RS59764B1 - Antismisaona nukleinska kiselina za upotrebu u lečenju dišenove mišićne distrofije - Google Patents

Description

Opis

TEHNIČKO PODRUČJE

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na antismisaoni oligomer za preskakanje eksona, koji obuhvata nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa dve ili više različitih sekvenci u ciljnom eksonu. Konkretnije, ovaj pronalazak se odnosi na antismisaoni oligomer koji prouzrokuje preskakanje eksona 44 u ljudskom genu za distrofin i na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata oligomer. Pronalazak je definisan u patentnim zahtevima.

[0002] Dišenova mišićna distrofija (DMD) je najčešći oblik nasledne progresivne mišićne distrofije od koje oboli jedan od oko 3.500 novorođenih dečaka. Iako se motorne funkcije retko razlikuju od funkcija zdravih osoba u ranom i kasnijem detinjstvu, slabost mišića se primećuje kod dece starosti oko 4 do 5 godina. Zatim, slabost mišića napreduje do gubitka ambulacije do otprilike 12. godine života i smrti usled srčane ili respiratorne insuficijencije u dvadesetim godinama života. DMD je u tolikoj meri ozbiljan poremećaj. Trenutno ne postoji dostupna efektivna terapija za DMD, i prisutna je želja za razvojem novog terapijskog agensa.

[0003] Poznato je da je DMD prouzrokovana mutacijom u genu za distrofin. Gen za distrofin se nalazi na X hromozomu i u pitanju je veliki gen koji se sastoji od 2,2 miliona parova nukleotida DNK. DNK se transkribuje u mRNK prekursore, a introni se uklanjaju splajsovanjem radi sintetizacije mRNK od 13.993 baze, gde se spaja 79 eksona. Ova mRNK se translatuje u 3.685 amino kiselina kako bi se proizveo protein distrofin. Protein distrofin je povezan sa održavanjem stabilnosti membrane u ćelijama mišića i neophodan je kako bi ćelije mišića bile manje fragilne. Gen za distrofin pacijenata obolelih od DMD sadrži mutaciju i stoga protein distrofin, koji je funkcionalan u ćelijama mišića, se retko ekspresuje. Stoga, struktura ćelija mišića se ne može održati u telu pacijenata obolelih od DMD, što dovodi do velikog influksa jona kalcijuma u ćelije mišića. Posledično, javlja se odgovor koji podseća na zapaljenje u cilju pospešivanja fibroze kako bi se ćelije mišića mogle regenerisati, samo uz teškoće.

[0004] Bekerova mišićna distrofija (BMD) je takođe prouzrokovana mutacijom u genu za distrofin. Simptomi uključuju slabost mišića, ali su obično blagi i spori tokom napredovanja slabosti mišića u poređenju sa DMD. U mnogim slučajevima, njen početak se javlja u odraslom dobu. Smatra se da se razlike u kliničkim simptomima između DMD i BMD svode na pitanje da li je okvir čitanja za amino kiseline na translaciji distrofina mRNK u protein distrofin poremećen mutacijom ili nije (Nepatentni dokument 1). Konkretnije, kod DMD prisustvo mutacije pomera okvir čitanja amino kiseline tako da se ekspresija funkcionalnog proteina distrofina ukida, dok se kod BMD protein distrofin koji funkcioniše, premda nesavršeno, proizvodi zbog toga što je okvir čitanja amino kiseline očuvan, dok se deo eksona briše mutacijom.

[0005] Očekuje se da preskakanje eksona posluži kao postupak za lečenje DMD. Ovaj postupak uključuje modifikovanje splajsovanja radi vraćanja okvira čitanja amino kiseline distrofina mRNK i indukovanje ekspresije proteina distrofina sa delimično vraćenom funkcijom (Nepatentni dokument 2). Deo sekvence amino kiseline, koji je cilj za preskakanje eksona, biće izgubljen. Iz ovog razloga, protein distrofin ekspresovan ovim lečenjem postaje kraći od običnog, ali pošto se okvir čitanja amino kiseline zadržava, funkcija stabilizacije ćelija mišića se delimično zadržava. Posledično, očekuje se da će preskakanje eksona voditi DMD do simptoma sličnih onim kod BMD koja je blaža. Pristup preskakanja eksona je prošao testove na životinjama upotrebom miševa ili pasa, a trenutno se procenjuje u kliničkim ispitivanjima na ljudskim pacijentima obolelim od DMD.

[0006] Preskakanje eksona može biti indukovano vezivanjem antismisaonih nucleinskih kiselina koje ciljaju bilo 5' ili 3' mesto splajsovanja ili oba mesta, ili mesta unutar eksona. Ekson će biti uključen u mRNK tek kada oba njegova mesta splajsovanja prepozna kompleks splajsozoma. Stoga, preskakanje eksona se može indukovati ciljanjem mesta splajsovanja pomoću antismisaonih nukleinskih kiselina. Dalje, vezivanje SR proteina, koji je bogat serinom i argininom, za eksonski pojačivač splajsovanja (ESE) se smatra neophodnim kako bi mehanizam splajsovanja prepoznao ekson. U skladu sa tim, preskakanje eksona može se takođe indukovati ciljanjem ESE.

[0007] Pošto se mutacija gena za distrofin može razlikovati u zavisnosti od pacijenata obolelih od DMD, antismisaone nukleinske kiseline treba da budu projektovane na osnovu mesta ili tipa respektivne genetske mutacije. Postoji više izveštaja o antismisaonim nukleinskim kiselinama koje indukuju preskakanje eksona sa jednom uzastopnom sekvencom kao ciljem za jedan ekson u genu za distrofin (Patentni dokumenti 1 do 6 i Nepatentni dokumenti 1 i 2). Takođe, navedeno je da, kada se dva tipa antismisaonih nukleinskih kiselina koje ciljaju isti ekson u genu za distrofin mešaju i mogu da deluju (dvostruko ciljanje), aktivnost preskakanja može biti pojačana u poređenju sa upotrebom svake pojedinačne antismisaone nukleinske kiseline (Patentni dokument 7).

[0008] Međutim, nijedan od prethodnih izveštaja ne pokazuje da povezana jednolančana antismisaona nukleinska kiselina (povezani tip) koja cilja dva ili više mesta u istom eksonu iskazuje aktivnost preskakanja (Patentni dokument 1).

DOKUMENT O PRETHODNOM STANJU TEHNIKE

Patentni dokument

[0009]

Patentni dokument 1: Međunarodna objava WO 2004/048570

Patentni dokument 2: Međunarodna objava WO 2009/139630

Patentni dokument 3: Međunarodna objava WO 2010/048586

Patentni dokument 4: US 2010/0168212

Patentni dokument 5: Međunarodna objava WO 2011/057350

Patentni dokument 6: Međunarodna objava WO 2006/000057

Patentni dokument 7: Međunarodna objava WO 2007/135105

Nepatentni dokument

[0010]

Nepatentni dokument 1: Annemieke Aartsma-Rus et al., (2002) Neuromuscular Disorders 12: S71-S77 Nepatentni dokument 2: Wilton S. D., e t al., Molecular Therapy 2007: 15: p.1288-96

OPIS PRONALASKA

PROBLEMI KOJE OVAJ PRONALAZAK TREBA DA REŠI

[0011] U ovim okolnostima, glavni cilj ovog pronalaska je obezbeđivanje novog povezanog tipa antismisaonog oligomera koji indukuje preskakanje eksona ciljanjem dve različite nukleotidne sekvence u istom eksonu u genu za distrofin, i terapijskog agensa za mišićnu distrofiju koja obuhvata oligomer.

SREDSTVA ZA REŠAVANJE PROBLEMA

[0012] Pronalazači su sproveli ekstenzivna ispitivanja sadržaja tehnika opisanih u gore navedenim dokumentima i strukture gena za distrofin, itd., i posledično su utvrdili da antismisaoni oligomer dobijen povezivanjem oligomera koji ciljaju dva različita mesta u eksonu 44 u ljudskom genu za distrofin može indukovati preskakanje ovog eksona. Na osnovu ovog otkrića, pronalazači su ostvarili ovaj opis.

[0013] Drugim rečima, ovaj opis je sledeći.

[1] Antismisaoni oligomer sa dužinom od 15 do 30 baza, u kojem

(a) prva jedinica oligomera koja obuhvata nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa prvom nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza u ciljnom eksonu; i (b) druga jedinica oligomera koja obuhvata nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa drugom nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza u ciljnom eksonu su povezane, pri čemu

prva nukleotidna sekvenca i druga nukleotidna sekvenca nisu uzastopne niti se preklapaju jedna sa drugom, i

antismisaoni oligomer indukuje preskakanje ciljnog eksona, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.

[2] Antismisaoni oligomer prema [1], pri čemu prva i/ili druga jedinica oligomera obuhvata nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa delimičnom nukleotidnom sekvencom introna susednog sa ciljnim eksonom, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.

[3] Antismisaoni oligomer prema [1] ili [2], pri čemu ciljni ekson je ekson u ljudskom genu za distrofin, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.

[4] Antismisaoni oligomer prema [1] ili [2], pri čemu prva nukleotidna sekvenca je nukleotidna sekvenca od 7 do 15 uzastopnih baza odabranih iz nukleotidne sekvence koju predstavlja SEQ ID NO: 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.

[5] Antismisaoni oligomer prema bilo kom od [1] do [3], pri čemu druga nukleotidna sekvenca je sekvenca nukleotida od 7 do 15 uzastopnih baza odabranih iz nukleotidne sekvence koju predstavlja SEQ ID NO: 2, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.

[6] Antismisaoni oligomer prema [1] ili [2], u kojem su dve jedinice oligomera odabrane iz grupe koju čine sledeći (c) do (e):

(c) jedinica oligomera koja se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza odabranih iz nukleotidne sekvence koju predstavlja SEQ ID NO: 3;

(d) jedinica oligomera koja se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza odabranih iz nukleotidne sekvence koju predstavlja SEQ ID NO: 4; i

(e) jedinica oligomera koja se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza odabranih iz nukleotidne sekvence koju predstavlja SEQ ID NO: 5, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.

[7] Antismisaoni oligomer prema [1] ili [2], koji se sastoji od nukleotidne sekvence odabrane iz grupe koju čine SEQ ID No: 6 do 9, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.

[8] Antismisaoni oligomer prema bilo kom od [1] do [7], koji je oligonukleotid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.

[9] Antismisaoni oligomer prema [8], pri čemu je grupa šećera i/ili fosfat-vezujući region najmanje jednog nukleotida koji čini oligonukleotid modifikovan, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.

[10] Antismisaoni oligomer prema [8] ili [9], pri čemu grupa šećera najmanje jednog nukleotida koji čini oligonukleotid predstavlja ribozu u kojoj 2'-OH grupa je zamenjena bilo kojim odabranim iz grupe koju čine OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br i I (u kojima R je alkil ili aril, a R' je alkilen), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.

[11] Antismisaoni oligomer prema bilo kom od [8] do [10], pri čemu fosfat-vezujući region najmanje jednog nukleotida koji čini oligonukleotid je bilo koji odabran iz grupe koju čine fosforotioatna veza, fosforoditioatna veza, alkilfosfonatna veza, fosforamidatna veza i boranofosfatna veza, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.

[12] Antismisaoni oligomer prema bilo kom od [1] do [7], koji je morfolino oligomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.

[13] Antismisaoni oligomer prema zahtevu [12], koji je morfolino oligomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.

[14] Antismisaoni oligomer prema [12] ili [13], gde 5' kraj je bilo koji kraj sledećih hemijskih formula (1) do (3), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.

[15] Farmaceutska kompozicija za lečenje mišićne distrofije, koja kao aktivni sastojak obuhvata antismisaoni oligomer prema bilo kom od [1] do [14], ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili hidrat.

[16] Farmaceutska kompozicija prema [15], koja obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač.

[17] Postupak za lečenje mišićne distrofije, koji obuhvata obezbeđivanje antismisaonog oligomera ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili hidrata pacijentu obolelom od mišićne distrofije prema bilo kom od [1] do [12] ili farmaceutske kompozicije prema [1] ili [16].

[18] Postupak za lečenje prema [17], pri čemu pacijent oboleo od mišićne distrofije ima mutaciju(e) koja(e) mora(ju) biti ciljana(e) za preskakanje eksona 44 u genu za distrofin.

[19] Postupak za lečenje prema [17] ili [18], pri čemu je pacijent ljudsko biće.

[20] Upotreba antismisaonog oligomera ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili hidrata prema bilo kom od [1] do [14] u proizvodnji farmaceutske kompozicije za lečenje mišićne distrofije.

[21] Antismisaoni oligomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema bilo kom od [1] do [14], koji se primenjuje za lečenje mišićne distrofije.

[22] Antismisaoni oligomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema [21], pri čemu pacijent oboleo od mišićne distrofije u navedenom lečenju ima mutaciju(e) koju(e) treba ciljati za preskakanje eksona 44 u genu za distrofin.

[23] Antismisaoni oligomer prema [21] ili [22], ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat, pri čemu je pacijent ljudsko biće.

