JP2014221058A - デュシェンヌ型筋ジストロフィーにおける効率的なエクソン（４４）スキッピングのための方法及び関連手段 - Google Patents

Abstract

【課題】配列５’−ＧＵＧＧＣＵＡＡＣＡＧＡＡＧＣＵを有するヌクレオチド分子に結合し、且つ／又は相補的である核酸分子、及びデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者においてＤＭＤ遺伝子のエクソン４４スキッピングの誘導方法の提供。【解決手段】ヌクレオチド配列５’ＵＣＡＧＣＵＵＣＵＧＵＵＡＧＣＣＡＣＵＧ３’からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド、それの発現のためのベクター、それらを含む医薬品組成物、それらの使用及び使用方法。【選択図】図２

Description

本発明は、遺伝学、より具体的にはヒト遺伝学の分野に関する。本発明は、特にヒトデュシェンヌ型筋ジストロフィー遺伝子のスプライシングの調節に関する。

ミオパシーは、筋肉の機能障害を引き起こす障害である。筋ジストロフィー（ＭＤ）とは、骨格筋の進行性の衰弱及び変性を特徴とする遺伝子疾患をいう。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及びベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、最も一般的な小児期の筋ジストロフィーの形態である。それらは劣性障害であり、ＤＭＤ及びＢＭＤの原因である遺伝子はＸ染色体上に存在するため、変異は、約３５００人の男児に１人の発生率で、主に男性に発症する。

ＤＭＤ及びＢＭＤは、細胞骨格及び細胞外マトリックス間で相互作用し、収縮中の筋線維の安定性を維持するのに必要である筋タンパク質であるジストロフィンをコードするＤＭＤ遺伝子における遺伝子欠損により引き起こされる。ＤＭＤは重篤な致死性神経筋障害であり、１２歳より前に車いすの支えに頼ることになり、ＤＭＤ患者はしばしば、呼吸不全又は心不全のために３０歳より前に死亡する。対照的に、ＢＭＤ患者はしばしば、後年まで歩行可能な状態を維持し、正常に近い平均余命を有する。ジトロフィン遺伝子におけるＤＭＤ変異は、フレームシフト性の挿入又は欠失又はナンセンス点変異を特徴とし、機能性ジストロフィンの欠如を引き起こす。ＢＭＤ変異は、一般的にリーディングフレームを無傷に保ち、部分的な機能性ジストロフィンの合成を可能とする。

いくつかの可能性のある治療が、ここ２０年にわたり研究されており、これには、筋芽細胞移植、ＤＮＡを標的にした遺伝子療法、及びアンチセンス媒介型エクソンスキッピング（ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍ及びｖａｎ Ｏｍｍｅｎ、（２００３）、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、４（１０）：７７４−８３）が挙げられる。アンチセンス媒介型エクソンスキッピングは、ＤＭＤ患者中に存在するアウトオブフレーム変異を、少なくとも部分的な機能性ジストロフィンの合成をもたらす、インフレームのＢＭＤ様変異に転換させることが狙いであり、これにより筋肉の生存能力が延長される（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ及びｖａｎ Ｏｍｍｅｎ、（２００７）、ＲＮＡ、１３（１０）：１６０９−２４）。

エクソンスキッピングは、エクソン連結の酵素過程に関わるスプライスジャンクションのスプライスドナー部位若しくはスプライスアクセプター部位、又はエクソン内の配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）によって誘導することができる。一般的に、スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位は保存配列を含み、これらの配列を標的にすることは、ＤＭＤ又は他の遺伝子転写物からの追加のエクソンのスプライス部位を共に標的にする不可避の危険を有する。

ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４は、１４８塩基対からなる。エクソン４４の治療的スキッピングにより、これに限定されないが、エクソン０３〜４３、０５〜４３、０６〜４３、１０〜４３、１３〜４３、１４〜４３、１７〜４３、１９〜４３、２８〜４３、３０〜４３、３１〜４３、３３〜４３、３４〜４３、３５〜４３、３６〜４３、３７〜４３、３８〜４３、４０〜４３、４１〜４３、４２〜４３、４３、４５、４５〜５４及び４５〜６８を含む欠失を有する、又はエクソン４４の重複を有するＤＭＤ患者における正しいリーディングフレームが回復する。その上、一部のＤＭＤ患者では、変異は、リーディングフレームを回復させるために、エクソン４４スキッピングに加えて１つ又は複数の同時に起こるエクソンスキッピングを必要とするような変異である。かかる変異の非限定的な例には、エクソン４３＋４４スキッピング又はエクソン４４＋４５スキッピングをそれぞれ必要とする、隣接エクソン４３又は４５中のナンセンス点変異がある。全体での前述の変異は、全ＤＭＤ患者の約６〜８％に生じる。結果として生じるジストロフィンタンパク質の大部分は、タンパク質の中央のロッドドメイン中で切断され、必須のＮ末端アクチン結合ドメイン、ジストロブレビン及びシントロフィンに結合するＣ末端ドメイン、並びにＣ末端のシステインリッチなβ−ジストログリカン結合ドメインを無傷なまま残す。

本発明は、エクソン４４スキッピングの誘導に特に適している、エクソン４４における４つの異なる領域を特定するものである。したがって、本発明は、細胞中でＤＭＤ遺伝子のエクソン４４のスプライシングを調節するための方法であって、配列番号１：５’−ＧＵＧＧＣＵＡＡＣＡＧＡＡＧＣＵ、配列番号２：５’−ＧＧＧＡＡＣＡＵＧＣＵＡＡＡＵＡＣ、配列番号３：５’−ＡＧＡＣＡＣＡＡＡＵＵＣＣＵＧＡＧＡ、又は配列番号４：５’−ＣＵＧＵＵＧＡＧＡＡＡを含むヌクレオチド配列に結合する分子を前記細胞に提供するステップを含む方法を提供する。この分子は、好ましくは、配列番号１、２、３又は４がＤＭＤプレｍＲＮＡのエクソン４４内に存在するとき、配列番号１、２、３又は４のいずれかに結合する、又は相補的である。

本出願の全体を通して、表現「スキッピングの誘導」は、「スプライシングの調節」と同義である。

配列番号１：５’−ＧＵＧＧＣＵＡＡＣＡＧＡＡＧＣＵ、配列番号２：５’−ＧＧＧＡＡＣＡＵＧＣＵＡＡＡＵＡＣ、配列番号３：５’−ＡＧＡＣＡＣＡＡＡＵＵＣＣＵＧＡＧＡ、又は配列番号４：５’−ＣＵＧＵＵＧＡＧＡＡＡを含むヌクレオチド配列に結合する分子により、この分子が提供された細胞中で高効率なエクソン４４スキッピングが生じることがわかった。その上、スプライスジャンクション部位の保存部分に由来すると示された配列はない。したがって、前記分子は、ＤＭＤプレｍＲＮＡ由来の他のエクソン、又は他の遺伝子由来のエクソンの特質的なスプライシングを媒介しないようである。さらに、他の（免疫）毒性は、好ましくは、本明細書で上記に規定したようなヌクレオチド配列に結合する分子中のＣｐＧ対を避けることにより回避する。

エクソンスキッピングとは、細胞中に正常に存在する特定のエクソンを含有しない成熟ｍＲＮＡの細胞中での誘導をいう。エクソンスキッピングは、例えば、スプライシングの酵素過程を可能にするのに必要なスプライスドナー配列又はスプライスアクセプター配列などの配列を干渉できる分子、又はエクソンがｍＲＮＡに含まれるようなヌクレオチドの伸長を認識するのに必要なエクソン包含シグナルを干渉できる分子を、前記ｍＲＮＡのプレｍＲＮＡを発現する細胞に提供することにより達成される。用語プレｍＲＮＡとは、細胞核中で転写によってＤＮＡ鋳型から合成された、処理されていない又は部分的に処理された前駆体ｍＲＮＡをいう。

本発明のある種の方法により、これに限定されないが、エクソン０３〜４３、０５〜４３、０６〜４３、１０〜４３、１３〜４３、１４〜４３、１７〜４３、１９〜４３、２８〜４３、３０〜４３、３１〜４３、３３〜４３、３４〜４３、３５〜４３、３６〜４３、３７〜４３、３８〜４３、４０〜４３、４１〜４３、４２〜４３、４３、４５、４５〜５４及び４５〜６８を含む欠失を有する、又はエクソン４４の重複を有する、ＤＭＤ患者の筋原細胞又は筋細胞の１つ又は複数の特徴が軽減されよう。その上、例えばエクソン４３又はエクソン４５などの隣接エクソンの除去により、隣接エクソン中のナンセンス点変異のために、アウトオブフレームの転写が生じるであろう。追加のエクソン４４スキッピングは、隣接エクソンのスキッピングとの組合せにより、ＤＭＤ患者の筋原細胞又は筋細胞中のＤＭＤ遺伝子のリーディングフレームを回復させる。かかる変異の非限定的な例には、エクソン４３＋４４スキッピング又はエクソン４４＋４５スキッピングをそれぞれ必要とする、隣接エクソン４３又は４５中のナンセンス点変異がある。

ある実施形態では、本発明の方法により、強いＢＭＤ患者の筋原細胞又は筋細胞の１つ又は複数の特徴を、軽度のＢＭＤ患者の特徴に軽減することもできる。ＤＭＤ又はＢＭＤ患者の細胞の特徴には、筋細胞によるカルシウム取込みの増加、コラーゲン合成の増加、形態の変化、脂質生合成の変化、酸化ストレスの増加、及び／又は筋細胞膜の損傷が挙げられる。本発明の方法の好ましい実施形態は、本明細書で後に規定する。

１つの実施形態では、本明細書で規定される分子は、特定された配列、又はＲＮＡ結合タンパク質、若しくはＲＮＡ分子上の指示されたヌクレオチド配列に結合できるように変更した非天然のジンクフィンガータンパク質などのタンパク質に結合し、且つ／又は相補的である化合物分子であってよい。特異的なヌクレオチド配列に結合する化合物分子を選別する方法は、例えば、ＰＣＴ／ＮＬ０１／００６９７及び米国特許第６，８７５，７３６号に開示され、これらは参照により本明細書に組み込まれる。特異的なヌクレオチド配列に結合するＲＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質を設計する方法は、Ｆｒｉｅｓｅｎ及びＤａｒｂｙ、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：５４３−５４６（１９９８）により開示され、これは参照により本明細書に組み込まれる。特定された配列番号１、２、３又は４のうちの１つの配列への結合は、好ましくはＤＭＤのエクソン４４との関連で、当業者に既知の技法により評価することができる。好ましい技法は、ＥＰ１６１９２４９に記載のゲル移動度シフトアッセイである。好ましい実施形態では、分子と、標識された配列番号１、２、３又は４の配列との結合が、ゲル移動度シフトアッセイにおいて検出できるとすぐに、前記分子は特定の配列の１つに結合すると言われている。代替的に、又は先の実施形態と組み合わせて、分子は、配列番号１、２、３若しくは４、又は本明細書で後に規定されるその部分に相補的又は実質的に相補的であるオリゴヌクレオチドである。この場面で使用される用語「実質的に」相補的とは、機能性、すなわちエクソン４４スキッピングの誘導がなおも許容される限り、１つ又は２つ以上のミスマッチは許可できることを示す。

本発明は、分子、好ましくはＤＭＤ遺伝子のエクソン４４スキッピングを誘導できるオリゴヌクレオチドを設計するための方法を提供する。まず、配列番号１、２、３若しくは４の１つ、又は本明細書で前に規定したようなその部分に結合する前記オリゴヌクレオチドを選択する。続いて、好ましい方法では、設計するために以下の態様の少なくとも１つを考慮に入れ、前記分子をいくらかさらに改良した：
分子がＣｐＧを含まない、
分子がＧカルテットモチーフを含まない、
分子が、許容されるＲＮＡ結合反応速度及び／又は熱力学的特性を有する。

オリゴヌクレオチド中のＣｐＧの存在は、通常、前記オリゴヌクレオチドの免疫原性の増加に関連する（Ｄｏｒｎ及びＫｉｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００８ １０（１）１０−２０）。この免疫原性の増加は、筋線維の崩壊を誘導し得るため、望ましくない。免疫原性は、動物モデルの筋生検においてＣＤ４^＋及び／又はＣＤ８^＋及び／又は炎症性単核球浸潤の存在を評価することにより、前記動物において評価することができる。免疫原性は又、当業者に既知の標準の免疫測定法を用いて、中和抗体及び／又は前記オリゴヌクレオチドを認識する抗体の存在を検出することにより、本発明のオリゴヌクレオチドで処置している動物又は人間の血液において評価することもできる。免疫原性における増加は、標準の免疫測定法を用いて、中和抗体又は前記オリゴヌクレオチドを認識する抗体の存在又は増加量を検出することによって評価することができる。

Ｇカルテットモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、４つの１本鎖オリゴヌクレオチドのフーグスティーン塩基対によって形成された、四重鎖、多量体又は凝集体を形成する傾向を有し（Ｃｈｅｎｇ及びＶａｎ Ｄｙｋｅ、Ｇｅｎｅ．１９９７ Ｓｅｐ １５；１９７（１−２）：２５３−６０）、結果としてオリゴヌクレオチドの効率が低下すると予期されるのは、もちろん望ましくない。多量体化又は凝集は、好ましくは、当業者に既知の標準の非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動技法により評価する。好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドの総量の２０％又は１５％未満、１０％、７％、５％又はそれ未満が、上述のアッセイを用いて評価した、多量体化又は凝集する能力を有する。

