リガンド自
体の存在によって実質的に影響されることなく、成長し、所望の産物を発現することがで
きる。
EcRリガンドは、続いて外来遺伝子（例えば、IL-12）に連結された応答エレメントに結
合するEcR複合体と共に用いる場合、外来遺伝子の発現を外部から一時的に調節する手段
を提供する。様々な成分が互いに、すなわち、リガンドから受容体複合体および受容体複
合体から応答エレメントに結合する順序は重要ではない。典型的には、外来遺伝子の発現
の調節はEcR複合体の特定の制御、または調節DNAエレメントへの結合に応答している。Ec
Rタンパク質は、核内受容体ファミリーの他のメンバーと同様、少なくとも3つのドメイン
、すなわちトランス活性化ドメイン、DNA結合ドメイン、およびリガンド結合ドメインを
有する。この受容体は、核内受容体ファミリーのサブセットと同様、ヘテロ二量体化特性
を担う、あまり明確に規定されていない領域も有する。USPまたはRXRタンパク質とのヘテ
ロ二量体化後の、リガンドのEcRタンパク質のリガンド結合ドメインへの結合は、ヘテロ
二量体タンパク質のDNA結合ドメインが活性化型の応答エレメントに結合するのを可能に
し、したがって外来遺伝子の発現または抑制を引き起こす。このメカニズムはリガンドの
EcRまたはUSPへの結合と、その結果としての活性ホモ二量体複合体（例えば、EcR+EcRま
たはUSP+USP）の形成の可能性を除外するものではない。一つの態様において、受容体ド
メインの1つまたは複数が変動して、キメラ遺伝子スイッチを生成することができる。典
型的には、キメラ受容体が選択した宿主細胞または生物中で、トランス活性化特性、リガ
ンドの相補的結合、および特定の応答エレメントの認識について最適化されるように、3
つのドメインの1つまたは複数を、他のドメインの源とは異なる源から選択してもよい。
加えて、応答エレメント自体を、酵母由来のGAL-4タンパク質（Sadowski et al., Nature
335:563 (1988)参照）または大腸菌由来のLexAタンパク質（Brent et al., Cell 43:729
(1985)参照）などの他のDNA結合タンパク質ドメインに対する応答エレメントで修飾また
は置換して、キメラEcR複合体を適応させることもできる。キメラシステムの別の利点は
、所望の最終結果に応じて外来遺伝子を駆動するために用いるプロモーターの選択が可能
になることである。そのような二重制御は、発現のタイミングならびに発現が起こる細胞
の両方を制御しうるため、遺伝子療法の分野において、特に細胞毒性タンパク質が生成さ
れる場合に、特に重要である。適当なプロモーターに機能的に連結された外来遺伝子を対
象の細胞に導入する場合、外来遺伝子の発現を本発明のリガンドの存在によって制御する
。プロモーターは構成的もしくは誘導的に調節してもよく、または組織特異的（すなわち
、特定の型の細胞においてのみ発現される）もしくは生物の特定の発生段階に特異的であ
ってもよい。
転写因子およびレポータータンパク質などの様々なポリペプチドをコードする多くのゲ
ノムおよびcDNA核酸配列が当技術分野において周知である。当業者であれば、実質的にす
べての公知の遺伝子に関する核酸配列情報を利用することができ、公の供託所、配列を公
表した施設から核酸分子を直接得るか、または分子を調製するための日常的方法を用いる
ことができる。例えば、下記の配列アクセッション番号の記載を参照されたい。
遺伝子スイッチは、特定のリガンドの添加または除去によって遺伝子発現を調節する任
意の遺伝子スイッチシステムでありうる。一つの態様において、遺伝子スイッチは、その
中で遺伝子発現のレベルが存在するリガンドのレベルに依存するものである。本発明の遺
伝子スイッチにおいて用いうるリガンド依存的転写因子の例には、それぞれのリガンド（
例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、レチノイド、エクジソン、
ならびにその類縁体および類似物質）によって活性化する核内受容体スーパーファミリー
のメンバーおよびテトラサイクリンによって活性化するrTTAが含まれるが、それらに限定
されるわけではない。本発明の一つの局面において、遺伝子スイッチはEcRに基づく遺伝
子スイッチである。そのようなシステムの例には、米国特許第6,258,603号、第7,045,315
号、米国特許公開出願第2006/0014711号、第2007/0161086号、および国際公開公報第01/7
0816号に記載のシステムが含まれるが、それらに限定されるわけではない。キメラエクジ
ソン受容体システムの例は、米国特許第7,091,038号、米国特許公開出願第2002/0110861
号、第2004/0033600号、第2004/0096942号、第2005/0266457号、および第2006/0100416号
、ならびに国際公開公報第01/70816号、第02/066612号、第02/066613号、第02/066614号
、第02/066615号、第02/29075号、および第2005/108617号に記載されている。非ステロイ
ドエクジソンアゴニスト調節システムの例は、RheoSwitch(登録商標) Mammalian Inducib
le Expression System（New England Biolabs, Ipswich, MA）である。
一つの態様において、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドは、プロモーター
の制御下でリガンド依存的転写因子をコードする1つの転写因子配列を含む。転写因子配
列は、天然または人工転写因子であるリガンド依存的転写因子をコードしうる。人工転写
因子は、転写因子の天然の配列が、例えば、配列の突然変異により、または異なる転写因
子からのドメインの組み合わせにより、変更されているものである。一つの態様において
、転写因子はグループH核内受容体リガンド結合ドメイン（LBD）を含む。一つの態様にお
いて、グループH核内受容体LBDはEcR、遍在性受容体、オーファン受容体1、NER-1、ステ
ロイドホルモン核内受容体1、レチノイドX受容体相互作用タンパク質-15、肝臓X受容体β
、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓X受容体、肝臓X受容体α、ファルネソイ
ドX受容体、受容体相互作用タンパク質14、またはファルネソール受容体からのものであ
る。別の態様において、グループH核内受容体LBDはエクジソン受容体からのものである。
EcRおよび他のグループH核内受容体は、すべてのメンバーが一般にアミノ末端トランス
活性化ドメイン（TD）、DNA結合ドメイン（DBD）、およびヒンジ領域によってDBDから分
離されたLBDの存在によって特徴付けられる、核内受容体スーパーファミリーのメンバー
である。本明細書において用いられる「DNA結合ドメイン」なる用語は、DNA結合ドメイン
が特定の応答エレメントと結合するよう機能する限り、DNA結合タンパク質の全長までのD
NA結合タンパク質の最小ポリペプチド配列を含む。核内受容体スーパーファミリーのメン
バーは、4または5つのドメイン：A/B、C、D、E、およびいくつかのメンバーではFの存在
によっても特徴付けられる（米国特許第4,981,784号およびEvans, Science 240:889 (198
8)参照）。「A/B」ドメインはトランス活性化ドメインに対応し、「C」はDNA結合ドメイ
ンに対応し、「D」はヒンジ領域に対応し、かつ「E」はリガンド結合ドメインに対応する
。このファミリーのいくつかのメンバーは、「F」に対応するLBDのカルボキシ末端側に別
のトランス活性化ドメインを有することもある。
DBDは、その間が2つのアミノ酸モティーフである2つのシステイン亜鉛フィンガー、応
答エレメントに対する特異性を付与するP-ボックスおよびD-ボックスの存在によって特徴
付けられる。これらのドメインは天然、修飾、または異種受容体タンパク質の異なるドメ
インのキメラのいずれであってもよい。EcRは、核内受容体ファミリーのサブセットと同
様、ヘテロ二量体化特性を担う、あまり明確に規定されていない領域も有する。核内受容
体のドメインは本来モジュール式であるため、LBD、DBD、およびTDは相互交換してもよい
。
別の態様において、転写因子はTD、発現が調節される外来遺伝子と結合している応答エ
レメントを認識するDBD；およびグループH核内受容体LBDを含む。特定の態様において、
グループH核内受容体LBDは置換突然変異を含む。
他の態様において、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドは、第一のプロモー
ター制御下の第一の転写因子配列および第二のプロモーター制御下の第二の転写因子配列
を含み、ここで該第一の転写因子配列および該第二の転写因子配列によってコードされる
タンパク質は相互作用して、リガンド依存的転写因子として機能するタンパク質複合体、
すなわち、「二重スイッチ」または「2ハイブリッド」の遺伝子スイッチを形成する。第
一および第二のプロモーターは同じでも異なっていてもよい。
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドは、1つのプロモーター制御下の第一の
転写因子配列および第二の転写因子配列を含んでいてもよく、ここで第一の転写因子配列
および第二の転写因子配列によってコードされるタンパク質は相互作用して、リガンド依
存的転写因子として機能するタンパク質複合体、すなわち、「単一遺伝子スイッチ」を形
成する。第一の転写因子配列および第二の転写因子配列は内部リボソーム侵入部位、例え
ば、EMCV IRESによって連結されていてもよい。
一つの態様において、第一の転写因子配列は、TD、発現が調節される外来遺伝子と結合
している応答エレメントを認識するDBD；およびグループH核内受容体LBDを含むポリペプ
チドをコードし、第二の転写因子配列は、脊椎動物RXR LBD、無脊椎動物RXR LBD、ウルト
ラスピラクルタンパク質LBD、および2つのポリペプチド断片を含むキメラLBDから選択さ
れる核内受容体LBDを含む転写因子をコードし、ここで、第一のポリペプチド断片は脊椎
動物RXR LBD、無脊椎動物RXR LBD、またはウルトラスピラクルタンパク質LBDからのもの
であり、第二のポリペプチド断片は異なる脊椎動物RXR LBD、無脊椎動物RXR LBD、または
ウルトラスピラクルタンパク質LBDからのものである。
別の態様において、遺伝子スイッチは、核内受容体LBDおよび発現が調節される外来遺
伝子と結合している応答エレメントを認識するDBDを含む第一のポリペプチドをコードす
る第一の転写因子配列、ならびにTDおよび核内受容体LBDを含む第二のポリペプチドをコ
ードする第二の転写因子配列を含み、ここで核内受容体LBDの1つはグループH核内受容体L
BDである。好ましい態様において、第一のポリペプチドはTDを実質的に含まず、第二のポ
リペプチドはDBDを実質的に含まない。本発明の目的のために、「実質的に含まない」と
は、件のタンパク質が活性化または結合活性を提供するのに十分な件のドメインの配列を
含まないことを意味する。
本発明の別の局面において、第一の転写因子配列はヘテロ二量体パートナーおよびTDを
含むタンパク質をコードし、第二の転写因子配列はDBDおよびLBDを含むタンパク質をコー
ドする。
1つの核内受容体LBDだけがグループH LBDである場合、他の核内受容体LBDはグループH
LBDと二量体を形成する任意の他の核内受容体からのものであってもよい。例えば、グル
ープH核内受容体LBDがEcR LBDである場合、他の核内受容体LBD「パートナー」はEcR、脊
椎動物RXR、無脊椎動物RXR、ウルトラスピラクルタンパク質（USP）、または脊椎動物RXR
、無脊椎動物RXR、およびUSPから選択される、少なくとも2つの異なる核内受容体LBDポリ
ペプチド断片を含むキメラ核内受容体からのものであってもよい（国際公開公報第01/708
16 A2号、国際特許出願第PCT/US02/05235号および米国特許第2004/0096942 A1号参照）。
「パートナー」核内受容体リガンド結合ドメインは、切断突然変異、欠失突然変異、置換
突然変異、または別の修飾をさらに含んでいてもよい。
一つの態様において、脊椎動物RXR LBDはヒト（ヒト、Homo sapiens）、マウス（ハツ
カネズミ、Mus musculus）、ラット（ドブネズミ、Rattus norvegicus）、ニワトリ（チ
ャボ、Gallus gallus）、ブタ（ブタ、Sus scrofa domestica）、カエル（アフリカツメ
ガエル、Xenopus laevis）、ゼブラフィッシュ（ゼブラダニオ、Danio rerio）、ホヤ（
ミサキマメイタボヤ、Polyandrocarpa misakiensis）、またはクラゲ（ミツデリッポウク
ラゲ、Tripedalia cysophora）RXRからのものである。
一つの態様において、無脊椎動物RXRリガンド結合ドメインはトノサマバッタ（トノサ
マバッタ、Locusta migratoria）ウルトラスピラクルポリペプチド（「LmUSP」）、マダ
ニ（アムブリオンマ-アメリカヌム、Amblyomma americanum）RXRホモログ1（「AmaRXR1」
）、マダニ（アムブリオンマ-アメリカヌム）RXRホモログ2（「AmaRXR2」）、シオマネキ
（セルカ-プギレーター、Celuca pugilator）RXRホモログ（「CpRXR」）、カブトムシ（
チャイロコメノゴミムシダマシ、Tenebrio molitor）RXRホモログ（「TmRXR」）、ミツバ
チ（ヨーロッパミツバチ、Apis mellifera）RXRホモログ（「AmRXR」）、アブラムシ（モ
モアカアブラムシ、Myzus persicae）RXRホモログ（「MpRXR」）、または非双翅目（non-
Dipteran）/非鱗翅目（non-Lepidopteran）RXRホモログからのものである。
一つの態様において、キメラRXR LBDは、脊椎動物種RXRポリペプチド断片、無脊椎動物
種RXRポリペプチド断片、および非双翅目/非鱗翅目無脊椎動物種RXRホモログポリペプチ
ド断片から選択される少なくとも2つのポリペプチド断片を含む。本発明で用いるキメラR
XRリガンド結合ドメインは、少なくとも2つの異なる種のRXRポリペプチド断片を含んでい
てもよく、または種が同一である場合、複数のポリペプチド断片はその種のRXRポリペプ
チド断片の複数の異なるアイソフォームからのものであってもよい。
一つの態様において、キメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも1つの脊椎動物種
RXRポリペプチド断片および1つの無脊椎動物種RXRポリペプチド断片を含む。
別の態様において、キメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも1つの脊椎動物種RX
Rポリペプチド断片および1つの非双翅目/非鱗翅目無脊椎動物種RXRホモログポリペプチド
断片を含む。
リガンドは、続いて外来遺伝子に連結された応答エレメントに結合する核内受容体のLB
Dと組み合わせた場合、外来遺伝子の発現の外部からの一時的調節を提供する。本発明の
様々な成分が相互に結合する結合メカニズムまたは順序、すなわち、例えば、リガンドか
らLBD、DBDから応答エレメント、TDからプロモーターなどは重要でない。
特定の例において、グループH核内受容体のLBDおよびその核内受容体LBDパートナーへ
のリガンドの結合は、外来遺伝子の発現を可能にする。このメカニズムは、グループH核
内受容体（GHNR）またはそのパートナーへのリガンド結合、およびその結果としての活性
ホモ二量体複合体（例えば、GHNR＋GHNRまたはパートナー＋パートナー）の形成の可能性
を除外するものではない。好ましくは、1つまたは複数の受容体ドメインが変化してハイ
ブリッド遺伝子スイッチを生じる。典型的には、ハイブリッド遺伝子および得られるハイ
ブリッドタンパク質が選択した宿主細胞または生物中で、トランス活性化活性、リガンド
の相補的結合、および特定の応答エレメントの認識について最適化されるように、3つの
ドメイン、DBD、LBDおよびTDの1つまたは複数を、他のドメインの源とは異なる源から選
択してもよい。加えて、応答エレメント自体を、酵母由来のGAL-4タンパク質（Sadowski
et al., Nature 335:563 (1988)参照）もしくは大腸菌由来のLexAタンパク質（Brent et
al., Cell 43:729 (1985)参照）などの他のDNA結合タンパク質ドメインに対する応答エレ
メント、またはそのような特定の相互作用のために設計、修飾、および選択されたタンパ
ク質との標的化相互作用について特異的な合成応答エレメント（例えば、Kim et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:3616 (1997)参照）で修飾または置換し、ハイブリッド受
容体を適応させることもできる。
機能的EcR複合体はイムノフィリンなどのさらなるタンパク質を含んでいてもよい。転
写因子（DHR38またはベータFTZ-1など）として公知のタンパク質の核内受容体ファミリー
のさらなるメンバーは、EcR、USP、および/またはRXRのリガンド依存的または非依存的パ
ートナーであってもよい。加えて、一般にコアクチベーター（アダプターまたはメディエ
ーターともいう）として公知のタンパク質などの補助因子も必要でありうる。これらのタ
ンパク質はDNAに配列特異的に結合せず、基礎的な転写に関与しない。これらは、クロマ
チン構造に影響することによって、またはアクチベーター開始複合体相互作用を仲介する
ことによって、アクチベーターのDNA結合の刺激を含む、様々なメカニズムを通じて転写
活性化に対するその効果を発揮しうる。そのようなコアクチベーターの例には、RIP140、
TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70、SRC-1/NCoA-1、TIF2/GRIP/NCoA-2、ACTR/AIB1/RAC3/pCIPな
らびに乱交雑コアクチベーターC応答エレメントB結合タンパク質、CBP/p300が含まれる（
総説については、Glass et al., Curr. Opin. Cell Biol. 9:222 (1997)参照）。また、
一般にコリプレッサー（リプレッサー、サイレンサー、またはサイレンシングメディエー
ターとしても公知）として公知のタンパク質補助因子が、リガンド非存在下で転写活性化
を効果的に阻害するのに必要とされることもある。これらのコリプレッサーは、リガンド
結合していないEcRと相互作用して、応答エレメントにおける活性をサイレントとするこ
ともある。現在の証拠は、リガンドの結合が受容体の立体配座を変化させ、その結果、コ
リプレッサーが放出され、前述のコアクチベーターが動員され、それにより、それらのサ
イレンシング活性がなくなることを示唆している。コリプレッサーの例には、N-CoRおよ
びSMRTが含まれる（総説については、Horwitz et al., Mol Endocrinol. 10:1167 (1996)
参照）。これらの補助因子は細胞または生物内で内因性であってもよく、または調節また
は非調節いずれかの様式で発現される導入遺伝子として外因的に添加してもよい。
外来遺伝子は、遺伝子スイッチによってコードされるリガンド依存的転写因子のDBDに
よって認識される少なくとも1つの応答エレメントを含むプロモーターに機能的に連結さ
れている。一つの態様において、プロモーターは応答エレメントの1、2、3、4、5、6、7
、8、9、10、またはそれ以上のコピーを含む。所望の応答エレメントを含むプロモーター
は、天然プロモーターまたは当技術分野において周知の技術、例えば、最小プロモーター
に機能的に連結された1つまたは複数の応答エレメントを用いて作成された人工プロモー
ターであってもよい。
ポリヌクレオチドを細胞に導入するために、ベクターを用いることができる。ベクター
は、例えば、プラスミドベクターまたは一本もしくは二本鎖RNAもしくはDNAウイルスベク
ターであってもよい。そのようなベクターを細胞に、DNAおよびRNAを細胞に導入するため
の周知の技術によって導入してもよい。ウイルスベクターは、複製能を有していてもよく
、または複製能を欠損していてもよい。後者の場合、ウイルス増殖は一般に相補性宿主細
胞でのみ起こることになる。本明細書において用いられる「宿主細胞」または「宿主」な
る用語は、1つまたは複数の本発明のポリヌクレオチドを有している本発明の細胞を意味
するために用いられる。
したがって、最低限でも、ベクターは本発明のポリヌクレオチドを含まなければならな
い。ベクターの他の成分には、選択可能マーカー、クロマチン修飾ドメイン、ベクター上
に同様に存在しうる他のポリペプチド（例えば、致死的ポリペプチド）の発現を駆動する
追加のプロモーター、ゲノム組込み部位、組換え部位、および分子挿入中心が含まれうる
が、それらに限定されるわけではない。ベクターは、所望の治療法の特定のゴールに合わ
せられるように、任意の数のこれらの追加要素をポリヌクレオチド内またはポリヌクレオ
チド外のいずれかに含んでいてもよい。
本発明の一つの態様において、細胞に導入するベクターは、発現されると、本発明の遺
伝子スイッチ作成物が宿主細胞のゲノムに組み込まれていることを示す「選択可能マーカ
ー遺伝子」をさらに含む。この様式において、選択遺伝子はゲノム組込みの陽性マーカー
でありうる。本発明の方法にとって重要ではないが、選択可能マーカー遺伝子の存在は、
実施者にとってベクター作成物が細胞のゲノムに組み込まれている生存細胞の集団を選択
することを可能にする。したがって、本発明の特定の態様は、ベクターがうまく組み込ま
れている細胞を選択することを含む。本明細書において用いられる「選択する」なる用語
またはその変形は、細胞と共に用いられる場合、特定の遺伝的性質または表現型を有する
細胞を選ぶための標準的な周知の方法を意味することが意図される。典型的方法には、細
胞をG418、ネオマイシンおよびアンピシリンなどの抗生物質存在下で培養する方法が含ま
れるが、それらに限定されるわけではない。選択可能マーカー遺伝子の他の例には、ジヒ
ドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシン、またはミコフェノール酸に対する耐性を付与
する遺伝子が含まれるが、それらに限定されるわけではない。他の選択法には、選択物質
としてチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
またはアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼの使用を可能にする選択可能マーカー
遺伝子が含まれるが、それらに限定されるわけではない。抗生物質耐性遺伝子を含むベク
ター作成物を含む細胞は、したがって、培養中に抗生物質に耐容可能であろう。同様に、
抗生物質耐性遺伝子を含むベクター作成物を含まない細胞は、培養中に抗生物質に耐容不
可能であろう。
本明細書において用いられる「クロマチン修飾ドメイン」（CMD）とは、DNAインスレー
ターなどであるが、それらに限定されるわけではない、クロマチン構造の維持および/ま
たは改変に関連する様々なタンパク質と相互作用するヌクレオチド配列を意味する。Ciav
atta et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A., 103:9958 (2006)参照。CMDの例には、ニ
ワトリβ-グロブリンインスレーターおよびニワトリ高感受性部位4（cHS4）が含まれるが
、それらに限定されるわけではない。1つまたは複数の遺伝子プログラム（すなわち、プ
ロモーター、コード配列、および3'調節領域）の間の異なるCMD配列の使用は、例えば、
既存の複遺伝子および一遺伝子シャトルベクターの間で遺伝子プログラムを「交換」する
ための様々な微生物またはインビトロリコンビニアリング技術と組み合わせての、「ミニ
相同性アーム」としての差次的CMD DNA配列の使用を容易にしうる。クロマチン修飾ドメ
インの他の例は、当技術分野において公知であるか、または容易に特定することができる
。
本発明と共に用いるための特定のベクターは、タンパク質またはポリヌクレオチドをコ
ードする発現ベクターである。一般に、そのようなベクターは、発現されるポリヌクレオ
チドに機能的に連結された宿主における発現に効果的なシス作用性制御領域を含む。適当
