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JP2013529070A - Ｔｒａｉｌｒ２特異的多量体足場 - Google Patents

Ｔｒａｉｌｒ２特異的多量体足場 Download PDF

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Abstract

本発明は、アポトーシスに関与する細胞膜受容体であるＴＲＡＩＬ受容体２（ＴＲＡＩＬ Ｒ２）に特異的に結合するテネイシン３ ＦｎＩＩＩドメインベースの多量体足場を提供する。本発明は、標的に対する増加した親和性、増加した安定性、および低減した免疫原性を有する操作された変異体をさらに提供する。さらに、本発明は、予防、診断、または治療薬としての操作された多価足場、およびＴＲＡＩＬ Ｒ２を発現している細胞により引き起こされる疾患に対するそれらの使用、特に、癌に対する治療用途への使用に関する。
【選択図】なし

Description

発明の背景
配列表の参照
本願には、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより、「２９４３．０１１ＰＣ０２＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」の名称で２０１１年４月１２日に作成された２１１キロバイトのサイズのテキストファイルとして本願と一緒に提出された配列表が、参照により組み込まれる。
発明の分野
本発明は、概括的には抗体模倣薬の分野に関し、具体的には、例えば新規の結合特性を有する産物の生成に有用な、フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ドメインに基づく多量体足場の分野に関する。特に、本発明は、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインに由来するＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場、ならびにＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体検出のためおよび癌や他の障害の治療等のＴＲＡＩＬ Ｒ２媒介機能の調節のための、それらの足場の使用に関する。
目的の標的エピトープに特異的結合可能な生体分子は、治療、研究、および医用診断ツールとして非常に重要である。このクラスの分子のよく知られた例は、抗体である。ほとんど全ての構造的エピトープに対し、特異的、かつ親和性を有する結合をする抗体を選択可能である。しかし、古典的な抗体は、構造的に複雑なヘテロテトラマー分子であり、単純な真核系で発現させるのは困難である。結果として、ほとんどの抗体は、複雑で高価な哺乳動物細胞発現系を使って産生される。
比較的確定した３次元構造を有し、通常、タンパク質足場と呼ばれるタンパク質は、操作産物の設計のための試薬として使用可能である。このような足場が有用な１つの特定の領域は、抗体模倣薬の設計の分野である。抗体模倣薬、すなわち、小さい、非抗体タンパク質治療薬は、抗体および抗体断片の利点、例えば、標的への高親和性結合ならびに低免疫原性および毒性を利用するが、いくつかの不十分な点、例えば、抗体断片が凝集し完全長ＩｇＧに比べて安定性が低い傾向、を回避する。
これらの欠点は、抗体本来の折り畳みの一部分の除去により作られる抗体断片を使って対処可能である。しかし、これは、通常は、疎水性の環境、例えば、可変および定常ドメインの間の境界に埋もれているアミノ酸残基が溶媒に曝される場合に、凝集する原因になることが多い。足場に基づく抗体模倣薬の一例は、哺乳類血液および構造タンパク質、等において動物門およびタンパク質クラスにわたって広く認められるドメインであるフィブロネクチンのタイプＩＩＩ（ＦｎＩＩＩ）モジュールの構造に基づくものである。
ＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド、文献ではＡｐｏ２ＬおよびＴＮＦＳＦ１０とも呼ばれる）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属し、腫瘍細胞中のプログラム細胞死、またはアポトーシスの活性化因子として同定されている。膜結合型および可溶両型のＴＲＡＩＬは双方とも、標的細胞上のＴＲＡＩＬ受容体との相互作用を介してアポトーシスを誘発することができる。ヒトでは、５つの受容体がＴＲＡＩＬに対する結合活性を有するとして特定されている。ＴＲＡＩＬがＴＲＡＩＬ Ｒ１またはＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合すると、カスパーゼ関連細胞死が誘発される。この細胞死活性を踏まえて、ＴＲＡＩＬに基づく治療手法が探究されている。ＴＲＡＩＬまたはＴＲＡＩＬ Ｒ１またはＲ２ヒトアゴニスト抗体に基づくいくつかの治療手法が開発されているが、しかし、ＴＲＡＩＬは、寿命が非常に短く、デコイ受容体に結合し、さらに、抗体の大きなサイズによりそれらの腫瘍浸透が制限される可能性がある。従って、ＴＲＡＩＬ受容体に結合できる新規分子、これらの分子を含む薬学的組成物、このような分子の選別方法、および多種多様な癌の治療でのこのような分子の使用方法に対するニーズがある。
本明細書における文献の参照と考察は、それらが本発明に対する先行技術であることを認めるものと解釈されるべきではない。
本発明は、２つのＴｎ３単量体足場を含むＴＲＡＩＬＲ２特異的組換え型多量体足場を提供し、ここで（ａ）各Ｔｎ３単量体足場は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ、と命名される７つのベータ鎖、およびＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧと命名されるループ領域とを含み、（ｂ）Ｔｎ３単量体足場は、タンデムに連結され、かつ（ｃ）この組換え型多量体足場は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２に特異的に結合する。一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場は、３、４、５、６、７、または８つのＴｎ３単量体足場を含む。一部の他の実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場中の全てのＴｎ３単量体足場は、タンデム配列である。
一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場の少なくとも１つのＴｎ３単量体足場が、直接、リンカーにより、または異種の成分により、１、２、３、４、５、６、または７つの他のＴｎ３単量体足場に連結されている。ある特定の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場の少なくとも２つのＴｎ３単量体足場が、Ｔｎ３単量体足場の間に挟まれたリンカー無しに直接連結されている。一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場の少なくとも２つのＴｎ３単量体足場が、リンカーにより連結されている。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーを含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、柔軟性ペプチドリンカーである。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｙ配列を含み、ｘおよびｙは整数であって、ｘ＝１、２、３または４であり、ｙ＝１、２、３、４、５、６、または７である。
一部の実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場のＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する結合は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３単量体足場よりも改善されている。一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場のＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する結合は、ＴＲＡＩＬＲ２特異的Ｔｎ３単量体足場に比較して、標的に対する作用を改善する。
一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３単量体足場の結合に比較した本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的足場のＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する結合の改善は、結合親和性の改善および／または結合アビディティの改善である。他の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する結合親和性およびタンパク質安定性が、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３単量体足場のそれらよりも改善されている。一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する結合アビディティ、およびタンパク質安定性が、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３単量体足場のそれらよりも改善されている。
一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場は、官能性成分（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｏｉｅｔｙ）を含むリンカーを含む。一部の実施形態では、官能性成分は、免疫グロブリンまたはその断片である。特定の実施形態では、免疫グロブリンまたはその断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、直鎖抗体、完全長抗体、Ｆｃ領域、および前記成分の２つ以上の組み合わせ、からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、免疫グロブリンまたはその断片は、ＩｇＧのＦｃドメインおよびヒンジ部を含む。他の実施形態では、免疫グロブリンまたはその断片は、ＣＨ１ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンまたはその断片は、ＩｇＧのＣカッパドメインまたはＣラムダドメインを含む。
一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場の少なくとも１つのＴｎ３単量体足場は、異種の成分に融合されている。一部の実施形態では、異種の成分は、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、薬剤、毒素、細胞傷害性薬物、造影剤、放射性核種、放射性化合物、有機ポリマー、無機ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ビオチン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＨＳＡ ＦｃＲｎ結合部分、抗体、抗体のドメイン、抗体断片、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩ足場、エピトープタグ、組換え型ポリペプチドポリマー、サイトカイン、および前記成分の２つ以上の組み合わせ、からなる群より選択される組成物を含む。
一部の特定的な実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場は、ＰＥＧにコンジュゲートされている。他の実施形態では、３つ以上のＴｎ３単量体足場がリンカーにより連結され、少なくとも１つのリンカーが他のリンカーとは構造的におよび／または機能的に異なる。
一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場中のＴｎ３単量体足場は、分岐形式で連結されている。他の実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場中の一部のＴｎ３単量体足場は、直鎖タンデム形式で連結され、一部のＴｎ３単量体足場は、分岐形式で連結されている。一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場中の少なくとも２つのＴｎ３単量体足場は、同一である。他の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場中の少なくとも２つのＴｎ３単量体足場は、異なっている。
一部の実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場は、少なくとも１つの追加の標的に結合し、それはＴ細胞抗原であってもよい。一部の実施形態では、このＴ細胞抗原はＣＤ４０Ｌである。
一部の実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場は受容体アゴニストである。一部の実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場中の少なくとも２つのＴｎ３単量体足場は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２上の同じエピトープに結合する。他の実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場中の少なくとも２つのＴｎ３単量体足場は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２上の異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、異なるＴＲＡＩＬ Ｒ２エピトープは、非重複エピトープである。他の実施形態では、異なるＴＲＡＩＬ Ｒ２エピトープは、重複エピトープである。
一部の実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場中の少なくとも２つのＴｎ３単量体足場のベータ鎖は、配列番号１のベータ鎖に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場中の少なくとも２つのＴｎ３単量体足場は、アミノ酸配列：ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＣＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＸ２Ｌ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＥＶＳＬＩＣ（ＸＦＧ）ｎＫＸ３ＴＦＴＴ、を含み、ここでＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧはＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループ中に存在するアミノ酸残基をそれぞれ表し、Ｘ１はアミノ酸残基ＡまたはＴを表し、Ｘ２はアミノ酸残基ＤまたはＧを表し、Ｘ３はアミノ酸ＥまたはＧを表し、さらにループの長さｎは２〜２６の整数である。一部の実施形態では、ＡＢループは配列番号３５を含み、ＣＤループは配列番号３７を含み、さらにＥＦループは配列番号３９を含む。一部の実施形態では、ＢＣループは配列番号９７、９８、または１６８からなる群より選択される配列を含む。一部の実施形態では、ＤＥループは、配列番号１０２、１０３、および１７９からなる群より選択される配列を含む。一部の実施形態では、ＦＧループは、配列番号１０６、１０８、１０９、１６９および１７０からなる群より選択される配列を含む。一部の実施形態では、ＢＣループは配列番号９７を含み、ＤＥループは配列番号１７９を含み、さらにＦＧループは配列番号１７０を含む。一部の実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場は配列番号２０９または２０４を含む。
一部の実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場は、１μＭ以下の親和性（Ｋｄ）でＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体に結合する。別の実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場は、５００ｎＭ以下の親和性（Ｋｄ）でＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体に結合する。さらに別の実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場は、１００ｎＭ以下の親和性（Ｋｄ）でＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体に結合する。
本発明は、また、上述のいずれかの多量体足場をコードする単離核酸分子を提供する。一部の実施形態では、発現ベクターが当該核酸を含む。他の実施形態では、宿主細胞が、当該ベクターを含み得る。
本発明は、また、核酸分子にコードされた多量体足場が発現する条件下で宿主細胞を培養することを含む、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場を製造する方法を提供する。本発明は、また、薬学的に許容可能な賦形剤中に本発明の組換え型ＴＲＡＩＬＲ２特異的多量体足場を含む組成物を提供する。本発明は、また、本発明の特異的多量体足場を含む組成物の有効量を投与することにより、癌の予防、治療、改善、または管理を、それを必要とする患者において行う方法を提供する。一部の実施形態では、癌は、肺癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、および多発性骨髄腫、から選択される。
本発明は、また、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場を含む組成物を用いて、患者の疾患を診断または画像化する方法を提供する。また、ＴＲＡＩＬ Ｒ２を発現している細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、該細胞を本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場と接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態では、癌の予防、治療、改善、または管理をそれを必要とする患者において行う方法は、追加の治療をさらに含み、その療法が、免疫療法、生物学的療法、化学療法、放射線療法、または小分子薬物療法である。
一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場は、ヒトＴＲＡＩＬ Ｒ２に特異的に結合する。一部の特定的な実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合し、（ａ）ＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体を作動させるか、（ｂ）ＴＲＡＩＬのＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体に対する結合を模倣するか、（ｃ）ＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体の二量体化もしくはオリゴマー化を促進するか、（ｄ）アポトーシスを誘導するか、（ｅ）細胞生存率を低下させるか、もしくは阻害するか、または（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の活性の組み合わせを示す。
他の実施形態では、本発明は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２発現細胞中の活性を変える方法を提供し、この方法は、細胞を請求項１〜４７のいずれか１項に記載のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場を接触させることを含み、多量体足場は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合し、（ａ）ＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体を作動させるか、（ｂ）ＴＲＡＩＬのＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体に対する結合を模倣するか、（ｃ）ＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体の二量体化もしくはオリゴマー化を促進するか、（ｄ）アポトーシスを誘導するか、（ｅ）細胞生存率を低下させるか、もしくは阻害するか、または（ｆ）活性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の組み合わせを示す。
一部の実施形態では、ＰＥＧが、Ｎ末端またはＣ末端で、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場にコンジュゲートされている。
本発明の説明のために、本発明のある特定の実施形態を図によって示す。しかし、本発明は、図に示した実施形態の厳密な配置および手段に限定されるものではない。
直鎖、抗体様および融合体形式の多価性のＴｎ３足場を示す。多価性のＴｎ３足場は、黒色八角形ブロックで示されたスペーサーで連結された２つ以上のＴｎ３モジュールを含み、ここで、スペーサーは、例えば、リンカーであってもよい。 Ａ２〜Ａ９として命名されるＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多価性のＴｎ３足場を示す。これらは、図１に示す２から８まで変動する結合価（Ｔｎ３モジュールの数）を有する３種の異なる分子形式に従って得られた。 大腸菌中で発現され、１から８まで変動する結合価を有する、Ａ１〜Ａ５と命名される直鎖タンデム構築物に対応する未精製細菌培地（右のゲル）およびアフィニティー精製した検体（左のゲル）の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。 ＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する一価（Ａ１）および多価性（Ａ２、Ａ３）のＴｎ３足場の競合ＥＬＩＳＡ法で測定した結合を示す。 ＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合しない同種（ｃｏｇｎａｔｅ）の対照足場（Ｂ９）と比較した、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多価性足場Ａ９のＨ２１２２細胞への結合のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。 多価性の足場による、ＴＲＡＩＬ Ｒ２発現細胞株Ｈ２１２２の特異的殺滅に与える結合価の効果を示す。 ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多価性足場によるＨ２１２２腫瘍細胞殺滅の特異性を示す。 ４つのＴｎ３モジュールを含むＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多価性足場によるＨ２１２２細胞の殺滅に与える、分子形式の効果を示す。 ８つのＴｎ３モジュールを含むＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多価性足場によるＨ２１２２細胞の殺滅に与える、分子形式の効果を示す。 直鎖状に融合した４価（Ａ３）および８価（Ａ５）ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３足場による、ＴＲＡＩＬ Ｒ２を発現している結腸直腸腺癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５細胞の特異的殺滅を示す。 直鎖状に融合した４価（Ａ３）および８価（Ａ５）ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３足場による、ＴＲＡＩＬ Ｒ２を発現している白血病株Ｊｕｒｋａｔ細胞の特異的殺滅を示す。 マウスＣＤ４０Ｌ特異的タンデム二価Ｔｎ３足場（Ｍ１３構築物）の構造を示す。 精製一価Ｍ１３構築物（ＣＤ４０Ｌ特異的Ｔｎ３構築物）、または２つのＭ１３モジュールを連結した１、３、５または７つのＧｌｙ４Ｓｅｒユニット（ＧＳと表示）を含むリンカーを有するタンデム二価足場のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。一価Ｍ１３構築物をレーン２で、構築物Ｃ１をレーン３と７で、構築物Ｃ２をレーン４と８で、構築物Ｃ３をレーン５と９で、および構築物Ｃ４をレーン６と１０で実施した。検体を非還元条件（レーン２〜６）または還元条件（レーン７〜１０）のいずれかで試験した。 ＭｕＣＤ４０Ｌ特異的一価（Ｍ１３）または二価タンデム足場による、バイオセンサーチップ上に固定されたマウスＣＤ４０受容体に対するＭｕＣＤ４０Ｌ結合の競合的阻害を示す。種々の構築物に対する５０％最大阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。 Ｂ細胞上のＭｕＣＤ４０Ｌ誘導性ＣＤ８６発現に与えるＭｕＣＤ４０Ｌ特異的一価（Ｍ１３）Ｔｎ３、二価タンデム足場、または抗体ＭＲ１（抗ＭｕＣＤ４０Ｌ抗体）の阻害効果を示す。 細菌培地のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した、組換えにより大腸菌中で発現させた可溶性一価およびＴＲＡＩＬ Ｒ２／ＣＤ４０Ｌ二重特異性タンデム二価Ｔｎ３足場構築物の発現レベルを示す。一価足場であるＡ１と７９をレーン２と３にそれぞれ示す。長さが次第に増えるＧｌｙ４Ｓｅｒアミノ酸リンカーによりタンデムに連結されたＡ１と７９を含むタンデム足場構築物（構築物Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７およびＣ８に同種）を、レーン４〜７に示す。発現構築物は、染色したゲル上にアスタリスクで示す。 捕捉ＥＬＩＳＡ法を使ってアッセイした二重特異性Ｔｎ３足場のＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する結合を示す。 捕捉ＥＬＩＳＡ法を使ってアッセイした二重特異性Ｔｎ３足場のヒトＣＤ４０Ｌに対する結合を示す。 ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイ法を使ってアッセイした二重特異性タンデムＴｎ３足場Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、およびＣ８のＴＲＡＩＬ Ｒ２およびＣＤ４０Ｌに対する同時結合を示す。 グアニジン−ＨＣｌの存在下のＴｎ３足場の安定性を示す。各被験足場のＣｍ（中点値）を示す。 より長いＦＧループを有する親のＴｎ３足場と比較した、異なるループ配列であるが同じ長さのＦＧループ（９つのアミノ酸）の３つの異なるＴｎ３足場の、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）で分析した熱安定性を示す。 親（ＷＴ）Ｔｎ３足場と比較した、９アミノ酸長のＦＧループを有するＴｎ３足場（Ｐ１Ｃ０１、Ａ６、および７１）のグアニジン−ＨＣｌの存在下の安定性の増加を示す。 図１６Ａは、三重特異性／三価Ｔｎ３足場の模式図および発現を示す。Ｄ１−１Ｅ１１−７９足場は、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）結合ドメイン（Ｄ１）、続いてＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃ結合ドメイン（１Ｅ１１）、およびヒトＣＤ４０Ｌ（７９）に特異的なＣ末端Ｔｎ３ドメインを含む。柔軟性（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーが各ドメインを隔てている。図１６Ｂは、発現させ、精製したＤ１−１Ｅ１１−７９足場のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ビストリス）ゲルを示す。この構築物の予測される分子量は、約３４，０８１ダルトンである。 ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ結合分析を用いた、三重特異性／三価Ｔｎ３足場Ｄ１−１Ｅ１１−７９のｈｕＣＤ４０ＬおよびＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃへの同時結合を示す。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎシグナル（ＡＳＳ）は、ＴｒａｉｌＲ２−Ｆｃ濃度の関数として示される。 ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ結合分析を用いた、三重特異性／三価Ｔｎ３足場Ｄ１−１Ｅ１１−７９のｈｕＣＤ４０ＬおよびＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）への同時結合を示す。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎシグナル（ＡＳＳ）は、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）濃度の関数として示される。 ＥＬＩＳＡを用いた、三重特異性／三価Ｔｎ３足場Ｄ１−１Ｅ１１−７９のＴＲＡＩＬ Ｒ２−ＦｃおよびＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）への同時結合を示す。 親ＴＲＡＩＬ Ｒ２結合クローン１Ｃ１２および親和性成熟誘導体の配列アラインメントを示す。操作したジスルフィド結合の位置は、強調表示しており、矢印は１つのフレームワーク変異の位置を示し、さらに親和性成熟の際に生じたループの変化を強調表示ブロックＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤで示す。 １Ｃ１２クローンおよびその親和性成熟誘導体のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存率アッセイを示す。 マウス血清中のＧ６タンデム体の濃度を時間の関数として示す。 クローンＦ４に対するカニクイザルの交差反応性の操作した増強に対応する配列アラインメントを示す。これらの全クローンに共通の特徴は、ＤＥループの前の２つのアミノ酸ＤからＧへの変異である。 ヒトまたはカニクイザルＴＲＡＩＬ Ｒ２−ＦｃのＦ４ｍｏｄ１コートプレートへの結合の、Ｆ４またはＦ４ｍｏｄ１単量体による阻害のＥＬＩＳＡ測定を示す。 クローンＦ４ｍｏｄ１の生殖系列化に対応する配列アラインメント、特に、Ｆ４、Ｆ４ｍｏｄ１およびＦ４ｍｏｄ１２のＴＮ３生殖系列に対する比較を示す。 ヒトまたはカニクイザルＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ＦｃのＦ４ｍｏｄ１コートプレートへの結合の、Ｆ４、Ｆ４ｍｏｄ１、またはＦ４ｍｏｄ１２単量体による阻害のＥＬＩＳＡ測定を示す。 Ｆ４ｍｏｄ１２タンデム６に対しＧ６タンデム６を比較したＣｏｌｏ２０５細胞死滅アッセイを示す。 Ｆ４ｍｏｄ１２タンデム８に対しＧ６タンデム８を比較したＣｏｌｏ２０５細胞死滅アッセイを示す。 ＴＲＡＩＬ耐性細胞株ＨＴ２９中でＦ４ｍｏｄ１２タンデム８に対しＧ６タンデム８の活性を比較したＨＴ２９細胞死滅アッセイを示す。 Ａｎｔｉｔｏｐｅ ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ免疫原性分析で試験したクローンに対応する配列アラインメントを示す。クローンＦ４ｍｏｄ１２に関する差異を強調表示している。 非ＳＥＣ精製Ｇ６タンデム８のＳＥＣデータを示す。 ＳＥＣ精製Ｇ６タンデム８のＳＥＣデータを示す。 種々用量のＴｎ３ ＴＲＡＩＬ Ｒ２アゴニストであるＧ６タンデム６およびＧ６タンデム８に応答したＣｏｌｏ２０５結腸直腸癌異種移植モデルにおける腫瘍体積の変化を示す。 種々用量のＴｎ３ ＴＲＡＩＬ Ｒ２アゴニストであるＧ６タンデム６およびＧ６タンデム８に応答したＣｏｌｏ２０５結腸直腸異種移植モデルの体重変化を示す。
発明の詳細な説明
定義
本発明を詳細に記載する前に、具体的な組成物またはプロセスステップを変更しうるという理由から、本発明は、これらに限定されないことは理解されたい。本明細書および添付の請求項で使われる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明確に別義が指示されない限り、複数参照対象を含むことに留意しなければならない。「ａ」（また「ａｎ」）という用語、ならびに「１つまたは複数の」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書では同義に使用することができる。
さらに、「および／または」は、本明細書で使用される場合は、他方を含め、または含めない、２つの特定された特徴または要素のそれぞれの特定的開示と解釈すべきである。従って、本明細書の語句、例えば、Ａおよび／またはＢ」で使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことが意図されている。同様に、語句、例えば、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」で使用される「および／または」という表現は、次の実施形態のそれぞれを包含することが意図されている：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。
特に断らなければ、本明細書で使われる全ての技術的科学的用語は、本発明が関連する当業者によって通常理解されているのと同じ意味を有する。例えば、ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｕｏ、Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ、２ｎｄ ｅｄ．、２００２、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３ｒｄ ｅｄ．、１９９９、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ ｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｒｅｖｉｓｅｄ、２０００、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、は、本発明で使用されている多くの用語の一般的辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞、および記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）で認められた形式で表示される。数値の範囲は、範囲を定める数値を含む。他に指示がない限り、アミノ酸配列は、左から右へアミノからカルボキシの方向へ記述される。本明細書で記載される表題は、本発明の種々の態様または実施形態を限定するものではなく、これら態様または実施形態は明細書全体への参照により理解することができる。従って、すぐ後で定義される用語は、明細書全体への参照によりより完全に定義される。
実施形態が、本明細書で用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用いて記載される場合はいつでも、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および／または「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」の用語で記載されるそれ以外の類似の実施形態もまた提供されることは理解されよう。
アミノ酸は、本明細書では、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法に関する委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨されているそれらの一般に知られている３文字記号または１文字記号により参照される。同様に、ヌクレオチドは、それらの通常受け入れられている単一文字コードにより参照される。
本明細書で使われる「エピトープ」という用語は、本発明の足場に結合できるタンパク質決定因子を指す。エピトープは、通常、化学的に活性な表面分子集団、例えば、アミノ酸または糖側鎖からなり、通常は、特異的３次元的構造特性、ならびに特異的電荷特性を有する。立体構造および非立体構造エピトープは、変性溶剤の存在下で前者に対する結合が失われ、後者に対しては失われないことから区別される。
「フィブロネクチンタイプＩＩＩ（ＦｎＩＩＩ）ドメイン」、「ＦｎＩＩＩドメイン」という用語は、ヒトフィブロネクチンタイプＩＩＩドメインに相同なポリペプチドを指し、これは少なくとも７つのベータ鎖を有し、それらのベータ鎖は２つのベータシート間に分布し、それら自身で互いに集まってタンパク質のコアを形成し、さらに相互にベータ鎖を連結する溶媒に露出したループを含む。ベータシートサンドイッチの各エッジに少なくとも３つのこのようなループがあり、このエッジは、ベータ鎖の方向に垂直なタンパク質の境界である。ある特定の実施形態では、ＦｎＩＩＩドメインは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧと命名される６つのループ領域に結合したＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと命名される７つのベータ鎖を含み、ループ領域は、各ベータ鎖を連結している。
