TW201718629A

TW201718629A - 包含多個生理多肽及免疫球蛋白Ｆｃ區之蛋白質接合物

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Publication number: TW201718629A
Application number: TW105131168A
Authority: TW
Inventors: 李鍾守; 崔承鎬; 崔宰赫; 金尙允; 鄭聖燁; 權世昌
Original assignee: 韓美藥品股份有限公司
Priority date: 2015-09-25
Filing date: 2016-09-23
Publication date: 2017-06-01
Also published as: JP2018531237A; EP3354664A1; KR20170037564A; US20180271995A1; WO2017052321A1; AR106144A1; EP3354664A4; CN108473593A

Abstract

本發明涉及包括多個生理活性多肽及免疫球蛋白Fc區的生理活性多肽接合物、其用途及其製備方法。

Description

包含多個生理多肽及免疫球蛋白Fc區之蛋白質接合物

本發明涉及包含多個生理活性多肽及免疫球蛋白Fc區的蛋白質接合物，其用途，及其製備方法。

最近的經濟進步和生活方式的改變伴隨著飲食習慣的重大改變。特別地，今天忙碌的人們接觸高卡路里飲食、少量的運動、過度的壓力、不規律的生活方式等，導致各種成人病的增加。

超重及肥胖是造成血壓及膽固醇水平上升，及引起諸如心臟病、糖尿病、關節炎等各種疾病或導致其惡化的原因。如果風險因子諸如超重、肥胖、高血脂症、胰島素抗性、糖尿病等，未妥善處理，則非酒精性脂肪肝疾病可導致肝纖維化、肝硬化及肝癌。

具有至少一種引起代謝疾病問題的成人病諸如糖尿病、肥胖、高血脂症、脂肪肝等之患者，具有發生其他成人病的高風險，而這些患者需要同時治療及控制若干成人病。

胰島素是由胰臟β細胞分泌的肽且在控制體內血糖值上扮演非常重要的角色。一種與胰島素分泌量不足或不正常功能有關，並造成血糖值增加的代謝疾病稱為糖尿病。有缺陷的胰島素分泌或所分泌胰島素的不正常功能會阻止體內血糖值的適當控制並導致血糖值增加，此類型的糖尿病稱為第二型糖尿病，而由於胰臟無法分泌胰島素所造成的血糖值增加，則稱為第一型糖尿病。使用含有化學物質作為活性成分的口服降血糖劑治療第二型糖尿病，而某些患者，則可使用胰島素治療。相反的，治療第一型糖尿病，給藥胰島素是必要的。

目前，胰島素可作為注射藥物。原則上，胰島素必須皮下注射給藥且給藥方法依作用時間而有所不同。經由注射給藥胰島素比口服給藥的藥物顯示更快速的降血糖效果。即使在藥物無法使用口服給予的環境下，可安全地給予胰島素注射，而且在劑量上沒有任何限制。然而，這種胰島素療法需要每日3次連續注射使用，而因此具有缺點諸如患者對注射針的排斥、給藥上的困難、低血糖症狀、由於長期胰島素給藥所造成的體重增加等。此外，體重增加的現象會提高心血管疾病的風險且亦可能造成控制血糖值功能之惡化的副作用。

當血糖值由於其他藥物或疾病，或激素或酶缺乏的結果而下降時，胰臟則製造昇糖素。昇糖素發出肝臟分解肝醣的信號並隨後釋放葡萄糖，且在提升血糖值至正常範圍上具有作用。除了增加血糖值的效用外，據報導昇糖素壓抑食慾並活化脂肪細胞的激素敏感脂酶以幫助脂肪分解，因此顯示抗肥胖效用。

昇糖素的衍生物之一，類昇糖素肽-1(GLP-1)，經發展成治療糖尿病患者之高血糖的治療劑。GLP-1具有刺激胰島素的合成及分泌、抑制昇糖素分泌、緩慢胃排空、增加葡萄糖利用及抑制食物攝取的功能。從蜥蜴毒液製備的艾塞那肽-4(exendin-4)，具有與GLP-1約50%胺基酸同源性，其亦經報導可活化GLP-1受體，從而緩解糖尿病患者的高血糖症。然而，據報導含有GLP-1的抗肥胖藥物具有副作用諸如嘔吐及噁心的問題。

成纖維細胞生長因子21(FGF21)是屬於包含FGF19、FGF21及FGF23之成纖維細胞生長因子(FGF)之亞族的分泌型多肽。FGF21在包含血管生成、有絲分裂繁殖、模式形成、細胞分化、代謝控制及組織傷害之復原的各種生理機能上具有重要的作用。據報導，FGF21主要在肝中表現且已被描述為治療疾病，諸如缺血性血管疾病、傷口癒合，及與肺、支氣管或肺泡細胞之功能損傷有關的疾病及其他許多障礙的治療劑。

根據WO 2003/011213，在胰島素存在或不存在下，將FGF21施用於小鼠3T3-L1脂肪細胞中進行長期治療(72小時)時，FGF21刺激脂肪細胞中的葡萄糖攝取。此外，FGF21顯示呈劑量依賴關係地降低禁食及餵食的ob/ob小鼠、db/db小鼠及ZDF大鼠(8週齡)之血糖值、三酸甘油酯及昇糖素。因此，確認使用FGF21作為治療糖尿病及肥胖之療法的效用。

同時，本案發明者等人先前已發展出一種蛋白質接合物，其中相較於天然型胰島素有增長之半衰期的胰島素類似物及諸如咪唑并乙醯基(CA)艾塞那肽-4(CA-艾塞那肽-4)(CA-exendin-4)之生理活性多肽分別地透過非肽聚合物並經由位點特異性共價連結而與免疫球蛋白Fc區，及含有該免疫球蛋白Fc區的組成物連結(WO 2014/133324及WO 2008/082274)。然而，尚無報導揭露其中2種或更多種生理活性多肽經由非肽聚合物而分別與免疫球蛋白Fc區的單一單元連結的形式。

在這些情況下，本案發明者等人努力發展同時降低免疫球蛋白Fc量之具有2種或更多種效用的單一材料，而該免疫球蛋白Fc在組合給藥的情況或以複合製劑之形式使用時，給藥劑量是加倍的。結果，本案發明者發展出生理活性多肽接合物，其包含多個生理活性多肽及免疫球蛋白Fc區。具體地，發展出異源二聚體接合物，其為各自展現其生理活性的2種不同多肽分別與免疫球蛋白Fc之單一單元共價連結的形式，其為經由非肽聚合物的二聚體形式。

比較異源二聚體接合物及單體接合物的分別與其中一種生理物質經由非肽聚合物而與免疫球蛋白Fc之單一單元共價連結的體外效價時，已確認異源二聚體接合物的相應生理活性水平與單體接合物相當。據此，本案發明者等人已確認將異源二聚體接合物給藥人體時，相較於組合給予2種或更多種單體接合物或給予其複合製劑，可減低所給予的免疫球蛋白Fc一半濃度，且亦減少所給予蛋白之濃度及量，而因此緩解在注射期間由於蛋白質濃度而可能發生的稠度增加及隨後造成之患者須忍受的疼痛，從而完成本發明。

本發明的目的為提供生理活性多肽的蛋白質接合物，其包含多個生理活性多肽及1個免疫球蛋白Fc區。

具體地，本發明的目的為提供包含2個或多個生理活性多肽的蛋白質接合物，其中蛋白質接合物包含：(i)具有FcRn-結合親合力的免疫球蛋白Fc區的單元或Fc區的一部分；(ii)共價連結Fc區或其部分的非肽聚合物；及(iii)共價連結非肽聚合物的生理活性多肽；其中Fc區或其部分為2條多肽鏈的二聚體，且1個或多個非肽聚合物係連結2條多肽鏈的各肽鏈。

本發明的另一個目的為提供製備蛋白質接合物的方法。

本發明的又另一個目的為提供含有該蛋白質接合物的組成物。

本發明的又另一個目的為提供用於改善生理活性多肽在體內之持續時間及穩定性之含有蛋白質接合物的組成物。

本發明的又另一個目的為提供治療目標疾病的方法，包含將蛋白質接合物或含有蛋白質接合物的組成物給予在其中有需要的受試者。

本發明的一方面提供包含多個生理活性多肽及免疫球蛋白Fc區之生理活性多肽之蛋白質接合物。

具體地，一方面，本發明提供包含2種或更多種生理活性多肽的蛋白質接合物，其中蛋白質接合物包含：(i)具有FcRn-結合親合力的免疫球蛋白Fc區的單元或Fc區的一部分；(ii)共價連結Fc區或其部分的非肽聚合物；及(iii)共價連結非肽聚合物的生理活性多肽；其中Fc區或其部分為2條多肽鏈的二聚體，且1個或多個非肽聚合物係與2條多肽鏈的各肽鏈連結。