なトランス作用性因子は宿主によって供給されるか、相補性ベクターによって供給される
か、または宿主への導入後にベクター自体によって供給される。
多様な発現ベクターを用いて、タンパク質またはポリヌクレオチドを発現することがで
きる。そのようなベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来ベクター、例え
ば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、酵母エピソーム由来、酵母染色体成
分由来、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、SV40などのパポバウ
イルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよ
びレトロウイルスなどのウイルス由来のベクター、ならびにコスミドおよびファージミド
などの、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子成分由来のものなどの、その組み合
わせ由来のベクターが含まれる。本発明の本局面に従っての発現のためにすべてを用いて
もよい。一般に、宿主中でポリヌクレオチドまたはタンパク質を維持する、増加させる、
または発現するのに適した任意のベクターを、これに関する発現のために用いてもよい。
発現ベクターにおけるポリヌクレオチド配列を、例えば、mRNA転写を誘導するプロモー
ターを含む、適当な発現制御配列に機能的に連結する。さらなるプロモーターの代表例に
は、構成的プロモーターおよび組織特異的または誘導性プロモーターが含まれるが、それ
らに限定されるわけではない。構成的真核生物プロモーターの例には、マウスメタロチオ
ネインI遺伝子のプロモーター（Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273 (1982)）；ヘ
ルペスウイルスのTKプロモーター（McKnight, Cell 31:355 (1982)）；SV40初期プロモー
ター（Benoist et al., Nature 290:304 (1981)）；およびワクシニアウイルスプロモー
ターが含まれるが、それらに限定されるわけではない。タンパク質またはポリヌクレオチ
ドの発現を駆動するために用いうるプロモーターのさらなる例には、アルブミンプロモー
ター（肝細胞）、プロインスリンプロモーター（膵臓ベータ細胞）などの、組織特異的プ
ロモーターおよび他の特定のタンパク質に対する内因性プロモーターが含まれるが、それ
らに限定されるわけではない。一般に、発現作成物は転写、開始および終止のための部位
、ならびに転写された領域では、翻訳のためのリボソーム結合部位を含むことになる。作
成物によって発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳されるポリペプチドの始まりに
翻訳開始AUGおよび末端に適当に配置された終止コドン（UAA、UGAまたはUAG）を含みうる
。
加えて、作成物は発現を調節し、ならびに発生させる制御領域を含みうる。一般に、特
にリプレッサー結合部位およびエンハンサーなどの、そのような領域は、転写を制御する
ことにより作動することになる。
真核生物ベクターの例には、Stratageneから市販されているpW-LNEO、pSV2CAT、pOG44
、pXT1およびpSG；Amersham Pharmacia Biotechから市販されているpSVK3、pBPV、pMSGお
よびpSVL；ならびにClontechから市販されているpCMVDsRed2-express、pIRES2-DsRed2、p
DsRed2-Mito、およびpCMV-EGFPが含まれるが、それらに限定されるわけではない。多くの
他のベクターが周知で、市販されている。
遺伝子プログラムの成分の迅速な挿入および除去のための分子挿入中心を含む、特に有
用なベクターは、米国特許公開出願第2004/0185556号、米国特許出願第11/233,246号およ
び国際公開公報第2005/040336号および第2005/116231号に記載されている。そのようなベ
クターの例は、国際公開公報第2007/038276号に記載のUltra Vector(商標) Production S
ystem（Intrexon Corp., Blacksburg, VA）である。本明細書において用いられる「遺伝
子プログラム」は、プロモーター（P）、発現配列（E）および3'調節配列（3）を含む遺
伝子成分の組み合わせであり、したがって「PE3」は遺伝子プログラムである。遺伝子プ
ログラム内の成分は、遺伝子プログラムの成分それぞれに隣接する分子中心の間で容易に
交換することができる。本明細書において用いられる分子中心は、少なくとも2つの直線
に配列された非可変の珍しい、または一般的でない制限部位を含むポリヌクレオチドと定
義される。一つの態様において、分子中心は、少なくとも3つの直線に配列された非可変
の珍しい、または一般的でない制限部位を含む。典型的に、任意の1つの分子中心は、同
じ遺伝子プログラム内の任意の他の分子中心の珍しい、または一般的でない制限部位を含
むことはない。それに対して所与の制限酵素が作用する、6を越えるヌクレオチドの同族
配列は「珍しい」制限部位と呼ばれる。しかし、統計学的に予測されるよりも出現頻度が
低い6bpの制限部位があり、これらの部位およびそれらを切断するエンドヌクレアーゼは
「一般的でない」制限部位と呼ばれる。珍しい、または一般的でない制限酵素の例には、
AsiS I、Pac I、Sbf I、Fse I、Asc I、Mlu I、SnaB I、Not I、Sal I、Swa I、Rsr II、
BSiW I、Sfo I、Sgr AI、AflIII、Pvu I、Ngo MIV、Ase I、Flp I、Pme I、Sda I、Sgf I
、Srf I、およびSse8781 Iが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
ベクターは、ホーミングエンドヌクレアーゼ（HE）酵素と呼ばれる第二のクラスの制限
酵素の制限部位も含みうる。HE酵素は大きく、非対称の制限部位（12〜40塩基対）を有し
、その制限部位は本来まれである。例えば、I-SceIとして公知のHEは18bpの制限部位
Figure 2016128451
を有し、無作為配列の7×1010塩基対あたり1回しか出現しないと予想される。この出現率
は、哺乳動物ゲノムの20倍のサイズのゲノムでわずか1部位に等しい。HE部位の珍しさは
、HE部位がクローニングベクタープラスミド中の適当な位置に含まれていた場合、遺伝子
操作が、遺伝子プログラムの完全性を壊すことなく、遺伝子プログラムを切断しうる可能
性を大幅に高める。
宿主細胞における発現のための適当なベクターおよびプロモーターの選択は公知の手法
であり、ベクター構築および宿主細胞への導入、ならびに宿主中での発現に必要な技術は
、当技術分野における日常的技術である。
ポリヌクレオチドの細胞への導入は、ベクターの一時的トランスフェクション、安定ト
ランスフェクション、または遺伝子座特異的挿入でありうる。ベクターの宿主細胞への一
時的および安定トランスフェクションは、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE
-デキストラン仲介トランスフェクション、カチオン脂質仲介トランスフェクション、電
気穿孔法、形質導入、感染、または他の方法によって行うことができる。そのような方法
は、Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)；Keown et al., 1990,
Methods Enzymol. 185: 527-37；Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Labor
atory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.などの、多
くの標準的実験マニュアルに記載されている。これらの安定形質転換法は、細胞のゲノム
中へのベクターの無作為挿入をもたらす。さらに、ベクターのコピー数および配向も、一
般に、無作為である。
本発明の一つの態様において、ベクターをゲノム中の生物中性部位に挿入する。生物中
性部位は、ポリヌクレオチドの挿入が細胞の正常な機能を妨害したとしても非常にわずか
である、ゲノム中の部位である。生物中性部位は利用可能な生物情報学を用いて解析して
もよい。多くの生物中性部位、例えば、ROSA等価性遺伝子座が当技術分野において公知で
ある。他の生物中性部位は、当技術分野において周知の日常的技術を用いて特定してもよ
い。ゲノム挿入部位の特徴づけは、当技術分野において公知の方法を用いて実施する。ベ
クターを細胞に導入する際にポリヌクレオチドの位置、コピー数および/または配向を制
御するために、遺伝子座特異的挿入の方法を用いてもよい。遺伝子座特異的挿入の方法は
当技術分野において周知で、相同組換えおよびリコンビナーゼ仲介ゲノム挿入が含まれる
が、それらに限定されるわけではない。もちろん、遺伝子座特異的挿入法を本発明の方法
において用いる場合、ベクターは、相同組換えなどであるが、それらに限定されるわけで
はない、この遺伝子座特異的挿入を助ける成分を含んでいてもよい。例えば、ベクターは
1、2、3、4またはそれ以上のゲノム組込み部位（GIS）を含んでいてもよい。本明細書に
おいて用いられる「ゲノム組込み部位」は、そのヌクレオチド配列が、ベクターのゲノム
への挿入を可能にする細胞内のゲノムの一部と同一またはほぼ同一である、ベクター配列
の部分と定義される。特に、ベクターは少なくともポリヌクレオチドに隣接する2つのゲ
ノム挿入部位を含んでいてもよい。もちろん、GISはさらなる成分、またはベクター上に
存在するすべての成分にさえ、隣接していてもよい。
別の態様において、遺伝子座特異的挿入はリコンビナーゼ部位特異的遺伝子挿入によっ
て実施してもよい。簡単に言えば、PhiC31インテグラーゼなどであるが、それらに限定さ
れるわけではない、細菌リコンビナーゼ酵素は、ヒトゲノム内の「偽」組換え部位におい
て作用することができる。これらの偽組換え部位はリコンビナーゼを用いての遺伝子座特
異的挿入の標的でありうる。リコンビナーゼ部位特異的遺伝子挿入は、Thyagarajan et a
l., Mol. Cell Biol. 21:3926 (2001)に記載されている。リコンビナーゼ部位特異的遺伝
子挿入に用いうるリコンビナーゼおよびそのそれぞれの部位の他の例には、R4およびTP90
1-1などのセリンリコンビナーゼならびに国際公開公報第2006/083253号に記載のリコンビ
ナーゼが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
さらなる態様において、ベクターは化学的抵抗遺伝子、例えば、多剤耐性遺伝子mdr1、
ジヒドロ葉酸レダクターゼ、またはO6-アルキルグアニン-DNAアルキルトランスフェラー
ゼを含んでいてもよい。化学物質抵抗性遺伝子は構成的（例えば、CMV）または誘導性（
例えば、RheoSwitch(登録商標)）プロモーターの制御下でありうる。本態様において、対
象の疾患を治療する一方で、対象内の改変細胞を維持することが望まれる場合、医師は患
部細胞を破壊するために化学療法剤を適用しうる一方で、改変細胞は適当な化学物質抵抗
性遺伝子の発現により薬剤から保護され、疾患または障害の治療、改善、または予防のた
めに使われ続けてもよい。化学物質抵抗性遺伝子を誘導性プロモーター下に置くことによ
り、化学物質抵抗性遺伝子の不必要な発現を避けることができ、さらに継続治療が必要と
される場合には利用可能となるであろう。改変細胞自体が患部となった場合、それらは以
下に記載する致死的ポリペプチドの発現を誘導することにより破壊することができよう。
本発明の方法は、遺伝子スイッチおよび外来遺伝子をコードするポリヌクレオチドを対
象の細胞に導入することにより実施する。前述のものなどの当技術分野において公知の、
ポリヌクレオチドを細胞に導入するための任意の公知の方法を用いることができる。
ポリヌクレオチドを細胞にエクスビボで導入する場合、細胞を対象から、生検、擦過、
および外科的組織摘出を含むが、それらに限定されるわけではない、当技術分野において
公知の任意の技術によって得てもよい。単離した細胞を、ポリヌクレオチドを細胞に導入
するのに十分な時間、例えば、2、4、6、8、10、12、18、24、36、48時間またはそれ以上
培養してもよい。一次細胞を短期間培養するための方法は当技術分野において周知である
。例えば、細胞をプレート（例えば、マイクロウェルプレート）に接着させるか、または
懸濁液のいずれかで培養してもよい。
エクスビボでの治療法のために、細胞を対象から単離し、ポリヌクレオチドを細胞に導
入するのに適した条件下で培養する。ポリヌクレオチドが細胞にいったん導入されれば、
細胞をリガンド依存的転写因子が発現されるのに十分な期間、例えば、0.5、1、2、3、4
、5、6、7、8、9、10、12、18、もしくは24時間またはそれ以上インキュベートする。ポ
リヌクレオチドを細胞に導入した後のある時点（かなりのレベルのリガンド依存的転写因
子が発現される前または後のいずれか）で、細胞を対象に再導入する。再導入は、当技術
分野において公知の任意の方法、例えば、静脈内注入または組織もしくは腔への直接注射
によって行いうる。一つの態様において、細胞を対象に再導入する前に、細胞におけるポ
リヌクレオチドの存在を調べる。別の態様において、ポリヌクレオチドを含む細胞を選択
し（例えば、ポリヌクレオチドにおける選択可能マーカーの存在により）、ポリヌクレオ
チドを含む細胞のみを対象に再導入する。細胞を対象に再導入した後、リガンドを対象に
投与して、治療的ポリペプチドまたは治療的ポリヌクレオチドの発現を誘導する。別の態
様において、治療的ポリペプチドまたは治療的ポリヌクレオチドが細胞の再導入前に発現
されるように、細胞を対象に再導入する前にリガンドを細胞に加えてもよい。リガンドは
、全身（例えば、経口、静脈内）または局所（例えば、腹腔内、クモ膜下、脳室内、また
は細胞を再導入する組織もしくは器官、例えば、腫瘍内への直接注射）のいずれかで、任
意の適当な方法により投与してもよい。リガンド投与の最適なタイミングは、日常的技術
だけを用いて、細胞の型および疾患または障害それぞれについて決定することができる。
本発明のインビボでの治療法は、対象の細胞へのポリヌクレオチドの直接インビボ導入
を含む。ポリヌクレオチドは対象に全身または局所（例えば、疾患または障害の部位）的
に導入してもよい。ポリヌクレオチドが対象にいったん導入されれば、リガンドを投与し
て、治療的ポリペプチドまたは治療的ポリヌクレオチドの発現を誘導してもよい。リガン
ドは、全身（例えば、経口、静脈内）または局所（例えば、腹腔内、クモ膜下、脳室内、
または疾患もしくは障害が起こっている組織もしくは器官、例えば、腫瘍内への直接注射
）のいずれかで、任意の適当な方法により投与してもよい。リガンド投与の最適なタイミ
ングは、日常的技術だけを用いて、細胞の型および疾患または障害それぞれについて決定
することができる。
インビボでの使用のために、本明細書に記載のリガンドを、例えば、液剤、懸濁剤、錠
剤、カプセル剤、軟膏、エリキシル剤、および注射可能な組成物などの、薬学的に許容さ
れる担体に取り込んでもよい。薬学的組成物は0.01重量％から99重量％のリガンドを含ん
でいてもよい。組成物は単一または複数用量剤形であってもよい。任意の特定の薬学的組
成物におけるリガンドの量は、有効用量、すなわち、所望の遺伝子発現または抑制を誘発
するのに必要な用量に依存することになる。
薬学的製剤の適当な投与経路には、経口、直腸、局所（皮膚、口腔内および舌下を含む
）、膣、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、クモ膜下、および硬膜外を含む）、およ
び経鼻胃管を含む。当業者であれば、好ましい投与経路は治療中の状態に依存することに
なり、受容者の状態などの因子によって変動しうることを理解するであろう。
本明細書において用いられる「rAD.RheoIL12」なる用語は、RheoSwitch(登録商標) The
rapeutic System（RTS）の遺伝子スイッチ制御下のIL-12遺伝子を有するアデノウイルス
ポリヌクレオチドベクターであって、活性化リガンド存在下でIL-12タンパク質を産生可
能なベクターを意味する。
本明細書において用いられる「IL-12p70」なる用語は、一般にp40およびp35と呼ばれる
2つのサブユニットを天然に有する、IL-12タンパク質を意味する。IL-12p70なる用語は、
IL-12（p40およびp35）の2つのサブユニットを含む融合タンパク質であって、サブユニッ
トの間にリンカーアミノ酸を含んでいてもよい、融合タンパク質を含む。
本明細書において用いられる「IL-12の機能を有するタンパク質」なる用語は、ヒトIL-
12の任意の生物活性の少なくとも20％（例えば、少なくとも30％、40％、50％、60％、70
％、80％、90％、95％、99％、または100％）を有するタンパク質を意味する。IL-12の生
物活性は当技術分野において周知で、天然T細胞のTh1細胞への分化、T細胞の成長および
機能の刺激、T細胞およびナチュラルキラー（NK）細胞からのインターフェロン-ガンマ（
IFN-γ）および腫瘍壊死因子-アルファ（TNF-α）の産生、IFN-γのIL-4仲介抑制の低減
、NK細胞およびCD8+細胞毒性Tリンパ球の細胞毒性の増強、IL-12R-β1およびIL-12R-β2
の発現の刺激、ならびに抗脈管形成活性が含まれるが、それらに限定されるわけではない
。「IL-12の機能を有するタンパク質」なる用語は、野生型配列がアミノ酸の付加、欠失
、または置換の1つまたは複数によって改変されている、野生型IL-12配列の突然変異体、
ならびにIL-12の生物活性の1つまたは複数を模擬する非IL-12タンパク質を含む。
本明細書において用いられる「rAd.cIL12」なる用語は、構成的プロモーター制御下のI
L-12遺伝子を含むアデノウイルスポリヌクレオチド制御ベクターを意味する。
本明細書において用いられる「活性化」または「活性化する」なる用語は、興味対象（
例えば、IL-12タンパク質）の遺伝子の発現を引き起こす、遺伝子スイッチの細胞活性に
おける任意の測定可能な増加を意味する。
本明細書において用いられる疾患の「治療すること」または「治療」なる用語は、疾患
の徴候または症状を軽減するために、1つまたは複数の薬物またはインビトロで遺伝子操
作した細胞を哺乳動物（ヒトまたは非ヒト）に投与することを含みうる、プロトコルを実
行することを意味する。したがって、「治療すること」または「治療」は、必ずしも徴候
または症状の完全な軽減が必要であると解釈すべきではなく、治癒を必要とはせず、特に
対象に対してわずかな効果しかないプロトコルを含む。
本明細書において用いられる「免疫細胞」には、樹状細胞、マクロファージ、好中球、
肥満細胞、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞およびリンパ球（例えば、BおよびT
細胞）が含まれる。
本明細書において用いられる「樹状細胞」および「DC」なる用語は、交換可能に用いら
れる。
本明細書において用いられる「治療補助細胞」（TSC）なる用語は、免疫調節物質の機
能を有する1つまたは複数のタンパク質、および任意に、IL-12の機能を有するタンパク質
を腫瘍微環境に送達するために、本発明のベクターで改変（例えば、形質移入）しうる細
胞である。そのようなTSCには、幹細胞、線維芽細胞、内皮細胞および角化細胞が含まれ
るが、それらに限定されるわけではない。
本明細書において用いられる「インビトロで遺伝子操作した樹状細胞」または「インビ
トロで遺伝子操作した樹状細胞の集団」または「インビトロで遺伝子操作したDC」または
「遺伝子操作した樹状細胞の集団」または「IL-12を発現するDC」または「DC.RheoIL12」
なる用語は、活性化リガンドによって活性化することができる、遺伝子スイッチの制御下
でIL-12を条件的に発現する樹状細胞を意味する。
本明細書において用いられる「インビトロで遺伝子操作したTSC」または「インビトロ
で遺伝子操作したTSCの集団」または「遺伝子操作したTSCの集団」または「免疫調節物質
を発現するTSC」または「IL-12を発現するTSC」なる用語は、場合により活性化リガンド
によって活性化することができる、遺伝子スイッチの制御下で免疫調節物質および/また
はIL-12を条件的に発現する、治療補助細胞、例えば、幹細胞、線維芽細胞、内皮細胞お
よび角化細胞を意味する。
本明細書において用いられる「MOI」または「感染多重度」なる用語は、特定の実験（
例えば、組換えアデノウイルスまたは制御アデノウイルス）において1つの細胞に感染す
るアデノウイルス粒子の平均数を意味する。
本明細書において用いられる「腫瘍」なる用語は、前癌性または癌性細胞および/また
は組織のいずれであろうと、インビボまたはインビトロいずれかでのすべての良性または
悪性細胞成長および増殖を意味する。
本発明に従って治療することができる癌の例には、乳癌、前立腺癌、リンパ腫、皮膚癌
、膵臓癌、結腸癌、黒色腫、悪性黒色腫、卵巣癌、脳癌、原発性脳癌腫、頭頸部癌、神経
膠腫、神経膠芽腫、肝臓癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頭部または頸部癌、乳癌腫、卵巣癌
腫、肺癌腫、小細胞肺癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌腫、精巣癌腫、膀胱癌腫、膵臓癌
腫、胃癌腫、結腸癌腫、前立腺癌腫、尿生殖器癌腫、甲状腺癌腫、食道癌腫、骨髄腫、多
発性骨髄腫、副腎癌腫、 腎細胞癌腫、子宮内膜癌腫、副腎皮質癌腫、悪性膵島細胞腺腫
、悪性類癌腫、絨毛癌、菌状息肉腫、悪性高カルシウム血症、子宮頸過形成、白血病、急
性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢
性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、ヘアリーセル白血病、神経芽細胞腫、横紋筋肉
腫、カポジ肉腫、真性多血症、本態性血小板増多症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、
軟部組織肉腫、骨原性肉腫、原発性マクログロブリン血症、および網膜芽細胞腫などが含
まれる。
本発明は、IL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現するためのDCの遺伝子操作
、ならびに癌もしくは腫瘍または両方の治療のための治療的使用および/または適用を提
供する。IL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現するインビトロで遺伝子操作し
たDCは、IL-12タンパク質の構成的産生よりも安全な改善物である。加えて、IL-12発現の
タイミングおよびレベルを制御する能力は、治療の有効性の制御を改善する。したがって
、インビトロで遺伝子操作したDCを、ヒトまたは非ヒト生物の癌または腫瘍を治療する治
療薬としての薬学的組成物に製剤してもよい。または、インビトロで遺伝子操作したDCの
集団またはそのサブセットを、IL-12タンパク質生成物をヒトまたは非ヒト生物の体内の
特定の領域（正常組織、癌、または腫瘍）に条件的に送達するための媒体として使用して
もよい。遺伝子操作した樹状細胞はまた、IFN-アルファを条件的に発現しうる。用いる樹
状細胞は自己または非自己樹状細胞であってもよい。樹状細胞を骨髄から、または末梢血
液循環から単離してもよい。ヒト患者において、樹状細胞の集団を、白血球画分を単離し
て取り出し、他の血液成分は患者に再注入する、白血球除去法により単離してもよい。
本発明は、IL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現するための、マクロファー
ジ、好中球、肥満細胞、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、およびリンパ球（例
えば、BおよびT細胞）などのDC以外の免疫細胞の遺伝子操作、ならびに癌もしくは腫瘍ま
たは両方の治療のための治療的使用および/または適用も提供する。IL-12の機能を有する
タンパク質を条件的に発現するインビトロで遺伝子操作したDC以外の免疫細胞、例えば、