「ＤＮＡ」という用語は、２つ以上の共有結合で結合した、天然または改変デオキシリボヌクレオチドの配列を指す。
「融合タンパク質」という用語は、（ｉ）１つまたは複数の本発明の足場と結合した（ｉｉ）第２の別のタンパク質（すなわち「異種の」タンパク質）を含むタンパク質を指す。
本明細書で使われる「異種の成分」という用語は、本発明の足場に対する組成物の追加を示すのに使われ、その組成物は、ＦｎＩＩＩドメインの通常の部分ではない。代表的異種の成分には、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、薬剤、毒素、造影剤、放射性化合物、有機および無機のポリマー、ならびにＦｎＩＩＩドメイン自体に固有ではない活性を提供可能な他のいずれかの組成物が含まれ、また、この活性を提供可能な組成物には、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、細胞傷害性の試薬、放射性核種、造影剤、ビオチン、二量体化ドメイン（例えば、ロイシンジッパードメイン）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）もしくはそのＦｃＲｎ結合部分、抗体ドメインもしくは断片（例えば、抗体可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、Ｃカッパドメイン、Ｃラムダドメイン、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメイン）、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、ＩｇＧ分子、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩ足場、エピトープタグ、組換え型ポリペプチドポリマー、サイトカイン、等、が含まれる。
本明細書で使われる「リンカー」という用語は、２つ以上の足場を結合またはこれらを連結するいずれの分子集合体をも指す。リンカーは、足場のモジュール間の「スペーサー」として作用する機能を有する分子であってもよく、また追加の機能を有する分子（すなわち、「官能性成分」）であってもよい。「異種の成分」の定義に含まれる分子もまた、リンカーとして機能することができる。
「結合された（ｌｉｎｋｅｄ）」および「融合された（ｆｕｓｅｄ）」という用語は、同義に使用される。これらの用語は、化学の結合または組換え型手段を含む意味を有する全ての作用により、２つ以上の足場、異種の成分、またはリンカーを結合することを指す。
「多量体」「多量体足場」および「多価性足場」という用語は、会合している少なくとも２つのＦｎＩＩＩ足場を含む分子を指す。多量体足場を形成する足場は、各足場を独立に機能させるリンカーを介して結合できる。「多量体」および「多価性」は、本明細書では同義に使用できる。多価性足場は、単一特異性でも、二重特異性でもよい。
「ドメイン」または「タンパク質ドメイン」という用語は、多くの場合残りのタンパク質とは無関係に、安定な３次元構造に折り畳み可能なタンパク質の領域を指し、これは特有の機能を備えることができる。この構造は、元のタンパク質内のドメインの機能に関連した、酵素活性、別の分子に対する認識モチーフの形成、等の特異的機能を保持し、またはタンパク質が、タンパク質の特定の環境中で存在するために必要な構造成分を提供する。タンパク質ファミリーおよび関連タンパク質スーパーファミリーの両方の内で、タンパク質ドメインは、進化的に保存された領域でありうる。多量体足場の成分を記述する場合、用語「ドメイン」、「単量体足場」、および「モジュール」は、同義に使用される。「自然ＦｎＩＩＩドメイン」は、生体によりコードされるいずれかの非組換え型ＦｎＩＩＩドメインを意味する。
「タンパク質配列」または「アミノ酸配列」は、アミノ末端からカルボキシル末端方向のポリペプチド中のアミノ酸成分の直鎖状表示を意味し、その表示中で相互に隣接している残基は、ポリペプチドの一次構造中で連続している。
「核酸」という用語は、２つ以上の共有結合しているヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体または誘導体のいずれをも指す。本明細書で使われるこの用語には、限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡが含まれる。「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書では同義に使われる。
「ポリヌクレオチド」という用語は、単一核酸ならびに複数核酸を包含することが意図され、単離核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。「単離」核酸またはポリヌクレオチドという用語は、自然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを指すことが意図される。例えば、ベクター中に含まれた本発明の足場をコードする組換え型ポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されているものとする。単離ポリヌクレオチドのさらなる例には、異種の宿主細胞中に維持された組換え型ポリヌクレオチドまたは溶液中の（部分的にまたは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離ＲＮＡ分子には、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物が含まれる。本発明による単離ポリヌクレオチドまたは核酸には、合成により製造されたそのような分子がさらに含まれる。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターであっても、またはこれらを含んでもよい。
「薬学的に許容可能な」という用語は、顕著な医学的有害結果を伴うことなく動物（例えば、哺乳動物）に投与可能な化合物またはタンパク質を指す。
「生理学的に許容される担体」という用語は、治療されている宿主に有意な顕著な影響を与えず、それとともに投与される、化合物の治療特性を維持できる担体を指す。１つの代表的な生理学的に許容される担体は、生理的食塩水である。他の生理学的に許容される担体およびその製剤は、当業者には既知であり、また、例えば、レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、（１８ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ）、ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ、１９９０、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（参照により本明細書に組み込まれる）、に記載されている。
「ポリペプチド」は、長さ、翻訳後改変、または機能に関わらず、アミド結合（ペプチド結合）により直鎖状に連結した２つ以上のアミノ酸の任意の配列を意味する。「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書では、同義に使用される。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、またはオリゴペプチドは、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、また、「ポリペプチド」という用語は、これらのいずれの用語に替えて、またはそれらと同義的に用いることができる。「ポリペプチド」という用語は、また、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、これに限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解性開裂、または非天然アミノ酸による修飾、を含む修飾産物を指すことが意図されている。ポリペプチドは、天然生物源由来でも、または組換え型技術によって製造されてもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳される必要はない。ポリペプチドは、化学合成を含むどのような手法によっても生成可能である。
また、本発明のポリペプチドには、前出のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、または変異体、およびその任意の組み合わせが含まれる。変異体は、天然でも、または非天然でも発生可能である。非天然変異体は、既知の変異誘発技術を使って製造可能である。変異体ポリペプチドは、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を含むことができる。また、「誘導体」には、２０種の標準アミノ酸の１つまたは複数の天然アミノ酸誘導体を含むペプチドも含まれる。
「ランダム化（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ）」または「変異した（ｍｕｔａｔｅｄ）」は、テンプレート配列に比較して、欠失、置換または付加等の、１つまたは複数のアミノ酸変化を含むことを意味する。「ランダム化する（ｒａｎｄｏｍｉｚｉｎｇ）」または「変異させる（ｍｕｔａｔｉｎｇ）」は、配列中へのこのようなアミノ酸変化を導入するプロセスを意味する。ランダム化または変異は、一般的には、核酸コード配列の意図的な、盲検法による、または自然の配列変化により達成することができ、任意の技術、例えば、ＰＣＲ、変異性ＰＣＲ、または化学ＤＮＡ合成によって発生させることができる。「ランダム化する」、「無作為の」、「変異させる」、「変異した」等の用語は、本明細書では、同義に使用される。
「同種の」（ｃｏｇｎａｔｅ）または「同種の、非変異タンパク質」は、変異体タンパク質がランダム化または変異導入されている場合の変異体タンパク質に導入されたアミノ酸変異を除いて、変異体タンパク質に対する配列が同じであるタンパク質を意味する。
「ＲＮＡ」は、２つ以上の共有結合した天然または改変リボヌクレオチドの配列を意味する。この用語に含まれる改変ＲＮＡの一例は、ホスホロチオエートＲＮＡである。
本明細書で使われる「本発明の足場」または「本発明の足場（複数）」という用語は、ＦｎＩＩＩ多量体足場ならびに単量体足場を指す。「標的」という用語は、本発明の特定的な足場により認識される化合物を指す。典型的な標的には、タンパク質、多糖類、ポリヌクレオチドおよび小分子が含まれる。「標的」および「抗原」という用語は、本明細書では同義に使用される。例えば、本明細書で使われる「特異的に結合」または「特異的結合」という用語中の「特異的」という用語は、本発明の足場が１つまたは複数の抗原結合ドメインを介して１つまたは複数の抗原に結合する相対的親和性を指し、その結合は１つまたは複数の抗原結合ドメインと１つまたは複数の抗原の間の一定の相補性を必要とする。この定義に従って、ランダムな非関連エピトープに結合するのに比べてより容易にエピトープに結合する場合に、本発明の足場はそのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。
本明細書で使われる「親和性」という用語は、本発明のある特定の足場の個別エピトープに対する結合の強度の尺度を指す。
本明細書で使われる「アビディティ」という用語は、本発明の足場集団とある特定のエピトープの間の複合体の全体的安定性、すなわち、機能的に組み合わされた複数の足場の抗原との結合強度を指す。アビディティは、個別の抗原結合ドメインの特異的エピトープに対する親和性、および、また本発明の足場の結合価の両方に関連する。
「標的に対する作用」という用語は、本発明の多量体足場の１つまたは複数の標的に対する結合、およびこのような結合から得られた生物学的効果を指す。この点に関しては、多量体足場中の複数の抗原結合ユニットは、種々の標的および／またはエピトープと相互作用でき、例えば、２つの標的を物理的により接近させ、個別の標的との相互作用を通して、代謝カスケードを開始させる、等の作用をする。ＴＲＡＩＬ Ｒ２に関しては、「標的に対する作用」は、例えば、１つまたは複数のＴＲＡＩＬ Ｒ２の生物学的活性の強化、刺激または活性化によって、達成される作用を指す。
本明細書で使われる「結合価」という用語は、可能性のある抗原結合モジュールの数、例えば、多くの本発明の足場中のＦｎＩＩＩモジュールを指す。本発明の足場が２つ以上の抗原結合モジュールを含む場合は、各結合モジュールは、例えば、同じ標的または異なる標的中の、同じエピトープまたは異なるエピトープに特異的に結合できる。
本明細書で使われる「ジスルフィド結合」という用語は、２つの硫黄原子間で形成された共有結合を含む。アミノ酸システインは、第２のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成することができるチオール基を含む。
本明細書で使われる「Ｔｎ３モジュール」および「Ｔｎ３足場」という用語は、ＦｎＩＩＩ足場を指し、ここで、Ａベータ鎖は配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４５または１３１を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号４９を含み、およびベータ鎖Ｇは配列番号５２を含み、少なくとも１つのループは、「野生型Ｔｎ３足場」のループの非天然変異体である。ある特定の実施形態では、Ｃベータ鎖中のシステイン残基（例えば、配列番号４５または１３１中のシステイン）およびＦベータ鎖（配列番号４９）中のシステイン残基は置換されないことを除いて、１つまたは複数のＴｎ３モジュールのベータ鎖は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
本明細書で使われる「野生型Ｔｎ３足場」という用語は、配列番号１、すなわち、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩ由来の操作ＦｎＩＩＩ足場を含むＦｎＩＩＩ足場を指す。
「免疫グロブリン」および「抗体」という用語は、生化学的に区別されうる種々の広範なクラスのポリペプチドを含む。当業者なら、重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類されることを理解するであろう。抗体の「クラス」をそれぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥ、として決定するのは、この鎖の性質である。これらのクラスの改変物は、当業者には容易に識別可能である。本明細書で使われる「抗体」という用語には、限定されないが、無傷抗体、改変抗体、抗体ＶＬまたはＶＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、Ｃカッパドメイン、Ｃラムダドメイン、Ｆｃドメイン（同上参照）、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメインが含まれる。
本明細書で使われる「改変抗体」という用語には、天然に存在しない、例えば、少なくとも２つの重鎖部分を含むが、２つの完全な重鎖を含まない（例えば、ドメイン欠失抗体またはミニボディのような）抗体となるように変えられた合成型の抗体；２つ以上の抗原または単一抗原の異なるエピトープに結合するように変えられた多選択性型の抗体（例えば、二重特異性、三重特異性、等）が含まれる。さらに、「改変抗体」という用語には、多価型抗体（例えば、三価、四価、等の同じ抗原の３つ以上のコピーに対する抗体）が含まれる（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＆ Ｄｕｂｅｌ、ｅｄｓ．、２０１０、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、を参照のこと）。
「インビボ半減期」という用語は、通常の意味、すなわち、ポリペプチドの生物活性の５０％が身体／標的器官中にまだ存在している時間、またはポリペプチドの活性が初期値の５０％になる時間の意味で使用される。機能的インビボ半減期を測定する代替法として、「血清半減期」、すなわち、除去される前に、ポリペプチド分子の５０％が血漿または血流中を循環する時間を測定可能である。血清半減期の測定は、機能的インビボ半減期を測定するより簡単なことが多く、血清半減期の大きさは、通常、機能的インビボ半減期の大きさの良い指標である。血清半減期の代わりの用語には、血漿半減期、循環（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）半減期、循環（ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ）半減期、血清クリアランス、血漿クリアランス、およびクリアランス半減期が含まれる。保持される機能は、通常、凝血促進性、タンパク分解性、補因子結合、受容体結合活性、または特定のタンパク質に関連する他のタイプの生物活性、から選択される。
機能的インビボ半減期または血漿半減期に関連する「増加した」という用語は、参照分子（例えば、非改変ポリペプチド）に比べて、ポリペプチドの関連する半減期が同等の条件下で測定して、統計的に有意に増加していることを示すために使用される。
本明細書で使われる「発現」という用語は、遺伝子が生化学物質、例えば、本発明の足場またはその断片を産生するプロセスを指す。このプロセスは、細胞内の遺伝子の機能的存在のいかなる現実化をも含み、限定されないが、遺伝子ノックダウンならびに一時的発現および安定発現の両方を含む。限定されないが、それは、遺伝子の１つまたは複数のｍＲＮＡへの転写、およびこのようなｍＲＮＡの１つまたは複数のポリペプチドへの翻訳を含む。最終目的産物が、生化学的である場合は、発現は、その生化学物質と任意の前駆物質の生成を含む。
「発現産物」は、核酸、例えば、遺伝子の転写により産生されるメッセンジャーＲＮＡ、またはポリペプチドであってもよい。本明細書記載の発現産物は、さらに、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化を受けた核酸、または転写後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク分解性開裂、等を受けたポリペプチドを含む。
本明細書で使われる「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、本発明においては、宿主細胞中に導入し、目的の発現産物を発現させるための媒体として使用するベクターを意味するように使われる。当業者には既知であるように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルス、からなる群より容易に選択できる。一般的に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、目的核酸のクローニングを、および真核または原核細胞中に入る能力、および／または増殖する能力を促進するための適切な制限酵素部位を含む。
「宿主細胞」という用語は、組換ＤＮＡ技術を使って構築され、少なくとも１つの発現産物をコードするベクターを収容する細胞を指す。組換え型宿主から発現産物を単離するプロセスの記述において、明確に別義が指示されていない限り、「細胞」および「細胞培養物」という用語は、同義に使用され、発現産物の源を意味する。すなわち、「細胞」からの発現産物の回収は、遠心沈殿全細胞からの回収、または培地および懸濁細胞の両方を含む細胞培養物からの回収を意味する。
本明細書で使われる「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、治療上の処置および予防または防止手段の両方を指し、その目的は、対象の望ましくない生理的な変化または障害、例えば、炎症性疾患または状態の進行、を防ぐか、または遅らせる（減らす）ことである。有益なまたは所望する臨床的結果には、限定されないが、検出可能、不可能に関わらず、症状の軽減、疾患の程度の低減、疾患の安定化（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延化または緩徐化、改善または疾患状態の緩和、および寛解（部分または完全）が含まれる。
「治療」という用語は、また、治療を受けていない場合に予想される生存に比べての生存の延長を意味する。治療を必要としている人には、既に状態または障害のある人、ならびに状態または障害になる傾向がある人、または状態または障害を予防すべき人が含まれる。
「対象」、「個体」、「動物」、「患者」、または「哺乳動物」という用語は、診断、予後、または治療が望まれる任意の個体、患者または動物、特に、哺乳類の対象を指す。哺乳類の対象には、ヒト、飼育動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）、家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）、および例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシ、等の、動物園の動物、スポーツ用動物またはペット動物が含まれる。
本明細書で使われる「ＴＲＡＩＬ受容体」という用語は、ＴＲＡＩＬに結合し、ＴＲＡＩＬに結合時に、腫瘍細胞のプログラム細胞死（アポトーシス）を活性化するタンパク質を指す。ＴＲＡＩＬ受容体の非制限的例には、ＴＲＡＩＬ２受容体が含まれる。
「ＴＲＡＩＬ Ｒ２」または「ＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体」は、本明細書では同義に使用され、完全長ＴＲＡＩＬ受容体配列および可溶の、細胞外ドメイン型の受容体を指す。これは、Ｓｈｅｒｉｄａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７：８１８−８２１（１９９７）；Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７：８１５−８１８（１９９７）、米国特許第６，０７２，０４７号および同６，３４２，３６９号：国際公開第９８／５１７９３号、同９８／４１６２９号、同９８／３５９８６号、同９９／０２６５３号、同９９／０９１６５号、９８／４６６４３号、および同９９／１１７９１号；Ｓｃｒｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、７：６９３−６９６（１９９７）；Ｗａｌｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯＪ．、１６：５３８６−５３８７（１９９７）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１７：１４１−１４３（１９９７）、に記載されている。代表的完全長長さＴＲＡＩＬ受容体配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ５１７７８．１およびＯ１４７６３．２．で入手可能である。
「ＴＲＡＩＬ受容体アゴニスト」または「アゴニスト」という用語は、最も広い意味で使用され、ＴＲＡＩＬ Ｒ２および生物学的に活性なその変異体の１つまたは複数の生物活性を、インビトロ、インサイチュ、またはインビボで、部分的または完全に高める、作動させる、または活性化するいずれの分子をも含む。このような生物活性の例には、アポトーシスならびに文献で報告されているものがさらに含まれる。アゴニストは、直接的に機能しても、間接的でもよい。例えば、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストは、受容体活性化またはシグナル伝達を起こすＴＲＡＩＬ Ｒ２への結合の結果として、１つまたは複数のＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体、または１つまたは複数のＴＲＡＩＬＲ２受容体および他の標的の、１つまたは複数の生物活性を、インビボ、インビトロまたはインサイチュで、部分的にまたは完全に、強化、刺激または活性化するよう機能してもよい。
「ＴＲＡＩＬ」または「ＴＲＡＩＬポリペプチド」は、１つまたは複数のＴＲＡＩＬ受容体に結合するリガンドを指し、ＴＲＡＩＬ Ｒ２、ならびに生物学的に活性なその断片が含まれる。代表的ＴＲＡＩＬ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ３２７２２．１およびＰ５０５９１．１で入手可能である。限定されないが、断片には、約５〜約５０アミノ酸残基、または約５〜約２５、または約１０〜２０残基、または約１２〜約２０アミノ酸残基のＴＲＡＩＬポリペプチド配列を有する配列が含まれる。任意選択で、ＴＲＡＩＬペプチドは、２５アミノ酸より多くない残基からなる（例えば、２５、２３、２１、１９、１７、１５またはそれ未満のアミノ酸残基）。
「アポトーシス」および「アポトーシス性活性」という用語は、広い意味で使用され、規則的または調節された形の哺乳動物の細胞死を指し、通常、細胞質の凝縮、細胞膜微絨毛の消失、核のセグメンテーション、染色体のＤＮＡの分解またはミトコンドリア機能の消失、を含む、１つまたは複数の特徴的細胞変化が伴う。この活性は、よく知られた技術的方法、例えば、細胞生存率アッセイ、ＦＡＣＳ分析またはＤＮＡ電気泳動、アネキシンＶに対する結合、ＤＮＡ断片化、細胞収縮、小胞体の膨張、細胞断片化、および／または膜ベシクルの形成（アポトーシス小体）により、判定および測定できる。
緒言
ＴＲＡＩＬ−Ｒ２タンパク質は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー遺伝子のメンバーにコードされ、細胞内死ドメインを含む。一部の例では、これは、ＴＮＦＲＳＦｌ０Ｂ；ＣＤ２６２、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＫＩＬＬＥＲ／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬ Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＴＲＩＣＫ２Ａ、ＴＲＩＣＫ２Ｂ、ＴＲＩＣＫＢ、またはＺＴＮＦＲ９、としても知られる。この受容体は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＮＦＳＦ １０／ＴＲＡＩＬ／ＡＰＯ−２Ｌ）により活性化され、アポトーシスシグナルを伝達する。さらに、ＴＲＡＩＬ Ｒ２誘導アポトーシスには、カスパーゼおよび細胞内アダプター分子ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１が関与する（Ｗａｌｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯＪ、（１９９７）、１６、５３８６−９７）。
いくつかのタイプの正常細胞がＴＲＡＩＬ Ｒ２を発現するが、この受容体を経由するアポトーシスシグナル伝達は、主に、腫瘍細胞に限定されているように思われ、腫瘍細胞は、癌遺伝子、例えば、ＭｙｃまたはＲａｓによるそれらの形質転換との関連で細胞死受容体媒介アポトーシスをより受けやすくなる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅ ｌｌ５：５０１−１２（２００４）；Ｎｅｓｔｅｒｏｖ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：３９２２−７（２００４））。ＴＲＡＩＬ Ｒ２は、ヒト癌細胞株ならびに原発性腫瘍で発現することが多い。
本発明は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合可能な組換え型、非天然タンパク質足場ファミリーを提供する。特に、本明細書記載のタンパク質は、抗体可変領域の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）に類似の規定されたループを提示するのに使用できる。これらのループは、ランダム化または制限された進化を受け、多数の標的化合物に結合可能な多様性を生成することができる。タンパク質は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２および別の標的に結合可能な多選択性の足場に構築することができる。
特定的な実施形態では、本発明は、限定されないが、癌等の疾患の予防、改善、検出、診断、またはモニタリングに有用なＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的結合物質を提供する。他の特定的な実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的結合足場は、癌細胞がＴＲＡＩＬ Ｒ２を発現する癌の治療に有用である。一部の実施形態では、癌には、限定されないが、肺癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、および多発性骨髄腫を含むことができる。本発明は、また、細胞集団を除去するための足場の使用方法を提供する。一実施形態では、本発明の方法は、次の細胞型の除去に有用である：好酸球、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、単球および腫瘍細胞。
本発明の足場は、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメイン由来の単量体足場を含む多量体足場であり、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合が操作されている。本発明の多量体足場を構成するＴｎ３足場は、相互に独立して正確に折り畳まれて、それらの結合特異性および親和性を維持し、また、それぞれの単量体足場は、その機能特性を保持する。本発明の多量体足場を構成するＴｎ３足場が高結合価多量体足場、例えば、６価または８価足場、に構築される場合、単量体足場は相互に独立して正確に折り畳まれてそれらの結合特異性および親和性を維持し、また、それぞれ１つの単量体足場は、その機能特性を保持する。
構築物の形態が直鎖状でない場合でも、例えば、単量体Ｔｎ３または多量体Ｔｎ３足場が複雑な分岐構造（例えば、Ｆｃ融合体構築物または抗体様構築物）に構築される場合でも、高結合価足場（例えば、６価または８価）を含む多量体Ｔｎ３足場は、正確に折り畳まれる。
自然ＦｎＩＩＩドメイン、例えば、ヒトフィブロネクチンの第１０ＦｎＩＩＩドメインおよび大部分の天然ＦｎＩＩＩドメインは、ジスルフィド結合または遊離システインを含まない。多ドメインタンパク質が複数のシステインの導入により操作される場合、タンパク質発現の欠失、生じたタンパク質の沈殿、または非機能性タンパク質の産生が頻繁に発生する。これらの有害作用は、分子内のドメイン内および／またはドメイン間ジスルフィド結合の不正確な形成、および／または分子間ジスルフィド結合の不正確な形成に起因し、これは不正確なタンパク質折り畳み構造を生ずる。これらの効果は、通常、システイン、および／またはタンパク質ドメインの数が増加すると増強される。
例えば、８つの野生型Ｔｎ３足場（配列番号１）を含む直鎖多量体足場は、単一ポリペプチドアミノ酸配列に沿って１６システインを含むことになるであろう。別の代表的実施形態では、４つのＴｎ３モジュールを含む抗体様構築物（２つのＴｎ３モジュールがＩｇＧ重鎖に結合し、２つのＴｎ３がＩｇＧ軽鎖に結合している）は、４つの異なるポリペプチド鎖の中に分布した８システインを含むことになるであろう。このような数のシステインおよびこのような構造的複雑さを含む、例えば、４、６、または８つの直鎖Ｔｎ３モジュールを有する本発明の多量体足場は、正確に折り畳まれ、それぞれの単量体に比較して、改善された安定性と標的結合特性を示す。
１つまたは複数の操作されたジスルフィド架橋を含むＴｎ３足場が高結合価多量体型に構築されると、各個別単量体足場は正確に折り畳まれ、結合特異性および親和性、ならびに機能特性を保持する。さらに、単量体足場は、安定、機能的、かつ正確に折り畳まれた多量体足場を形成することができる。
本発明の多量体足場の利点は、複数のエピトープに結合する能力、例えば、（ｉ）単一標的中の複数のエピトープへの結合、（ｉｉ）複数標的中の単一エピトープへの結合、（ｉｉｉ）１つの標的の複数の異なるサブユニット上に位置する複数のエピトープへの結合、または（ｉｖ）複数の標的の複数のエピトープへの結合、すなわち、増加していくアビディティである。
さらに、多量体足場の柔軟性、および複数のＴｎ３単量体間の距離をリンカーを介して変えることができる可能性により、Ｔｎ３多量体足場は、表面（同じ細胞／表面または異なる細胞／表面）上の複数の標的分子に結合可能である。
２つ以上の標的に同時に結合するそれらの能力の結果として、本発明の多量体足場は、複数の経路を調節し、細胞表面上の受容体に交差結合し、別々の細胞上の細胞表面受容体に結合し、および／または標的分子または細胞を基質に結合させるために使用することができる。
ＦｎＩＩＩドメインの以前の配列解析から、ＢＣとＦＧループで大きな変動が認められ、これらのループが安定性に重要ではないことを示唆している（例えば、国際公開第２００９／０５８３７９号を参照）。本発明は、改善された安定性を有するＴｎ３足場を提供し、これは、アミノ酸配列が変動するが、ヒトテネイシンＣの対応する第３ＦｎＩＩＩのＦＧループよりも短い長さのＦＧループを含む。ＦＧループの短縮化により安定性の増加した変異Ｔｎ３足場が生成されることが観察された。従って、本発明の別の態様では、タンパク質安定性の増加した野生型Ｔｎ３足場（配列番号１）の変異体が提供される。
ある特定の実施形態では、本発明のＴｎ３単量体足場は、９アミノ酸および１０アミノ酸のＦＧループ長さを有する自然ヒトテネイシンＣ第３ＦｎＩＩＩドメインを含む足場に比べて増加した安定性を有するＦＧループを含む。さらに、本発明は、安定性の増加したＴｎ３足場を単離するのに有用な特定したＦＧループ長さを有する多様なＦｎＩＩＩ足場のライブラリーを提供する。
さらに、本発明は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２および１つまたは複数の追加の標的に結合することのできる特異性足場、特定的な標的に対する親和性が変異により調節される親和性成熟足場、および動物種間の免疫原性および／または交差反応性が変異により調節されている足場を提供する。また、本発明は、本発明の足場の製造方法、ならびに足場を望ましい物理化学的、薬理学的、または免疫学的な特性を有するように操作する方法を提供する。さらに、本発明は、このような足場の使用、および治療、予防、および診断のための使用方法を提供する。
ＦｎＩＩＩ構造モチーフ
本発明のＴｎ３足場は、生命体およびウイルスの３つのドメイン全てにわたって、また、多数のタンパク質クラスで広く認められるドメインであるタイプＩＩＩ（ＦｎＩＩＩ）フィブロネクチンモジュールの構造に基づいている。
特定的な実施形態では、本発明の足場は、ヒトテネイシンＣの第３のＦｎＩＩＩドメイン（配列番号４）由来である。１つの特定的な実施形態では、本発明の足場は、Ｔｎ３モジュールを含む。このドメインの全体としての３次元折り畳みは、最小の機能的抗体断片である重鎖（ＶＨ）可変領域に密接に関連している。この重鎖（ＶＨ）可変領域は、ラクダおよびラクダ科動物（例えば、ラマ）の単一ドメイン抗体では、完全抗原認識ユニットを含む。
本発明のＴｎ３単量体足場およびテネイシンＣ由来自然ＦｎＩＩＩドメインは、同じ３次元構造、すなわち、一方の側に３つのベータ鎖（Ａ、Ｂ、およびＥ）およびもう一方の側に４つのベータ鎖（Ｃ、Ｄ、Ｆ、およびＧ）を有し、６つのループ領域により連結されているベータサンドイッチ構造を特徴とする。これらのループ領域は、各ループのＮおよびＣ末端に連結したベータ鎖に従って命名されている。従って、ＡＢループは、ベータ鎖ＡとＢの間に位置し、ＢＣループは鎖ＢとＣの間に位置し、ＣＤループはベータ鎖ＣとＤの間に位置し、ＤＥループはベータ鎖ＤとＥの間に位置し、ＥＦループはベータ鎖ＥとＦの間に位置し、およびＦＧループはベータ鎖ＦとＧの間に位置する。ＦｎＩＩＩドメインは、ランダム化に耐性のある溶媒に露出したループを有し、これは、特定的な標的に高親和性で結合可能な多様なタンパク質足場プールの生成を促進する。
本発明の一態様では、Ｔｎ３ドメインは、抗体可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）に類似の１つまたは複数のループをランダム化するように設計されている指向性進化に供される足場として使用される。このような指向性進化手法は、対象標的、例えば、ＴＲＡＩＬ Ｒ２に対し高親和性を有する抗体様分子の産生をもたらす。さらに、一部の実施形態では、本明細書記載の足場は、確定した露出ループ（例えば、以前にランダム化され、標的との結合に基づいて選択されたループ）を、このような導入ループに結合する分子の進化を指示することを目的として、提示するために使用可能である。このタイプの選択は、いずれかの個別のＣＤＲ様ループに対して、認識分子を特定するために、または、その代わりに、２つまたは３つ全ての非線形エピトープ結合成分に組み合わされたＣＤＲ様ループの認識のために、行うことができる。
本発明の足場は、国際公開第２００９／０５８３７９号に記載のヒトテネイシンＣ構造モチーフの第３ＦｎＩＩＩドメインに基づいた分子である。特異的標的結合を付与することができる３つのループ（ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧと命名）のセットは、それぞれ、ＢとＣ鎖；ＤとＥ鎖、およびＦとＧベータ鎖の間をつないでいる。ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインのＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループは、それぞれ、９、６、および１０アミノ酸残基の長さである。これらループの長さは、抗体重鎖で見つかった同種の抗原認識ループの狭い範囲内、すなわち、それぞれ７〜１０、４〜８、および４〜２８アミノ酸長さ、に入る。同様に、第２のセットのループのＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループ（それそれ７、７、および８、アミノ酸長さ）は、それぞれ、ＡとＢベータ鎖；ＣとＤベータ鎖；およびＥとＦベータ鎖の間をつないでいる。