在具體實施例中，免疫球蛋白Fc區為非糖基化。

在另一個具體實施例中，免疫球蛋白Fc區係由選自CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域及CH4結構域所成之群組的1至4個結構域所構成。

又在另一個具體實施例中，免疫球蛋白Fc區進一步包含鉸鏈區。

又在另一個具體實施例中，免疫球蛋白Fc區係選自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM之Fc區，其組合，及其雜合體所成之群組。

又在另一個具體實施例中，免疫球蛋白Fc區係選自 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之Fc區，其組合，及其雜合體所成的群組。

又在另一個具體實施例中，免疫球蛋白Fc區為IgG4 Fc區。

又在另一個具體實施例中，免疫球蛋白Fc區為人類非糖基化IgG4 Fc區。

又在另一個具體實施例中，使選自由醛基、順丁烯二醯亞胺基及琥珀醯亞胺衍生物所成之群組的非肽聚合物之一端點的反應基團與Fc區或其部分的胺基或生理活性多肽的胺基反應而形成共價連結。

又在另一個具體實施例中，琥珀醯亞胺衍生物為丙酸琥珀醯亞胺酯、琥珀醯亞胺基羧甲基、羥基琥珀醯亞胺基或碳酸琥珀醯亞胺酯。

又在另一個具體實施例中，在非肽聚合物兩端點的反應基團為醛基。

又在另一個具體實施例中，非肽聚合物的一個端點連結選自免疫球蛋白Fc的N端、離胺酸殘基的側鏈及精胺酸殘基的側鏈之任何一者，而非肽聚合物的另一個端點連結選自生理活性多肽的N端、離胺酸殘基的側鏈、精胺酸殘基的側鏈、組胺酸殘基的側鏈及半胱胺酸殘基的側鏈之任何一者。

又在另一個具體實施例中，非肽聚合物至少為選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-聚丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄糖、聚乙烯基乙基醚、生物可分解的聚合物、脂質聚合物、脂肪酸、幾丁質、玻尿酸所成之群組中的一者，及其組合。

又在另一個具體實施例中，非肽聚合物為聚乙二醇。

又在另一個具體實施例中，生理活性多肽係選自由激素、細胞介素、酵素、抗體、生長因子、轉錄因子、血液因子、疫苗、結構蛋白、配體蛋白及受體所成之群組。

又在另一個具體實施例中，生理活性多肽係選自由下列者所成之群組：胰島素、昇糖素、類昇糖素肽、調酸催素、艾塞那肽-3、艾塞那肽-4、成纖維細胞生長因子21(FGF21)、人類生長激素(hGH)、生長激素釋放激素、生長激素釋放肽、干擾素、干擾素受體、群落刺激因子、G蛋白偶合受體、介白素、介白素受體、酵素、介白素結合蛋白、細胞介素結合蛋白、巨噬細胞活化因子、巨噬細胞肽、B細胞因子、T細胞因子、蛋白A、過敏抑制物、細胞壞死醣蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制因子、腫瘤轉移誘導因子、α-1-抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、缺脂脂蛋白-E、紅血球生成素、高糖基化紅血球生成素、血管生成素、血紅素、凝血酶、凝血酶受體活化肽、凝血酶調節素、血液因子VII、VIIa、VIII、IX及XIII、胞漿素原活化因子、血纖維蛋白結合肽、尿激酶、鏈球菌激酶、水蛭素、蛋白C、C-反應蛋白、腎素抑制劑、膠原酶抑制物、超氧化物歧化酶、瘦素、血小板衍生的生長因子、上皮細胞生長因子、表皮細胞生長因子、血管抑制素、成骨生長因子、骨生成促進蛋白、降鈣素、心房肽、軟骨誘導因子、依降鈣素(elcatonin)、結締組織活化因子、組織因子途徑抑制物、濾泡刺激激素、促黃體激素、促黃體激素釋放激素、神經生長因子、副甲狀腺素、鬆弛素、胰泌素、體介素、類胰島素生長因子、腎上腺皮質素、昇糖素、膽囊收縮素、胰多肽、胃泌素釋放肽、促皮質素釋放因子、甲狀腺刺激激素、自體毒素、乳鐵素、肌生成抑制素、受體、受體拮抗劑、細胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、單株抗體、多株抗體、抗體片段、紅血球生成生長因子、白血球形成素、澱粉素、體抑素、肽YY(PYY)、神經肽Y(NPY)、血管收縮素、緩激肽、降鈣素、促皮質素、章魚唾腺精(eledoisin)、胃泌素、瘦素、催產素、血管加壓素、黃體激素、促黃體激素、濾泡刺激素、副甲狀腺素、胰泌素、舍莫瑞林(sermorelin)、人類生長激素(hGH)、生長激素釋放肽、顆粒細胞群落刺激因子(GCSF)、干擾素(IFN)、介白素、泌乳素釋放肽、食慾激素、甲狀腺釋放肽、膽囊收縮素、胃泌素抑制肽、調鈣素、胃泌素釋放肽、腸動素、血管活性腸肽、心房利鈉肽(ANPs)、腦利鈉肽(BNPs)、C-型利鈉肽(CNPs)、神經激肽A、神經介素、腎素、內皮素、角蝰毒素肽(sarafotoxin peptide)、酪啡肽(carsomorphin peptide)、皮啡肽(dermorphin)、強啡肽、內啡肽、腦啡肽(enkepalin)、T細胞因子、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子受體、脲激酶受體、腫瘤抑制因子、膠原酶抑制物、胸腺生成素、胸腺九肽(thymulin)、胸腺五肽(thymopentin)、胸腺素、胸腺體液因子、腎上腺髓素、咽側體抑制素(allatostatin)、類澱粉β-蛋白片段、抗菌肽、抗氧化肽、鈴蟾素、骨鈣化素、CART肽、E-選滯蛋白、ICAM-1、VCAM-1、leucokine、kringle-5、層黏黏蛋白、抑制素、甘丙肽、纖維接合素、胰抑素、福艾(fuzeon)，及其等之類似物。

又在另一個具體實施例中，生理活性多肽係選自由胰島素、昇糖素、類昇糖素肽、調酸催素、艾塞那肽-3、艾塞那肽-4、成纖維細胞生長因子21(FGF21)、人類生長激素、α-干擾素、顆粒細胞群落刺激因子(G-CSF)、紅血球生成素、Fab'抗體片段及其等之類似物所成之群組。

又在另一個具體實施例中，生理活性多肽係連結Fc區或其部分各不同之2條多肽鏈。

又在另一個具體實施例中，生理活性多肽之兩單元係各自經由非肽聚合物而連結免疫球蛋白Fc區之單一單元或其部分，且該兩單元的種類彼此不同。

又在另一個具體實施例中，不同種類的生理活性多肽係分別經由非肽聚合物而連結免疫球蛋白Fc區的單一單元或其部分，且不同種類的生理活性多肽以不同比率存在。

又在另一個具體實施例中，經由非肽聚合物而共價連結免疫球蛋白Fc區或其部分的生理活性多肽，係在不同於與非肽聚合物連結的位點，進一步與另一個生理活性多肽連結。

又在另一個具體實施例中，生理活性多肽之3個或更多個單元係各自經由非肽聚合物而連結免疫球蛋白Fc區的單一單元或其部分，且該3個或更多個單元的種類彼此不同。

為實現本發明，另一方面，提供生理活性多肽的同源多聚體接合物，其中生理活性多肽的3個或更多個單元係各自經由非肽聚合物而共價連結具有FcRn-結合親合力的免疫球蛋白Fc區的單一單元或其部分，且其中該3個或更多個單元展現相同的生理活性。

為實現本發明，又另一方面，提供製備蛋白質接合物的方法。

具體地，該方法包含提供(a)非肽聚合物，其係在一個端點連結生理活性多肽，且在另一個端點包含餘留之反應基團，及(b)生理活性多肽接合物，其中1個或多個生理活性多肽分別連結具有FcRn-結合親合力的免疫球蛋白Fc區單元或其部分，其中具有FcRn-結合親合力的免疫球蛋白Fc區單元或其部分包含餘留之反應基團；及共價連結於連結(a)之生理活性多肽之非肽聚合物的餘留之反應基團，及(b)之生理活性多肽接合物之免疫球蛋白Fc區或其部分的餘留之反應基團。