本発明により、許容されるＲＮＡ結合反応速度及び／又は熱力学的特性を有するオリゴヌクレオチドを設計することができる。ＲＮＡ結合速度及び／又は熱力学的特性は、オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ；基本的なＴｍ及び最近接モデルを用いて、１本鎖ＲＮＡ用のオリゴヌクレオチド特性計算機（ｗｗｗ．ｕｎｃ．ｅｄｕ／〜ｃａｉｌ／ｂｉｏｔｏｏｌ／ｏｌｉｇｏ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）により計算した）、及び／又は（ＲＮＡ構造バージョン４．５を用いる）ＡＯＮ標的エクソン複合体の自由エネルギーによって、少なくとも一部は決定される。もしＴｍが高すぎれば、オリゴヌクレオチドは特異性がより低いと予想される。許容されるＴｍ及び自由エネルギーは、オリゴヌクレオチドの配列に依存する。したがって、これらの各パラメータについて好ましい範囲を得ることは難しい。許容されるＴｍは３５及び６５℃の間の範囲であってよく、許容される自由エネルギーは１５及び４５ｋｃａｌ／ｍｏｌの間の範囲であってよい。

したがって、当業者は第一に、エクソン４４の配列番号１、２、３若しくは４、又は本明細書で規定したようなその部分に結合し、且つ／又は相補的であるような、可能性のある治療化合物としてのオリゴヌクレオチドを選ぶことができる。当業者は、前記オリゴヌクレオチドが、本明細書で前に規定されたような前記配列に結合できることをチェックすることができる。任意選択で、第２ステップでは、当業者は、ＣｐＧの非存在、Ｇカルテットモチーフの非存在に関してチェックすること、及び／又は前記オリゴヌクレオチドのＴｍ及び／又はＡＯＮ標的複合体の自由エネルギーを最適化することにより、前記オリゴヌクレオチドをさらに最適化するために本発明を使用することができる。当業者は、ＣｐＧ及びＧカルテットモチーフが存在せず、且つ／又はオリゴヌクレオチドと相補的であるエクソン４４の異なる配列（例えば、配列番号１、２、３又は４）を選ぶことによって、より許容されるＴｍ及び／又は自由エネルギーが得られる、オリゴヌクレオチドの設計を試みることができる。或いは、もしエクソン４４の配列番号１、２、３又は４内の所与の伸長に相補的なオリゴヌクレオチドが、ＣｐＧ、Ｇカルテットモチーフを含み、且つ／又は許容されるＴｍ及び／又は自由エネルギーをもたなければ、当業者は、オリゴヌクレオチドの長さを短くすること、及び／又はオリゴヌクレオチドと相補的ないずれかの配列番号１、２、３又は４内の異なる伸長を選ぶこと、及び／又はオリゴヌクレオチドの化学的性質を変えることによって、これらのどのパラメータも改善することができる。

例として、配列番号１を選ぶと、いくつかのオリゴヌクレオチドが設計され、配列番号５、４９及び５４の配列に結合することがわかった。配列番号５を含むオリゴヌクレオチドは、最適なＴｍなどの、最適なＲＮＡ結合速度及び／又は熱力学的特性を有することがわかった。発明者等が、エクソン４４スキッピングを誘導するこれらのオリゴヌクレオチドの機能性を試験すると、配列番号５を含むオリゴヌクレオチドが、これらの４つのオリゴヌクレオチドのうち最も効率的であることが確認された。これらの各オリゴヌクレオチドは、本発明の意味では機能的である。しかし、配列番号５を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号１に結合し、且つ／又は相補的である、同定された最も好ましいオリゴヌクレオチドである。

本方法のどのステップでも、本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、許容されるレベルの機能的活性をなおも示すことができるオリゴヌクレオチドである。前記オリゴヌクレオチドの機能的活性は、好ましくは、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４スキッピングをある程度まで誘導して、機能性ジストロフィンタンパク質及び／若しくはｍＲＮＡ、並びに／又は異常なジストロフィンタンパク質及び／又はｍＲＮＡの産生の少なくとも部分的な減少を個体にもたらすものである。これらの各特質は、本明細書で後に規定する。かかる機能的活性は、個体の筋組織中若しくは筋細胞中、又はインビトロの細胞中で測定することができる。機能性の評価は、好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ｍＲＮＡレベルで行うことができる。機能性の評価は、好ましくは、断面のウエスタンブロット解析又は免疫蛍光解析を用いて、タンパク質レベルで行うことができる。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドはＤＭＤ遺伝子のエクソン４４スキッピングを誘導すると言われ、ＲＴ−ＰＣＲによってＤＭＤ患者の筋細胞において試験したとき、エクソン４４スキッピングの割合は、少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は１００％である。

好ましい実施形態では、かかるオリゴヌクレオチドは、好ましくは薬剤である。より好ましくは、前記薬剤は、個体又は患者においてデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを予防又は治療するためのものである。本明細書で規定したように、ＤＭＤプレｍＲＮＡは、好ましくはＤＭＤ又はＢＭＤ患者のＤＭＤ遺伝子のプレｍＲＮＡを意味する。患者は、好ましくはＤＭＤ若しくはＢＭＤを有する患者、又はその遺伝的背景のためにＤＭＤ若しくはＢＭＤにかかりやすい患者を意味することを意図する。

ＤＭＤ患者の場合では、使用されるオリゴヌクレオチドにより、好ましくは前記患者のＤＭＤ遺伝子中に存在するような少なくとも１つのＤＭＤ変異が訂正されることになり、したがって、好ましくはＢＭＤジストロフィンのように見えるジストロフィンがつくられることになり、前記ジストロフィンは、好ましくは本明細書で後に規定される機能性ジストロフィンとなる。

ＢＭＤ患者の場合では、使用されるようなオリゴヌクレオチドにより、好ましくは前記患者のＤＭＤ遺伝子中に存在するような少なくとも１つのＢＭＤ変異が訂正されることになり、したがって、好ましくは前記ＢＭＤ患者にもともと存在したジストロフィンより機能的になる、１つ又は複数のジストロフィンがつくられるであろう。さらにより好ましくは、前記薬剤により、個体において、機能的な若しくはより機能的なジストロフィンタンパク質及び／又はｍＲＮＡの産生が増加し、且つ／又は少なくとも一部は、異常な若しくはより機能的でないジストロフィンタンパク質及び／又はｍＲＮＡの産生が減少する。

好ましくは、本発明の方法により、１つ又は複数の細胞、好ましくは患者の筋細胞中で、本明細書で特定されるＤＭＤプレｍＲＮＡの少なくともエクソン４４のスキッピングを誘導及び／又は促進することによって、前記患者において、より機能的なジストロフィンタンパク質及び／又はｍＲＮＡの産生が増加し、且つ／又は異常な若しくはより機能的でないジストリフィンタンパク質及び／又はｍＲＮＡの産生が減少する。患者におけるより機能的なジストロフィンタンパク質及び／又はｍＲＮＡの産生の増加、及び／又は異常なジストロフィンタンパク質及び／又はｍＲＮＡの産生の減少が、一般的にＤＭＤ患者に適用される。より機能的な又は機能的なジストロフィン及び／又はｍＲＮＡの産生の増加が、一般的にＢＭＤ患者に適用される。

したがって、好ましい方法は、患者中又は前記患者の１つ又は複数の細胞中で、前記患者において、より機能的な若しくは機能的なジストロフィンタンパク質及び／又はｍＲＮＡの産生を増加させ、且つ／又は異常なジストロフィンタンパク質及び／又はｍＲＮＡの産生を減少させる方法であって、前記異常な又はより機能的なジストロフィンタンパク質及び／又はｍＲＮＡのレベルを、本方法の開始時の前記患者における前記ジストロフィン及び／又はｍＲＮＡのレベルと比較することによって評価する方法である。

本明細書で規定したように、機能性ジストロフィンは、好ましくは配列番号５５で特定されるアミノ酸配列を有するタンパク質に相当する野生型ジストロフィンである。機能性ジストロフィンは、好ましくは、当業者に知られているように、そのＮ末端部分にアクチン結合ドメイン（Ｎ末端の最初の２４０個のアミノ酸）、システインリッチなドメイン（３３６１から３６８５個までのアミノ酸）及びＣ末端ドメイン（Ｃ末端の最後の３２５個のアミノ酸）を有し、これらの各ドメインが野生型ジストロフィンに存在するジストロフィンである。本明細書で示されるアミノ酸は、配列番号５５で表される野生型ジストロフィンのアミノ酸に相当する。別の実施形態では、機能性ジストロフィンは、少なくともある程度は野生型ジストロフィンの活性を示すジストロフィンである。「少なくともある程度」とは、好ましくは野生型機能性ジストロフィンに相当する活性の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％を意味する。この場面では、野生型ジストロフィンの活性は、好ましくはアクチン及びジストロフィン関連糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）に結合することである（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ Ａら、（２００６）、ライデンのデュシェンヌ型筋ジストロフィー変異データベースへの登録：リーディングフレームルールを確認する変異型及び矛盾するケースの概観（Ｅｎｔｒｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅｉｄｅｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄａｔａｂａｓｅ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｙｐｅｓ Ａｎｄ ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ ｃａｓｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｒｅａｄｉｎｇ−ｆｒａｍｅ ｒｕｌｅ）、Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ、３４：１３５−１４４）。アクチン及びＤＧＣ複合体へのジストロフィンの結合は、当業者に知られているような、ジストロフィーの疑いのある筋生検からの、総タンパク質抽出物を使用する共免疫沈降法又は断面の免疫蛍光解析のどちらかによって、可視化することができる。

デュシェンヌ型筋ジストロフィーを患っている個体は、一般的に、ジストロフィンをコードする遺伝子中に変異を有し、これにより完全なタンパク質の合成が妨げられる、すなわち中途終止によりタンパク質のＣ末端の合成が妨げられる。ベッカー型筋ジストロフィーにおいても、ジストロフィン遺伝子は野生型と比べて変異を含むが、変異により一般的に中途終止が誘導されず、タンパク質のＣ末端は一般的に合成される。結果として、必ずしも同じ活性量ではないが、少なくとも野生型タンパク質と種類の同じ活性を有する機能性ジストロフィンタンパク質が合成される。好ましい実施形態では、機能性ジストロフィンタンパク質とは、インフレームのジストロフィン遺伝子を意味する。ＢＭＤ個体のゲノムは、一般的に、Ｎ末端部分（Ｎ末端の最初の２４０個のアミノ酸）、システインリッチなドメイン（３３６１から３６８５個までのアミノ酸）及びＣ末端ドメイン（Ｃ末端の最後の３２５個のアミノ酸）を含むジストロフィンタンパク質をコードするが、その中央のロッド形状ドメインは、野生型ジストロフィンの１つより短い場合がある（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ Ａら、（２００６）、ライデンのデュシェンヌ型筋ジストロフィー変異データベースへの登録：リーディングフレームルールを確認する変異型及び矛盾するケースの概観（Ｅｎｔｒｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅｉｄｅｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄａｔａｂａｓｅ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ ｃａｓｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｒｅａｄｉｎｇ−ｆｒａｍｅ ｒｕｌｅ）、Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ、３４：１３５−１４４）。本明細書で示されるアミノ酸は、配列番号５５で表される野生型ジストロフィンのアミノ酸に相当する。ＤＭＤ治療のためのエクソンスキッピングは、好ましいが非限定的には、ロッドドメイン形状のドメイン中のエクソンをスキッピングしてリーディングフレームを訂正することにより、プレｍＲＮＡにおける中途終止を克服することを対象とし、タンパク質はロッドドメインがより短くなった結果としていくらかより短くはあるが、これによりＣ末端を含むジストロフィンタンパク質の残りを合成することが可能になる。好ましい実施形態では、ＤＭＤを有し、本明細書で規定されているようなオリゴヌクレオチドを使用して治療されている個体は、少なくともある程度は野生型ジストロフィンの活性を示すジストロフィンが得られるであろう。より好ましくは、もし前記個体がデュシェンヌの患者、又はデュシェンヌの患者である疑いがあれば、機能性ジストロフィンは、ＢＭＤを有する個体に由来するジストロフィンと機能性において同程度であり、好ましくは前記ジストロフィンがアクチン及びＤＧＣの両方と相互作用できるが、その中央のロッド形状ドメインが野生型ジストロフィンの１つより短い場合がある（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ Ａら、（２００６）、ライデンのデュシェンヌ型筋ジストロフィー変異データベースへの登録：リーディングフレームルールを確認する変異型及び矛盾するケースの概観（Ｅｎｔｒｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅｉｄｅｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄａｔａｂａｓｅ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ ｃａｓｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｒｅａｄｉｎｇ−ｆｒａｍｅ ｒｕｌｅ）、Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ、３４：１３５−１４４）。野生型ジストロフィンの中央のロッドドメインは、２４個のスペクトリン様反復を含む（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ Ａら、（２００６）、ライデンのデュシェンヌ型筋ジストロフィー変異データベースへの登録：リーディングフレームルールを確認する変異型及び矛盾するケースの概観（Ｅｎｔｒｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅｉｄｅｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄａｔａｂａｓｅ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｙｐｅｓ Ａｎｄ ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ ｃａｓｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｒｅａｄｉｎｇ−ｆｒａｍｅ ｒｕｌｅ）、Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ、３４：１３５−１４４）。例えば、本明細書で提供されるようなジストロフィンの中央のロッド形状ドメインは、それがアクチン及びＤＣＧに結合できる限り、５から２３、１０から２２又は１２から１８個のスペクトリン様反復を含むことができる。