[24] Postupak za proizvodnju antismisaonog oligomera prema [1], koji obuhvata povezivanje

(a) prve jedinice oligomera koja obuhvata nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa prvom nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza u ciljnom eksonu; i (b) druge jedinice oligomera koja obuhvata nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa drugom nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza u ciljnom eksonu radi proizvodnje antismisaonog oligomera dužine od 15 do 30 baza, pri čemu prva nukleotidna sekvenca i druga nukleotidna sekvenca nisu uzastopne niti se preklapaju jedna sa drugom.

[25] Postupak prema [24], koji dalje obuhvata:

merenje efikasnosti preskakanja pomoću dobijenog antismisaonog oligomera; i odabir antismisaonog oligomera čija je efikasnost preskakanja veća od referentne vrednosti.

[26] Postupak za skrining antismisaonog oligomera, koji obuhvata:

(a) odabir

(i) prve jedinice oligomera koja obuhvata nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa prvom nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza u ciljnom eksonu; i

(ii) druge jedinice oligomera koja obuhvata nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa drugom nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza u ciljnom eksonu, pri čemu prva nukleotidna sekvenca i druga nukleotidna sekvenca nisu uzastopne niti se preklapaju jedna sa drugom;

(b) povezivanje prve i druge jedinice oligomera radi proizvodnje antismisaonog oligomera dužine od 15 do 30 baza;

(c) merenje efikasnosti preskakanja pomoću antismisaonog oligomera dobijenog u fazi (b); i

(d) odabir antismisaonog oligomera čija je efikasnost preskakanja veća od referentne vrednosti.

DEJSTVA PRONALASKA

[0014] Antismisaoni oligomer ovog pronalaska može indukovati preskakanje eksona 44 u ljudskom genu za distrofin sa visokom efikasnošću. Takođe, simptomi Dišenove mišićne distrofije mogu se efektivno ublažiti davanjem farmaceutske kompozicije ovog pronalaska.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0015]

FIG.1 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijskoj liniji ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

FIG.2 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.3 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.4 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.5 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.6 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.7 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.8 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.9 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.10 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.11 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.12 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.13 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.14 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.15 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.16 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.17 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.18 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.19 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.20 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.21 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.22 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.23 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.24 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.25 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.26 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) u respektivnim koncentracijama oligomera.

FIG.27 prikazuje upoređivanje efikasnosti preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) između povezanog oblika i kompozicije dve jedinice oligomera koje ciljaju različita mesta.

FIG.28 prikazuje upoređivanje efikasnosti preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) između povezanog oblika i kompozicije dve jedinice oligomera koje ciljaju različita mesta.

FIG.29 prikazuje upoređivanje efikasnosti preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) između povezanog oblika i kompozicije dve jedinice oligomera koje ciljaju različita mesta.

FIG.30 prikazuje upoređivanje efikasnosti preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) između svake zasebne ćelije, povezanog oblika i kompozicije dve jedinice oligomera koje ciljaju različita mesta.

FIG.31 prikazuje upoređivanje efikasnosti preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u ćelijama ljudskog rabdomiosarkoma (RD ćelije) između svake zasebne ćelije, povezanog oblika i kompozicije dve jedinice oligomera koje ciljaju različita mesta.

FIG.32 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 44 u ljudskom genu za distrofin u fibroblastovima ljudskog pacijenta obolelog od DMD sa brisanjem eksona 45.

NAČIN ZA UPOTREBU PRONALASKA

[0016] U daljem tekstu, ovaj pronalazak biće detaljno opisan. Načini ostvarivanja opisani u nastavku predviđeni su da budu predstavljeni primerom radi opisa pronalaska, ali nisu ograničeni samo na sledeće načine ostvarivanja.

1. Antismisaoni oligomer

[0017] Ovaj opis obezbeđuje antismisaoni oligomer dužine 15 do 30 baza, u kojima

(a) prva jedinica oligomera obuhvata nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa prvom nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza u ciljnom eksonu; i

(b) druga jedinica oligomera obuhvata nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa drugom nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza u ciljnom eksonu su povezane, pri čemu

prva nukleotidna sekvenca i druga nukleotidna sekvenca nisu uzastopne niti se preklapaju jedna sa drugom, a antismisaoni oligomer indukuje preskakanje ciljnog eksona, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.

[0018] U daljem tekstu, „antismisaoni oligomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat“ mogu se generički kolektivno nazivati „antismisaoni oligomer“.

1

[0019] Gore opisani antismisaoni oligomer može se proizvesti postupkom za proizvodnju koji obuhvata povezivanje

(a) prve jedinice oligomera koja obuhvata nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa prvom nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza u ciljnom eksonu; i

(b) druge jedinice oligomera koja obuhvata nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa drugom nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza u ciljnom eksonu radi proizvodnje antismisaonog oligomera dužine od 15 do 30 baza, pri čemu

prva nukleotidna sekvenca i druga nukleotidna sekvenca nisu uzastopne niti se preklapaju jedna sa drugom.

[0020] Postupak za proizvodnju može dalje obuhvatati fazu merenja efikasnosti preskakanja pomoću dobijenog antismisaonog oligomera i sekundarnu fazu odabira antismisaonog oligomera čija je efikasnost preskakanja veća od referentne vrednosti.

[0021] U sekundarnoj fazi gore opisanog postupka proizvodnje, efikasnost preskakanja može se utvrditi na sledeći način. mRNK za gen koji obuhvata ciljani ekson se prikuplja iz test ćelija; u mRNK, mere se nivo polinukleotida „A“ trake na kojoj je ciljani ekson preskočen i nivo polinukleotida „B“ trake na kojoj ciljani ekson nije preskočen. Upotrebom ovih mernih vrednosti „A“ i „B“ efikasnost se izračunava sledećom jednačinom:

[0022] Alternativno, za izračunavanje efikasnosti preskakanja, Međunarodna objava WO2012/029986 može biti referenca.

[0023] U sekundarnoj fazi, efikasnost preskakanja upotrebljena kao referentna vrednost iznosi 10% ili više, 20% ili više, 30% ili više, 40% ili više, 50% ili više, 60% ili više, 70% ili više, 80% ili više ili 90% ili više.

[0024] Povezivanjem više jedinica oligomera kako je gore pomenuto, antismisaoni oligomer sa poboljšanom aktivnošću preskakanja može se dobiti čak i ako svaka od jedinica oligomera ima nisku aktivnost preskakanja (ili nikakvu aktivnost preskakanja).

[0025] Ovaj opis takođe obezbeđuje postupak za skrining antismisaonog oligomera, koji obuhvata:

(a) odabir

(i) prve jedinice oligomera koja obuhvata nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa prvom nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza u ciljnom eksonu; i (ii) druge jedinice oligomera koja obuhvata nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa drugom nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza u ciljnom eksonu, pri čemu prva nukleotidna sekvenca i druga nukleotidna sekvenca nisu uzastopne niti se preklapaju jedna sa drugom;

(b) povezivanje prve i druge jedinice oligomera radi proizvodnje antismisaonog oligomera dužine od 15 do 30 baza;

(c) merenje efikasnosti preskakanja pomoću antismisaonog oligomera dobijenog u fazi (b); i (d) odabir antismisaonog oligomera čija je efikasnost preskakanja veća od referentne vrednosti.

[0026] U gore opisanom antismisaonom oligomeru, prva i druga jedinica oligomera mogu se povezati tako da bilo koja od prve i druge jedinice oligomera bude pozicionirana na 5' ili 3' strani druge. U jednom načinu ostvarivanja, prva jedinica oligomera je pozicionirana na 5' strani, a druga jedinica oligomera je pozicionirana na 3' strani radi spajanja.

[0027] Takođe, antismisaoni oligomer može obuhvatati treću jedinicu oligomera koja obuhvata nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa trećom nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza u ciljnom eksonu.

[0028] Kako se ovde koristi, pojam „povezivanje“ odnosi se na situaciju kada su dve jedinice oligomera direktno vezane jedna za drugu ili kada su dve jedinice oligomera vezane jedna za drugu preko linkera. Kada su dve jedinice oligomera direktno vezane jedna za drugu, tada 3' kraj jedinice oligomera pozicionirane na 5' strani i 5' kraj druge jedinice oligomera pozicionirane na 3' strani formiraju fosfatnu vezu ili grupu prikazanu u nastavku. Primer linkera uključuje nukleinsku kiselinu (lanac) od 1 do 5 ostataka, kao i poznati linker koji se obično koristi za povezivanje nukleinskih kiselina ili ostataka morfolino nukleinske kiseline, poput 3-aminopropila, sukcinila, 2,2'-dietanolsulfonila i alkilamina dugog lanca (LCAA).

u kojoj X predstavlja -OH, -CH2R<1>, -OCH2R<1>, -S-CH2R<1>, -NR<2>R<3>ili F ;

R<1>predstavlja H ili alkil;

R<2>i R<3>, koji mogu biti isti ili različiti, svaki predstavlja H, alkil, cikloalkil ili aril ;

Y1predstavlja O, S, CH2ili NR<1>;

Y2predstavlja O, S ili NR<1>;

Z predstavlja O ili S.

[0029] Prva i/ili druga jedinica oligomera može obuhvatati nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa delimičnom nukleotidnom sekvencom introna susednog sa ciljnim eksonom. U načinu ostvarivanja u kojem su, na primer, prva i druga jedinica oligomera povezane jedna sa drugom tako da je prva jedinica oligomera pozicionirana na 5' strani, a druga jedinica oligomera je pozicionirana na 3' strani, 5' strana prve jedinice oligomera može obuhvatati nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa nukleotidnom sekvencom smeštenom u blizini 3' kraja introna susednog sa 5' stranom ciljnog eksona, i/ili 3' strana druge jedinice oligomera može obuhvatati nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa nukleotidnom sekvencom smeštenom u blizini 5' kraja introna susednog sa 3' stranom ciljnog eksona.

[0030] Prva i/ili druga jedinica oligomera može obuhvatati nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa delimičnom nukleotidnom sekvencom eksonskog pojačivača splajsovanja (ESE) ciljnog eksona.

[0031] Ciljni ekson nije naročito ograničen. U jednom načinu ostvarivanja, ciljni ekson je ekson u ljudskom genu i dalje predstavlja ekson u ljudskom genu za distrofin.

[0032] Konkretnije, ciljni ekson je ekson 44 u ljudskom genu za distrofin.

[0033] Stoga, u jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje antismisaoni oligomer koji prouzrokuje preskakanje eksona 44 u ljudskom genu za distrofin (u daljem tekstu „oligomer ovog pronalaska“). U daljem tekstu, struktura antismisaonog oligomera ovog pronalaska biće detaljno opisana.

[Ekson 44 u ljudskom genu za distrofin]

[0034] U ovom pronalasku, pojam „gen“ je predviđen da označava genomski gen i takođe uključuje cDNK, mRNK prekursor i mRNK. Poželjno, gen je mRNK prekursor, tj. pred-mRNK.

[0035] U ljudskom genomu, ljudski gen za distrofin se nalazi na lokusu Xp21.2. Ljudski gen za distrofin ima veličinu od 3,0 Mbp i predstavlja najveći gen među poznatim ljudskim genima. Međutim, regioni kodiranja ljudskog gena za distrofin su samo 14kb, distribuirani kao 79 eksona kroz ljudski gen za distrofin (Roberts, RG, et al., Genomics, 16: 536-538 (1993)). Pred-mRNK, koji je transkript ljudskog gena za distrofin, podvrgava se splajsovanju kako bi se generisala zrela mRNK od 14 kb. Nukleotidna sekvenca divljeg tipa ljudskog gena za distrofin je poznata (GenBank Accession No. NM_004006).

[0036] Nukleotidna sekvenca eksona 44 u divljem tipu ljudskog gena za distrofin je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 10.

[0037] U jednom načinu ostvarivanja, oligomer ovog pronalaska je predviđen da prouzrokuje preskakanje eksona 44 u ljudskom genu za distrofin, čime se modifikuje protein kodiran pomoću DMD

1

tipa gena za distrofin u BMD tip proteina distrofina. U skladu sa tim, ekson 44 u genu za distofin koji je cilj preskakanja eksona od strane antismisaonog oligomera ovog pronalaska uključuje i divlje i mutirane tipove.

[0038] Konkretno, mutanti eksona 44 ljudskog gena za distrofin uključuju polinukleotide definisane u (I) ili (II) u nastavku.

(I) Polinukleotid koji se hibridizuje pod strogo definisanim uslovima u polinukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom od SEQ ID NO: 10; i, (II) Polinukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja ima najmanje 90% identičnosti sa nukleotidnom sekvencom od SEQ ID NO: 10.

Kako se ovde koristi, pojam „polinukleotid“ je predviđen da označava DNK ili RNK.

[0039] Kako se ovde koristi, pojam „polinukleotid koji se hibridizuje pod strogo definisanim uslovima“ odnosi se, na primer, na polinukleotid dobijen hibridizacijom kolonije, hibridizacijom plaka, Southern hibridizacijom ili slično, koji kao sondu koristi celokupan ili deo polinukleotida koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom od, npr., SEQ ID NO: 10. Postupak hibridizacije koji se može koristiti uključuje postupke opisane u, na primer, "Sambrook i Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol.3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001," "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley i Sons 1987-1997," itd.