在具體實施例中，(a)之非肽聚合物包含選自由醛基、順丁烯二醯亞胺基及琥珀醯亞胺衍生物所成之群組的餘留之反應基團。

在另一個具體實施例中，(b)之免疫球蛋白Fc區或其部分的餘留之反應基團位於免疫球蛋白Fc的N端、離胺酸殘基的側鏈及精胺酸殘基的側鏈之中的任何一者。

又在另一個具體實施例中，(a)之生理活性多肽及(b)之生理活性多肽彼此為相同或不同種類。

又在另一個具體實施例中，(a)之生理活性多肽及(b)之生理活性多肽在單一單元內。

為實現本發明，又另一方面，提供含有蛋白質接合物的組成物。

在具體實施例中，該組成物係用於改善生理活性多肽在體內的持續時間及穩定性。

在另一個具體實施例中，該組成物為醫藥組成物。

為實現本發明，又另一方面，提供治療目標疾病的方法，包含將蛋白質接合物或含有蛋白質接合物的組成物給予在其中有需要的受試者。

其中2種或更多種生理活性多肽經由非肽聚合物而連結免疫球蛋白Fc的本發明接合物，可具有與各單體接合物相同或相似的生理活性，其中單一生理活性多肽經由非肽聚合物而連結免疫球蛋白Fc。因此，相較於使用單體接合物，本發明接合物可降低對人體給藥之不必要的免疫球蛋白Fc量。

此外，在包含不同種類生理活性多肽的本發明接合物的情況下，接合物可進一步具有在單一接合物中含有2種或更多種藥效的優點。

第1圖顯示包含胰島素類似物、咪唑并乙醯基(CA)艾塞那肽-4及免疫球蛋白Fc之異源二聚體接合物的HPLC分析結果，其中長效胰島素類似物接合物代表其中胰島素類似物經由PEG而連結免疫球蛋白Fc的單體接合物，而長效CA-艾塞那肽-4接合物代表其中CA-艾塞那肽-4經由PEG而連結免疫球蛋白Fc的單體接合物。

第2圖顯示包含胰島素類似物、咪唑并乙醯基艾塞那肽-4及免疫球蛋白Fc之異源二聚體接合物的SDS-PAGE(12%)結果。

第3圖顯示包含胰島素類似物、咪唑并乙醯基艾塞那肽-4及免疫球蛋白Fc之異源二聚體接合物，使用抗免疫球蛋白Fc的西方墨點分析結果。

第4圖顯示包含胰島素類似物、咪唑并乙醯基艾塞那肽-4及免疫球蛋白Fc之異源二聚體接合物，使用抗艾塞那肽-4的西方墨點分析結果。

第5圖顯示包含胰島素類似物、咪唑并乙醯基艾塞那肽-4及免疫球蛋白Fc之異源二聚體接合物，使用抗胰島素的西方墨點分析結果。

第6圖顯示包含2單元胰島素類似物及免疫球蛋白Fc的同源二聚體接合物的HPLC分析結果，其中長效胰島素類似物接合物代表其中胰島素類似物經由PEG而連結免疫球蛋白Fc的單體接合物。

第7圖顯示包含2單元胰島素類似物及免疫球蛋白Fc的同源二聚體接合物的SDS-PAGE分析結果。

第8圖顯示包含2單元咪唑并乙醯基艾塞那肽-4及免疫球蛋白Fc的同源二聚體接合物的HPLC分析結果。

第9圖顯示包含2單元咪唑并乙醯基艾塞那肽-4及免疫球蛋白Fc的同源二聚體接合物的SDS-PAGE分析結果。

第10圖顯示包含胰島素類似物、昇糖素類似物及免疫球蛋白Fc的異源二聚體接合物的HPLC分析結果。

第11圖顯示包含胰島素類似物、昇糖素類似物及免疫球蛋白Fc的異源二聚體接合物的SDS-PAGE分析結果。

第12圖顯示包含咪唑并乙醯基艾塞那肽-4、昇糖素類似物及免疫球蛋白Fc的異源二聚體接合物的HPLC分析結果。

第13圖顯示包含咪唑并乙醯基艾塞那肽-4、昇糖素類似物及免疫球蛋白Fc的異源二聚體接合物的SDS-PAGE分析結果。

第14圖顯示包含咪唑并乙醯基艾塞那肽-4、成纖維細胞生長因子21及免疫球蛋白Fc的異源二聚體接合物的HPLC分析結果。

第15圖顯示包含咪唑并乙醯基艾塞那肽-4、成纖維細胞生長因子21及免疫球蛋白Fc的異源二聚體接合物的SDS-PAGE分析結果。

下文中，將詳細說明本發明的具體實施例。其間，本文所揭露的各說明及具體實施例可適用於其他說明及具體實施例。即，本文所揭露的各種因子的所有組合均屬於本發明的範圍。再者，本發明之範圍不應該侷限於本文以下所提供的具體公開。

為實現本發明，一方面，提供包含多個生理活性多肽及免疫球蛋白Fc區之生理活性多肽的蛋白質接合物。

具體地，本發明提供包含2種或更多種生理活性多肽的蛋白質接合物，其中蛋白質接合物包含：(i)具有FcRn-結合親合力的免疫球蛋白Fc區的單元或Fc區的一部分；(ii)共價連結Fc區或其部分的非肽聚合物；及(iii)共價連結非肽聚合物的生理活性多肽；其中Fc區或其部分為2條多肽鏈的二聚體，及1個或多個非肽聚合物係連結2條多肽鏈的各肽鏈。

如本文中所使用，術語「蛋白質接合物」意指包含生理活性多肽及任何不同組分之接合物，且具體地，為其中生理活性多肽及任何不同組分經共價連結的物質。

任何不同組分可為具有與生理活性多肽之體內作用有關之任何有益功能的物質，諸如增加生理活性多肽的血液半衰期或降低其腎臟清除率。

任何不同組分可包含載體。可構成本發明蛋白質接合物之載體的實例可包含，但不限於可與生理活性多肽連結的白蛋白、轉鐵蛋白、抗體、抗體片段、彈性蛋白、肝素、多醣諸如幾丁質，及纖維接合素，從而增加血中穩定性。

在本發明的具體實施例中，不同組分可為免疫球蛋白Fc區或具有與新生兒Fc受體(FcRn)之結合親合力的免疫球蛋白Fc區的部分，但不限於此。

免疫球蛋白Fc區或其部分可為2條多肽鏈的二聚體形式。尤其，該2條多肽鏈可具有經由包含二硫鍵等之任何連結的二聚體形式。此外，可用於蛋白質接合物的免疫球蛋白Fc區的部分可為可結合至FcRn之Fc區的部分。

更具體地，蛋白質接合物可為其中2種或更多種生理活性多肽經由非肽聚合物而連結免疫球蛋白Fc區的單一單元或其部分的形式，但不限於此。

在本發明的具體實施例中，蛋白質接合物可為其中生理活性多肽經由非肽聚合物而與係連結各免疫球蛋白重鏈之一種，而該免疫球蛋白重鏈構成具有FcRn-結合親合力之二聚體形式的免疫球蛋白Fc區或Fc區的部分，但不限於此。

非肽聚合物可插入生理活性多肽及免疫球蛋白Fc區或其部分之間，且具體地，在生理活性多肽及構成Fc區或其部分的免疫球蛋白重鏈之間，從而經由共價連結而連接兩者。

蛋白質接合物可為同源多聚體或異源多聚體的形式，更具體地，同源二聚體或同源三聚體或異源二聚體或異三聚體，及甚至更具體地，同源二聚體或異源二聚體。

如本文中所使用，術語「同源多聚體」意指接合物，其為其中顯示相同生理活性的2種或更多種多肽單元各自經由非肽聚合物而連結免疫球蛋白Fc區的單一單元或其部分的形式。

即，連結免疫球蛋白Fc區的單一單元或其部分的生理活性多肽顯示相同生理活性，而因此接合物可顯示單一生理活性。

本發明中，術語「同源多聚體」可與「同源多聚體接合物」相互替代使用。

如本文中所使用，術語「同源二聚體」意指接合物，其為其中顯示相同生理活性的2種多肽單元各自經由非肽聚合物而連結免疫球蛋白Fc區的單一單元或其部分的形式。

具體地，同源二聚體可具有其中顯示相同生理活性的2種多肽單元各自經由非肽聚合物而連結免疫球蛋白Fc區的單一單元或其部分中的2條多肽鏈各自的結構。

本發明中，術語「同源二聚體」可與「同源二聚體接合物」相互替代使用。

如本文中所使用，術語「同源三聚體」意指接合物，其為其中顯示相同生理活性的3種多肽單元各自經由非肽聚合物而分別連結免疫球蛋白Fc區的單一單元或其部分的形式。

例如，同源三聚體可具有其中1種非肽聚合物及2種非肽聚合物分別連結免疫球蛋白Fc區的單一單元或其部分的各個2條多肽鏈，且3種生理活性多肽單元各自分別連結相應之非肽聚合物的結構，但並不特別限制於此。

本發明中，術語「同源三聚體」可與「同源三聚體接合物」相互替代使用。

如本文中所使用，術語「異源多聚體」意指接合物，其為其中顯示不同生理活性的2種或更多種多肽單元(如，2單元或3單元或更多)各自經由非肽聚合物而連結免疫球蛋白Fc區的單一單元或其部分的形式。