マクロファージ、好中球、肥満細胞、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、および
リンパ球（例えば、BおよびT細胞）は、IL-12タンパク質の構成的産生よりも安全な改善
物である。加えて、IL-12発現のタイミングおよびレベルを制御する能力は、治療の有効
性の制御を改善する。したがって、インビトロで遺伝子操作したDC以外の免疫細胞、例え
ば、マクロファージ、好中球、肥満細胞、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、お
よびリンパ球（例えば、BおよびT細胞）を、ヒトまたは非ヒト生物の癌または腫瘍を治療
する治療薬としての薬学的組成物に製剤してもよい。または、インビトロで遺伝子操作し
たDC以外の免疫細胞、例えば、マクロファージ、好中球、肥満細胞、好酸球、好塩基球、
ナチュラルキラー細胞、およびリンパ球（例えば、BおよびT細胞）の集団またはそのサブ
セットを、IL-12タンパク質生成物をヒトまたは非ヒト生物の体内の特定の領域（正常組
織、癌、または腫瘍）に条件的に送達するための媒体として使用してもよい。遺伝子操作
したDC以外の免疫細胞、例えば、マクロファージ、好中球、肥満細胞、好酸球、好塩基球
、ナチュラルキラー細胞、およびリンパ球（例えば、BおよびT細胞）はまた、IFN-アルフ
ァを条件的に発現しうる。用いる免疫細胞は自己または非自己免疫細胞であってもよい。
免疫細胞を骨髄から、または末梢血液循環から単離してもよい。ヒト患者において、免疫
細胞集団を、白血球画分を単離して取り出し、他の血液成分は患者に再注入する、白血球
除去法により単離してもよい。
別の態様において、樹状細胞を、ヒト造血幹細胞にIL-12の機能を有するタンパク質を
発現する本発明のベクターを形質移入し、形質移入した幹細胞を分化させて樹状細胞を得
ることにより調製してもよい。米国特許第6,734,014号参照。
一つの態様において、VP16-RXRおよびGal4-EcRのコード配列がEMCV内部リボソーム侵入
部位（IRES）配列で分離されている、遺伝子スイッチを含む核酸アデノウイルスベクター
（rAd.RheoIL12）を、ヒトユビキチンCプロモーターの制御下でアデノウイルスシャトル
ベクターに挿入する。IRES配列で分離され、合成誘導性プロモーターの制御下に置かれた
、IL12のp40およびp35サブユニットのコード配列を、ユビキチンCプロモーターの上流に
挿入する。
別の態様において、本発明は、大腸菌BJ5183細胞中に2つの融合タンパク質の転写単位
（VP16-RXRおよびGal4-EcR）およびアデノウイルス主鎖で組み替えた誘導性IL-12サブユ
ニット（AdEasy1）を有するシャトルベクターを提供する。組換えクローンを検証した後
、rAd.RheoIL12ゲノムを有するプラスミドをXL10-Gold細胞中で培養し、この細胞から精
製し、消化してプラスミド主鎖から分離し、HEK 293細胞への転写によりパッケージング
する。
特定の態様において、得られた一次ウイルス株をHEK 293細胞の再感染により増幅し、C
sCl密度勾配遠心沈降により精製する。
一つの態様において、IL-12遺伝子は野生型IL-12遺伝子配列である。別の態様において
、IL-12遺伝子は修飾遺伝子配列、例えば、キメラ配列または好ましいコドンを用いるた
めに修飾された配列である。
一つの態様において、IL-12遺伝子はヒト野生型IL-12配列である。別の態様において、
配列は野生型ヒトIL-12配列に対して少なくとも85％同一、例えば、野生型ヒトIL-12に対
して少なくとも90％、95％、または99％同一である。さらなる態様において、IL-12遺伝
子配列はヒトIL-12ポリペプチドをコードする。別の態様において、遺伝子は、野生型ヒ
トIL-12に対して少なくとも85％同一、例えば、野生型ヒトIL-12に対して少なくとも90％
、95％、または99％同一であるポリペプチドをコードする。
一つの態様において、IL-12遺伝子は野生型マウスIL-12配列である。別の態様において
、配列は野生型マウスIL-12に対して少なくとも85％同一、例えば、野生型マウスIL-12に
対して少なくとも90％、95％、または99％同一である。さらなる態様において、IL-12遺
伝子配列はマウスIL-12ポリペプチドをコードする。別の態様において、遺伝子は、野生
型マウスIL-12に対して少なくとも85％同一、例えば、野生型マウスIL-12に対して少なく
とも90％、95％、または99％同一であるポリペプチドをコードする。
本発明は、IL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現するインビトロで遺伝子操
作したDCの集団を生成する方法であって、（a）DCの少なくとも一部、例えば、骨髄由来D
Cを、該DCにIL-12の機能を有するタンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子スイッチ
を有するベクターを導入することにより改変し、それにより疾患を治療または予防するこ
とができる該インビトロで遺伝子操作したDCの集団を生成する段階を含む方法を提供する
。
別の態様において、本発明は、IL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現するイ
ンビトロで遺伝子操作したDC以外の免疫細胞、例えば、マクロファージ、好中球、肥満細
胞、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、およびリンパ球（例えば、BおよびT細胞
）またはTSCの集団を生成する方法であって、（a）DC以外の免疫細胞またはTSCの少なく
とも一部を、該DC以外の免疫細胞またはTSCにIL-12の機能を有するタンパク質をコードす
る核酸配列を含む遺伝子スイッチを有するベクターを導入することにより改変し、それに
より疾患を治療または予防することができる該インビトロで遺伝子操作したDC以外の免疫
細胞またはTSCの集団を生成する段階を含む方法を提供する。
他の態様において、本発明は、DC、DC以外の免疫細胞またはTSCの単離および濃縮を提
供する。DCはヒト、マウス、または他の哺乳動物由来の骨髄から単離してもよい。樹状細
胞はヒト、マウス、または他の哺乳動物の血液から単離してもよい。ヒト患者において、
樹状細胞の集団を、白血球画分を単離して取り出し、他の血液成分は患者に再注入する、
白血球除去法により単離してもよい。一つの態様において、DCは以前に記載されたとおり
（Tatsumi et al., 2003）、マウス骨髄由来である。簡単に言うと、野生型またはEGFP T
gマウス骨髄（BM）を、1000ユニット/mlの組換えマウス顆粒球/マクロファージコロニー
刺激因子および組換えmIL-4（Peprotech, Rocky Hill, NJ）を補足した条件培地（CM）中
、37℃の加湿した5％CO2インキュベーター内で7日間培養する。次いで、CD11c+ DCを、例
えば、特異的MACSTMビーズを製造者の指示（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）に従い用い
て単離する。この様式で生成したCD11c+ DCは、形態学ならびにCD11b、CD40、CD80と、ク
ラスIおよびII MHC抗原の同時発現に基づき＞95％の純度であった。
本発明の一つの態様は、ヒトまたは非ヒト生物における遺伝子療法として、癌、もしく
は腫瘍または両方の治療のための治療的適用に適した、IL-12の機能を有するタンパク質
を条件的に発現する遺伝子操作したDCを提供する。本発明の別の態様は、ヒトまたは非ヒ
ト生物における遺伝子療法として、癌、もしくは腫瘍または両方の治療のための治療的適
用に適した、IL-12の機能を有するタンパク質および/またはIFN-アルファの機能を有する
タンパク質を条件的に発現する遺伝子操作したDCを提供する。
一つの態様において、本発明は、遺伝子スイッチを含む遺伝子操作したDCを提供する。
別の態様において、本発明は、哺乳動物の腫瘍の治療法であって、ジアシルヒドラジン
リガンドの有効量を投与する段階を含む方法を含む。
別の態様において、本発明は、哺乳動物の腫瘍の治療法であって、RG-115830またはRG-
115932の有効量を投与する段階を含む方法を含む。
別の態様において、本発明は、遺伝子スイッチを含むよう遺伝子操作した樹状細胞を含
み、かつ遺伝子スイッチを活性化するリガンドを含むキットを含む。
別の態様において、本発明は、遺伝子スイッチを含むよう遺伝子操作した樹状細胞を含
み、かつRG-115830またはRG-115932を含む組成物を含むキットを含む。
別の態様において、本発明は、エクジソン受容体の少なくとも一部を含む、遺伝子操作
したDC、DC以外の免疫細胞、またはTSCを提供する。別の態様において、本発明は、エク
ジソン受容体に基づく遺伝子スイッチを含む、遺伝子操作したDC、DC以外の免疫細胞、ま
たはTSCを提供する。別の態様において、本発明は、RheoSwitchを含む、遺伝子操作したD
C、DC以外の免疫細胞、またはTSCを提供する。別の態様において、本発明は、遺伝子スイ
ッチおよび遺伝子スイッチを調節するリガンドを含む、遺伝子操作したDC、DC以外の免疫
細胞、またはTSCを含むキットを提供する。別の態様において、キットはジアシルヒドラ
ジンリガンドをさらに含む。別の態様において、キットはRG-115830またはRG-115932をさ
らに含む。
一つの態様において、本発明は、遺伝子操作したDCの集団を提供する。第7日目の培養D
Cは未処理であったか、構成的（rAd.cIL12）もしくは誘導性（rAd.RheoIL12）プロモータ
ーによって駆動されたマウスIL-12p70をコードする組換えアデノウイルスで感染させたか
、または一連の感染多重度（MOI）にわたる模擬、対照アデノウイルスベクター（rAdΨ5
）で感染させた。48時間後、感染させたDCを回収し、表現型およびIL-12p70の産生につい
て、低検出レベルが62.5pg/mlの、検出特異的ELISAキット（BD-PharMingen, San Diego,
CA）を用いて分析した。
別の態様において、本発明は、IL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現するこ
とができる遺伝子スイッチを有するベクター、例えば、DNAベクターを含み、かつ活性化
リガンドをさらに含む、インビトロで遺伝子操作したDC、DC以外の免疫細胞、またはTSC
の集団を提供する。別の態様において、本発明は、IL-12の機能を有するタンパク質およ
び/またはIFN-アルファの機能を有するタンパク質を条件的に発現することができる遺伝
子スイッチを有するベクターを含み、かつ活性化リガンドをさらに含む、インビトロで遺
伝子操作したDC、DC以外の免疫細胞、またはTSCの集団を提供する。
さらなる態様において、本発明は、癌、例えば、黒色腫または神経膠腫の治療法であっ
て、遺伝子操作したDC、DC以外の免疫細胞、またはTSCを患者に投与し、次いでRG-115919
、RG-115830またはRG-115932などの活性化リガンドを該患者に投与することによる方法を
提供する。患者は癌を有するヒトであっても、または動物であってもよい。治療法ならび
に生成物、遺伝子操作した細胞、キット、およびリガンドは、ヒトの治療法および獣医学
的な動物の治療法において適用される。したがって、生成物および方法は、ヒトおよび獣
医学的動物のために用いられることが企図される。
本発明は、DC（DC.RheoIL12と呼ぶ）、DC以外の免疫細胞、またはTSCにおけるIL-12タ
ンパク質の条件的発現は、通常の遺伝子療法スキームによる治療転帰に関して解決するこ
とができなかった、初期の腫瘍病変内、および後期の腫瘍流入領域リンパ節内のIL-12の
免疫学的影響を克服しうることを提供する。遺伝子操作したDC、DC以外の免疫細胞、また
はTSCの投与後のIL-12の発現のタイミングは、癌の治療成功にとって重要であることが、
さらに明らかにされている。
一つの局面において、本発明は、IL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現する
、またはIL-12および/もしくはIFN-アルファを条件的に発現する、インビトロで遺伝子操
作したDC、DC以外の免疫細胞、またはTSCの集団を含む、ヒトまたは非ヒトへの投与に適
した薬学的組成物であって、製剤が腫瘍内投与による投与に適している組成物を提供する
。本発明は、RG-115830またはRG-115932などの活性化リガンドを含む薬学的組成物であっ
て、腹腔内、経口、または皮下投与による投与に適している組成物をさらに提供する。
本明細書に記載の特定の態様において、本発明は、腫瘍の治療法であって：
a. 哺乳動物において前述のインビトロで遺伝子操作したDCを腫瘍内投与する段階；およ
び
b. 該哺乳動物に活性化リガンドの治療上有効な量を投与する段階を含む方法を提供する
。
例えば、本発明は、腫瘍の治療法であって：
a. インビトロで遺伝子操作したDCを提供する段階；
b. 哺乳動物において該インビトロで遺伝子操作したDCを腫瘍内投与する段階；および
c. 該哺乳動物に活性化リガンドの治療上有効な量を投与する段階を、この順で含む方法
を提供する。
別の態様において、本発明は、腫瘍の治療法であって：
a. 哺乳動物において前述のインビトロで遺伝子操作した樹状細胞以外の免疫細胞、例え
ば、マクロファージ、好中球、肥満細胞、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、お
よびリンパ球（例えば、BおよびT細胞）または治療補助細胞を腫瘍内投与する段階；およ
び
b. 該哺乳動物に活性化リガンドの治療上有効な量を投与する段階を含む方法を提供する
。
一つの態様において、インビトロで遺伝子操作したDC、DC以外の免疫細胞またはTSCを1
回投与する。別の態様において、1回投与が安全で十分に耐容されると証明され、追加の
注入が患者の利益になるであろう場合、DC、DC以外の免疫細胞またはTSCを複数回投与す
る。再治療の基準は、対象の疾患が安定であるか、または改善の臨床（すなわち、CTスキ
ャン（腫瘍の退行）、血清化学、尿検査、血液学、生命徴候、腫瘍の直径減少など）もし
くは主観的徴候（すなわち、ECOG状態の改善など）を示していることである。再治療は最
初の治療の1、2、3、もしくは4週間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12
ヶ月、または1、2、3、4、もしくは5年の時点で開始してもよい。
導入遺伝子の複数用量の有効性および安全性を、腫瘍および関連する流入領域リンパ節
の穿刺吸引生検によって評価してもよい。これらは、hIL-12の導入遺伝子発現および細胞
免疫応答のインビボ評価のために、再治療期間の第-12から-7日目および第14日目に採取
してもよい。T細胞の腫瘍および流入領域リンパ節への細胞浸潤を評価するために、生検
試料を標準の光学顕微鏡および免疫組織化学によって評価してもよく、適切に設計したプ
ライマーによるRNAのRT-PCRを用いてもよい。再治療期間の第-12から-7日目、第8日目お
よび第14日目に、血清サイトカインプロファイルのために血液を採取してもよい。血清サ
イトカインプロファイルは、他のサイトカインの発現がhIL-12導入遺伝子での治療によっ
て影響されるかどうかを調べるために得てもよい。IL-12、INF-ガンマ、IP-10、ならびに
IL-1、TNF-アルファ、IL-4、IL-5、およびIL-10などの他のTh1/Th2サイトカインについて
、多重サイトカイン試験を血清中でLuminexにより行ってもよい。
一つの態様において、活性化リガンドをインビトロで遺伝子操作したDC、DC以外の免疫
細胞、またはTSCと実質的に同時に、例えば、細胞の投与前または後1時間以内に投与する
。別の態様において、活性化リガンドをインビトロで遺伝子操作したDC、DC以外の免疫細
胞、またはTSCの投与後約24時間以内に投与する。さらに別の態様において、活性化リガ
ンドをインビトロで遺伝子操作したDC、DC以外の免疫細胞、またはTSCの後約48時間以内
に投与する。別の態様において、リガンドはRG-115932である。別の態様において、リガ
ンドを約1から50mg/kg/日の用量で投与する。別の態様において、リガンドを約30mg/kg/
日の用量で投与する。別の態様において、リガンドを1日1回、5から28日間投与する。別
の態様において、リガンドを1日1回、14日間投与する。別の態様において、約1×106個か
ら1×108個の細胞を投与する。別の態様において、約5×107個の細胞を投与する。
有効なIL-12仲介遺伝子療法を示すために、腫瘍内注入後の様々な時点でDC.RheoIL12細
胞によるIL-12産生を開始させる、条件的IL-12 cDNA発現システムを用いる。C57BL/6マウ
スの進行性B16黒色腫モデルにおける結果に基づき、以下の結論を出した：1）活性化リガ
ンドRG-115830存在下では高レベルのIL-12がDC.RheoIL12から分泌されるが、リガンド非
存在下ではそうではない；2）腫瘍内のDC.RheoIL12に基づく治療は、DC注入の24時間以内
にRG-115830を投与して動物を処置する限り、腫瘍内のDC.cIL12に基づく治療と同等に有
効である（リガンド提供がそれ以降の時点では、RG-115830治療は失敗する）；3）DCにお
けるIL-12発現は腫瘍微環境におけるこれらの生存を延長すると思われ、腫瘍流入領域リ
ンパ節に移動する腫瘍内注入したDCの数の多さに関連している；および4）治療転帰に相
関する最も強い免疫は、治療によってクロスプライミングを受けた腫瘍特異的CD8+ T細胞
のレベルであって、腫瘍微環境において維持される注入したDCの数ではない。全体に、こ
れらのデータは、DC.IL12に基づく治療は1型CD8+ T細胞エフェクターの求心（クロスプラ
イミング）に対するその正の影響によって成功し、注入したDCが仲介する抗腫瘍T細胞の
腫瘍微環境への動員などの、後に起こる遠心事象に対する影響によるものではないことを
示唆している。
腫瘍内注入の前に、細胞（免疫細胞またはTSC）を細胞の活性を刺激するための因子で
処理してもよい。例えば、細胞をOX40L、4-1BBL、CD40、CD40L、GITRL、CD70、LIGHTもし
くはICOS-Lを含む正の共刺激分子または抗CTLA4、抗PD-L1もしくは抗PD-L2抗体などの負
の共刺激分子で処理してもよい。例えば、細胞（例えば、DC、免疫細胞またはTSC）を、1
つまたは複数の共刺激分子を発現する細胞、例えば、CD40リガンド分子を発現するJ588リ
ンパ腫細胞と共にインキュベートしてもよい。別の態様において、細胞（免疫細胞または
TSC）を、抗TGF-ベータ抗体（微環境内のTGFシグナリングを阻害するため）、抗IL10抗体
、TGF-ベータRII DN（遺伝子を改変細胞内のTGFシグナリングを阻害するため）、IL-10R
DN、dnFADD（細胞内の細胞死経路を阻害するため）、抗SOCS1抗体、siRNAもしくはデコイ
（細胞内の抑制性サイトカインシグナリングを阻害するため）、または抗TGF-アルファ抗
体などの対抗免疫抑制分子（耐性阻害剤）で処理してもよい。
DCおよび他の抗原提示細胞からのIL-12産生は、CD4+およびCD8+ T細胞に作用して、そ
れぞれTh1またはTc1型表現型に歪曲させる。したがって、患者からの生体試料中のTh1/Tc
1型サイトカイン、IFN-γの発現または活性のレベルを測定することにより、細胞の集団
へのIL-12の効果を評価することが可能である。
本発明の目的のために、本発明は、癌患者におけるインビトロで遺伝子操作したDC、DC
以外の免疫細胞またはTSCに基づく治療レジメンの有効性を評価する方法であって：
a. ヒト患者からインビトロで遺伝子操作したDC、DC以外の免疫細胞、またはTSCの投与
前に得た、第一の生体試料中のインターフェロン-ガンマ（IFN-γ）の発現のレベルもし
くは活性のレベルまたは両方を測定し、それにより対照レベルをもとめる段階；
b. 該患者に、インビトロで遺伝子操作したDC、DC以外の免疫細胞、またはTSCを腫瘍内
投与する段階；
c. 該患者に、活性化リガンドの有効量を投与する段階；
d. 該患者から該活性化リガンドの投与後の時点で得た、第二の生体試料中のIFN-γの発
現のレベルもしくは活性のレベルまたは両方を測定し、それにより試験レベルのデータを
もとめる段階；および
e. IFN-γの対照レベルと試験レベルを比較し、ここで対照レベルに比べて試験レベルに
おけるIFN-γの発現、活性、または両方のレベルの上昇を示すデータは、該患者において
治療レジメンが有効であることを示す方法を提供する。
一つの態様において、本発明は、癌患者におけるインビトロで遺伝子操作したDC以外の
免疫細胞またはTSCに基づく治療レジメンの有効性を評価する方法であって：
a. ヒト患者からインビトロで遺伝子操作したDC以外の免疫細胞またはTSCの投与前に得
た、第一の生体試料中のインターフェロン-ガンマ（IFN-γ）の発現のレベルもしくは活
性のレベルまたは両方を測定し、それにより対照レベルをもとめる段階；
b. 該患者に、インビトロで遺伝子操作したDC以外の免疫細胞またはTSCを腫瘍内投与す
る段階；
c. 該患者に、活性化リガンドの有効量を投与する段階；
d. 該患者から該活性化リガンドの投与後の時点で得た、第二の生体試料中のIFN-γの発
現のレベルもしくは活性のレベルまたは両方を測定し、それにより試験レベルのデータを
もとめる段階；および
e. IFN-γの対照レベルと試験レベルを比較し、ここで対照レベルに比べて試験レベルに
おけるIFN-γの発現、活性、または両方のレベルの上昇を示すデータは、該患者において
治療レジメンが有効であることを示す方法を提供する。
「対象」なる用語は、完全な昆虫、植物または動物を意味する。対象が真菌または酵母
である場合、リガンドは同等にはたらくであろうことも予想される。「対象」なる用語は
、診断、予後、または治療が望まれる、任意の対象、特に哺乳動物対象を表すことが意図
される。哺乳動物には、ヒト；イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ
、ウシ、クマ、雌ウシなどの家庭内動物、農場動物、クマなどの動物園動物、スポーツ動
物；類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジーなどの霊長類；イヌおよびオオ
カミなどのイヌ科；ネコ、ライオン、およびトラなどのネコ科；ウマ、ロバ、およびシマ
ウマなどのウマ科；ウシ、ブタ、およびヒツジなどの食用動物；シカおよびキリンなどの
有蹄類；マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどの齧歯類などが含まれるが、
それらに限定されるわけではない。特定の態様において、動物はヒト対象である。
「動物」なる用語は、単数の「動物」ならびに複数の「動物」を含むことが意図され、
哺乳動物および鳥、ならびに魚、爬虫類、および両生類を含む。動物なる用語は、モデル
動物、例えば、疾患モデル動物も含む。いくつかの態様において、動物なる用語は、経済
的またはそれ以外に価値のある動物、例えば、経済的に重要な種畜、競走用動物、ショー
動物、財産動物、希少もしくは絶滅危惧動物、またはコンパニオン動物を含む。特に、哺
乳動物はヒト対象、食用動物、またはコンパニオン動物でありうる。
本明細書において用いられる「それを必要としている哺乳動物」とは、治療すること、
すなわち、腫瘍のサイズを低減する、または腫瘍を除去することが望ましい哺乳動物を意
味する。
本発明の方法は、腫瘍内注入した樹状細胞による腫瘍環境からの腫瘍抗原捕捉および腫
瘍特異的T細胞応答を発生させるための流入領域リンパ節におけるT細胞の初回抗原刺激に
依存している。したがって、最適な治療上の利益のために、DCは腫瘍内注入時に高いエン
ドサイトーシス活性の状態にあるべきである。CD14+単球をGM-CSFおよびIL-4で約6〜7日
間処理することにより調製した未成熟DCは、未成熟表現型の細胞であり、高い率のエンド
サイトーシスを示すことが十分に確立されている（Cella et al. 1999；Gilboan, 2007）
。DCの成熟はエンドサイトーシス活性の抑制に関連している。IL-12は未成熟DCに作用し
、成熟誘導因子の発現をシグナリングすることが明らかにされている（Nagayama et al.