ランダム化を行い、標的に対する高親和性結合で選択されると、Ｔｎ３ドメイン中のループは、抗体中の同種のＣＤＲループの接触に等価の標的との接触が可能である。従って、一部の実施形態では、ＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループは、ランダム化および１つまたは複数の標的、例えば、ＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する高親和性結合について選択される。一部の実施形態では、このランダム化および選択プロセスは、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループのランダム化と平行に行うことができ、一方、他の実施形態では、このランダム化および選択プロセスは順次で行われる。
本発明の単量体足場
本発明は、複数のループ領域に結合した複数のベータ鎖ドメインを含む組換え型、非天然ＦｎＩＩＩ足場を提供し、ここで１つまたは複数の前記ループ領域が、野生型Ｔｎ３（配列番号１）中の同種のループ由来の少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換または付加により変化している。
新規結合特性を有する改善されたＴｎ３モジュールを生成するために、野生型Ｔｎ３がアミノ酸付加、欠失または置換を受ける。改善された足場の配列をＴｎ３配列に比較する場合、ベータ鎖およびループの同じ定義が使用されることは理解されよう。改善されたＴｎ３足場は、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメイン、野生型Ｔｎ３足場、または以前改善されたＴｎ３足場を使って生成できる。一部の実施形態では、本発明の単量体足場は、アミノ酸配列：
ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＣＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＥＶＳＬＩＣ（ＸＦＧ）ｎＫＥＴＦＴＴ、
を含み、ここで、ＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、それぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループ中に存在するアミノ酸残基を表し、Ｘ１はアミノ酸残基ＡまたはＴを表し、また、ｎ＝２〜２６である。
一実施形態では、ＸＡＢは配列番号３５からなる。一実施形態では、ＸＢＣは配列番号３６からなる。一実施形態では、ＸＣＤは配列番号３７からなる。一実施形態では、ＸＤＥは配列番号３８からなる。一実施形態では、ＸＥＦは配列番号３９からなる。一実施形態では、ＸＦＧは配列番号４０からなる。
一実施形態では、ＸＡＢは配列番号３５を含む。一実施形態では、ＸＢＣは配列番号３６を含む。一実施形態では、ＸＣＤは配列番号３７を含む。一実施形態では、ＸＤＥは配列番号３８を含む。一実施形態では、ＸＥＦは配列番号３９を含む。一実施形態では、ＸＦＧは配列番号４０を含む。
ある特定の実施形態では、ＸＡＢは配列番号３５からなり、ＸＣＤは配列番号３７からなり、さらにＸＥＦは配列番号３９からなる。一実施形態では、ＸＢＣは配列番号３６からなり、ＸＤＥは配列番号３８からなり、さらにＸＦＧは配列番号４０からなる。
ある特定の実施形態では、ＸＡＢは配列番号３５を含み、ＸＣＤは配列番号３７を含み、さらにＸＥＦは配列番号３９を含む。一実施形態では、ＸＢＣは配列番号３６を含み、ＸＤＥは配列番号３８を含み、さらにＸＦＧは配列番号４０を含む。
一部の実施形態では、本発明の単量体足場は、Ｔｎ３モジュールを含む。さらに他の実施形態では、本発明の足場は、Ｔｎ３モジュール（配列番号１）を含み、ヒトテネイシンＣの第３のＦｎＩＩＩドメインのベータ鎖Ｃ（配列番号４）がＮ末端システイを含む変異ベータ鎖Ｃ（配列番号４５または配列番号１３１）により置換され、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインのベータ鎖Ｆ（配列番号４８）がＣ末端システインを含む変異ベータ鎖Ｆ（配列番号４９）により置換されている。一部の実施形態では、本発明の足場は、Ｔｎ３モジュールを含み、ＣおよびＦベータ鎖（それぞれ、配列番号４５または１３１；および配列番号４９）中のシステイン残基は置換できないことを除いて、１つまたは複数のベータ鎖が少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
本発明の足場の種々のベータ鎖を結合するループは、長さおよび／または配列多様性に関しランダム化可能である。一実施形態では、本発明の足場は、長さおよび／または配列多様性に関しランダム化された少なくとも１つのループを有する。一実施形態では、足場の少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つのまたは少なくとも６つのループが長さおよび／または配列多様性に関しランダム化される。一実施形態では、本発明の足場の少なくとも１つのループは、一定に保持され、他方、少なくとも１つの別のループは、長さおよび／または配列多様性に関しランダム化される。別の実施形態では、ループＡＢ、ＣＤ、ＥＦのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てが一定に保持され、他方、ループＢＣ、ＤＥ、ＦＧのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てが長さまたは配列多様性に関しランダム化される。別の実施形態では、ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つ全てがランダム化され、他方、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てが長さおよび／または配列多様性に関しランダム化される。さらに別の実施形態では、ループＡＢ、ＣＤ、ＥＦ、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧのうちの少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つのループ、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または６つ全てのループが長さまたは配列多様性に関しランダム化される。
一部の実施形態では、１つまたは複数のループ内の残基が一定に保持され、他方、他の残基が長さおよび／または配列多様性に関しランダム化される。一部の実施形態では、１つまたは複数のループ内の残基が所定の、限られた数の異なるアミノ酸に限定され、他方、他の残基が長さおよび／または配列多様性に関しランダム化される。従って、本発明の足場は、縮重したコンセンサス配列および／または１つまたは複数の不変アミノ酸残基を有する１つまたは複数のループを含むことができる。一実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ａ、を有するランダム化されたＡＢループを含む。ここで、Ｘは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、（ａ）は、セリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンを表す。別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ａ、を有するランダム化されたＡＢループを含む。ここで、Ｘは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、（ａ）は、セリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンを表す。
別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｓ−Ｘ−ａ−Ｘ−ｂ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ、を有するランダム化されたＢＣループを含む。ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、（ａ）は、プロリンまたはアラニンを表し、さらに、（ｂ）は、アラニンまたはグリシンを表す。別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｓ−Ｐ−ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｔ−Ｇ、を有するランダム化されたＢＣループを含み、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、（ｃ）は、プロリン、セリンまたはグリシンを表す。さらに別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ａ−ｄ−Ｐ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ｅ−ｆ−Ｘ−Ｉ−Ｘ−Ｇ、を有するランダム化されたＢＣループを含み、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、（ｄ）は、プロリン、グルタメートまたはリシンを表し、（ｅ）は、アスパラギンまたはグリシンを表し、さらに、（ｆ）は、セリンまたはグリシンを表す。
一実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｘｎを有するランダム化されたＣＤループを含み、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、ｎ＝６、７、８、９、または１０である。別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｘｎ、を有するランダム化されたＣＤループを含み、Ｘは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、ｎ＝７、８、または９である。
一実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ、を有するランダム化されたＤＥループを含み、Ｘは任意のアミノ酸を表す。
一実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｘ−ｂ−Ｌ−Ｘ−Ｐ−Ｘ−ｃ−Ｘ、を有するランダム化されたＥＦループを含み、Ｘは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、（ｂ）は、アスパラギン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはグリシンを表し、さらに、（ｃ）は、イソロイシン、トレオニン、セリン、バリン、アラニン、またはグリシンを表す。
一実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｘ−ａ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ｂ、を有するランダム化されたＦＧループを含み、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、（ａ）は、アスパラギン、トレオニンまたはリシンを表し、さらに、（ｂ）は、セリンまたはアラニンを表す。別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（Ｘ９）、を有するランダム化されたＦＧループを含み、Ｘは、任意のアミノ酸を表す。さらに別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｘ−ａ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ｂ−Ｎ−Ｐ−Ａ、を有するランダム化されたＦＧループを含み、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、（ａ）は、アスパラギン、トレオニンまたはリシンを表し、（ｂ）は、セリンまたはグリシンを表す。特定的な実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列：Ｘ−ａ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｓ−Ｎ−Ｐ−Ａ、を有するランダム化されたＦＧループを含み、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、（ａ）は、アスパラギン、トレオニンまたはリシンを表す。
特定の実施形態では、本発明の足場は、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインの同種のＦＧループよりも、少なくとも１つのアミノ酸残基分短くなるように維持され、１つまたは複数の位置でさらにランダム化されているＦＧループを含む。
特定的な実施形態では、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧの内の少なくとも１つのループがランダム化され、Ａベータ鎖が配列番号４１または４２を含み、Ｂベータ鎖が配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖が配列番号４４を含み、Ｄベータ鎖が配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖が配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖が配列番号４８、４９、５０、または５１を含み、およびＧベータ鎖が配列番号５２または５３を含み、ＡＢループが配列番号３５を含み、ＣＤループが配列番号３７を含み、さらにＥＦループが配列番号３９を含む。
他の特定的な実施形態では、ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦの内の少なくとも１つのループがランダム化され、Ａベータ鎖が配列番号４１または４２を含み、Ｂベータ鎖が配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖が配列番号４４または４５を含み、Ｄベータ鎖が配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖が配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖が配列番号４８、４９、５０、または５１を含み、さらに、Ｇベータ鎖が配列番号５２または５３を含み、ＢＣループが配列番号３６を含み、ＤＥループが配列番号３８を含み、さらに、ＦＧループが配列番号４０を含む。
足場安定性の強化
非天然ジスルフィド結合
本発明のＴｎ３足場の安定性は、多くの異なる手法により高めることができる。一部の実施形態では、本発明の足場は、Ｎおよび／またはＣ末端領域の伸長により安定化できる。Ｎおよび／またはＣ末端領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０超のアミノ酸により伸長することができる。他の実施形態では、本発明のＴｎ３足場は、本明細書記載の血清半減期を増加させる変化を導入することにより安定化できる。さらに別の実施形態では、本発明のＴｎ３足場は、足場の疎水性のコアを安定化させるために、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換を含む。
本発明のＴｎ３足場は、非天然ジスルフィド結合を操作することにより効果的に安定化できる。このように操作された足場は、多量体足場の一部として、効果的に発現させることができる。操作された足場のジスルフィド結合の正確な形成および正確な折り畳みは、足場の生物活の保存により証明される。非天然ジスルフィド結合を含む操作された足場は、少なくとも２つの標的（例えば、実施例８参照）または３つの標的（例えば、実施例１２参照）に同時に結合できるという事実は、足場の３次元構造は、操作されたジスルフィド結合によって大きく変えられていないこと、および標的結合ループの相対的位置が保存されていることの証明を提供する。一部の実施形態では、本発明の足場は、国際公開第２００９／０５８３７９号に記載のように、非天然ジスルフィド結合を含む。バイオインフォマティクス手法を利用して、ジスルフィド結合を操作するのに適した候補位置を特定できる。
一実施形態では、本発明のＴｎ３単量体足場は、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、または少なくとも５つの非天然分子内ジスルフィド結合を含む。特定的な実施形態では、本発明は、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインに比べて安定性の増加した、２つ、３つ、４つ、またはそれを超える数の操作された分子内のジスルフィド結合を含むＴｎ３足場を得る方法を提供する。
一実施形態では、本発明のＴｎ３単量体足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、少なくとも１つの前記非天然ジスルフィド結合が単量体足場を安定化させる。
別の実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも１つの同じ多量体足場中の２つの異なる単量体足場の間に位置する非天然ジスルフィド結合を含む。さらに別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合を含み、結合は、２つの異なる多量体足場の間に位置する、すなわち、ジスルフィド結合は、分子間ジスルフィド結合である。例えば、ジスルフィド結合は、異なる足場（例えば、２つの分離したＴｎ３単量体足場、分離したＴｎ３単量体足場と多量体足場、または２つの多量体足場）、Ｔｎ３足場とリンカー、足場とＦｎドメイン、またはＴｎ３足場と抗体またはその断片、を連結できる。一部の実施形態では、本発明の足場は、足場および分離した異種の成分、足場および同じ足場に融合またはコンジュゲートされた異種の成分、または足場および異なる足場に融合またはコンジュゲートされた異種の成分を連結する少なくとも１つの非天然分子間ジスルフィド結合を含む。
一部の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたはそれを超える数の多量体足場を形成するジスルフィド結合を含む。
別の実施形態では、本発明の足場は、Ｎおよび／またはＣ末端領域の伸長を含んでもよい。一実施形態では、本発明の足場は、本明細書記載の血清半減期を延長するための変化を含む。さらに別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換を含み、疎水性の足場のコアを安定化させる。
特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４５を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号４９を含み、さらにＧベータ鎖は配列番号５２を含む。
特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは配列番号４２からなり、Ｂベータ鎖は配列番号４３からなり、Ｃベータ鎖は配列番号４５からなり、Ｄベータ鎖は配列番号４６からなり、Ｅベータ鎖は配列番号４７からなり、Ｆベータ鎖は配列番号４９からなり、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５２からなる。
特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも１つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Ａベータ鎖ドメインは本質的に配列番号４２からなり、Ｂベータ鎖は本質的に配列番号４３からなり、Ｃベータ鎖は本質的に配列番号４５からなり、Ｄベータ鎖は本質的に配列番号４６からなり、Ｅベータ鎖は本質的に配列番号４７からなり、Ｆベータ鎖は本質的に配列番号４９からなり、さらに、Ｇベータ鎖は本質的に配列番号５２からなる。
足場安定性の強化：ＦＧループ長
発明者はＦＧループの長さがＴｎ３足場の安定性に対してある種の役割を果たすことを発見した。特に、ＦＯＩのＦＧループで認められる長さより少なくとも１つのアミノ酸長分短い非天然変異ＦＧループを含むＴｎ３足場は、強化された安定性を有することが示されている。ある特定の実施形態では、本発明の足場は、ヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインのＦＧループより少なくとも１つのアミノ酸残基分が短い非天然変異体ＦＧループを含む。
特定的な実施形態では、Ｔｎ３足場の安定性は、ＦＧループの少なくとも１つのアミノ酸の欠失により強化される。別の実施形態では、Ｔｎ３足場の安定性は、少なくとも１つ、または少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも７つ、または少なくとも８つ、または少なくとも９つ、または少なくとも１０のＦＧループ中のアミノ酸の欠失により強化されうる。安定化Ｔｎ３足場は、少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合を含んでもよいことが特に意図されている。
ある特定の実施形態では、Ｔｎ３足場変異体は、また、長さおよび／または配列に関してランダム化された少なくとも１つのループ（すなわち、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、および／またはＦＧ）を含む。Ｔｎ３足場変異体は、少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合を含んでもよいことが、特に意図される。
特定の実施形態では、Ｔｎ３足場変異体は、少なくとも１つの、または少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも７つ、または少なくとも８つ、または少なくとも９つ、または少なくとも１０だけ野生型Ｔｎ３足場のＦＧループより短いアミノ酸残基のＦＧループを含み、Ｔｎ３足場変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む。
安定性の測定
単離された多量体足場またはその一部としての本発明の安定化ＦｎＩＩＩ足場の安定性の増加は、当技術分野でよく知られた技術、例えば、熱（Ｔｍ）および不安定化変性（例えば、尿素、またはグアニジン塩での処理）、プロテアーゼ処理（例えば、サーモリシンでの処理）またはタンパク質の安定性測定のために技術的に受け入れられた別の方法により容易に測定可能である。タンパク質の安定性測定に使用される技術の包括的考察は、ｃａｎｂｅｆｏｕｎｄ、例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」および「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ」ｂｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ．２００７、で見付けることができる。
多量体足場
本発明の一態様では、タンデムに連結された少なくとも２つの本発明のＴｎ３単量体足場を含む多量体足場が提供される。このような多量体足場は、複数の形態に構築することができる。一部の実施形態では、Ｔｎ３単量体足場は、直鎖状形式で構築され、また、他の実施形態では、足場は、分岐形式で構築される（例えば、図１参照）。特定的な態様では、本発明は多量体足場を提供し、少なくとも２つのＴｎ３足場がペプチドリンカーを介してタンデムに連結される。一部の実施形態では本発明の多量体足場中の各Ｔｎ３足場はＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合し、第２のＴｎ３足場は、異なる標的に結合し、それにより複数の機能を示し、および／または同じ標的に結合し、それにより標的結合の結合価および／またはアビディティ、標的の他の作用、を高める。一部の実施形態では、複数の足場が同じ標的に結合する場合に標的結合の結合価および／またはアビディティの増加が達成される。一部の実施形態では、結合価の増加により、標的に対する特定の作用、例えば、標的タンパク質の二量体化の増加作用が改善される。
特定的な実施形態では、本発明の多量体足場は、タンデムに連結された少なくとも２つの本発明のＴｎ３足場を含み、各Ｔｎ３足場は、少なくとも１つの標的に結合し、各Ｔｎ３足場は、複数のループ領域に結合した複数のベータ鎖を含み、少なくとも１つのループは、野生型Ｔｎ３ドメインの同種のループの非天然変異体である。
多量体タンデム足場
一実施形態では、本発明の多量体足場は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはそれを超える数の本発明のＴｎ３単量体足場を含む。一部の実施形態では、一部のＴｎ３単量体足場がタンデムに連結される。さらに別の実施形態では、一部のＴｎ３単量体足場がタンデムに連結され、一部のＴｎ３単量体足場は、タンデムに連結されない。特定的な実施形態では、本発明の多量体足場は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはそれ超のタンデムに連結された本発明の足場を含む（例えば、図１および図２参照）。
一実施形態では、多量体足場は、Ｔｎ３単量体足場間の共有結合を介して、例えば、直接Ｔｎ３足場を連結することにより、またはリンカー、例えば、ペプチドリンカーを組み込む事により、生成される。特定の例では、共有結合足場は、Ｔｎ３単量体足場をコードする融合遺伝子を構築することにより、あるいは、システイン残基のコドンを単量体Ｔｎ３足場中へ操作して、発現産物間でジスルフィド結合形成を可能とすることにより、生成される。
一実施形態では、本発明の多量体足場は、いかなる介在アミノ酸の追加をも必要とせず、相互に直接連結される少なくとも２つのＴｎ３足場を含む。別の実施形態では、本発明の多量体足場は、リンカー、例えば、ペプチドリンカー経由でタンデムに連結されている少なくとも２つのＴｎ３足場を含む。特定的な実施形態では、本発明の多量体足場は、ペプチドリンカーを介して連結されている少なくとも２つのＴｎ３足場を含み、ペプチドリンカーは、１〜約１０００、または１〜約５００、または１〜約２５０、または１〜約１００、または１〜約５０、または１〜約２５のアミノ酸を含む。特定的な実施形態では、本発明の多量体足場は、ペプチドリンカーを介してタンデムに連結されている少なくとも２つのＴｎ３足場を含み、ペプチドリンカーは、１〜約２０、または１〜約１５、または１〜約１０、または１〜約５のアミノ酸を含む。
特定的な実施形態では、本発明の多量体足場は、リンカー、例えば、ペプチドリンカーを介してタンデムに連結されている少なくとも２つのＴｎ３足場を含み、リンカーは、官能性成分である。官能性成分は、目的の多量体足場の機能および／または特性に基づき選択される。例えば、精製に有用な官能性成分（例えば、ヒスチジンタグ）は、リンカーとして使用可能である。リンカーとして使用可能な官能性成分には、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、細胞傷害剤、放射性核種、造影剤、ビオチン、二量体化ドメイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはそのＦｃＲｎ結合部分、抗体ドメインまたは断片、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、ＩｇＧ分子、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非Ｔｎ３足場、エピトープタグ、組換え型ポリペプチドポリマー、サイトカイン、等が含まれる。リンカーとして使用可能な特定のペプチドリンカーおよび官能性成分は、下記に開示される。
一部の実施形態では、多量体Ｔｎ３足場は、１つまたは複数のリンカーを介して連結されている少なくとも２つのＴｎ３足場を含み、各Ｔｎ３足場間に挟まれたリンカーは、同一のリンカーであっても、または異なるリンカーであってもよい。一部の実施形態では、リンカーは、複数のリンカーを含むことができ、これらは、同一のリンカーでも異なるリンカーでもよい。一部の実施形態では、複数のリンカーが鎖状に連結される場合、一部または全部のリンカーが官能性成分であってよい。
多量体足場結合化学量論
一部の実施形態では、多量体Ｔｎ３足場は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２に対し特異的な足場を含む。他の実施形態では、本発明の多量体足場は、異なるエピトープに対し特異的な足場を含み、異なるエピトープは、ＴＲＡＩＬ Ｒ２上のまたは異なる標的上の異なるエピトープであり得る。
特定的な実施形態では、多量体Ｔｎ３足場は、同じＴＲＡＩＬ Ｒ２上の２つ以上の異なるエピトープ（例えば、非重複エピトープ）に結合する。別の特定的な実施形態では、多量体Ｔｎ３足場は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２上の２つ以上の異なるエピトープに結合する。さらに別の特定的な実施形態では、多量体Ｔｎ３足場は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２上の２つ以上の異なるエピトープに結合し、さらに、１つまたは複数の異なる標的分子上の少なくとも１つのエピトープに結合する。さらに別の特定的な実施形態では、多量体Ｔｎ３足場は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２二量体上の同じエピトープに結合する。さらに別の実施形態では、多量体Ｔｎ３足場は、少なくとも２つのＴＲＡＩＬ Ｒ２分子上の同じエピトープに結合する。特定の実施形態では、多量体Ｔｎ３足場は、隣接する細胞表面のＴＲＡＩＬ Ｒ２分子の２つ以上のコピー上の同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、多量体Ｔｎ３足場は、同じまたは異なる結合親和性および／またはアビディティで、ＴＲＡＩＬ Ｒ２または異なる標的上の同じエピトープまたは異なるエピトープに結合することができる。
別の実施形態では、多量体Ｔｎ３足場中の単量体足場は、所望の標的に対する作用、例えば、標的の二量体化を（例えば、相乗的に）達成する、または強化するように作られた特異的結合パターンに従ってＴＲＡＩＬ Ｒ２の１つまたは複数のコピー上のエピトープに結合することができる。例えば、直鎖多量体足場中のＴｎ３足場は、ある特定のパターンに従って単一ＴＲＡＩＬ Ｒ２または複数ＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合できる。例えば、６モジュール直鎖多価性足場中のＴｎ３足場は、２つのＴＲＡＩＬ Ｒ２標的ＡとＢに、ＡＡＡＢＢＢパターン、ＡＡＢＢＡＡパターン、ＡＢＡＢＡＢパターン、ＡＡＡＡＢＢパターン、等に従って結合でき；３つの標的に、ＡＡＢＢＣＣパターン、ＡＢＣＡＢＣパターン、およびＡＢＣＣＢＡパターン、等に従って、結合でき；４つの標的に、ＡＢＣＤＤＡパターン、ＡＢＣＡＤＡパターン、等に従って結合できる；等である。さらに、本発明の多量体足場が、複数の操作された（例えば、ジスルフィド操作された、ループ操作された、またはジスルフィドおよびループ両方の操作された）および操作されていない足場を含む場合、このような単量体足場は、ある特定のパターンに従って配置され、ある特定の生物学的効果を達成する、または強化することができる。単量体Ｔｎ３足場のこのような組み合わせは、コンビナトリアルケミストリー的に組み立てられ、その後、当技術分野で既知の方法を使って評価できる。
一部の実施形態では、分岐構築物中の多量体Ｔｎ３足場、例えば、Ｆｃ融合体または抗体様形式の多量体足場は、ある特定のパターンに従って単一ＴＲＡＩＬ Ｒ２または複数のＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合できる。例えば、特定の実施形態では、抗体様形式Ｔｎ３多量体足場中のＩｇＧ重鎖に融合した直鎖形式Ｔｎ３足場は、第１の標的に結合でき、一方、抗体様形式足場中のＩｇＧ軽鎖に融合した多価性のＴｎ３直鎖足場は、第２の標的に結合できる。別の実施形態では、抗体様形式Ｔｎ３足場のＩｇＧ重鎖に融合した直鎖形式Ｔｎ３足場は、特定の親和性で標的に結合でき、一方、抗体様形式足場のＩｇＧ軽鎖に融合した直鎖形式足場は、異なる親和性で同じ標的に結合できる。一部の実施形態では、抗体の「Ｙ」の左アーム中の鎖に融合したＴｎ３足場は、第１の標的に結合することができ、一方、抗体の「Ｙ」の右側の鎖に融合したＴｎ３足場は、第２の標的に結合することができる。
融合体
本発明は、少なくとも２つのＴｎ３単量体足場を含む多量体Ｔｎ３足場をさらに提供し、少なくとも１つのＴｎ３単量体足場が異種の成分に融合可能である。これに関連して、異種の成分は、スペーサーとして足場の連結に使用されないが、多量体Ｔｎ３足場に追加の機能性を与えることができ得る。例えば、一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合する多量体Ｔｎ３足場を細胞傷害剤に融合して、標的特異的細胞殺滅を促進できる。一部の実施形態では、異種の成分は、リンカーとして機能できる。
本発明は、１つまたは複数の異種の成分にコンジュゲートした、または融合した多量体Ｔｎ３足場の使用を包含し、異種の成分には、限定されないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣薬）、合成薬剤、無機分子、および有機分子が含まれる。本発明は、異種のタンパク質またはポリペプチドまたはその断片に組換えにより融合した、または化学的にコンジュゲートした多量体Ｔｎ３足場の使用を包含する。コンジュゲーションには、共有結合および非共有結合によるコンジュゲーションの両方が含まれる。一部の実施形態では、多量体Ｔｎ３足場は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも５００、または少なくとも１０００アミノ酸のポリペプチドに融合、または化学的にコンジュゲートして、融合タンパク質を生成可能である。
多量体Ｔｎ３足場の１つまたは複数の異種の成分に対する融合またはコンジュゲートは、直接、すなわち、Ｔｎ３足場と異種の成分の間にリンカー無しで、または、１つまたは複数の本明細書記載のリンカー配列を介してであり得る。一部の実施形態では、足場は、インビトロでまたはインビボで、Ｔｎ３足場を標的細胞、例えば、ＴＲＡＩＬ Ｒ２中の特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に融合またはコンジュゲートすることにより、異種のポリペプチドに特定の細胞型を標的にさせるのに使用できる。異種のポリペプチドに融合またはコンジュゲートした多量体Ｔｎ３足場は、また、当技術分野で既知の方法を使ったインビトロイムノアッセイおよび精製法に使用可能である。例えば、国際公開第９３／２１２３２号；欧州特許第４３９、０９５号；Ｎａｒａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９、１９９４；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２、１９９２；およびＦｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２、１９９１、を参照のこと。これらは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、多量体Ｔｎ３足場は、限定されないが、ＩｇＧ（Ｆｃ）の定常領域、等の免疫グロブリンまたはそのドメインに、例えば、ＮまたはＣ末端を介して、足場を融合またはコンジュゲートすることにより、ヒト免疫応答に組み込むことができる。同様に、足場と補体タンパク質、例えば、ＣＩｑの間の融合体は、細胞を標的化するのに使用可能である。多量体Ｔｎ３足場と毒素の間の融合体は、本明細書記載のように特定の抗原を含む細胞を特異的に破壊するのに使用可能である。
種々の出版物には、ＦｃＲｎ結合親和性が保存されているが、他のＦｃ受容体に対する親和性は大きく低下している抗体と分子を融合することにより（例えば、国際公開第９９／４３７１３号参照）、または分子を抗体のＦｃＲｎ結合ドメインと融合することにより（例えば、国際公開第００／０９５６０号；米国特許第４，７０３，０３９０号参照）、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドの分子中へ導入して、半減期を変更できる生理学的に活性な分子を得る方法に関し記載されている（例えば、国際公開第９７／４３３１６号；米国特許第５，８６９，０４６号；同５，７４７，０３５号；国際公開第９６／３２４７８号；および同９１／１４４３８号を参照）。生理的に活性な分子の半減期を延長する具体的な技術と方法は、また、米国特許第７，０８３，７８４号で見付けることができる。特に、多量体Ｔｎ３足場は、ＩｇＧ由来のＦｃ領域に融合でき、Ｆｃ領域は、アミノ酸残基変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６ＥまたはＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ／Ｙ４３６Ｈ（アミノ酸位置はＫａｂａｔナンバリングスキームに従い命名）を含むことが意図されている。一部の実施形態では、多量体Ｔｎ３足場の半減期は、多価Ｔｎ３足場を本質的に不定形の組換え型ポリペプチド（例えば、ＸＴＥＮ（商標）ポリペプチド）と遺伝的に融合することにより、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とコンジュゲートすることにより、延長できる。