據此，異源多聚體接合物可包含2種或更多種類型的生理活性多肽，從而顯示雙重或多重生理活性。

例如，異源多聚體可具有其中1種或2種或多種非肽聚合物連結免疫球蛋白Fc區或其部分的單一單元的各個2條多肽鏈，且各生理活性多肽連結相應之非肽聚合物的結構，但並不特別限制於此。

本發明中，術語「異源多聚體」可與「異源多聚體接合物」相互替代使用。

異源多聚體可為異源二聚體、異三聚體等形式，但並不特別限制於此。

如本文中所使用，術語「異源二聚體」意指接合物，其為其中顯示不同生理活性的2種多肽單元各自經由非肽聚合物而連接至免疫球蛋白Fc區的單一單元或其部分的形式。

具體地，異源二聚體可具有其中顯示不同生理活性的2種生理活性多肽單元各自經由非肽聚合物而連結免疫球蛋白Fc區的單一單元或其部分中的2條多肽鏈各自的結構。

本發明中，術語「異源二聚體」可與「異源二聚體接合物」相互替代使用。

如本文中所使用，術語「異三聚體」意指接合物，其為其中顯示不同生理活性的3種多肽單元各自經由非肽聚合物而連結免疫球蛋白Fc區的單一單元或其部分的形式。

例如，異三聚體可具有其中1種非肽聚合物及2種非肽聚合物連結免疫球蛋白Fc區的單一單元或其部分的各個2條多肽鏈，且3種生理活性多肽單元各自分別連結相應之非肽聚合物的結構，但並不特別限制於此。

本發明中，術語「異三聚體」可與「異三聚體接合物」相互替代使用。

特別地，經由非肽聚合物而共價連結免疫球蛋白Fc區或其部分，並構成同源多聚體或異源多聚體接合物的生理活性多肽，在不同於連結非肽聚合物的位點，可進一步與另一個生理活性多肽連結，但並不特別限制於此。

特別地，另外的生理活性多肽可為其中2種或更多種生理活性多肽經由連接物連結，或直接彼此連結的形式，但不限於此。連接物可為肽連接物或非肽連接物，但不限於此。

亦包含其中至少一個或至少一種生理活性多肽經由連接物而連續地連結在生理活性多肽之任何區域上的形式，而後者之生理活性多肽係經由非肽聚合物而連結免疫球蛋白Fc的單一單元之多肽鏈。

特別地，另外添加的生理活性多肽可為與連結至此的生理活性多肽相同種類的生理活性多肽，但不限於此。在此情況下，所有種類或一些種類之構成同源多聚體的生理活性多肽及構成異源多聚體的生理活性多肽可以多種多肽的形式存在。即，彼等可具有其中多種多肽形式的生理活性多肽經由非肽聚合物而連結免疫球蛋白Fc區的結構，但並不特別限制於此。

此外，異源多聚體中，不同種類的生理活性多肽可以彼此不同的比率存在。

例如，2種不同的生理活性多肽可以彼此不同的比率存在，經由連結2種不同的生理活性多肽，其係經由非肽聚合物而連結構成免疫球蛋白Fc的單一單元或其部分之各個2條生理活性多肽鏈，其中2種生理活性多肽之一進一步連結相同種類的生理活性多肽，但是比率不限於此。

在具體實施例中，蛋白質接合物為異源二聚體，其中胰島素類似物的單一單元及咪唑并乙醯基艾塞那肽-4(即，葡萄糖依賴性促胰島素肽)的單一單元經由非肽聚合物而分別連結Fc區的單一單元的各個多肽。

在本發明的具體實施例中，蛋白質接合物為異源二聚體，其中胰島素類似物的單一單元及昇糖素類似物的單一單元經由非肽聚合物而分別連結Fc區的單一單元的各多肽。

在具體實施例中，蛋白質接合物為異源二聚體，其中咪唑并乙醯基艾塞那肽-4(即，葡萄糖依賴性促胰島素肽) 的單一單元及昇糖素類似物的單一單元經由非肽聚合物而分別連結Fc區的單一單元的各個多肽。

在具體實施例中，蛋白質接合物為異源二聚體，其中咪唑并乙醯基艾塞那肽-4(即，葡萄糖依賴性促胰島素肽)的單一單元及FGF21的單一單元經由非肽聚合物而分別連結Fc區的單一單元的各多肽。

上述異源多聚體，特別是異源多聚體，可展現與構成異源多聚體之生理活性多肽的單體接合物相等或相應的生理活性，但並不特別限制於此。

如本文中所使用，術語「單體」意指其形式為其中展現生理活性多肽的單一單元經由非肽聚合物而連結免疫球蛋白Fc區的單一單元的接合物。

具體地，單體意指其形式為其中生理活性多肽的單一單元經由非肽聚合物而連結免疫球蛋白Fc區的單一單元之兩條多肽鏈的任何一條多肽鏈的接合物。

本發明中，「單體」可與「單體接合物」相互替代使用。

構成蛋白質接合物之部分的生理活性多肽，為在人體內能展現生理活性的物質，且可包含能展現生理活性的任何肽。

例如，生理活性多肽可選自由激素、細胞介素、酵素、抗體、生長因子、轉錄因子、血液因子、疫苗、結構蛋白、配體蛋白及受體所成之群組。

此外，例如，生理活性多肽可選自由下列者所成之群組：葡萄糖依賴性促胰島素肽、血液因子、促進消化激素、腎上腺皮質素、甲狀腺素、腸激素、細胞介素、酵素、生長因子、神經肽、腦下垂體激素、下視丘激素、抗肥胖肽、抗病毒肽、具有生理活性的非天然肽衍生物，及其等之類似物，但不限於此。此外，生理活性多肽可為GLP-1受體致效劑、瘦素受體致效劑、DPP-IV抑制劑、Y5受體拮抗劑、黑色素濃集激素(melanin-concentrating hormone,MCH)受體拮抗劑、Y2/3受體致效劑、MC3/4受體致效劑、胃/胰脂酶抑制劑、5HT2c致效劑、β 3A受體致效劑、澱粉素受體致效劑、飢餓肽拮抗劑，或飢餓肽受體拮抗劑。

更具體地，生理活性多肽可為選自由下列者所成之群組的一種：胰島素、昇糖素、類昇糖素肽、調酸催素、艾塞那肽-3、艾塞那肽-4、成纖維細胞生長因子21(FGF21)、人類生長激素(hGH)、生長激素釋放激素、生長激素釋放肽、干擾素、干擾素受體、群落刺激因子、G蛋白偶合受體、介白素、介白素受體、酵素、介白素結合蛋白、細胞介素結合蛋白、巨噬細胞活化因子、巨噬細胞肽、B細胞因子、T細胞因子、蛋白A、過敏抑制物、細胞壞死醣蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制因子、轉移誘導因子、α-1-抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、缺脂脂蛋白-E、紅血球生成素、高糖基化紅血球生成素、血管生成素、血紅素、凝血酶、凝血酶受體活化肽、凝血酶調節素、血液因子VII、VIIa、VIII、IX及XIII、胞漿素原活化因子、血纖維蛋白結合肽、尿激酶、鏈球菌激酶、水蛭素、蛋白C、C-反應蛋白、腎素抑制劑、膠原酶抑制物、超氧化物歧化酶、瘦素、血小板衍生的生長因子、上皮細胞生長因子、表皮細胞生長因子、血管抑制素、成骨生長因子、骨生成促進蛋白、依降鈣素、心房肽、軟骨誘導因子、依降鈣素、結締組織活化因子、組織因子途徑抑制物、濾泡刺激激素、促黃體激素、促黃體激素釋放激素、神經生長因子、副甲狀腺素、鬆弛素、胰泌素、體介素、類胰島素生長因子、腎上腺皮質素、昇糖素、膽囊收縮素、胰多肽、胃泌素釋放肽、促皮質素釋放因子、甲狀腺激素、自體毒素、乳鐵素、肌生成抑制素、受體、受體拮抗劑、細胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、單株抗體、多株抗體、抗體片段、紅血球生成生長因子、白血球形成素、澱粉素、體抑素、肽YY(PYY)、神經肽Y(NPY)、血管收縮素、緩激肽、降鈣素、促皮質素、章魚唾腺精、胃泌素、瘦素、催產素、血管加壓素、黃體激素、促黃體激素、濾泡刺激素、副甲狀腺素、胰泌素、舍莫瑞林、人類生長激素(hGH)、生長激素釋放肽、顆粒細胞群落刺激因子(GCSF)、干擾素(IFN)、介白素、泌乳素釋放肽、食慾激素、甲狀腺釋放肽、膽囊收縮素、胃泌抑制肽、調鈣素、胃泌素釋放肽、腸動素、血管活性腸肽、心房利鈉肽(ANPs)、腦利鈉肽(BNPs)、C-型利鈉肽(CNPs)、神經激肽A、神經介素、腎素、內皮素、角蝰毒素肽、酪啡肽、皮啡肽、強啡肽、內啡肽、腦啡肽、T細胞因子、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子受體、脲激酶受體、腫瘤抑制因子、膠原酶抑制物、胸腺生成素、胸腺九肽、胸腺五肽、胸腺素、胸腺體液因子、腎上腺髓素、咽側體抑制素、類澱粉β-蛋白片段、抗菌肽、抗氧化肽、鈴蟾素、骨鈣化素、CART肽、E-選滯蛋白、ICAM-1、VCAM-1、leucokine、kringle-5、層黏黏蛋白、抑制素、甘丙肽、纖維接合素、胰抑素、福艾，及其等之類似物。