2000）。したがって、RTSを用いることで、形質導入したDCにおけるIL-12の発現を、DCが
腫瘍内に注入されるまで遅らせることにより、ヒトの治療転帰を最適にすることが可能で
ある。構成的発現システムは、発現を一時的に制御するこの能力がないため、産生された
IL-12の自己分泌作用およびその結果としての成熟過程を制御することができない（Mazzo
lini et al. 2005）。加えて、ヒト対象における調節された遺伝子発現システムの性能を
試験することになる本発明は、他のヒト遺伝子療法分野におけるシステム適用を見いだす
ことができる。
理論に縛られたくはないが、第一の試験終点として客観的臨床応答に焦点を合わせ、第
二の試験終点としてクロスプライミングを受けた抗腫瘍CD8+ T細胞（IFN-γを産生する）
に焦点を合わせて、本発明は、腫瘍内注入したインビトロで遺伝子操作したDC、DC以外の
免疫細胞、またはTSCに基づく遺伝子療法の臨床状況における使用を支持することが予想
される。データは、IL-12発現のタイミングおよびレベルの両方をリガンドの投与によっ
て制御することができ、さらにIL-12発現のタイミングはこの方法の治療的有効性にとっ
て重要であると予想されるため、インビボにおいてIL-12発現のオン-オフを切りかえる能
力は、治療に安全性および治療制御の要素を加えることを示している。
本発明は、ヒト疾患の有効かつ効率的治療のための革新的アプローチとしての、興味対
象の条件的に発現された遺伝子によりインビトロで遺伝子操作した細胞の治療的適用をさ
らに支持する。
本明細書において引用する任意の参照文献の任意の教示または示唆と本明細書との間に
矛盾がある場合は、本発明の目的のために、後者が優勢である。
本発明の方法に従っての具体的態様を以下の実施例においてこれから記載するが、これ
らの実施例は例示のために提供するものであって、本発明の範囲を限定する意図はない。
実施例1
DC.RheoIL12はインビトロでリガンドRG-115830に応答して高レベルのIL-12p70を条件的に
生成する
1.1 材料と方法
1.1.1 マウス
雌6〜8週齢のC57BL/6野生型およびC57BL/6-TgN(ACTbEGFP)1Osb/J EGFP Tgマウスを、Ja
ckson Laboratory（Bar Harbor, ME）から購入し、マイクロアイソレーターケージ内で維
持した。マウスを実験動物の適切な管理と使用のための推奨に従って扱った。
1.1.2 細胞株
C57BL/6マウスと同系のB16黒色腫およびEL-4胸腺腫H-2b細胞株が以前に記載されている
（Itoh et al., 1994）。細胞株をCM（10％熱不活化ウシ胎仔血清、100単位/mlペニシリ
ン、100 μg/mlストレプトマイシン、および10mM L-グルタミンを補足したRPMI 1640；す
べての試薬はInvitrogen, Carlsbad, CAから）中、5％CO2および37℃の加湿インキュベー
ター内で維持した。
1.1.3 樹状細胞（DC）の生成
DCを、以前に記載されているとおり（Tatsumi et al., 2003）、マウス骨髄から生成し
た。簡単に言うと、野生型またはEGFP TgマウスBMを、1000単位/ml組換えマウス顆粒球/
マクロファージコロニー刺激因子および組換えmIL-4（Peprotech, Rocky Hill, NJ）を補
足したCM中、37℃の加湿した5％CO2インキュベーター内で7日間培養した。次いで、CD11c
+ DCを、特異的MACSTMビーズを製造者のプロトコル（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）に
従い用いて単離した。この様式で生成したCD11c+ DCは、形態学ならびにCD11b、CD40、CD
80と、クラスIおよびII MHC抗原の同時発現に基づき＞95％の純度であった。
1.1.4 ウイルスベクター
対照アデノウイルスベクターrAd.Ψ5およびCMVプロモーターによって駆動されるmIL-12
をコードするrAd.cIL12（Tatsumi et al., 2003）は、University of Pittsburgh Cancer
Institute's Vector Core Facilityによって生成され、提供された。
rAd.RheoIL12ベクターを以下の様式で生成した。EMCV内部リボソーム侵入部位（IRES）
配列で分離されたVP16-RXRおよびGal4-EcRのコード配列を、ヒトユビキチンCプロモータ
ーの制御下でアデノウイルスシャトルベクターに挿入した。続いて、IRES配列で分離され
、合成誘導性プロモーターの制御下に置かれた、IL12のp40およびp35サブユニットのコー
ド配列を、ユビキチンCプロモーターの上流に挿入した（図1参照）。様々な強度の別々の
プロモーター下で2つの融合タンパク質（VP-16 RXRとGal4-EcR）を発現することによるシ
ステムの性能は、Gal4-EcRに対するVP16-RXRの割合が高いほど最良の性能を呈することを
示した。したがって、IRESの上流のVP-16 RXRおよび下流のGal4-EcRは、反対のデザイン
よりも最適な性能を呈した。
大腸菌BJ5183細胞中、2つの融合タンパク質のこれらの転写単位および誘導性IL12サブ
ユニットを有するシャトルベクターを、アデノウイルス主鎖（AdEasyl, stratagene, La
Jolla, CA）で組み替えた。組換えクローンを検証した後、rAd.RheoIL12ゲノムを有する
プラスミドをXL10-Gold細胞中で増やし、この細胞から精製し、消化してプラスミド主鎖
から分離し、HEK 293細胞への転写によりパッケージングした。
得られた一次ウイルス株をHEK 293細胞の再感染により増幅し、CsCl密度勾配遠心沈降
により精製した。
1.1.5 ELISA
第7日目の培養DCは未処理であったか、構成的（rAd.cIL12）もしくは誘導性（rAd.Rheo
IL12）プロモーターによって駆動されたマウスIL-12p70をコードする組換えAdで感染させ
たか、または一連のMOIにわたる模擬、対照ベクターrAdΨ5で感染させた。この後の様々
な時点（0〜48時間）で、DCを活性化リガンド（10〜200μg/ml）非存在下または存在下で
さらに24時間培養し、その後、特異的ELISAキット（BDPharMingen, San Diego, CA；低検
出レベル＝62.5pg/ml）を用いてIL-12p70分泌を分析した。いくつかの場合には、条件的
サイトカイン産生のストリンジェンシーを識別するために、活性化リガンドであらかじめ
処理した、rAd.RheoIL12で感染させたDC（すなわち、DC.RheoIL12）を洗浄してリガンド
を除去し、対照培地中でさらに24時間培養し、その後、IL-12p70分泌を分析した。または
、48時間後、感染させたDCを回収し、表現型およびIL-12p70の産生について、低検出レベ
ルが62.5pg/mlの、ELISAキット（BD-PharMingen, San Diego, CA）を用いて分析した。
1.1.6 フローサイトメトリー
アデノウイルス感染したDCの表現型分析のために、マウス細胞表面分子（CD11b、CD11c
、CD40、CD54、CD80、CD86、H-2Kd、I-Ad（すべてBD-PharMingenから））に対するPEまた
はFITC結合mAbおよび適当なアイソタイプ対照を用い、フローサイトメトリー分析を、FAC
scan（Becton Dickinson, San Jose, CA）フローサイトメトリー測定器を用いて実施した
。
1.2 結果
1.2.1 Rheo-IL12で感染させたマウスBM由来DCは、インビトロでリガンド処理した場合、
高レベルのIL-12p70を条件的に産生する
C57BL/6（B6）マウスBMからrmIL-4およびrmGM-CSF存在下で7日間培養したDCを、未処理
で放置したか、または様々なMOIで、対照rAd.Ψ5、rAd.cIL-12（構成的CMVプロモーター
下でmIL-12p70をコードする）またはrAd.RheoIL12（低分子リガンドRG-115830に応答する
条件的プロモーター下でIL-12p70をコードする）で感染させた。感染の48時間後、DCをRG
-115830非存在下または存在下でさらに24時間培養し、その時点でELISAによるIL-12p70生
成の定量のために、培養上清を回収した。図2Aに示すとおり、対照の非感染DCまたは外来
薬物非存在下もしくは存在下でAd.Ψ5で感染させたDCは、rAd.cIL12で感染させたDC（DC.
cIL12）と比べた場合、高いレベルのIL-12p70を産生することができなかった。rAd.RheoI
L-12で感染させたDC（DC.RheoIL12）は、RG-115830で処理した場合にのみ、IL-12p70を産
生した（図2Aおよび2B）。「十字交差」実験の結果に基づき、最適に感染させたDCによる
IL-12p70産生は、MOI＝100を用い、50〜200μg/ml RG-115830で細胞を処理して起こった
（図2A）。DC.RheoIL12にRG-115830を最大48時間まで遅れて提供すると、インビトロでこ
のリガンドを0時間の時点で加えた場合と比べて、IL-12p70のいかなる顕著な産生低下も
引き起こすことはなかった（図2B）。最後に、リガンドの除去は、インビトロでDC.RheoI
L12（リガンドによってあらかじめ活性化した）が高レベルのIL-12p70を産生し続ける能
力を急激に停止させた（図2C）。
実施例2
インビトロで遺伝子操作した樹状細胞の動物への腫瘍内投与
2.1 方法と材料
2.1.1 B16腫瘍モデル
第0日目に、B6マウスの右側腹部に1×105個のB16黒色腫細胞を皮下に注射した。第7日
目に、腫瘍は約20〜30mm2のサイズに達し、マウスをPBSまたは全量50μlのPBS中1×106個
の対照およびアデノウイルス導入（MOI＝100）DCのi.t.注射により処置した。また、表示
のとおり、マウスに200μg RG-115830（50μl DMSO中）とDMSO担体対照のi.p.注射も、DC
投与後0時間、24時間または48時間の時点で開始して行った。開始後、マウスに合計5日連
続でRG-115830をこの用量で1日1回腹腔内注射した。さらなる実験において、リガンド投
与をDC注射の日に開始し、DC注射後の1、3または5日目に停止して、IL-12p70導入遺伝子
プロモーションを早期停止すると、このアプローチの治療上の利益が低減するかどうかを
確認した。すべての場合に、腫瘍サイズを3日または4日に1回評価し、ノギスで測定した
最大の直交する直径の積をもとめることによりmm2で記録した。データは平均腫瘍面積±S
Dで報告する。すべての動物コホートは1群あたり5匹のマウスを含んでいた。
表示の実験において、これらのマウスにおける記憶免疫の有無および特異性を確認する
ために、治療後（45日）に腫瘍がなくなった動物をB16黒色腫（105個の細胞を左側腹部、
すなわち元のB16黒色腫攻撃部位の対側に注射）およびMC38結腸癌（105個の細胞を右側腹
部）細胞で再攻撃した。すべてのデータは平均腫瘍面積±SDで報告する。すべての動物コ
ホートは1群あたり5匹のマウスを含んでいた。
注射したDCの最終結果および機能を評価するために、第7日目のBM由来のCD11c+ DCをC5
7BL/6-TgN(ACTbEGFP)1Osb/J EGFP Tgマウスから生成した。EGFP+ CD11c+ DCを、前述のと
おり、非感染で放置またはrAdウイルスで感染させた。感染の48時間後、1×106個の対照
またはウイルス感染DCを回収し、PBS中で洗浄し、同系B6マウスで定着した第7日目B16腫
瘍病変に注射した。DC注射の3日後、腫瘍および流入領域鼠径リンパ節（LN）を切除し、2
％パラホルムアルデヒド（PBS中）中で1時間固定し、次いでPBS中30％スクロースで凍結
保護した後、液体窒素で冷却したイソペンタン中で衝撃凍結した。次いで、5ミクロンの
凍結切片を生成し、2mg/ml Hoechst 33258（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）で3分間、
対比染色した。次いで、洗浄した切片をGelvatol（Monsanto Chemical Co., St. Louis,
MO）中で固定し、冷却電荷結合素子カラーカメラを装備したOlympus BX51顕微鏡を用いて
観察した。
2.1.2 B16黒色腫に対する特異的CD8+ T細胞応答の評価
腫瘍接種の25日後に1群あたり2匹の処置マウスの脾臓から、磁気ビーズ細胞選別（MACS
TM; Miltenyi Biotec）を用いて、プールしたCD8+ T細胞を＞95％の純度まで単離し、次
いで1×104個の放射線照射（10,000rad）したB16またはEL-4腫瘍細胞と共に同時培養（1
×105個/ウェル）した。48時間のインキュベーション後、培養上清を回収し、検出下限が
31.5pg/mlの市販のELISA（BD-PharMingen）を用いて、IFN-γ放出について分析した。デ
ータは三重複測定の平均±SDで報告する。
2.1.3 統計学的分析
処置を完全無作為デザインで適用した3群以上によるすべての実験を、まず一元配置ま
たは二元配置の要因ANOVAで分析した。得られるPが＜0.05である場合、必要に応じて特定
の対の対比を不等分散についてのウェルチの補正によるT検定で分析した。データを分布
特性についてチェックし、適当な変換を適用した。脾細胞由来T細胞からのIFN-γ産生の
分析を、正確なクラスカル-ウォリス検定により行った。クラスカル-ウォリス検定のP値
が＜0.05の場合、演繹的対比をウィルコクソン検定により評価した。治療的単一腫瘍接種
マウス処置モデルの分析を、混合線形モデルで行った。データを対数変換し、マウス内共
分散を推定し、処置の固定効果を無作為マウス効果に対して調節した。1時点で群の対を
比較するための生のP値を、ブーツストラップ法の標本再抽出により調節した。腫瘍拒絶
率を、処置群、観察日、およびそれらの相互作用を組み込んだ、一般線型モデル（二項連
結による）にあてはめた。
2.2 結果
2.2.1 DC.cIL12単独またはRG-115830のi.p.投与と組み合わせてのDC.RheoIL12の腫瘍内
投与は、定着したs.c.B16黒色腫病変の退行を促進する
B16黒色腫細胞（1×105個）を同系H-2b B6マウスの左側腹部にs.c注射し、定着させた
。第7日目に、マウスを5匹ずつのコホートに無作為割り付けし、コホートの平均腫瘍サイ
ズは約20〜30mm2であった。次いで、マウスにPBSまたは全量50μlのPBS中106個のDC（イ
ンビトロでrAd.Ψ5、rAd.cIL12またはrAd.RheoIL12により48時間あらかじめ感染させた）
を腫瘍内注射した。また、マウスにDMSOまたはRG-115830（DMSO中）の腹腔内注射も、DC
投与時（すなわち、処置の第1日目）またはDC投与後24時間もしくは48時間（すなわち、
処置の第2日目）に行った。図3Aおよび3Bに示すとおり、マウスのRG-115830単独またはRG
-115830非存在下でのDC.RheoIL12による処置では、いかなる治療上の利益も得ることはで
きなかった。顕著な対照をなして、DC.cIL-12またはDC.RheoIL-12＋RG-115830（DC注射の
24時間以内に提供し、5日間のリガンド投与も一緒に行った）で処置した腫瘍は、その後
の3週間でサイズが縮小した。これらの治療は、腫瘍サイズ測定に基づき、統計学的に識
別不能で、これらそれぞれの場合に100％（マウス5匹中5匹）の腫瘍退行率を示した。興
味深いことに、RG-115830投与が腫瘍内DC注射の48時間後（この物質がインビトロでDC.Rh
eoIL-12からのIL-12p70産生を効率的に促進しうる時点、図2B参照）まで遅れると、DC.Rh
eoIL12に基づく治療は腫瘍成長速度のわずかな阻害をもたらした（第10日目以降のすべて
の時点でP＜0.05）が、すべての動物は進行を示し、第30日目までに屠殺が必要であった
（図3A）。これは、腫瘍内DC.IL12処置の治療上の利益は、主に早期の時点でのIL-12p70
産生（おそらくは腫瘍病変および/または流入領域リンパ節内で起こっている）に決定的
に依存していることを示唆している。
活性化リガンド（RG-115830）を、DC.RheoIL-12を注射したマウスに、DC注射後1、3ま
たは5日間投与する、さらなる実験を実施した（図3B〜3C）。これらの試験の結果は、リ
ガンド投与の早期停止は、i.t.送達したDC.RheoIL-12の抗腫瘍効果に影響をおよぼし、遺
伝子を改変したDCの供与後約5日以上の間、リガンドがマウスに提供されなければ、腫瘍
成長の阻害は限定されるか、または除去されることを示唆している。これらの知見は、図
2Bおよび2Cに示すデータと一致しており、このモデルに注射したDC.RheoIL-12から得られ
る治療上の影響の緊密な（リガンド依存的）調節を支持している。さらに、合わせて考え
ると、図3に示す結果は、DC.RheoIL12のi.t.送達に関連する最適な抗黒色腫効果は、B16
腫瘍へのDC注射後第1日目〜第5日目の期間中のリガンド提供によってもたらされることを
強く示唆している。
2.2.2 条件的DC.RheoIL12療法の遅延活性化は、インビボで注射したDCが明らかに生存で
きないことにより、無効である。
発明者らの以前の報告（Tatsumi et al., 2003）は、IL-12遺伝子のDCへの挿入は、イ
ンビボで、腫瘍微環境に注入した後のこれらの細胞の生存増強と、その結果としてのこれ
らの細胞が抗腫瘍CD8+ T細胞をクロスプライミングし、おそらくは循環中のエフェクター
T細胞を腫瘍微環境に動員する能力を促進すると示唆した。したがって、次の試みは、DC
注射の48時間後に開始した（RG-115830のi.p.投与により）DC-RheoIL12療法の失敗は、DC
が腫瘍微環境にとどまることができないため、これらの細胞が腫瘍流入領域LNに移動する
ことができないため、および/または特異的CD8+ T細胞が処置の結果としてクロスプライ
ミングを受けられないためであるかどうかを識別することであった。図3Aに概略を示した
実験を、DC生成のための骨髄供給源としてEGFP Tg (H-2b)マウスを用いた以外は、1コホ
ートあたり2匹のマウスをDCの腫瘍内注射の72時間後に屠殺して繰り返した。腫瘍およびL
Nを切除し、組織切片を蛍光顕微鏡によるEGFP+ DCの分析のために調製した。残りのマウ
ス3匹/コホートを第25日目まで経過観察し、第25日目の時点で屠殺し、プールした脾細胞
をB16特異的CD8+ T細胞応答の分析のために単離した。
図4に示すとおり、i.t.注射の72時間後に腫瘍またはLN内のEGFP+ DCを消散させる能力
は、これらの細胞のインビボ投与の24〜48時間以内のIL-12導入遺伝子の活性化に厳密に
依存していた。DC.cIL12またはDC.RheoIL12をi.t.注射したマウスにおいて（RG-115830を
DC投与後0時間または24時間の時点でi.p.提供した場合）、EGFP+ DC.cIL12およびDC.Rheo
IL12はB16病変において容易に観察することができ、流入領域LN内では見られる頻度は低
かった。対照（非感染）DCまたはDC.RheoIL12で処置したマウス（RG-115830投与をDC注射
後48時間遅らせた）から回収した組織では、EGFP+ DCはほとんど、またはまったく検出す
ることができなかった。DC.RheoIL12で処置し、RG-115830を0時間と24時間の時点で提供
したマウスから単離した組織を比較すると、活性化物質を早く提供するほど、腫瘍（p＝0
.001）および流入領域LN（p＝0.02）の両方で多くのEGFP+ DCが見られた。
2.2.3 DC.RheoIL12投与の治療上の利益は特異的CD8+ T細胞の誘導および持続性の抗腫瘍
免疫に関連している。
注入DCの生存度がリガンド注入のタイミングに明らかに依存していることを考慮して、
発明者らは、RG-115830によって0時間の時点で活性化されたDC.RheoIL12を投与したマウ
スでは、それよりも後に活性化されたものに比べて、特異的CD8+ T細胞のクロスプライミ
ングの程度がすぐれていると予測していた。興味深いことに、これは0時間（DC.RheoIL-1
2、第1日目〜第5日目）と48時間（DC.RheoIL-12、第3日目〜第7日目）のDC.RheoIL-12コ
ホートを比べると確かに観察されたが、0時間と24時間（DC.RheoIL-12＋L、第2日目〜第6
日目）を比べた場合には観察されなかった（図5A）。事実、関連するB16と無関係のEL-4
腫瘍標的に対するインビトロでの脾臓CD8+ T細胞応答（IFN-γ分泌）は、これらのコホー
ト両方で同等であり、これらはそれぞれDC.cIL12で処置したマウスで検出されたものに近
づいた。全体に、これらのCD8+ T細胞応答特性は、治療転帰に直接相関するようであった
（図3A）。図5Aと同様、特異的B16腫瘍細胞と無関係のMC38に対するIFN-γ産生による脾
臓T細胞応答は、治療転帰に相関していた。
有効なDC.RheoIL12に基づく治療が持続性の抗腫瘍免疫の発生に関連しているかどうか
という問題に取り組むために、腫瘍のない動物を第45日目（最初のB16攻撃後）に関連す
るB16黒色腫細胞または無関係のMC38結腸癌細胞で（再）攻撃した。図5Bに示すとおり、
以前に黒色腫から治癒したすべてのマウスはB16腫瘍細胞に対して特異的防御を示したが
、MC38腫瘍病変はだんだんと成長した。これは、本発明の樹状細胞は治療様式に対してさ
らなる安全性と、治療的制御の可能性を有することを示している（すなわち、IL-12発現
のタイミングおよびレベルの両方がリガンドの投与によって制御されうる）。
実施例3
治療効果に対するリガンドの投与経路/用量の比較
3.1 方法と材料
B16黒色腫を同系B6マウスの右側腹部に7日間、皮下に定着させた。第7日目に、106個の
DC.SP1-IL12（図10の比較で特定された最適なスイッチ）を腫瘍内に（i.t.）注入した。
活性化リガンド（RG-115932）を、i.p.注入、Labrasol中の経口胃管栄養法、または適宜
に提供する薬物含有飼料のいずれかで、DC注入の前日に開始して（その後1日1回6日間）
提供した。各コホートは5匹の動物を含み、腫瘍成長を3〜4日に1回モニターし、平均サイ
ズ（直交する測定値の積に基づくmm2）で報告した。各コホートの処置を以下に記載する
。
Figure 2016128451
3.2 結果
結果は、任意の用量または任意の経路でのリガンド単独の投与は、B16腫瘍成長にまっ
たく影響がなかったことを示している（図6）。DC-SP1 i.t.治療はB16の成長を制御する
上で有効であるが、リガンドが適用される場合に限り、リガンド投与のすべての経路はい
くらかの有効性を生じる。i.p.投与したリガンドを用いてのDC-SP1 i.t.治療は、明らか
なリガンド用量-腫瘍阻害反応パターンを示し、最適な抗腫瘍効果はリガンド用量＞30mg/
kg/日で得られた。DC-SP1 i.t.治療に30mg/kg/日の用量で適用したリガンドは、i.p.注入
、経口胃管栄養法、または飼料混合物のいずれで投与しても同等に有効であった。試料中
で提供したより高用量のリガンドは、有効性がいくらか低かった。R鏡像異性体（RG-1159
32）だけがRTSを活性化することができるため、ラセミ混合物を含む飼料は約20〜22.5mg/
kg/日の活性鏡像異性体を提供するにすぎない。これに関して、飼料によるコホートの抗
腫瘍効果は、10および30mg/kg/日i.p.のRG-115932用量群で観察された効果の間にはいる
ため、飼料からラセミ混合物AD（すなわち、約20〜22.5mg/kg/日の活性鏡像異性体RG-115
932）を投与した動物で観察された腫瘍退行は、純粋なRG-115932で見られたi.p.用量反応
と一致する。これらのデータは、リガンドの経口投与は治療効果を誘導する上で有効であ
ることを示唆している。リガンドの経口投与の利用可能性は、患者に対する治療の負担を
軽減するであろう。
この活性化薬物依存効果は、（1）腫瘍およびDLNにおける導入遺伝子発現、（2）腫瘍
微環境におけるAd-DCの生存延長、（3）DLNにおけるAdDCの移動および存続、ならびに（4
）抗B16 CD8+ T細胞の誘導に関連している。
図10は、異なるIL-12含有アデノウイルスベクターの効果の比較を示す。SP1-RheoIL-12
変異体はRheoswitch含有変異体のうちで最も有効であった。SP1-RheoIL-12はベクター主
鎖においてoldRheoIL-12と異なる（oldRheoIL-12ではAdEasy1ベクターおよびSp1-RheoIL-
12ではViraQuestのRAPAdベクター）。TTR-RheoIL-12は、Gal4応答エレメントの下流のTTR
最小プロモーターを含むという点で、oldRheoIL-12と異なる。図10が示すとおり、B16黒
色腫のサイズ縮小において、SP1-RheoIL-12はTTR-RheoIL-12よりも効果的であった。
図11は、以前に組換えアデノウイルスRheoswitch誘導性IL-12を含む樹状細胞（DC-SP1-
RheoIL-12）で処置したマウスの再攻撃後に、B16黒色腫形成が見られないことを示す。こ
れは、B16免疫マウスにB16細胞を最初の接種から45日後に再接種した場合、B16黒色腫は
最大25日まで成長を妨げられたことを示している。マウス樹状細胞をB6マウスの骨髄から
、rmIL-4およびrmGM-CSFを含む完全培地（RPMI-1640、10％FBS）中で7日間培養すること
により生成した。次いで、CD11c陽性樹状細胞を、特異的MACSビーズを製造者のプロトコ
ル（Miltenyi Biotech）に従い用いて単離し、MOI＝100でrAd.IL-12（RheoIL-12対SP1対T
TR）を用いて24時間感染させた後、10E6 DCを定着した第9日目のB16黒色腫に皮下注入し
た（1群あたりマウス5匹、右側腹部の腫瘍）。マウスを、DC注入後第0〜4日目に活性化リ