[0040] Kako se ovde koristi, pojam „komplementarna nukleotidna sekvenca“ nije ograničen samo na nukleotidne sekvence koje formiraju Watson-Crick parove sa ciljnim nukleotidnim sekvencama, već je takođe predviđen da uključuje nukleotidne sekvence koje formiraju kolebljive bazne parove. Kako se ovde koristi, pojam Watson-Crick par odnosi se na par nukleobaza u kojima se formiraju vodonične veze između adenina-timina, adenina-uracila ili guanina-citozina, a pojam kolebljivi bazni par se odnosi na par nukleobaza u kojima se formiraju vodonične veze između guanina-uracila, inozina-uracila, inozinaadenina ili inozina-citozina. Kako se ovde koristi, pojam „komplementarna nukleotidna sekvenca“ ne odnosi se samo na nukleotidnu sekvencu 100% komplementarnu sa ciljnom nukleotidnom sekvencom, već se takođe odnosi i na komplementarnu nukleotidnu sekvencu koja može sadržati, na primer, 1 do 3, 1 ili 2, ili jedan nukleotid nekomplementaran sa ciljnom nukleotidnom sekvencom.

[0041] Kako se ovde koristi, pojam „strogo definisani uslovi“ može biti bilo koji od nisko strogo definisanih uslova, umereno strogo definisanih uslova ili visoko strogo definisanih uslova. Pojam „nisko strogo definisani uslovi“ su, na primer, 5x SSC, 5x Denhardt-ov rastvor, 0,5% SDS, 50% formamida na 32°C. Pojam „umereno strogo definisani uslovi“ su, na primer, 5x SSC, 5x Denhardt-ov rastvor, 0,5% SDS, 50% formamida na 42°C, ili 5x SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50% formamida na 42°C. Pojam „visoko strogo definisani uslovi“ su, na primer, 5x SSC, 5x Danhardt-ov rastvor, 0,5% SDS, 50% formamida na 50°C ili 0,2 x SSC, 0,1% SDS na 65°C. U ovim uslovima, očekuje se da polinukleotidi sa višom homologijom budu efikasno dobijeni na višim temperaturama, iako je više faktora uključeno u strogost hibridizacije uključujući temperaturu, koncentraciju sonde, dužinu sonde, jonsku snagu, vreme, koncentraciju soli i drugo, a stručnjaci iz ove oblasti mogu pravilno odabrati ove faktore za dostizanje slične strogosti definisanja uslova.

[0042] Kada se komercijalno dostupni kompleti koriste za hibridizaciju, na primer, Alkphos sistem direktnog obeležavanja i detekcije (GE Healthcare) se može koristiti. U ovom slučaju, prema priloženom protokolu, nakon kultivacije pomoću obeležene sonde tokom noći, membrana se ispira primarnim puferom za ispiranje koji sadrži 0,1 mas.% SDS na 55°C, čime se detektuju hibridizovani polinukleotidi. Alternativno, tokom proizvodnje sonde bazirane na celokupnoj ili delu nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom od SEQ ID NO: 10, hibridizacija se može detektovati pomoću DIG kompleta za detekciju nukleinske kiseline (Roche Diagnostics) kada se sonda obeleži digoksigeninom (DIG) pomoću komercijalno dostupnog reagensa (npr., PCR Labeling Mix (Roche Diagnostics), itd.).

[0043] Pored gore opisanih polinukleotida, drugi polinukleotidi koji mogu biti hibridizovani uključuju polinukleotide sa 90% ili više, 91% ili više, 92% ili više, 93% ili više, 94% ili više, 95% ili više, 96% ili više, 97% ili više, 98% ili više, 99% ili više, 99,1% ili više, 99,2% ili više, 99,3% ili više, 99,4% ili više, 99,5% ili više, 99,6% ili više, 99,7% ili više, 99,8% ili više ili 99,9% ili više identičnosti sa polinukleotidom od SEQ ID NO: 10, kako je izračunato pomoću softvera za pretragu homologije BLAST upotrebom različitih parametara.

[0044] Identičnost između nukleotidnih sekvenci može se utvrditi upotrebom algoritma BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) koji su razvili Karlin i Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873, 1993). Programi koji se nazivaju BLASTN i BLASTX bazirani na BLAST algoritmu su razvijeni (Altschul SF, et al: J. Mol. Biol.215: 403, 1990). Kada se nukleotidna sekvenca sekvencira pomoću BLASTN, parametri su, na primer, skor = 100 i dužina reči = 12. Kada se koriste programi BLAST i Gapped BLAST, koriste se definisani parametri za svaki program.

[0045] Oligomer ovog opisa je konkretno antismisaoni oligomer dužine od 15 do 30 baza, u kojem su povezane dve jedinice oligomera odabrane iz grupe koju čine (a) i (b) u nastavku:

(a) jedinica oligomera koja se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza odabranih iz nukleotidne sekvence koju predstavlja SEQ ID NO: 1; i

(b) jedinica oligomera koja se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza odabranih iz nukleotidne sekvence koju predstavlja SEQ ID NO: 2.

1

[0046] Na primer, prva nukleotidna sekvenca može biti nukleotidna sekvenca od 7 do 15 uzastopnih baza odabranih od nukleotidne sekvence koju predstavlja SEQ ID NO: 1, i/ili druga nukleotidna sekvenca može biti nukleotidna sekvenca od 7 do 15 uzastopnih baza odabranih iz nukleotidne sekvence koju predstavlja SEQ ID NO: 2.

[0047] Poželjno, oligomer ovog pronalaska je antismisaoni oligomer dužine od 15 do 30 baza, u kojem su povezane dve jedinice oligomera odabrane iz grupe koju čine (c) do (e) u nastavku:

(c) jedinica oligomera koja se sastoji od sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza odabranih iz nukleotidne sekvence koju predstavlja SEQ ID NO: 3; (d) jedinica oligomera koja se sastoji od sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza odabranih iz nukleotidne sekvence koju predstavlja SEQ ID NO: 4; i (e) jedinica oligomera koja se sastoji od sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom od 7 do 15 uzastopnih baza odabranih iz nukleotidne sekvence koju predstavlja SEQ ID NO: 5.

[0048] Ovde, nukleotidne sekvence koje predstavljaju SEQ ID NO: 1 i 2 su sekvence koje se sastoje od 1. do 44. baze i od 58. do 115. baze, respektivno, od 5' kraja nukleotidne sekvence eksona 44 (SEQ ID NO: 10) u divljem tipu ljudskog gena za distrofin.

[0049] Nukleotidna sekvenca koju predstavlja SEQ ID NO: 3 je sekvenca koja se sastoji od 18. do 34. baze od 5' kraja nukleotidne sekvence eksona 44 (SEQ ID NO: 10) u divljem tipu ljudskog gena za distrofin. Slično, nukleotidne sekvence koje predstavljaju SEQ ID NO: 4 i 5 su sekvence koje se sastoje od 61. do 77. baze i od 88. do 104. baze, respektivno.

[0050] Veličina svake jedinice oligomera (a) do (e) (u daljem tekstu, takođe se jednostavno navode kao „jedinice“) je dužina od 7 do 15 baza i poželjno je dužina od 8 do 15 baza, dužina od 9 do 15 baza, dužina od 10 do 15 baza, dužina od 10 do 14 baza, dužina od 10 do 13 baza ili dužina od 11 do 13 baza. Jedinice (a) do (e) mogu biti iste ili različite veličine.

[0051] Za odabir dve jedinice oligomera iz grupe koja se sastoji od (a) i (b), dve jedinice oligomera mogu biti kombinacija istih jedinica oligomera ili mogu biti kombinacija različitih jedinica oligomera.

Konkretno, dve jedinice oligomera mogu biti kombinacija (a) i (a) ili kombinacija (b) i (b) ili mogu biti kombinacija (a) i (b).

[0052] Za odabir dve jedinice oligomera iz grupe koju čine (c) do (e), dve jedinice oligomera mogu biti kombinacija istih jedinica oligomera ili mogu biti kombinacija različitih jedinica oligomera. Poželjno, dve jedinice se respektivno biraju od različitih tipova. Kada je, na primer, (c) odabrana kao jedna jedinica, druga jedinica je poželjno (d) ili (e). Isto tako, kada je (d) odabrana kao jedna jedinica, druga jedinica je poželjno (c) ili (e). Takođe, kada je (e) odabrana kao jedna jedinica, druga jedinica je poželjno (c) ili (d).

[0053] Kada su jedinice (a) i (b) odabrane, bilo koja od odabrane dve jedinice može se nalaziti na 5' strani. Kada su jedinice (a) i (b) odabrane, jedinica (a) je poželjno povezana na 3' strani.

1

[0054] Kada su dve jedinice odabrane od (c) do (e), bilo koja od odabrane dve jedinice može se nalaziti na 5' strani. Kada su odabrane jedinice (c) i (d), jedinica (c) je poželjno povezana na 3' strani. Kada su odabrane jedinice (d) i (e), jedinica (d) je poželjno povezana na 3' strani. Kada su odabrane jedinice (c) i (e), jedinica (c) je poželjno povezana na 3' strani.

[0055] Kako se ovde koristi, pojam „povezivanje“ odnosi se na direktno vezivanje dve jedinice odabrane od (a) i (b) ili dve jedinice odabrane od (c) do (e). Konkretno, pojam „kada su dve jedinice povezane“ označava da 3' kraj jedinice pozicionirane na 5' strani i 5' kraj jedinice pozicionirane na 3' strani formiraju fosfatnu vezu ili grupu prikazanu u nastavku.

u kojoj X predstavlja -OH, -CH2R<1>, -O-CH2R<1>, -S-CH2R<1>, -NR<2>R<3>ili F;

R<1>predstavlja H ili alkil;

R<2>i R<3>, koji mogu biti isti ili različiti, svaki predstavlja H, alkil, cikloalkil ili aril;

Y1predstavlja O, S, CH2ili NR<1>;

Y2predstavlja O, S ili NR<1>;

Z predstavlja O ili S.

[0056] Pojam „prouzrokovati preskakanje eksona 44 u ljudskom genu za distrofin“ treba da znači da se vezivanjem oligomera ovog pronalaska za mesto koje odgovara eksonu 44 transkripta (npr., pred-mRNK) ljudskog gena za distrofin, na primer, što rezultira formiranjem zrele mRNK koja je oslobođena promene okvira kodona, nukleotidna sekvenca koja odgovara 5' kraju eksona 46 splajsuje na nukleotidnoj sekvenci koja odgovara 3' kraju eksona 43 kod pacijenata obolelih od DMD sa brisanjem eksona 45 kada se transkript podvrgne splajsovanju.

[0057] Ovde, gore opisan pojam „vezivanje“ treba da znači da, kada se oligomer ovog pronalaska meša sa transkriptom ljudskog gena za distrofin, oba se hibridizuju u fiziološkim uslovima radi formiranja dvolančane nukleinske kiseline. Pojam „u fiziološkim uslovima“ odnosi se na uslove podešene da podražavaju in vivo okruženje u pogledu pH vrednosti, sastava soli i temperature. Uslovi su, na primer, 25 do 40°C, poželjno 37°C, pH vrednost 5 do 8, poželjno pH 7,4 i 150 mM koncentracije natrijum hlorida.

[0058] Da li je preskakanje eksona 44 u ljudskom genu za distrofin prouzrokovano ili nije može se potvrditi uvođenjem oligomera ovog pronalaska u ekspresionu ćeliju distrofina (npr., ćelije ljudskog

1

rabdomiosarkoma), pojačavanjem regiona oko eksona 44 mRNK ljudskog gena za distrofin od ukupne RNK ekspresione ćelije distrofina pomoću RT-PCR i sprovođenjem gnezdane PCR ili analize sekvence na proizvodu pojačanom pomoću PCR.

[0059] Efikasnost preskakanja može se utvrditi na sledeći način. mRNK za ljudski gen za distrofin se sakuplja iz test ćelija; u mRNK, mere se nivo polinukleotida „A“ na traci gde se ekson 44 preskače i nivo polinukleotida „B“ na traci gde se ekson 44 ne preskače. Upotrebom ovih vrednosti merenja „A“ i „B“, efikasnost se izračunava sledećom jednačinom:

[0060] Alternativno, za izračunavanje efikasnosti preskakanja, Međunarodna objava WO2012/029986 može biti referenca.

[0061] Poželjno, antismisaoni oligomer ovog pronalaska prouzrokuje preskakanje ciljnog eksona (npr., ekson 44) sa efikasnošću od 10% ili više, 20% ili više, 30% ili više, 40% ili više, 50% ili više, 60% ili više, 70% ili više, 80% ili više, ili 90% ili više.

[0062] Antismisaoni oligomer ovog pronalaska uključuje, na primer, oligonukleotid, morfolino oligomer ili oligomer peptidne nukleinske kiseline (PNA), dužine od 15 do 30 baza. Dužina je poželjno od 16 do 30, od 17 do 30, od 18 do 30, od 19 do 30, od 20 do 30, od 20 do 29, od 20 do 28, od 20 do 27, od 20 do 26, od 21 do 26, ili od 22 do 26 baza, a poželjni su morfolino oligomeri.