根據本發明的具體實施例，1)胰島素或其類似物及昇糖素或其類似物的組合；2)胰島素或其類似物及葡萄糖依賴性促胰島素肽或其類似物的組合；3)葡萄糖依賴性促胰島素肽或其類似物及昇糖素或其類似物的組合；及4)葡萄糖依賴性促胰島素肽或其類似物及FGF21或其類似物的組合，可適用於異源多聚體，但並不特別限制於此。

生理活性多肽不只包含天然生理活性多肽而且包含其類似物。

特別地，類似物可為具有相應於天然多肽之生理活性的先驅物、衍生物及片段。彼等可為自然發生的或非天然發生的。

如本文中所使用，術語「天然多肽的衍生物」包含相較於天然多肽而具有至少一個在胺基酸序列之差異的肽；經由修飾天然多肽序列而修飾的肽；及具有與天然多肽相同生理活性的天然多肽模擬物。

具體地，可使用取代、添加、缺失及修飾方法中的任一種或其組合來修飾天然多肽胺基酸的一部分而製備天然多肽的衍生物。此外，用於製備天然多肽衍生物的修飾可包含使用L-型或D-型胺基酸、及/或非天然型胺基酸的修飾；及/或天然序列的修飾(如，側鏈反應基團的修飾、分子間共價鍵結，諸如側鏈間的環形成、甲基化、醯化、泛素化、磷酸化、胺基-己烷化(amino-hexanation)、生物素化等。)

此外，修飾可包含在天然多肽的胺基及/或羧基端添加1個或多個胺基酸。

取代或添加所使用的胺基酸不僅可包含通常在人體蛋白內觀察到的20種胺基酸而且可包含非典型或非天然發生的胺基酸。商業來源的非典型胺基酸包含Sigma-Aldrich、ChemPep Inc.及Genzyme Pharmaceuticals。可合成及從商業供應商，如，American Peptide Company或Bachem(USA)或Anygen(Korea)，購買包含這些胺基酸及典型的肽序列的肽。

如本文中所使用，術語「天然多肽的片段或天然多肽的衍生物」意指其中天然多肽或天然多肽衍生物的胺基及/或羧基端的1個或多個胺基酸缺失的形式。此種天然多肽的片段可具有能夠展現相同或相應於天然多肽之生理活性的程度。

關於胰島素及胰島素類似物之實例的資訊，WO 2014/133324及相應之美國專利申請公開案第2016-0008483 A1號的整個說明書以引用方式併入本文中作為本發明之參考。

這種胰島素類似物可為在A-鏈或B-鏈有修飾者，例如，用丙胺酸取代選自由B-鏈位置8、23、24及25之胺基酸及A-鏈位置1、2、14及19之胺基酸所成之群組的胺基酸，且具體地用丙胺酸取代選自由B-鏈位置8、23、24及25之胺基酸及A-鏈位置1、2及19之胺基酸所成之群組的胺基酸；或用麩胺酸或天門冬醯胺酸修飾A-鏈置14的胺基酸，但不限於此，且具有像胰島素一樣可控制體內血糖值功能的任何胰島素類似物可包含在本發明範圍內，但不限制於此。

此外，在具體實施例中，胰島素類似物可為包含以下通式1表示的SEQ ID NO：68之A-鏈及以下通式2表示的SEQ ID NO：69之B-鏈的肽：[通式1]Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa2-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa3-Leu-Xaa4-Gln-Xaa5-Glu-Asn-Xaa6-Cys-Xaa7(SEQ ID NO：68)

其中，在通式1中，Xaa1為丙胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、麩胺酸，或天門冬醯胺酸，Xaa2為丙胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、組胺酸，或天門冬醯胺酸，Xaa3為丙胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、組胺酸，或天門冬醯胺酸，Xaa4為丙胺酸、酪胺酸、麩胺酸、組胺酸、離胺酸、天門冬胺酸或天門冬醯胺酸，Xaa5為丙胺酸、白胺酸、酪胺酸、組胺酸、麩胺酸，或天門冬醯胺酸， Xaa6為丙胺酸、酪胺酸、絲胺酸、麩胺酸、組胺酸，或天門冬醯胺酸，Xaa7為天門冬醯胺酸、甘胺酸、組胺酸，或丙胺酸；及[通式2] Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa8-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa9-Tyr-Xaa10-Xaa11-Lys-Thr(SEQ ID NO：69)

在通式2中，Xaa8為酪胺酸、麩胺酸，或天門冬胺酸，或不存在，Xaa9為苯丙胺酸或不存在，Xaa10為蘇胺酸或不存在，Xaa11為脯胺酸、麩胺酸，或天門冬胺酸，或不存在，其條件為可排除天然胰島素序列。

在更具體的實施例中，胰島素類似物可為胰島素類似物肽，其中，在上述通式1中，Xaa1為甘胺酸，Xaa2為麩醯胺酸，Xaa3為絲胺酸，Xaa4為丙胺酸、麩胺酸，或天門冬醯胺酸，Xaa5為白胺酸，Xaa6為酪胺酸，Xaa7為天門冬醯胺酸；及在上述通式2中，Xaa8為酪胺酸或麩胺酸，Xaa9為苯丙胺酸或不存在，Xaa10為蘇胺酸，Xaa11為脯胺酸、麩胺酸，或天門冬胺酸，或不存在，但不限於此。

在另一個更具體的實施例中，胰島素類似物可為胰島素類似物肽，其中，在上述通式1中，Xaa1為甘胺酸，Xaa2為麩醯胺酸，Xaa3為絲胺酸，Xaa4為麩胺酸或天門冬醯胺酸，Xaa5為白胺酸，Xaa6為酪胺酸，Xaa7為天門冬醯胺酸；在上述通式2中，Xaa8為酪胺酸，Xaa9為苯丙胺酸或不存在，Xaa10為蘇胺酸，Xaa11為脯胺酸、麩胺酸或天門冬胺酸，或不存在，但不限於此。

又在另一個更具體的實施例中，胰島素類似物可為包含上述通式1之A-鏈及SEQ ID NO：69之B-鏈的肽，其中在B-鏈中，Xaa8為酪胺酸，Xaa9不存在，Xaa10為蘇胺酸，Xaa11為脯胺酸、麩胺酸，或天門冬胺酸，或不存在，但不限於此。

肽可為包含上述通式1之A-鏈及SEQ ID NO：69之B-鏈者，其中在B-鏈中，Xaa8為酪胺酸，Xaa9為苯丙胺酸，Xaa10不存在，Xaa11為脯胺酸、麩胺酸，或天門冬胺酸，或不存在，但不限於此。

肽可為，其中，在上述SEQ ID NO：68之A-鏈中，Xaa1為甘胺酸，Xaa2為麩醯胺酸，Xaa3為絲胺酸，Xaa4為麩胺酸，Xaa5為白胺酸，Xaa6為酪胺酸，及Xaa7為天門冬醯胺酸者；及在SEQ ID NO：69之B-鏈中，Xaa8為酪胺酸，Xaa9為苯丙胺酸，Xaa10為蘇胺酸，Xaa11為脯胺酸、麩胺酸，或天門冬胺酸，或不存在，但不限於此。

肽可為，其中，在上述SEQ ID NO：68之A-鏈中，Xaa1為甘胺酸，Xaa2為麩醯胺酸，Xaa3為絲胺酸，Xaa4為天門冬醯胺酸，Xaa5為白胺酸，Xaa6為酪胺酸，及Xaa7為天門冬醯胺酸；及在SEQ ID NO：69之B-鏈中，Xaa8為酪胺酸，Xaa9為苯丙胺酸，Xaa10為蘇胺酸，Xaa11為脯胺酸、麩胺酸，或天門冬胺酸，或不存在，但不限於此。

又在另一個更具體的實施例中，胰島素類似物可為肽，其中，在上述SEQ ID NO：68之A-鏈中，Xaa1為甘胺酸，Xaa2為麩醯胺酸，Xaa3為絲胺酸，Xaa4為麩胺酸，Xaa5為白胺酸，Xaa6為酪胺酸，Xaa7為天門冬醯胺酸；及在SEQ ID NO：69之B-鏈中，Xaa8為酪胺酸，Xaa9不存在，Xaa10為蘇胺酸，Xaa11為脯胺酸、麩胺酸，或天門冬胺酸，或不存在，但不限於此。