ガンドRG-115830（50マイクロリットルのDMSO中30mg/kg）を1日1回i.p.注入することによ
り処置し、または処置しなかった。腫瘍サイズを3〜4日に1回モニターし、直交する直径
の積として平方mmで報告している。治療関連の防御の特異性を評価するために、すべての
腫瘍がない動物を、最初のB16腫瘍攻撃後第45日目に、左側腹部に10E5 B16黒色腫細胞と
右側腹部にMC38結腸癌細胞で再攻撃した。MC38腫瘍は形成されたが、B16腫瘍は形成され
なかった。
図12は、B16黒色腫マウスモデルにおけるB16腫瘍中に注入した樹状細胞（DC-SP1-RheoI
L-12）の数（105個、106個、107個）およびリガンド投与の期間の長さならびに腫瘍退縮
の間の比較を示す（6日間または13日間）。図12は、腫瘍に注入した形質導入DCの用量お
よびAD投与の期間（i.p.注入、30mg/kg/日）の、腫瘍成長の阻害への依存を示す。腫瘍を
有するマウスにAdDCを細胞105個、106個、107個の用量で腫瘍内に1回注入し、活性化リガ
ンドを107個の細胞注入の日に開始して、1回用量30mg/kg/日で6日間または13日間、1日1
回i.p.注入した。ここでも、活性化リガンドを6日間の代わりに13日間提供した場合に、
腫瘍成長の著しく強い抑制が観察された。107個の樹状細胞と組み合わせて連続13日間投
与したリガンド（RG-115932）は、25日間を通して腫瘍退行を引き起こす上で有効であっ
た。これは、エクスビボで形質導入したDCは腫瘍内への注入後ほんの数日間しか生存しな
いとの考えに反して、RTSの制御下でIL-12を発現するAdDCは腫瘍内注入後1週間を越えて
完全なままであるようで、注入後13日間にもわたって生存し、活性化リガンドに反応性で
ありうることを示唆している。活性化リガンド単独（AdDCなし）では、腫瘍成長にまった
く影響はなかった。
図12と同様の実験において、活性化リガンドを経口胃管栄養法によって9および12日間
投与した。Labrasol中の異なる用量で活性化リガンドの経口製剤による抗腫瘍用量反応を
評価した。用量依存的抗腫瘍効果が観察され、最も大きい反応は50mg/kg/日を経口で12日
間投与した動物で見られた。事実、試験したすべての用量で、13日間の活性化リガンド処
置は9日間の活性化薬物処置よりもすぐれていた。これは、インビボ（腫瘍微環境または
リンパ系器官のいずれか）で少なくとも9から12日間生存し、IL-12産生を持続するDCは、
最適な治療効果のために重要であると示唆している。
図13は、本明細書に記載の治療法は衰弱による動物の有害な体重減少に関連していなか
ったことを示す。衰弱および体重減少はしばしば、IL-12に応答してアップレギュレート
されることが知られている高レベルのインターフェロン-ガンマおよびTNF-アルファに関
連している。
B16黒色腫を5匹の同系B6マウスの右側腹部s.c.に7日間定着させた。第7日目に、DC.SP1
-IL-12（MOI＝100でSP1最適スイッチを用いて感染させた骨髄由来DC）を10E5、10E6また
は10E7の用量で腫瘍内（i.t.）注入した。RG-115932をDC注入の日に開始して（その後1日
1回6日間または13日間のいずれか）i.p.注入により提供した。各コホートは5匹の動物を
含み、腫瘍の成長を3〜4日に1回モニターし、平均サイズ（直交する直径の測定値に基づ
く平方mm）で報告している。個々の動物の体重も腫瘍測定時に評価した（図13）。任意の
治療によって疾患がなくなったすべての動物を、第50日目（最初のB16腫瘍接種後）に元
の腫瘍の反対の側腹部（左側腹部）に10E5のB16黒色腫細胞と右側腹部に10E5のMC38結腸
癌細胞で再攻撃した。腫瘍の成長を3〜4日に1回モニターし、未処置（非治療）動物で観
察された成長（図12参照）と比較した。
図14は、以前に組換えアデノウイルスRheoswitch誘導性IL-12を含む樹状細胞および活
性化リガンドRG-115932で処置したマウスの再攻撃後に、B16黒色腫形成が見られないこと
を示す。したがって、図14は、B16黒色腫は、B16免疫マウスにB16細胞を再接種した場合
に、最大24日まで成長が妨げられたことを示している。図14は、B16未処置マウスは、MC3
8免疫マウスおよびMC38未処置マウスと同様、腫瘍形成から防御されなかったことも示し
ている。MC38は当技術分野において公知の結腸癌である。これは組換えアデノウイルスRh
eoswitch誘導性IL-12を含む樹状細胞の元のB16腫瘍への注入によって引き起こされた免疫
化の特異性を示している。
CD14+細胞の分化により生成したDCは未成熟表現型で、検出可能なレベルのIL-12を産生
しない（Cella et al. 1999）。図15は、骨髄細胞をGM-CSFおよびIL-4で7日間処置し、続
いてCD11c+選択することにより生成したマウスDCも、RTSの制御下でIL-12を有するアデノ
ウイルスベクターを形質導入した後に検出可能なIL-12を発現しなかったことを示す。形
質導入細胞の様々な用量の活性化薬物（RG-115932）での処置は、IL-12を用量依存的様式
で産生した。
アデノウイルス形質導入は、NFkB活性化経路を通じてTNF-アルファ産生を引き起こすペ
ントン-インテグリン相互作用により、DCにおいてある程度の成熟を誘導すると報告され
ている。TNF-アルファの自己分泌作用は、この場合のDCの成熟誘導シグナルであると報告
される（Philpott et al. 2004）。用いた短時間のアデノウイルス形質導入（2〜3時間）
と、MOIを必要最低レベルに選択することで、この早期成熟効果が制限されると予想され
る。
実施例4
本実施例において、樹状細胞を骨髄から単離し、図7に示すアデノウイルス作成物を形
質導入し、同系頭蓋内GL261神経膠腫を有するマウスに遺伝子操作した樹状細胞を腫瘍内
注入し；かつRG-115830を腹腔内注入した。図7は、マウス頭蓋内神経膠腫GL261にRTS制御
下またはRTSなしでIL-12および/またはIFN-アルファをコードするポリヌクレオチドを形
質導入した樹状細胞を腫瘍内注入した結果を示す。データは、RTSのRG-115830リガンドに
よる活性化を通じてのIFN-アルファおよびIL-12のリガンド誘導性発現により、IFN-アル
ファ発現だけの場合と比べて、50日目の時点でGL261神経膠腫マウスの75％の生存が促進
されたことを示している。さらに、RheoSwitchおよびリガンドによって提供される対照は
生存増強を促進した。
実施例5
第III期および第IV期黒色腫の対象における、RTS制御下でhIL-12を発現するよう遺伝子
操作したアデノウイルス形質導入自己樹状細胞の腫瘍内注入の安全性、耐容性、導入遺伝
子機能、および免疫学的効果を、以下に記載するものなどの方法により評価する。
第III期および第IV期黒色腫の試験対象を含む試験を4つの対象コホート（群）で行い、
各対象に、ヒトインターロイキン-12（hIL-12）を発現するよう遺伝子操作した、アデノ
ウイルスを形質導入した自己（それらを取り出した同じ対象に再挿入）樹状細胞（DC）の
5×107個の用量での1回腫瘍内（黒色腫内）注入を、活性化薬物（活性化リガンド）の1日
1回の経口投与と組み合わせて投与する。試験は、ヒトIL-12の誘導性発現のためのアデノ
ウイルスベクターをエクスビボ（細胞を対象から取り出した後）で形質導入した樹状細胞
の注入を用いる。IL-12産生を、活性化薬物（RG-115932）の経口投与によるRTSの活性化
を通じて、注入したDCから「オンに切替」（誘導）する。安全性および耐容性を、理学検
査（ECOG状態を含む）、生命徴候測定値、血清化学、尿検査、血液学、有害事象「副作用
」、ならびにアデノウイルス、RTSの成分、および活性化薬物に対する抗体および細胞性
免疫応答を通じて評価する。進行を評価するために、経口活性化薬物およびその主な代謝
物の1回投与および定常状態の薬物動態/ADME、標的腫瘍、流入領域リンパ節、および末梢
循環の生検試料中のhIL-12レベルおよび細胞性免疫応答（T細胞）の分析、ならびに血清
サイトカインプロファイルを調べる。
例えば、第III期および第IV期黒色腫の対象16名を4つのコホートに分け、コホート1お
よび2は3名を含み、コホート3および4は5名を含む。すべての対象に、RTS制御下でヒトIL
-12をコードするアデノウイルスベクターを形質導入した5×107個の自己DCを1回腫瘍内注
入する。対象に、活性化薬物の1日1回経口投与（コホート1：0.01mg/kg、コホート2：0.1
mg/kg；コホート3：1.0mg/kgまたはコホート4：3mg/kg）を、1回目の投与を第1日目のDC
注入の約3時間前に開始し、さらに連続13日間続けて行う。アデノウイルスを形質導入し
た自己樹状細胞の追加注入を、14回の活性化薬物の1日1回経口投与と組み合わせて、再処
置の基準に合う適格対象に投与してもよい。コホート1の各群のすべての対象について、
安全性、耐容性、および樹状細胞機能を、インビトロで遺伝子操作した樹状細胞の注入後
最大1ヶ月まで評価した後、対象を活性化薬物の次に最も高い用量を投与するよう登録す
る。安全性評価を、すべての対象で、遺伝子操作した樹状細胞の最初の注入後3ヶ月間継
続し、毒性が観察されるか、または対象が樹状細胞の追加注入を受ける場合、対象の安全
性をモニターするために、経過観察期間を合計6ヶ月間まで延長する可能性がある。
そのような試験は、黒色腫を有する対象において、アデノウイルス形質導入自己樹状細
胞の1回または複数回腫瘍内注入の、経口活性化薬物と組み合わせての安全性および耐容
性を示す。試験は、経口活性化薬物の定常状態の薬物動態/ADMEを提供する。試験は、活
性化薬物の経口投与によるRTSの活性化に応答しての標的腫瘍および/または流入領域リン
パ節におけるアデノウイルス形質導入自己樹状細胞のhIL-12発現を測定することにより、
対象におけるRTSの機能性を示す。さらに、試験は、活性化薬物の経口投与後の、標的腫
瘍、流入領域リンパ節、および末梢循環における細胞性免疫応答に関して、アデノウイル
ス形質導入自己樹状細胞の免疫学的効果を示す。
第III期および第IV期黒色腫の患者は生存可能な治療法がなく、固形腫瘍の中でも特に
黒色腫は免疫療法アプローチに反応することが明らかにされており、かつ黒色腫は腫瘍内
注入および生検のために容易に接近可能であるため、黒色腫が例示的癌として（RTSと共
に用いるため）選択される。試験に含まれる対象は、切除不可能な第III期または第IV期
黒色腫を有し、これは少なくとも0.5cmの直径、任意の厚みの腫瘍、任意の数の波及リン
パ節、移行中の転移、または遠隔転移を有する。
5.1. RheoSwitch Therapeutic SystemおよびhIL-12を有するアデノウイルスの調製
組換えDNAをエクスビボでのアデノウイルスベクター形質導入により樹状細胞（DC）に
導入する。組換えDNAを用いて、腫瘍内に注入した未成熟樹状細胞からヒトIL-12(p70)を
発現させ、これは腫瘍微環境においてDCの生存を延長させて成熟を刺激し、その結果、DC
は続いて流入領域リンパ節に移動することになる。これによってTヘルパー細胞はTh1型へ
と分化する方向に偏り、腫瘍抗原でのクロスプライミングによって腫瘍特異的細胞毒性T
細胞の活性化も起こる。
組換えアデノウイルスベクターとして用いる組換えDNAは、RheoSwitch(登録商標) Ther
apeutic System（RTS）の制御下でヒトIL-12の発現を可能にする。RTSはヒトユビキチンC
プロモーターから発現される2シストロン性メッセージを含み、2つの融合タンパク質：Ga
l4-EcRおよびVP16-RXRをコードする。Gal4-EcRは酵母Gal4のDNA結合ドメイン（アミノ酸1
〜147）と昆虫トウヒシントメハマキ（Choristoneura fumiferana）からのエクジソン受
容体のDFFドメインとの間の融合物である。別の態様において、RTSはヒトユビキチンCプ
ロモーターから発現される2シストロン性メッセージからなり、2つの融合タンパク質：Ga
l4-EcRおよびVP16-RXRをコードする。Gal4-EcRは酵母Gal4のDNA結合ドメイン（アミノ酸1
〜147）と昆虫トウヒシントメハマキからのエクジソン受容体のDEFドメインとの間の融合
物である。VP16-RXRはHSV-VP16の転写活性化ドメインとヒトおよびバッタ配列由来のキメ
ラRXRのEFドメインとの間の融合物である。これらのGal4-EcRおよびVP16-RXR配列は、EMC
Vからの内部リボソーム侵入部位（IRES）によって分離されている。これら2つの融合タン
パク質は、Gal4-EcRが低分子薬物（RG-115932）に結合すると二量体化し、6つのGal4結合
部位および合成最小プロモーターを含むGal4応答性プロモーターからのhIL-12の転写を活
性化する。前述のRTS転写単位はhIL-12転写単位の下流に位置する。この全RTS-hIL12カセ
ットを、アデノウイルス5ゲノムにE1領域が欠失している部位で組み込む。アデノウイル
ス主鎖はE3遺伝子も欠いている。アデノウイルスベクターAd-RTS-hIL-12の地図を図8に示
す。
本試験において用いる組換えアデノウイルスベクターは、ウイルスベクター配列に加え
て以下の例示的調節配列を含む：ヒトユビキチンCプロモーター、EMCV由来の内部リボソ
ーム侵入部位、Gal4結合部位の6コピーを含む誘導性プロモーター、SP-1結合部位の3コピ
ー、および合成最小プロモーター配列、SV40ポリアデニル化部位、ならびにヒトアルファ
-グロビン遺伝子由来の転写終止配列。他の調節配列を代替物として用いうることが理解
されるべきである。
例示的組換えアデノウイルスベクターAd-RTS-hIL-12が以下の様式で生成されている。E
MCV-IRES（内部リボソーム侵入部位）で分離された受容体融合タンパク質、VP16-RXRおよ
びGal4-EcRのコード配列を、ヒトユビキチンCプロモーター（構成的プロモーター）の制
御下でアデノウイルスシャトルベクターに挿入する。続いて、Gal4結合部位の6コピーを
含む合成誘導性プロモーターの制御下に置いた、IRESで分離されたhIL-12のp40およびp35
サブユニットのコード配列を、ユビキチンCプロモーターおよび受容体配列の上流に挿入
する。シャトルベクターは、左端から地図単位16（mu16）までにアデノウイルス血清型5
配列を含み、これからE1配列が欠失し、RTSおよびIL-12配列によって置き換えられている
（RTS-hIL-12）。RTS-hIL-12を有するシャトルベクターを、活性化薬物依存的IL-12発現
についてHT-1080細胞における一時的トランスフェクションによって試験する。次いで、
シャトルベクターをアデノウイルス主鎖で、HEK 293細胞への同時トランスフェクション
により組み替えて、組換えアデノウイルスAd-RTS-hIL-12を得る。アデノウイルス主鎖は
、ゲノムの左端にmu0から9.2の配列欠失およびE3遺伝子を含む。シャトルベクターおよび
アデノウイルス主鎖は、それらの間の組換えおよび組換えアデノウイルスベクターの生成
を可能にするmu9.2からmu16の重複配列を含む。組換えアデノウイルスベクターはE1およ
びE3領域が欠損しているため、ウイルスは正常な哺乳動物細胞における複製に欠陥がある
。しかし、ウイルスは、アデノウイルス-5 E1領域を有するHEK 293細胞中で複製すること
ができ、したがってE1機能をトランスに提供する。
例示的組換えアデノウイルスベクターが以下の様式で生成されている：ヒトIL12の誘導
性発現のためのDNA配列を有する直鎖化シャトルベクター、およびアデノウイルス主鎖をH
EK293細胞に同時トランスフェクションする。シャトルベクターおよびウイルス主鎖上の
重複配列間の組換えにより、組換えアデノウイルスを生成し、HEK293細胞においてウイル
ス粒子にパッケージングする。HEK293細胞をウシ胎仔血清を含むDMEM中で培養する。
提唱する試験のために用いるウイルスをCsCl密度勾配遠心沈降により精製した。組換え
アデノウイルスを2ラウンドのプラーク精製にかけ、得られた種株を用いて、十分に特徴
付けられたマスターセルバンクからのHEK293細胞中での増幅により、マスターウイルスバ
ンク（MVB）を生成した。MVBに、複製可能アデノウイルス（RCA）、無菌性、マイコプラ
ズマ、外来ウイルス、レトロウイルス、ヒトウイルスHIV1/2、HTLV1/2、HAV、HBV、HCV、
EBV、B19、CMV、HHV-6、7および8、ウシおよびブタウイルス、完全ベクター配列ならびに
ヒト細胞株中のAD誘導性IL12発現による機能試験を含む、広範なcGMP/GLP公開試験を行う
。
MVBからのウイルスをcGMP施設で精製ウイルスの産生のために用いてもよく、再度、同
一性、RCA、無菌性、マイコプラズマ、外来ウイルス、ウイルス粒子-感染単位の比、宿主
細胞DNA、エンドトキシンおよびタンパク質の混入、ならびにヒト細胞株中のAD誘導性IL1
2発現による機能試験を含む、公開試験を行ってもよい。
6.2. hIL-12導入遺伝子およびRheoSwitch(登録商標) Therapeutic System（RTS）を含む
アデノウイルスによる自己樹状細胞の形質導入
ヒト対象由来の樹状細胞をエクスビボで形質導入し、腫瘍に注入する。DCを、ウイルス
形質導入の前に、生存度、純度（典型的には＞80％の細胞がDC表現型を示す）無菌性、マ
イコプラズマおよびエンドトキシンについて特徴付ける。ウイルス形質導入の後、細胞を
繰り返し洗浄して、いかなる吸収されていないウイルスも除去する。最後の洗液の上清を
、残留ウイルスの含有量についてPCRで試験する。DCをエクスビボでアデノウイルスベク
ター（非組み込み型ベクター）によって形質導入しており、腫瘍内注入およびその後の流
入領域リンパ節への移動後のDCの寿命は短いため、ウイルスDNAが任意の非標的細胞に組
み込まれるとは予想されない。DCのアデノウイルス形質導入に用いるプロトコルは80〜90
％の形質導入を達成すると予想され、非常に効率的であると考えられる。
白血球搬出によるPBMCの回収：対象にUPCI外来のアフェレーシス部門で標準の90から12
0分の白血球搬出を行う。白血球搬出法は、一方の腕の静脈から血液を取り出し；血液を
遠心分離機（血球分離機）を通過させ、ここで血液成分を分離し、1つまたは複数の成分
を除去し；および残りの成分を対象の同じ、または他方の腕の静脈に戻すことを含む。血
液を血球分離装置によって処理するいかなる時にも、対象の全血液量の15％を越えて抜き
取ることはしない。血球分離機において、血液を血漿、血小板、白血球および赤血球に分
離する。白血球（WBC）を除去し、他の成分をすべて対象に循環中に戻す。このために2つ
の末梢IVラインを用いるためのあらゆる試みを行う。それが可能でなければ、中枢ライン
が必要となることもある。医師は対象に白血球搬出を行うことを明瞭にしなければならず
、この方法の前に生命徴候（血圧を含む）について日常的スクリーニングを行う。
処理：採取後、ロイカパック（leukapack）を手動でCPLに送達し、ただちにELUTRA(商
標)での遠心エルトリエーションにより処理する。これは臨床で用いるために妥当性確認
された閉鎖システムである。単球画分を回収し、細胞の回収および生存度を確立した後、
Aastromカートリッジに移して、IL-4およびGM-CSF存在下で6日間培養する。すべての処理
および洗浄手順を無菌条件下で行う。
初期播種：1つのロイカパックから回収した単球を、トリパンブルー色素存在下で計数
して、生細胞の数をもとめる。フローサイトメトリーにより単球の純度を評価する。単球
を、SOP-CPL-0166に従い1,000IU/mLのIL-4および1,000IU/mLのGM-CSFを含む無血清および
無抗生物質CellGenix培地中5から10×106細胞/mLで再懸濁する。カセット接種のために最
小ローディング量50mlおよび最小細胞数が必要である。
培養：Aastromカートリッジを、完全に閉鎖した、未成熟DC生成用のcGMP適合自動培養
装置、Replicell Systemのインキュベーターに入れる。
未成熟DC回収：第6日目に、Aastromカートリッジをインキュベーターから取り出し、未
成熟DCを回収する。細胞を1,500rpmでの遠心分離により回収し、CellGenix培地で洗浄し
、トリパンブルー色素存在下で計数し、形態および表現型の特徴を調べる。
生存度：トリパンブルー存在下で血球計数器による計数を行って生存度を評価する。一
般に、回収した細胞の＞95％が生存、すなわちトリパンブルー色素を排除する。生存度が
70％未満であれば、未成熟DCを廃棄する。
表現型分類：培養で生成した細胞を、血球計数器上で鏡検により計数し、予備的鑑別計
算（DC対リンパ球）をトリパンブルー色素を用いて行う。鑑別計算の確認を、DC対リンパ
球でゲーティングし、未成熟DC同定のための基準として高い前方および側方散乱特性を用
いて、フローサイトメトリーにより行う。未成熟DCは日常的に、＞80％の樹状細胞の形態
を有する細胞を含み、DC表現型を有する。
IL-12p70力価検定：成熟DC（mDC）は、自発的に、または先天性免疫シグナル（例えば
、LPS）の追加を伴う、または伴わないCD40Lでの活性化により、IL-12p70を産生する能力
を有することが確立されている。標準化されたIL-12p70産生検定が最近確立され、様々な
条件下で生成されたDCワクチンの少量の試料または大規模ロットに適用可能である。現行
の力価検定は2つの異なる段階からなり、第一の段階は応答DCを、刺激因子としてのヒトC
D40リガンド遺伝子を安定に形質移入したJ588リンパ腫細胞と同時インキュベートするこ
とを含む。第二の段階は、これらの同時培養物からの上清を、LuminexシステムでJ558/CD
40L±LPSで刺激したDCにより分泌されたIL-12p70のレベルについて試験することを含む。
この力価検定は検定間CV＝18.5％（n＝30）および広いダイナミックレンジを有し、これ
は非常に異なるレベルのIL-12p70産生によって特徴付けられる様々なDC生成物の評価を容
易にする。13名の健常供与者の単球からのDC生成物を用いて確立した検定の正常範囲は8
〜999pg/mLで、平均270pg/mLであった。
樹状細胞の生産および発売基準
インビトロで生成した樹状細胞の各ロットを、微生物混入物（好気性および嫌気性菌、
真菌およびマイコプラズマ）、ならびにエンドトキシンの存在について試験し、表現型お
よび機能について特徴付ける。対象に注入するすべての樹状細胞は新鮮で、凍結保存する
ことはない。
DCの品質保証試験：前述のとおりに生成したDCを、無菌性、生存度、純度、力価および
安定性について評価する。細胞生成物の発売のための基準を確立し、厳密に従う。
生存度：培養で生成した細胞を、血球計数器上で鏡検により計数し、鑑別計算（DC対リ
ンパ球）をトリパンブルー色素を用いて行う。この計算は、試験した培養物中の生細胞の
パーセンテージを提供する。発売基準を通るために、トリパンブルー排除による細胞生存
度が70％を越え、単球由来DCマーカーとしてHLA-DRおよびCD86を発現している細胞が最低
70％であることが必要とされる。試験的分析のために、DC成熟状態を評価するためのCD83
およびCCR7、ならびにリンパ球混入を評価するためのCD3およびCD19などの、追加のマー
カーを含んでいてもよい。
純度：FITCおよびPE結合mAbで染色した細胞の2色フローサイトメトリー分析を用いて、
形態学的に特定されたDCがDCについて規定された表面抗原を発現し、単球ならびにTおよ
びB細胞系統の抗原を欠くことを調べる。ワクチン調製のために、生成したDCはHLA-DRお
よびCD86を発現しなければならず、CD3、CD19、またはCD14を発現してはならない。mDCと
考えるために、細胞はCD83+およびCCR7+を発現しなければならない。
力価：DC力価の尺度を定義するために、発明者らは前述のとおりIL-12p70を産生するDC
の能力を調べた。
無菌性：DCを、University of Pittsburgh Medical Center Microbiology Laboratory
において、BD Bactecシステム（Becton Dickinson Co., Sparks, MD）を用いての細菌（
好気性および嫌気性）および真菌培養により試験する。微生物培養の最終結果は14日で得
られる。ワクチン使用のためのDCの発売の前に、グラム染色を実施し、微生物の存在が陰
性でなければならない。
IMCPLはGen-Probe Mycoplasma Tissue Culture Rapid Detection System（Gen-Probe,
Inc. San Diego, CA）を用いてマイコプラズマを試験し、これは核酸ハイブリダイゼーシ
ョン技術に基づいている。エンドトキシン試験を、Limulus Amoebocyte Lysate Pyrogen
Plus検定（Bio Whittaker, Inc., Walkerville, MD）を用いて実施する。エンドトキシン
試験は、細胞培養物において回収時と最終生成物の発売前に行う。許容されるエンドトキ
シンレベルは体重1kgあたり＜5EUである。非形質導入および形質導入樹状細胞をさらなる
分析のために凍結保存する。
形質導入細胞はすべて導入遺伝子を発現すると予想される。80％を越えるDCは形質導入
されていると予想される。導入遺伝子において本来のコード配列が維持されるため、生成
物は生物学的に活性であろう。腫瘍に注入したウイルス形質導入DCは未成熟DC表現型で、
成熟するまでIL-12を発現せず、したがってこの段階では、IL-12発現はほとんどが導入遺
伝子からである。IL-12導入遺伝子の発現は低分子活性化薬物RG-115932によって用量依存
的に誘導されるため、形質導入DCにおける導入遺伝子発現のレベルを所望のレベルに制御
することができる。ヒト対象に投与するために調製した形質導入DCの少量を、IL12発現の
活性化薬物依存的誘導について、インビトロで試験してもよい。IL-12発現を4ng/mlの感
度のELISAで検定してもよい。
インビボマウス腫瘍モデルは、皮下黒色腫（B16）腫瘍を有するマウスをアデノウイル