[0063] Gore opisan oligonukleotid (u daljem tekstu „oligonukleotid ovog pronalaska“) je oligomer ovog pronalaska koji se sastoji od nukleotida kao sastavnih jedinica. Takvi nukleotidi mogu biti bilo koji od ribonukleotida, dezoksiribonukleotida i modifikovanih nukleotida.

[0064] Modifikovani nukleotid se odnosi na onaj koji ima u celosti ili delimično modifikovane nukleobaze, grupe šećera i/ili fosfat-vezujuće regione, koji čine ribonukleotid ili dezoksiribonukleotid.

[0065] Nukleobaza uključuje, na primer, adenin, guanin, hipoksantin, citozin, timin, uracil i njihove modifikovane baze. Primeri takvih modifikovanih baza uključuju, ali nisu ograničeni na pseudouracil, 3-metiluracil, dihidrouracil, 5-alkilcitozine (npr., 5-metilcitozin), 5-alkiluracile (npr., 5-etiluracil), 5-halouracile (5-bromouracil), 6-azapirimidin, 6-alkilpirimidine (6-metiluracil), 2-tiouracil, 4-tiouracil, 4-acetilcitozin, 5-(karboksihidroksimetil) uracil, 5'-karboksimetilaminometil-2-tiouracil, 5-karboksimetilaminometiluracil, 1-metiladenin, 1-metilhipoksantin, 2,2-dimetilguanin, 3-metilcitozin, 2-metiladenin, 2-metilguanin, N6-metiladenin, 7-metilguanin, 5-metoksiaminometil-2-tiouracil, 5-metilaminometiluracil, 5-metilkarbonilmetiluracil, 5-metiloksiuracil, 5-metil-2-tiouracil, 2-metiltio-N6-izopenteniladenin, uracil-5-oksisirćetna kiselina, 2-tiocitozin, purin, 2,6-diaminopurin, 2-aminopurin, izoguanin, indol, imidazol, ksantin, itd.

[0066] Modifikacija grupe šećera može uključivati, na primer, modifikacije u 2'-poziciji riboze i modifikacije drugih pozicija šećera. Modifikacija u 2'-poziciji riboze uključuje zamenu 2'-OH riboze sa OR,

1

R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br ili I, u kojima R predstavlja alkil ili aril, a R' predstavlja alkilen.

[0067] Modifikacija za druge pozicije šećera uključuje, na primer, zamenu O u 4' poziciji riboze ili dezoksiriboze sa S, uz premošćavanje između 2' i 4' pozicije šećera, npr., BNK (blokirana nukleinska kiselina) ili ENK (2'-O,4'-C-etilenom premošćene nukleinske kiseline), ali nije ograničena na njih.

[0068] Modifikacija fosfat-vezujućeg regiona uključuje, na primer, modifikaciju zamene fosfodiestarske veze sa fosforotioatnom vezom, fosforoditioatnom vezom, alkil fosfonatnom vezom, fosforoamidatnom vezom ili boranofosfatnom vezom (Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry ,2008, 18, 9154-9160 ) (up., npr., Japan Domestic Re-Publications of PCT Application Nos.2006/129594 i 2006/038608).

[0069] Alkil je poželjno prav ili razgranat alkil koji ima 1 do 6 atoma ugljenika. Konkretni primeri uključuju metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, izobutil, sec-butil, tert-butil, n-pentil, izopentil, neopentil, tert-pentil, n-heksil i izoheksil. Alkil može opciono biti supstituisan. Primeri takvih supstituenata su halogen, alkoksi, cijano i nitro. Alkil može biti supstituisan sa jednim do tri takva supstituenta.

[0070] Cikloalkil je poželjno cikloalkil koji ima 5 do 12 atoma ugljenika. Konkretni primeri uključuju ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil, ciklooktil, ciklodecil i ciklododecil.

[0071] Halogen uključuje fluor, hlor, brom i jod.

[0072] Alkoksi je prav ili razgranat alkoksi koji ima 1 do 6 atoma ugljenika kao što su metoksi, etoksi, npropoksi, izopropoksi, n-butoksi, izobutoksi, sec-butoksi, tert-butoksi, n-pentiloksi, izopentiloksi, nheksiloksi, izoheksiloksi, itd. Između ostalih, poželjan je alkoksi koji ima 1 do 3 atoma ugljenika.

[0073] Aril je poželjno aril koji ima 6 do 10 atoma ugljenika. Konkretni primeri uključuju fenil, α-naftil i βnaftil. Između ostalih, poželjan je fenil. Aril može opciono biti supstituisan. Primeri takvih supstituenata su alkil, halogen, alkoksi, cijano i nitro. Aril može biti supstituisan sa jednim do tri takva supstituenta.

[0074] U ovom pronalasku, alkilen je poželjno prav ili razgranat alkilen koji ima 1 do 6 atoma ugljenika. Konkretni primeri uključuju metilen, etilen, trimetilen, tetrametilen, pentametilen, heksametilen, 2-(etil) trimetilen i 1-(metil) tetrametilen.

[0075] Acil uključuje prav ili razgranat alkanoil ili aroil. Primeri alkanoila uključuju formil, acetil, 2-metilacetil, 2,2-dimetilacetil, propionil, butiril, izobutiril, pentanoil, 2,2-dimetilpropionil, heksanoil, itd. Primeri aroila uključuju benzoil, toluoil i naftoil. Aroil može opciono biti supstituisan u supstituišućim pozicijama i može biti supstituisan sa alkilom(ima).

[0076] Poželjno, oligonukleotid ovog pronalaska je oligomer ovog pronalaska koji sadrži konstituentnu jedinicu predstavljenu opštom formulom u nastavku, u kojoj -OH grupa na poziciji 2' riboze je supstituisana sa metoksijem, a fosfat-vezujući region je fosforotioatna veza:

1

u kojoj Baza predstavlja nukleobazu.

[0077] Oligonukleotid ovog pronalaska može se jednostavno sintetizovati pomoću različitih automatizovanih sintetizera (npr., AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare)). Alternativno, sinteza se takođe može poveriti trećoj organizaciji (npr., Promega Inc. ili Takara Co.), itd.

[0078] Gore opisani morfolino oligomer je oligomer ovog pronalaska koji obuhvata konstituentnu jedinicu predstavljenu opštom formulom u nastavku:

u kojoj Baza ima isto značenje kao gore definisano, i,

W predstavlja grupu prikazanu bilo kojom od sledećih grupa:

u kojoj X predstavlja -CH2R<1>, -O-CH2R<1>, -S-CH2R<1>, -NR<2>R<3>ili F ;

R<1>predstavlja H ili alkil;

R<2>i R<3>, koji mogu biti isti ili različiti, svaki predstavlja H, alkil, cikloalkil ili aril;

Y1predstavlja O, S, CH2ili NR<1>;

Y2predstavlja O, S ili NR<1>;

Z predstavlja O ili S.

2

[0079] Poželjno, morfolino oligomer je oligomer koji obuhvata konstituentnu jedinicu predstavljenu opštom formulom u nastavku (fosforodiamidat morfolino oligomer (u daljem tekstu „PMO“)).

u kojoj Baza, R<2>i R<3>imaju isto značenje kao gore definisano.

[0080] Morfolino oligomer može biti proizveden u skladu sa, npr., WO 1991/009033 ili WO 2009/064471. Određenije, PMO se može proizvesti postupkom opisanim u WO 2009/064471 ili WO2013/100190.

[Postupak za proizvodnju PMO]

[0081] Način ostvarivanja PMO-a je, na primer, jedinjenje predstavljeno opštom formulom (I) u nastavku (u daljem tekstu PMO (I)).

u kojoj Baza, R<2>i R<3>imaju isto značenje kao gore definisano; i,

n je dati ceo broj od 1 do 99, poželjno dati ceo broj od 18 do 28.

[0082] PMO (I) se može proizvesti u skladu sa poznatim postupkom, na primer, može se proizvesti sprovođenjem postupaka u sledećim fazama.

[0083] Jedinjenja i reagensi koji se koriste u sledećim fazama nisu naročito ograničeni sve dok se uobičajeno koriste za pripremu PMO.

[0084] Takođe, sve sledeće faze se mogu sprovesti postupkom tečne faze ili postupkom čvrste faze (upotrebom uputstava ili komercijalno dostupnih automatskih sintetizera čvrste faze). Tokom proizvodnje PMO postupkom čvrste faze, poželjno je koristiti automatske sintetizere radi pojednostavljenja postupaka rada i tačnosti sinteze.

(1) Faza A:

[0085] Jedinjenje predstavljeno opštom formulom (II) u nastavku (u daljem tekstu Jedinjenje (II)) reaguje sa kiselinom kako bi se pripremilo jedinjenje predstavljeno opštom formulom (III) u nastavku (u daljem tekstu Jedinjenje (III)):

u kojoj n, R<2>i R<3>imaju isto značenje kao gore definisano;

svaki B<P>zasebno predstavlja nukleobazu koja može opciono biti zaštićena;

T predstavlja tritil, monometoksitritil ili dimetoksitritil; i,

L predstavlja vodonik, acil ili grupu predstavljenu opštom formulom (IV) u nastavku (u daljem tekstu grupa (IV)).

[0086] „Nukleobaza“ za B<P>uključuje istu „nukleobazu“ kao u Bazi, pod uslovom da amino ili hidroksi grupa u nukleobazi koju prikazuje B<P>može biti zaštićena.

[0087] Takva zaštitna grupa za amino nije naročito ograničena sve dok se koristi kao zaštitna grupa za nukleinske kiseline. Konkretni primeri uključuju benzoil, 4-metoksibenzoil, acetil, propionil, butiril, izobutiril, fenilacetil, fenoksiacetil, 4-tert-butilfenoksiacetil, 4-izopropilfenoksiacetil i (dimetilamino)metilen. Konkretni primeri zaštitne grupe za hidroksi grupu uključuju 2-cijanoetil, 4-nitrofenetil, fenilsulfoniletil, metilsulfoniletil i trimetilsililetil, i fenil, koji može biti supstituisan sa 1 do 5 elektron povlačećih grupa na opcionim supstituišućim pozicijama, difenilkarbamoil, dimetilkarbamoil, dietilkarbamoil, metilfenilkarbamoil, 1-pirolidinilkarbamoil, morfolinokarbamoil, 4-(tert-butilkarboksi) benzil, 4-[(dimetilamino)karboksi]benzil i 4-(fenilkarboksi)benzil, (up., npr., WO 2009/064471).

[0088] „Čvrsti nosač“ nije naročito ograničen sve dok je u pitanju nosač koji se koristi za reakciju čvrste faze nukleinskih kiselina. Poželjno je da čvrsti nosač poseduje sledeće karakteristike: npr., (i) umereno je rastvorljiv u reagensima koji se mogu koristiti za sintezu derivata morfolino nukleinske kiseline (npr., dihlorometan, acetonitril, tetrazol, N-metilimidazol, piridin, anhidrid sirćetne kiseline, lutidin, trifluorosirćetna kiselina); (ii) hemijski je stabilan u odnosu na reagense koji se koriste za sintezu derivata morfolino nukleinske kiseline; (iii) može se hemijski modifikovati; (iv) može se puniti željenim derivatima morfolino nukleinske kiseline; (v) poseduje snagu dovoljnu da izdrži visok pritisak tokom lečenja; i (vi) poseduje uniformni opseg i distribuciju prečnika čestice. Konkretno, bubreći polistiren (npr., aminometil polistiren smola 1% dibenzilbenzen unakrsno vezani (200-400 smeša) (2,4-3,0 mmol/g) (proizvodi Tokyo Chemical Industry), aminometilisana polistiren smola HCl [dibenzilbenzen 1%, 100-200 smeša] (proizvodi Peptide Institute, Inc.)), nebubreći polistiren (npr., Primer Support (proizvodi GE Healthcare)), PEG lancem vezani polistiren (npr., NH2-PEG smola (proizvodi Watanabe Chemical Co.), TentaGel smola), kontrolno porozno staklo (kontrolno porozno staklo; CPG) (proizvodi, npr., CPG), oksalil-kontrolisano porozno staklo (up., npr., Alul et al., Nucleic Acids Research, Vol.19, 1527 (1991)), TentaGel podloga-aminopolietilen podloga kao derivat glikola (npr., Wright et al., up., Tetrahedron Letters, Vol.34, 3373 (1993)), i kopolimer Poros-polistirena/divinilbenzena.

[0089] „Linker“ koji se može koristiti je poznati linker koji se generalno koristi za povezivanje nukleinskih kiselina ili derivata morfolino nukleinske kiseline. Primeri uključuju 3-aminopropil, sukcinil, 2,2'-dietanolsulfonil i alkil amino dugog lanca (LCAA).

[0090] Ova faza može se sprovesti reakcijom Jedinjenja (II) sa kiselinom.