一部の実施形態では、多量体Ｔｎ３足場は、インビボ、または血清半減期を増加または延長する分子と融合できる。一部の実施形態では、足場は、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、その新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合断片、ＰＥＧ、多糖類、抗体、補体、ヘモグロビン、結合ペプチド、リポタンパク質および血流中および／またはその組織浸透中のその半減期を増大させる他の因子に融合またはコンジュゲートされる。これらのいずれの融合体も、標準的な方法、例えば、公に利用可能な遺伝子配列を使って構築された組換え型融合体遺伝子由来の融合タンパク質の発現により、生成可能である。
さらに、本発明の足場は、マーカー配列、例えば、精製促進用ペプチドに融合できる。一部の実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、ポリヒスチジンペプチド（Ｈｉｓタグ）、例えば、他のベクターも多くが市販されている中で、ｐＱＥ発現ベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ、９１３１１）中に提供されるタグのようなオクタヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−８−ｔａｇ）またはヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−６−ｔａｇ）がある。Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４、１９８９、に記載のように、例えば、ポリヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製法を提供する。精製に有用な他のペプチドタグには、限定されないが、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する赤血球凝集素（「ＨＡ」）タグ（例えば、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ３７：７６７、１９８４を参照）、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、ＧＦＰタグ、ＡＵ１タグ、ＡＵ５タグ、ＥＣＳタグ、ＧＳＴタグ、またはＯＬＬＡＳタグが含まれる。
本発明の足場を含むさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エキソンシャフリング、および／またはコドンシャフリング（まとめて「ＤＮＡシャフリング」と呼ばれる）の技術により生成可能である。
ＤＮＡシャフリングは、標的に対するＴｎ３足場の作用を変えるために（例えば、高い親和性と低い解離速度を有する足場、またはＴＲＡＩＬ Ｒ２を二量体化する能力を高めた足場を生成するために）採用できる。Ｔｎ３足場は、変異性ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または組換え前の他の方法を使ってランダム変異誘発を受けることにより改変できる。特異的標的に結合する、足場をコードするポリヌクレオチドの１つまたは複数の部分は、１つまたは複数の異種の分子の１つまたは複数の成分、モチーフ、断片、部分、ドメイン、断片、等と組換え可能である。
抗体様多量体足場
一部の実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも２つのＴｎ３足場を含み、少なくとも１つのＴｎ３足場は、限定されないが、無傷抗体、抗体可変ドメイン、ＣＨｌドメイン、Ｃカッパドメイン、Ｃラムダドメイン、Ｆｃドメイン、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメイン、を含む抗体（例えば、ＩｇＧ）のドメインまたは断片に融合されている。
一部の実施形態では、Ｔｎ３足場は、抗体のドメインまたは断片に融合可能である。抗体のドメインまたは断片は、下記のＦｃドメインと同様に、本発明の多量体足場の形成を促進する二量体化または多量体化ドメインを提供することにより多量体足場のアビディティおよび／または親和性をさらに増強できる。さらに、抗体のドメインまたは断片は、標的に対する足場の作用をさらに、例えば、より効率的に標的の二量体化または多量体化を行う、等の増強をすることができる。
一部の実施形態では、２つのＴｎ３ドメインを含むただ１つの多量体Ｔｎ３タンデム足場が抗体のドメインまたは断片にコンジュゲートまたは融合される。例えば、単一多量体タンデム足場が、抗体のドメインまたは断片（例えば、抗体の重鎖または軽鎖）のポリペプチドのＮ末端に融合できる。一部の実施形態では、多量体Ｔｎ３足場が、１つまたは複数のＦｎＩＩＩ足場を、抗体のドメインまたは断片（例えば、抗体の重鎖および／または軽鎖）のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に融合またはコンジュゲートすることにより生成される。一部の実施形態では、抗体のドメインまたは断片に融合した一部または全部のＴｎ３足場は、同一である。一部の他の実施形態では、抗体のドメインまたは断片に融合した一部のまたは全部のＴｎ３足場は、異なる。
一部の実施形態では、抗体様多価性のＴｎ３足場生成用に使用するタンデムＴｎ３足場は、同じ数のＴｎ３モジュールを含んでもよい。他の実施形態では、抗体様多価性のＴｎ３足場生成用に使用するタンデムＴｎ３足場は、異なる数のＴｎ３モジュールを含んでもよい。例えば、四価のＴｎ３足場は、例えば、直鎖型四価のＴｎ３足場を単一位置に融合することにより、または１つのＴｎ３単量体足場を１つの位置および３量体直鎖型Ｔｎ３足場を別の位置に融合することにより、または２つの２量体Ｔｎ３直鎖型足場を２つの異なる位置に融合することにより、または４つのＴｎ３単量体足場をそれぞれ単一位置に融合することにより、形成可能である。
特定的な実施形態では、本発明の多量体Ｔｎ３足場は、抗体のドメインまたは断片に融合した４つの多量体直鎖Ｔｎ３足場を含み、各多量体直鎖Ｔｎ３足場は、リンカーを介してタンデムに連結している２つのＴｎ３単量体足場を含む（図１）。他の実施形態では、本発明の多量体Ｔｎ３足場は、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つのまたは少なくとも８つの抗体のドメインまたは断片に融合した本発明の単量体または多量体Ｔｎ３足場を含む。
一特定的な実施形態では、四価のＴｎ３足場は、１つのＴｎ３足場を抗体のドメインまたは断片のそれぞれの軽鎖および重鎖のＮ末端に融合することにより生成できる（例えば、図２のＡ９構築物参照）。
抗体様形式の多価性Ｔｎ３足場は、Ｔｎ３足場の任意の組み合わせを抗体のドメインまたは断片または改変抗体に融合することにより生成できる。改変抗体の例には、ドメイン欠失した抗体、ミニボディ、（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号参照）、四価ミニボディ、四価抗体（例えば、Ｃｏｌｏｍａ ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１５９−１６３、１９９７；国際公開第９５／０９９１７号参照）、熱安定化抗体、ヒト化抗体、等が含まれる。
図１に従って抗体様多価性Ｔｎ３足場の生成に使用されるそれぞれの本発明の直鎖Ｔｎ３足場は、同じリンカーおよびリンカー分布、または異なるリンカーおよび異なるリンカー分布を含んでもよい。
Ｆｃ融合多量体足場
一部の実施形態では、本発明の多量体Ｔｎ３足場はＦｃドメインに結合した複数の単量体または多量体Ｔｎ３足場を含む。本発明の多量体Ｔｎ３足場のＦｃドメインを含む抗体断片への融合体は、多量体Ｔｎ３足場の二量体の形成を促進する二量体化ドメインを提供することにより、多量体ＦｎＩＩＩ足場のアビディティおよび／または活性をさらに増強する。
一部の実施形態では、ただ１つの多量体Ｔｎ３足場がＦｃドメインに融合される。特定的な実施形態では、本発明の多量体Ｔｎ３足場は、Ｆｃドメインに融合した２つの多量体Ｔｎ３足場を含み、各多量体Ｔｎ３足場は、１つまたは複数のリンカーを介して連結された２つ以上のＴｎ３足場を含む（図１）。一特定的な実施形態では、Ｆｃドメインに融合した多量体Ｔｎ３足場は、直鎖形式足場である。
一特定的な実施形態では、２つのタンデムＴｎ３ドメインを含む２つの直鎖形式Ｔｎ３足場は、Ｆｃドメインに融合され、結合価４を有する多量体Ｔｎ３足場が生成する（例えば図２のＡ７構築物参照）。別の特定的な実施形態では、２つの直鎖形式足場で、４つのＴｎ３単量体足場を含むそれぞれがＦｃドメインに融合されて、結合価８の多量体Ｔｎ３足場が生成する（例えば、図２のＡ８構築物参照）。
一部の実施形態では、Ｆｃドメインに融合されたＴｎ３足場は、同じ数のＴｎ３モジュールを含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメインに融合されたＴｎ３足場は、異なる数のＴｎ３モジュールを含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメインに融合されたＴｎ３足場は、同じリンカーを含む。他の実施形態では、Ｆｃドメインに融合されたＴｎ３足場は、異なるリンカーを含む。
一部の実施形態では、異なる本発明の多量体Ｔｎ３足場が、ヘテロ二量体の形成を助けるＦｃドメイン変異の使用により二量体化できる。Ｆｃ領域の変異体（例えば、アミノ酸置換および／または付加および／または欠失）は、抗体のエフェクター機能を強化または低下させ、また、抗体の薬物動態学的特性（例えば、半減期）を変えることができることが当技術分野で知られている。従って、特定の実施形態では、本発明の多選択性Ｔｎ３足場は、改変されたＦｃ領域を含むＦｃドメインを含み、１つまたは複数の変化がＦｃ領域で作られて、多量体Ｔｎ３足場の機能的および／または薬物動態学的特性を変える。
エフェクター機能および／または抗炎症性活性を増加、または減少させるようにＦｃ領域のグリコシル化を修飾できることも知られている。従って、一実施形態では、本発明の多量体ＦｎＩＩＩ足場のＦｃ領域は、アミノ酸残基の改変されたグリコシル化を含み、多量体足場の細胞傷害性および／または抗炎症性特性が変えられる。
多量体足場トポロジー
当業者なら、上記図１、図２で、および本明細書全体で考察される多量体足場は、単に説明用の例であることをわかるであろう。図１と図２で示す構築物トポロジーまたは形式は、一部の実施形態では、本発明の足場がＦｃドメインおよび抗体のポリペプチド成分のＮ末端に融合されることを示している。本発明の足場は、任意の適切な空間配置のＦｃドメイン、抗体軽鎖、および抗体重鎖のＣ末端に融合可能である。例えば、一部の実施形態では、四価の足場は、ＦｎＩＩＩ単量体足場を抗体の各重鎖のＮ末端およびＦｎＩＩＩ単量体足場を各軽鎖のＣ末端ドメインに融合させることにより、ＦｎＩＩＩ単量体足場を抗体の各軽鎖のＮ末端およびＦｎＩＩＩ単量体足場を各重鎖のＣ末端に融合することにより、またはＦｎＩＩＩ単量体足場を抗体の各重鎖のＮ末端およびＦｎＩＩＩ単量体足場を各軽鎖のＮ末端に融合させることにより、作成できる。単量体および／または多量体ＦｎＩＩＩ足場は、可変領域および定常領域の両方を含む完全長重鎖および／または軽鎖に融合できる。あるいは、ＦｎＩＩＩ単量体および／または多量体足場は、定常領域のみを含む切断型重鎖および／または軽鎖に融合できる（例えば、図２のＡ９構築物、等）。
多量体Ｔｎ３足場は、図１に示す形式を構成単位として使って、作成できる。例えば、抗体様およびＦｃ融合体形式は、より単純な直鎖形式Ｔｎ３モジュールを含む組み合わせである。従って、一部の実施形態では、図１の構成単位を組み合わせて、さらに複雑な多量体Ｔｎ３足場形式を作成できる。
図１と２は、また、一部の実施形態で、多量体Ｔｎ３足場は、直鎖でも、分岐でもよく、異なるレベルの分岐を示してもよいことを示している。例えば、Ｆｃ形式は、一次分岐形式の一例を提供し、一方、抗体様形式は、二次分岐形式の一例を提供する。より高次の分岐構築物は、抗体様形式またはＦｃ融合体形式中の直鎖形式構成単位をＦｃ融合体形式構成単位または抗体様構成単位で置き換え、それらをＦｃまたは抗体のポリペプチド成分のＣ末端またはＮ末端に連結することにより得られる。
図１と２、および表１は、一部の実施形態では、多量体Ｔｎ３足場中のリンカーは、構造的に、および機能的に多様であってよく、複数の結合点を提供することができるという事実を示している。例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２ＧｌｙＴｈｒＧｌｙＳｅｒＡｌａＭｅｔＡｌａＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１Ａｌａリンカーにより連結されている第４および第５ Ｔｎ３モジュールを除いて、Ａ４およびＡ５構築物中の全てのＴｎ３モジュールは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３Ａｌａリンカーにより連結されている。例えば、Ａ７構築物では、第１と第２Ｔｎ３ドメインおよび第３と第４Ｔｎ３ドメインは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３Ａｌａリンカーにより連結されており、一方、第２と第３Ｔｎ３ドメインは、官能性成分リンカーとしてＦｃドメインにより連結されている。
図１のＦｃ融合体は、一部の実施形態では、単量体または多量体Ｔｎ３足場は、官能性成分リンカーのポリペプチドのＮ末端に融合できることを例示している。一部の実施形態では、本発明の単量体または多量体Ｔｎ３足場は、Ｆｃ融合体形式の構築物中のＦｃドメインのＣ末端に容易に融合できる。
同様に、抗体様形式構築物中の抗体または改変抗体は、また、官能性成分リンカーでもある。この事例では、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３Ａｌａもしくは（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）２ＧｌｙＴｈｒＧｌｙＳｅｒＡｌａＭｅｔＡｌａＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１Ａｌａの場合のような２つの結合点の代わりに、またはＦｃドメインの場合のような４つの可能な結合点の代わりに、図１の抗体様の例に示される抗体は、６つの可能な結合点を提供する。図１の抗体様形式は、一部の実施形態では、官能性成分リンカー中のＮ末端結合点のみが、Ｔｎ３足場により結合されることを例示している。抗体様形式構築物では、一部または全部の本発明のＴｎ３足場が、抗体または改変抗体ドメインの重鎖および軽鎖のＣ末端に容易に融合できる。他の場合も融合化学量論が適用でき、すなわち、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはそれを超える数の本発明のＴｎ３足場を、抗体または改変抗体に融合できる。
図１と２は、また、一部の実施形態では、多量体Ｔｎ３足場は、他のＴｎ３多量体足場を組み合わせることにより生成できることを示している。例えば、図２のＦｃ形式Ａ６、Ａ７、およびＡ８足場は、多量体Ｔｎ３足場が２つのポリペプチド鎖で形成されているホモ２量体Ｔｎ３足場であり、ポリペプチド鎖はそれぞれＦｃドメインに融合した直鎖形式Ｔｎ３足場を含み、それらは次いで分子間ジスルフィド結合を介して連結される。図１と２の抗体様足場は、ヘテロテトラマーＴｎ３足場の例であり、２つの異なる型の足場（Ｔｎ３単量体足場をＩｇＧ軽鎖定常領域に融合して形成された２つのＴｎ３足場、およびＴｎ３単量体足場をＩｇＧのＣＨ１−ヒンジ領域−Ｆｃ領域に融合することにより形成された２つのＴｎ３足場）に対応する４つのポリペプチドが分子間ジスルフィドを介して連結されている。
本発明の足場の生成
本明細書記載のＴｎ３足場は、新しいまたは改良された標的結合タンパク質を進化させるいずれの技術においても使用可能である。一特定例では、標的は、固体支持体、例えば、カラム樹脂またはマイクロタイタープレートウエル、上に固定され、標的は、候補足場に基づいた結合タンパク質のライブラリーと接触させられる。このようなライブラリーは、ＣＤＲ様ループの配列および／または長さのランダム化を使ってＴｎ３足場から構築されたクローンから構成できる。
この点については、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、よく知られた技術の１つであり、大きなオリゴペプチドライブラリーを選別し、標的に特異的に結合することができるこれらのライブラリーのメンバーを特定することを可能とする。ファージディスプレイは、バクテリオファージ粒子表面のコートタンパク質への融合体として、変異体ポリペプチドが提示される技術である（Ｓｃｏｔｔ、Ｊ．Ｋ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ、Ｇ．Ｐ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６）。バイオインフォマティクス手法は、天然ＦｎＩＩＩドメインのループ長さおよび多様性の優先傾向を測定するために使用可能である。この分析を使って、ループ長さおよび配列多様性に対する優先傾向を、「制限されたランダム化」手法の開発に採用できる。この制限されたランダム化では、相対的ループ長さおよび配列の優先傾向が、ライブラリー戦略の開発に組み込まれる。ループ長さおよび配列多様性分析をライブラリー開発に一体化することが、制限されたランダム化（すなわち、アミノ酸が入ることができるランダム化ループ内の特定の位置が限定されている）につながる。
本発明は、また、本発明の非天然Ｔｎ３足場の多様な集団を含む組換え型ライブラリーを提供する。一実施形態では、ライブラリーは、複数のループ領域に連結した複数のベータ鎖ドメインを含む非天然Ｔｎ３足場を含み、１つまたは複数の前記ループが、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換または付加により変化する。特定的な実施形態では、ライブラリーは、野生型Ｔｎ３足場由来のＴｎ３足場を含む。
上で詳細に説明したように、足場の種々のベータ鎖を連結するループは、長さおよび／または配列多様性に関しランダム化できる。一実施形態では、本発明のライブラリーは、長さおよび／または配列多様性に関しランダム化されている少なくとも１つのループを有するＴｎ３足場を含む。一実施形態では、Ｔｎ３足場の少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つのまたは少なくとも６つのループが、長さおよび／または配列多様性に関してランダム化されている。一実施形態では、少なくとも１つのループが、一定に保持され、一方、少なくとも１つの追加のループが、長さおよび／または配列多様性に関してランダム化されている。別の実施形態では、ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦの内の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てが一定に保持され、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧの内の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てが長さまたは配列多様性に関しランダム化されている。別の実施形態では、ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦの内の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つ全てがランダム化され、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧの内の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つ全てが長さおよび／または配列多様性に関してランダム化されている。
ＦＯＩのＦＧループ中のものより、少なくとも１つのアミノ酸分短い長さのＦＧループが、安定性の増加を示すということを発見した。従って、本発明は、Ｔｎ３足場を含むライブラリーを提供し、ここで、ＦＧループの長さが少なくとも１つのアミノ酸分だけ、１０アミノ酸残基を含むヒトテネイシンＣの第３ＦｎＩＩＩドメインの同種のＦＧループよりも短く保持されていることを除いて、少なくとも１つのループが長さおよび／または配列多様性に関しランダム化される。一部の実施形態では、本発明のライブラリーは、Ｔｎ３足場を含み、各足場は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと命名された、６つのループ領域に結合した７つのベータ鎖を含み、ループ領域は、各ベータ鎖を連結し、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧと命名されている；また、少なくとも１つのループは、野生型Ｔｎ３足場ループの非天然変異体であり、ＦＧループは、野生型Ｔｎ３足場の同種のループよりも少なくとも１つのアミノ酸分短い。
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーは、ＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖は、配列番号４２を含み、Ｂベータ鎖は配列番号４３を含み、Ｃベータ鎖は配列番号４５を含み、Ｄベータ鎖は配列番号４６を含み、Ｅベータ鎖は配列番号４７を含み、Ｆベータ鎖は配列番号４９を含み、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５２を含む。
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖は配列番号４２からなり、Ｂベータ鎖は配列番号４３からなり、Ｃベータ鎖は配列番号４５からなり、Ｄベータ鎖は配列番号４６からなり、Ｅベータ鎖は配列番号４７からなり、Ｆベータ鎖は配列番号４９からなり、さらに、Ｇベータ鎖は配列番号５２からなる。
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩ足場を含み、Ａベータ鎖は本質的に配列番号４２からなり、Ｂベータ鎖は本質的に配列番号４３からなり、Ｃベータ鎖は本質的に配列番号４５からなり、Ｄベータ鎖は本質的に配列番号４６からなり、Ｅベータ鎖は本質的に配列番号４７からなり、Ｆベータ鎖は本質的に配列番号４９からなり、さらに、Ｇベータ鎖は本質的に配列番号５２からなる。
上で詳細に説明したように、ループ内の１つまたは複数の残基が一定に保持でき、一方、他の残基は、長さおよび／または配列多様性に関してランダム化される。任意選択で、または、代わりに、ループ内の１つまたは複数の残基が、所定の、限られた数の異なるアミノ酸に限定でき、一方、他の残基は、長さおよび／または配列多様性に関してランダム化される。従って、本発明のライブラリーは、縮重したコンセンサス配列および／または１つまたは複数の不変のアミノ酸残基を有する１つまたは複数のループを含むことができるＴｎ３足場を含む。
別の実施形態では、本発明のライブラリーは、ＢＣループを有するＴｎ３足場を含み、このループはランダム化された次のコンセンサス配列を有する：Ｓ−Ｘ−ａ−Ｘ−ｂ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、（ａ）は、プロリンまたはアラニンを表し、また、（ｂ）は、アラニンまたはグリシンを表す。別の実施形態では、本発明のライブラリーは、ＢＣループを有するＴｎ３足場を含み、このループはランダム化された次のコンセンサス配列を有する：Ｓ−Ｐ−ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｔ−Ｇ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、また、（ｃ）は、プロリン、セリンまたはグリシンを表す。さらに別の実施形態では、本発明のライブラリーは、ＢＣループを有するＴｎ３足場を含み、このループはランダム化された次のコンセンサス配列を有する：Ａ−ｄ−Ｐ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ｅ−ｆ−Ｘ−Ｉ−Ｘ−Ｇ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、（ｄ）は、プロリン、グルタメートまたはリシンを表し、（ｅ）は、アスパラギンまたはグリシンを表し、また、（ｆ）は、セリンまたはグリシンを表す。
一実施形態では、本発明のライブラリーは、ＤＥループを有するＴｎ３足場を含み、このループはランダム化された次のコンセンサス配列を有する：Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表す。
一実施形態では、本発明のライブラリーは、ＦＧループを有するＴｎ３足場を含み、このループはランダム化された次のコンセンサス配列を有する：Ｘ−ａ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ｂ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、（ａ）は、アスパラギン、トレオニンまたはリシンを表し、また、（ｂ）は、セリンまたはアラニンを表す。別の実施形態では、本発明のライブラリーは、ＦＧループを有するＦｎＩＩＩ足場を含み、このループはランダム化された次のコンセンサス配列を有する：Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（Ｘ９）、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表す。
特定的な実施形態では、本発明のライブラリーは足場を含み、その足場は、アミノ酸配列：ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＣＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＤＬ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＥＶＳＬＩＣ（ＸＦＧ）ｎＫＥＴＦＴＴ、を含み、ここで、ＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、それぞれ、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループ中に存在するアミノ酸残基を表し、Ｘ１は、アミノ酸残基ＡまたはＴを表し、また、ｎ＝２〜２６およびｍ＝１〜９である。
本発明は、本発明のライブラリー、本発明のライブラリーを選別することにより、標的、例えば、ＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合し、野生型Ｔｎ３足場に比較して増加した安定性または標的、例えば、ＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する改良された作用を有する組換え型Ｔｎ３足場を特定する方法をさらに提供する。
ある特定の実施形態では、野生型Ｔｎ３足場に比べて増加したタンパク質安定性を有し、特異的に標的に結合する組換え型Ｔｎ３足場を特定する方法は、以下を含む：
ａ．足場：標的リガンド複合体形成に適切な条件下、標的リガンドを本発明のライブラリーと接触させる；
ｂ．その複合体から標的リガンドに結合する足場を得る；
ｃ．ステップ（ｂ）で得られた足場の安定性が野生型Ｔｎ３足場のそれより大きいかどうかを測定する。
同じ方法を使って、標的に対し改善された結合親和性、アビディティ、等を有する組換え型Ｔｎ３足場を特定することができる。一実施形態では、ステップ（ａ）で、本発明の足場ライブラリーを固定化標的と共にインキュベートする。一実施形態では、ステップ（ｂ）で、足場：標的リガンド複合体を洗浄して非特異的結合物質（ｂｉｎｄｅｒ）を除去し、最も強固な結合物質を極めてストリンジェントな条件で溶出し、ＰＣＲにかけて配列情報を取り出す。ステップ（ｂ）で得られた結合物質および／または配列情報は、本明細書に開示の方法または当業者に既知の方法を使って新しいライブラリーの構築に使用可能であり、さらなる配列の変異誘発を行って、または行わないで、選択プロセスを反復するために使用可能できることが特に意図されている。一部の実施形態では、いくつかの選択のラウンドを、抗原に対する充分な親和性を有する結合物質が得られるまで行うことができる。
本発明のさらなる実施形態は、本発明および上述の足場を含むライブラリーをコードする単離核酸分子コレクションである。
本発明の足場は、親和性成熟に供してもよい。この当技術分野で受け入れられたプロセスでは、特定の結合タンパク質が、特定の標的に対する増加した親和性に対して選択されるスキームににさらされる（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５（１１）：６０３７−４２、参照）。結果として得られる本発明の足場は、親和性成熟前の足場と比べて少なくとも同等の大きさの結合特性を示しうる。
本発明は、また、足場：標的複合体を形成するために、標的に結合可能なタンパク質足場のアミノ酸配列を特定する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、以下を含む：ａ）固定された、または分離可能な標的と本発明のライブラリーを接触させる；ｂ）遊離足場から足場：標的複合体を分離する；ｃ）低下した多様性を有することにより、また、標的に結合可能な提示足場の濃縮によって、（ａ）におけるものとは区別される新規ポリペプチドディスプレイライブラリーを生成するために、（ｂ）の分離した足場を複製させる；ｄ）任意選択で、（ａ）、および（ｂ）のステップを（ｃ）の新規ライブラリーを使って、繰り返す；およびｅ）（ｄ）由来の種の提示足場をコードする領域の核酸配列を決定し、それにより、標的に結合できるペプチド配列を推定する。
別の実施形態では、本発明の足場は、ライブラリー選別による特定後に、さらにランダム化できる。一実施形態では、本発明の方法は、本明細書記載の方法を使ってライブラリーから特定された足場の少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つのまたは少なくとも６つのループのさらなるランダム化を含む。別の実施形態では、さらにランダム化された足場が、その後の標的に結合できる足場を特定する方法に供される。この方法は、（ａ）前記さらにランダム化された足場を固定された、または分離可能な標的と接触させること、（ｂ）さらにランダム化された足場：標的複合体を遊離足場から分離すること、（ｃ）（ｂ）の分離された足場の複製をさせるステップで、さらに、任意選択で（ａ）〜（ｃ）ステップを繰り返すこと、および（ｄ）前記さらにランダム化された足場をコードする領域の核酸配列を決定し、それにより、標的に結合できるペプチド配列を推測すること、を含む。
さらなる実施形態では、さらにランダム化された足場は、最初のライブラリーで以前ランダム化されている、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または少なくとも６つのランダム化されたループを含む。別のさらなる実施形態では、さらにランダム化された足場は、最初のライブラリーで以前ランダム化されていない、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または少なくとも６つのランダム化されたループを含む。
本発明は、また、少なくとも１つまたは複数の標的に結合する少なくとも２つのＴｎ３足場を得る方法を提供する。この方法は、協動して特定の応答を誘発するように作用する試薬の選別を可能とする。２つ以上の足場の協動が必要なアゴニスト活性が要求される場合（例えば、限定されないが、ＴＮＦ受容体ファミリーに属する受容体のアゴニズム）、このような選別を使用するのは、好都合であろう。この方法は、多量体複合体を形成するためにライブラリーを再編成することなく協動試薬の選別を可能とする。一実施形態では、本発明の方法は、足場：標的リガンド複合体の形成を可能とする条件下、標的リガンドを本発明のライブラリーと接触させること、前記足場を架橋試薬（少なくとも２つの同じまたは異なる足場を近接近状態に結合させる試薬と定義される）と結合させ、足場の架橋を検出可能な応答を誘発すること、および複合体から、前記標的に結合する足場を得ること、を含む。さらなる実施形態では、架橋試薬は、足場特異的抗体、またはその断片、エピトープタグ特異的抗体、またはその断片、二量体化ドメイン、例えば、Ｆｃ領域、コイルドコイルモチーフ（例えば、これに限定されないが、ロイシンジッパー）、化学架橋剤、または当技術分野で既知の別の二量体化ドメイン、である。
本発明は、また、本発明の足場を利用して、化合物を検出する方法を提供する。ライブラリー選別により得られた足場の結合特異性に基づいて、例えば、診断法のために、このような足場をアッセイに使用し、検体中の特異的標的を検出することが可能である。一実施形態では、化合物の検出方法は、化合物：足場複合体を形成可能とする条件下で、検体中の前記化合物を本発明の足場に接触させること、さらに、前記足場を検出し、それにより、検体中の前記化合物を検出すること、を含む。さらなる実施形態では、足場は、標識（すなわち、放射標識、蛍光、酵素結合または比色標識）して、化合物の検出を促進する。
本発明は、また、本発明の足場を利用して、化合物を捕捉する方法を提供する。ライブラリー選別から得られた足場の結合特異性に基づいて、例えば、精製の目的で検体中の特異的標的を捕捉するために、アッセイ中でこのような足場の使用が可能である。一実施形態では、試料中の化合物の捕捉方法は、化合物：足場複合体の形成を可能とする条件下で、試料中の前記化合物を本発明の足場を接触させること、および前記複合体を検体から取り出し、それにより、前記検体中の前記化合物を捕捉する、を含む。さらなる実施形態では、足場が固定され、化合物：足場複合体の取り出しを促進する。
一部の実施形態では、本発明のライブラリーから単離された足場は、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、またはそれを超える数のランダム化ループを含む。一部の実施形態では、単離足場ループ配列は、ドナー足場から受け側足場の任意のループと入れ替えできる（例えば、ドナー足場由来のＦＧループ配列は受け側足場の任意のループに移すことができる）。特定的な実施形態では、単離ループ配列は、受け側足場の同種のループに移すことができる（例えば、ドナー足場由来のＦＧループ配列は、ＦＧループ位置の受け側足場に移すことができる）。一部の実施形態では、単離ループ配列は、種々の受け手足場とランダムに「組み合わせて（ｍｉｘ ａｎｄ ｍａｔｃｈｅｄ）」使うことができる。
他の実施形態では、単離足場配列は、ループ配列により特定できる。例えば、ライブラリーは、特定の標的に対し選別するために使用され、特異的結合物質のコレクションが単離される。ランダム化ループ配列は、足場背景とは独立して特異的配列として特徴付け出来る（すなわち、標的Ｘに結合する足場で、前記足場は配列番号ＸのＦＧループ配列を含む）。別の代替の実施形態では、足場が標的Ｘに結合する２つのループ配列を示す場合は、ループ配列は、足場配列が無い場合の結合標的Ｘとして特徴付け出来る。言い換えれば、特定の標的に結合するライブラリーから単離された足場は、足場骨格とは独立した標的に結合する可変ループ配列として発現できることが意図されている。この過程は、抗体の可変領域のＣＤＲの概念と類似であろう。
親和性成熟
ＴＲＡＩＬ Ｒ２ Ｔｎ３足場の開発は、１つまたは複数のインビトロまたはインビボ親和性成熟ステップを含んでもよい。所望の抗原に対するＴｎ３足場の結合を改善できるようにＴｎ３ドメインまたはＴｎ３ドメインループのアミノ酸変化を生ずるいずれの親和性成熟手法も採用可能である。
これらのアミノ酸変化は、例えば、ランダム変異誘発、「ウォークスルー型（ｗａｌｋ ｔｈｒｏｕｇｈ）」変異誘発、および「ルックスルー型（ｌｏｏｋ ｔｈｒｏｕｇｈ）」変異誘発により達成可能である。このような変異誘発は、全または部分ＦｎＩＩＩベース結合分子の非経験的合成の間に、例えば、変異性ＰＣＲ、酵母または細菌の「変異誘発遺伝子」株、ランダムまたは規定核酸変化の組込み、を使って達成可能である。親和性成熟および／または変異誘発を行う方法は、例えば、米国特許第７，１９５，８８０号；同６，９５１，７２５；同７，０７８，１９７号；同７，０２２，４７９号；同５，９２２，５４５号；同５，８３０，７２１号；同５，６０５，７９３号；同５，８３０，６５０号；同６，１９４，５５０号；同６，６９９，６５８号；同７，０６３，９４３号；同５，８６６，３４４号および国際公開第０６０２３１４４号、に記載されている。
そのような親和性成熟方法は、抗原結合選別アッセイの厳密性を高くして、改善された抗原に対する親和性を有するＴｎ３足場を選択することがさらに必要である可能性がある。タンパク質−タンパク質相互作用アッセイの厳密性を高める技術的に認められた方法は、本明細書で使用可能である。一実施形態では、１つまたは複数のアッセイ条件を変えて（例えば、アッセイ緩衝液の塩濃度を変えて）目的の抗原に対するＴｎ３足場の親和性を低下させる。別の実施形態では、Ｔｎ３足場が目的抗原に結合するのに許容される時間の長さを短くする。
別の実施形態では、競合的結合ステップをタンパク質−タンパク質相互作用アッセイに追加できる。例えば、最初に、Ｔｎ３足場を目的の固定化抗原に結合させる。次に、特定の濃度の非固定化抗原を添加し、固定化抗原と結合に対して競合させ、それにより、抗原に対する最低の親和性のＴｎ３足場が固定化抗原から溶離され、改善された抗原結合親和性を有するＴｎ３足場の選択がなされる。アッセイ条件の厳密性は、添加される非固定化抗原の濃度を増やすことにより、さらに高めることができる。
また、選別方法に関しては、１つまたは複数の改善された抗原結合を有するＴｎ３足場を濃縮するために、複数の選択ラウンドが必要な可能性もある。一実施形態では、各選択ラウンドで、さらなるアミノ酸変異がＴｎ３足場に導入される。別の実施形態では、各選択ラウンドで、目的の抗原への結合の厳密性が高められ、抗原に対する親和性の増加したＴｎ３足場が選択される。