又在另一個更具體的實施例中，胰島素類似物可為肽，其中，在上述SEQ ID NO：68之A-鏈中，Xaa1為甘胺酸，Xaa2為麩醯胺酸，Xaa3為絲胺酸，Xaa4為丙胺酸，Xaa5為白胺酸，Xaa6為酪胺酸，Xaa7為天門冬醯胺酸；及在SEQ ID NO：69之B-鏈中，Xaa8為麩胺酸，Xaa9不存在，Xaa10為蘇胺酸，Xaa11為脯胺酸、麩胺酸，或天門冬胺酸，或不存在，但不限於此。

此外，胰島素類似物可包含，其中天然胰島素之A-鏈位置14的胺基酸經修飾為麩胺酸、天門冬醯胺酸，或丙胺酸；及/或天然胰島素之B-鏈位置25的胺基酸不存在；及/或天然胰島素之B-鏈位置16的胺基酸(即，酪胺酸)經修飾為麩胺酸的那些肽，但不限於此。

作為葡萄糖依賴性促胰島素肽及其衍生物的實例，WO 2008/082274及相應之美國專利申請公開案第2010-0105877 A1號的整個說明書以引用方式併入本文中作為本發明之參考。

例如，葡萄糖依賴性促胰島素肽為具有胰島素分泌功能的肽，可在胰臟β細胞中刺激胰島素的合成及表現。葡萄糖依賴性促胰島素肽的實例可包含類昇糖素肽(GLP)-1、艾塞那肽-3、艾塞那肽4等，但不限於此。

葡萄糖依賴性促胰島素肽的類似物可為其中葡萄糖依賴性促胰島素肽的N端胺基缺失的形式；其中葡萄糖依賴性促胰島素肽的N端胺基經羥基取代的形式；其中葡萄糖依賴性促胰島素肽的N端胺基經2個甲基修飾的形式；或其中組胺酸(即，葡萄糖依賴性促胰島素肽的第1個胺基酸)的α碳經去除的形式等，但不限於此。

艾塞那肽-4類似物的具體實例可包含脫胺基-組胺醯基艾塞那肽-4，其中艾塞那肽-4的N端胺基經去除；β-羥基-咪唑并丙醯基艾塞那肽-4，其中艾塞那肽-4的N端胺基經羥基取代；二甲基組胺醯基-艾塞那肽-4，其中艾塞那肽-4的N端胺基經2個甲基修飾；及咪唑并乙醯基艾塞那肽-4，其中組胺酸(即，艾塞那肽-4的第1個胺基酸)的α碳經去除等，但不限於此。

昇糖素類似物可為包含下列通式3之胺基酸序列的肽，但不限於此：X1-X2-QGTF-X7-SD-X10-S-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-F-X23-X24-W-L-X27-X28-X29-X30(通式 3，SEQ ID NO：45)

其中，在通式3中，X1為組胺酸、脫胺基-組胺醯基、N-二甲基-組胺醯基、β-羥基咪唑并丙醯基、4-咪唑并乙醯基、β-羧基咪唑并丙醯基、色胺酸，或酪胺酸，或不存在；X2為α-甲基-麩胺酸、胺基異丁酸(Aib)、D-丙胺酸、甘胺酸、Sar(N-甲基甘胺酸)、絲胺酸，或D-絲胺酸；X7為蘇胺酸、纈胺酸，或半胱胺酸；X10為酪胺酸或半胱胺酸；X12為離胺酸或半胱胺酸；X13為酪胺酸或半胱胺酸；X14為白胺酸或半胱胺酸；X15為天門冬胺酸、麩胺酸或半胱胺酸；X16為麩胺酸、天門冬胺酸、絲胺酸、α-甲基-麩胺酸，或半胱胺酸，或不存在；X17為天門冬胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、絲胺酸、半胱胺酸，或纈胺酸，或不存在；X18為丙胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、精胺酸、纈胺酸，或半胱胺酸，或不存在；X19為丙胺酸、精胺酸、絲胺酸、纈胺酸，或半胱胺酸，或不存在；X20為離胺酸、組胺酸、麩醯胺酸、天門冬胺酸、離胺酸、精胺酸、α-甲基-麩胺酸，或半胱胺酸，或不存在；X21為天門冬胺酸、麩胺酸、白胺酸、纈胺酸，或半胱胺酸，或不存在；X23為異白胺酸、纈胺酸，或精胺酸，或不存在；X24為纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、離胺酸、麩醯胺酸、α-甲基-麩胺酸，或白胺酸，或不存在；X27為異白胺酸、纈胺酸、丙胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、麩醯胺酸，或精胺酸，或不存在；X28為麩醯胺酸、離胺酸、天門冬醯胺酸，或精胺酸，或不存在；X29為離胺酸、丙胺酸、甘胺酸，或蘇胺酸，或不存在；及X30為半胱胺酸或不存在

(條件為當序列與天然昇糖素序列相同時，則排除)。

此外，更具體地，上述通式3中，X1可為組胺酸、色胺酸，或酪胺酸，或不存在；X2可為絲胺酸或胺基異丁酸(Aib)；X7可為蘇胺酸、纈胺酸，或半胱胺酸；X10可為酪胺酸或半胱胺酸；X12可為離胺酸或半胱胺酸；X13可為酪胺酸或半胱胺酸；X14可為白胺酸或半胱胺酸；X15可為天門冬胺酸或半胱胺酸；X16可為麩胺酸、絲胺酸，或半胱胺酸； X17可為天門冬胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、絲胺酸、半胱胺酸，或纈胺酸；X18可為天門冬胺酸、麩胺酸、精胺酸，或半胱胺酸；X19可為丙胺酸或半胱胺酸；X20可為麩醯胺酸、天門冬胺酸、離胺酸，或半胱胺酸；X21可為天門冬胺酸、麩胺酸、白胺酸、纈胺酸，或半胱胺酸；X23可為異白胺酸、纈胺酸，或精胺酸；X24可為纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、麩胺酸、離胺酸、麩醯胺酸，或白胺酸；X27可為異白胺酸、纈胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、麩醯胺酸，或精胺酸；X28可為麩醯胺酸、離胺酸、天門冬醯胺酸，或精胺酸；X29可為蘇胺酸；及X30可為半胱胺酸或不存在。

更具體的實施例中，昇糖素類似物可包含下列種類，但不限於此。然而，SEQ ID NO：1表示天然昇糖素的序列。

FGF21類似物可包含下列者。

FGF21類似物可為相較於天然成纖維細胞生長因子21(FGF21)具有減低之FGF受體(FGFR)或輔助受體(β-klotho)結合親合力者及相較於天然FGF21具有一種或多種修飾胺基酸者，但不限於此。

具體地，FGF21類似物可為相對於天然FGF21胺基酸序列而在第1個胺基酸及/或第2個胺基酸具有缺失者，再者，可包含那些其中選自位置167及168之一種或多種胺基酸經其他胺基酸取代或修飾者，但不限於此。

FGF21類似物可包含天然FGF21之第1個胺基酸(即，組胺酸)及/或第2個胺基酸(即，脯胺酸)的缺失，及獨立地或任選地進一步包含天然FGF21的第167個胺基酸(即，絲胺酸)經其他胺基酸取代，及獨立地或另外地包含天然FGF21的第168個胺基酸(即，甲硫胺酸)經不同胺基酸取代；或其至少一種取代的組合。

進一步，FGF21類似物可包含天然FGF21之N-端之第1個胺基酸(即，組胺酸)的缺失，及任選地進一步包含天然FGF21的第167個胺基酸(即，絲胺酸)經其他胺基酸取代，第168個胺基酸(即，甲硫胺酸)經另一種胺基酸取代，或其至少一種取代的組合。

此外，FGF21類似物可包含天然FGF21之第2個胺基酸(即，脯胺酸)的缺失，及任選地進一步包含天然FGF21的第167個胺基酸(即，絲胺酸)經另一種胺基酸取代，第 168個胺基酸(即，甲硫胺酸)經另一種胺基酸取代，或其至少一種取代的組合。

再者，FGF21類似物可包含天然FGF21之第1個胺基酸(即，組胺酸)及第2個胺基酸(即，脯胺酸)的缺失，及任選地進一步包含天然FGF21的第167個胺基酸(即，絲胺酸)經另一種胺基酸取代，第168個胺基酸(即，甲硫胺酸)經另一種胺基酸取代，或其至少一種取代的組合。