[0091] „Kiselina“ koja se može koristiti u ovoj fazi uključuje, na primer, trifluorosirćetnu kiselinu, dihlorosirćetnu kiselinu i trihlorosirćetnu kiselinu. Kiselina koja se koristi je odgovarajuće u opsegu od, na primer, ekvivalenta 0,1 mol do ekvivalenata 1000 mol na bazi 1 mol Jedinjenja (II), poželjno u opsegu od ekvivalenta 1 mol do ekvivalenata 100 mol na bazi 1 mol Jedinjenja (II).

[0092] Organski amin se može koristiti u kombinaciji sa gore opisanom kiselinom. Organski amin nije naročito ograničen i uključuje, na primer, trietilamin. Količina organskog amina koji se koristi je odgovarajuće u opsegu od, npr., ekvivalenta 0,01 mol do ekvivalenata 10 mol, a poželjno u opsegu od ekvivalenta 0,1 mol do ekvivalenata 2 mol, na bazi 1 mol kiseline.

[0093] Kada se so ili kompozicija kiseline i organskog amina koristi u ovoj fazi, so ili kompozicija uključuje, na primer, so ili kompoziciju trifluorosirćetne kiseline i trietilamina, i konkretnije, kompoziciju od 1 ekvivalenta trietilamina i 2 ekvivalenta trifluorosirćetne kiseline.

[0094] Kiselina koja se može koristiti u ovoj fazi može se takođe koristiti u obliku razblaživanja sa odgovarajućim rastvaračem u koncentraciji od 0,1% do 30%. Rastvarač nije naročito ograničen sve dok je inertan na reakciju, i uključuje, na primer, dihlorometan, acetonitril, alkohol (etanol, izopropanol, trifluoroetanol, itd.), vodu, ili njihovu kompoziciju.

[0095] Temperatura reakcije u gore opisanoj reakciji je poželjno u opsegu od, npr., 10°C do 50°C, poželjnije u opsegu od 20°C do 40°C, a najpoželjnije u opsegu od 25°C do 35°C.

2

[0096] Vreme reakcije se može razlikovati u zavisnosti od vrste kiseline koja se koristi i temperature reakcije, i odgovarajuće je u opsegu od 0,1 minuta do 24 sata generalno, a poželjno u opsegu od 1 minuta do 5 sati.

[0097] Nakon završetka ove faze, baza se može dodati, po potrebi, radi neutralizacije kiseline preostale u sistemu. „Baza“ nije naročito ograničena i uključuje, na primer, diizopropilamin. Baza se takođe može koristiti u obliku razblaživanja sa odgovarajućim rastvaračem u koncentraciji od 0,1% (v/v) do 30% (v/v).

[0098] Rastvarač koji se koristi u ovoj fazi nije naročito ograničen sve dok je inertan na reakciju, i uključuje dihlorometan, acetonitril, alkohol (etanol, izopropanol, trifluoroetanol, itd.), vodu i njihovu kompoziciju. Temperatura reakcije je poželjno u opsegu od, npr., 10°C do 50°C, poželjnije u opsegu od 20°C do 40°C, a najpoželjnije u opsegu od 25°C do 35°C.

[0099] Vreme reakcije se može razlikovati u zavisnosti od vrste baze koja se koristi i temperature reakcije, i odgovarajuće je u opsegu od 0,1 minuta do 24 sata generalno, a poželjno u opsegu od 1 minuta do 5 sati.

[0100] U Jedinjenju (II), jedinjenje opšte formule (IIa) u nastavku (u daljem tekstu Jedinjenje (IIa)), u kojem n je 1 i L je grupa (IV), može biti proizvedeno sledećim postupkom.

u kojoj B<P>, T, linker i čvrsti nosač imaju isto značenje kao gore definisano.

Faza 1:

[0101] Jedinjenje predstavljeno opštom formulom (V) u nastavku reaguje sa agensom acilacije radi pripreme jedinjenja predstavljenog opštom formulom (VI) u nastavku (u daljem tekstu Jedinjenje (VI)).

u kojoj B<P>, T i linker imaju isto značenje kao gore definisano; i,

R<4>predstavlja hidroksi, halogen, karboksilnu grupu ili amino.

[0102] Ova faza se može sprovesti poznatim postupcima za uvođenje linkera, upotrebom Jedinjenja (V) kao početnog materijala.

[0103] Određenije, jedinjenje predstavljeno opštom formulom (VIa) u nastavku može se proizvesti sprovođenjem postupka poznatog kao esterifikacija, upotrebom Jedinjenja (V) i sukcinskog anhidrida.

u kojoj B<P>i T imaju isto značenje kao gore definisano.

Faza 2:

[0104] Jedinjenje (VI) reaguje sa čvrstim nosačem pomoću agensa kondenzacije radi pripreme Jedinjenja (IIa).

u kojoj B<P>, R<4>, T, linker i čvrsti nosač imaju isto značenje kao gore definisano.

[0105] Ova faza se može sprovesti upotrebom Jedinjenja (VI) i čvrstog nosača u skladu sa postupkom poznatim kao reakcija kondenzacije.

[0106] U Jedinjenju (II), jedinjenje predstavljeno opštom formulom (IIa2) u nastavku, u kojem n je 2 do 99 i L je grupa predstavljena opštom formulom (IV), može se proizvesti upotrebom Jedinjenja (IIa) kao početnog materijala i ponavljanjem faze A i faze B postupka proizvodnje PMO opisanog u specifikaciji tokom željenog broja puta.

2

u kojoj B<P>, R<2>, R<3>, T, linker i čvrsti nosač imaju isto značenje kao gore definisano; i,

n' predstavlja 1 do 98.

[0107] U Jedinjenju (II), jedinjenje opšte formule (IIb) u nastavku, u kojem n je 1 i L je vodonik, može se proizvesti postupkom opisanim u, npr., WO 1991/009033.

u kojoj B<P>i T imaju isto značenje kao gore definisano.

[0108] U Jedinjenju (II), jedinjenje predstavljeno opštom formulom (IIb2) u nastavku, u kojem n je 2 do 99 i L je vodonik, može se proizvesti upotrebom Jedinjenja (IIb) kao početnog materijala i ponavljanjem faze A i faze B postupka proizvodnje PMO opisanog u specifikaciji tokom željenog broja puta.

u kojoj B<P>, n', R<2>, R<3>i T imaju isto značenje kao gore definisano.

[0109] U Jedinjenju (II), jedinjenje predstavljeno opštom formulom (IIc) u nastavku, u kojem n je 1 i L je acil, može se proizvesti sprovođenjem postupka poznatog kao reakcija acilacije, upotrebom Jedinjenja (IIb).

u kojoj B<P>i T imaju isto značenje kao gore definisano; i,

R<5>predstavlja acil.

[0110] U Jedinjenju (II), jedinjenje predstavljeno opštom formulom (IIc2) u nastavku, u kojem n je 2 do 99 i L je acil, može se proizvesti upotrebom Jedinjenja (IIc) kao početnog materijala i ponavljanjem faze

2

A i faze B postupka proizvodnje PMO opisanog u specifikaciji tokom željenog broja puta.

u kojoj B<P>, n', R<2>, R<3>, R<5>i T imaju isto značenje kao gore definisano.

(2) Faza B

[0111] Jedinjenje (III) reaguje sa jedinjenjem morfolino monomera u prisustvu baze radi pripreme jedinjenja predstavljenog opštom formulom (VII) u nastavku (u daljem tekstu Jedinjenje (VII)):

u kojoj B<P>, L, n, R<2>, R<3>i T imaju isto značenje kao gore definisano.

[0112] Ova faza može se sprovesti reakcijom Jedinjenja (III) sa jedinjenjem morfolino monomera u prisustvu baze.

[0113] Jedinjenje morfolino monomera uključuje, na primer, jedinjenja predstavljena opštom formulom (VIII) u nastavku:

u kojoj B<P>, R<2>, R<3>i T imaju isto značenje kao gore definisano.

2

[0114] „Baza“ koja se može koristiti u ovoj fazi uključuje, na primer, diizopropilamin, trietilamin i N-etilmorfolin. Količina baze koja se koristi je odgovarajuće u opsegu od ekvivalenta 1 mol do ekvivalenata 1000 mol na bazi 1 mol Jedinjenja (III), poželjno, ekvivalenata 10 mol do ekvivalenata 100 mol na bazi 1 mol Jedinjenja (III).

[0115] Jedinjenje morfolino monomera i baza koji se mogu koristiti u ovoj fazi mogu se takođe koristiti kao razblaživanje sa odgovarajućim rastvaračem u koncentraciji od 0,1% do 30%. Rastvarač nije naročito ograničen sve dok je inertan na reakciju, i uključuje, na primer, N,N-dimetilimidazolidon, N-metilpiperidon, DMF, dihlorometan, acetonitril, tetrahidrofuran, ili njihovu kompoziciju.

[0116] Temperatura reakcije je poželjno u opsegu od, npr., 0°C do 100°C, a poželjnije u opsegu od 10°C do 50°C.

[0117] Vreme reakcije može se razlikovati u zavisnosti od vrste baze koja se koristi i temperature reakcije, i odgovarajuće je u opsegu od 1 minuta do 48 sati generalno, a poželjno u opsegu od 30 minuta do 24 sata.

[0118] Dalje, nakon završetka ove faze, agens acilacije se može dodati, po potrebi. „Agens acilacije“ uključuje, na primer, anhidrid sirćetne kiseline, acetil hlorid i anhidrid fenoksisirćetne kiseline. Agens acilacije se takođe može koristiti kao razblaživanje sa odgovarajućim rastvaračem u koncentraciji od 0,1% do 30%. Rastvarač nije naročito ograničen sve dok je inertan na reakciju, i uključuje, na primer, dihlorometan, acetonitril, alkohol(e) (etanol, izopropanol, trifluoroetanol, itd.), vodu, ili njihovu kompoziciju.

[0119] Po potrebi, baza poput piridina, lutidina, kolidina, trietilamina, diizopropiletilamina, N-etilmorfolina, itd. može se takođe koristiti u kombinaciji sa agensom acilacije. Količina agensa acilacije je odgovarajuće u opsegu od ekvivalenta 0,1 mol do ekvivalenata 10000 mol, a poželjno u opsegu od ekvivalenta 1 mol do ekvivalenata 1000 mol. Količina baze je odgovarajuće u opsegu od, npr., ekvivalenta 0,1 mol do ekvivalenata 100 mol, a poželjno u opsegu od ekvivalenta 1 mol do ekvivalenata 10 mol, na bazi 1 mol agensa acilacije.

[0120] Temperatura reakcije u ovoj reakciji je poželjno u opsegu od 10°C do 50°C, poželjnije u opsegu od 10°C do 50°C, mnogo poželjnije u opsegu od 20°C do 40°C, a najpoželjnije u opsegu od 25°C do 35°C. Vreme reakcije se može razlikovati u zavisnosti od vrste agensa acilacije koji se koristi i temperature reakcije, i odgovarajuće je u opsegu od 0,1 minuta do 24 sata generalno, a poželjno u opsegu od 1 minuta do 5 sati.

(3) Faza C:

[0121] U Jedinjenju (VII) proizvedenom u Fazi B, zaštitna grupa je uklonjena upotrebom agensa uklanjanja zaštite radi pripreme jedinjenja predstavljenog opštom formulom (IX).

2

u kojoj Baza, B<P>, L, n, R<2>, R<3>i T imaju isto značenje kao gore definisano.

[0122] Ova faza se može sprovesti reakcijom Jedinjenja (VII) sa agensom uklanjanja zaštite.

[0123] „Agens uklanjanja zaštite“ uključuje, npr., konc. amonijum hidroksida i metilamina. „Agens uklanjanja zaštite“ koji se koristi u ovoj fazi može se takođe koristiti kao razblaživanje sa, npr., vodom, metanolom, etanolom, izopropil alkoholom, acetonitrilom, tetrahidrofuranom, DMF, N,N-dimetilimidazolidonom, N-metilpiperidonom, ili kompozicijom ovih rastvarača. Među njima, poželjan je etanol. Količina agensa uklanjanja zaštite koji se koristi je odgovarajuće u opsegu od ekvivalenta 1 mol do ekvivalenata 100000 mol, a poželjno u opsegu od ekvivalenata 10 mol do ekvivalenata 1000 mol, na bazi 1 mol Jedinjenja (VII).

[0124] Temperatura reakcije je odgovarajuće u opsegu od 15°C do 75°C, poželjno u opsegu od 40°C do 70°C, a poželjnije u opsegu od 50°C do 60°C. Vreme reakcije uklanjanja zaštite može se razlikovati u zavisnosti od vrste Jedinjenja (VII), temperature reakcije, itd., i odgovarajuće je u opsegu od 10 minuta do 30 sati, poželjno 30 minuta do 24 sata, a poželjnije u opsegu od 5 sati do 20 sati.

(4) Faza D:

[0125] PMO (I) se proizvodi reakcijom Jedinjenja (IX) proizvedenog u fazi C sa kiselinom:

u kojoj Baza, n, R<2>, R<3>i T imaju isto značenje kao gore definisano.

[0126] Ova faza se može sprovesti dodavanjem kiseline Jedinjenju (IX).