一部の実施形態では、親和性成熟が、Ｔｎ３のＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループ部分の飽和変異誘発により行われる。一部の実施形態では、飽和変異誘発が、Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発を使って行われる。他の実施形態では、飽和変異誘発が、ＰＣＲを使って行われる。
一部の実施形態では、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５ラウンド、または５ラウンド超の親和性成熟が適用される。一部の実施形態では、飽和変異誘発がただ１つのループに適用され、一方、一部の他の実施形態では、ただ１つのループまたはループの一部が親和性成熟の１ラウンドの間に変異導入される。一部の実施形態では、２つ以上のループまたは１つまたは複数のループの一部が、親和性成熟の同じラウンドの間に変異導入される。
他の実施形態では、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループが、同じラウンドの親和性成熟の間に同時に変異導入される。
Ｔｎ３足場を同じ標的の異なるエピトープに結合する多量体足場に構築する場合、または二重特異性Ｔｎ３足場の場合には、各結合特異性を、独立に選別できる。従って、一部の実施形態では、第１の標的、例えば、ＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合する個別Ｔｎ３結合分子を特定するための最初の選別は、Ｔｎ３足場の第１ライブラリーを使って行い、１つまたは複数のループ中の１つまたは複数のアミノ酸が変えられる。一部の実施形態では、異なる標的または同じ標的の異なるエピトープに結合する個別Ｔｎ３分子を特定するために、追加の選別を行うことができる。
一部の実施形態では、ループが、ファージディスプレイライブラリーを使ってランダム化される。一部の実施形態では、Ｔｎ３足場の目的の標的に対する結合を当技術分野で既知の方法を使って判定できる。また、選別で特定されたＴｎ３足場のアミノ酸を、当技術分野で既知の方法を使って判定できる。
一部の実施形態では、本発明の親和性成熟単量体足場は、表面プラズモン共鳴法または当技術分野で既知の他のアッセイで測定して、親和性成熟前の同じＴｎ３足場に比べて、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも６０倍、少なくとも８０倍、または少なくとも１００倍もしくはそれ超のＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する増加した親和性を示す。一部の実施形態では、本発明の親和性成熟単量体足場は、表面プラズモン共鳴法または当技術分野で既知の他のアッセイで測定して、５μＭ未満、１μＭ未満、５００μＭ未満、２５０μＭ未満、１００μＭ未満、または５０μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）を有する。
これらの親和性成熟方法は、望ましい改善された結合特性、例えば、増加した親和性、または好ましい薬物動態学的特性、高効力、低免疫原性、他の生物由来のＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体との増加した、もしくは低下した交差反応性、等、の他の望ましい特性を有するＴｎ３足場を開発するために適用可能である。
タンデム反復の生成
タンデム構築物の結合は、限定されないが、ＩＩ型およびＩＩＳ型制限酵素を含む当技術分野で既知の制限酵素を使って、制限酵素部位でのオリゴヌクレオチドの連結反応により形成できる。
本発明の多量体Ｔｎ３足場は、Ｃ末端および／またはＮ末端の位置に、および／または本明細書記載のドメイン間にリンカーを含んでもよい。さらに、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つのポリペプチド足場を含む本発明の足場は、二量体化ドメインに融合またはコンジュゲートしてもよい。二量体化ドメインには、限定されないが、以下から選択される抗体成分が含まれる：
（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦａｂ断片；
（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つまたは複数のシステイン残基を有するＦａｂ断片であるＦａｂ’断片；
（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；
（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＣＨ１ドメインのＣ末端に１つまたは複数のシステイン残基を有するＦｄ’断片；
（ｖ）抗体単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを有するＦｖ断片；
（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片；
（ｖｉｉ）単離ＣＤＲ領域；
（ｖｉｉｉ）ヒンジ部でのジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ’断片を含むを含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片；
（ｉｘ）単鎖抗体分子（例えば、単鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）；
（ｘ）同じポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する「ダイアボディ」；
（ｘｉ）相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む「直鎖抗体」；
（ｘｉｉ）完全長抗体；および
（ｘｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３を含み、さらに全ての、または一部のヒンジ部および／またはＣＨ１領域を含むＦｃ領域。種々の結合価、親和性、および空間配向スキームが、以下の実施例で例示されている。
足場の製造
本発明の足場の組み換え体発現には、足場をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの作成が必要である。足場をコードするポリヌクレオチドが得られると、足場製造用ベクターが当技術分野でよく知られた技術を使って組換えＤＮＡ技術により作製可能である。従って、ヌクレオチド配列をコードする足場を含むポリヌクレオチドを発現させることによるタンパク質調製方法が本明細書で記載される。当業者によく知られた方法を使用して足場ポリペプチドコード配列および適切な転写および転写調節シグナルを含むベクターを構築できる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換ＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝的組換え技術が含まれる。本発明は、従って、本発明の足場をコードするヌクレオチド配列を含み、プロモーターに機能的に連結された複製可能なベクターを提供する。
発現ベクターを従来の技術を使って宿主細胞に導入し、その後、形質移入された細胞を従来の技術により培養して本発明の足場を製造する。従って、本発明は、本発明の足場をコードし、異種のプロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。適切な宿主細胞には、限定されないが、細菌（例えば、大腸菌および枯草菌）等の微生物が含まれる。
種々の宿主発現ベクター系が本発明の足場の発現に利用可能である。このような宿主発現系は、対象のコード配列を産生し、その後精製できるように使われる媒体を表すが、また、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換された、またはこれを形質移入された場合は、本発明の足場をその場発現可能な細胞も表す。これらには、足場コード配列を含む組換え型バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌および枯草菌）等の微生物、または哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳＯ、および３Ｔ３細胞）、が含まれる（これらに限定されない）。
本発明の足場の製造に有用な方法が、例えば、国際公開第２００９／０５８３７９号に開示されている。本発明の足場が組み換え体発現により製造されると、当技術分野で既知のタンパク質のいずれかの精製方法により精製可能である。
研究室での本発明の足場の製造は、米国特許公開第２０１０−０２９８５４１Ａ１号に記載のように、分析的規模のリアクターまたは生産規模のリアクターで足場を製造できるように、スケールアップできる。
分泌足場の拡張可能な製造
本発明のＴｎ３足場は、細胞内で、または分泌型として産生できる。一部の実施形態では、分泌足場は、正しく折り畳まれ、完全に機能する。本発明のＴｎ３足場は、拡張可能プロセスにより産生出来る。一部の実施形態では、足場は、本発明の足場をスケールアップして分析規模のバイオリアクター（例えば、限定されないが、５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、３０Ｌ、または５０Ｌバイオリアクター）で産生可能な、本発明の拡張可能プロセスにより研究室で産生出来る。他の実施形態では、本発明のＴｎ３足場をスケールアップして生産規模のバイオリアクター（例えば、限定されないが、７５Ｌ、１００Ｌ、１５０Ｌ、３００Ｌ、または５００Ｌ）で産生可能な、本発明の拡張可能プロセスにより研究室で産生出来る。一部の実施形態では、本発明の拡張可能プロセスは、研究室で行った産生プロセスに比べて、生産効率の低下をほとんど、または全く生じない。
リンカー
多量体足場中のＴｎ３足場は、タンパク質および／または非タンパク質リンカーにより連結され得、各リンカーは、少なくとも２つの本発明のＴｎ３足場に融合される。適切なリンカーは、タンパク質リンカー、非タンパク質リンカー、およびそれらの組み合わせからなってよい。リンカーの組み合わせは、ホモマーであっても、ヘテロマーであってもよい。一部の実施形態では、本発明の多量体Ｔｎ３足場は、複数の単量体Ｔｎ３足場を含み、全てのリンカーは同一である。他の実施形態では、多量体Ｔｎ３足場は、複数のＴｎ３足場を含み、少なくとも１つのリンカーは、残りのリンカーとは機能的にまたは構造的に異なる。一部の実施形態では、リンカーは、標的に対する結合に直接的または間接的に関与することにより、それ自体で、多量体ＦｎＩＩＩ足場の活性に寄与できる。
一部の実施形態では、タンパク質リンカーは、ポリペプチドである。リンカーポリペプチドは、２つ以上の本発明の単量体足場または２つ以上の本発明の多量体足場を、目的活性を保持できるように、相互に対し正しい立体構造を呈するような方法で連結するのに適する長さを持たねばならない。
一実施形態では、ポリペプチドリンカーは、１〜約１０００アミノ酸残基、１〜約５０アミノ酸残基、１〜２５アミノ酸残基、１〜２０アミノ酸残基、１〜１５アミノ酸残基、１〜１０アミノ酸残基、１〜５アミノ酸残基、１〜３アミノ酸残基を含む。本発明は、ポリペプチドリンカー配列をコードする核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方の組み合わせをさらに提供する。ポリペプチドリンカーに組み入れるために選択されるアミノ酸残基は、本発明の多量体Ｔｎ３足場の活性または機能と大きく干渉しない特性を有すべきである。従って、ポリペプチドリンカーは、全体として、本発明の多量体足場の活性また機能と一致しない、または内部折り畳みと干渉する、または本発明の多量体足場のＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する結合を大きく妨害する可能性のあるＴｎ３単量体ドメインの１つまたは複数のアミノ酸残基と結合を形成する、または他の相互作用を形成する電荷を示すべきではない。
ポリペプチドを新規連結融合体ポリペプチドに連結するための、天然ならびに人工ペプチドリンカーの使用は、文献でよく知られている。従って、２つ以上の本発明の足場を融合しているリンカーは、天然リンカー、人工リンカー、またはこれらの組み合わせである。一部の実施形態では、本発明の多量体足場中に存在する全ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、同一である。他の実施形態では、本発明の多量体足場中に存在するペプチドリンカーの少なくとも２つのアミノ酸配列は異なる。
一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、立体構造の柔軟性を有する。特定的な実施形態では、ポリペプチドリンカー配列は、（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ）ｘアミノ酸配列を含み、ｘは正の整数である。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、本質的に構造不定の天然または人工ポリペプチドである（例えば、Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：１１８６−１１９０、２００９、を参照；また、Ｓｉｃｋｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５：Ｄ７８６−９３、２００７、も参照のこと）。
ペプチドリンカーは、非ポリペプチド成分に結合させる基を含むアミノ酸残基が導入されるように修飾可能である。そのようなアミノ酸残基の例は、システイン残基であってよく（非ポリペプチド成分が、その後、それに対し結合される）、またはアミノ酸配列がインビボＮ−グリコシル化部位を含んでもよい（それにより、糖成分（インビボで）をペプチドリンカーに結合させる）。
一部の実施形態では、ポリペプチド多量体中に存在する全ペプチドリンカーのアミノ酸配列は同一である。あるいは、ポリペプチド多量体中に存在する全ペプチドリンカーのアミノ酸配列は異なる。
足場の標識またはコンジュゲート
本発明の足場は、非コンジュゲート型で用いられてもよいし、あるいは、標的検出を容易にするために、または画像化もしくは治療のために、種々の異種の成分のうちの少なくとも１つに対してコンジュゲートされてもよい。この足場は、精製が行われるとき、精製の前にまたは後のいずれに標識されてもまたはコンジュゲートされてもよい。
多くの異種の成分は、本発明の足場が連結され得る適切な官能基を欠く。従って、いくつかの実施形態では、エフェクター分子が、リンカーを通じて足場に結合され、ここでこのリンカーは、コンジュゲーションのための反応性基を含む。いくつかの実施形態では、本発明の足場に対してコンジュゲートされた異種の成分は、リンカーとして機能し得る。他の実施形態では、この成分は、切断可能または切断不能であり得るリンカーを介して足場にコンジュゲートされる。一実施形態では、切断可能な連結分子は、酸化還元切断可能連結分子であり、その結果その連結分子は、細胞質および他の領域と遊離スルフヒドリル基を有する高濃度の分子のような、より低い酸化還元電位で、環境中で切断可能である。酸化還元電位における変化に起因して切断され得る連結分子の例としては、ジスルフィドを含有する分子が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明の足場は、コンジュゲーションのための反応性基を得るように操作される。このような足場では、Ｎ末端および／またはＣ末端はまた、コンジュゲートのための反応性基を提供するように機能し得る。他の実施形態では、Ｎ末端は、１つの部分（例えば、限定されるものではないが、ＰＥＧ）にコンジュゲートされ得るが、Ｃ末端は、別の部分（例えば、限定されるものではないが、ビオチン）にコンジュゲートされ、または逆もまた真である。
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」という用語は、ポリエチレングリコール化合物またはその誘導体を意味し、ここでカップリング剤、カップリングまたは活性化部分を有する場合と有さない場合がある（例えば、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジンまたはマレイミド部分）。「ＰＥＧ」という用語は、５００〜１５０、０００Ｄａの間の分子量のポリエチレングリコール（その類似体を含む）を意図し、そこで、例えば、末端のＯＨ基が、メトキシ基（ｍＰＥＧと呼ばれる）で置換されている。
本発明の足場は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で誘導体化され得る。ＰＥＧは、２つの末端ヒドロキシル基を有するエチレンオキシド反復ユニットの直線の水溶性ポリマーである。ＰＥＧは、典型的には約５００ダルトン〜約４０、０００ダルトンにおよぶそれらの分子量によって分類される。特定の実施形態では、使用されるＰＥＧは、５、０００ダルトン〜約２０、０００ダルトンにおよぶ分子量を有する。本発明の足場に結合されるＰＥＧ類は、分岐されてもまたは非分岐であってもよい（例えば、Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ、Ｃ．ら、１９９５ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ６：６２−６９を参照のこと）。ＰＥＧ類は、Ｎｅｋｔａｒ Ｉｎｃ．、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．および他の会社から市販される。このようなＰＥＧ類としては限定されるものではないが、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシナート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルスクシナート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）、およびモノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−ＩＭ）が挙げられる。
簡潔に述べると、使用される親水性ポリマー、例えば、ＰＥＧは、メトキシ基またはエトキシ基のような非反応性の基によって末端でキャップされる。その後、ポリマーは、適切な活性化剤、例えば、ハロゲン化シアヌル（例えば、塩化シアヌル、臭化シアヌルまたはフッ化シアヌル）、カルボニルジイミダゾール、無水物試薬（例えば、ジハロコハク酸無水物、例えば、ジブロモコハク酸無水物）、アシルアジド、ｐ−ジアゾニウムベンゾイルエーテル、３−（ｐ−ジアゾニウムフェノキシ）−２−ヒドロキシプロピルエーテル）などとの反応によってその末端で活性化される。この活性化ポリマーは次いで、本明細書に記載のようなポリペプチドと反応されて、ポリマーで誘導体化されたペプチドが生成される。あるいは、本発明の足場中の官能基は、ポリマーとの反応のために活性化されてもよく、または２つの基は、公知のカップリング方法を用いて共同カップリング反応で連結されてもよい。本発明のポリペプチドは、当業者に公知であってかつ用いられる無数の他の反応スキームを用いてＰＥＧで誘導体化され得る。ＰＥＧは、足場のどちらかの末端または足場内の１つまたは複数の官能基の位置で、本発明の足場に結合可能である。ある特定の実施形態では、ＰＥＧは、Ｎ末端またはＣ末端で結合される。
他の実施形態では、本発明の足場、その類似体または誘導体は、診断剤または検出剤にコンジュゲートされ得る。このような足場は、臨床試験手順の一部として疾患の発生または進行をモニタリングまたは診断するために、例えば、特定の治療の有効性を決定するために有用であり得る。
本発明はさらに、治療部分にコンジュゲートさせた足場の使用を包含する。足場は、細胞毒素（例えば細胞増殖抑制剤もしくは細胞破壊剤）、治療剤または放射性金属イオン（例えばα線放射体）などの治療部分にコンジュゲートされてもよい。細胞毒素または細胞傷害剤としては、細胞にとって有害である任意の因子が挙げられる。
足場のアッセイ
抗原に対する足場の結合親和性および他の結合特性は、当該技術分野において公知の種々のインビトロアッセイ法によって決定することができ、これには、例えば、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、または速度論（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析）、および他の方法、例えば、間接結合アッセイ、競合結合アッセイ、ゲル電気泳動、およびクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）が挙げられる。これらのおよび他の方法では、色素生産、蛍光、発光、または同位体標識が含まれるが、これらに限定されない、検査されている１つ以上の成分に対する標識を利用し、および／または種々の検出方法を使用してもよい。結合親和性および速度論についての詳細な説明は、Ｐａｕｌ、Ｗ．Ｅ．、編集、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９９）に見出すことができる。いくつかの実施形態では、本発明の足場は、特定の反応速度で標的に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本発明の足場は、１×１０−２Ｍ、１×１０−３Ｍ、１×１０−４Ｍ、１×１０−５Ｍ、１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ、１×１０−１３Ｍ、１×１０−１４Ｍ未満、または１×１０−１５Ｍ未満という解離定数すなわちＫｄ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有し得る。特定の実施形態では、本発明の足場は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（登録商標）によって、または当該分野で公知の他のアッセイによって決定して、５００μＭ、１００μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、またはそれより小さいＫｄを有する。別の実施形態では、本発明の親和性は、会合定数（Ｋａ）を単位として記載され、この定数は、少なくとも１×１０２Ｍ−１、１×１０３Ｍ−１、１×１０４Ｍ−１、１×１０５Ｍ−１、１×１０６Ｍ−１、１×１０７Ｍ−１、１×１０８Ｍ−１、１×１０９Ｍ−１、１×１０１０Ｍ−１１×１０１１Ｍ−１１×１０１２Ｍ−１、１×１０１３Ｍ−１、１×１０１４Ｍ−１、１×１０１５Ｍ−１、または少なくとも５×ｌ０１５Ｍ−１というｋｏｎ／ｋｏｆｆ比として算出される。ある特定の実施形態では、本発明の足場が、標的エピトープから解離する速度が、ＫｄまたはＫａの値よりも適切であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の足場は、１０−３ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０−４ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１、または１０−１０ｓ−１未満というｋｏｆｆを有する。ある特定の他の実施形態では、本発明の足場が標的エピトープと会合する速度が、ＫｄまたはＫａの値よりも適切であり得る。この場合、本発明の足場は、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０９Ｍ−１ｓ−１というｋｏｎ速度で標的に結合する。
本発明の足場はまた、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用な固体支持体に結合され得る。このような固体支持体としては限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３足場
ＴＲＡＩＬ Ｒ２タンパク質は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー遺伝子のメンバーによりコードされており、細胞内死ドメインを含む。一部の例では、また、ＴＮＦＲＳＦｌＯＢ；ＣＤ２６２、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＫＩＬＬＥＲ／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＩＣＫ２、ＴＲＩＣＫ２Ａ、ＴＲＩＣＫ２Ｂ、ＴＲＩＣＫＢ、またはＺＴＮＦＲ９、としても知られている。この受容体は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＮＦＳＦ１０／ＴＲＡＩＬ／ＡＰＯ−２Ｌ）により活性化され、アポトーシスシグナルを伝達できる。さらに、ＴＲＡＩＬ Ｒ２誘導アポトーシスには、カスパーゼおよび細胞内アダプター分子ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１が関与する（Ｗａｌｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯＪ、（１９９７）、１６、５３８６−９７）。
本発明は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２に特異的に結合するＴｎ３足場を提供する。特定的な実施形態では、本発明の足場は、ヒトＴＲＡＩＬ Ｒ２に特異的に結合する。他の特定的な実施形態では、本発明のＴｎ３足場は、マウス、ニワトリ、アカゲザル、カニクイザル、ラット、またはウサギ由来のＴＲＡＩＬ Ｒ２ホモログと結合する。一部の実施形態では、本発明のＴｎ３足場は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２の露出エピトープに結合する。そのような実施形態では、細胞上で内因的に発現したＴＲＡＩＬ Ｒ２および／またはその受容体を異所的に発現するように形質移入された細胞が含まれる。
他の実施形態では、本発明のＴｎ３足場は、単量体ＴＲＡＩＬ Ｒ２上で提示されたエピトープを認識する。他の実施形態では、本発明のＴｎ３足場は、ホモ二量体型のＴＲＡＩＬ Ｒ２上で提示されたエピトープを認識する。また他の実施形態では、本発明のＴｎ３足場は、単量体ＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合し、２つ以上のＴＲＡＩＬ Ｒ２分子の二量体化またはオリゴマー化（例えば、多量体足場（これに限定されない））を促進する。また他の実施形態では、本発明の足場は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２とＴＲＡＩＬリガンドの間の相互作用を減らすか、または阻害する。他の実施形態では、本発明の足場は、ＴＲＡＩＬリガンドとＴＲＡＩＬ Ｒ２の相互作用を模倣する。さらなる実施形態では、本発明のＴｎ３足場は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２による細胞シグナル伝達を作動させる。
本発明は、また、本明細書記載のＴｎ３足場を使ってＴＲＡＩＬ Ｒ２活性を調節する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明の方法は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２を発現している細胞をＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的足場と接触させ、ＴＲＡＩＬリガンドとの相互作用を遮断することを含む。他の実施形態では、本発明の方法は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２を発現している細胞をＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３足場と接触させ、ＴＲＡＩＬリガンドとＴＲＡＩＬ Ｒ２との相互作用を模倣させることを含む。
他の実施形態では、本発明の方法は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３足場と接触させることによりＴＲＡＩＬ Ｒ２を作動させる（agonize）ステップを含む。他の実施形態では、本発明の方法は、細胞上に発現したＴＲＡＩＬ Ｒ２単量体をＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的足場と接触させ、二量体化またはオリゴマー化を促進することによるＴＲＡＩＬ Ｒ２を二量体化またはオリゴマー化するステップを含む。さらなる実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２の二量体化は、例えば、限定されないが、ＴＲＡＩＬ Ｒ２二量体を模倣する、ＴＲＡＩＬ Ｒ２ダイマー形成を安定化する、ＴＲＡＩＬ Ｒ２単量体を不安定化する、または単に細胞上に提示されたＴＲＡＩＬ Ｒ２二量体を認識する、多量体Ｔｎ３足場の使用により達成可能である。
他の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２の二量体化またはオリゴマー化は、足場二量体化またはオリゴマー化試薬と結合した単量体Ｔｎ３足場の使用により達成可能である。このような足場の二量体化またはオリゴマー化試薬には、例えば、限定されないが、抗足場抗体、エピトープタグに対する抗体に結合したエピトープタグを有する足場の使用、または本明細書記載および当技術分野で既知の種々のタンパク質二量体化またはオリゴマー化モチーフの組込み、を含んでもよい。さらなる実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２二量体またはオリゴマーは、単量体足場の投与に続く足場二量体化またはオリゴマー化試薬の投与により誘導されうる。
一部の実施形態では、本発明の方法は、当技術分野で既知の日常的アッセイにより測定して、細胞生存率を減少させるＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的足場の投与を含む。さらなる実施形態では、細胞生存率の減少は、当技術分野で既知のアッセイで測定したアポトーシスの活性化である。他の実施形態では、細胞生存率の減少は、技術的に受け入れられた方法で測定した細胞分裂の抑制である。一部の実施形態では、処置が無い場合の細胞生存率に比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれ超だけ細胞生存率が減少する。
一部の実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２結合Ｔｎ３足場は、ＴＲＡＩＬとして知られるＴＲＡＩＬ Ｒ２用リガンドと類似の活性によりＴＲＡＩＬ Ｒ２を作動させる。他の実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２結合Ｔｎ３足場は、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路の活性化を生ずるのに充分な程度にＴＲＡＩＬ Ｒ２の活性化（カスパーゼ３、カスパーゼ８、カスパーゼ１０、またはＦＡＤＤの活性化を含む）を可能とする。他の実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２結合Ｔｎ３足場は、少なくとも１つの癌細胞型のアポトーシスを活性化する。さらなる実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２結合Ｔｎ３足場は、ＴＲＡＩＬに比較して、少なくとも１つの細胞型アポトーシスの活性化の増強を示す。
他の実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２結合Ｔｎ３足場は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２上の、ＴＲＡＩＬ（リガンド）が結合するのと同じエピトープに結合、または結合の競合が可能である。このような実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２結合足場は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２とＴＲＡＩＬの相互作用を、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれ超の、遮断または阻害ができる（可溶性ＴＲＡＩＬリガンド（例えば、ＴＲＡＩＬリガンドの１１４−２８１断片）を使ったインビトロ競合アッセイ、結晶学的試験、または他の既知のインビボまたはインビトロ試験で測定可能）。
治療におけるＴｎ３ ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的足場の使用方法
ＴＲＡＩＬ Ｒ２は、アポトーシスシグナル伝達を媒介することが知られている。いくつかのタイプの正常細胞がＴＲＡＩＬ Ｒ２を発現するが、この受容体を介したアポトーシスシグナル伝達は、主に腫瘍細胞に限定されているように思われ、癌遺伝子、例えば、ＭｙｃまたはＲａｓによるそれらの形質転換との関連で、細胞死受容体媒介アポトーシスの影響を受けやすくなる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５：５０１−１２（２００４）；Ｎｅｓｔｅｒｏｖ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：３９２２−７（２００４））。ＴＲＡＩＬ Ｒ２は、ヒト癌細胞株ならびに原発性腫瘍で発現することが多い。
一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的本発明の足場は、治療を必要としている対象（すなわち、癌患者）に投与される。そのような実施形態では、無菌の、発熱性物質を含まないＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的足場含有組成物が、それを必要としている対象に投与される。治療の効果は、当技術分野でよく知られた種々のインビトロおよびインビボアッセイ、例えば、限定されないが、アネキシンＶ結合のカスパーゼ活性化を使ったアポトーシス活性、ならびに腫瘍組織重量または腫瘍体積の減少を使って測定できる。
他の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的本発明の足場は、癌または他のＴＲＡＩＬ Ｒ２関連疾患の診断および検出に有用である。そのような実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的足場は、検出試薬、例えば、限定されないが、放射性同位元素、蛍光または化学発光標識に結合される。そのような結合物質は、対象または前記対象から採取した検体における癌またはＴＲＡＩＬ Ｒ２関連疾患の検出または診断法に有用である。さらに、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的足場は、ヒトを含む哺乳動物の他のＴＲＡＩＬ Ｒ２関連病理学的状態、例えば、免疫関連疾患の診断および治療に有用である。
特異的ＴＲＡＩＬ Ｒ２結合配列
一部の実施形態では、本発明のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３単量体足場は、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または少なくとも６つのＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合するループ配列を含む。
一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３足場は、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または少なくとも６つの、１Ｃ１２（配列番号１３２）、Ｇ３（配列番号１３３）、１Ｅ１１（配列番号１３４）、Ｃ４（配列番号１３５）、Ｃ１１（配列番号１３６）、Ｆ４（配列番号１３７）、およびＧ６（配列番号１３８）から選択されるＴＲＡＩＬ Ｒ２結合単量体足場クローンのループ配列を含む。
一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３単量体足場は、表４に挙げられたループ配列から選択される少なくとも１つのループ配列を含む。他の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的単量体足場は、表４に挙げられたＢＣループ配列から選択される少なくとも１つのＢＣループ配列を含む。他の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的単量体足場は、表４に挙げられたＤＥループ配列から選択される少なくとも１つのＤＥループ配列を含む。他の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的単量体足場は、表４に挙げられたＦＧループ配列から選択される少なくとも１つのＦＧループ配列を含む。
一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３単量体足場は、表４に挙げられたＢＣループ配列から選択されるＢＣループ配列を含み、表４に挙げられたＤＥループ配列から選択されるＤＥループ配列を含む。他の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３単量体足場は、表４に挙げられたＢＣループ配列から選択されるＢＣループ配列を含み、表４に挙げられたＦＧループ配列から選択されるＦＧループ配列を含む。他の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３単量体足場は、表４に挙げられたＤＥループ配列から選択されるＤＥループ配列を含み、表４に挙げられたＦＧループ配列から選択されるＦＧループ配列を含む。一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３単量体足場は、１つ、２つまたは３つの異なるＴｎ３クローン由来のループ配列に対応するループ配列を含む。