前記患者中又は前記患者の細胞中の異常なジストロフィンの産生の減少とは、ｍＲＮＡレベルで評価でき、好ましくは、異常なジストロフィンｍＲＮＡの最初の量の９９％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又はそれ未満が、ＲＴ ＰＣＲによってなおも検出できることを意味する。異常なジストロフィンｍＲＮＡ又はタンパク質は、本明細書において、非機能性又は低から非機能性又は半機能性ジストロフィンｍＲＮＡ又はタンパク質とも称される。非機能性プレｍＲＮＡジストロフィンは、好ましくはアウトオブフレームのジストロフィンタンパク質を導き、これはジストロフィンタンパク質が産生されず、且つ／又は検出されないことを意味する。非機能性ジストロフィンタンパク質は、好ましくはアクチン及び／又はＤＧＣタンパク質複合体メンバーに結合できないジストロフィンタンパク質である。非機能性ジストロフィンタンパク質又はジストロフィンｍＲＮＡは、一般的に、タンパク質の無傷なＣ末端を有するジストロフィンタンパク質をもたない、又はコードしない。

患者中又は前記患者の細胞中の機能性ジストロフィンの産生の増加は、（ＲＴ−ＰＣＲ解析によって）ｍＲＮＡレベルで評価でき、好ましくは、機能性又はインフレームのジストロフィンｍＲＮＡの検出可能な量が、ＲＴ ＰＣＲによって検出できることを意味する。別の実施形態では、検出可能なジストロフィンｍＲＮＡの１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上が、機能性又はインフレームのジストロフィンｍＲＮＡである。

患者中又は前記患者の細胞中の機能性ジストロフィンの産生の増加は、（免疫蛍光法及びウエスタンブロット解析によって）タンパク質レベルで評価でき、好ましくは、機能性ジストロフィンタンパク質の検出可能な量が、免疫蛍光法又はウエスタンブロット解析によって検出できることを意味する。別の実施形態では、検出可能なジストロフィンタンパク質の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上が、機能性ジストロフィンタンパク質である。

増加又は減少は、好ましくは、本発明の前記分子又は組成物で処置する前の個体又は患者に存在する量と比較することによって、前記個体又は患者の筋組織中又は筋細胞中で評価する。或いは、比較は、処置が局所の場合、前記オリゴヌクレオチド又は組成物でまだ処置していない前記個体又は患者の筋組織又は細胞を用いて行うことができる。

さらなる態様では、個体におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状（単数又は複数）を軽減する、又は前記個体の筋芽細胞又は筋細胞の１つ又は複数の特徴（単数又は複数）を軽減するための方法であって、本明細書で規定されるオリゴヌクレオチド又は組成物を前記個体に投与するステップを含む方法が提供される。

デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを患っている個体において、ジストロフィンプレｍＲＮＡを発現する細胞中の前記プレｍＲＮＡからのエクソンスキッピングを増強、誘導又は促進するための方法であって、本明細書で規定されるオリゴヌクレオチド又は組成物を前記個体に投与するステップを含む方法がさらに提供される。

細胞中の機能性ジストロフィンタンパク質の産生を増加させ、且つ／又は異常なジストロフィンタンパク質の産生を減少させるための方法であって、前記細胞が異常なジストロフィンタンパク質をコードするジストロフィン遺伝子のプレｍＲＮＡを含み、本発明のオリゴヌクレオチド又は組成物を前記細胞に提供するステップと、前記プレｍＲＮＡのスプライシングから産生されるｍＲＮＡの翻訳を可能にするステップとを含む方法がさらに提供される。１つの実施形態では、前記方法は、例えば細胞培養を用いてインビボで行う。好ましくは、前記方法は前記個体においてインビボで行う。

この場面では、機能性ジストロフィンタンパク質の産生の増加は、本明細書で規定されている。

本発明の分子又は組成物を使用する、個体におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状（単数又は複数）の軽減は、次のいずれかのアッセイによって評価することができる：歩行をロスする時間の延長、筋強度の改善、重りを持ち上げる能力の改善、床から立ち上がるのにかかる時間の改善、９メートルの歩行時間の改善、４段を上るのにかかる時間の改善、脚の機能グレードの改善、肺機能の改善、心臓機能の改善、生活の質の改善。これらの各アッセイは、当業者に既知である。例として、Ｍａｎｚｕｒらの発表（Ｍａｎｚｕｒ ＡＹら、（２００８）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー用のグルココルチコイド副腎皮質ステロイド（概説）（Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、Ｗｉｌｅｙ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｔｈｅ Ｃｏｃｈｒａｎｅ ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）では、これらの各アッセイの広範な説明がされている。これらの各アッセイに関しては、アッセイで測定したパラメータの検出可能な改善又は延長が見つかり次第、それは好ましくは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状が、本発明の分子又は組成物を用いて、個体において軽減したことを意味するであろう。検出可能な改善又は延長は、好ましくは、Ｈｏｄｇｅｔｔｓらの説明のように統計学的に重要な改善又は延長である（Ｈｏｄｇｅｔｔｓ Ｓ．ら、（２００６）、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、１６：５９１−６０２）。

或いは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状（単数又は複数）の軽減は、機能、完全性及び／又は生存に関する筋線維の特徴の改善を測定することによって評価でき、前記特徴は患者自身について評価する。かかる特徴は、所与の患者の細胞、組織レベルで評価することができる。１つ又は複数の特徴の軽減は、患者由来の筋原細胞又は筋細胞についての以下のいずれかのアッセイによって評価することができる：筋細胞によるカルシウム取込みの低下、コラーゲン合成の減少、形態の変化、脂質生合成の変化、酸化ストレスの減少、及び／又は筋線維の機能、完全性及び／又は生存の改善。これらのパラメータは、通常、筋生検の断面の免疫蛍光法及び／又は組織化学的解析を用いて評価する。

本明細書で使用するようなオリゴヌクレオチドは、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴリボヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、エクソンスキッピング技法が適用される。エクソンスキッピングは、真核細胞内で起こる天然のスプライシング過程を干渉する。高等真核生物では、細胞のＤＮＡにおけるタンパク質に関する遺伝情報は、イントロン配列によって互いに隔てられるエクソン中にコードされている。これらのイントロンは、場合によっては非常に長い。真核生物の転写機構により、エクソン及びイントロンの両方を含むプレｍＲＮＡがつくり出されるが、スプライシング機構により、しばしばすでにプレｍＲＮＡの産生中に、プレｍＲＮＡ中に存在するエクソンと一緒にスプライシングすることによって、タンパク質に関する実際のコード領域がつくり出される。

エクソンスキッピングにより、少なくとも１つのスキッピングされたエクソンを欠く成熟ｍＲＮＡが生じる。したがって、前記エクソンがアミノ酸をコードするとき、エクソンスキッピングにより、変化した産物の発現が導かれる。エクソンスキッピングのための技術は、現在、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の使用に向けられている。この研究の多くは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー用のｍｄｘマウスモデルにおいて行われる。ｍｄｘマウスは、エクソン２３中にナンセンス変異を保有する。ｍｄｘ変異により、機能性ジストロフィンタンパク質の合成が妨げられるはずであるにも関わらず、まれに、天然に生じるジストロフィン陽性線維が、ｍｄｘ筋組織中に観察された。これらのジストロフィン陽性線維は、体細胞変異のために又は選択的スプライシングによって、見かけ上天然に生じるエクソンスキッピング機構から生じたと考えられる。ジストロフィンプレｍＲＮＡ中のイントロン２２及び２３の３’及び／又は５’スプライス部位にそれぞれ向かうＡＯＮは、普通、エクソン２３もｍＲＮＡから除去するための、イントロン２３の除去に関連する因子を干渉することが示されている（Ａｌｔｅｒ Ｊら、モルホリノオリゴヌクレオチドの全身性送達により体全体のジストロフィン発現が回復し、ジストロフィーの病状が改善する（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｏｄｙｗｉｄｅ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００６；１２（２）：１７５−７、Ｌｕ ＱＬら、ｍｄｘジストロフィーマウスにおいて変異エクソンをスキッピングすることによって産生されたジストロフィンの機能量（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｅｄ ｅｘｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｄｘ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｏｕｓｅ）．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００３；６：６、Ｌｕ ＱＬら、アンチセンスオリゴリボヌクレオチドの全身性送達により、体全体の骨格筋におけるジストロフィン発現が回復する（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂｏｄｙ−ｗｉｄｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅｓ）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００５；１０２（１）：１９８−２０３、Ｍａｎｎ ＣＪら、改善したアンチセンスオリゴヌクレオチドにより、筋ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルにおいてエクソンスキッピングを誘導した（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００２；４（６）：６４４−５４又はＧｒａｈａｍ ＩＲら、アンチセンスオリゴリボヌクレオチド（ｓｐｌｉｃｏｍｅｒ）によって誘導される、ｍｄｘマウス筋におけるジストロフィンエクソン２３スプライシングの治療用阻害に向けて：オリゴヌクレオチドアレイを用いた標的配列の最適化（Ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｏｎ ２３ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｎ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｍｕｓｃｌｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ （ｓｐｌｉｃｏｍｅｒｓ）：ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙｓ）．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００４；６（１０）：１１４９−５８）。

標的にした特異的なエクソンスキッピングによって、ＤＭＤ表現型は、より軽度なＢＭＤ表現型に転換される。エクソンスキッピングは、好ましくはエクソン内の配列を標的にするＡＯＮの結合によって誘導される。エクソン内の配列に向きをもつオリゴヌクレオチドは、一般的に、エクソンでない配列とのオーバーラップを示さない。好ましくは、少なくともイントロン中に存在しない限り、オリゴヌクレオチドはスプライス部位にオーバーラップしない。エクソン内の配列に向きをもつオリゴヌクレオチドは、好ましくは隣接するイントロンに相補的な配列を含まない。したがって、本発明によるオリゴヌクレオチドがさらに提供され、前記オリゴヌクレオチド又はその機能性同等物は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソンが、前記プレｍＲＮＡのスプライシングから産生されるｍＲＮＡに含まれるのを阻害するためのものである。エクソンスキッピング技法は、好ましくは、ジストロフィンプレｍＲＮＡから産生されるｍＲＮＡ由来のエクソンの非存在により、より短くはあるが、より機能的なジストロフィンタンパク質のコード領域が生み出されるように適用される。この場面では、エクソンが含まれるのを阻害するとは、好ましくは、本明細書で前に規定されたように、元のもの、すなわち異常なジストロフィンｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の検出が減少することを意味する。

本発明の場面内では、オリゴヌクレオチドの機能性同等物とは、好ましくは、１つ又は複数のヌクレオチドが置換されており、前記機能性同等物の活性が少なくともある程度は保持されている、本明細書で規定されるオリゴヌクレオチドを意味する。好ましくは、前記機能性同等物の活性により、機能性ジストロフィンタンパク質が提供される。したがって、前記機能性同等物の前記活性は、好ましくは機能性ジストロフィンタンパク質の量を定量化することによって、又は機能性ジストロフィンｍＲＮＡの量を定量化することによって評価される。機能性ジストロフィンタンパク質（又は機能性ジストロフィンｍＲＮＡ）は、本明細書では好ましくは、アクチン及びＤＧＣタンパク質メンバーに結合できる、ジストロフィンタンパク質（又は前記ｍＲＮＡによってコードされるジストロフィンタンパク質）であることとして規定される。オリゴヌクレオチドの前記活性の評価は、好ましくはＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡ）によって、又は免疫蛍光法若しくはウエスタンブロット解析（タンパク質）によって行う。前記活性は、好ましくは、機能性同等物が派生する前記オリゴヌクレオチドに相当する活性の、少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％又はそれ以上を表すとき、少なくともある程度は保持される。かかる活性は、個体の筋組織中若しくは筋細胞中、又はインビトロの細胞中で、機能性同等物が派生するオリゴヌクレオチドに相当する前記オリゴヌクレオチドの活性と比較することによって、測定することができる。この出願全体にわたり、言葉オリゴヌクレオチドが用いられるとき、それは本明細書で規定されるその機能性同等物に置き換えることができる。