FGF21類似物可包含天然FGF21之第1個胺基酸(即，組胺酸)的缺失，及進一步包含第167個胺基酸(即，絲胺酸)或第168個胺基酸(即，甲硫胺酸)經蘇胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸，或異白胺酸取代。具體地，FGF21類似物可包含天然FGF21之第1個胺基酸(即，組胺酸)的缺失，及進一步包含第167個胺基酸(即，絲胺酸)經蘇胺酸取代，第168個胺基酸(即，甲硫胺酸)經丙胺酸、苯丙胺酸，或異白胺酸取代，或其至少一種取代的組合。

此外，本發明的FGF21類似物可包含天然FGF21之第2個胺基酸(即，脯胺酸)的缺失，及另外地包含天然FGF21的第167個胺基酸(即，絲胺酸)或第168個胺基酸(即，甲硫胺酸)經蘇胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸，或異白胺酸取代。具體地，本發明的FGF21類似物可包含天然FGF21之第2個胺基酸(即，脯胺酸)的缺失，及進一步包含第167個胺基酸(即，絲胺酸)經蘇胺酸取代，第168個胺基酸(即，甲硫胺酸)經丙胺酸、苯丙胺酸，或異白胺酸取代，或其至少一種取代的組合。

再者，FGF21類似物可包含天然FGF21之第1個胺基酸(即，組胺酸)及第2個胺基酸(即，脯胺酸)的缺失，及另外地包含天然FGF21的第167個胺基酸(即，絲胺酸)或第168個胺基酸(即，甲硫胺酸)經蘇胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸，或異白胺酸取代。具體地，FGF21類似物可包含天然FGF21之第1個胺基酸(即，組胺酸)及第2個胺基酸(即，脯胺酸)的缺失，及另外包含第167個胺基酸(即，絲胺酸)經蘇胺酸取代，第168個胺基酸(即，甲硫胺酸)經丙胺酸、苯丙胺酸，或異白胺酸取代，或其至少一種取代的組合。

此外，FGF21類似物可為其中天然FGF21之選自由胺基酸位置5、6、7、8、9、168、172、176、177及178之經其他胺基酸取代所成之群組的一種或多種胺基酸的類似物。另一種胺基酸可為丙胺酸，但並不特別限制於此。

FGF21類似物的更具體實例可包含具有選自SEQ ID NO：46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66及67所成之群組的胺基酸序列的FGF21類似物。

此外，本發明的蛋白質接合物可為其中該蛋白質接合物經生物可分解的聚合物諸如具有體內白蛋白結合親合力的聚乙二醇(PEG)或脂肪酸修飾的形式；或其中該蛋白質接合物另外與有優異持續性的蛋白，諸如白蛋白或免疫球蛋白連結的形式；及其中該蛋白質接合物被封閉在生物可分解的奈米微粒中的形式，但不限於此。

在蛋白質接合物中，非肽聚合物的形式可為其一個端點連結選自免疫球蛋白Fc的N端、離胺酸殘基的側鏈及精胺酸殘基的側鏈之任何一者；而另一個端點連結選自生理活性多肽的N端、離胺酸殘基的側鏈、精胺酸殘基的側鏈、組胺酸殘基的側鏈及半胱胺酸殘基的側鏈之任何一者。

如本文中所使用，術語「非肽聚合物」意指其中連結至少兩重複單元的生物相容性聚合物。重複單元經由任何的共價連結而非經由肽鍵而彼此連結。在本發明中，術語「非肽聚合物」及「非肽連接物」可相互替代使用。

本發明中使用的非肽聚合物可選自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄糖、聚乙烯基乙基醚、諸如聚乳酸(PLA)及聚乳酸-乙醇酸(PLGA)之生物可分解的聚合物、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸及其等之組合所成之群組，及具體地，聚乙二醇。可以所屬領域技術程度而容易製備的衍生物亦屬於本發明的範圍。

經由現有框內融合(inframe fusion)方法而得到的融合蛋白中所使用的肽連接物具有容易被體內蛋白酶裂解的缺點，因此不能如預期得到經由載體而增加活性藥物之血清半衰期的充分功效。然而，本發明中，可使用具有蛋白酶抗性的聚合物以維持與載體相似之肽之血清半衰期。因此，本發明可無限制的使用任何非肽聚合物，只要它是具有體內蛋白酶抗性的聚合物。非肽聚合物具有分子量在超過0kDa至100kDa或較少的範圍、1kDa至100kDa，且具體地超過0kDa，例如，在1kDa或較高及20kDa或較少的範圍；或在0.5kDa至20kDa的範圍；或0.5kDa至50kDa；或5kDa至20kDa；但不限於此。本發明之連結免疫球蛋白Fc區的非肽聚合物，可為一種聚合物或不同聚合物的組合。

此外，非肽聚合物可具有2個或更多個端點，例如，可為具有2個端點的非肽聚合物或具有3個端點的非肽聚合物，但不限於此。

非肽聚合物的兩端點均可連結免疫球蛋白Fc的胺基或硫醇基及展現生理活性的2種或更多種多肽的其中之一。

一種或多種非肽聚合物可使用於一種蛋白質接合物。

例如，連結的形式可為展現生理活性多肽之單一單元的胺基及免疫球蛋白Fc區或其部分之一個多肽的胺基與插在其中的非肽聚合物之兩端連結，而連接展現不同生理活性多肽之單一單元及免疫球蛋白Fc區或其部分的另一個多肽之單一單元的非肽聚合物，在一個端點連結展現不同生理活性的其中一個多肽之單一單元的胺基，或免疫球蛋白Fc區或其部分的多肽之單一單元的胺基，及在另一個端點連結展現不同生理活性的另一個多肽之單一單元的硫醇基，或免疫球蛋白Fc區或其部分的多肽之單一單元的硫醇基。

本發明中使用的非肽聚合物具有可結合至免疫球蛋白Fc區及生理活性多肽的反應基團，而因此其可連結免疫球蛋白Fc區及生理活性多肽。

位於非肽聚合物兩端的反應基團可包含醛基、順丁烯二醯亞胺基，及琥珀醯亞胺衍生物，但不限於此。

醛基的實例可包含丙醛基及丁醛基，但不限於此。

琥珀醯亞胺衍生物的實例可包含丙酸琥珀醯亞胺酯、羥基琥珀醯亞胺基、琥珀醯亞胺基羧甲基，及碳酸琥珀醯亞胺酯。

蛋白質接合物中，可經由使選自由醛基、順丁烯二醯亞胺基及琥珀醯亞胺衍生物所成之群組的非肽聚合物之一端點的反應基團與Fc區或其部分的胺基或生理活性多肽的胺基反應而形成共價連結。

當非肽聚合物在兩端點具有反應性醛基時，可最小化非特異性反應而有效地在兩端點分別結合生理活性多肽及免疫球蛋白。經由醛基透過還原烷化而產生的最終產物比經由醯胺鍵連結更穩定。醛基選擇地在低pH與N-端反應且可在高pH(如，pH9.0)與離胺酸殘基形成共價連結。

非肽聚合物兩端的反應基團可彼此相同或不同。

例如，非肽聚合物可在一端具有順丁烯二醯亞胺基而在另一端具有醛基，如，丙醛基或丁醛基。此外，例如，非肽聚合物可在一端具有醛基以作為反應基團，而在另一端具有順丁烯二醯亞胺基、琥珀醯亞胺基、醛基(如，丙醛基或丁醛基)等。例如，當非肽聚合物在一端具有反應性醛基及在另一端具有反應性順丁烯二醯亞胺基時，可最小化非特異性反應而可有效地在非肽聚合物之兩端分別連結生理活性多肽及免疫球蛋白。使用兩端具有羥基的聚乙二醇作為非肽聚合物時，可使用已知化學反應用上述各種反應基團活化羥基，或使用可購自市售具有修飾之反應基團的聚乙二醇而製備本發明之長效蛋白質接合物。

如本文中所使用，術語「免疫球蛋白Fc區」意指免疫球蛋白的重鏈恆定區2(CH2)及重鏈恆定區3(CH3)，重鏈及輕鏈的可變區除外。免疫球蛋白Fc區可為建立本發明之蛋白質接合物之部分的建構。

免疫球蛋白Fc區的重鏈恆定區可包含鉸鏈區，但不限於此。此外，本發明之免疫球蛋白Fc區可為延伸的Fc區，包含重鏈恆定區1(CH1)及/或輕鏈恆定區1(CL1)的部分或全部，但是只有免疫球蛋白之重鏈及輕鏈的可變區除外，只要它具有實質上與天然類型相同或改進的功效。此外，本發明之免疫球蛋白Fc區可為其中相應於CH2及/或CH3之相當長的胺基酸序列缺失的區域。

例如，本發明之免疫球蛋白Fc區可包含1)CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域，及CH4結構域；2)CH1結構域及CH2結構域；3)CH1結構域及CH3結構域；4)CH2結構域及CH3結構域；5)CH1、CH2、CH3及CH4結構域其中的1個或2個或更多個結構域及免疫球蛋白的鉸鏈區(或鉸鏈區的部分)的組合；及6)重鏈恆定區及輕鏈恆定區之各結構域的二聚體，但不限於此。