ス形質導入DCの注入およびマウスIL12導入遺伝子の誘導により推奨ヒト試験と同じ様式で
処置したという点で、ヒト試験と同様である。腫瘍退行が観察された後、同じ腫瘍細胞で
再攻撃しても腫瘍成長は見られず、全身の腫瘍免疫を示していた。
推奨試験において用いるベクターによって形質導入した細胞からのインビトロでのIL-1
2の誘導は、ELISAにより定量して、24時間で106細胞あたり約500ngのIL-12を生じると予
想される。黒色腫のマウスモデルを用いての前臨床試験において、106個以上の形質導入D
Cの腫瘍内注入は有効性を示した。しかし、必要とされる腫瘍内注入はこの量よりも低い
レベルで有効性を示しうると予想され、したがって、より少ない量またはより多い量が必
要かどうかを調べるために、5×107個の形質導入DCの注入を出発点として用いてもよい。
例えば、インビトロで、IL12の遺伝子を有する組換えアデノウイルスを形質導入したヒ
トおよびマウス細胞株ならびに一次樹状細胞は、活性化薬物に用量依存的に反応して、IL
12発現の誘導を示す。
ヒトDCの異なるMOIおよび異なるウイルス吸着期間でのアデノウイルス形質導入は、MOI
＝500で3時間のウイルス吸着によりこれらの細胞の効率的形質導入を示した。活性化薬物
はこれらの形質導入ヒトDCにおいてIL-12発現を誘導した（図9）。
前述のマウス黒色腫モデルにおけるインビボ実験のために、C57/BL6マウスにB16細胞の
皮下注入を行って腫瘍を形成した。RTSの制御下でマウスIL-12遺伝子を有するアデノウイ
ルスベクターを形質導入したDCの腫瘍内注入は、活性化薬物の投与と共に、腫瘍に特異的
な全身免疫をもたらした。処置は腫瘍退行を引き起こした。治癒したマウスの50日後のB1
6細胞による再攻撃は、B16細胞が腫瘍を形成しないことを示した。この腫瘍免疫の誘導は
活性化薬物の投与に依存し、したがって注入した形質導入DCにおけるIL-12発現に依存し
ていた。活性化薬物は腹腔内および経口経路において有効であった。図11および図14参照
。
6.3. 活性化薬物の製剤
本明細書において用いる活性化薬物を以下の製剤の任意の1つに製剤する：
（1）100％Labrasol；
（2）（a）メントール、（b）チモール、（c）ユーカリプトール、（d）アスパルテーム
、（e）サッカリンナトリウム、（f）クエン酸、（g）ペパーミント香料、（h）クリーム
香料、（i）labrasolを含む、Listerine風味のLabrasol（Latitude Pharmaceuticals Inc
., USA）；
（3）Miglyol 812およびphospholipon 90G（Latitude Pharmaceuticals Inc., USA）；ま
たは
（4）Miglyol 812、phospholipon 90GおよびビタミンEトコフェリルポリエチレングリコ
ールスクシネート（Latitude Pharmaceuticals Inc., USA）。
6.4. 送達
様々な濃度および特定のプロトコルが想定されうるが、患者を治療するための一例は、
RTSの制御下でhIL-12（ヒトインターロイキン12）を発現するよう遺伝子操作した形質導
入自己樹状細胞（AdDC）を滅菌食塩水中に5×107個の濃度で懸濁し、その腫瘍内注入を、
経口活性化薬物（RG-115932）との組み合わせで受ける患者を含むことになる。
6.4.1 初期治療
第1日目の入院患者来診：第1日目に、基準時理学検査（生命徴候、体重、およびECOG状
態を含む）を行う。基準時血清化学、尿検査、および血液学（安全性プロファイル）のた
めに、尿を集め、血液を採取する。インビトロで遺伝子操作した樹状細胞の腫瘍内注入の
約3時間前に、各対象に活性化薬物（コホート1−0.01mg/kg、0.3mg/kg、1.0mg/kg、およ
び3mg/kg）を食事の直後に投与する。活性化薬物およびその主な代謝物の1回投与薬物動
態を評価するために、血液を指定の間隔（投与前、AD投与後0.5、1、1.5、2、4、6、8、1
2、16、および24時間）で1日目に採取する。各対象に、RTSの制御下でhIL-12を発現する
よう遺伝子操作した、アデノウイルス形質導入自己樹状細胞の1回腫瘍内注入を5×107細
胞の濃度で投与する。対象を局所注射部位反応および/または過敏反応について注意深く
モニターする。第2から14日目の入院患者来診： 第2から14日目に、各対象に活性化薬物
を食事の直後に投与する。生命徴候および有害事象を第2から14日目まで1日1回収集する
。第4日目±24時間の時点で、腫瘍および/または流入領域リンパ節の生検試料を約50％の
対象から取り出し、hIL-12および細胞免疫応答を測定する。第8日目に、体重を測定する
。第8日目±24時間の時点で、腫瘍および/または流入領域リンパ節の生検試料を、第4日
目に生検を実施していない対象から取り出し、hIL-12および細胞免疫応答を測定する。第
4日目±24時間および第8日目±24時間の時点で、アデノウイルスおよび/またはRTS成分に
対して可能な抗体および細胞免疫応答の検定のために血液を採取する。他のサイトカイン
の発現がhIL-12導入遺伝子での処置によって影響されるかどうかを調べるために、血清サ
イトカインプロファイルも得る。第8日目に、基準時血清化学、尿検査、および血液学（
安全性プロファイル）のために、尿を集め、血液を採取する。第8日目に、活性化薬物お
よびその主な代謝物の定常状態の薬物動態/ADMEを評価するために、血液を指定の間隔（
投与前、AD投与後0.5、1、2、4、6、8、12、16、および24時間）で採取する。
第14日目の入院患者来診：第14日目に、各対象に活性化薬物を食事の直後に投与する。
各対象に理学検査（生命徴候、身長、体重およびECOG状態を含む）を行う。血清化学、尿
検査、および血液学（安全性プロファイル）のために、尿を集め、血液を採取する。第14
日目±24時間の時点で、アデノウイルスおよび/またはRTS成分に対して可能な抗体および
細胞免疫応答の検定のために血液を採取する。他のサイトカインの発現が影響されるかど
うかを調べるために、血清サイトカインプロファイルも得る。
指定の入院患者および外来患者来診時に対象から血液を採取し、アデノウイルスおよび
/またはRTS成分に対して可能な抗体および細胞免疫応答を測定する。基準時血清サイトカ
インプロファイルのために採血する。AdVeGFP感染性阻止型検定を用いて、アデノウイル
スベクターに対する抗体応答を検出する（Gambotto, Robins et al. 2004）。RTS成分に
対する抗体応答を、患者からの血清および発現ベクターから生成したRTSタンパク質を用
いてウェスタンブロットおよび/またはELISAにより評価する。加えて、多重サイトカイン
試験を血清中で、IL-12、IFN-ガンマ、IP-10、ならびにIL-2、TNF-アルファ、IL-4、IL-5
、およびIL-10などの他のTh1/Th2サイトカインについてLuminexにより行う。これらの抗
体およびサイトカイン検定は約10mlの血液が必要である。
細胞免疫応答検定は約50〜60mlの血液を用い、それからCD4およびCD8 T細胞サブセット
を分離する。分離したT細胞を、AdVおよびRTS由来抗原がいくらかでもあれば、それらに
より活性化されたT細胞によるINF-ガンマ産生についてのELISPOT検定において、空のAdV
ベクター、AdV-RTS、またはAdV-RTS-hIL12ベクターを形質導入した自己DCと混合する。腫
瘍に対する早期応答を評価するため、それ自体としての腫瘍細胞および/または共有黒色
腫抗原を発現するDCを用いて同様の検定を実施する。必要に応じて追加の検定も実施する
。
第14日目±24時間の時点で、腫瘍および/または流入領域リンパ節の生検試料を、hIL-1
2および細胞免疫応答の測定のために利用可能な組織を有するすべての対象から取り出す
。有害事象を記録する。第14日目の手順完了後、各対象を入院診療所から退院させ、1ヶ
月経過観察の外来来診のために約3週間以内に戻るよう依頼する。
早期中止来診：対象が入院治療相を完了することができない場合、以下の早期中止来診
手順を診療所から退院する前に行う。各対象に理学検査（生命徴候、身長、体重およびEC
OG状態を含む）を行う。血清化学、尿検査、および血液学（安全性プロファイル）のため
に、尿を集め、血液を採取する。前述のアデノウイルスおよび/またはRTS成分に対して可
能な抗体および細胞免疫応答の検定のために血液を採取する。他のサイトカインの発現が
影響されるかどうかを調べるために、血清サイトカインプロファイルも得る。腫瘍および
/または流入領域リンパ節の生検試料を、hIL-12および細胞免疫応答の測定のために利用
可能な組織を有するすべての対象から取り出す。有害事象を記録する。早期中止来診の手
順完了後、各対象を入院診療所から退院させ、1ヶ月経過観察の外来来診のために約3週間
以内に戻るよう依頼する。
1から4ヶ月目の経過観察来診：1から4ヶ月目の経過観察期間中に有害事象を収集する。
1、2、および3ヶ月目の来診時に、経過観察理学検査（生命徴候、体重およびECOG状態を
含む）を行う。1、2、および3ヶ月目の来診時に、血清化学、尿検査、および血液学（安
全性プロファイル）のために、尿および血液を採取する。1および3ヶ月目の来診時に、ア
デノウイルスおよび/またはRTS成分に対して可能な抗体および細胞免疫応答の検定のため
に血液を採取する。1ヶ月目の来診時に、血清サイトカインプロファイリングのために血
液を得る。1ヶ月目の来診時に、腫瘍および/または流入領域リンパ節の生検を、hIL-12お
よび細胞免疫応答の測定のために、利用可能な組織を有する対象で実施する。2および4ヶ
月目の来診時に、CT/PETスキャンを行って、全体の疾患進行または退行を評価する。
5から6ヶ月目の経過観察来診：3ヶ月目または4ヶ月目に薬物関係の毒性が観察されれば
、5ヶ月目から6ヶ月目の経過観察来診を行う。5ヶ月目から6ヶ月目の経過観察期間中に有
害事象を収集する。対象の安全性を、5ヶ月目の間から6ヶ月目の外来来診まで、診療所職
員から各対象への電話によりモニターする。薬物関係の毒性が5ヶ月目の間に起こるか、
または持続し、治験責任医師によって重篤、安定化していない、またはさらなる評価が正
当であると考えられる場合；診療所職員は対象に電話するだけでなく、対象に来診するよ
う依頼する。6ヶ月目の来診時に、経過観察理学検査（生命徴候、体重およびECOG状態を
含む）を行う。血清化学、尿検査、および血液学（安全性プロファイル）のために、尿お
よび血液を採取する。6ヶ月目の来診時に、アデノウイルスおよび/またはRTS成分に対し
て可能な抗体および細胞免疫応答の検定ためにも血液を採取する。6ヶ月目の来診時に、C
T/PETスキャンを行って、全体の疾患進行または退行を評価する。
活性化薬物投与＆停止基準：用量制限毒性（DLT；すなわち、コホート1の1群に登録し
た対象3名のうち＞2名がCTCAE v3.0による＞等級3の毒性を経験）が所与の用量レベルで
判定されれば、次の群の対象3名に同じ用量レベルの活性化薬物を投与する。DLTがさらな
る投与群の対象1名以上で観察されれば、用量増大を中止し、次に低い用量を最大耐容用
量（MTD）と考え、そうでなければMTDに達するか、または最大用量10mg/kgまで（どちら
でも最初に起こった方）用量増大を再開する。
安全性、耐容性、および導入遺伝子機能を、コホート1の各群のすべての対象について
、活性化薬物の次に最も高い用量を投与するために対象を登録する前に、AdDCの注入後1
ヶ月まで評価する。
対象が、ひょっとすると、多分または明確に試験薬治療に関係していると考えられる、
CTCAE v3.0による＞等級3の毒性を経験すれば、活性化薬物の投与をその対象に対して中
止し、対象は早期中止来診手順を受ける。
試験停止基準：コホートの＞70％の対象が、多分または明確に試験薬治療に関係してい
ると考えられる、CTCAE v3.0による＞等級3の毒性を経験すれば、活性化薬物の投与をす
べての対象に対して中止し、すべての対象は早期中止来診手順を受ける。
治験薬：本治験において、2つの治験薬の組み合わせを、安全性、耐容性、導入遺伝子
機能、および免疫学的効果について評価する。第III期または第IV期黒色腫を有する対象
に、低分子活性化薬物を経口液剤として0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kgおよび10.0mg/kg
の用量で1日1回連続14日間と、hIL-12を発現するように遺伝子操作したアデノウイルス形
質導入自己樹状細胞を5×107個の濃度で1回腫瘍内注入との組み合わせで投与する。追加
のAdDC腫瘍内注入と活性化薬物による連続14日間の治療との組み合わせを対象に投与する
選択肢もある。
6.5. 安全性の評価から導入遺伝子機能および免疫学的効果の評価
エンドトキシン試験を、細胞培養物において回収時と最終生成物の放出前に行う。許容
されるエンドトキシンレベルは体重1kgあたり＜5EUである。非形質導入および形質導入樹
状細胞をさらなる分析のために凍結保存する。
安全性の評価：アデノウイルス形質導入自己樹状細胞の1回腫瘍内注入と経口活性化薬
物との組み合わせの安全性を、試験中および12ヶ月目の経過観察時に、理学検査、生命徴
候、血清化学、尿検査、血液学、有害事象、ならびにアデノウイルスおよびRTS成分に対
する抗体および細胞免疫応答によって評価する。スクリーニング時に妊娠可能な女性には
、妊娠試験を行う。併用薬物と可能な有害事象との間に関係があるかどうかを調べるため
に、スクリーニング時および再治療の第0日目に対象から併用薬物のリストも得る。スク
リーニング相および初期入院治療相（26日間）の間に、合計茶さじ約89杯（439ml）の血
液プラス白血球搬出を対象から採取する。入院再治療相（26日間、前回の入院来診から5
〜6週間）の間に、合計茶さじ約75杯（370ml）の血液プラス白血球搬出を対象から採取す
る。外来経過観察相（1〜6ヶ月目）の間に、合計茶さじ約46杯（227ml）の血液を対象か
ら採取する。
理学検査：完全な理学検査（ECOG状態を含む）を、指定の入院および外来来診時に行う
。各対象の病歴および人口統計学もスクリーニング来診時に記録する。
生命徴候：各対象の生命徴候を予定の各理学検査に含めるが、すべての入院および外来
来診時にも行う。生命徴候は血圧、脈拍、体温、および呼吸を含む。体重および身長も指
定の来診時に記録する。生命徴候（身長および体重を除く）を、活性化薬物の投与を行っ
た後、最初の2時間は1時間毎、次いで8時間ごとに記録する。
血液化学：無作為の非絶食血液試料を各対象から指定の入院および外来来診時に採取し
、血清を化学検査のために回収する。以下の血清試験を実施する：AST（アスパラギン酸
トランスアミナーゼ）、ALT（アラニントランスアミナーゼ）、GGT（ガンマグルタミルト
ランスペプチダーゼ）、LDH（乳酸デヒドロゲナーゼ）、LAP（ロイシンアミノペプチダー
ゼ）、アルカリ性ホスファターゼ、クレアチニン、総ビリルビン、総タンパク質、アルブ
ミン、血液尿素窒素、総コレステロール、グルコース、および電解質。
尿検査：無作為の中間尿試料を各対象から指定の入院および外来来診時に採取し、分析
する。以下の試験を実施する：色および外観の記載、比重、pH、グルコース、ケトン体、
タンパク質、赤血球および白血球数、ならびにピロール尿。
血液学：無作為の非絶食血液試料を各対象から指定の入院および外来来診時に採取し、
血液学試験を以下のとおりに行う：白血球数、白血球分画、赤血球数、ヘマトクリット、
ヘモグロビン、赤血球指数、および血小板数を含む全血球計算（CBC）。PTT（部分トロン
ボプラスチン時間）およびPT（プロトロンビン時間）も評価する。
有害事象：NCI Common Terminology Criteria for Adverse Events（CTCAE 第3.0版）
を用いて、試験中および3〜6ヶ月の経過観察期間の毒性を評価する。有害事象/経験は、
事象が試験品に関係すると考えられるかどうかに関わらず、試験品（薬物、生物製剤、ま
たは装置）の使用に付随する任意の反応、副作用、または他の都合が悪い事象（徴候、症
状、検査データの変化）である。重篤な有害事象/経験は、以下の転帰のいずれかをもた
らす任意の有害事象または経験である：死亡、生命を脅かす有害経験、先天性異常/出産
時欠損、入院もしくはすでに入院している場合の入院延長、または持続性もしくは顕著な
能力障害/不能。死亡、生命を脅かす、または入院を必要とする結果にはならないと思わ
れる重要な医学的事象/経験は、適当な医学的判断に基づき、それらが対象を危険にさら
しうる、または本定義に挙げた転帰の1つを予防するために内科的もしくは外科的介入を
必要としうる場合に、重篤な有害経験であると考えてもよい。
有害事象の重症度は以下のとおりに等級付けされる：等級1（軽度）、等級2（中等度）
、等級3（重症）、等級4（生命を脅かす、または能力障害を引き起こす）、等級5（有害
事象に関係する死亡）。有害事象と治験薬との間の関係を、臨床判断および以下の定義に
基づいて判定する：
a. 明確に関係しているとは、治験薬の投与から妥当な時間的配列に従い、治験薬に対す
る公知の反応パターンに従い、かつプロトコルに対して適当である場合は、治験薬停止（
積極的脱攻撃）後の改善および反復曝露（積極的再攻撃）後の反応の再出現によって確認
され、かつ対象の臨床状態の公知の特徴または他の治療によって妥当に説明ができない、
有害事象である。
b. 多分関係しているとは、治験薬の投与からの時間的配列に従い、治験薬に対する公知
の反応パターンに従い、かつプロトコルに対して適当である場合は、脱攻撃後の改善によ
って確認され、かつ対象の臨床状態の公知の特徴または他の治療によって妥当に説明がで
きない、有害事象である。
c. ひょっとすると関係しているとは、治験薬の投与から妥当な時間的配列に従い、治験
薬に対する公知の反応パターンに従うが、対象の臨床状態または他の治療によって生じて
いる可能性がある、有害事象である。
d. 無関係とは、原因が治験薬に無関係であることを示す十分な情報がある、有害事象で
ある。以下の変数の2つ以上が無関係の有害事象に適用される：1. 有害事象が治験薬投
与後の妥当な時間的配列に従わない、2. 有害事象が対象の臨床状態または他の治療によ
って容易に説明される、3. 有害事象が用量低減または治療の停止後に軽減されない（観
察間隔内での有害事象の軽減を予想するのが妥当であると仮定して）。
対象の登録後に観察または報告されたすべての有害事象を記録する。登録時に存在して
、悪化した任意の状態は有害事象として記録する。有害事象を自発的に申告された症状お
よび臨床観察ならびに治験来診時の評価に基づき判定する。各入院および外来来診時に、
登録対象に有害事象に関して「どのように感じていますか」などの非誘導的質問により自
発的情報をもとめる。検査値の変化を、臨床上顕著と考えられる場合、および治療の開始
などの臨床上の変化または行動が必要とされる場合に、有害事象として記録する。
アデノウイルスおよび/またはRTS成分に対して可能な抗体および細胞免疫応答：血液を
対象から指定の入院および外来来診時に採取し、アデノウイルスおよび/またはRTS成分に
対して可能な抗体および細胞免疫応答ならびに腫瘍抗原を評価する。AdVeGFP感染性阻止
型検定を用いて、アデノウイルスベクターに対する抗体応答を検出する（Nwanegbo, et a
l. 2004）。RTS成分に対する抗体応答を、対象からの血清および発現ベクターから生成し
たRTSタンパク質を用いてウェスタンブロットおよび/またはELISAにより評価する。加え
て、多重サイトカイン試験を血清中で、IL-12、IFN-ガンマ、IP-10、ならびにIL-2、TNFa
、IL-4、IL-5、およびIL-10などの他のTh1/Th2サイトカインについてLuminexにより行う
。これらの抗体およびサイトカイン検定は約10mlの血液が必要である。
細胞免疫応答検定は約50〜60mlの血液を用い、それからCD4およびCD8 T細胞サブセット
を分離する。分離したT細胞を、AdVおよびRTS由来抗原がいくらかでもあれば、それらに
より活性化されたT細胞によるINF-ガンマ産生についてのELISPOT検定において、空のAdV
ベクター、AdV-RTS、またはAdV-RTS-hIL12ベクターを形質導入した自己DCと混合する。腫
瘍に対する早期免疫応答を評価するため、それ自体としての腫瘍細胞および/または共有
黒色腫抗原を発現するDCを用いて同様の検定を実施する。必要に応じて追加の検定を実施
してもよい。
妊娠試験：妊娠可能な女性には、スクリーニング来診時および再治療相の1回目の入院
来診前に、尿妊娠試験を行う。試験を初期治療および再治療期間の両方の間、活性化薬物
投与の少なくとも72、48、24、または12時間前に実施する。尿妊娠試験が陽性であれば、
血清妊娠試験で確認する。妊娠が確認されれば、対象が治験に入る、または再治療相を継
続することは認められない。妊娠試験は必要がある限り多く再実施してもよい。
併用薬物の問診：治験および経過観察相の間に起こる有害事象との関係の任意の可能性
を判定するために、スクリーニング時、および再治療相の1回目の入院来診前に、各対象
に併用薬物のリストを提供するよう依頼する。
再治療基準：対象が前回のAdDC接種に制限性の有害反応なく耐容し、可能な再治療時に
疾患の進行または症状の減退を示していなければ、その対象への再治療を考慮する。治験
責任医師および治療医師の見解において、追加のAdDCの腫瘍内注入と連続14日間の活性化
薬物（コホート1からの最大耐容用量）との組み合わせに臨床上の利益の可能性がある場
合、以下の基準に適合すれば、対象に再治療を提案する：
1. 制限性の毒性がこれまでまったくなく、
2. 対象の疾患が安定しているか、または改善の臨床もしくは主観的徴候を示しており、
かつ
3. RheoSwitch(登録商標) Therapeutic Systemのアデノウイルス成分に対する抗体また
は細胞免疫応答の証拠がない。
導入遺伝子機能および免疫学的効果の評価：hIL-12の導入遺伝子発現および細胞免疫応
答のインビボ評価のために、腫瘍および関連する流入領域リンパ節のパンチまたは切除生
検試料をスクリーニング中（第-12日目から第-7日目）、治験の第4日目、第8日目および
第14日目、ならびに経過観察の1ヶ月目に採取する（表3〜5参照）。hIL-12の導入遺伝子
発現および細胞免疫応答のインビボ評価のために、腫瘍および関連する流入領域リンパ節
の細針吸引生検を再治療期間の第-12から-7日目および第14日目に採取する。生検試料を
標準の光学顕微鏡および免疫組織化学によって検査し、T細胞の腫瘍および流入領域リン
パ節への細胞浸潤を評価する。生検切片は試験対象の背景を知らない病理学者が検査する
。腫瘍および流入領域リンパ節における内因性およびDCにより誘導されたIL-12発現を識
別するために、適当に設計されたプライマーによるRNAに対するRT-PCRを用いる。血清サ
イトカインプロファイルのために、血液をスクリーニング時、治験の第4日目、第8日目お
よび第14日目、経過観察の1ヶ月目、ならびに再治療期間の第-12から-7日目、第8日目お
よび第14日目に採取する（表3〜5参照）。他のサイトカインの発現がhIL-12導入遺伝子で
の治療によって影響されるかどうかを調べるために、血清サイトカインプロファイルを得
る。多重サイトカイン試験を血清中で、IL-12、IFN-ガンマ、IP-10、ならびにIL-2、TNFa
、IL-4、IL-5、およびIL-10などの他のTh1/Th2サイトカインについてLuminexにより行う
。これらの抗体およびサイトカイン検定は約10mlの血液が必要である。
活性化薬物の1回投与および定常状態の薬物動態：活性化薬物およびその主な代謝物の1
回投与薬物動態を評価するために治験の第1日目と、定常状態の薬物動態/ADMEを測定する
ために治験の第8日目の指定の間隔（投与前、朝投与の0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、16
、および24時間後）で血液を採取する。活性化薬物およびその主な代謝物の以下の定常状
態の薬物動態終点を得るために、血漿をHPLCで評価する：Cmax（観察された最大血漿濃度
）、Tmax（観察された最大血漿濃度までの時間）、Ctrough（0および24時間における濃度
の平均として算出した、観察された最小血漿濃度）、C24h（24時間における血漿濃度）、
AUC24h（0から24時間の血漿濃度-時間曲線下面積）、Ke（見かけの排出速度）、およびT1
12（見かけの半減期）。
前述の態様および例示はいかなる点でも本発明の範囲を限定することを意図するもので
はなく、添付の特許請求の範囲は本明細書において明確に示しているか否かにかかわらず
、すべての態様および例示を包含することを意図していることが理解されるべきである。
文献
Figure 2016128451
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前述の態様および例示はいかなる点でも本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲は本明細書において明確に示しているか否かにかかわらず、すべての態様および例示を包含することを意図していることが理解されるべきである。

本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、インターロイキン-12（IL-12）の
機能を有するタンパク質を条件的に発現するためのベクターであって、該遺伝子スイッチ
が、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存的転写因子をコードする少
なくとも1つの転写因子配列、および（2）該リガンド依存的転写因子によって活性化する
プロモーターに連結された、IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオ
チドを含む、ベクター。
［２］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連結さ