好ましい実施形態では、本明細書で前に規定されたようなジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン４４の配列に結合し、且つ／又は相補的である配列を含む、本発明のオリゴヌクレオチドは、相補的な部分が、本発明のオリゴヌクレオチドの長さの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、又はさらにより好ましくは少なくとも９５％、又はさらにより好ましくは少なくとも９８％、又はさらにより好ましくは少なくとも９９％、又はさらにより好ましくは少なくとも１００％であるようなものである。最も好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書で規定されるジストロフィンプレｍＲＮＡの部分に相補的である配列からなる。例として、オリゴヌクレオチドは、本明細書で規定されるジストロフィンプレｍＲＮＡの部分、及び追加の隣接配列に相補的である配列を含み得る。より好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの前記相補的な部分の長さは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０ヌクレオチドである。好ましくは、追加の隣接配列は、タンパク質とオリゴヌクレオチドとの結合を改変するため、又はオリゴヌクレオチドの熱力学的特性を改変するため、より好ましくは標的ＲＮＡ結合親和性を改変するために使用される。

したがって、必ずしも、相補性領域中の全塩基が、対立する鎖中の塩基とペアをつくることができる必要はない。例えばオリゴヌクレオチドを設計するとき、例えば、相補的な鎖上の塩基と塩基対をつくらない残基を組み込むことを望むことができる。もし細胞中の環境下で、ヌクレオチドの伸長が相補的な部分と十分にハイブリッド形成できれば、ミスマッチはある程度は許可することができる。この場面では、「十分に」とは、好ましくは、ＥＰ１６１９２４９の実施例１に記載のようなゲル移動度シフトアッセイを使用して、オリゴヌクレオチドの結合が検出できることを意味する。任意選択で、前記オリゴヌクレオチドは、患者の筋細胞にトランスフェクトすることによって、さらに試験することができる。標的にしたエクソンスキッピングは、（ＥＰ１６１９２４９に記載のような）ＲＴ−ＰＣＲによって評価することができる。相補的な領域は、好ましくは、結合したときに、それらがプレｍＲＮＡ中のエクソンに特異的であるように設計する。かかる特異性は、システムにおける他の（プレ）ｍＲＮＡ中の実際の配列に依存するので、相補的な領域の様々な長さでつくることができる。１つ又は複数の他のプレｍＲＮＡがオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成できることになる危険も、オリゴヌクレオチドのサイズが大きくなるにつれて減少する。相補性領域中にミスマッチを含むが、プレｍＲＮＡ中の標的領域（単数又は複数）とハイブリッド形成及び／又は結合する能力を保持するオリゴヌクレオチドが、本発明で使用できることは明白である。しかし好ましくは、少なくとも相補的な部分が、一般的に、１つ又は複数の相補的な領域中にかかるミスマッチを有するオリゴヌクレオチドより、高い効率及び高い特異性を有するとき、相補的な部分はかかるミスマッチを含まない。より高いハイブリッド形成強度（すなわち、対立する鎖との相互作用の数が増加すること）は、システムのスプライシング機構を干渉する方法の効率を上げるのに有利であると考えられる。好ましくは、相補性は９０及び１００％の間である。一般的に、これによりヌクレオチド２０個のオリゴヌクレオチド中に１又は２つのミスマッチ（単数又は複数）か、ヌクレオチド４０個のオリゴヌクレオチド中に１、２、３又は４個のミスマッチか、ヌクレオチド６０個のオリゴヌクレオチド中に１、２、３、４、５又は６つのミスマッチが許可される。

本発明の好ましい分子は、ＤＭＤプレｍＲＮＡのエクソン４４から選択される配列にアンチセンスであるヌクレオチドベースの配列を含む、又はそれからなる。ＤＭＤプレｍＲＮＡの配列は、好ましくは配列番号１：５’−ＧＵＧＧＣＵＡＡＣＡＧＡＡＧＣＵ、配列番号２：５’−ＧＧＧＡＡＣＡＵＧＣＵＡＡＡＵＡＣ、配列番号３：５’−ＡＧＡＣＡＣＡＡＡＵＵＣＣＵＧＡＧＡ及び配列番号４：５’−ＣＵＧＵＵＧＡＧＡＡＡから選択される。

本発明の分子は、好ましくは、単離された分子である。

本発明の分子は、好ましくは、配列番号１、２、３又は４から選択されたエクソン４４の配列に結合し、且つ／又は相補的である、核酸分子又はヌクレオチドベースの分子又はオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

本発明の好ましい分子は、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド又は２３ヌクレオチドなどの、約８から約６０ヌクレオチド、より好ましくは約１０から約５０ヌクレオチド、より好ましくは約１７から約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１８から約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１８から約２４ヌクレオチド、最も好ましくは約２０ヌクレオチドを含む、又はそれからなる。

本発明の好ましい分子は、８から６０ヌクレオチド、より好ましくは１０から５０ヌクレオチド、より好ましくは１７から４０ヌクレオチド、より好ましくは１８から３０ヌクレオチド、より好ましくは２１から６０ヌクレオチド、より好ましくは２２から５５ヌクレオチド、より好ましくは２３から５３ヌクレオチド、より好ましくは２４から５０ヌクレオチド、より好ましくは２５から４５ヌクレオチド、より好ましくは２６から４３ヌクレオチド、より好ましくは２７から４１ヌクレオチド、より好ましくは２８から４０ヌクレオチド、より好ましくは２９から４０ヌクレオチド、より好ましくは１８から２４ヌクレオチドを含み、又はそれからなり、好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０ヌクレオチドを含む、又はそれからなる。

ある種の実施形態では、本発明により、表１Ａに示されるアンチセンスヌクレオチド配列から選択されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む、又はそれからなる分子が提供される。

ヌクレオチド配列：配列番号１：５’−ＧＵＧＧＣＵＡＡＣＡＧＡＡＧＣＵを有するヌクレオチドに、結合し、且つ／又は相補的であり、且つ／又はアンチセンスである、本発明の分子又は核酸分子は、好ましくは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４９、配列番号５４のアンチセンスヌクレオチド配列を含む、又はそれからなる。ＤＭＤプレｍＲＮＡのこの領域を標的にする好ましい分子は、配列番号５、配列番号４９又は配列番号５４のアンチセンスヌクレオチド配列を含む、又はそれからなる。最も好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号５のアンチセンスヌクレオチド配列を含む、又はそれからなる。

より好ましい実施形態では、本発明により、アンチセンスヌクレオチド配列である配列番号５：５’−ＵＣＡＧＣＵＵＣＵＧＵＵＡＧＣＣＡＣＵＧを含む、又はそれからなる分子が提供される。この分子は、筋細胞中でＤＭＤ遺伝子のエクソン４４のスプライシングを調節するのに非常に効率的であることがわかった。配列番号５を含む、本発明のより好ましいこの分子は、２１から６０、より好ましくは２２から５５、より好ましくは２３から５３、より好ましくは２４から５０、より好ましくは２５から４５、より好ましくは２６から４３、より好ましくは２７から４１、より好ましくは２８から４０、より好ましくは２９から４０個を含み、好ましくは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０ヌクレオチドを含む、又はそれからなる。

別の好ましい実施形態では、本発明により、アンチセンスヌクレオチド配列である配列番号４９又は５４を含む、又はそれからなる分子が提供される。配列番号４９又は配列番号５４のいずれかを含む、本発明のこれらの好ましい分子は、１８から６０、より好ましくは１８から５５、より好ましくは２０から５３、より好ましくは２４から５０、より好ましくは２５から４５、より好ましくは２６から４３、より好ましくは２７から４１、より好ましくは２８から４０、より好ましくは２９から４０個をさらに含み、好ましくは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０ヌクレオチドを含む、又はそれからなる。

さらなる実施形態では、配列番号２：５’−ＧＧＧＡＡＣＡＵＧＣＵＡＡＡＵＡＣにアンチセンスである本発明の分子は、好ましくは配列番号４３又は配列番号４４のアンチセンスヌクレオチド配列を含む、又はそれからなる。配列番号４３又は配列番号４４のいずれかを含む、本発明のこれらの好ましい分子は、１７から６０ヌクレオチド、より好ましくは１８から３０ヌクレオチド、より好ましくは２１から６０、より好ましくは２２から５５、より好ましくは２３から５３、より好ましくは２４から５０、より好ましくは２５から４５、より好ましくは２６から４３、より好ましくは２７から４１、より好ましくは２８から４０、より好ましくは２９から４０、より好ましくは１８から２４ヌクレオチドをさらに含み、好ましくは、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０ヌクレオチドを含む、又はそれからなる。

なおさらなる実施形態では、配列番号３：５’−ＡＧＡＣＡＣＡＡＡＵＵＣＣＵＧＡＧＡにアンチセンスである本発明の分子は、好ましくは、配列番号４７又は配列番号４８のアンチセンスヌクレオチド配列を含む、又はそれからなる。配列番号４７又は配列番号４８のいずれかを含む、本発明のこれらの好ましい分子は、１７から６０ヌクレオチド、より好ましくは１８から３０ヌクレオチド、より好ましくは１７から６０、より好ましくは２２から５５、より好ましくは２３から５３、より好ましくは２４から５０、より好ましくは２５から４５、より好ましくは２６から４３、より好ましくは２７から４１、より好ましくは２８から４０、より好ましくは２９から４０、より好ましくは１８から２４ヌクレオチドをさらに含み、好ましくは、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０ヌクレオチドを含む、又はそれからなる。

なおさらなる実施形態では、配列番号４：５’−ＣＵＧＵＵＧＡＧＡＡＡにアンチセンスである本発明の分子は、好ましくは、配列番号４５又は配列番号４６のアンチセンスヌクレオチド配列を含む、又はそれからなる。配列番号４５又は配列番号４６のいずれかを含む、本発明のこれらの好ましい分子は、１１から６０ヌクレオチド、より好ましくは１１から３０ヌクレオチド、より好ましくは１１から６０個をさらに含み、好ましくは、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０ヌクレオチドを含む、又はそれからなる。

本発明の分子のヌクレオチド配列は、本明細書で下記にさらに詳述するように、ＲＮＡ残基、又は１つ若しくは複数のＤＮＡ残基、及び／又は１つ若しくは複数のヌクレオチド類似体若しくは同等物を含むことができる。

本発明の分子は、ヌクレアーゼ耐性を増加させ、且つ／又は標的配列に対するアンチセンスヌクレオチドの親和性を増加させるように修正される１つ又は複数の残基を含むことが好ましい。したがって、好ましい実施形態では、アンチセンスヌクレオチド配列は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体又は同等物を含み、ヌクレオチド類似体又は同等物は、修飾された塩基、及び／又は修飾された骨格、及び／又は非天然のヌクレオシド間結合、又はこれらの修飾の組合せを有する残基として規定される。

好ましい実施形態では、ヌクレオチド類似体又は同等物は、修飾された骨格を含む。かかる骨格の例には、モルホリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルホメート、スルホネート及びスルホンアミド骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、並びにアミド骨格が挙げられる。ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーは、アンチセンス剤として以前に研究された、修飾骨格オリゴヌクレオチドである。モルホリノオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡのデオキシリボース糖が六員環に置き換えられ、ホスホジエステル結合がホスホロジアミデート結合に置き換えられた、無電荷の骨格を有する。モルホリノオリゴヌクレオチドは、酵素分解に耐性があり、ＲＮａｓｅ Ｈの活性よりむしろ、翻訳の抑止又はプレｍＲＮＡスプライシングの干渉によって、アンチセンス剤として機能するようである。モルホリノオリゴヌクレオチドは、細胞膜を物理的に破壊する方法によって、組織培養細胞にうまく送達され、これらのいくつかの方法を比較するある研究では、スクレープローディングが最も効率的な送達方法であることがわかったが、モルホリノ骨格は無電荷であるため、陽イオン性脂質は、細胞中へのモルホリノオリゴヌクレオチドの取込みの効率的な媒介物ではない。最近の報告では、モルホリノオリゴヌクレオチドによる三重鎖形成が実際に示され、非イオン性骨格のため、これらの研究により、モルホリノオリゴヌクレオチドはマグネシウムの非存在において三重鎖形成できることが示された。

短鎖アルキル若しくはシクロアルキルのヌクレオチド間結合によって形成される結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルのヌクレオチド間結合、又は１つ若しくは複数の短鎖ヘテロ原子又は複素環のヌクレオシド間結合などの、骨格中の残基間の結合が、リン原子を含まないことがさらに好ましい。

好ましいヌクレオチド類似体又は同等物は、修飾されたポリアミド骨格を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む（Ｎｉｅｌｓｅｎら、（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４、１４９７−１５００）。ＰＮＡベースの分子は、塩基対認識に関するＤＮＡ分子の正確な模倣体である。ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって連結されるＮ−（２−アミノエチル）グリシンユニットで構成され、核酸塩基がメチレンカルボニル結合によって骨格に連結される。代替骨格は、１つの炭素が伸長したピロリジンＰＮＡモノマーを含む（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ及びＫｕｍａｒ（２００５）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ、４９５−４９７）。ＰＮＡ分子の骨格は、荷電したリン酸基を含まないため、ＰＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは、通常、ＲＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドそれぞれより安定である（Ｅｇｈｏｌｍら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６５、５６６−５６８）。