一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３多量体足場は、直鎖多量体であり、例えば、二量体、例えば、配列番号１３９の１Ｅ１１タンデム２足場、四量体、例えば、配列番号１４０の１Ｅ１１タンデム４足場もしくは配列番号１４３のＧ６タンデム４足場、六量体、例えば、配列番号１４１の１Ｅ１１タンデム６足場、配列番号１４４のＧ６タンデム６足場もしくは配列番号１６７のＦ４ｍｏｄ１２タンデム６、または八量体、例えば、配列番号１４２の１Ｅ１１タンデム８足場、配列番号１４５のＧ６タンデム８足場、もしくは配列番号１６６のＦ４ｍｏｄ１２タンデム８足場である。
一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３多量体足場は、Ｆｃ融合体であり、例えば、配列番号１４９の１Ｃ１２のＦｃ融合体、配列番号１５０のＧ３のＦｃ融合体、配列番号１５１の１Ｅ１１のＦｃ融合体、配列番号１５２のＣ４のＦｃ融合体、または配列番号１５３のＧ６のＦｃ融合体である。
一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３多量体足場は、抗体様融合体であり、例えば、配列番号１５４の１Ｃ１２のＩｇＧ１重鎖定常領域足場と配列番号１５５の１Ｃ１２カッパ軽鎖足場の結合により得られる足場、配列番号１５６のＧ３のＩｇＧ１重鎖足場と配列番号１５７のＧ３カッパ軽鎖足場の結合により得られる足場、配列番号１５８の１Ｅ１１のＩｇＧ１重鎖足場と配列番号１５９の１Ｅ１１カッパ軽鎖足場の結合により得られる足場、配列番号１６０のＣ４のＩｇＧ１重鎖足場と配列番号１６１のＣ４カッパ軽鎖足場の結合により得られる足場、または配列番号１６２のＧ６のＩｇＧ１重鎖足場と配列番号１６３のＧ６カッパ軽鎖足場の結合により得られる足場である。
一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３多量体足場は、Ｆｃ融合体形式を直鎖形式と結合し、例えば、配列番号１６４の１Ｅ１１タンデムの２Ｆｃ融合体、または配列番号１６５の１Ｅ１１タンデム４である。
ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３多量体足場配列が配列のＣ末端にリンカーおよび／またはヒスチジンタグを含むような、ある特定の実施形態では、このＣ末端リンカーおよび／またはヒスチジンタグは、取り除くことができ、従って、対応するアミノ酸配列はＣ末端リンカーおよびヒスタグ配列の欠失を含む。
一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３多量体足場は、ＰＥＧにコンジュゲートされる。特定的な実施形態では、Ｆ４ｍｏｄ１２タンデム６（配列番号１６７）またはＦ４ｍｏｄ１２タンデム８（配列番号１６６）足場は、ＰＥＧにコンジュゲートされる。さらなる実施形態では、ＰＥＧは多量体足場分子のＮ末端またはＣ末端にコンジュゲートされる。
薬学的組成物
別の態様では、本発明は、組成物、例えば、限定されるものではないが、薬学的に許容される担体と一緒に処方された、本発明の足場または多量体足場の１つまたは組み合わせを含んでいる薬学的組成物を提供する。このような組成物は、例えば、限定されるものではないが、本発明の２つ以上の異なる足場のうちの１つまたは組み合わせを含んでもよい。例えば、本発明の薬学的組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または相補的な活性を有する足場の組み合わせを含んでもよい。特定の実施形態では、薬学的組成物は、本発明の多量体足場を含む。
本発明の薬学的組成物はまた、他の薬剤との組合せなどの併用療法において投与してもよい。例えば、併用療法は、免疫療法、化学療法、放射線療法、または薬物療法であってよい、少なくとも１つの他の療法と組み合わせた本発明の足場を含んでもよい。本発明の医薬品は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な塩を含んでもよい。
薬学的な用法および用量
本発明の足場を含む薬学的組成物または滅菌組成物を調製するために、足場を、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合する。治療剤のための投与計画の選択は、実体の血清もしくは組織回転率、症状のレベル、実体の免疫原性、生体マトリックス中の標的細胞の接近性などのいくつかの要因に依存する。ある特定の実施形態においては、投与計画は、許容し得るレベルの副作用と一致する患者に送達される治療剤の量を最大化する。本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の用量レベルを、患者に対して毒性を示すことなく、特定の患者、組成物、および投与様式に対する所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を取得するために変化させてもよい。選択される用量レベルは、使用される本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用されている特定の化合物の排出速度、治療期間、使用される特定の組成物と共に用いられる他の薬剤、化合物および／もしくは物質、処置される患者の年齢、性別、体重、症状、一般的な健康および以前の病歴、ならびに医学界で周知の同様の要因などの様々な薬物動態要因に依存するであろう。
本発明の組成物はまた、当該分野で公知の種々の方法のうちの１つ以上を用いて１つ以上の投与経路を介して投与されてもよい。特定の実施形態では、本発明のＴｎ３足場をインビボで適切な分布が確実になるように処方してもよい。
足場の使用方法
本発明の足場は、インビトロまたはインビボにおいて、診断上および治療上の有用性を有する。例えば、これらの分子を、培養物中の細胞に、例えば、インビトロもしくはエキソビボで、または対象中に、例えば、インビボで投与して、様々な障害を治療、予防または診断してもよい。
また、多くの細胞表面受容体は、サブユニットの交差結合の結果として活性化または不活性化する。本発明のＴｎ３足場を用いて、ＴＲＡＩＬ Ｒ２等の細胞表面受容体の交差結合によって標的細胞中での応答を刺激または阻害してもよい。別の実施形態においては、本発明の足場を用いて、複数の細胞表面受容体と抗原との相互作用を遮断してもよい。別の実施形態においては、本発明のＴｎ３足場を用いて、複数の細胞表面受容体と抗原との相互作用を強化してもよい。別の実施形態においては、同じ抗原に対する特異性を共有するか、または２個の異なる抗原に結合する結合ドメインを含んでいる本発明のＴｎ３足場を用いて、細胞表面受容体のホモまたはヘテロ二量体を架橋することが可能な場合がある。別の実施形態においては、本発明のＴｎ３足場を用いて、特定の細胞表面受容体にリガンド、またはリガンド類似体を送達してもよい。
本発明はまた、伝統的な抗体では容易に達成されないエピトープを標的化する方法も提供する。例えば、一実施形態においては、本発明のＴｎ３足場を用いて、隣接する抗原を最初に標的してもよく、結合の間、別の結合ドメインが潜在的（ｃｒｙｐｔｉｃ）抗原に関与してもよい。
本発明はまた、異なる細胞型を一緒にするために本発明のＴｎ３足場を用いる方法も提供する。一実施形態においては、本発明の足場は、１個の結合ドメインを有する標的細胞に結合し、別の結合ドメインを介して別の細胞を動員してもよい。別の実施形態においては、第１の細胞は癌細胞であり得、第２の細胞はＮＫ細胞などの免疫エフェクター細胞である。別の実施形態においては、本発明のＴｎ３足場を用いて、おそらく免疫応答を増進する、抗原提示細胞とＴ細胞のような２種の異なる細胞間の相互作用を強化してもよい。
本発明はまた、癌またはその症状を改善、処置、または予防するためにＴｎ３足場を用いる方法も提供する。一実施形態においては、本発明は、本発明のＴｎ３足場を使ってＴＲＡＩＬ抵抗性細胞集団を減少させる方法を提供する。これに関して、本発明のＴｎ３足場は、一部のタイプの治療耐性癌の治療に使用できる。
本発明はまた、細胞集団を枯渇させるためにＴｎ３足場を用いる方法も提供する。一実施形態においては、本発明の方法は、以下の細胞型の枯渇において有用である：好酸球、好塩基球、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、単球および腫瘍細胞。本発明は、また、本発明の足場を使って、サイトカインを不活化、阻害、または減少させる方法を提供する。また、本発明は、Ｔｎ３足場タンパク質を診断薬として使う方法を提供する。これに関して、一部の実施形態では、本発明のＴｎ３足場のＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体に対する結合を使って、ＴＲＡＩＬ Ｒ２を発現している細胞を検出し、診断に役立てることができる。他の実施形態では、ＴＲＡＩＬに耐性であるがＴＲＡＩＬ模倣薬には感受性がある細胞集団、およびＴＲＡＩＬにもＴＲＡＩＬ模倣薬にも耐性である細胞集団との間の差異を鑑別できる本発明のＴｎ３足場の能力（例えば、実施例１９参照）を診断の目的のために使用可能である。本発明のＴｎ３足場は、異なる抗原が同時に効率的に捕捉されることが必要である場合に、キットまたは試薬として有用でありうる。また、アポトーシスの異常が原因の癌も、本発明の方法と組成物により治療可能であることも意図されている。
別の実施形態では、本発明は、癌の予防、管理、治療または改善の方法を提供する。ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体Ｔｎ３足場は、癌、例えば、肺癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、結腸癌、結腸直腸癌、脾臓癌、および多発性骨髄腫の治療に使用できる。ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体Ｔｎ３による癌の治療は、追加の療法、例えば、免疫療法、生物学的療法、化学療法、放射線療法、または小分子薬物療法をさらに含んでもよい。
癌を治療する方法は、それを必要とする対象に、予防上または治療上有効用量の本発明の１種以上のＴｎ３足場を、外科手術と組み合わせて、単独で、または標準的もしくは実験的化学療法、ホルモン療法、生物療法／免疫療法および／もしくは放射線療法の投与とさらに組み合わせて投与することを含む。これらの実施形態に従えば、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患もしくは感染性疾患またはその１つ以上の症状を予防、管理、処置または改善するのに利用される本発明のＴｎ３足場を、部分（例えば、治療剤もしくは薬剤）にコンジュゲートさせるか、または融合させてもさせなくてもよい。
等価物
当業者であれば、日常的なものを超えない実験を用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲により包含されるものとする。
本明細書に記載の全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各々の個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に参照により本明細書に援用されると示されるのと同程度まで、参照により本明細書に援用されるものとする。本出願は、その内容全体が参照によって本明細書に援用される、２０１０年４月１３日出願の米国特許仮出願第６１／３２３、７０８号に対する優先権の恩典を請求する。さらに、２００８年１０月１０日に出願され、国際公開番号ＷＯ２００９／０５８３７９Ａ２として公開された、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１２３９８号は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に援用される。
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ここで本発明を、以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は、例示に過ぎず、本発明は、決してこれらの実施例に限定されるものではなく、本明細書に示される技術の結果として証明される任意のかつ全ての変形を包含すると解釈されるべきである。
実施例１
種々の多価Ｔｎ３形式のデザイン
Ｔｎ３足場の多価形式が設計された。この多価形式は、それら自体に融合されるか、オリゴマー形成し得る他のタンパク質モチーフに融合されるか、またはそれら自体におよびオリゴマー形成し得る他のタンパク質モチーフに融合される、１つ以上のＴｎ３モジュールを含むことが図１に示される。各々の場合に、得られた分子実体は、少なくとも２つのＴｎ３モジュールを含む。お互いに対する、または他のタンパク質モチーフに対するＴｎ３モジュールを接続するポリペプチドリンカーが構築されても、または未構築であってもよく、機能はある場合とない場合がある。多価Ｔｎ３足場タンパク質のこれらの例示的な分類が、特に提供される：（ｉ）直線の（Ｌ）多価タンパク質であって、ポリペプチドリンカーを介してお互いに対して融合されたＴｎ３モジュールを含有する多価タンパク質；（ｉｉ）抗体様（Ｉｇ）多価タンパク質であって、抗体または抗体フラグメントの軽鎖および重鎖に融合された１つ以上の直鎖的に融合されたＴｎ３モジュールを含む多価タンパク質；ならびに（ｉｉｉ）Ｆｃ含有多価タンパク質であって、抗体Ｆｃ領域に融合された１つ以上の直鎖状に融合されたＴｎ３モジュールを含む、多価タンパク質（図１）。
実施例２
多価ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的なＴｎ３含有タンパク質の発現および精製
ヒトＴＲＡＩＬ Ｒ２の結合特異性を有する一連の８つの多価Ｔｎ３モジュール（足場タンパク質を含む）（「Ｔｎ３タンパク質」または「Ｔｎ３足場」とも呼ばれる）を調製した。実施例は、実施例１に記載の３つの多価形式の各々から調製し、これらのタンパク質の全てが、２つ以上のＴＲＡＩＬ Ｒ２−結合Ｔｎ３モジュールＡ１（クローン１Ｅ１１、Ｇ６または１Ｃ１２）を示した。ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的な多価Ｔｎ３タンパク質については、ＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合しなかった対応する対照のＴｎ３タンパク質（クローンＤ１、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）抗体に特異的なＴｎ３ドメイン）も生成され、これは、成分Ｔｎ３モジュールの配列および結合特異性においてのみ異なる。Ｔｎ３クローンＤ１は、Ｔｎ３タンパク質であって、ここで１Ｅ１１クローンのＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループは、それぞれ配列番号９９、３８、および１０７に対応する配列を有する別のループで置き換えられる（表４を参照のこと）。発現された多価Ｔｎ３タンパク質構築物の配列同一数を表２に示しており、全ての可能な構築物は、表３および図２に模式的に示される。クローンのループ配列を表４に示す。
Figure 2013529070
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発現構築物の調製：用いられた酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）のものであり、ＤＮＡ精製キットは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）のであり、ＤＮＡプライマーは、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）のであった。２つ以上の直鎖状に融合されたＴ３モジュールをコードする発現構築物の調製は、以下のとおりであった。ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的なＴｎ３モジュールをコードするＤＮＡ（例えば、１Ｅ１１；配列番号１３４；Ｇ６、配列番号１３８；など）は、プライマー「Ｔｎ３ ｇｌｙ４ｓｅｒ１モジュールフォワード」（配列番号１１２）および「Ｔｎ３ ｇｌｙ４ｓｅｒ２モジュールリバース」（配列番号１１３）（表５）を用いるＰＣＲによって増幅した。
ＰＣＲ産物の浄化後、増幅されたＤＮＡを２つに分け、ここで、半分はＢｐｍＩで消化し、残りの半分はＡｃｕＩで消化した。消化したサンプルを、ＰＣＲ浄化キットを用いて精製し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結して、２つのＴｎ３モジュール（Ａ２）をコードするＤＮＡ産物を作製した。この物質を、アガロースゲル電気泳動によって精製して、再度２つに分けた。ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩでの消化、続いてＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ消化したｐＳｅｃ−ｏｐｐＡ（Ｌ２５Ｍ）への連結によって（ＷＯ２００９／０５８３７９Ａ２、実施例１８に記載）、タンパク質Ａ２についての細菌発現構築物を得た。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）への未消化生成物の連結によって、より高次の融合物の生成のための遺伝物質を得た。４つのＴｎ３モジュール（Ａ３）をコードするＤＮＡフラグメントを作製するために、ＴＯＰＯクローニングされたＡ２のＤＮＡを、プライマー「モジュール ａｍｐ フォワード」（配列番号１１４）および「モジュール ａｍｐ リバース」（配列番号１１５）（表５）でＰＣＲ増幅し、精製して、ＡｃｕＩまたはＢｐｍＩでの消化のために２つに分けた。Ａ３発現構築物を作製するためのプロセスの残りは、Ａ２構築物を作製するために用いたものと同じであって、ここでＡ３をコードするＤＮＡを、Ａ２構築ブロックからアセンブルした。再度、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にアセンブルされたＡ３のＤＮＡの同時的なクローニングによって、より高次の融合物の生成のための遺伝物質を得た。
Ａ４およびＡ５細菌発現構築物の調製のために、アダプターモジュールを、Ａ３発現構築物内のマルチ−Ｔｎ３コード配列の３’末端に導入した。この目的を達成するために、Ａ３発現ベクターを最初に、ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、切り出したフラグメントを、オリゴヌクレオチド「ｐＳｅｃフォワード中のインサートＢａｍＨＩ（ｉｎｓｅｒｔ ＢａｍＨＩ ｉｎ ｐＳｅｃ ｆｏｒｗａｒｄ）」（配列番号１１６）および「ｐＳｅｃリバース中のインサートＢａｍＨＩ（ｉｎｓｅｒｔ ＢａｍＨＩ ｉｎ ｐＳｅｃ ｒｅｖｅｒｓｅ）」（配列番号１１７）（表５）を含有する二重カセットで置き換えた。対応するｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ構築物由来のＡ２およびＡ３配列のＰＣＲ増幅を、プライマー「モジュールインサートＢａｍＨＩフォワード（モジュール ｉｎｓｅｒｔ ＢａｍＨＩ ｆｏｒｗａｒｄ）」（配列番号１１８）および「モジュールａｍｐリバース（モジュール ａｍｐ ｒｅｖｅｒｓｅ）」（配列番号１１５）（表５）で行った。増幅された生成物を、ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩで二重消化して、同時に消化したＡ３発現構築物中にクローニングした。
タンパク質Ａ６−Ａ９を、ＷＯ２００９／０５８３７９（Ａ２）の実施例１６に記載されるように、２９３Ｆ細胞の一過性のトランスフェクションによって発現した。簡潔に述べると、発現ベクターを、細菌発現構築物からＴｎ３モジュール（単数または複数）をＰＣＲ増幅すること、ならびにＦｃ融合物もしくは抗体タンパク質の発現のために、Ｆｃ領域、カッパ軽鎖定常領域および／またはＣＨ１ヒンジＣＨ２−ＣＨ３重鎖定常領域をコードする自家ベクター中にこれらをクローニングすることによって生成した。タンパク質Ａ９については、Ｔｎ３モジュールは、ヒトのＩｇＧ１重鎖およびカッパ軽鎖中の抗体可変領域を置き換える。タンデム構築物のＦｃ融合物を作製するための適合するのＮｈｅＩおよびＫａｓＩ部位を付加するプライマーを表５に示す。
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タンパク質の発現および精製：多価または直鎖状のＴｎ３タンパク質は、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＭＤ／Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）中で発現され、Ｈｉｓ−タグ化タンパク質は、Ｎｉ ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて培養培地から精製した。驚くべきことに、分子量の大きな相違にもかかわらず、Ｅ．ｃｏｌｉ中で中レベルから高レベルで発現されるこれらの構築物の全てが、培地中に効率的に分泌された（表６および図３）。
Ｆｃ融合および抗体様タンパク質（Ａ６−Ａ９）を発現するために、２９３Ｆ細胞を、適切な発現構築物で一過的にトランスフェクトした。上清の回収は、６日および１０日に行い、タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
全ての精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＮｕＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘで、ＭＥＳ緩衝液中の４〜１２％のビストリスゲル上で還元剤なしで分析し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて可視化した。サイズ排除クロマトグラフィーもまた用いて、精製されたタンパク質を分析し、必要に応じて、凝集した物質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ＧＬまたはＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）のいずれかで除去して、総タンパク質の１０％未満の最終レベルにした。Ｍｕｓｔａｎｇ Ｅ膜を備えるＡｃｒｏｄｉｓｃユニット（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）を、製造業者が示すとおり用いて、細菌発現したタンパク質調製物からエンドトキシンを除去した。
Figure 2013529070
実施例３
一価および多価のＴｎ３タンパク質についてのＴＲＡＩＬ Ｒ２結合親和性
一連のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３タンパク質の結合親和性に対するＴｎ３の価数の影響を測定するために、競合的ＥＬＩＳＡ実験を行った。９６ウェルのＮＵＮＣ ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を、Ａ９（１Ｃ１２）（配列番号１５４＋配列番号１４５）ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的な足場を用いて、抗体様の形式で、ＰＢＳ中で、２μｇ／ｍｌで、４℃で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０＋１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡでブロックした。Ａ１（１Ｅ１１単量体）、および線形方式のＡ２（１Ｅ１１二価）またはＡ３（１Ｅ１１四価）多量体足場の希釈物を、このコーティングしたプレート上で０．７５ｎＭのビオチニル化ＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃとともに、２時間室温で、ＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０＋１ｍｇ／ｍｌＢＳＡｎ中でインキュベートして、洗浄した。結合したビオチニル化ＴＲＡＩＬ Ｒ２ Ｆｃを、ストレプトアビジンＨＲＰ、ＴＭＢで検出して、酸で中和した。吸光度は、４５０ｎｍで読み取った。データを図４に示す。結合親和性（ＩＣ５０）を、表７に示しており、ビオチニル化ＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃの最大結合を５０％まで減少するために必要な競合するタンパク質の濃度として算出した。
Ａ２およびＡ３についてのＩＣ５０値は、単量体Ａ１のものよりも少なくとも３０倍低く、かつこのアッセイの限界である（すなわち、ビオチニル化ＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃの濃度にほぼ等しい）。固定されたＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的なＴｎ３に対するビオチニル化ＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃの結合は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２結合構築物によって置き換えた。
単量体のＡ１タンパク質に対して、二価および四価のＡ２およびＡ３タンパク質は、３０〜４０倍高い親和性でＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃに結合し、これは、多重Ｔｎ３モジュールがその結合活性を保持し、かつ結合活性効果を通じて高い親和性に寄与することを示すものである。一価および二価または四価のＴｎ３タンパク質の間の親和性における真の差異は、Ａ２およびＡ３についてのＩＣ５０値がこのアッセイで用いられるビオチニル化ＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃの濃度とほぼ等しかったと仮定すれば（０．７５ｎＭ）、３０〜４０倍大きいものであり得る。
Figure 2013529070
実施例４
細胞結合の確認のためのフローサイトメトリー
フローサイトメトリーを用いて、Ｈ２１２２細胞の表面上で発現される内因性ＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する多価ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的なＴｎ３タンパク質の結合の特異性を確認した。付着性のＨ２１２２細胞（非小細胞細胞肺癌腺癌細胞株）を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて組織培養フラスコから剥がした。細胞を、完全培地（１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０培地）ですすぎ、ＰＢＳ／２％ＦＢＳ中に約２×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。Ｔｎ３タンパク質Ａ９（１Ｅ１１）（配列番号１５８＋配列番号１５９）、四価抗体様の形式の多量体足場、または形式の適合した対照のＴｎ３タンパク質Ｂ９（クローンＤ１）を、４０ｎＭの濃度でＰＢＳ中で／２％ＦＢＳ中で調製した。
細胞を、１ウェルあたり７５μｌで９６ウェルのＵ底（丸底）プレートに播いて、タンパク質試料を、１ウェルあたり２５μｌで添加した（１０ｎＭの最終濃度まで）。プレートを、４℃で約１時間インキュベートし、次いでＰＢＳ／２％ＦＢＳで３回洗浄した。抗ヒトＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲートした添加された二次抗体を添加して（１００μｌ／ウェル）、プレートを４℃で約３０分間インキュベートして、上記のように洗浄した。細胞を、１００μｌのＰＢＳ／２％ ＦＢＳ中に再懸濁して、フローサイトメトリー分析を、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩ血球計算器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて行った。対照に対してＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的な Ｔｎ３タンパク質とインキュベートした場合の傾向的に標識したＨ２１２２細胞でのシフト（増大）によって、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的なＴｎ３タンパク質が、細胞性ＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合し得ることが確認された（図５）。
実施例５
ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的なＴｎ３タンパク質によるＨ２１２２細胞のアポトーシスに対する価数および形式（フォーマット）の効果
アポトーシス性の細胞死は、細胞表面ＴＲＡＩＬ Ｒ２の架橋によって、癌細胞株で誘導され得る。この効果は、生存細胞の数を測定する細胞アッセイで決定され得る。この目的を達成するために、肺癌細胞株Ｈ２１２２細胞を、９６ウェルプレート中に、１０、０００細胞／ウェルの密度で、７５μｌの完全培地（１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０培地）中でプレートした。一晩３７℃でインキュベーションした後、培地に、連続希釈のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的な（クローン１Ｅ１１）または負の対照（クローンＤ１）Ｔｎ３タンパク質を含有する２５μｌの追加の培地を補充した。全ての処置は、二重のウェルで行った。市販のＴＲＡＩＬリガンド（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を、ＴＲＡＩＬ受容体−誘導性の細胞死の陽性対照として用いた。７２時間後、ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏキット（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を、製造業者の指示に従って用いて、培養中の生存細胞の数の指標であるＡＴＰレベルをアッセイした。アッセイの発光は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｐｌａｔｅリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で測定した。細胞生存の阻害は、処理した細胞についての発光の値を未処理の生存細胞についての平均の発光で除すことによって決定した。阻害対化合物濃度の用量応答プロットを作製し、細胞殺滅力価（ＥＣ５０）は、細胞生存度の５０％を阻害するのに必要なタンパク質の濃度として決定した。
多価ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的なＴｎ３タンパク質のプロアポトーシス性の活性に対する価数の影響を試験するために、Ｈ２１２２細胞を、一価のＴｎ３タンパク質Ａ１（クローン１Ｅ１１）、および一連の直鎖状に融合されたＴｎ３タンパク質Ａ２−Ａ５（各々のクローン１Ｅ１１）（２、４、６または８のＴｎ３モジュールを含む）で処理した。一価および二価のＴｎ３タンパク質は、殺滅活性をまったくまたはほとんど示さなかったが、４、６および８のＴｎ３モジュールを含有するタンパク質は、Ｈ２１２２細胞生存度を強力に阻害し、ここで力価は、価数の関数として増大した（図６Ａ；表８）。タンパク質Ａ３（四価）は、ＴＲＡＩＬ、天然のＴＲＡＩＬ Ｒ２リガンドに対して類似の力価を有するが、タンパク質Ａ４（六価）およびＡ５（八価）は、１〜２対数強力であった。このアッセイから、所定の分子フォーマットについて、細胞殺滅は、アッセイがもはや識別できない点まで高い価数で改善することが明らかである。
Figure 2013529070
細胞生存度の阻害が、ＴＲＡＩＬ Ｒ２結合に依存することを示すため、１００ｐＭのタンパク質Ａ５（クローンＧ６）（すなわち、１６７×ＥＣ５０）を、Ｈ２１２２細胞と共に、可溶性のＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃタンパク質の存在下でインキュベートした。可溶性のＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃによる細胞殺滅の用量依存性の抑制は、細胞殺滅が、細胞表面ＴＲＡＩＬ Ｒ２に対するタンパク質Ａ５結合に依存することを示すものである（図６Ｂ）。クローン１Ｅ１１ループを含むタンパク質Ａ５で同様の結果が示された（データ示さず）。
結合モジュールの数に加えて、多価Ｔｎ３タンパク質の活性はまた、個々の結合単位を示すために用いられる分子フォーマットによって影響され得る。活性に対する分子フォーマットの効果を試験するために、Ｈ２１２２細胞を、同じ数のＴｎ３結合モジュールの同じ数を提示する種々のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的なＴｎ３タンパク質で処理した。四価タンパク質Ａ３、Ａ７およびＡ９（各々クローン１Ｅ１１）が、Ｈ２１２２細胞の殺滅を誘導する能力を、細胞生存度アッセイで試験し、同様に、八価のＴｎ３タンパク質Ａ５およびＡ８（各々クローン１Ｅ１１）の対も試験した。不活性な一価および二価のタンパク質を、負の対照として、およびＴＲＡＩＬを正の対照として含めた（図７；表９および表１０）。図７Ａでは、４の価数で試験した３つの構築物について、Ａ３（直鎖状フォーマット）およびＡ７（Ｆｃ融合物フォーマット）が、それらの細胞殺滅活性において同様であり、かつＡ９よりもＨ２１２２細胞を殺滅するのに強力であることが明らかである（抗体様の融合形式）。これによって、Ｔｎ３モジュールの空間的配向が、生理活性にかなりの影響を有し得、ここでＡ３は、Ｈ２１２２細胞生存度を阻害するのにおいてＡ９タンパク質よりも約１５０倍強力であることが明確に示される（表９）。図７Ｂによって、八価のＴＲＡＩＬ Ｒ２結合性Ｔｎ３タンパク質、Ａ５（直鎖状）およびＡ８（Ｆｃ融合物）の両方の形式とも、Ｈ２１２２細胞の生存度を阻害するのに同様の有効性を有することが示される。これらの構築物についてのＥＣ５０データを、表９に示す。親和性、価数および空間配向を繊細に調節する能力によって、所望の治療結果を正確に操作する能力に関してかなりの柔軟性が得られる。
Figure 2013529070
Figure 2013529070
実施例６
細胞株Ｃｏｌｏ２０５およびＪｕｒｋａｔにおける用量依存性の細胞殺滅
多価ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的なＴｎ３タンパク質が、Ｈ２１２２以外の癌細胞株を殺滅し得ることを示すために、他のＴＲＡＩＬ Ｒ２発現性の細胞株も試験した。結腸直腸腺癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５（図８Ａ）およびＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞白血病株（図８Ｂ）を、それらが、タンパク質Ａ３（四価、直鎖状形式）（配列番号１４３）およびＡ５（八価、直鎖状フォーマット）（配列番号１４５）（各々クローンＧ６）によって殺滅され得る能力について試験した。各々の細胞株を、Ａ３、Ａ５、正の対照ＴＲＡＩＬ、または負の対照タンパク質Ｂ５（配列番号１４８）（これは、ＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合しない）とともにインキュベートして、細胞生存度アッセイを、Ｈ２１２２について記載されるとおり行った。これらの細胞株の各々において、Ａ５は、細胞生存度の極度に強力な阻害を示す。より低い価数のＡ３タンパク質はまた、Ａ５よりも低い価数ではあるが、細胞殺滅を誘導する。従って、構築物の価数が高いほど、大きい活性を示す。予想どおり、ＴＲＡＩＬはまた、細胞生存度を阻害し得るが、八価の負の対照タンパク質Ｂ５（ＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合しない）は阻害し得ない。
Figure 2013529070
Figure 2013529070
細胞は、実施例５のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイによって分析した。
実施例７
マウスのＣＤ４０Ｌ特異的な二価のタンデム足場のデザイン、発現および活性
二価のマウスＣＤ４０Ｌ特異的なＴｎ３タンパク質（表１３）を、一対の同一のＴｎ３モジュールを融合することによって調製した。Ｍ１３は、マウスＣＤ４０Ｌに特異的に結合するＴｎ３タンパク質である。Ｍ１３配列は、Ｔｎ３の配列に対応し、ここでは、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループの配列が、それぞれ、配列番号１００、１０４および１１０に対応する配列を有する別のループで置き換えられる（表４を参照のこと）。Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（ＧＳ）ユニットの１（構築物Ｃ１（Ｍ１３））、３（構築物Ｃ２（Ｍ１３））、５（構築物Ｃ３（Ｍ１３））、または７（構築物Ｃ４（Ｍ１３））コピーを含むリンカーを用いて、１３〜４３アミノ酸の総リンカー長を得た（図９Ａおよび表３を参照のこと）。