[0127] „Kiselina“ koja se može koristiti u ovoj fazi uključuje, na primer, trihlorosirćetnu kiselinu, dihlorosirćetnu kiselinu, sirćetnu kiselinu, fosfornu kiselinu, hlorovodoničnu kiselinu, itd. Kiselina koja se koristi se odgovarajuće koristi kako bi se omogućilo rastvoru da ima opseg pH vrednosti od 0,1 do 4,0, a

2

poželjnije opseg pH vrednosti od 1,0 do 3,0. Rastvarač nije naročito ograničen sve dok je inertan na reakciju, i uključuje, na primer, acetonitril, vodu, ili kompoziciju ovih rastvarača.

[0128] Temperatura reakcije je odgovarajuće u opsegu od 10°C do 50°C, poželjno u opsegu od 20°C do 40°C, a poželjnije u opsegu od 25°C do 35°C. Vreme reakcije uklanjanja zaštite može se razlikovati u zavisnosti od vrste Jedinjenja (IX), temperature reakcije, itd., i odgovarajuće je u opsegu od 0,1 minuta do 5 sati, poželjno 1 minuta do 1 sata, a poželjnije u opsegu od 1 minuta do 30 minuta.

[0129] PMO (I) se može dobiti podvrgavanjem reakcione kompozicije dobijene u ovoj fazi konvencionalnim postupcima razdvajanja i prečišćavanja poput ekstrahovanja, koncentrovanja, neutralizacije, filtracije, centrifugalnog razdvajanja, rekristalizacije, hromatografije na koloni reverzne faze C8do C18, hromatografije na koloni izmene katjona, hromatografije na koloni izmene anjona, hromatografije na koloni filtracije gela, tečne hromatografije visokih performansi, dijalize, ultrafiltracije, itd., samostalno ili u kombinaciji navedenog. Stoga, željeni PMO (I) može biti izolovan i prečišćen (up., npr., WO 1991/09033).

[0130] Tokom prečišćavanja PMO (I) upotrebom hromatografije reverzne faze, npr., kompozicija rastvora od 20 mM pufera trietilamina/acetata i acetonitrila može se koristiti kao rastvarač za eluciju.

[0131] Tokom prečišćavanja PMO (I) upotrebom hromatografije izmene jona, npr., kompozicija rastvora od 1 M fiziološkog rastvora i 10 mM vodenog rastvora natrijum hidroksida može se koristiti kao rastvarač za eluciju.

[0132] Gore opisana peptidna nukleinska kiselina je oligomer ovog pronalaska koji ima grupu predstavljenu sledećom opštom formulom kao konstituentna jedinica:

u kojoj Baza ima isto značenje kao gore definisano.

[0133] Peptidne nukleinske kiseline mogu se pripremiti upućivanjem na, npr., sledeću literaturu.

1) P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497 (1991)

2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg, Jacs., 114, 1895 (1992)

3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)

4) L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995)

5) T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)

[0134] U oligomeru ovog pronalaska, 5' kraj može biti bilo koji kraj sledećih hemijskih struktura (1) do (3), a poželjno je (3)-OH.

[0135] U daljem tekstu, grupe prikazane gore sa (1), (2) i (3) se navode kao „Grupa (1)“, „Grupa (2)“ i „Grupa (3)“, respektivno.

2. Farmaceutska kompozicija

[0136] Oligomer ovog pronalaska prouzrokuje preskakanje eksona 44 u genu za distrofin. Stoga se očekuje da se stanja mišićne distrofije mogu ublažiti davanjem farmaceutske kompozicije koja obuhvata oligomer ovog pronalaska pacijentima obolelim od DMD, koji ima ciljnu mutaciju preskakanja eksona 44, odnosno mutaciju koja se konvertuje u unutrašnji okvir preskakanjem Eksona 44. Takođe, postupak proizvodnje oligomera ovog pronalaska, čija dužina lanca je kratka, je jednostavan, a troškovi proizvodnje oligomera ovog pronalaska mogu biti smanjeni.

[0137] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za lečenje mišićne distrofije, koja obuhvata kao aktivan sastojak oligomer ovog pronalaska, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili hidrat (u daljem tekstu „kompozicija ovog pronalaska“)

[0138] Primeri farmaceutski prihvatljive soli oligomera ovog pronalaska sadržane u kompoziciji ovog pronalaska su soli alkalnih metala poput soli natrijuma, kalijuma i litijuma; soli zemnoalkalnih metala poput soli kalcijuma i magnezijuma; soli metala poput soli aluminijuma, gvožđa, cinka, bakra, nikla, kobalta, itd.; soli amonijuma; soli organskih amina poput soli t-oktilamina, dibenzilamina, morfolina, glukozamina, estra fenilglicin alkila, etilendiamina, N-metilglukamina, guanidina, dietilamina, trietilamina, dicikloheksilamina, N, N' -dibenziletilendiamina, hloroprokaina, prokaina, dietanolamina, N-benzilfenetilamina, piperazina, tetrametilamonijuma, tris(hidroksimetil)aminometana; soli vodonik halida poput soli fluorovodonika, hlorovodonika, bromovodonika i jodovodonika; soli neorganskih

1

kiselina poput nitrata, perhlorata, sulfata, fosfata, itd.; sulfonata nižih alkana poput metansulfonata, trifluorometansulfonata i etansulfonata; arilsulfonata poput benzensulfonata i p-toluensulfonata; soli organskih kiselina poput acetata, malata, fumarata, sukcinata, citrata, tartarata, oksalata, maleata, itd.; i soli amino kiselina poput soli glicina, lizina, arginina, ornitina, glutaminske kiseline i asparaginske kiseline. Ove soli se mogu proizvesti poznatim postupcima. Alternativno, oligomer ovog pronalaska sadržan u kompoziciji ovog pronalaska može biti u obliku njegovog hidrata.

[0139] Put davanja kompozicije ovog pronalaska nije naročito ograničen sve dok je u pitanju farmaceutski prihvatljiv put davanja, i može se odabrati u zavisnosti od postupka lečenja. U cilju jednostavne isporuke do tkiva mišića, poželjni su intravensko davanje, intraarterijalno davanje, intramuskularno davanje, subkutano davanje, oralno davanje, davanje u tkivo, transdermalno davanje, itd. Takođe, dozni oblici koji su dostupni za kompoziciju ovog pronalaska nisu naročito ograničeni, i uključuju, na primer, različite injekcije, oralne agense, ukapavanja, inhalacije, masti, losione, itd.

[0140] Tokom davanja oligomera ovog pronalaska pacijentima obolelim od mišićne distrofije, kompozicija ovog pronalaska poželjno sadrži nosač radi pospešivanja isporuke oligomera do tkiva mišića. Takav nosač nije naročito ograničen sve dok je farmaceutski prihvatljiv, i primeri uključuju katjonske nosače poput katjonskih lipozoma, katjonskih polimera, itd., ili nosače koji koriste virusni omotač.

Katjonski lipozomi su, na primer, lipozomi sačinjeni od 2-O-(2-dietilaminoetil)karabamoil-1,3-O-dioloilglicerola i fosfolipida kao esencijalnih konstituenata (u daljem tekstu „lipozom A“), Oligofectamine (registrovani zaštitni znak) (proizvodi Invitrogen Corp.), Lipofectin (registrovani zaštitni znak) (proizvodi Invitrogen Corp.), Lipofectamine (registrovani zaštitni znak) (proizvodi Invitrogen Corp.), Lipofectamine 2000 (registrovani zaštitni znak) (proizvodi Invitrogen Corp.), DMRIE-C (registrovani zaštitni znak) (proizvodi Invitrogen Corp.), GeneSilencer (registrovani zaštitni znak) (proizvodi Gen Therapy Systems), TransMessenger (registrovani zaštitni znak) (proizvodi QIAGEN, Inc.), TransIT TKO (registrovani zaštitni znak) (proizvodi Mirus) i Nucleofector II (Lonza). Između ostalih, poželjan je lipozom A. Primeri katjonskih polimera su JetSI (registrovani zaštitni znak) (proizvodi Qbiogen, Inc.) i Jet-PEI (registrovani zaštitni znak) (polietilenimin, proizvodi Qbiogen, Inc.). Primer nosača koji koriste virusni omotač je GenomeOne (registrovani zaštitni znak) (HVJ-E lipozom, proizvodi Ishihara Sangyo). Alternativno, medicinski uređaji opisani u japanskom patentu br.2924179 i katjonski nosači opisani u Japanese Domestic Re-Publication PCT br.2006/129594 i 2008/096690 takođe se mogu koristiti.

[0141] Koncentracija oligomera ovog pronalaska sadržanog u kompoziciji ovog pronalaska može se razlikovati u zavisnosti od vrste nosača, itd., i odgovarajuće je u opsegu od 0,1 nM do 100 µM, poželjno u opsegu od 1 nM do 10 µM, a poželjnije u opsegu od 10 nM do 1 µM. Odnos mase oligomera ovog pronalaska sadržanog u kompoziciji ovog pronalaska i nosača (nosač/oligomer ovog pronalaska) može se razlikovati u zavisnosti od karakteristike oligomera, tipa nosača, itd., i odgovarajuće je u opsegu od 0,1 do 100, poželjno u opsegu od 1 do 50, a poželjnije u opsegu od 10 do 20.

2

[0142] Pored oligomera ovog pronalaska i gore opisanog nosača, farmaceutski prihvatljivi aditivi se takođe mogu opciono formulisati u kompoziciji ovog pronalaska. Primeri takvih aditiva su sredstva za emulzifikaciju (npr., masne kiseline koje imaju 6 do 22 atoma ugljenika i njihove farmaceutski prihvatljive soli, albumin i dekstran), stabilizatori (npr., holesterol i fosfatidinska kiselina), agensi izotonizacije (npr., natrijum hlorid, glukoza, maltoza, laktoza, saharoza, trehaloza), i agensi kontrolisanja pH vrednosti (npr., hlorovodonična kiselina, sumporna kiselina, fosforna kiselina, sirćetna kiselina, natrijum hidroksid, kalijum hidroksid i trietanolamin). Može se koristiti jedan ili više ovih aditiva. Sadržaj aditiva u kompoziciji ovog pronalaska je odgovarajuće 90 mas.% ili manje, poželjno 70 mas.% ili manje, a poželjnije 50 mas.% ili manje.

[0143] Kompozicija ovog pronalaska može se pripremiti dodavanjem oligomera ovog pronalaska disperziji nosača i adekvatnim mešanjem kompozicije. Aditivi se mogu dodati u odgovarajućoj fazi bilo pre ili nakon dodavanja oligomera ovog pronalaska. Vodeni rastvarač koji se može koristiti u dodavanju oligomera ovog pronalaska nije naročito ograničen sve dok je farmaceutski prihvatljiv, a primeri su injektabilna voda ili injektabilna destilovana voda, elektrolitni fluid poput fiziološkog rastvora, itd., i tečni šećer poput tečne glukoze, tečne maltoze, itd. Stručnjak iz ove oblasti može pravilno odabrati uslove za pH vrednost i temperaturu za takvu materiju.

[0144] Kompozicija ovog pronalaska može se pripremiti u, npr., tečnom obliku i njenom liofilizovanom preparatu. Liofilizovani preparat može se pripremiti liofilizacijom kompozicije ovog pronalaska u tečnom obliku na konvencionalan način. Liofilizacija se može sprovesti, na primer, odgovarajućom sterilizacijom kompozicije ovog pronalaska u tečnom obliku, raspodelom alikvota u ampulu, sprovođenjem preliminarnog zamrzavanja tokom 2 sata u uslovima od oko -40 do -20°C, sprovođenjem primarnog sušenja na oko 0 do 10°C pod smanjenim pritiskom, a zatim sprovođenjem sekundarnog sušenja na oko 15 do 25°C pod smanjenim pritiskom. Generalno, liofilizovani preparat kompozicije ovog pronalaska može se dobiti zamenom sadržaja ampule azotnim gasom i zatvaranjem.

[0145] Liofilizovani preparat kompozicije ovog pronalaska generalno se može koristiti nakon rekonstituisanja dodavanjem opcionog odgovarajućeg rastvora (rekonstituciona tečnost) i ponovnim rastvaranjem preparata. Takva rekonstituciona tečnost uključuje injektabilnu vodu, fiziološki rastvor i druge infuzione tečnosti. Količina rekonstitucione tečnosti može se razlikovati u zavisnosti od predviđene upotrebe, itd., nije naročito ograničena, i poželjno je 0,5 do 2-struko veća od količine pre liofilizacije ili ne iznosi više od 500 mL.

[0146] Poželjno je kontrolisati dozu kompozicije ovog pronalaska koja se daje uzimanjem sledećih faktora u obzir: sadržanog tipa i doznog oblika oligomera ovog pronalaska; stanja pacijenata, uključujući starost, telesnu masu, itd.; puta davanja; i karakteristika i razmera bolesti. Dnevna doza izračunata kao količina antismisaonog oligomera ovog pronalaska je generalno u opsegu od 0,1 mg do 10 g/čovek, a poželjno 1 mg do 1 g/čovek. Ovaj numerički opseg može se povremeno razlikovati u zavisnosti od tipa ciljne bolesti, puta davanja i ciljnog molekula. Stoga, doza manja od opsega može biti dovoljna u nekim slučajevima i obrnuto, doza veća od opsega može povremeno biti neophodna. Kompozicija se može davati od jedanput do više puta dnevno ili u intervalima od jednog dana do nekoliko dana.