れた、リガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、および（2）
該リガンド依存的転写因子によって活性化するプロモーターに連結された、IL-12の機能
を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項1記載のベクター。
［３］
アデノウイルスベクターである、請求項1または2記載のベクター。
［４］
rAD.RheoIL12である、請求項3記載のベクター。
［５］
遺伝子スイッチがエクジソン受容体（EcR）に基づく遺伝子スイッチである、請求項1〜4
のいずれか一項記載のベクター。
［６］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドがプロモーター制御下にある第一の転写因
子配列および第二の転写因子配列を含み、該第一の転写因子配列および該第二の転写因子
配列によってコードされるタンパク質が相互作用してリガンド依存的転写因子として機能
するタンパク質複合体を形成する、請求項1〜5のいずれか一項記載のベクター。
［７］
第一の転写因子および第二の転写因子が内部リボソーム侵入部位によって連結されている
、請求項6記載のベクター。
［８］
内部リボソーム侵入部位がEMCV IRESである、請求項7記載のベクター。
［９］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが第一のプロモーター制御下にある第一の
転写因子配列および第二のプロモーター制御下にある第二の転写因子配列を含み、該第一
の転写因子配列および該第二の転写因子配列によってコードされるタンパク質が相互作用
してリガンド依存的転写因子として機能するタンパク質複合体を形成する、請求項1また
は2記載のベクター。
［１０］
第一の転写因子配列がVP-16トランス活性化ドメインおよびレチノイン酸X受容体（RXR）
タンパク質をコードする核酸を含む、請求項5〜9のいずれか一項記載のベクター。
［１１］
第二の転写因子配列がGAL-4 DNA結合ドメインおよびエクジソン受容体（EcR）タンパク質
をコードする核酸を含む、請求項5〜10のいずれか一項記載のベクター。
［１２］
リガンド依存的転写因子によって活性化するプロモーターに連結された、IFN-アルファの
機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1〜11のい
ずれか一項記載のベクター。
［１３］
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドがヒトIL-12をコードする
、請求項1〜12のいずれか一項記載のベクター。
［１４］
IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、野生型ヒトIL-12と少
なくとも85％同一のポリペプチドをコードする、請求項13記載のベクター。
［１５］
IL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現する樹状細胞の集団を生成する方法であ
って、請求項1〜14のいずれか一項記載のベクターを樹状細胞に導入することにより、該
樹状細胞の少なくとも一部を改変する段階を含む、方法。
［１６］
樹状細胞がヒト樹状細胞である、請求項15記載の方法。
［１７］
樹状細胞が骨髄樹状細胞である、請求項16記載の方法。
［１８］
請求項1〜14のいずれか一項記載のベクターを含む、インビトロで遺伝子操作した樹状細
胞。
［１９］
IFN-アルファの機能を有するタンパク質を条件的に発現するベクターをさらに含むインビ
トロで遺伝子操作した樹状細胞であって、該ベクターが遺伝子スイッチをコードするポリ
ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連結された
、リガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、および（2）該リ
ガンド依存的転写因子によって活性化するプロモーターに連結された、IFN-アルファの機
能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項18記載のインビトロ
で遺伝子操作した樹状細胞。
［２０］
請求項18記載のインビトロで遺伝子操作した樹状細胞の集団を含む、薬学的組成物。
［２１］
腫瘍内、腹腔内または皮下投与に適した、請求項20記載の薬学的組成物。
［２２］
インビトロで遺伝子操作した樹状細胞の集団が少なくとも10 4 個の細胞を含む、請求項20
または21記載の薬学的組成物。
［２３］
インビトロで遺伝子操作した樹状細胞の集団が少なくとも10 7 個の細胞を含む、請求項20
または21記載の薬学的組成物。
［２４］
哺乳動物の腫瘍治療用の医薬の製造における、請求項18または19記載のインビトロで遺伝
子操作した樹状細胞の集団の使用。
［２５］
腫瘍が良性腫瘍である、請求項24記載の使用。
［２６］
腫瘍が悪性腫瘍である、請求項24記載の使用。
［２７］
腫瘍が黒色腫である、請求項24記載の使用。
［２８］
腫瘍が悪性黒色腫皮膚癌である、請求項27記載の使用。
［２９］
前記細胞をそれを必要としている哺乳動物に投与する、請求項24〜28のいずれか一項記載
の使用。
［３０］
リガンド依存的転写因子を活性化するリガンドの有効量を前記哺乳動物にさらに投与する
、請求項29記載の使用。
［３１］
リガンドがRG-115819、RG-115932、およびRG-115830からなる群より選択される、請求項3
0記載の使用。
［３２］
リガンドがアミドケトンまたはオキサジアゾリンである、請求項30または31記載の使用。
［３３］
リガンドを腫瘍内、経口、腹腔内、または皮下に投与する、請求項30〜32のいずれか一項
記載の使用。
［３４］
リガンドを、インビトロで遺伝子操作した樹状細胞の前または後1時間未満で投与する、
請求項30〜33のいずれか一項記載の使用。
［３５］
リガンドを、インビトロで遺伝子操作した樹状細胞の後24時間未満で投与する、請求項30
〜33のいずれか一項記載の使用。
［３６］
リガンドを、インビトロで遺伝子操作した樹状細胞の後48時間未満で投与する、請求項30
〜33のいずれか一項記載の使用。
［３７］
治療が腫瘍成長を低減させる、請求項24〜36のいずれか一項記載の使用。
［３８］
治療が腫瘍成長を阻害する、請求項24〜36のいずれか一項記載の使用。
［３９］
患者におけるインビトロで遺伝子操作した樹状細胞に基づく治療レジメンの有効性を判定
するための方法であって：
（a）それを必要としている患者からインビトロで遺伝子操作した樹状細胞の投与前に得
た、第一の生体試料中のインターフェロン-ガンマ（IFN-γ）の発現のレベルもしくは活
性のレベルまたは両方を測定し、それにより対照レベルをもとめる段階；
（b）それを必要としている患者に、請求項18または19記載のインビトロで遺伝子操作し
た樹状細胞を投与する段階；
（c）それを必要としている患者に、活性化リガンドの有効量を投与する段階；
（d）それを必要としている患者からインビトロで遺伝子操作したDCおよび活性化リガン
ドの投与後に得た、第二の生体試料中のIFN-γの発現のレベルもしくは活性のレベルまた
は両方を測定し、それにより試験レベルをもとめる段階；および
（e）IFN-γの対照レベルと試験レベルとを比較し、ここでIFN-γの発現、活性、または
両方の対照レベルに対する試験レベルの上昇が、それを必要としている該患者において治
療レジメンが有効であることを示す段階
を含む方法。
［４０］
それを必要としている患者がヒト患者である、請求項39記載の方法。
［４１］
患者が癌患者である、請求項39記載の方法。
［４２］
癌患者が黒色腫患者である、請求項41記載の方法。
［４３］
IFN-γのレベルをELISAで測定する、請求項39記載の方法。
［４４］
リガンドがジアシルヒドラジンである、請求項39〜43のいずれか一項記載の方法。
［４５］
リガンドがRG-115819、RG-115932、およびRG-115830からなる群より選択される、請求項4
4記載の方法。
［４６］
リガンドがアミドケトンまたはオキサジアゾリンである、請求項39記載の方法。
［４７］
リガンドを腫瘍内、経口、腹腔内、または皮下に投与する、請求項39〜46のいずれか一項
記載の方法。
［４８］
リガンドをインビトロで遺伝子操作した樹状細胞の前または後1時間未満で投与する、請
求項39〜47のいずれか一項記載の方法。
［４９］
リガンドをインビトロで遺伝子操作した樹状細胞の後24時間未満で投与する、請求項39〜
47のいずれか一項記載の方法。
［５０］
リガンドをインビトロで遺伝子操作した樹状細胞の後48時間未満で投与する、請求項39〜
47のいずれか一項記載の方法。
［５１］
請求項18または19記載のインビトロで遺伝子操作した樹状細胞を含むキット。
［５２］
RG-115819、RG-115830、またはRG-115932からなる群より選択されるリガンドをさらに含
む、請求項51記載のキット。
［５３］
樹状細胞におけるインターロイキン-12（IL-12）の機能を有するタンパク質の条件的発現
を誘導するための医薬の製造における、請求項18または19記載のインビトロで遺伝子操作
した樹状細胞の集団の使用。
［５４］
インビトロで遺伝子操作した樹状細胞をそれを必要としている哺乳動物に投与する、請求
項53記載の使用。
［５５］
リガンド依存的転写因子を活性化するリガンドの有効量を前記哺乳動物にさらに投与する
、請求項54記載の使用。
［５６］
哺乳動物が腫瘍を有する、請求項54または55記載の使用。
［５７］
インビトロで遺伝子操作した樹状細胞を腫瘍内、腹腔内または皮下に投与する、請求項56
記載の使用。
［５８］
腫瘍が良性腫瘍である、請求項56記載の使用。
［５９］
腫瘍が悪性腫瘍である、請求項56記載の使用。
［６０］
腫瘍が黒色腫である、請求項56記載の使用。
［６１］
腫瘍が悪性黒色腫皮膚癌である、請求項60記載の使用。
［６２］
インビトロで遺伝子操作した樹状細胞がヒト樹状細胞である、請求項53〜61のいずれか一
項記載の使用。
［６３］
インビトロで遺伝子操作した樹状細胞が骨髄樹状細胞である、請求項62記載の使用。
［６４］
インビトロで遺伝子操作した樹状細胞の集団が少なくとも10 7 個の細胞を含む、請求項53
〜63のいずれか一項記載の使用。
［６５］
インビトロで遺伝子操作した樹状細胞の集団が少なくとも5×10 7 個の細胞を含む、請求項
53〜64のいずれか一項記載の使用。
［６６］
リガンドがRG-115819、RG-115932、およびRG-115830からなる群より選択される、請求項5
5〜65のいずれか一項記載の使用。
［６７］
リガンドがアミドケトンまたはオキサジアゾリンである、請求項55〜65のいずれか一項記
載の使用。
［６８］
リガンドを腫瘍内、経口、腹腔内、または皮下に投与する、請求項66または67記載の使用
。
［６９］
リガンドをインビトロで遺伝子操作した樹状細胞の前または後1時間未満で投与する、請
求項66〜68のいずれか一項記載の使用。
［７０］
リガンドをインビトロで遺伝子操作した樹状細胞の後24時間未満で投与する、請求項66〜
68のいずれか一項記載の使用。
［７１］
リガンドをインビトロで遺伝子操作した樹状細胞の後48時間未満で投与する、請求項66〜
68のいずれか一項記載の使用。
［７２］
それを必要としている哺乳動物の腫瘍成長を低減させる、請求項53〜71のいずれか一項記
載の使用。
［７３］
それを必要としている哺乳動物の腫瘍を阻害する、請求項53〜71のいずれか一項記載の使
用。

Claims (73)

  1. 遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、インターロイキン-12（IL-12）
    の機能を有するタンパク質を条件的に発現するためのベクターであって、該遺伝子スイッ
    チが、（1）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存的転写因子をコードする
    少なくとも1つの転写因子配列、および（2）該リガンド依存的転写因子によって活性化す
    るプロモーターに連結された、IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレ
    オチドを含む、ベクター。
  2. 遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連結
    された、リガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、および（2
    ）該リガンド依存的転写因子によって活性化するプロモーターに連結された、IL-12の機
    能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項1記載のベクター。
  3. アデノウイルスベクターである、請求項1または2記載のベクター。
  4. rAD.RheoIL12である、請求項3記載のベクター。
  5. 遺伝子スイッチがエクジソン受容体（EcR）に基づく遺伝子スイッチである、請求項1〜
    4のいずれか一項記載のベクター。
  6. 遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドがプロモーター制御下にある第一の転写
    因子配列および第二の転写因子配列を含み、該第一の転写因子配列および該第二の転写因
    子配列によってコードされるタンパク質が相互作用してリガンド依存的転写因子として機
    能するタンパク質複合体を形成する、請求項1〜5のいずれか一項記載のベクター。
  7. 第一の転写因子および第二の転写因子が内部リボソーム侵入部位によって連結されてい
    る、請求項6記載のベクター。
  8. 内部リボソーム侵入部位がEMCV IRESである、請求項7記載のベクター。
  9. 遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが第一のプロモーター制御下にある第一
    の転写因子配列および第二のプロモーター制御下にある第二の転写因子配列を含み、該第
    一の転写因子配列および該第二の転写因子配列によってコードされるタンパク質が相互作
    用してリガンド依存的転写因子として機能するタンパク質複合体を形成する、請求項1ま
    たは2記載のベクター。
  10. 第一の転写因子配列がVP-16トランス活性化ドメインおよびレチノイン酸X受容体（RXR
    ）タンパク質をコードする核酸を含む、請求項5〜9のいずれか一項記載のベクター。
  11. 第二の転写因子配列がGAL-4 DNA結合ドメインおよびエクジソン受容体（EcR）タンパク
    質をコードする核酸を含む、請求項5〜10のいずれか一項記載のベクター。
  12. リガンド依存的転写因子によって活性化するプロモーターに連結された、IFN-アルファ
    の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1〜11の
    いずれか一項記載のベクター。
  13. IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドがヒトIL-12をコードす
    る、請求項1〜12のいずれか一項記載のベクター。
  14. IL-12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、野生型ヒトIL-12と
    少なくとも85％同一のポリペプチドをコードする、請求項13記載のベクター。
  15. IL-12の機能を有するタンパク質を条件的に発現する樹状細胞の集団を生成する方法で
    あって、請求項1〜14のいずれか一項記載のベクターを樹状細胞に導入することにより、
    該樹状細胞の少なくとも一部を改変する段階を含む、方法。
  16. 樹状細胞がヒト樹状細胞である、請求項15記載の方法。
  17. 樹状細胞が骨髄樹状細胞である、請求項16記載の方法。
  18. 請求項1〜14のいずれか一項記載のベクターを含む、インビトロで遺伝子操作した樹状
    細胞。
  19. IFN-アルファの機能を有するタンパク質を条件的に発現するベクターをさらに含むイン
    ビトロで遺伝子操作した樹状細胞であって、該ベクターが遺伝子スイッチをコードするポ
    リヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドが、（1）プロモーターに機能的に連結され
    た、リガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、および（2）該
    リガンド依存的転写因子によって活性化するプロモーターに連結された、IFN-アルファの
    機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項18記載のインビト
    ロで遺伝子操作した樹状細胞。
  20. 請求項18記載のインビトロで遺伝子操作した樹状細胞の集団を含む、薬学的組成物。
  21. 腫瘍内、腹腔内または皮下投与に適した、請求項20記載の薬学的組成物。
  22. インビトロで遺伝子操作した樹状細胞の集団が少なくとも104個の細胞を含む、請求項2
    0または21記載の薬学的組成物。
  23. インビトロで遺伝子操作した樹状細胞の集団が少なくとも107個の細胞を含む、請求項2
    0または21記載の薬学的組成物。
  24. 哺乳動物の腫瘍治療用の医薬の製造における、請求項18または19記載のインビトロで遺
    伝子操作した樹状細胞の集団の使用。
  25. 腫瘍が良性腫瘍である、請求項24記載の使用。
  26. 腫瘍が悪性腫瘍である、請求項24記載の使用。
  27. 腫瘍が黒色腫である、請求項24記載の使用。
  28. 腫瘍が悪性黒色腫皮膚癌である、請求項27記載の使用。
  29. 前記細胞をそれを必要としている哺乳動物に投与する、請求項24〜28のいずれか一項記
    載の使用。
  30. リガンド依存的転写因子を活性化するリガンドの有効量を前記哺乳動物にさらに投与す
    る、請求項29記載の使用。
  31. リガンドがRG-115819、RG-115932、およびRG-115830からなる群より選択される、請求
    項30記載の使用。
  32. リガンドがアミドケトンまたはオキサジアゾリンである、請求項30または31記載の使用
    。
  33. リガンドを腫瘍内、経口、腹腔内、または皮下に投与する、請求項30〜32のいずれか一
    項記載の使用。
  34. リガンドを、インビトロで遺伝子操作した樹状細胞の前または後1時間未満で投与する
    、請求項30〜33のいずれか一項記載の使用。
  35. リガンドを、インビトロで遺伝子操作した樹状細胞の後24時間未満で投与する、請求項
    30〜33のいずれか一項記載の使用。
  36. リガンドを、インビトロで遺伝子操作した樹状細胞の後48時間未満で投与する、請求項
    30〜33のいずれか一項記載の使用。
  37. 治療が腫瘍成長を低減させる、請求項24〜36のいずれか一項記載の使用。
  38. 治療が腫瘍成長を阻害する、請求項24〜36のいずれか一項記載の使用。
  39. 患者におけるインビトロで遺伝子操作した樹状細胞に基づく治療レジメンの有効性を判
    定するための方法であって：
    （a）それを必要としている患者からインビトロで遺伝子操作した樹状細胞の投与前に得
    た、第一の生体試料中のインターフェロン-ガンマ（IFN-γ）の発現のレベルもしくは活
    性のレベルまたは両方を測定し、それにより対照レベルをもとめる段階；
    （b）それを必要としている患者に、請求項18または19記載のインビトロで遺伝子操作し
    た樹状細胞を投与する段階；
    （c）それを必要としている患者に、活性化リガンドの有効量を投与する段階；
    （d）それを必要としている患者からインビトロで遺伝子操作したDCおよび活性化リガン
    ドの投与後に得た、第二の生体試料中のIFN-γの発現のレベルもしくは活性のレベルまた
    は両方を測定し、それにより試験レベルをもとめる段階；および
    （e）IFN-γの対照レベルと試験レベルとを比較し、ここでIFN-γの発現、活性、または
    両方の対照レベルに対する試験レベルの上昇が、それを必要としている該患者において治
    療レジメンが有効であることを示す段階
    を含む方法。
  40. それを必要としている患者がヒト患者である、請求項39記載の方法。
  41. 患者が癌患者である、請求項39記載の方法。
  42. 癌患者が黒色腫患者である、請求項41記載の方法。
  43. IFN-γのレベルをELISAで測定する、請求項39記載の方法。
  44. リガンドがジアシルヒドラジンである、請求項39〜43のいずれか一項記載の方法。
  45. リガンドがRG-115819、RG-115932、およびRG-115830からなる群より選択される、請求
    項44記載の方法。
  46. リガンドがアミドケトンまたはオキサジアゾリンである、請求項39記載の方法。
  47. リガンドを腫瘍内、経口、腹腔内、または皮下に投与する、請求項39〜46のいずれか一
    項記載の方法。
  48. リガンドをインビトロで遺伝子操作した樹状細胞の前または後1時間未満で投与する、
    請求項39〜47のいずれか一項記載の方法。
  49. リガンドをインビトロで遺伝子操作した樹状細胞の後24時間未満で投与する、請求項39
    〜47のいずれか一項記載の方法。
  50. リガンドをインビトロで遺伝子操作した樹状細胞の後48時間未満で投与する、請求項39
    〜47のいずれか一項記載の方法。
  51. 請求項18または19記載のインビトロで遺伝子操作した樹状細胞を含むキット。
  52. RG-115819、RG-115830、またはRG-115932からなる群より選択されるリガンドをさらに
    含む、請求項51記載のキット。
  53. 樹状細胞におけるインターロイキン-12（IL-12）の機能を有するタンパク質の条件的発
    現を誘導するための医薬の製造における、請求項18または19記載のインビトロで遺伝子操
    作した樹状細胞の集団の使用。
  54. インビトロで遺伝子操作した樹状細胞をそれを必要としている哺乳動物に投与する、請
    求項53記載の使用。
  55. リガンド依存的転写因子を活性化するリガンドの有効量を前記哺乳動物にさらに投与す
    る、請求項54記載の使用。
  56. 哺乳動物が腫瘍を有する、請求項54または55記載の使用。
  57. インビトロで遺伝子操作した樹状細胞を腫瘍内、腹腔内または皮下に投与する、請求項
    56記載の使用。
  58. 腫瘍が良性腫瘍である、請求項56記載の使用。
  59. 腫瘍が悪性腫瘍である、請求項56記載の使用。
  60. 腫瘍が黒色腫である、請求項56記載の使用。
  61. 腫瘍が悪性黒色腫皮膚癌である、請求項60記載の使用。
  62. インビトロで遺伝子操作した樹状細胞がヒト樹状細胞である、請求項53〜61のいずれか
    一項記載の使用。
  63. インビトロで遺伝子操作した樹状細胞が骨髄樹状細胞である、請求項62記載の使用。
  64. インビトロで遺伝子操作した樹状細胞の集団が少なくとも107個の細胞を含む、請求項5
    3〜63のいずれか一項記載の使用。
  65. インビトロで遺伝子操作した樹状細胞の集団が少なくとも5×107個の細胞を含む、請求
    項53〜64のいずれか一項記載の使用。
  66. リガンドがRG-115819、RG-115932、およびRG-115830からなる群より選択される、請求
    項55〜65のいずれか一項記載の使用。
  67. リガンドがアミドケトンまたはオキサジアゾリンである、請求項55〜65のいずれか一項
    記載の使用。
  68. リガンドを腫瘍内、経口、腹腔内、または皮下に投与する、請求項66または67記載の使
    用。
  69. リガンドをインビトロで遺伝子操作した樹状細胞の前または後1時間未満で投与する、
    請求項66〜68のいずれか一項記載の使用。
  70. リガンドをインビトロで遺伝子操作した樹状細胞の後24時間未満で投与する、請求項66
    〜68のいずれか一項記載の使用。
  71. リガンドをインビトロで遺伝子操作した樹状細胞の後48時間未満で投与する、請求項66
    〜68のいずれか一項記載の使用。
  72. それを必要としている哺乳動物の腫瘍成長を低減させる、請求項53〜71のいずれか一項
    記載の使用。
  73. それを必要としている哺乳動物の腫瘍を阻害する、請求項53〜71のいずれか一項記載の
    使用。
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Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2698212A1 (en) * 2007-08-23 2009-02-26 Intrexon Corporation Methods and compositions for diagnosing disease
NZ584848A (en) * 2007-09-28 2012-09-28 Intrexon Corp Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof
MX2010003720A (es) * 2007-10-08 2010-10-20 Intrexon Corp Celulas dendriticas creadas por ingenieria genetica y usos para el tratamiento de cancer.