さらなる好ましい骨格は、モルホリノヌクレオチド類似体又は同等物を含み、リボース又はデオキシリボース糖が、六員環モルホリノに置き換えられる。最も好ましいヌクレオチド類似体又は同等物は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）を含み、リボース又はデオキシリボース糖が、六員環モルホリノに置き換えられ、隣接モルホリノ環の間の陰イオン性ホスホジエステル結合が、非イオン性ホスホロジアミデート結合に置き換えられる。

なおさらなる実施形態では、本発明のヌクレオチド類似体又は同等物は、ホスホジエステル結合中の非架橋酸素の１つの置換を含む。この修飾により、塩基対がわずかに不安定化するが、ヌクレアーゼ分解への重要な耐性が加えられる。好ましいヌクレオチド類似体又は同等物は、ホスホロチオエート、キラルなホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、Ｈ−ホスホネート、例えば３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート及びキラルなホスホネートを含むエチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、例えば３’−アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート又はボラノホスフェートを含む。

本発明のさらなる好ましいヌクレオチド類似体又は同等物は、−ＯＨ；−Ｆ；１つ又は複数のヘテロ原子によって妨げることができる、置換又は非置換の、直鎖状又は分岐状の低級（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アリル又はアラルキル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アリル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、−メトキシ、−アミノプロポキシ；メトキシエトキシ；−ジメチルアミノオキシエトキシ；及び−ジメチルアミノエトキシエトキシなどの、２’、３’及び／又は５’位で一又は二置換される、１つ又は複数の糖部分を含む。糖部分は、ピラノース若しくはその誘導体、又はデオキシピラノース若しくはその誘導体、好ましくはリボース若しくはその誘導体、又はデオキシリボース若しくはその誘導体であってよい。好ましい誘導体化された糖部分は、ロックト核酸（ＬＮＡ）を含み、２’炭素原子が、糖環の３’又は４’炭素原子に連結し、それによって二環式糖部分を形成する。好ましいＬＮＡは、２’−Ｏ、４’−Ｃ−エチレン架橋核酸を含む（Ｍｏｒｉｔａら．２００１．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｎｏ．１：２４１−２４２）。これらの置換により、ヌクレオチド類似体又は同等物に、ＲＮａｓｅ Ｈ及びヌクレアーゼ耐性が与えられ、標的ＲＮＡに対する親和性が増加する。

別の実施形態では、本発明のヌクレオチド類似体又は同等物は、１つ又は複数の塩基の修飾又は置換を含む。修飾された塩基は、当業者に既知である又は既知であろう、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、他の−アザ、デアザ、−ヒドロキシ、−ハロ、−チオ、チオール、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、ピリミジン及びプリン塩基のチオアルキル誘導体などの合成及び天然塩基を含む。

アンチセンスオリゴヌクレオチド中の全ての位置が一様に修飾される必要はないことは、当業者に理解される。さらに、前述の類似体又は同等物の１つ以上は、単一のアンチセンスオリゴヌクレオチド中、又はアンチセンスオリゴヌクレオチド内の単一の位置でさえも、組み込むことができる。ある種の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの異なるタイプの類似体又は同等物を有する。

本発明のより好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾リボース（ＲＮＡ）、２’−Ｏ−エチル修飾リボース、２’−Ｏ−プロピル修飾リボースなどの、２’−Ｏ−アルキルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び／又はハロゲン化誘導体などの、これらの修飾の置換誘導体を含む。

本発明の最も好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートリボースを含む。

効率的なエクソン４４スキッピングのために、異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを組み合わせられることも、当業者に理解されよう。好ましい実施形態では、２つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチド、３つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチド、４つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチド又は５つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、少なくとも２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの組合せが、本発明の方法で使用される。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞、好ましくは筋原細胞又は筋細胞中へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの取込みを増強する部分に結合することができる。かかる部分の例は、コレステロール、炭水化物、ビタミン、ビオチン、脂質、リン脂質、これに限定されないが、アンテナペディア、ＴＡＴ、トランスポータン、及びオリゴアルギニン、ポリアルギニン、オリゴリシン若しくはポリリシンなどの陽電荷アミノ酸を含む細胞貫通ペプチド、抗体によって得られるような抗体結合ドメイン、抗体のＦａｂフラグメント、又はラクダ科単一ドメイン抗体結合ドメインなどの単鎖抗体結合ドメインである。

好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ペプチド連結型ＰＭＯを含む。

本発明のオリゴヌクレオチドは、当業者に既知の適切な方法を用いて、間接的に投与することができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、発現ベクターの形式で、個体、又は前記個体の細胞、組織又は器官に提供することができ、発現ベクターが前記オリゴヌクレオチドを含む転写物をコードする。発現ベクターは、好ましくは遺伝子送達媒体によって細胞、組織、器官又は個体に導入される。好ましい実施形態では、本明細書で特定される分子の発現又は転写を駆動する発現カセット又は転写カセットを含む、ウイルスベースの発現ベクターが提供される。細胞には、必須配列を干渉できる分子をもたらすことができ、結果としてプラスミド由来アンチセンスオリゴヌクレオチドの発現、又はアデノウイルス若しくはアデノ関連ウイルスベースのベクターにより実現するウイルスの発現によって、高効率なエクソン４４スキッピングが引き起こされる。発現は、好ましくは、Ｕ１、Ｕ６又はＵ７ＲＮＡプロモーターなどのポリメラーゼＩＩＩプロモーターによって駆動される。好ましい送達媒体は、アデノ関連ウイルスベクター（ＡＡＶ）などのウイルスベクター、又はレンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクター（Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ Ａら、Ｕ７ｓｎＲＮＡ媒介型エクソンスキッピングによるジストロフィー筋の救済（Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｕｓｃｌｅ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｕ７ ｓｎＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４；３０６（５７０２）：１７９６−９、Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ ＦＧら、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１のスプライスジャンクションに対するアンチセンス配列を保有するキメラｓｎＲＮＡ分子により、デルタ４８−５０ＤＭＤ細胞中でのエクソンスキッピング及びジストロフィン合成の回復を誘導する（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｓｎＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｓｐｌｉｃｅ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｏｎ ５１ ｏｆ ｔｈｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ ｉｎｄｕｃｅ ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｄｅｌｔａ ４８−５０ ＤＭＤ ｃｅｌｌｓ）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００２；９９（１４）：９４５６−６１、又はＤｅｎｔｉ ＭＡら、キメラアデノ関連ウイルス／アンチセンスＵ１核内低分子ＲＮＡにより、ｍｄｘマウスの局所治療によってジストロフィン合成及び筋機能を効果的に救済する（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ／ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｕｌ ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｒｅｓｃｕｅｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｕｓｃｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ｌｏｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｄｘ ｍｉｃｅ）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６；１７（５）：５６５−７４）などである。或いは、プラスミド、人工染色体、細胞のヒトゲノム中の標的にした相同組換え及び組込みに使用できるプラスミドは、本明細書で規定されるオリゴヌクレオチドの送達に適切に適用することができる。本発明で好ましいのは、転写がＰｏｌＩＩＩプロモーターから駆動され、且つ／又は転写物がＵ１又はＵ７転写物との融合の形態であり、これにより低分子転写物を送達するための優れた結果がもたらされるベクターである。適切な転写物を設計することは、当業者の技能内である。好ましいのは、ＰｏｌＩＩＩ駆動型転写物である。好ましくは、Ｕ１又はＵ７転写物との融合転写物の形態である（同じＧｏｙｅｎｖａｌｌｅ Ａら、Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ ＦＧら又はＤｅｎｔｉ ＭＡらを参照されたい）。かかる融合は、記載のようにつくり出すことができる（Ｇｏｒｍａｎ Ｌら、改変Ｕ７核内低分子ＲＮＡによるプレｍＲＮＡスプライシング様式の安定的な変化（Ｓｔａｂｌｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｕ７ ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡｓ）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８；９５（９）：４９２９−３４、又はＳｕｔｅｒ Ｄら、二重標的アンチセンスＵ７ｓｎＲＮＡにより、３つのヒトベータサラセミア変異中の異常なエクソンの効率的なスキッピングを促進する（Ｄｏｕｂｌｅ−ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｕ７ ｓｎＲＮＡｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｏｆ ａｎ ａｂｅｒｒａｎｔ ｅｘｏｎ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａｔｈａｌａｓｓｅｍｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １９９９；８（１３）：２４１５−２３）。オリゴヌクレオチドは、そのままで送達することができる。しかし、オリゴヌクレオチドは、ウイルスベクターにもコードすることができる。一般的に、これは、転写物の一部にオリゴヌクレオチドの配列を含むＲＮＡ転写物の形態である。

１つの好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチド発現系は、アデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクターである。高効率なＤＭＤのエクソン４４スキッピングのための低分子アンチセンスヌクレオチド配列の延長した発現に使用できる、単鎖及び二本鎖ＡＡＶベースのベクターを開発した。

好ましいＡＡＶベースのベクターは、ポリメラーゼＩＩＩプロモーター（ＰｏｌＩＩＩ）によって駆動される発現カセットを含む。好ましいＰｏｌＩＩＩプロモーターは、例えば、Ｕ１、Ｕ６又はＵ７ＲＮＡプロモーターである。

したがって、本発明は又、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４スキッピングを誘導するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現させるためのＰｏｌＩＩＩプロモーター駆動型発現カセットを含む、ウイルスベースのベクターも提供する。

個体又は前記個体の細胞、組織、器官に、オリゴヌクレオチド及び／又はその同等物をもたらすための方法の改善は、これまですでに達成された前進を考慮して予測される。かかる将来の改善は、本発明の方法を使用するｍＲＮＡの再構築への述べた効果を達成するためにもちろん組み込むことができる。オリゴヌクレオチド及び／又はその同等物は、個体、前記個体の細胞、組織又は器官にそのまま送達することができる。オリゴヌクレオチド及び／又はその同等物を投与するとき、オリゴヌクレオチド及び／又はその同等物は、送達方法と適合性のある溶液中に溶解させることが好ましい。筋又は筋原細胞には、水溶液中でプラスミドを提供することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチド発現のためのプラスミドを提供することができる。或いは、プラスミドは、既知のトランスフェクト剤を用いたトランスフェクションによって提供することができる。静脈内、皮下、筋肉内、くも膜下腔内及び／又は脳室内投与のために、溶液は生理食塩水であることが好ましい。本発明において特に好ましいのは、本明細書で規定される各構成物を細胞に且つ／又は細胞中に、好ましくは筋細胞中に送達する助けとなるであろう賦形剤又はトランスフェクト剤を使用することである。好ましいのは、細胞膜を通って小胞又はリポソーム中に複合体化又はトラップした、本明細書で規定される各構成物を送達する複合体、ナノ粒子、ミセル、小胞及び／又はリポソームを形成できる賦形剤又はトランスフェクト剤である。これらの賦形剤の多くは、当技術分野では既知である。適切な賦形剤又はトランスフェクト剤は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ＥｘＧｅｎ５００（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）若しくはその誘導体、又はポリプロピレンイミン若しくはポリエチレンイミンコポリマー（ＰＥＣ）及び誘導体を含む同様の陽イオン性ポリマー、合成両親媒性物質（ＳＡＩＮＴ−１８）、リポフェクチンＴＭ、ＤＯＴＡＰ及び／又は本明細書で規定される各構成物を細胞に、好ましくは筋細胞に送達できる粒子中に自己集合できるウイルスカプシドタンパク質を含む。かかる賦形剤は、アンチセンス核酸などのオリゴヌクレオチドを、筋細胞を含む幅広い様々な培養細胞に効率的に送達することが示された。それらの高いトランスフェクション潜在力を、全体の細胞の生存の観点から、予期される低レベルから中レベルの毒性と組み合わせる。構造的な改変の容易さは、さらなる改変、並びにそれらのさらなる（インビボの）核酸輸送の特徴及び毒性の解析を可能にするのに用いることができる。

リポフェクチンはリポソームのトランスフェクト剤の例を表す。リポフェクチンは、２つの脂質成分、すなわち陽イオン性脂質Ｎ−［１−（２，３ジオレオイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）（ｃｐ．硫酸メチル塩であるＤＯＴＡＰ)及び中性脂質ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる。中性成分は、細胞内放出を媒介する。送達系の別の群は、ポリマーのナノ粒子である。

ＤＮＡトランスフェクト試薬としてよく知られる、ジエチルアミノエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストリンのようなポリカチオンは、ブチルシアノアクリレート（ＰＢＣＡ）及びヘキシルシアノアクリレート（ＰＨＣＡ）と組み合わせて、本明細書で規定される各構成物を送達できる、好ましくは細胞膜を通過して細胞中にオリゴヌクレオチドを送達できる陽イオン性ナノ粒子を処方することができる。

これらの一般的なナノ粒子物質に加えて、陽イオン性ペプチドのプロタミンにより、コロイドを伴うオリゴヌクレオチドを処方するための代替のアプローチが可能になる。このコロイドナノ粒子系により、いわゆるプロティクルが形成でき、これはオリゴヌクレオチドの細胞内放出をパッケージ及び媒介する、単純な自己集合方法によって調製することができる。当業者は、ヒトにおけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの治療のために、オリゴヌクレオチドを送達する本発明に使用するための、上記又は他の市販のいかなる代替賦形剤、並びにオリゴヌクレオチドをパッケージ及び送達するための送達系も、選択及び適応することができる。