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簡潔に述べると、発現構築物を、以下のとおり生成した：フラグメントＡは、Ｔｎ３遺伝子の上流のｐＳｅｃベクターに特異的なプライマー、およびプライマー「１−３ ＧＳリンカー リバース」（配列番号１２３）を用いる、実施例１に記載されるｐＳｅｃ−ｏｐｐＡ（Ｌ２５Ｍ）ベクター中にクローニングされたマウスＣＤ４０Ｌ結合因子ｐＳｅｃ−Ｍ１３のＰＣＲ増幅によって生成した（用いられるＴｎ３特異的プライマーの配列については表１４を参照のこと）。フラグメントＢ１ＧＳおよびＢ３ＧＳは、それぞれ、プライマー「１ＧＳリンカー」（配列番号１２１）または「３ＧＳリンカー」（配列番号１２２）、およびＴｎ３遺伝子の下流のｐＳｅｃベクターに特異的なプライマーを用いて同じテンプレートのＰＣＲ増幅によって生成した。フラグメントをゲル精製して、フラグメントＡおよびＢ１ＧＳ、またはフラグメントＡおよびＢ３ＧＳを混合して、タンデム構築物を、２つのｐＳｅｃベクター特異的なプライマーを用いてＰＣＲ反応において重複ＰＣＲによって生成した。この生成物を、ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで消化して、ｐＳｅｃ−ｏｐｐＡ（Ｌ２５Ｍ）ベクター中に、実施例１に記載のようにクローニングして戻し、２つの構築物を得た：Ｃ１（Ｍ１３）およびＣ２（Ｍ１３）。５および７のＧＳリンカー構築物を生成するために、プライマー「ＧＳ Ｌ Ａｍｐ フォワード」（配列番号１２６）および「ＧＳ Ｌ Ａｍｐ リバース」（配列番号１２７）を用いて、それぞれ、オリゴヌクレオチド「５ＧＳリンカー」（配列番号１２４）および「７ＧＳリンカー」（配列番号１２５）のＰＣＲ増幅によって生成されたリンカー挿入物を、ＰｓｔＩおよびＸｍａＩで消化して、ＰｓｔＩおよびＸｍａＩを用いてｐＳｅｃＭ１３−１ＧＳ−Ｍ１３を切断することによって生成したベクターフラグメント中にクローニングして、構築物Ｃ３（Ｍ１３）およびＣ４（Ｍ１３）を得た。
Figure 2013529070
同一のＴｎ３足場を含む一価および二価のタンデム構築物を、実施例２に記載のように、組み換え的に発現して、Ｅ．ｃｏｌｉから精製した。図９Ｂは、還元条件および非還元条件下での精製タンパク質調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
二価タンデムＭ１３−Ｍ１３構築物の結合有効性を試験して、それらを、一価のＭ１３足場と比較するために、それらが、バイオセンサーチップ上に固定されたマウスＣＤ４０受容体に対するマウスＣＤ４０Ｌ結合の競合的阻害を試験した。
簡潔に述べると、ＩｇＧ１のＦｃ領域とのキメラ融合の形態であるマウスＣＤ４０受容体のフラグメントを、約３０００という応答ユニットの密度でＧＬＣチップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上に固定した。競合結合アッセイについて、一価のＭ１３または異なるリンカー長を有するＭ１３のタンデム二価構築物の３倍連続希釈を、２０分間、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２００および０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有するＰＢＳ中に含まれる固定濃度のＥ．ｃｏｌｉ生成組み換えマウスＣＤ４０Ｌ（０．５μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。次いで、これらの試料を、３０μＬ／分の流速でＧＬＣチップ上に３００秒間注入して、結合したＣＤ４０Ｌのレベルをセンサーグラム内で固定の時点で記録して、任意の競合因子の非存在下で、結合したタンパク質の対応するレベルと比較した。各々の結合測定の後、残りのＣＤ４０Ｌを、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）を注入することによってチップ表面から脱着させた。非特異的な結合の効果を、チップのインタースポットからセンサーグラムを差引きすることによって修正した。マウスＣＤ４０Ｌの５０％を置き換えるのに必要なＴｎ３構築物の濃度に対応するＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて算出した。
図９Ｃに示されるとおり、Ｍ１３単量体についての最大半減阻害濃度（ＩＣ５０）は７１ｎＭであったが、二価タンデム構築物Ｃ１（Ｍ１３）についてのＩＣ５０は２９ｎＭであった。５または６ｎＭという同様のＩＣ５０値が、より長いリンカーを含む二価構築物について得られた（それぞれ、構築物Ｃ２（Ｍ１３）、Ｃ３（Ｍ１３）およびＣ４（Ｍ１３））。このアッセイで用いられるＣＤ４０Ｌの濃度に起因して、これは、このアッセイで観察できるＩＣ５０の下限である。この二価構築物は全てが、一価の構築物に比較して低いＩＣ５０値を有し、このことは、単一のＭ１３ Ｔｎ３モジュールに比較して二価タンデム構築物の結合活性の増強を示した。これらの二価構築物におけるリンカー長は、アッセイ力価に対してある程度の効果を示し、ここでは最短のリンカー長の構築物が中間の力価を有するが、２３以上のアミノ酸のリンカーを有するこれらの構築物は、このアッセイで等価である。
細胞に基づいたの活性において二価タンデムＴｎ３構築物の活性を試験し、それらを一価のＭ１３足場と比較するために、Ｂ細胞上のマウスＣＤ４０Ｌ−誘導性のＣＤ８６発現の阻害を試験した。対照として、市販の抗マウスＣＤ４０Ｌ特異的な抗体（ＭＲ１）を、平行して試験した。
このアッセイは、健常なボランティア由来の血液から調製したＰＢＭＣを利用する。簡潔に述べると、新鮮に吸引した血液を、ヘパリンを含むＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＣＰＴ（商標）細胞調製試験管中に収集した。遠心分離後、ＰＢＭＣを含有する細胞層を、収集して、ＰＢＳを用いて２回、およびＲＰＭＩ １６４０培地を用いて１回洗浄した。細胞を、完全ＲＰＭＩ １６４０培地（１０％熱不活化ウシ胎仔血清を補充、１％Ｐ／Ｓ）中に、５×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。
マウスＣＤ４０Ｌ−発現性のＴｈ２細胞株Ｄ１０．Ｇ４．１を、洗浄して、完全ＲＰＭＩ １６０培地中に、１×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。
Ｍ１３、Ｍ１３−Ｍ１３タンデム二価構築物Ｃ１−Ｃ４、またはＭＲ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号１０６５０８）を、完全ＲＰＭＩ １６４０培地中で連続希釈した（１：３）。各々の希釈物の５０μｌサンプルを、９６ウェル丸底組織培養プレート中のウェルに添加した。次いで、各々のウェルに５０μｌのＤ１０．Ｇ４．１細胞（５×１０４）を入れて、混合後、プレートを、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、１００μｌの再懸濁したＰＢＭＣ（５×１０５細胞）を、各々のウェルに添加して、３７℃で２０〜２４時間インキュベートした。
ＰＢＭＣを収集して、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ８６（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５５６６０）およびＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ１９（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５５４１２）が含有されるＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．４、１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム）４℃で３０分間、暗所で染色した。ＦＡＣＳ緩衝液中での２回洗浄後、次に試料を、ＦＡＣＳ ＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。ＣＤ１９ゲートしたＢ細胞上のＣＤ８６発現を評価した。ＣＤ８６発現の分析は、試験タンパク質の関数として、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて行った。
図９Ｄに示されるとおり、二価Ｍ１３−Ｍ１３タンデム構築物は全てが、ＭＲ１抗体（１００ｐＭ）のＩＣ５０に匹敵する、１００〜２００ｐＭというＩＣ５０でＣＤ８６発現を阻害し、Ｍ１３一価足場自体よりも約３ ｌｏｇ強力であった。生化学的アッセイと異なり、この細胞に基づいたのアッセイでは、リンカー長の効果は観察されず、そして、１３〜４３アミノ酸長におよぶリンカーを有する二価構築物は全てが、一価のタンパク質に比較して力価を増強に関し同じ能力を示す。
実施例８
二重特異性のタンデム足場の発現
ＴＲＡＩＬ Ｒ２およびヒトＣＤ４０Ｌ（ＨｕＣＤ４０Ｌ）に特異性を有する二重特異性のＴｎ３構築物を生成するために、２つのＴｎ３モジュール（１つは、ＴＲＡＩＬ Ｒ２に特異性を有するもの（クローン１Ｅ１１）、および１つは、ヒトＣＤ４０Ｌに特異性を有するもの（クローン７９））を２つのモジュールを分ける可変長のリンカーと一緒に融合した（表３および表１５）。クローン７９タンパク質の配列（配列番号１８４）は、Ｔｎ３モジュールの配列に対応し、ここでＢＣ、ＤＥ、およびＥＦループは、それぞれ、配列番号１０１、１０５および１１１に対応する別のループで置き換えた。１および３個のＧｌｙ４Ｓｅｒ（ＧＳ）リピートを有するリンカーを含む、タンデム二重特異性の足場についての発現構築物（それぞれ、構築物Ｃ６およびＣ８）は、Ｔｎ３改変体Ａ１および７９を担持するプラスミドを、最初にＰＣＲテンプレートとして用いたこと以外は、実施例７に記載のとおり生成した。構築物Ｃ５（ヒトテネイシンＣにおける第二および第三のＦｎＩＩＩドメインを連結する天然の配列由来の短いリンカーを含み、これは、第三のＦｎＩＩＩドメインのＡβ鎖の一部と解釈され得るが、足場結合には必要ではない）、および構築物Ｃ７は、「０ ＧＳリンカー リバース」を、「１−３ ＧＳリンカー リバース」の代わりにＣ５に用いたこと以外は、表１６に列挙される追加のプライマーを用いて、Ｃ６およびＣ８と同様の方法で生成した。
Figure 2013529070
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一価、ならびにタンデム二重特異性のＴｎ３足場を、実施例２に記載のようにＥ．ｃｏｌｉ培地で組み換え的に発現させた。可溶性構築物の発現レベルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。図１０は、試験した構築物について許容できる発現レベルを示す。
実施例９
二重特異性のタンデム足場の特異的な結合
ＣＤ４０ＬおよびＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する二重特異性のＴｎ３構築物の結合を測定するために、捕捉ＥＬＩＳＡアッセイを使用した。簡潔に述べると、８×Ｈｉｓ−タグ化タンパク質構築物：Ａ１、７９、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８（詳細に関しては、表１５を参照のこと）を、Ｅ．ｃｏｌｉ培地から、抗Ｈｉｓ抗体コーティングしたウェル上に以下のとおり捕捉した。９６ウェルのＭａｘｉＳｏｒｂプレートを、Ｑｉａｇｅｎ抗Ｈｉｓ抗体を用いて２μｇ／ｍｌで一晩コーティングした。コーティングしたプレートを、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０および４％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳（ＰＢＳＴ４％乳）を含有するＰＢＳで１．５時間ブロックした。コーティングしたプレートを、ＰＢＳＴで洗浄して、可溶性の発現されたタンパク質を含有する希釈した細菌培地（３０倍希釈）を添加して、プレートを室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴでの洗浄後、捕捉された構築物を含有するウェルを、種々の濃度のビオチニル化ＴＲＡＩＬ Ｒ２（図１１Ａ）またはＥ．ｃｏｌｉ産生のＨｉｓタグ化ＨｕＣＤ４０Ｌとビオチニル化抗Ｈｉｓ抗体とのプレインキュベーションによって生成された複合体（図１１Ｂ）のいずれかとともに１．５時間インキュベートした。ＰＢＳＴでの洗浄後、結合したＴＲＡＩＬ Ｒ２またはＨｕＣＤ４０Ｌ／抗Ｈｉｓ抗体複合体を、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＲＰＮ１２３１Ｖ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；１０００×ワーキング希釈液）を用いて２０分間検出し、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）の添加によって比色分析によって検出した。吸光度は、４５０ｎｍで読んだ。
ＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する二重特異性のタンデムＴＲＡＩＬ Ｒ２−ＨｕＣＤ４０Ｌ特異的な足場の結合、およびＨｕＣＤ４０Ｌに対する二重特異性のタンデムＴＲＡＩＬ Ｒ２−ＨｕＣＤ４０Ｌ特異的な足場の結合を、それぞれ図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。ＨｕＣＤ４０Ｌ特異的なＴｎ３ドメインに融合されるＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的なＴｎ３ドメインを含む、Ｃ５〜Ｃ８と命名された二重特異性のタンデム足場は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２およびＨｕＣＤ４０Ｌに結合した；しかし、単量体の／一価特異的なＴｎ３構築物Ａ１および７９は、それらの既知の特異性に従ってＴＲＡＩＬ Ｒ２またはＨｕＣＤ４０Ｌのいずれかに結合したが、両方の標的には結合しなかった。
ＴＲＡＩＬ Ｒ２およびＨｕＣＤ４０Ｌに対するタンデムＴＲＡＩＬ Ｒ２−ＨｕＣＤ４０Ｌ特異的構築物の同時結合は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイを用いて決定した。タンパク質Ａ１、７９、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７およびＣ８を含有するＥ．ｃｏｌｉ培地の希釈物を、１０ｎＭのＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃ融合タンパク質、５０ｎＭのビオチニル化 ＨｕＣＤ４０Ｌ（Ｅ．ｃｏｌｉで産生）、ストレプトアビジンＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎドナービーズ（０．０２ｍｇ／ｍｌ）およびプロテインＡ ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアクセプタービーズ（０．０２ｍｇ／ｍｌ）が含有されるＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ＋０．１％ＢＳＡとともにインキュベートした。試料を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー中での読み取りの前に暗所で１時間インキュベートした。ドナービーズ集団を、６８０ｎｍのレーザーで励起して、一重項酸素の放出を生じた。一重項酸素は、寿命が限られており、基底状態に戻る前に拡散によって最大２００ｎｍまで移動することを可能とする。一重項酸素は、アクセプタービーズを励起させて、５２０〜６２０ｎｍの光の放射を生じる（これは、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダーで測定される）。ドナーおよびアクセプタービーズが近位である場合のみ、シグナルが生成される。従って、シグナルの増大は、２種のビーズが、２つの標的と同時に相互作用する分子によって一緒にされる場合に観察される。いずれの標的に対する結合も存在しなければ、シグナルは検出されないはずである。
図１２に示すとおり、タンデム二重特異性構築物は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２およびＨｕＣＤ４０Ｌに同時に結合して、強力なＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎシグナルを生成した；しかし、一価のＴｎ３足場、Ａ１および７９は、シグナルを生成せず、このことは、それらが、両方の標的を同時に結合することによってドナーおよびアクセプタービーズを近位にし得ないことを示す。
実施例１０
９アミノ酸長のＦＧループを有するＴｎ３足場の安定性の増大
Ｔｎ３安定性に対するＦＧループ長の影響を測定するために、ｐＨ７．０での塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）による６つのＨｕＣＤ４０Ｌ特異的なＴｎ３足場の折り畳みを、内因性のトリプトファン蛍光によって評価した。これらのＴｎ３単量体足場は、９、１０または１１アミノ酸のＦＧループ長を含んだ。種々の濃度の塩酸グアニジンを含有する０．０５ｍｇ／ｍＬのＴｎ３足場のサンプルを、ｐＨ７．０で５０ｍＭのリン酸ナトリウム中で調製した。蛍光放射スペクトルは、Ｈｏｒｉｂａ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−４スペクトロフルオロメーターで、２８０ｎｍの励起波長で得た。３６０ｎｍの相対的な蛍光放射強度を、各々のタンパク質についてＧｕＨＣｌ濃度の関数としてプロットした。各々の足場は、固有のＢＣ、ＤＥ、およびＦＧのループ配列を含んだ。クローンＡ３（配列番号１８５；本実施例のＡ３単量体足場は、表３に提供されるようにＡ３と命名された構築物とは別であることに注意）、７１（配列番号１８６）、７９（配列番号１８４）、１２７（配列番号１８７）、２５２（配列番号１８８）、および２３０（配列番号１８９）は、ｐＨ７．０で３．０ＭのＧｕＨＣｌ（親のＴｎ３の５０％未折り畳みを発揮するのに必要なＧｕＨＣｌ濃度（Ｃｍ）である）中で５０％を超えて未折り畳みであった。クローンＡ３、７９、１２７、２５２および２３０のＣｍ値は、それぞれ、２．２Ｍ、２．７Ｍ、２．４Ｍ、２．７Ｍ、２．４Ｍであった。これらのクローンについてのＦＧループ長は、それぞれ、１１、１１、１１、１０および１１アミノ酸であるが、親のＴｎ３のＦＧループ長は、１０アミノ酸である。驚くべきことに、クローン７１（９アミノ酸というＦＧループ長を有する唯一の改変体）は、親のＴｎ３足場、または試験した他の５つの改変体よりも有意に高い安定性である、４．２ＭというＣｍを示した。結果を図１３に示す。
Ｔｎ３クローン７１の安定性の増強が、その配列に内因性であるか、または短縮されたＦＧループ長の結果であるかを決定するため、このクローンおよび２つの通過の単量体のＴｎ３足場タンパク質、（Ａ６（配列番号１９０；本実施例におけるＡ６単量体の足場は、表３に提供されるようにＡ６と命名された構築物とは別であることに注意）およびＰ１Ｃ０１（配列番号１９１））、であって９アミノ酸のＦＧループ長を有する（ただし、異なるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ配列）を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって分析し、１０アミノ酸長さであるＦＧループを含む親のＴｎ３足場と比較した。Ｔｎ３タンパク質サンプルは、１ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で分析した。全ての場合に、熱未折り畳みの中点は、１０残基のＦＧループを有する親（ＷＴ）Ｔｎ３に比較して９残基ＦＧループを有するクローンについて高かった。熱未折り畳みは、同じサンプルを冷却して再加熱した場合、上書き可能なサーモグラムによって証明されるとおり、可逆性であるか、または部分的に可逆性（クローンＡ６）であった。図１４に示されるとおり、親のＴｎ３についての融点（Ｔｍ）は７２．１℃であって、Ｐ１Ｃ０１については、Ｔｍは７５．２℃であって、Ａ６については、Ｔｍは７７．５℃であって、かつ７１については、Ｔｍは７４．４℃であった。
これらの知見を、塩酸グアニジン安定性実験において同じＴｎ３タンパク質改変体を試験することによって、裏付けた。ｐＨ７．０での塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）による親の（ＷＴ）Ｔｎ３、Ｐ１Ｃ０１、Ａ６、および７１の未折り畳みを、上記のように内因性のトリプトファン蛍光によって評価した。図１５に示されるとおり、図１４のＤＳＣデータと一致して、Ｔｎ３クローンＡ６、７１、およびＰ１Ｃ０１は全てが、親の（ＷＴ）Ｔｎ３足場よりも有意に高いＧｕＨＣｌ濃度で未折り畳みの中点を有し、このことは、９アミノ酸長である（すなわち、親のＴｎ３足場の長さよりも短い）ＦＧループを有するＴｎ３タンパク質の安定性が増強されることを示す。
実施例１１
ＦＧループ長の安定性分析
上記のように、予備的分析によって、９残基というＦＧループ長を有するＴｎ３分子が、それより長いＦＧループを有するＴｎ分子よりも有意に安定であることが示された。これらの研究では、本発明者らは、１セットのランダムなＴｎ３で安定性分析を行って、熱安定性に対するＦＧループ長の効果を評価した。
Ｔｎ３ライブラリーを、ｐＳＥＣ発現ベクター中にサブクローニングした。このライブラリーは、種々の配列であって同様に種々のただし規定の長さのＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループを有するＴｎ３をコードする。これらの研究の焦点であるＦＧループは、９、１０または１１残基長であってもよい。ＢＣループは、９、１１、または１２残基長であってもよい。このライブラリーのＤＥループは、６残基という固定長を有する。サブクローニングされたライブラリーを用いて、ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換して、これからプラスミドプールを精製して、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換するのに用いた。ＢＬ２１コロニーを、配列決定して、全長Ｔｎ３をコードする９６クローンを特定した。この最終の９６クローンを、９６ディープ−ウェルプレート中に５００μｌのスケールで、標準のＭａｇｉｃ Ｍｅｄｉａ発現（接種後２４時間３７℃で振盪する）を用いて増殖して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。中度〜高度の発現レベルを有する２９個のランダムなクローンを、５０ｍＬ規模の発現までスケールアップして、標準的な固定金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。全てのタンパク質が何であるかは、質量分析法によって確認した。
ランダムなクローンを、ＤＳＣによって安定性に関して分析した。簡潔に述べると、ＤＳＣ測定は、ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ（ＭｉｃｒｏＣａｌ）で行った。タンパク質を、十分な透析を通じてＰＢＳ（ｐＨ ７．２）に交換して、ＤＳＣ分析のために０．２５〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調節した。サンプルを、２０〜９５℃で、９０℃／時間のスキャン速度で、反復スキャンなしで、スキャンした。結果を表１７に示す。
Figure 2013529070
この研究では、ループ長ＦＧ９またはＦＧ１０および１１を有するＴｎ３の熱安定性を比較した。この傾向は、長さ９のＦＧループを有するＴｎ３ドメインが、ループ長ＦＧ１０または１１を有するものよりも熱安定性であることを示す。対照の野生型Ｔｎ３ドメイン（１０残基のＦＧループを有する）は、上記のサンプルと平行して行った場合、７２℃のＴｍを有した。各々のループ長で見られるＴｍ値の範囲によって、他の要因もまた、Ｔｎ３ドメイン熱安定性を決定するのにある役割を果たすことが示される。
実施例１２
三重特異性のＴｎ３の生成および特徴付け
これらの実験では、３つの異なる標的に結合特異性を有するＴｎ３分子を生成して、特徴付けた。Ｄ１、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）抗体に特異的なＴｎ３ドメインは、それぞれ、１Ｅ１１（ＴＲＡＩＬ受容体２に特異的なＴｎ３ドメイン）、および７９（ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３ドメイン）に連結された（図１６Ａ）。この構築物は、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞で発現され、標準的な方法を用いて精製された（図１６Ｂを参照のこと）。
三重特異性の構築物が、同時に３つ全ての標的の対に結合し得るかを確認するために、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎおよびＥＬＩＳＡ実験の両方を行った。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ実験については、三重特異性のＴｎ３、３つの総標的分子のうちの２つのサブセット（１つは、ビオチニル化、他方は、抗体Ｆｃ領域を含む）、プロテインＡドナービーズ、およびストレプトアビジンアクセプタービーズを、上記のように、３８４ウェルのホワイトオプティプレート（ｗｈｉｔｅ Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ）中で合わせた。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎシグナルは、ストレプトアビジンドナービーズおよびプロテインＡアクセプタービーズがお互いに近位にある（お互いに２００ｎｍ）である場合にのみ観察され得、近位であることは、このアッセイでは、三重特異性の分子による架橋を通じて達成される。Ｄ１−１Ｅ１１−７９が同時に、ｈｕＣＤ４０Ｌおよび ＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃに（図１７Ａ）、ならびに同時にｈｕＣＤ４０Ｌおよび Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）に（図１７Ｂ）結合する能力は、以下のようにＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎによって確認された：３８４−ウェルのホワイトオプティプレート中で、以下の成分を総容量３０μｌ中に合わせた：２０ｍＭの精製したＤ１−１Ｅ１１−７９、５０ｍＭのビオチニル化−ｈｕＣＤ４０Ｌ、（０、１、２．５、５、１０、または４２ｎＭ）ＴｒａｉｌＲ２−Ｆｃ（図１８Ａ）または（０、１、２．５、５、１０、または４２ｎＭ）Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）（図１８Ｂ）、５μｌの各々の１／５０希釈のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎプロテインＡアクセプタービーズおよびストレプトアビジンドナービーズ。暗野での１時間のインキュベーション後、プレートを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー上で、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎモードで読んだ。
Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）およびＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃは両方とも、Ｆｃドメインを含むので、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイを用いても、三重特異性の構築物に対するこれらの分子の同時の結合を示すことはできなかった。その代わり、ＥＬＩＳＡ実験を行った。ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、ＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃ（１μｇ／ｍｌで１００μｌ）でコーティングして、４％ミルクでブロックし、次いで、種々の濃度の三重特異性構築物を添加した。ビオチニル化Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）、第二の標的リガンドを、添加して、ＨＲＰ−ストレプトアビジンの添加によって検出した（図１８）。Ｄ１−１Ｅ１１−７９はまた、図１８のＥＬＩＳＡの結果によって示されるように、同時にＴＲＡＩＬ Ｒ２−ＦｃおよびＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）の両方に結合し得ることが示された。従って、この構築物は、同時にその標的の３つ全ての対に結合し得ると本発明者らは、結論し得る。
実施例１３
リードの単離
アゴニストＴｎ３を開発する最初の工程は、ＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合し得、かつ多価形式に連結された場合アポトーシス経路に関与するように２つ以上のＴＲＡＩＬ Ｒ２細胞外ドメインに結合し得るＴｎ３単量体を単離することである。全ての結合因子がアゴニストとして機能し得るのではないので、本発明者らは、結合因子のパネルを最初に単離することを決め、次いで、インビトロの細胞殺滅アッセイで二次的に作用薬についてスクリーニングした。本発明者らは、最初に、結合因子の最初のパネルを単離するために、組み換えＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃ上で、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループに変化を有するＴｎ３の大きいファージ提示ライブラリーをパニングした。このライブラリーの基礎として選択したＴｎ３足場は、テネイシンＣからの天然の３番目のＦｎＩＩＩドメインではないが、安定性を改善するために遺伝子操作されたジスルフィドを有するバージョンであった。自家のＴｎ３／遺伝子３融合ファージディスプレイライブラリーを構築した（これは、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループ中にランダム化を含んでいた）。複数の結合因子が、ファージＥＬＩＳＡによって見出され、ここでは、ＴＲＡＩＬ Ｒ２を直接、プレート上にコーティングして、１：３希釈したファージのＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）１％ミルク中での結合を、抗Ｍ１３−ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって検出した。ほとんどの結合因子は、ループの１つの望ましくない遊離のシステインを有し、さらなる研究については選択されなかった。不対のシステインを欠くクローンのサブセットを、Ｆｃ融合物または抗体様構築物のいずれかを生じる発現ベクター中にクローニングし（図１）、細胞殺滅のために腫瘍細胞株Ｈ２１２２において試験した（データ示さず）。Ｆｃ融合形式では、その融合したＴｎ３にかかわらず、細胞を殺滅することができなかったが、抗体様の形式では、２つ以上の結合因子について応答を引き出した。
実施例１４
親和性成熟
クローン１Ｃ１２（配列番号１３２）（図１９を参照のこと）は、最初のスクリーニングアッセイにおける最高の細胞殺滅を示し、従って、親和性成熟のために選択された。親和性成熟は、Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発またはランダム化を含むオリゴヌクレオチドによるＰＣＲのいずれかを用いるループの一部の飽和突然変異誘発、アセンブリおよびファージディスプレイベクターへの連結によって行った。１回目および３回目は、それぞれＢＣおよびＦＧループの一部の別個の飽和突然変異誘発からなり、２回目は、３つ全てのループの一部の飽和突然変異誘発、パニング、遺伝子シャッフリング、次いでシャッフリングされた変異体のパニングを組み合わせて、最高の親和性のアウトプットクローンを得た。親和性成熟したクローンのプールは、ファージから直接ＰＣＲによって、またはＱｉａｇｅｎキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて一本鎖ＤＮＡを調製することおよび次いでＰＣＲよってパニング後に回収した。ＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩ〜ＫｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）消化して、本発明者らの自家の発現ベクターｐＳＥＣ中にクローニングした。このクローンを、ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で発現させて、ゲル上で泳動して、発現がクローンの間で大きく異ならなかったことを確認した。改善されたクローンを、競合ＥＬＩＳＡによって特定し、ここではプレートを、四価の抗体様の１Ｃ１２（配列番号１５４および１５５）でコーティングして、ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ中で、Ｔｎ３の希釈の存在下で０．７５ｎＭのＴＲＡＩＬ Ｒ２ビオチンの結合の阻害を、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて測定した。ＴＭＢ（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を添加して、酸で中和した。吸光度は、４５０ｎｍで読み取った。
親和性測定は、ＧＬＣセンサーチップを備えるＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６タンパク質相互作用アレイシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で２５℃で行った。０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４を含有するＰｒｏｔｅＯｎリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）を泳動緩衝液として用いた。ＴＲＡＩＬ Ｒ２を、チップ上に固定し、Ｔｎ３結合因子（１Ｃ１２（配列番号１３２）、１Ｅ１１（配列番号１３４）、Ｇ３（配列番号１３３）、Ｃ４（配列番号１３５）、およびＧ６（配列番号１３８））の２倍の１２ポイントの連続希釈を、３６μＭ〜７００ｎＭにおよぶ出発濃度で、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ７．４中で調製した。各々の濃度の試料を、６つの分析物チャネル中に、３０μｌ／分の流速で３００秒間注入した。Ｋｄは、ＰｒｏｔｅＯｎソフトウェア中で平衡分析設定を用いることによって決定した。各々の回の最良のクローンの配列を図１９に示す。３回の親和性成熟後の親和性の総改善は、ほぼ２ケタの大きさであって、最良のクローンは、４０〜５０ｎＭの範囲の親和性を有する（表１８）。
Figure 2013529070
実施例１５
抗体様形式での力価に対するＴｎ３親和性の効果
力価に対する個々のＴＮ３サブユニットの親和性の効果を評価するため、表１８のクローンの全てを、図１に示される抗体様の構築物中に再フォーマットした。抗体様のタンパク質を発現するために、２９３Ｆ細胞を、適切な発現構築物で一過的にトランスフェクトした。上清の回収を、６日目および１０日目に行って、タンパク質を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した。全ての精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＮｕＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘ４−１２％ビストリスゲル上で、ＭＥＳ緩衝液中で、還元剤なしで分析し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて可視化した。
サイズ排除クロマトグラフィーも用いて、精製したタンパク質を分析し、必要に応じて、凝集した物質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ＧＬまたはＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上で取り除いて、１０％未満の総タンパク質という最終レベルにした。ＭｕｓｔａｎｇＥ膜を備えるＡｃｒｏｄｉｓｃユニット（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）を、製造業者が示したとおり用いて、細菌が発現したタンパク質調製物から内毒素を取り除いた。
次いで、Ｈ２１２２細胞を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存度アッセイを用いて、アゴニストの抗体様の構築物に対する感度について試験した。このアッセイでは、蛍光は、９６ウェルプレートの所定のウェル内のＡＴＰのレベルに対して直接比例し、これが次に、代謝的に活性な生存細胞の量と直接比例する。Ｈ２１２２細胞株については、細胞を、９６ウェルプレート中に、１０，０００細胞／ウェルの密度で、７５μｌの完全培地（１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０培地）中でプレートした。３７℃での一晩のインキュベーション後、培地に２５μｌの追加の培地（ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的なまたは負の対照のタンパク質の連続希釈を含有）を補充した。全ての処理は、二重のウェルで行った。市販のＴＲＡＩＬ リガンド（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を、ＴＲＡＩＬ受容体誘導性の細胞死についての正の対照として用いた。