KR101361416B1 (ko) 2008-10-08 2014-02-21 인트렉손 코포레이션 다수의 면역조절자를 발현하는 조작된 세포 및 그 용도
PL2534242T3 (pl) * 2010-02-10 2016-11-30 Polepszona kompozycja do hamowania proliferacji komórek nowotworowych
AU2011232435B2 (en) * 2010-03-23 2016-01-28 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing therapeutic proteins, host cells comprising the vectors, and uses thereof
EP3238782A3 (en) * 2010-04-06 2018-01-03 ExoCyte Therapeutics Pte, LTD Methods of treating cancer
CN102026031B (zh) * 2010-12-28 2013-09-04 张朝晖 一种机顶盒
CN102174479B (zh) * 2011-03-02 2013-04-03 北京锤特生物科技有限公司 靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒及其应用
EP3450568A3 (en) * 2011-03-04 2019-04-24 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing protein
TWI586640B (zh) 2011-09-08 2017-06-11 英翠克頌公司 結晶狀二醯基肼及其用途
EP3925615A1 (en) * 2011-10-11 2021-12-22 Universität Zürich Combination medicament comprising il-12 and an agent for blockade of t-cell inhibitory molecules for tumour therapy
US11951157B2 (en) 2011-10-11 2024-04-09 Universitat Zurich Methods of treating malignant tumour with IL-12 and anti-PD-1 antibody
WO2013148649A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Use of survivin antagonists in polyomavirus-related disease
SG10201901057UA (en) * 2014-08-05 2019-03-28 Cb Therapeutics Inc Anti-pd-l1 antibodies
JP6797111B2 (ja) * 2014-09-30 2020-12-09 インターベット インターナショナル ベー． フェー． イヌｐｄ−ｌ１と結合するｐｄ−ｌ１抗体
WO2017062953A1 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Intrexon Corporation Improved therapeutic control of proteolytically sensitive, destabilized forms of interleukin-12
WO2017083750A1 (en) 2015-11-11 2017-05-18 Intrexon Corporation Compositions and methods for expression of multiple biologically active polypeptides from a single vector for treatment of cardiac conditions and other pathologies
IL321834A (en) 2016-06-08 2025-08-01 Precigen Inc Cd33 specific chimeric antigen receptors
UY37343A (es) 2016-07-25 2018-02-28 Intrexon Corp Control del fenotipo en plantas
CN118406655A (zh) 2017-01-10 2024-07-30 普瑞赛格恩公司 通过新基因开关表达系统调节多肽的表达
CN110475566A (zh) * 2017-02-02 2019-11-19 斯克里普斯研究学院 工程细胞和使用方法
CA3053239A1 (en) * 2017-02-17 2018-08-23 George Todaro Use of tgf alpha for the treatment of diseases and disorders
RU2645957C1 (ru) * 2017-04-10 2018-02-28 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ лечения лучевых повреждений мочевого пузыря
CN110997920A (zh) 2017-06-07 2020-04-10 英特拉克森公司 新型细胞标签的表达
RU2663468C1 (ru) * 2017-09-25 2018-08-06 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ лечения местно-распространенного нерезектабельного рака поджелудочной железы
IL277128B2 (en) 2018-03-06 2025-11-01 Precigen Inc Hepatitis b vaccines and uses of the same
CN112088015A (zh) 2018-03-06 2020-12-15 普莱西根股份有限公司 人乳头瘤病毒疫苗及其用途
CN112912389B (zh) * 2018-06-19 2024-04-19 H·李·莫菲特癌症中心和研究所公司 使用i型干扰素和cd40配体的溶瘤病毒或抗原呈递细胞介导的癌症治疗
CN113226337A (zh) * 2018-06-27 2021-08-06 普莱西根股份有限公司 治疗癌症的体内受控联合疗法
WO2020180424A1 (en) 2019-03-04 2020-09-10 Iocurrents, Inc. Data compression and communication using machine learning
WO2020206056A1 (en) 2019-04-04 2020-10-08 Greenvenus Llc Peptides and methods of plant protection
CN110804594B (zh) * 2019-11-21 2020-11-20 启辰生生物科技(珠海)有限公司 工程化抗原递呈细胞及其在用于活化cd3+免疫细胞中的应用
EP4061485A4 (en) * 2019-11-22 2023-12-20 Alaunos Therapeutics, Inc. METHOD FOR TREATING GLIOBLASTOMA
AU2021236879A1 (en) * 2020-03-16 2022-11-10 Vrije Universiteit Brussel A mixture of mRNA to enhance the potency of dendritic cells
US20240342246A1 (en) * 2021-08-16 2024-10-17 Yale University Interleukin-12 variants and methods of use
CN114480280B (zh) * 2022-03-02 2023-09-29 中国科学院理化技术研究所 烟草花叶病毒在刺激巨噬细胞极化为m1型巨噬细胞中应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002513578A (ja) * 1998-05-05 2002-05-14 アシュエスエフ・ファーマシューティカルズ・ソシエテ・アノニム 単一ストレスによる目的の遺伝子の持続された活性化を達成するための分子調節回路
JP2002524537A (ja) * 1998-09-15 2002-08-06 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション サイトカイン発現が遺伝的に増強された抗原提示細胞のインサイチュ注入
WO2005044881A1 (ja) * 2003-11-07 2005-05-19 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 核酸分子送達用担体
JP2007524595A (ja) * 2003-02-28 2007-08-30 レオジーン， インコーポレイテッド エクジソン受容体複合体を通して外因性遺伝子の発現を調節するための生物学的利用能のあるジアシルヒドラジン・リガンド
JP5934776B2 (ja) * 2007-10-08 2016-06-15 イントレキソン コーポレーション 遺伝子操作した樹状細胞および癌の治療のための使用

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4985461A (en) * 1985-10-21 1991-01-15 Rohm And Haas Company Insecticidal N'-substituted-N,N'-diacylhydrazines
US5117057A (en) * 1985-10-21 1992-05-26 Rohm And Haas Company Insecticidal N' substituted-N-N'-disubstituted-hydrazines
FR2593630B1 (fr) 1986-01-27 1988-03-18 Maurice Francois Ecran d'affichage a matrice active a resistance de drain et procedes de fabrication de cet ecran
US5225443A (en) * 1986-05-01 1993-07-06 Rohm And Haas Company Insecticidal N'-substituted-N'-substituted N,N'-diacylhydrazines
US4981784A (en) * 1987-12-02 1991-01-01 The Salk Institute For Biological Studies Retinoic acid receptor method
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5693622A (en) * 1989-03-21 1997-12-02 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5399346A (en) * 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5264618A (en) * 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
CA2043775A1 (en) 1990-06-14 1991-12-15 Dat P. Le Dibenzoylakylcyanohydrazines
IL100643A (en) * 1991-01-25 1996-10-31 Nippon Kayaku Kk History of hydrazine and pesticides containing these histories as an active ingredient
US6013836A (en) 1992-02-28 2000-01-11 Rohm And Haas Company Insecticidal N'-substituted-N,N'-disubstitutedhydrazines
US5530028A (en) * 1992-11-23 1996-06-25 Rohm And Haas Company Insecticidal N'-substituted-N,N'-diacylhydrazines
US5814618A (en) * 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
US6652850B1 (en) * 1993-09-13 2003-11-25 Aventis Pharmaceuticals Inc. Adeno-associated viral liposomes and their use in transfecting dendritic cells to stimulate specific immunity
US5834441A (en) * 1993-09-13 1998-11-10 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Adeno-associated viral (AAV) liposomes and methods related thereto
WO1995014091A2 (en) * 1993-11-18 1995-05-26 Chiron Viagene, Inc. Compositions and methods for utilizing conditionally lethal genes
FR2714830B1 (fr) 1994-01-10 1996-03-22 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
US5573764A (en) * 1994-01-21 1996-11-12 Genetics Institute, Inc. Use of interleukin-12 to prevent graft versus host disease
FR2715847B1 (fr) 1994-02-08 1996-04-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
FR2727679B1 (fr) 1994-12-05 1997-01-03 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
US6306649B1 (en) * 1995-06-27 2001-10-23 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Heterologous transcription factors
US7176186B1 (en) * 1997-09-16 2007-02-13 The University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Stimulation of cell-mediated immune responses by targeted particulate genetic immunization
US6734014B1 (en) 1996-02-08 2004-05-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods and compositions for transforming dendritic cells and activating T cells
US6723531B2 (en) * 1996-04-05 2004-04-20 The Salk Institute For Biological Studies Method for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto
US5922685A (en) * 1996-06-05 1999-07-13 Powderject Vaccines, Inc. IL-12 gene therapy of tumors
JP2000515007A (ja) * 1996-06-14 2000-11-14 バイエル・コーポレーシヨン Ｔ細胞選択的インターロイキン―４アゴニスト
CA2269642A1 (en) * 1996-10-29 1998-05-07 Valentis, Inc. Modified glucocorticoid receptors, glucocorticoid receptors/progesterone receptors hybrids
WO1998022588A2 (en) * 1996-11-20 1998-05-28 Introgen Therapeutics, Inc. An improved method for the production and purification of adenoviral vectors
US5972986A (en) * 1997-10-14 1999-10-26 G.D. Searle & Co. Method of using cyclooxygenase-2 inhibitors in the treatment and prevention of neoplasia
US6899870B1 (en) * 1998-03-11 2005-05-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Induction of apoptic or cytotoxic gene expression by adenoviral mediated gene codelivery
US7279565B2 (en) * 1998-05-05 2007-10-09 Richard Voellmy Molecular regulatory circuits to achieve sustained activation of genes of interest by a single stress
US6333318B1 (en) 1998-05-14 2001-12-25 The Salk Institute For Biological Studies Formulations useful for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto
US6258603B1 (en) 1998-06-17 2001-07-10 Rohm And Haas Company Ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
BR0010539A (pt) * 1999-05-13 2002-02-19 American Cyanamid Co Composição antigênica, e, método para incrementar a capacidade de uma composição antigênica
US6630324B1 (en) * 1999-07-29 2003-10-07 Baylor College Of Medicine Aldehyde reductase bidirectional promoter and its use
US6774226B1 (en) * 1999-11-30 2004-08-10 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules encoding cancer associated antigens, the antigens per se, and uses thereof
US20040033600A1 (en) * 2001-03-21 2004-02-19 Palli Subba Reddy Ecdysone receptor-based inducible gene expression system
WO2001070816A2 (en) 2000-03-22 2001-09-27 Rohm And Haas Company Ecdysone receptor-based inducible gene expression system
RU2192263C2 (ru) * 2000-08-17 2002-11-10 Российский научно-исследовательский нейрохирургический институт им. проф. А.Л.Поленова Способ лечения злокачественных опухолей головного мозга
AR030382A1 (es) * 2000-08-18 2003-08-20 Yamanouchi Pharma Tech Inc Formulacion oral de un inhibidor de ciclooxigenasa-2 de fusion rapida
US8105825B2 (en) 2000-10-03 2012-01-31 Intrexon Corporation Multiple inducible gene regulation system
DK1373470T3 (da) * 2001-02-20 2013-07-29 Intrexon Corp Hidtil ukendte substitutionsmutantreceptorer og deres anvendelse i et cellekernereceptorbaseret inducerbart genekspressionssystem
JP4994563B2 (ja) 2001-02-20 2012-08-08 イントレキソン コーポレーション 新規置換突然変異体受容体および核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるその使用
DK1456346T3 (da) 2001-02-20 2012-05-29 Intrexon Corp Nyt inducerbart genekspressionssystem baseret på ecdysonreceptor/invertebrat-retinoid-x-receptor
EP1572862B1 (en) 2001-02-20 2012-08-01 Intrexon Corporation Chimeric retinoid x receptors and their use in a novel ecdysone receptor-based inducible gene expression system
CA2349506C (en) * 2001-06-14 2009-12-08 Duke University A method for selective expression of therapeutic genes by hyperthermia
US7375093B2 (en) 2002-07-05 2008-05-20 Intrexon Corporation Ketone ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US20080050808A1 (en) * 2002-10-09 2008-02-28 Reed Thomas D DNA modular cloning vector plasmids and methods for their use
US7785871B2 (en) 2002-10-09 2010-08-31 Intrexon Corporation DNA cloning vector plasmids and methods for their use
WO2004044147A2 (en) * 2002-11-07 2004-05-27 Lung-Ji Chang Modified dendritic cells
GB0228465D0 (en) * 2002-12-06 2003-01-08 Univ Belfast A method of treating disease
US7304161B2 (en) 2003-02-10 2007-12-04 Intrexon Corporation Diaclhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex
US7304162B2 (en) 2003-02-21 2007-12-04 Intrexon Corporation Oxadiazoline ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US20050130306A1 (en) * 2003-12-10 2005-06-16 Richard Voellmy Viral vectors whose replication and, optionally, passenger gene are controlled by a gene switch activated by heat in the presence or absence of a small molecule regulator
US7935510B2 (en) * 2004-04-30 2011-05-03 Intrexon Corporation Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
JP2007537755A (ja) 2004-05-18 2007-12-27 イントレクソン コーポレイション Ｄｎａクローニングベクタープラスミドのダイナミックなベクター構築のための方法
US9034650B2 (en) 2005-02-02 2015-05-19 Intrexon Corporation Site-specific serine recombinases and methods of their use
US7833754B2 (en) * 2006-01-13 2010-11-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services IL-12 for expression in mammalian cell
DK2167458T3 (en) * 2007-05-29 2018-06-18 Intrexon Corp CHIRAL DIACYL HYDRAZINE LIGANDS FOR MODULATING EXPRESSION OF EXOGENEOUS GENES OF AN ECDYSON RECEPTOR COMPLEX
NZ584848A (en) * 2007-09-28 2012-09-28 Intrexon Corp Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002513578A (ja) * 1998-05-05 2002-05-14 アシュエスエフ・ファーマシューティカルズ・ソシエテ・アノニム 単一ストレスによる目的の遺伝子の持続された活性化を達成するための分子調節回路
JP2002524537A (ja) * 1998-09-15 2002-08-06 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション サイトカイン発現が遺伝的に増強された抗原提示細胞のインサイチュ注入
JP2007524595A (ja) * 2003-02-28 2007-08-30 レオジーン， インコーポレイテッド エクジソン受容体複合体を通して外因性遺伝子の発現を調節するための生物学的利用能のあるジアシルヒドラジン・リガンド
WO2005044881A1 (ja) * 2003-11-07 2005-05-19 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 核酸分子送達用担体
JP5934776B2 (ja) * 2007-10-08 2016-06-15 イントレキソン コーポレーション 遺伝子操作した樹状細胞および癌の治療のための使用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOTECHNIQUES, vol. 41, no. 3, JPN6013041645, 2006, pages 283 - 290 *
MOLECULAR THERAPY, vol. Vol.13, Suppl.1, JPN6013041644, 2006, pages p.S194 *

Also Published As

Publication number Publication date
IL204841A (en) 2014-08-31
US20090123441A1 (en) 2009-05-14
WO2009048560A1 (en) 2009-04-16
ZA201003163B (en) 2011-07-27
EP2207874A4 (en) 2010-11-10
EP2207874A1 (en) 2010-07-21
CN101883845B (zh) 2015-06-10
JP2015091827A (ja) 2015-05-14
NZ585190A (en) 2012-11-30
JP6290270B2 (ja) 2018-03-07
KR101932027B1 (ko) 2018-12-24
ES2636460T3 (es) 2017-10-05
EP2207874B1 (en) 2014-12-03
US9675642B2 (en) 2017-06-13
IL204841A0 (en) 2010-11-30
RU2010118428A (ru) 2011-11-20
EP2674483A1 (en) 2013-12-18
KR20160047595A (ko) 2016-05-02
AU2008311292B9 (en) 2014-10-09
JP2010539993A (ja) 2010-12-24
US20120114620A1 (en) 2012-05-10
RU2017146770A3 (ja) 2019-07-17
CN101883845A (zh) 2010-11-10
RU2484132C2 (ru) 2013-06-10
US20130149290A1 (en) 2013-06-13
BRPI0818287A2 (pt) 2015-11-03
AU2008311292A1 (en) 2009-04-16
CA2702058A1 (en) 2009-04-16
KR101740205B1 (ko) 2017-05-25
KR101655487B1 (ko) 2016-09-08
HUE024479T2 (en) 2016-01-28
MX2010003720A (es) 2010-10-20
RU2017146770A (ru) 2019-06-28
ES2531522T3 (es) 2015-03-16
EP2674483B1 (en) 2017-05-03
JP5934776B2 (ja) 2016-06-15
KR20170059489A (ko) 2017-05-30
KR20100098600A (ko) 2010-09-08
RU2013106702A (ru) 2014-08-20
RU2644210C2 (ru) 2018-02-08
US20170312315A1 (en) 2017-11-02
AU2008311292B2 (en) 2014-07-17
HUE035406T2 (en) 2018-05-02
HK1146300A1 (en) 2011-05-27
RU2711606C2 (ru) 2020-01-17

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JP6290270B2 (ja) 遺伝子操作した樹状細胞および癌の治療のための使用
AU2015234302B2 (en) Engineered cells expressing multiple immunomodulators and uses thereof
HK1146300B (en) Engineered dendritic cells and uses for the treatment of cancer
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HK1192583B (en) Engineered dendritic cells and uses for the treatment of cancer

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