さらに、オリゴヌクレオチドは、細胞、細胞質及び／又はその核中への取込みを加速させるように設計された標的リガンドに、特異的に共有結合又は非共有結合的に連結させることができる。かかるリガンドは、（ｉ）細胞の取込みを加速させる、細胞、組織又は器官の特定のエレメントを認識する化合物（これに限定されないが、ペプチド（様）構造体が挙げられる）及び／又は（ｉｉ）細胞中への取込み、及び／又は例えばエンドソーム又はリソソームの、小胞からのオリゴヌクレオチドの細胞内放出を加速させることができる化学的化合物を含むことができる。

したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、組成物又は薬剤、又は少なくとも賦形剤、及び／又は送達のための標的リガンド、及び／又は細胞へのその送達装置、及び／又はその細胞内送達の増強がもたらされる組成物中に処方される。それ故に、本発明は又、オリゴヌクレオチドを含み、少なくとも１つの賦形剤、及び／又は送達のための標的リガンド、及び／又は前記オリゴヌクレオチドの細胞への送達装置、及び／又はその細胞内送達の増強をさらに含む、薬学的に許容される組成物も包含する。もし組成物が、本明細書で後に規定される補助化合物などの追加の構成物を含めば、組成物の各構成物は、１つの単一の組合せ又は組成物又は調製に処方することができないことを理解されたい。それらの独自性により、当業者は、どの処方のタイプが、本明細書で規定される各構成物に最も適するかを承知するであろう。好ましい実施形態では、本発明により、オリゴヌクレオチド及び本明細書で後に規定されるさらなる補助化合物を含む部分のキットの形態である組成物又は調製が提供される。

好ましいオリゴヌクレオチドは、個体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）又はベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）を予防又は治療するためのものである。本発明のオリゴヌクレオチドを使用して治療できる個体は、すでにＤＭＤ又はＢＭＤを有すると診断できている。或いは、本発明のオリゴヌクレオチドを使用して治療できる個体は、まだＤＭＤ又はＢＭＤを有すると診断できていないが、その遺伝的背景を考慮して、将来的にＤＭＤ又はＢＭＤにかかる危険性の増加を有する個体は診断することができる。好ましい個体はヒトである。

もし必要であれば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現する分子又はベクターは、薬学的に許容される担体を添加することによって、薬学的に活性な混合物に組み込むことができる。

したがって、本発明は又、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現するウイルスベースのベクターを含む分子を含む薬学的組成物も提供する。

さらなる態様では、本明細書で規定されるオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供される。好ましくは、前記組成物は、本明細書で規定される少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドを含む。より好ましくは、これらの２つの異なるオリゴヌクレオチドは、１つ又は２つ又はそれより多いエクソンをスキッピングするように設計される。マルチスキッピングは本発明に包含され、エクソン４４スキッピングを誘導する本発明のオリゴヌクレオチドが、別のエクソンスキッピングを誘導する別のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用される。この場面では、別のエクソンは、エクソン４３、４５又は５２であってよい。マルチエクソンスキッピングは、すでにＥＰ１６１９２４９中に開示されている。ＤＭＤ遺伝子は、多くの異なるエクソンを有する大きな遺伝子である。該遺伝子がＸ染色体上に位置することを考えれば、罹患するのはほとんど男児であるが、女児が両親から悪い遺伝子のコピーを受け取ることができるとき、又はその筋細胞中での特に偏ったＸ染色体不活性化のために、機能性対立遺伝子の特に偏った不活性化を患っているとき、女児も該疾患に罹患し得る。該タンパク質は、少なくとも２．４Ｍｂの範囲を超える複数のエクソン（７９）によってコードされる。欠損は、ＤＭＤ遺伝子のどの部分でも起こり得る。特定のエクソン（単数又は複数）のスキッピングにより、正常より短いが、少なくとも部分的に機能的なジストロフィンタンパク質をコードする、再構築されたｍＲＮＡを頻繁にもたらすことができる。エクソンスキッピング技術にもとづく薬剤の開発における実用上の問題は、細胞中の機能性ジストロフィンタンパク質の欠乏をもたらし得る、複数の変異である。多発性の異なる変異が、単一エクソンのスキッピングによってすでに訂正できるという事実にも関わらず、異なる変異に関して異なるエクソンのスキッピングが必要であるとき、この複数の変異には、異なる一連の医薬品の生成が必要である。オリゴヌクレオチド、又は２つ以上のエクソンのスキッピングを誘導できる、本明細書で後に規定される少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドを含む組成物の利点は、１つを超えるエクソンが、単一の医薬品を用いてスキッピングできることである。この特性は、多くの異なるＤＭＤ、又は特定の重篤なＢＭＤ変異を治療するために、限定された数の医薬品だけを生成する必要がある点で、実用上非常に有用であるだけではない。現在、当業者に開かれている別の選択肢は、特に再構築された機能性ジストロフィンタンパク質を選択し、これらの好ましいジストロフィンタンパク質を生成できる化合物を産生することである。かかる好ましい最終結果は、さらに軽度表現型ジストロフィンと称される。

好ましい実施形態では、前記組成物は、好ましくは医薬品組成物であり、前記医薬品組成物は、薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤及び／又は賦形剤を含む。かかる医薬品組成物は、薬学的に許容されるどの担体、フィラー、保存剤、アジュバント、溶解剤、希釈剤及び／又は賦形剤も含むことができ、又提供される。薬学的に許容されるかかる担体、フィラー、保存剤、アジュバント、溶解剤、希釈剤及び／又は賦形剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００で見つけることができる。前記組成物の各特質は、本明細書で前に規定した。

いくつかのオリゴヌクレオチドを使用する場合、本明細書ですでに規定された濃度又は用量は、使用する全オリゴヌクレオチドの総濃度若しくは用量、又は使用若しくは添加する各オリゴヌクレオチドの濃度若しくは用量を指し得る。したがって、１つの実施形態では、使用するオリゴヌクレオチドの各又は総量が、０．５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの間の範囲の量で投薬される組成物が提供される。

本発明によりさらに、ＤＭＤｍＲＮＡのスプライシングを調節するための、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現するウイルスベースのベクターの使用が提供される。スプライシングは、好ましくはインビトロのヒト筋原細胞又は筋細胞中で調節される。より好ましくは、スプライシングは、インビボのヒト筋原細胞又は筋細胞中で調節される。

本発明の１つ又は複数のヌクレオチド類似体又は同等物を含む、好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、全身性送達で、心筋細胞を含む１つ又は複数の筋細胞中のスプライシングを調節する。この点において、特定のヌクレオチド類似体又は同等物を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの全身性送達により、筋細胞のサブセットを標的にする結果になり得るが、異なるヌクレオチド類似体又は同等物を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドにより、筋細胞の異なるサブセットを標的にする結果になり得る。したがって、１つの実施形態では、ＤＭＤｍＲＮＡのエクソン４４スキッピングを調節するために、異なるヌクレオチド類似体又は同等物を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの組合せを使用するのが好ましい。

本発明によりその上、ＤＭＤ又はＢＭＤ患者の治療用の薬剤を調製するための、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現するウイルスベースのベクターの使用が提供される。

したがって、さらなる態様では、個体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを予防又は治療するための薬剤を製造するための、本明細書で規定されるオリゴヌクレオチド又は組成物の使用が提供される。前記使用の各特質は、本明細書で前に規定されている。

本発明による使用又は方法での治療は、少なくとも１週間、少なくとも１カ月、少なくとも数カ月、少なくとも１年、少なくとも２、３、４、５又は６年以上である。本発明にしたがって使用するための、本明細書で規定される各分子又はオリゴヌクレオチド又はその同等物は、ＤＭＤ又はＢＭＤに罹患した又はかかる危険がある個体のインビボの細胞、組織及び／又は器官への直接投与に適している場合があり、インビボ、エクスビボ又はインビトロで直接投与することができる。本発明のオリゴヌクレオチド、組成物、化合物又は補助化合物の投与頻度は、患者の年齢、患者の変異、分子の数（すなわち用量）、前記分子の剤形などのいくつかのパラメータに依存することができる。頻度は、少なくとも２週間又は３週間又は４週間又は５週間又はより長い期間に１回の間の範囲であってよい。

本発明によるオリゴヌクレオチドの用量範囲は、好ましくは厳密な手順要件が存在する、臨床試験（インビボでの使用）における用量漸増試験にもとづいて設計する。本明細書で規定される分子又はオリゴヌクレオチドは、０．１及び２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．５及び１０ｍｇ／ｋｇの間の範囲の用量で使用することができる。

好ましい実施形態では、０．１ｎＭ及び１μＭの間の範囲の、本明細書で規定されるオリゴヌクレオチドの濃度で使用される。好ましくは、この範囲は、筋細胞又は筋組織などの細胞モデルにおけるインビトロでの使用に関してである。より好ましくは、使用する濃度は、０．３から４００ｎＭ、さらにより好ましくは、１から２００ｎＭの間の範囲である。いくつかのオリゴヌクレオチドを使用する場合、この濃度又は用量は、オリゴヌクレオチドの総濃度若しくは用量、又は添加する各オリゴヌクレオチドの濃度若しくは用量を指し得る。所与の上記のようなオリゴヌクレオチド（単数又は複数）の濃度又は用量の範囲は、インビトロ又はエクスビボでの使用のための好ましい濃度又は用量である。当業者は、使用するオリゴヌクレオチド（単数又は複数）、処置される標的細胞、標的遺伝子及びその発現レベル、使用する溶媒、並びにトランスフェクション及びインキュベーションの条件に応じて、使用するオリゴヌクレオチド（単数又は複数）の濃度又は用量がさらに変化し、さらに最適化を必要とすることがあることを理解されよう。

本発明にしたがって使用するための本明細書で規定されるオリゴヌクレオチドは、ＤＭＤ又はＢＭＤに罹患した、又はかかる危険がある個体のインビボでの細胞、組織及び／又は器官への投与に適している場合があり、インビボ、エクスビボ又はインビトロで投与することができる。前記オリゴヌクレオチドは、ＤＭＤ又はＢＭＤに罹患した、又はかかる危険がある個体のインビボでの細胞、組織及び／又は器官に、直接的又は間接的に投与でき、インビボ、エクスビボ又はインビトロで直接的又は間接的に投与することができる。デュシェンヌ及びベッカー型筋ジストロフィーが、筋細胞において顕著な表現型を有するとき、前記細胞は筋細胞であることが好ましく、前記組織が筋組織であることがさらに好ましく、且つ／又は前記器官が筋組織を含む、若しくはそれからなることがさらに好ましい。好ましい器官は心臓である。好ましくは、前記細胞は、変異ジストロフィンタンパク質をコードする遺伝子を含む。好ましくは、前記細胞は、ＤＭＤ又はＢＭＤを患っている個体の細胞である。

別段に示されていない限り、本明細書に記載のような各実施形態は、本明細書に記載のような別の実施形態と組み合わせることができる。

この文書及びその特許請求の範囲では、動詞「含む」及びその活用は、その非限定的な意味において使用され、この言葉に続く事項は含まれるが、特別に述べられない事項は除外されないことを意味する。さらに、動詞「からなる」は、「から本質的になる」に置き換えることができ、これは、本明細書で規定される化合物又は補助化合物が、特別に特定されるものより多くの追加の成分（単数又は複数）を含むことができ、前記追加の成分（単数又は複数）が本発明特有の特徴を変えないことを意味する。

さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素の言及は、場面により１つ及び１つだけの要素があることが明確に要求されない限り、１つより多い要素が存在する可能性を除外しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つの」を意味する。

言葉「およそ」又は「約」は、数値に関して使用するとき（およそ１０、約１０）、好ましくは、値が所与の値１０の１％大きい又は小さい値であってよいことを意味する。

本明細書で使用されるような表現「インビボ」は、細胞が由来する生物から単離できる細胞系におけることを意味し得る。好ましい細胞は筋細胞である。インビボは、組織中又は好ましくは本明細書で規定される患者である多細胞生物中も意味し得る。本発明にわたり、インビボは、一般的に無細胞系に関連するインビトロと反対である。

本明細書に引用される全ての特許及び論文の参考文献は、参照によりそれらの全体を本明細書に組み込む。本明細書で特定される各実施形態は、別段に示されていない限り、一緒に組み合わせることができる。