[0147] U još jednom načinu ostvarivanja kompozicije ovog opisa, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja obuhvata vektor koji može da ekspresuje oligonukleotid ovog pronalaska i gore opisan nosač. Takav ekspresioni vektor može biti vektor koji može da ekspresuje više oligonukleotida ovog pronalaska. Kompozicija može biti formulisana sa farmaceutski prihvatljivim aditivima kao u slučaju sa kompozicijom ovog pronalaska koja sadrži oligomer ovog pronalaska. Koncentracija ekspresionog vektora sadržanog u kompoziciji može se razlikovati u zavisnosti od tipa nosača, itd., i odgovarajuće je u opsegu od 0,1 nM do 100 µM, poželjno u opsegu od 1 nM do 10 µM, a poželjnije u opsegu od 10 nM do 1 µM. Odnos mase ekspresionog vektora sadržanog u kompoziciji i nosača (nosač/ekspresioni vektor) može se razlikovati u zavisnosti od karakteristike ekspresionog vektora, tipa nosača, itd., i odgovarajuće je u opsegu od 0,1 do 100, poželjno u opsegu od 1 do 50, a poželjnije u opsegu od 10 do 20. Sadržaj nosača sadržanog u kompoziciji je isti kao u slučaju sa kompozicijom ovog pronalaska koja sadrži oligomer ovog pronalaska, a postupak za njegovu proizvodnju je takođe isti kao u slučaju sa kompozicijom ovog pronalaska.

[0148] U daljem tekstu, ovaj pronalazak biće detaljnije opisan uz pozivanje na sledeće PRIMERE i TEST PRIMERE, ali nije predviđen da bude ograničen na njih.

[PRIMERI]

[REFERENTNI PRIMER 1]

4-{[(2S,6R)-6-(4-Benzamido-2-oksopirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il] metoksi}-4-oksobutanska kiselina napunjena na amino polistiren smoli

Faza 1: Proizvodnja 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oksopirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi}-4-oksobutanske kiseline

[0149] U argonskoj atmosferi, 3,44 g od N-{1-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-okso-1,2-dihidropirimidin-4-il}benzamida i 1,1 g od 4-dimetilaminopiridina (4-DMAP) je suspendovano u 50 mL dihlorometana, a 0,90 g sukcinskog anhidrida je dodato u suspenziju, nakon čega je usledilo mešanje na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Reakcionoj kompoziciji je dodato 10 mL metanola, a kompozicija je koncentrovana pod smanjenim pritiskom. Ostatak je ekstrahovan pomoću etil acetata i 0,5 M vodenog rastvora kalijum dihidrogenfosfata. Rezultujući organski sloj je ispran sekvencijalno sa 0,5M vodenog rastvora kalijum dihidrogenfosfata, vodom i slanim rastvorom pomenutim redosledom. Rezultujući

4

organski sloj je osušen na natrijum sulfatu i koncentrovan pod smanjenim pritiskom kako bi se dobilo 4,0 g proizvoda.

Faza 2; Proizvodnja 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oksopirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi}-4-oksobutanske kiseline napunjene na amino polistiren smoli

[0150] Nakon što je 4,0 g od 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oksopirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi}-4-oksobutanske kiseline rastvoreno u 200 mL piridina (dehidrirano), 0,73 g od 4-DMAP i 11,5 g od 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hlorovodonika je dodato u rastvor. Zatim, 25,0 g od amino polistiren smole Primer support 200 amino (proizvodi GE Healthcare Japan Co., Ltd., 17-5214-97) i 8,5 mL trietilamina je dodato u kompoziciju, nakon čega je usledilo mućkanje na sobnoj temperaturi tokom 4 dana. Nakon završetka reakcije, smola je izvučena filtracijom. Rezultujuća smola je isprana sekvencijalno pomoću piridina, metanola i dihlorometana pomenutim redosledom, i osušena pod smanjenim pritiskom. Rezultujućoj smoli je dodato 200 mL tetrahidrofurana (dehidrirano), 15 mL anhidrida sirćetne kiseline i 15 mL 2,6-lutidina, a kompozicija je mućkana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Smola je izvučena filtracijom, isprana sekvencijalno pomoću piridina, metanola i dihlorometana pomenutim redosledom i osušena pod smanjenim pritiskom kako bi se dobilo 26,7 g proizvoda.

[0151] Količina punjenja proizvoda je utvrđena iz molarnog iznosa tritila po g smole merenjem apsorpcije UV zračenja na 409 nm pomoću poznatog postupka. Količina punjenja smole je iznosila 192,2 µmol/g.

Uslovi merenja UV zračenja

[0152] Uređaj: U-2910 (Hitachi, Ltd.)

Rastvarač: metansulfonska kiselina

Talasna dužina: 265 nm

ε vrednost: 45000

[REFERENTNI PRIMER 2]

4-{[(2S, 6R)-6-(5-metil-2,4-dioksopirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il] metoksi}-4-oksobutanska kiselina napunjena na amino polistiren smoli

[0153] Jedinjenje iz naslova je proizvedeno na način sličan REFERENTNOM PRIMERU 1, osim što je 1-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-5-metilpirimidin-2,4 (1H,3H)-dion upotrebljen u ovoj fazi, umesto N-{1-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-okso-1,2-dihidropirimidin-4-il}benzamida upotrebljenog u Fazi 1 REFERENTNOG PRIMERA 1.

[0154] Količina punjenja proizvoda je utvrđena iz molarnog iznosa tritila po g smole merenjem apsorpcije UV zračenja na 409 nm pomoću poznatog postupka. Količina punjenja smole je iznosila 164,0 µmol/g.

[REFERENTNI PRIMER 3]

4-{[(2S, 6R)-6-(6-benzamido purin-9-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi}-4-oksobutanska kiselina napunjena na amino polistiren smoli

[0155] Jedinjenje iz naslova je proizvedeno na način sličan REFERENTNOM PRIMERU 1, osim što je N-{9-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il] purin-6-il}benzamido upotrebljen u ovoj fazi, umesto N-{1-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-okso-1,2-dihidropirimidin-4-il}benzamida upotrebljenog u Fazi 1 REFERENTNOG PRIMERA 1.

[0156] Količina punjenja proizvoda je utvrđena iz molarnog iznosa tritila po g smole merenjem apsorpcije UV zračenja na 409 nm pomoću poznatog postupka. Količina punjenja smole je iznosila 185,7 µmol/g.

[REFERENTNI PRIMER 4]

4-{{(2S, 6R)-6-{6-2-cijanoetoksi}-2-[(2-fenoksiacetil)amino] purin-9-il}-4-tritilmorfolin-2-il}metoksi}-4-oksobutanska kiselina napunjena na amino polistiren smoli

[0157] Jedinjenje iz naslova je proizvedeno na način sličan REFERENTNOM PRIMERU 1, osim što je N-{6-(2-cijanoetoksi)-9-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]purin-2-il} -2-fenoksiacetoamido upotrebljen u ovoj fazi, umesto N-{1-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-okso-1,2-dihidropirimidin-4-i l} benzamida upotrebljenog u Fazi 1 REFERENTNOG PRIMERA 1.

[0158] Količina punjenja proizvoda je utvrđena iz molarnog iznosa tritila po g smole merenjem apsorpcije UV zračenja na 409 nm pomoću poznatog postupka. Količina punjenja smole je iznosila 164,8 µmol/g.

[0159] Prema opisima u PRIMERIMA 1 u nastavku, PMO-ovi prikazani pomoću PMO Br.1-118 u TABELI 1 su sintetizovani. PMO Br.119 i 120 su nabavljeni od Gene Tools, LLC. Sintetizovani PMO je rastvoren u vodi radi ubrizgavanja (proizvodi Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.).

[Tabela 1-1]

[TABELA 1]

4

[PRIMER 1]

[0161] Kao baza na 5'-terminusu, 0,2 g od 4-{[(2S, 6R)-6-(4-benzamid-2-oksopirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi} 4-oksobutanske kiseline podržane na aminopolistiren smoli (Referentni primer 1), 4-{[(2S, 6R)-6-(5-metil-2,4-dioksopirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il] metoksi}-4-oksobutanske kiseline podržane na aminopolistiren smoli (Referentni primer 2), 4-{[(2S, 6R)-6-(6-benzamido purin-9-il)-4-tritilmorfolin-2-il] metoksi}-4-oksobutanske kiseline podržane na aminopolistiren smoli (Referentni primer 3), ili 4-{{(2S, 6R)-6-{6-(2-cijanoetoksi)-2-[(2-fenoksiacetil) amino] purin-9-il}-4-tritilmorfolin-2il}metoksi}-4-oksobutanske kiseline podržane na aminopolistiren smoli (Referentni primer 4) je napunjeno u koloni sa filterom. Zatim, sintetički ciklus prikazan u nastavku je započet upotrebom sintetizatora oligonukleotida (AKTA Oligopilot 10 plus). Željeno jedinjenje morfolino monomera je dodato u svaki ciklus spajanja kako bi se dobila sekvenca baze opisana u Tabeli 1 (pogledati Tabelu 2 u nastavku).

[TABELA 2]

[0162] Upotrebljen rastvor za deblokiranje je bio rastvor dihlorometana koji sadrži 3 mas.% trifluorosirćetne kiseline. Upotrebljen rastvor za neutralizaciju i ispiranje je bio rastvor dobijen rastvaranjem N,N-diizopropiletilamina kako bi bio 10% (v/v) i tetrahidrofurana kako bi bio 5% (v/v) u dihlorometanu koji sadrži 35% (v/v) acetonitrila. Upotrebljen rastvor spajanja A je bio rastvor dobijen rastvaranjem jedinjenja morfolino monomera u tetrahidrofuranu kako bi bio 0,10 M. Upotrebljen rastvor spajanja B je bio rastvor dobijen rastvaranjem N,N- diizopropiletilamina kako bi bio 20% (v/v) i tetrahidrofurana kako bi bio 10% (v/v) u acetonitrilu. Upotrebljen rastvor zatvaranja je bio rastvor dobijen rastvaranjem 20% (v/v) anhidrida sirćetne kiseline i 30% (v/v) 2,6-lutidina u acetonitrilu.

[0163] Aminopolistiren smola na kojoj je napunjen gore sintetizovani PMO je dobijena iz reakcione posude i osušena na sobnoj temperaturi tokom najmanje 2 sata pod smanjenim pritiskom. Osušeni PMO napunjen na aminopolistiren smoli je napunjen u reakcionoj posudi i dodato mu je 5 mL od 28% amonijum hidroksid-etanola (1/4). Kompozicija je mešana na 55°C tokom 15 sati. Aminopolistiren smola je razdvojena filtracijom i isprana sa 1 mL voda-etanola (1/4). Rezultujući filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Rezultujući ostatak je rastvoren u 10 mL kompozicije rastvarača od 20 mM pufera sirćetne kiseline - trietilamina (TEAA pufera) i acetonitrila (4/1) i filtriran kroz filter membrane. Dobijeni filtrat je prečišćen pomoću HPLC reverzne faze. Upotrebljeni uslovi su prikazani u Tabeli 3 u nastavku.

[TABELA 3]

[0164] Svaka frakcija je analizirana, a ciljni proizvod je dobijen i koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Koncentrovanom ostatku je dodato 0,5 mL od 2 M vodenog rastvora fosforne kiseline, a kompozicija je mešana tokom 15 minuta. Dalje, 2 mL od 2 M vodenog rastvora natrijum hidroksida je dodato kako bi kompozicija postala alkalna, nakon čega je usledila filtracija kroz filter membrane (0,45 µm).

[0165] Rezultujući vodeni rastvor koji sadrži ciljni proizvod je prečišćen kolonom anjonoizmenjivačke smole. Upotrebljeni uslovi su prikazani u Tabeli 4 u nastavku.

[TABELA 4]

[0166] Svaka frakcija je analizirana (na HPLC) i ciljni proizvod je dobijen kao vodeni rastvor.

Rezultujućem vodenom rastvoru dodato je 0,1 M fosfatnog pufera (pH 6,0) za neutralizaciju. Zatim, iz

4

dobijene kompozicije je odstranjena so pomoću HPLC reverzne faze pod uslovima opisanim u Tabeli 5 u nastavku.

[TABELA 5]

[0167] Ciljni proizvod je dobijen i kompozicija je koncentrovana pod smanjenim pritiskom. Rezultujući ostatak je rastvoren u vodi. Dobijeni vodeni rastvor je osušen zamrzavanjem kako bi se dobilo ciljno jedinjenje kao bela čvrsta materija poput pamuka.

[0168] Izračunate vrednosti i utvrđene vrednosti ESI-TOF-MS su predstavljene u Tabeli 6 u nastavku.