７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏキットを、製造業者の指示に従って用いた。アッセイの発光は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｐｌａｔｅリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で測定した。細胞生存度の阻害は、処理した細胞についての発光の値を未処理の生存細胞についての平均発光値で除すことによって決定した。
２つの可変量が効力を決定する：ある構築物が細胞の生存度を５０％まで阻害する濃度（ＥＣ５０）および細胞生存度の最大阻害。図２０は、一般的な傾向として、Ｔｎ３単量体親和性が大きいほど、抗体様構築物のＥＣ５０が低くなることを示す。なぜなら、Ｇ６は、１Ｅ１１よりも低いＥＣ５０を有し、かつ１Ｅ１１は、１Ｃ１２よりも低いＥＣ５０を有するからである。
実施例１６
直鎖Ｔｎ３の薬物動態
１つのタンデム（直列）あたりのＴｎ３モジュールの数の関数として直鎖Ｔｎ３タンデム半減期を決定するため、Ｇ６単量体（配列番号１３８）、Ｇ６タンデム４（配列番号１４３）、Ｇ６タンデム６（配列番号１９２）、およびＧ６タンデム８（配列番号１４５）を、マウスに注射し、Ｔｎ３の血清濃度をＥＬＩＳＡによってモニターした。投与の経路は、腹腔内（ＩＰ）注射であった。実験デザインを、表１９に示す。マウスを、１時点あたり１５０μＬ採血した。Ｔｎ３を、ＥＬＩＳＡによって血清中で検出し、ここでは自家で生成したＴＲＡＩＬ Ｒ２コーティングしたプレートを、ＰＢＳＴ１％ミルク中で希釈した血清とともにインキュベートした。最初のＥＬＩＳＡを行って、所定の時点について、アッセイの動的な範囲内にシグナルがあるように正確な希釈範囲を決定した。結合したＴｎ３を、ＰＢＳＴ１％ミルク中のウサギからのポリクローナル抗Ｔｎ３血清の１，０００希釈中の１（Ｃｏｖａｎｃｅ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）で、続いて、ロバ抗ウサギＨＲＰのＰＢＳＴ１％ミルク中の１０，０００希釈中の１（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）で検出した。各々の構築物について、標準曲線を作製し、統計学的分析を、自家の統計学的プログラムを用いて行った。
「最大血漿濃度」（「Ｃｍａｘ」）という用語は、患者に対する試験物質の投与後、血漿中のタンデムＴｎ３の最高の観察された濃度を指す。
「Ｔｍａｘ」という用語は、最大血漿濃度Ｃｍａｘまでの時間を指す。
「曲線下面積」（「ＡＵＣ」）という用語は、時間に対する血漿中のタンデムＴｎ３の濃度のプロットにおける曲線下の面積である。ＡＵＣは、時間間隔の間の即時的血漿濃度（Ｃｐ）の積分の指標であり得、質量＊時間／容量の単位を有する。しかし、ＡＵＣは通常は、時間間隔ゼロから無限まで示される。従って、本明細書において用いる場合、「ＡＵＣｉｎｆ」とは、無限の時間間隔にまたがるＡＵＣを指す。
「生物学的半減期」（「Ｔ１／２」）という用語は、タンデムＴｎ３の血漿濃度がそのもとの値の半分になるのに必要な時間として規定される。
「ＣＬ／Ｆ」という用語は、用量／ＡＵＣｉｎｆとして算出される見かけの総身体クリアランスを指す。
生物学的半減期（Ｔ１／２）は、直鎖状分子についてタンデムＴｎ３の数が増大するとともに増大する。７つのＴｎ３を付加して単量体からタンデム８を作製することで、半減期はほぼ５０％まで増大した。価数の増大は、Ｔｍａｘには影響しなかった。しかし、価数が１から８へ増大することによって、それぞれ、ＣｍａｘおよびＡＵＣｉｎｆにおいて、約１０倍および７倍の増大が生じた。さらに、価数が１から８まで増大する場合、クリアランスにおける約７倍の低下（ＣＬ／Ｆ）が観察された。
Figure 2013529070
Figure 2013529070
実施例１７
カニクイザル交差反応性の遺伝子操作された増強
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）での前臨床毒性試験のために、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）ＴＲＡＩＬ Ｒ２（ｃｙｎｏ ＴＲＡＩＬ Ｒ２）と交差反応する抗ＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｔｎ３を開発することが所望される。本発明者らの最初の親和性成熟したリードクローンは、ｃｙｎｏ ＴＲＡＩＬ Ｒ２との交差反応が乏しいが、ヒトＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する相同性は８８％である。交差反応性は、クローンＦ４（配列番号１３７）に基づくライブラリーを作製することによって増強されたが、このクローンは、親和性成熟から生じたクローンの間で最高のカニクイザル交差反応性を有するクローンであった。
２つのライブラリーを、飽和突然変異誘発によって作製した：１つは、ＦＧループ単独に多様性を有し、１つは、ＢＣおよびＦＧループに多様性を有した。低エラー率変異原性ＰＣＲをまた用いて、増強されたｃｙｎｏＴＲＡＩＬ Ｒ２結合に有益であり得るループの外側の変異を可能にした。４回のファージパニングを、自家で製造したｃｙｎｏ ＴＲＡＩＬ Ｒ２で行い、アウトプットを、ｐＳＥＣ発現ベクター中にクローニングした。ＥＬＩＳＡフォーマットにおける最初のヒットのスクリーニングのために、Ｔｎ３は、ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に分泌され、抗ｈｉｓタグ抗体（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いて上清から捕捉された。
捕捉されたＴｎ３に対する、溶液中のヒトまたはｃｙｎｏ ＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃのいずれかの結合を、抗ヒト−Ｆｃ−ＨＲＰによって検出した。ｃｙｎｏ ＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃに対する有意な結合を有し、かつヒトＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃに対する結合を失うと思われなかったクローンを、引き続くスクリーニングＥＬＩＳＡのために選択して、ここではヒトまたはｃｙｎｏ ＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃのいずれかを、プレート上にコーティングして、Ｔｎ３上清を滴定し、次いで抗ｈｉｓタグＨＲＰで検出した。クローンからクローンへの発現レベルの変化のレベルが低いため、およびまた溶液中に有する二価ＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃからのアビディティは、Ｔｎ３親和性における相違をマスクできなかったので、このＥＬＩＳＡが親和性識別を可能にした。１つの変異、ＤＥループの前のＤからＧの２つのアミノ酸の変異は、全ての操作されたカニクイザル交差反応性クローンに存在したことが見出された（図２２Ａ）。このＤからＧへの変異は、もとのＦ４に操作して、Ｆ４ｍｏｄ１という名称のクローン（配列番号１９３）を作製し、カニクイザルについての交差反応性は、ヒトＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する犠牲的結合なしに大きく改善された（図２２Ｂ）。このＥＬＩＳＡでは、精製されたＦ４またはＦ４ｍｏｄ１による、Ｆ４ｍｏｄ１コーティングしたプレートに対する０．７５ｎＭのヒトまたはｃｙｎｏ ＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃの結合の阻害を測定した。
ｃｙｎｏ ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｆｃに対するカニクイザル交差反応性の増強クローンの結合は、ヒトＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃに対するその結合の１０倍内であることが望ましい。また、ｃｙｎｏ ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｆｃに対するカニクイザル交差反応性の増強クローンの結合は、ヒトＴＲＡＩＬ Ｒ２−Ｆｃに対するＦ４の結合の１０倍内であることも望ましい。ｃｙｎｏ ＴＲＡＩＬ Ｒ２に対するＦ４ｍｏｄ１結合についてのＩＣ５０は、ヒトＴＲＡＩＬ Ｒ２に対するＦ４ｍｏｄ１結合についてのＩＣ５０よりも３倍未満異なる。さらに、ヒトＴＲＡＩＬ Ｒ２に対するＦ４ｍｏｄ１結合についてのＩＣ５０は、ヒトＴＲＡＩＬ Ｒ２に対するＦ４結合についてのＩＣ５０よりも６倍強い。従って、Ｆ４ｍｏｄ１は、意図される交差反応性の要件を満たす。
実施例１８
増強されたカニクイザル交差反応性クローンの生殖細胞系列の操作
クローンＦ４ｍｏｄ１をさらに操作して可能性のある免疫原性の危険性を低減するために生殖細胞系列から本質的でない変異を排除した。１２の異なる改変群を作製して、ヒトおよびカニクイザルの両方のＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する結合に対して所定の変異からの効果があったか否かを決定した。図２３Ａは、最終クローンＦ４ｍｏｄ１２（配列番号１９４）の比較を示しており、これは、他の構築物に対して、結合に影響しない全ての試験した生殖細胞系列変異を組み込む、すなわち、Ｔｎ３生殖細胞系列、もとのＦ４親、およびクローンＦ４ｍｏｄ１（最初の増強された遺伝子操作されたカニクイザル交差反応性）。
Ｆ４ｍｏｄ１２のアミノ酸配列は、天然のＴｎ３配列ＳＱで開始して、Ｌで終わり、ＡからＴへのフレームワーク２変異の逆転を有し、かつＤＥループの最後の２つのアミノ酸のＴＡからＮＱの逆転を有する。図２３Ｂは、Ｆ４、Ｆ４ｍｏｄ１、およびＦ４ｍｏｄ１２が全て、ヒトＴＲＡＩＬ Ｒ２に対するそれらの結合においてお互いの６倍内であることを示す。Ｆ４ｍｏｄ１およびＦ４ｍｏｄ１２は、ｃｙｎｏ ＴＲＡＩＬ Ｒ２に対するそれらの結合においてお互いの２倍内であることも示される。
Ｆ４ｍｏｄ１２は、タンデム６（配列番号１６７）およびタンデム８（配列番号１６６）構築物中に再フォーマットされて、試験されたＧ６タンデム６（配列番号１４４）およびタンデム８（配列番号１４５）に対する力価の損失がないことが確認された。図２３Ｃおよび図２３Ｄによって、遺伝子操作された生殖細胞系列について、Ｃｏｌｏ２０５細胞株におけるＧ５タンデムと比較して増強されたカニクイザル交差反応性Ｆ４ｍｏｄ１２タンデムは力価の損失がないことが示される。
実施例１９
ＴＲＡＩＬ耐性細胞株におけるＧ６タンデムの活性
複数の細胞株が、ＴＲＡＩＬによる殺滅に耐性である。従って、本発明者らは、ＴＲＡＩＬ感受性細胞株におけるＴＲＡＩＬに対するＧ６タンデム８構築物の力価の増強が、ＴＲＡＩＬ耐性細胞株におけるＧ６タンデム８の力価に現れるか否かを評価した。いくつかの癌細胞株におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対する感受性は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で決定した。簡潔に述べると、細胞を、９６ウェルプレート上にプレートして、一晩接着させ、次いで、種々の濃度の組み換えヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬおよびＴＲＡＩＬ模倣Ｇ６タンデム８が含まれる培地（１０％ＦＢＳ含有）で処理した。４８〜７２時間後、細胞生存度を、製造業者のプロトコールに従って決定した。図２４は、ＴＲＡＩＬ耐性細胞株ＨＴ２９について、Ｇ６タンデム８が、強力な細胞殺滅活性を示すが、ＴＲＡＩＬは示さないことを示す。表２１は、Ｇ６タンデム８が細胞殺滅活性を多くの、ただし全てではない試験したＴＲＡＩＬ耐性細胞株で有することを示す。結合モジュールの空間的配向も一定の効果を有する可能性はあるが、効力の増強は、ＴＲＡＩＬに比べて、タンデム型のより高い結合価に起因すると思われる。
Figure 2013529070
実施例２０
ＴＲＡＩＬ Ｒ２結合単量体の免疫原性研究
免疫原性は、いずれの治療タンパク質にとっても、それがヒト由来である場合でさえ、あり得る問題である。免疫原性応答は、炎症をもたらし得る中和抗体を通じて有効性を限定し得る。免疫応答の生起における最も重要な要因の１つは、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を刺激し得るエピトープの存在である。ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ試験（Ａｎｔｉｔｏｐｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）では、ＣＤ８＋Ｔ細胞を欠く末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、試験タンパク質とともにインキュベートして、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖およびＩＬ−２分泌をモニターする（Ｂａｋｅｒ ＆ Ｊｏｎｅｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｄｅｖ．１０：２１９−２２７、２００７；Ｊａｂｅｒ ＆ Ｂａｋｅｒ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．４３：１２５６−１２６１、２００７；．Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓおよびＨａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ３：９９１−１０００、２００５；Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．２４：５６０−７２、２００４）。ＰＢＭＣは、世界の集団で発現されるＨＬＡ−ＤＲアロタイプに相当するドナーのプールから単離される。
図２５に示されるＴｎ３単量体を、発現し（ＧＧＧＧＨＨＨＨＨＨＨＨリンカー−Ｈｉｓタグと共に）、精製し、ＳＥＣによって単量体であることを確認し、上記のように内毒素除去のために濾過した。試験した全ての非野生型クローンは、カニクイザル交差反応性を増強するための操作の回からであった（図２２Ａ）。しかし、これらのクローンは、Ｆ４ｍｏｄ１バックグラウンドにおける結合に影響を示さなかった生殖細胞系列に対して変異を有した。これらのクローンをＥＬＩＳＡで試験して、生殖細胞系列の変異が結合に影響しなかったことを確認した。Ｔ細胞増殖アッセイおよびＩＬ−２分泌アッセイの両方で、２を超える刺激指数（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）（ＳＩ）が、所定のドナーについての陽性応答として以前に確立された。平均のＳＩ、または陽性応答集団のＳＩの平均は、応答の強度の指標である。強力な応答を誘導することが公知の対照のタンパク質である、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を両方のアッセイに含んだ。
表２２は、全ての試験タンパク質についての平均ＳＩを示しており、これは、ＫＬＨについて有意に低く、かつ陽性平均ＳＩについての２というカットオフよりもそれほど高くない。さらに、試験タンパク質についての応答の頻度は、極めて低かった（９０％という過剰で応答した対照を除けば、全ての試験したタンパク質について１０％以下）。Ａｎｔｉｔｏｐｅによる以前の研究では、１０％未満というＥｐｉＳｃｒｅｅｎ応答は、臨床の免疫原性の危険性が低い指標であることが明らかになった。従って、試験した全てのＴｎ３が１０％以下の応答頻度を有するという本発明者らの観察によって、臨床上の免疫原性のリスクが低いことが示される。
Figure 2013529070
実施例２１
未精製および精製したＧ６タンデム８ Ｔｎ３の凝集状態
複数のシステインを含むタンパク質、例えば、内部ジスルフィド結合を含むタンデムリピートからできたタンパク質は、適切なジスルフィド対合を示さない場合が多いことは当該分野で公知である。ジスルフィドのスクランブリングは、培地中への発現を減少または排除し得る。タンパク質が培地中へ発現する場合、これは不適切に折り畳まれたタンパク質と、分子間の、ならびにミスマッチの分子間のジスルフィド対（凝集をもたらす）との混合物である場合がある。本発明者らのＳＥＣデータによって、細菌発現培地中のタンデムタンパク質のほとんどが、単量体の適切に折り畳まれた状態であることが明らかになった。Ｈｉタグ化Ｇ６タンデム８タンパク質のＮｉ−ＮＴＡ精製後、タンパク質のうち約１５％が凝集した。観察された凝集は、２ｍＭのＤＴＴによる還元によって、４％まで低下し（図２６Ａ）、このことは、ほとんどの凝集がジスルフィド媒介性であったことを示す。凝集物のほとんどを、上記のように、ＳＥＣ精製によって除去した（図２６Ｂ）。
実施例２２
Ｃｏｌｏ２０５結腸直腸癌異種移植片モデルにおけるＴＲＡＩＬ模倣物、Ｇ６ＴＮ６およびＧ６ＴＮ８の腫瘍増殖阻害の決定
ＴＲＡＩＬ Ｔｎ３模倣物、Ｇ６タンデム６（Ｇ６ＴＮ６）（配列番号１４４）およびＧ６タンデム８（Ｇ６ＴＮ８）（配列番号１４５）の抗腫瘍活性を、Ｃｏｌｏ２０５、ヒト結腸直腸癌異種移植片モデルで評価した。Ｃｏｌｏ２０５細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地中で、５％ＣＯ２下、３７℃で半接着単層培養物として維持した。トリプシン処理によって回収した細胞を、ハンクス平衡塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＨＢＳＳ）中で３×１０７細胞／ｍＬという最終濃度に再懸濁した。無胸腺雌性ヌードマウスに各々、右わき腹の皮下に（ＳＣ）３×１０６個のＣｏｌｏ２０５細胞を注射した。本研究は、腫瘍が平均で約１７７ｍｍ３に達した時点で開始した。研究デザインは、表２３にまとめる。ＴＲＡＩＬを、ストック溶液から２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ３００ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ（ｐＨ７）で希釈して、体重に応じて（１０ｍＬ／ｋｇ）全部で５用量を毎日、表２３に示す用量で、静脈内に（ＩＶ）投与した。Ｇ６タンデム６（Ｇ６ＴＮ６）およびＧ６タンデム８（Ｇ６ＴＮ８）を、各々ストック溶液からＰＢＳで希釈して、体重に応じて（１０ｍＬ／ｋｇ）全部で５用量を毎日、表２４に示す用量で、静脈内に（ＩＶ）投与した。腫瘍体積および体重の測定を記録した。腫瘍の測定は、電子カリパスを用いて行い、そして腫瘍体積（ｍｍ３）は、腫瘍体積＝［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２］／２という式を用いて算出した。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は、ＴＧＩパーセント＝（１−Ｔ／Ｃ）×１００として算出し、ここでＴ＝最終投与後の処置群の最終腫瘍体積であり、かつＣ＝最終投与後の対照群の最終腫瘍体積である。
投与段階（ｄｏｓｉｎｇ ｐｈａｓｅ）（ＤＰ）の間（図２７）、３ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇのＧ６ＴＮ６は、それぞれ、９２％（ｐ＜０．０００１）および９３％（ｐ＜０．０００１）の有意なＴＧＩを生じた（表２４）。同様に、最終濃度のための等モル調節後、２．２５ｍｇ／ｋｇおよび２５．５ｍｇ／ｋｇのＧ６ＴＮ８によって、それぞれ９３％（ｐ＜０．０００１）および９４％（ｐ＜０．０００１）という有意なＴＧＩが生じた（表２４）。３０ｍｇ／ｋｇのＴＲＡＩＬは、６０％のＴＧＩを生じた（ｐ＜０．００１）、（表２５）。
再増殖段階（ｒｅｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）（ＲＰ）の３４日まで（図２７）、３ｍｇ／ｋｇのＧ６ＴＮ６は、なんらＣＲ（ＣＲ；２回の連続した測定に対し、検出可能な触知腫瘍のない群のマウスのパーセンテージ）を生じなかったが、２．２５ｍｇ／ｋｇのＧ６ＴＮ８は、９０％のＣＲを生じた。３０ｍｇ／ｋｇというより高用量では、Ｇ６ＴＮ６は、５０％のＣＲを達成した。他方では、２５．５ｍｇ／ｋｇのＧ６ＴＮ８は、１００％のＣＲを生じた（表２５）。両方の用量からの結果によって、Ｇ６ＴＮ８は、Ｇ６ＴＮ６に比較して大きい有効性を生じたことが示唆される。しかし、Ｇ６ＴＮ６とＧ６ＴＮ８の両方とも特定の用量で有効性を示した。さらに重要なことに、両方の構築物とも、なんらＰＲもＣＲも生じなかったＴＲＡＩＬよりも有意に優れていた。
図２８に示すとおり、この研究の投与および再増殖段階の間、全ての用量でＧ６ＴＮ６およびＧ６ＴＮ８の両方にいかなる体重減少も観察されなかった。
Figure 2013529070
Figure 2013529070
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上記の実施例は、本発明の種々の態様および本発明の実施方法を説明している。これらの例は、多くの異なる本発明の実施形態の完全な記述を提供することを意図するものではない。従って、本発明を図および実施例を用いて幾分詳細に記述し、理解の明確化を期してきたが、当業者なら、添付の請求項の趣旨や範囲から逸脱することなく多くの変更と修正を行うことができることは、容易にわかるであろう。
本明細書で挙げた全ての出版物、特許および特許出願は、それぞれの出版物、特許および特許出願が、具体的に参照により本明細書に組み込まれることが指示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
前述の実施例は、本発明および本発明の方法の実施の種々の態様を例示説明する。実施例は、本発明の多くの異なる実施形態の網羅的な説明を提供することを意図していない。従って、前述の本発明は、理解の明確化の目的で例示説明および実施例によってある程度詳細に記載してきたが、当業者には、それに対して多くの変化および改変が、添付の特許請求の趣旨からも範囲からも逸脱することなくなされ得ることが容易に理解される。
本明細書に言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各々の個々の刊行物、特許または特許出願が、参照によって本明細書に援用されると詳細にかつ個々に示されるかのように、本明細書に参照によってここに援用される。

Claims (61)

  1. ２つのＴｎ３単量体足場を含むＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的組換え型多量体足場であって、
    （ａ）各Ｔｎ３単量体足場が、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと命名される７つのベータ鎖、およびＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧと命名される６つのループ領域を含み、
    （ｂ）Ｔｎ３単量体足場がタンデムに連結され、さらに
    （ｃ）組換え型多量体足場が特異的にＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合する、
    多量体足場。
  2. 多量体足場が、３、４、５、６、７、または８つのＴｎ３単量体足場を含む、請求項１に記載の多量体足場。
  3. 全てのＴｎ３単量体足場が、タンデムになっている、請求項２に記載の多量体足場。
  4. 少なくとも１つのＴｎ３単量体足場が、直接に、リンカーにより、または異種の成分により、１、２、３、４、５、６、または７つの他のＴｎ３単量体足場に連結されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多量体足場。
  5. 少なくとも２つのＴｎ３単量体足場が、Ｔｎ３単量体足場間に挟まれたリンカー無しに直接連結されている、請求項４に記載の多量体足場。
  6. 少なくとも２つのＴｎ３単量体足場が、リンカーにより連結されている、請求項４に記載の多量体足場。
  7. リンカーがペプチドリンカーを含む、請求項６に記載の多量体足場。
  8. ペプチドリンカーが柔軟性ペプチドリンカーである、請求項７に記載の多量体足場。
  9. ペプチドリンカーが、（ＧｘＳ）ｙ配列を含み、ｘおよびｙは整数であって、ｘ＝１、２、３または４であり、ｙ＝１、２、３、４、５、６、または７である、請求項７に記載の多量体足場。
  10. 多量体足場のＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する結合が、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３単量体足場の結合よりも改善されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の多量体足場。
  11. 多量体足場のＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する結合が、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３単量体足場に比較して、標的に対する作用を改善する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の多量体足場。
  12. ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３単量体足場に比較したＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する結合の改善が、結合親和性の改善および／または結合アビディティの改善である、請求項１０に記載の多量体足場。
  13. ＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する結合親和性およびタンパク質安定性が、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３単量体足場のそれらに比較して改善されている、請求項１０に記載の多量体足場。
  14. ＴＲＡＩＬ Ｒ２に対する結合アビディティおよびタンパク質安定性が、ＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的Ｔｎ３単量体足場のそれらに比較して改善されている、請求項１０に記載の多量体足場。
  15. リンカーが、官能性成分を含む、請求項４に記載の多量体足場。
  16. 官能性成分が、免疫グロブリンまたはその断片である、請求項１５に記載の多量体足場。
  17. 免疫グロブリンまたはその断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、直鎖抗体、完全長抗体、Ｆｃ領域、および前記成分の２つ以上の組み合わせ、からなる群より選択される、請求項１６に記載の多量体足場。
  18. 免疫グロブリンまたはその断片が、ＩｇＧのＦｃドメインおよびヒンジ部を含む、請求項１６に記載の多量体足場。
  19. 免疫グロブリンまたはその断片が、ＣＨ１ドメインをさらに含む、請求項１８に記載の多量体足場。
  20. 免疫グロブリンまたはその断片が、ＩｇＧのＣカッパドメインまたはＣラムダドメインを含む、請求項１６に記載の多量体足場。
  21. 少なくとも１つのＴｎ３単量体足場が、異種の成分に融合されている、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の多量体足場。
  22. 異種の成分が、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、薬剤、毒素、細胞傷害性薬物、造影剤、放射性核種、放射性化合物、有機ポリマー、無機ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ビオチン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＨＳＡ ＦｃＲｎ結合部分、抗体、抗体のドメイン、抗体断片、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩ足場、エピトープタグ、組換え型ポリペプチドポリマー、サイトカイン、および前記成分の２つ以上の組み合わせ、からなる群より選択される組成物を含む、請求項２１に記載の多量体足場。
  23. 足場がＰＥＧにコンジュゲートされている、請求項２２に記載の多量体足場。
  24. ３つ以上のＴｎ３単量体足場がリンカーにより連結され、少なくとも１つのリンカーが他のリンカーとは構造的に、および／または機能的に異なる、請求項６に記載の多量体足場。
  25. Ｔｎ３単量体足場が分岐形式で連結されている、請求項２に記載の多量体足場。
  26. 一部のＴｎ３単量体足場が直鎖タンデム形式で連結され、一部のＴｎ３単量体足場が分岐形式で連結されている、請求項２に記載の多量体足場。
  27. 少なくとも２つのＴｎ３単量体足場が同一である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の多量体足場。
  28. 少なくとも２つのＴｎ３単量体足場が異なっている、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の多量体足場。
  29. Ｔｎ３多量体足場が少なくとも１つの追加の標的に結合する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の多量体足場。
  30. 追加の標的がＴ細胞抗原である、請求項２９に記載の多量体足場。
  31. Ｔ細胞抗原がＣＤ４０Ｌである、請求項３０に記載の多量体足場。
  32. 多量体足場が受容体アゴニストである、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の多量体足場。
  33. 少なくとも２つのＴｎ３単量体足場がＴＲＡＩＬ Ｒ２上の同じエピトープに結合する、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の多量体足場。
  34. 少なくとも２つのＴｎ３単量体足場がＴＲＡＩＬ Ｒ２上の異なるエピトープに結合する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の多量体足場。
  35. 異なるＴＲＡＩＬ Ｒ２エピトープが非重複エピトープである、請求項３４に記載の多量体足場。
  36. 異なるＴＲＡＩＬ Ｒ２エピトープが重複エピトープである、請求項３４に記載の多量体足場。
  37. 少なくとも２つのＴｎ３単量体足場のベータ鎖が、配列番号１のベータ鎖に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の多量体足場。
  38. 少なくとも２つのＴｎ３単量体足場がアミノ酸配列：
    ＩＥＶ（ＸＡＢ）ｎＡＬＩＴＷ（ＸＢＣ）ｎＣＥＬＸ１ＹＧＩ（ＸＣＤ）ｎＴＴＩＸ２Ｌ（ＸＤＥ）ｎＹＳＩ（ＸＥＦ）ｎＹＥＶＳＬＩＣ（ＸＦＧ）ｎＫＸ３ＴＦＴＴ
    を含み、ここでＸＡＢ、ＸＢＣ、ＸＣＤ、ＸＤＥ、ＸＥＦ、およびＸＦＧは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループ中に存在するアミノ酸残基をそれぞれ表し、Ｘ１はアミノ酸残基ＡまたはＴを表し、Ｘ２はアミノ酸残基ＤまたはＧを表し、Ｘ３はアミノ酸ＥまたはＧを表し、さらにループの長さｎは２〜２６の整数である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の多量体足場。
  39. ＡＢループが配列番号３５を含み、ＣＤループが配列番号３７を含み、さらにＥＦループは配列番号３９を含む、請求項３８に記載の多量体足場。
  40. ＢＣループが、配列番号９７、９８、または１６８からなる群より選択される配列を含む請求項３８に記載の多量体足場。
  41. ＤＥループが、配列番号１０２、１０３、および１７９からなる群より選択される配列を含む、請求項３８に記載の多量体足場。
  42. ＦＧループが、配列番号１０６、１０８、１０９、１６９、および１７０からなる群より選択される配列を含む、請求項３８に記載の多量体足場。
  43. ＢＣループが配列番号９７を含み、ＤＥループが配列番号１７９を含み、さらにＦＧループが配列番号１７０を含む、請求項３８に記載の多量体足場。
  44. 足場が配列番号２０９または２０４を含む、請求項４３に記載の多量体足場。
  45. 足場が１μＭ以下の親和性（Ｋｄ）でＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体と結合する、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の多量体足場。
  46. 足場が、５００ｎＭ以下の親和性（Ｋｄ）でＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体と結合する、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の多量体足場。
  47. 足場が、１００ｎＭ以下の親和性（Ｋｄ）でＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体に結合する、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の多量体足場。
  48. 請求項１〜４７のいずれか１項の多量体足場をコードする単離核酸分子。
  49. 請求項４８に記載の核酸を含む発現ベクター。
  50. 請求項４９に記載のベクターを含む宿主細胞。
  51. 核酸分子によりコードされた多量体足場が発現する条件下、請求項５０の宿主細胞を培養するステップを含む組換え型多量体足場の製造方法。
  52. 薬学的に許容可能な賦形剤中に請求項１〜４７のいずれか１項の組換え型多量体足場を含む組成物。
  53. 有効量の請求項５２に記載の組成物を投与することにより、癌の予防、治療、改善、または管理を、それを必要とする患者において行う方法。
  54. 請求項５２に記載の組成物を用いて患者の疾患を診断または画像化する方法。
  55. ＴＲＡＩＬ Ｒ２を発現している細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、該細胞を請求項１〜４７のいずれか１項に記載の組換え型多量体足場と接触させることを含む、方法。
  56. 前記癌が、肺癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、および多発性骨髄腫、から選択される、請求項５４に記載の方法。
  57. 前記方法が、追加の療法をさらに含み、その療法が免疫療法、生物学的療法、化学療法、放射線療法、または小分子薬物療法である、請求項５３に記載の方法。
  58. 前記ＴＲＡＩＬ Ｒ２がヒトＴＲＡＩＬ Ｒ２である、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の多量体足場。
  59. 足場が、ＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合し、さらに：
    （ａ）ＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体を作動させるか、
    （ｂ）ＴＲＡＩＬのＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体に対する結合を模倣するか、
    （ｃ）ＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体の二量体化もしくはオリゴマー化を促進するか、
    （ｄ）アポトーシスを誘導するか、
    （ｅ）細胞生存率を低下させるか、もしくは阻害するか、または
    （ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の活性の組み合わせを示す、
    請求項１〜４７のいずれか１項に記載の多量体足場。
  60. 請求項１〜４７のいずれか１項に記載のＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的多量体足場と細胞を接触させることを含むＴＲＡＩＬ Ｒ２発現細胞の活性を変える方法であって、多量体足場が結合ＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合し、さらに：
    （ａ）ＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体を作動させるか、
    （ｂ）ＴＲＡＩＬのＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体に対する結合を模倣するか、
    （ｃ）ＴＲＡＩＬ Ｒ２受容体の二量体化もしくはオリゴマー化を促進するか、
    （ｄ）アポトーシスを誘導するか、
    （ｅ）細胞生存率を低下させるか、もしくは阻害するか、または
    （ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の活性の組み合わせを示す、
    方法。
  61. ＰＥＧがＮ末端またはＣ末端で足場にコンジュゲートされている、請求項２３に記載の多量体足場。
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