本発明は以下の実施例でさらに説明される。これらの実施例は、本発明の範囲を制限するものではなく、単に本発明を明確にする助けとなるものである。

健康な対照又はエクソン４５欠失を有するＤＭＤ患者由来の、トランスフェクトした筋細胞中のＤＭＤ遺伝子からエクソン４４スキッピングを誘導するように設計したＡＯＮの評価を示す図である。 （Ａ）エクソン４５欠失を有する患者由来の分化した筋細胞（筋管）中で、試験した（トランスフェクトした）全ＡＯＮは、濃度１５０ｎＭでエクソン４４スキッピングを誘導し、ＰＳ１８８（配列番号５）、ＰＳ１９０（ｈ４４ＡＯＮ２として以前に出版された；Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ ２００２；１２ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ７１）、ＰＳ１９１（配列番号４７）、ＰＳ１９３（配列番号４８）、ＰＳ１９４（配列番号４６）及びＰＳ１９６（配列番号５１）は、高効率（８４％及び９４％の間）を実際に示した。 （Ｂ）大部分のＡＯＮは又、１５０及び４００ｎＭの濃度で健康なヒトの対照細胞にトランスフェクトすることによって試験した。結果は、このカラムチャートに要約する。ＰＳ１８８（配列番号５）、ＰＳ１９０、ＰＳ１９１（配列番号４７）、ＰＳ１９３（配列番号４８）、ＰＳ１９４（配列番号４６）及びＰＳ１９６（配列番号５１）は、エクソン４４スキッピングの誘導に最も効率が良いことが確認された。健康な細胞と比較して、患者の細胞中のエクソン４４スキッピングは、フレームを回復させ、より機能性及び安定性を高めるという事実の結果を受けて、患者の細胞中のエクソン４４スキッピングレベルは、一般的に、対照細胞中より高いことに留意されたい。エクソン４４スキッピングは、全実験においてトランスフェクトしていない筋細胞中では観察されなかった（データは示していない）。 （Ｃ）ＰＳ１９７（配列番号５２）及び３つの追加のＡＯＮ、すなわちＰＳ１９９（配列番号４４）、ＰＳ２００（配列番号４９）、及びＰＳ２０１（配列番号５０）の実施例は、１５０ｎＭ及び４００ｎＭのトランスフェクト濃度で、対照筋細胞中で同様に試験した。エクソン４４スキッピングの割合は、１％（ＰＳ１９９）及び４４％（ＰＳ２００）の間で変化した。Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー（１００ｂｐラダー）。 ヒトの対照筋細胞又は末梢血単核球（ＰＢ−ＭＮＣ）のトランスフェクションによるＰＳ１８８（配列番号５）のさらなる評価を示す図である。 （Ａ）用量反応実験。ヒトの対照筋細胞中でＰＳ１８８は、５０ｎＭから４００ｎＭに増加するトランスフェクト用量で、エクソン４４スキッピングレベルが増加し（三連）、４００ｎＭで４５％まで増加することを示した。 （Ｂ）健康な個体のＰＢ−ＭＮＣに、２００ｎＭのＰＳ１８８をトランスフェクトした。ジストロフィンは、このタイプの細胞中で低いレベルのときだけ発現するという事実にも関わらず、エクソン４４スキッピングは明確に観察された。これらの結果により、ＤＭＤ遺伝子からエクソン４４スキッピングを誘導するＰＳ１８８の効率が確認される。Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー。 完全長ヒトＤＭＤ遺伝子を発現するトランスジェニックｈＤＭＤマウス、及び大規模毒性試験に含まれるカニクイザルへの投与によるＰＳ１８８（配列番号５）のさらなる評価を示す図である。 （Ａ）ｈＤＭＤマウスの両腓腹筋（Ｇ１及びＧ２）中へのＰＳ１８８の２ｘ４０μｇの筋肉内注射の後に、エクソン４４スキッピングは、低いレベルではあるが観察された。これにより、ＰＳ１８８がインビボの筋組織中でヒトのエクソン４４スキッピングを誘導できることが確認される。低いレベルは、このマウスモデルが、ジストロフィン筋線維と比較して、ＡＯＮ取込みのより低いレベルを一般的に示す、健康な筋線維を有するという事実から得られると期待された。ＮＴ：処置していないｈＤＭＤ筋では、エクソン４４スキッピングは観察されなかった。Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー。 （Ｂ）ＰＳ１８８の毒性試験に含まれるサルにおいて、ＰＳ１８８の用量レベル６ｍｇ／ｋｇで、２９日間４日ごとに１時間静脈内注入した後、エクソン４４スキッピングは、末梢血単核球（ＰＢ−ＭＮＣ）中で観察された。処置していないサル（ＮＴ）では、エクソン４４スキッピングは観察されなかった。Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー。

（例１）
材料及び方法
ＡＯＮの設計は、ｍ−ｆｏｌｄプログラム（Ｍａｔｈｅｗｓｅｔら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９９；２８８（５）：９１１−４０）によって予測されるような標的エクソンＲＮＡのオープン二次構造の（部分的な）オーバーラップ、ＥＳＥ−ｆｉｎｄｅｒソフトウェア（ｒｕｌａｉ．ｃｓｈｌ．ｅｄｕ／ｔｏｏｌｓ／ＥＳＥ／）（Ｃａｒｔｅｇｎｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００３；３１（１３）：３５６８−７１）によって予測されるような推測上のＳＲタンパク質結合部位の（部分的な）オーバーラップ、及び３つ以上のヌクレオチドのＧ伸長又はＣｐＧ対の回避にもとづいた。ＡＯＮ（表１を参照されたい）は、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）及びＰｒｏｓｅｎｓａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＢＶ（ライデン、オランダ）により合成し、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ及び完全長ホスホロチオエート骨格を含む。

組織培養、トランスフェクション及びＲＴ−ＰＣＲ解析
健康な個体（「ヒト対照」）又はエクソン４５欠失を有するＤＭＤ患者に由来する筋管培養物を、以前に記載されたように処理した（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００３；１２（８）：９０７−１４；Ｈａｖｅｎｇａら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００２；７６（９）：４６１２−２０）。ＡＯＮの選別のために、筋管培養物に、１５０及び／又は４００ｎＭの各ＡＯＮをトランスフェクトした。トランスフェクト剤ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、ＥｘＧｅｎ５００ ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）又は誘導体（ＵＮＩＦｅｃｔｙｌｉｎ、Ｐｒｏｓｅｎｓａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＢＶ、オランダ）を、ＡＯＮ１μｇにつき、２μｌのＥｘＧｅｎ５００又はＵＮＩＦｅｃｔｙｌｉｎで使用した。フルオレセイン標識を有する対照ＡＯＮを、最適なトランスフェクト効率を確認するために使用した（概して９０％以上の蛍光の核が得られた）。ＲＮＡを、記載のようにトランスフェクトして２４から４８時間後に単離した（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ ２００２；１２ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ７１）。エクソンスキッピングの効率を、エクソン４４に隣接するエクソン中のプライマーを使用して（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ ２００２；１２ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ７１）、ネステッドＲＴ−ＰＣＲ解析によって決定した。ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＡＢＩ ３７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する、Ｌｅｉｄｅｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ （ＬＧＴＣ）による配列検証のために、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、ＰＣＲフラグメントをアガロースゲルから単離した。定量化のために、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）のＤＮＡ １０００ ＬａｂＣｈｉｐｓキットを使用して、ＰＣＲ産物を解析した。

結果
エクソン４４内の配列を標的にする一連のＡＯＮを設計し、トランスフェクト及びそれに続くＲＴ−ＰＣＲ及び単離したＲＮＡの配列解析によって、健康な対照及び患者由来の筋管培養物中の両方で試験した。エクソン４５の欠失を有するＤＭＤ患者に由来する筋管では、特異的なエクソン４４スキッピングは、試験したＡＯＮごとに（ＰＳ１８７からＰＳ２０１）１５０ｎＭで誘導され、ＰＳ１８８（配列番号５）、ＰＳ１９０（ｈ４４ＡＯＮ２として以前に出版された；Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ ２００２；１２ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ７１）、ＰＳ１９１（配列番号４７）、ＰＳ１９３（配列番号４８）、ＰＳ１９４（配列番号４６）及びＰＳ１９６（配列番号５１）は、最高レベルのスキッピング（１５０ｎＭで８４％及び９４％の間）を実際に示した（図１Ａ）。

同様のトランスフェクション実験を、健康な個体由来の対照細胞中で行った。エクソン４４スキッピングの割合を評価し、患者の細胞培養物中のものと比較した（図１Ｂ）。エクソン４４スキッピング後の対照の転写物の本来備わっているナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のために、対照の割合は、患者の細胞中のものより概して低かった（例えば、図１Ａ（患者細胞）対図１Ｃ（対照細胞）のＰＳ１９７による結果を参照されたい）。

３つの追加のＡＯＮ（ＰＳ１９９（配列番号４４）、ＰＳ２００（配列番号４９）及びＰＳ２０１（配列番号５０））を、１５０ｎＭ及び４００ｎＭの濃度で、対照筋細胞中で試験した。エクソン４４スキッピングの割合は、１％（ＰＳ１９９）及び４４％（ＰＳ２００）の間で変化した（図１Ｃ）。全トランスフェクション実験にもとづき、ＡＯＮ ＰＳ１８７、ＰＳ１８８、ＰＳ１９０、ＰＳ１９１、ＰＳ１９２、ＰＳ１９３、ＰＳ１９４、ＰＳ１９６及びＰＳ２００は、最も効率が良く、ＡＯＮ ＰＳ１８９、ＰＳ１９７、ＰＳ１９８、ＰＳ１９９及びＰＳ２０１は最も効率が悪いと考察された。

ＰＳ１８８（配列番号５）を、健康なヒトの対照筋細胞中で、イントリプロで５０から４００ｎＭの用量増加を適用する用量反応実験においてさらに試験した。エクソン４４スキッピングの増加レベルは、それにしたがって、４００ｎＭのＰＳ１８８で４５％まで観察された（図２Ａ）。

（例２）
材料と方法
ＥＤＴＡ管中に採取した、健康なヒトの新鮮な対照血液試料を、ＨｉｓｔｏＰａｑｕｅ勾配の最上層に重ねた。遠心分離において（最上部から最下部まで４層のうち）単核細胞を有する第２層を採取し、洗浄し、再び遠心分離した。細胞ペレットを、増殖培養液中で再懸濁し、計数した。６穴プレート中に、１穴につき８ｘ１０^６個の細胞を蒔き、３７℃、５％ＣＯ_２で３時間インキュベートした。次いで細胞に、二連で１ディッシュにつき０又は２００ｎＭのＰＳ１８８（配列番号５；２’ＯＭｅＰＳ ＲＮＡ；Ｐｒｏｓｅｎｓａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＢＶ）をトランスフェクトした。トランスフェクトして７２時間後にＲＮＡを単離し、エクソン４４に隣接するＤＭＤ遺伝子特異的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ解析によって解析した（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ ２００２；１２ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ７１）。ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＡＢＩ ３７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＬｅｉｄｅｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ（ＬＧＴＣ）による配列解析を、ＱｌＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してＲＮＡレベルで特異的エクソン４４スキッピングを確認した単離ＰＣＲ産物において行った。

結果
健康な対照個体由来のトランスフェクトした末梢血単核球（ＰＢ−ＭＮＣ）中では、ＰＳ１８８は、２００ｎＭで加えたときに、新規のより短い転写物フラグメントの産生を誘導した（図２Ｂ）。このフラグメントを単離し、配列決定し、特異的なエクソン４４スキッピングのための確認をした。トランスフェクトしていないＰＢ−ＭＮＣでは、エクソン４４スキッピングは観察されなかった。これらの結果は、ＰＳ１８８が、インビトロでのヒトのエクソン４４スキッピングを誘導する効率的な化合物であることを示す。

（例３）
材料及び方法
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）
正常及びｍｄｘマウス（Ｓｉｃｉｎｓｋｉら（１９８９）．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１５７８−１５８０）に、マウス特異的ｍ４６ＡＯＮ４（ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍら（２００１）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １０：１５４７−１５５４）を注射し、一方、ｈＤＭＤマウスに、ヒト特異的ＰＳ１９６（配列番号５１）又はＰＳ１８８（配列番号５）を注射した。どちらのＡＯＮも、完全長ホスホロチオエート骨格及び２’−Ｏ−メチル修飾リボース分子を含んでいた（ＰＳ１９６：Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｂｅｌｇｉｕｍ；ＰＳ１８８：Ｐｒｏｓｅｎｓａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＢＶ）。

正常、ｍｄｘ及びトランスジェニックｈＤＭＤマウス
正常なマウス（Ｃ５７Ｂ１／６ＮＣｒＬ）及びｍｄｘマウス（Ｃ５７Ｂ１／１０ＳｃＳｎ−ｍｄｘ／Ｊ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（オランダ）から入手した。トランスジェニックｈＤＭＤマウスは、発明者等自身のＬＵＭＣ実験室で操作した。簡潔には、胚性幹（ＥＳ）細胞を、完全長（２．４Ｍｂ）ヒトＤＭＤ遺伝子を含む２．７ＭｂのＹＡＣを保有する酵母スフェロプラストと融合することにより、遺伝子改変した。このＹＡＣは、酵母におけるより小さいオーバーラップＹＡＣの相同遺伝子組換えによって以前に再構築した（Ｄｅｎ Ｄｕｎｎｅｎら（１９９２）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ１：１９−２８）。ＰＦＧＥマッピング、全体の遺伝子にわたるエクソンＰＣＲ解析、及び分裂中期のＦＩＳＨ解析により評価されるような、完全サイズのＹＡＣの１つのコピーの組込みを示すＥＳ細胞を、次いでホモ接合体ｈＤＭＤマウスの作製に使用した（’ｔ Ｈｏｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００８）。トランスジェニックｈＤＭＤマウスは、遺伝子改変による身体的影響を受けないようである。ヒトＤＭＤ遺伝子の適切な発現は、筋肉においてＲＮＡ及びタンパク質の両レベルで実際に示すことができた。これらのマウスの操作は、Ｄｕｔｃｈ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＬＮＶ）；ｐｒｏｊｅｃｔ ｎｒ．ＶＶＡ／ＢＤ０１．２８４（Ｅ２１）により認可された。