[Tabela 6-1]

[0169]

[TABELA 6]

4

4

4

4

[TEST PRIMER 1]

In vitro analiza

[0170] Pomoću Amaxa Cell Line Nucleofector kompleta L na Nucleofector II (Lonza), 0,1 do 30 µM antismisaonih oligomera u Tabeli 1 je transfektovano pomoću 3,5x 10<5>od RD ćelija (ćelijska linija ljudskog rabdomiosarkoma). Upotrebljen je Program T-030.

[0171] Nakon transfekcije, ćelije su kultivisane tokom tri noći u 2 mL Eagle-ovog minimalnog esencijalnog medijuma (EMEM) (proizvodi Sigma, u daljem tekstu isto) koji sadrži 10% fetalnog telećeg seruma (FCS) (proizvodi Invitrogen) pod uslovima od 37°C i 5% CO2.

[0172] Ćelije su isprane jedanput pomoću PBS (proizvodi Nissui, u daljem tekstu isto) i 350 µl od Buffer RLT (proizvodi Qiagen) koji sadrži 1% 2-merkaptoetanola (proizvodi Nacalai Tesque) je dodato ćelijama. Nakon što su ćelije ostavljene da odstoje na sobnoj temperaturi tokom nekoliko minuta radi liziranja, lizat je sakupljen u QIAshredder homogenizatoru (proizvodi Qiagen). Zatim je lizat centrifugiran na 15.000 rpm (obrtaja u minutu) tokom 2 minuta radi pripreme homogenata. Ukupna RNK je ekstrahovana prema protokolu priloženom uz RNeasy Mini komplet (proizvodi Qiagen). Koncentracija ukupne ekstrahovane RNK je utvrđena pomoću NanoDrop ND-1000 (proizvodi LMS).

[0173] One-Step RT-PCR je sprovedena pomoću 400 ng ukupne ekstrahovane RNK upotrebom QIAGEN OneStep RT-PCR kompleta (proizvodi Qiagen). Reakcioni rastvor je pripremljen u skladu sa protokolom priloženim uz komplet. PTC-100 (proizvodi MJ Research) ili TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch (proizvodi Takara Bio) je upotrebljen kao DNK pojačivač. Upotrebljeni RT-PCR program je sledeći.

[0174] 50°C, 30 minuta: reakcija reverzne transkripcije

95°C, 15 minuta: aktivacija polimeraze, inaktivacija reverzne transkriptaze, toplotna denaturacija cDNK [94°C, 30 sekundi; 60°C, 30 sekundi; 72 °C, 1 min] x 35 ciklusa: PCR amplifikacija

72°C, 10 minuta: finalno izduživanje

4

[0175] Sekvence baze direktnog prajmera i reverznog prajmera upotrebljene za RT-PCR su prikazane u nastavku.

Direktni prajmer : 5'- GCTCAGGTCGGATTGACATT -3' (SEQ ID NO: 125)

Reverzni prajmer : 5'- GGGCAACTCTTCCACCAGTA -3' (SEQ ID NO: 126)

[0176] Proizvod reakcije, 1 µL od PCR iznad je analiziran pomoću Bioanalyzer (proizvodi Agilent Technologies, Inc.).

[0177] Izmereni su nivo polinukleotida „A“ trake sa preskakanjem eksona 44 i nivo polinukleotida „B“ trake bez preskakanja eksona 44. Na osnovu ovih vrednosti merenja „A“ i „B“, efikasnost preskakanja je utvrđena sledećom jednačinom:

Eksperimentalni rezultati

[0178] Rezultati su prikazani na FIG.1 do 26. Ovaj eksperiment je otkrio da oligomer ovog pronalaska dobijen povezivanjem kratkih jedinica oligomera odabranih od 1. do 44. baze (SEQ ID NO: 1) i 58. do 115. baze (SEQ ID NO: 2), respektivno, od 5' kraja nukleotidne sekvence eksona 44 (SEQ ID NO: 10) u divljem tipu ljudskog gena za distrofin efektivno prouzrokuje preskakanje eksona 44.

[TEST PRIMER 2]

In vitro analiza

[0179] Eksperiment je sproveden kao u TEST PRIMERU 1, osim što je 3,5x 10<5>od RD ćelija (ćelijska linija ljudskog rabdomiosarkoma) transfektovano pomoću oligomera ovog pronalaska od PMO Br.34, 100, 45, 73, 49 i 47, pri čemu je svaki samostalan ili u obliku u kojem su dve jedinice oligomera koji čine svaki oligomer sadržane same ili u kompoziciji, u koncentraciji od 1, 3 ili 10 µM, upotrebom Amaxa Cell Line Nucleofector kompleta L na Nucleofector II (Lonza). Upotrebljen je Program T-030. Kombinacije sekvenci za transfekciju su sledeće.

[TABELA 7]

Eksperimentalni rezultati

[0180] Rezultati su prikazani na FIG.27 do 31. Ovaj eksperiment je otkrio da nijedan od PMO Br.110 do 115, PMO Br.117 i PMO Br.118 koji ciljaju mesto u eksonu 44 ne može sam prouzrokovati preskakanje eksona 44. Ovaj eksperiment je takođe otkrio da, u poređenju sa kompozicijama dve antismisaone nukleinske kiseline koje ciljaju različita mesta u eksonu 44 (kompozicija PMO Br.114 i PMO Br.115; kompozicija PMO Br.109 i PMO Br.114; kompozicija PMO Br.110 i PMO Br.111; kompozicija PMO Br.

112 i PMO Br.113; kompozicija PMO Br.117 i PMO Br.118; i kompozicija PMO Br.119 i PMO Br.120), oligomeri ovog pronalaska od PMO Br.34, PMO Br.100, PMO Br.45, PMO Br.73, PMO Br.49 i PMO Br.

47, gde su sve jedinice oligomera međusobno povezane, prouzrokuju preskakanje eksona 44 sa visokom efikasnošću.

[TEST PRIMER 3]

In vitro analiza upotrebom ljudskih fibroblastova

1

[0181] Aktivnost preskakanja eksona 44 je utvrđena pomoću GM05112 ćelija (ljudski fibroblastovi izvedeni od pacijenata obolelih od DMD sa brisanjem eksona 45, Coriell Institute for Medical Research). Kao medijum rasta, upotrebljen je Dulbeko modifikovani Eagle medijum: hranljiva kompozicija F-12 (DMEM/F-12) (Life Technologies) koja sadrži 10% FCS (HyClone Laboratories, Inc.) i 1% penicilina/streptomicina (P/S) (Sigma-Aldrich, Inc.), a ćelije su kultivisane pod uslovima od 37°C i 5% CO2.

[0182] Ćelije su kultivisane u T225 flasku i 2,5 mL retrovirusa (ZsGreen1 koekspresija) koji ekspresuje myoD izveden od ljudi (SEQ ID NO: 127), a krajnja koncentracija od 8 pg/mL polibrena (Sigma-Aldrich, Inc.) je dodata u 30 mL medijuma rasta. Nakon inkubiranja na 32°C tokom 2 dana, medijum je izmenjen u sveži medijum rasta i inkubiranje je nastavljeno na 37°C tokom 3 dana. ZsGreen1-pozitivni MyoD-transformisani fibroblastovi su sakupljeni pomoću BD FACSAria ćelijskog sortera (BD Bioscience).

Sakupljene ćelije su suspendovane u medijumu za diferencijaciju (DMEM/F-12 koji sadrži 2% konjskog seruma (LifeTechnologies), 1% P/S i ITS suplementa tečnog medijuma (Sigma-Aldrich, Inc.)) i zasejane na 9,4 x 10<4>ćelija/bazenčić u kolagenom obloženu ploču od 24 bazenčića. Medijum je izmenjivan svaka 2 do 3 dana i inkubiranje je nastavljeno radi diferencijacije u miocevima.

[0183] Sedmog dana nakon zasađivanja na ploči od 24 bazenčića, medijum je zamenjen medijumom za diferencijaciju, a 10 µM oligomera PMO Br.34, 45, 49 i 73 mu je dodato u krajnjoj koncentraciji. Nakon što su ćelije inkubirane tokom 2 dana, medijum je zamenjen medijumom za diferencijaciju bez PMO, a ćelije su inkubirane još pet dana. Zatim su ćelije sakupljene za ekstrahovanje ukupne RNK upotrebom RNeasy Mini kompleta (QIAGEN). RT-PCR je sprovedena sa 50 ng ekstrahovane ukupne RNK pomoću QIAGEN OneStep RT-PCR kompleta. Reakcioni rastvor je pripremljen u skladu sa protokolom priloženim uz komplet. iCycler (proizvodi Bio-Rad Laboratories) je upotrebljen kao DNK pojačivač. Upotrebljeni RT-PCR program je sledeći.

[0184] 50°C, 30 minuta: reakcija reverzne transkripcije

95°C, 15 minuta: aktivacija polimeraze, inaktivacija reverzne transkriptaze, toplotna denaturacija cDNK [94°C, 1 min; 60°C, 1 min; 72 °C, 1 min] x 35 ciklusa: PCR amplifikacija

72°C, 7 minuta: finalno izduživanje

[0185] Sekvence baze direktnog prajmera i reverznog prajmera upotrebljene za RT-PCR su date u nastavku.

Direktni prajmer : 5'- GCTCAGGTCGGATTGACATT -3' (SEQ ID NO: 125)

Reverzni prajmer : 5'- GGGCAACTCTTCCACCAGTA -3' (SEQ ID NO: 126)

[0186] 1 µL od PCR proizvoda je analiziran pomoću Experion kompleta za DNK 1K analizu (Bio-Rad Laboratories) upotrebom Experion stanice za elektroforezu (Bio-Rad Laboratories). DNK 1K analiza je odabrana na Experion softveru verzija 3.2 (Bio-Rad Laboratories) i izmerena. Utvrđeni su nivo (A) trake

2

oko 317 bp i nivo (B) trake oko 465 bp (jedinica: nmol/L). Efikasnost preskakanja (%) je utvrđena sledećom jednačinom pomoću Excel 2007 SP3 (Microsoft).

Eksperimentalni rezultati

[0187] Rezultati su prikazani na FIG.32. Ovaj eksperiment je otkrio da antismisaoni oligomeri ovog pronalaska PMO Br.34, 45, 49 i 73 mogu prouzrokovati preskakanje eksona 44 sa visokom efikasnošću u ćelijama pacijenta obolelog od DMD sa brisanjem eksona 45.

INDUSTRIJSKA PRIMENLJIVOST

[0188] Eksperimentalni rezultati u TEST PRIMERIMA pokazuju da su oligomeri ovog pronalaska u kojima su kratki oligomeri povezani prouzrokovali preskakanje eksona 44 u RD ćelijama. Stoga, oligomeri ovog pronalaska su izuzetno korisni za lečenje DMD.

Besplatan tekst liste sekvenci

4

1

2

4

1

2

4

1

�

Claims (12)

1. Patentni zahtevi 1. Antismisaoni oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO 6 do 9, i indukuje preskakanje eksona 44 u ljudskom genu za distrofin, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.
2. 2. Antismisaoni oligomer prema zahtevu 1, koji je oligonukleotid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.
3. 3. Antismisaoni oligomer prema zahtevu 2, pri čemu je grupa šećera i/ili fosfat-vezujući region najmanje jednog nukleotida koji čini oligonukleotid modifikovan, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.
4. 4. Antismisaoni oligomer prema zahtevu 2 ili 3, pri čemu grupa šećera najmanje jednog nukleotida koji čini oligonukleotid predstavlja ribozu u kojoj je 2'-OH grupa zamenjena bilo kojim odabranim iz grupe koju čine OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br i I (u kojima R je alkil ili aril, a R' je alkilen), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.
5. 5. Antismisaoni oligomer prema bilo kom od zahteva 2 do 4, pri čemu je fosfat-vezujući region najmanje jednog nukleotida koji čini oligonukleotid bilo koji odabran iz grupe koju čine fosforotioatna veza, fosforoditioatna veza, alkilfosfonatna veza, fosforamidatna veza i boranofosfatna veza, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.
6. 6. Antismisaoni oligomer prema zahtevu 1 ili 2, koji je morfolino oligomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.
7. 7. Antismisaoni oligomer prema zahtevu 6, koji je fosforoamidat morfolino oligomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.
8. 8. Antismisaoni oligomer prema zahtevu 6 ili 7, gde 5' kraj predstavlja bilo koji kraj sledećih hemijskih formula (1) do (3), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat:
9. 9. Farmaceutska kompozicija za lečenje mišićne distrofije, koja obuhvata kao aktivni sastojak antismisaoni oligomer prema bilo kom od zahteva 1 do 8, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili hidrat.
10. 10. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 9, koja dalje obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač.
11. 11. Antismisaoni oligomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema bilo kom od zahteva 1 do 8 za upotrebu u lečenju mišićne distrofije.
12. 12. Antismisaoni oligomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat za upotrebu prema zahtevu 11, pri čemu pacijent oboleo od mišićne distrofije u navedenom lečenju ima mutaciju(e) koja(e) mora(ju) biti ciljana(e) za preskakanje eksona 44 u genu za distrofin.