ＡＯＮの投与
マウスにおける筋肉内ＡＯＮ注射の実験は、Ｌｅｉｄｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ医学部の動物実験委員会（ＵＤＥＣ）により認可された（ｐｒｐｊｅｃｔ ｎｏ．０００９５，０３０２７）。ＡＯＮは、純粋、又は製品説明書にしたがい、５％ｗ／ｖグルコース溶液中でＡＯＮ１ｎｍｏｌにつきＰＥＩ１ｍｌの比率の陽イオン性ポリマーのポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ＥｘＧｅｎ ５００（２０ｘ）、ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）との複合体、若しくは１５ｎｍｏｌのＳＡＩＮＴ−１８ＴＭ（Ｓｙｎｖｏｌｕｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｂ．Ｖ．、オランダ）との複合体のいずれかで、注射した。ＳＡＩＮＴ−１８ＴＭ送達系は、陽イオン性ピリジニウム頭部基にもとづき、アンチセンスオリゴヌクレオチドの非毒性送達を可能にする。マウスを１：１（ｖ／ｖ）ヒプノルム／ドルミカム溶液（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ、Ｂｅｌｇｉｕｍ／Ｒｏｃｈｅ、オランダ）の腹腔内注射により麻酔した。純粋ＡＯＮ（ＰＳ１８８）を、２２ゲージ針のハミルトンシリンジを用いるマウスの両腓腹筋への筋肉内注射により、最終注射量４０μｌで投与した。マウスは、２４時間間隔で４０μｇの２つの注射を受けた。マウスを、注射後の異なる時点；ＰＳ１８８を注射したｈＤＭＤマウスに関しては最後に注射して１０日後で屠殺した。筋肉を単離し、液体窒素冷却した２−メチルブタン中で凍結した。

ＲＴ−ＰＣＲ解析
筋肉試料を、ＲＮＡ−Ｂｅｅ溶液（Ｃａｍｐｒｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、オランダ）中でホモジナイズした。全部のＲＮＡを、製品説明書にしたがい単離及び精製した。逆転写酵素Ｃ．ｔｈｅｒｍポリメラーゼ又はＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、オランダ）によるｃＤＮＡ合成のために、ＲＮＡ３００ｎｇを、３０分間６０℃で２０μｌ反応液に使用し、マウス又はヒト特異的プライマーで逆方向刺激した。最初のＰＣＲを、（ＰＳ１８８を注射したマウスに関してはエクソン４３−４５に隣接する）外側のプライマーセットを用いて、９４℃（４０秒）、６０℃（４０秒）及び７２℃（６０秒）の２０周期で行った。この反応液（１：１０に希釈）の１μｌを、次いで標的エクソン（ＰＳ１８８を注射したマウスに関してはエクソン４４）に直接隣接するエクソン中のネステッドプライマーの組合せを使用して、９４℃（４０秒）、６０℃（４０秒）及び７２℃（６０秒）の３０周期で再増幅した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で解析した。スキッピング効率を、ＤＮＡ１０００ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キット及びＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オランダ）を使用する、ＰＣＲ産物の定量化によって決定した。プライマーセット及び配列は、以前記載された（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら（２００２） Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ １２ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ７１．８，１７；ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍら（２００１） Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １０：１５４７−１５５４）。

配列解析
ＲＴ−ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、２％アガロースゲルから単離した。Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ配列決定を、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、Ｌｅｉｄｅｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ（ＬＧＴＣ）により行い、ＡＢＩ ３７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で解析した。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法
ＲＮＡ−Ｂｅｅの筋肉ホモジネートを、製品説明書にしたがい９６穴スピンプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、核酸精製キット（ＳｅｑｕａｚｙｍｅＴＭ Ｐｉｎｐｏｉｎｔ ＳＮＰキット用Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して精製した。マトリックス溶液（５０％アセトニトリル中の３−ヒドロキシピコリン酸５０ｍｇ／ｍｌ及び二塩基性クエン酸アンモニウム２５ｍＭ）を、１ｍｌアリコートで、ＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐＴＭ試料標的（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、ドイツ）に加え、風乾した。試料をマトリックスの結晶上に０．５ｍｌアリコートでスポットし、風乾した。質量決定を、Ｒｅｆｌｅｘ ＩＩＩ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、ドイツ）で行った。スペクトルを、反射鏡モードで得、およそ９００のレーザーショットを蓄積した。標識した及び標識していないｍ４６ＡＯＮ４の試料を比較のために解析した。

結果
野生型筋肉におけるエクソンスキッピング
発明者等はまず、インビボのマウスの筋肉中で標的にしたエクソンスキッピングを設定し、投与の異なるパラメータを最適化した。最初の実験は、野生型マウスで行い、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構により、エクソンスキッピング効率の過小評価が起こることになるが、ＡＯＮの効果をｍＲＮＡレベルのみでモニターした。発明者等は、各アンチセンスオリゴヌクレオチドを０．９ｎｍｏｌから５．４ｎｍｏｌの用量に増やし注射した。全部の筋肉のＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析では、注射した全試料中に新規のより短い転写物フラグメントの出現が実際に示された。配列解析では、この産物中で正確なエクソン４４スキッピングが確認された（データは示していない）。

反対側の注射した筋肉の断面を、蛍光標識した対照ＡＯＮの分散及び持続に関して解析した。純粋ＡＯＮの注射後、発明者等は、最大１週間いくつかの線維内で蛍光シグナルを観察した。後の時点では、弱いシグナルだけが、主に間質スペース内で観察された。ＰＥＩの使用により、蛍光シグナルの分散及び持続の両方が、３週間後でさえ明確に強化された。しかし、それは又、ほとんどの蛍光を吸収する、線維の変性及び単球浸潤も誘導する。ＳＡＩＮＴを使用して、シグナルのほとんどを、最大１週間、間質スペース中で検出し、このことは、この薬剤が筋線維中にＡＯＮを効率的に送達しなかったことを示す。蛍光シグナルは、無傷な機能性ＡＯＮの存在に一致しない可能性があるため、発明者等は、注射した筋肉試料のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を行った。この解析では、蛍光標識が、２４時間以内にＡＯＮから除去されたことが示された。標識したＡＯＮは、ＰＥＩを使用したときのみ最大２週間検出できた。間質のＡＯＮは、おそらく細胞内のＡＯＮより、分解に対して脆弱だったのであろう。標識していないＡＯＮは、全３シリーズにおいて注射後３から４週間観察されたが、それは細胞内に存在するとき、すなわちＰＥＩシリーズにおいてのみ機能的であり得る。

ｈＤＭＤ筋肉におけるヒト特異的エクソンスキッピング
エクソンスキッピング戦略は、配列特異的な治療アプローチであるため、理想の前臨床検証は、マウスの実験的背景における標的ヒトＤＭＤ遺伝子であろう。発明者等は、組み込んだ完全長ヒトＤＭＤ遺伝子の機能性コピーを保有する、かかるトランスジェニック「ヒト化」ＤＭＤ（ｈＤＭＤ）マウスを操作した。ｈＤＭＤマウスの筋肉中のヒトジストロフィンの発現は、ヒト特異的抗体（ＭＡＮＤＹＳ１０６）を使用する、断面の免疫組織化学解析によって特異的に検出した。筋肉のＲＮＡレベルでは、マウス又はヒトいずれかの特異的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ解析により、ヒトＤＭＤ遺伝子の正しい転写が実際に示された。その上、ｍｄｘマウスにわたる使用において、ｈＤＭＤコンストラクトでは、組織学的及びｃＤＮＡマイクロアレイ解析により評価したように（’ｔ Ｈｏｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００８）、ジストロフィー欠損の補完が示された。ｈＤＭＤマウスは、一般的にネイキッドＡＯＮの制限された取込みを示す、健康な筋線維を有する。発明者等は、ＰＥＩと複合体化したヒト特異的なＡＯＮ ＰＳ１９６（配列番号５１）又はＰＥＩなしのＰＳ１８８（配列番号５）を、ｈＤＭＤマウスの腓腹筋に注射した（２４時間以内に２ｘ４０μｇの注射）。注射して７から１０日後に、発明者等は、ヒトＤＭＤ転写物から標的エクソン４４スキッピングを明確に観察した（図３Ａ）。ヒト特異的ＡＯＮは、相当するマウスの配列に対して、各２０塩基長に２又は３つだけのミスマッチを有する高い相同性をもつが、マウスの内在性転写物は、どの検出可能なレベルでも影響を受けなかった。ＰＳ１８８は、配列解析により確認したように、エクソン４４スキッピングを誘導した。処置していないｈＤＭＤ筋肉中で、エクソン４４スキッピングは観察されなかった。これらの結果は、ＰＳ１８８が、筋組織中でヒトエクソン４４スキッピングを誘導する効率的な化合物であることを示す。

（例４）
材料及び方法
ＰＳ１８８に関する大規模毒性プログラムの一部として、非絶食のカニクイザルを、ＰＳ１８８（配列番号５；２’ＯＭｅＰＳ ＲＮＡ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）の用量レベル６ｍｇ／ｋｇで、２９日間４日ごとに、１時間静脈内注入（５ｍｌ／ｋｇ／ｈ）により処置した。ＰＳ１８８製剤は、投与開始の直前（可能な限り早く、すなわち投与を始める１時間以内前の最も早く）に、各処置日（１、５、９、１３、１７、２１、２５及び２９日目の試験）に新鮮に調製した。製剤は、リン酸緩衝液中でＰＳ１８８を溶解することによって調製した；純度及び含水量は、薬物物質の分析証明書に提示したように考慮した。ＰＳ１８８の量は、各動物の現在の体重に適合させた。動物は、最後に投与して９６時間後に屠殺した（３３日目）。全体の血液試料（１０ｍｌ）をＥＤＴＡ管に採取し、（室温で夜間輸送した後）ＨｉｓｔｏＰａｑｕｅ勾配の最上層に重ねた。遠心分離において、（最上層から最下層まで４層のうち）単核細胞を有する第２層を採取し、洗浄し、再び遠心分離した。ＲＮＡを、結果として生じた細胞ペレットから単離し、エクソン４４に隣接するＤＭＤ遺伝子特異的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ解析によって解析した（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ ２００２；１２ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ７１）。配列解析は、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及びＡＢＩ３７００Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、Ｌｅｉｄｅｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ（ＬＧＴＣ）によって単離したＰＣＲ産物において行ったＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、ＲＮＡレベルでの特異的エクソン４４スキッピングを確認した。

結果
ＰＳ１８８の用量レベル６ｍｇ／ｋｇで、２９日間４日ごとに１時間静脈内注入により処置したサルにおいて、末梢血単核球では低いレベルのジストロフィンのみが発現されるという事実にも関わらず、エクソン４４スキッピングが、末梢血単核球中で観察された（図３Ｂ）。ＰＳ１８８により標的にしたヒト及びサルのＤＭＤ配列は、実際１００％同一である。処置していないサルでは、エクソン４４スキッピングは観察されなかった。これらの結果は、ＰＳ１８８が、インビボでエクソン４４スキッピングを誘導する効率的な化合物であることを示す。

Claims (11)

1. ヌクレオチド配列：
   ５’−ＧＵＧＧＣＵＡＡＣＡＧＡＡＧＣＵ（配列番号１）
   を有するヌクレオチドに結合し、且つ／又は相補的である核酸分子。
2. ８から６０ヌクレオチドを含む、又はそれからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の分子。
3. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号５から配列番号４２、配列番号４９又は配列番号５４を含む、又はそれからなる、請求項２に記載の分子。
4. 配列番号５のヌクレオチド配列を含む、又はそれからなる、請求項３に記載の分子。
5. ２’−Ｏアルキルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の分子。
6. ２’−Ｏメチルホスホロチオエートリボースを含む、請求項５に記載の分子。
7. 請求項１から６までのいずれか一項で規定される分子を発現させるためのＰｏｌＩＩＩプロモーター駆動型発現カセットを含み、好ましくは、前記分子が、ヌクレオチド配列
   ５’−ＧＵＧＧＣＵＡＡＣＡＧＡＡＧＣＵ（配列番号１）
   に結合し、且つ／又は相補的であるウイルスベースのベクター。
8. 請求項１から６までのいずれか一項で規定される分子、又は請求項７に記載のベクター、及び薬学的に許容される担体を含む医薬品組成物。
9. ＤＭＤプレｍＲＮＡのスプライシングを調節するための、請求項１から６までのいずれか一項で規定される分子、又は請求項７に記載のベクターの使用。
10. ＤＭＤ又はＢＭＤ患者の治療用の薬剤を調製するための、請求項１から６までのいずれか一項で規定される分子、又は請求項７に記載のベクターの使用。
11. 細胞中でＤＭＤ遺伝子のエクソン４４スキッピングを誘導するための方法であって、請求項１から６までのいずれか一項で規定される分子、又は請求項７に記載のベクターを有する前記細胞に提供するステップを含む上記方法。