此外，在具體實施例中，免疫球蛋白Fc區可為二聚形式。

此外，免疫球蛋白Fc區不僅包含天然胺基酸序列而且包含其序列衍生物。胺基酸序列衍生物意指由於缺失、插入、非保守性或保守性取代，或其組合，而具有至少一個胺基酸殘基之差異的胺基酸序列。

例如，習知在免疫球蛋白Fc的連結上具重要性的位置214至238、297至299、318至322或327至331之胺基酸殘基，可使用作為修飾之合適位置。

此外，其他各種衍生物是可能的，包含那些具有能夠形成雙硫鍵之區域的缺失，或在天然Fc之N-端的一些胺基酸殘基的缺失，或在天然Fc之N-端添加甲硫胺酸殘基者。此外，可在補體結合位點，諸如C1q-結合位點及抗體依賴的細胞介導細胞毒殺作用(ADCC)位點發生缺失而去除效用功能。在國際專利公開案第WO 97/34631、WO 96/32478等號中揭露製備這種免疫球蛋白Fc區之序列衍生物的技術。

通常不會改變蛋白質或肽的活性之蛋白質或肽中的胺基酸交換為所屬領域所習知(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins, Academic Press, New York, 1979)。最常發生的交換為Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu，及Asp/Gly。在某些情況，Fc區可經由磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化(farnesylation)、乙醯化、醯胺化等而修飾。

上述Fc衍生物顯示相應於本發明之Fc區的生物活性或彼等可為具有抗熱、pH等之改進的Fc區結構穩定性。

另外，可從分離自人或動物諸如牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、天竺鼠等活體內之天然形式而得到免疫球蛋白Fc區，或可為得自轉殖動物細胞或微生物的重組體或其衍生物。特別地，可經由從人體或動物活體分離整個免疫球蛋白並用蛋白酶處理分離之免疫球蛋白以自天然免疫球蛋白得到Fc區。用木瓜蛋白酶處理整個免疫球蛋白時，免疫球蛋白會裂解成Fab及Fc區，而用胃蛋白酶處理整個免疫球蛋白時，免疫球蛋白會裂解成pF'c及F(ab)2片段。可使用粒徑排阻層析法等分離Fc或pF'c。在更具體的實施例中，人源Fc區為得自微生物的重組免疫球蛋白Fc區。

此外，免疫球蛋白Fc區可為天然聚糖、相較於其天然類型為增加聚糖或減少聚糖的形式，或為去糖基化的形式。免疫球蛋白Fc聚糖的增加、減少或去除可經由習知的方法諸如化學方法、酵素方法，及使用微生物的基因工程方法而達成。從Fc區去除聚糖而得到的免疫球蛋白Fc區顯示明顯減少與C1q部分的結合親合力及減少或喪失抗體依賴的細胞毒殺作用或補體依賴的細胞毒殺作用，因此不會在體內誘發不必要的免疫反應。關於這點，去糖基化或非糖基化免疫球蛋白Fc區中的免疫球蛋白Fc區可為符合本發明之原始目的而作為藥物載體的更合適形式。

如本文中所使用，術語「去糖基化」意指從Fc區以酶促方式去除糖部分，及術語「非糖基化」意指原核生物，更具體地，E.coli，所生產之Fc區的未糖基化狀態。

同時，免疫球蛋白Fc區可衍生自人類或包含牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠及天竺鼠的其他動物。更具體的實施例中，其係衍生自人類。

此外，免疫球蛋白Fc區可衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其組合體或雜合體。在更具體的實施例中，其係衍生自人類血液中最充足的蛋白中的IgG或IgM，甚至在更具體的實施例中，其係衍生自已知可加強配體結合蛋白之半衰期的IgG。還甚至在更具體的實施例中，免疫球蛋白Fc區為IgG4 Fc區，且在最具體的實施例中，IgG4 Fc區為衍生自人類IgG4的非糖基化Fc區，但不限於此。

特別地，如本文中所使用，術語「組合」意指連結編碼相同來源的單鏈免疫球蛋白Fc區的多肽與不相同來源的單鏈多肽而形成二聚體或多聚體。即，可從選自由IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc及IgE Fc片段所成之群組的2個或更多個片段而製備二聚體或多聚體。

為實現本發明，另一方面，提供製備接合物的方法。

接合物與以上所說明的相同。

具體地，方法包含：提供(a)非肽聚合物，其在一個端點連結生理活性多肽，且在另一個端點包括餘留之反應基團，及(b)生理活性多肽接合物，其中1個或多個生理活性多肽分別連結與具有FcRn-結合親合力的免疫球蛋白Fc區單元或其部分，其中具有FcRn-結合親合力的免疫球蛋白Fc區單元或其部分包含餘留之反應基團；及共價連結於(a)之生理活性多肽之非肽聚合物的餘留之反應基團，及與(b)之生理活性多肽接合物之免疫球蛋白Fc區或其部分的餘留之反應基團。

特別地，(a)之非肽聚合物可具有選自醛基、順丁烯二醯亞胺基及琥珀醯亞胺衍生物所成之群組的餘留之反應基團。

此外，(b)之免疫球蛋白Fc區或其部分的餘留之反應基團可位於免疫球蛋白Fc區或其部分的N端、離胺酸殘基的側鏈及精胺酸殘基的側鏈之任何一處。

此外，(a)之生理活性多肽及(b)之生理活性多肽可為彼此相同或不同種類，更具體地，彼等為不同種類。

此外，(a)之生理活性多肽及(b)之生理活性多肽可為單一單元，但是彼等不限於此。

為實現本發明，進一步方面，提供含有蛋白質接合物的組成物。

蛋白質接合物與以上所說明的相同。

此外，組成物可為用於改善生理活性多肽在體內之持續時間及穩定性之一種。

此外，組成物可為醫藥組成物。醫藥組成物的目的可取決於其中所含的生理活性多肽的種類而變化，及可包含疾病諸如糖尿病及肥胖，且該組成物可作為用於預防及治療這些疾病的醫藥組成物。

本發明之醫藥組成物可包含藥學上可接受之載體、賦形劑或稀釋劑。藥學上可接受之載體、賦形劑或稀釋劑可為那些非天然發生者，但不限於此。如本文中所使用，術語「藥學上可接受」意指具有足夠量以展現治療效果且不造成不良作用的特性，本領域具有通常知識者可根據醫療領域中習知的因素，諸如疾病種類、年齡、體重、健康狀況、性別、患者對藥物的敏感度、給藥途徑、給藥方法、給藥頻率、治療持續時間、以混合或組合而同時給予的藥物等，而容易地判定。

藥學上可接受之載體可包含，用於口服給藥的黏合劑、助流劑、崩解劑、賦形劑、助溶劑、分散劑、安定劑、懸浮劑、著色劑、調味劑等；用於注射的緩衝劑、防腐劑、鎮痛劑、助溶劑、等張劑、安定劑等，可組合而使用；及用於局部給藥的基質、賦形劑、潤滑劑、防腐劑等，但不限於此。

同時，適用於製劑的載體、賦形劑及稀釋劑的實例可包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯橡膠、海藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、礦物油等。此外，組成物可進一步含有填料、抗凝劑、潤滑劑、保濕劑、調味劑、防腐劑等。

此外，本發明之醫藥組成物可製備成選自由下列者所成之群組的任何製劑類型：錠劑、丸劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、懸浮液、內用藥水、乳狀液、糖漿、無菌注射液、非水性溶劑、冷凍乾燥製劑及栓劑。

本發明組成物可與如上述之藥學上可接受的載體組合而製備成各種製劑類型。例如，用於口服給藥，可將組成物調配成錠劑、含片、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、糯米紙囊製劑等。用於注射，可將組成物調配至單劑量安瓿或多劑量容器內。亦可將組成物調配成溶液、懸浮液、錠劑、膠囊及緩釋製劑。

此外，可將組成物調配成適合於患者身體的單劑量形式，及在更具體的實施例中，可根據所屬領域常用的方法調配成經由口服或腸外途徑給藥而適用於肽藥物的製劑，口服或腸外途徑諸如透過皮膚、靜脈、肌肉內、動脈內、脊髓內、鞘內、腦室內、肺部、經皮、皮下、腹膜內、鼻腔、胃內、局部、舌下、陰道或直腸，但不限於此。

此外，肽可摻合各種藥學上可接受之載體諸如生理食鹽水或有機溶劑而使用。可使用碳水化合物諸如葡萄糖、蔗糖或聚葡萄糖；抗氧化劑諸如抗壞血酸或麩胱甘肽；螯合劑；低分子量蛋白；或其他安定劑，來增加穩定性或吸收性。

本發明之醫藥組成物的給藥劑量及頻率由活性成分的類型以及各種因素而決定，諸如待治療的疾病、給藥途徑、患者年齡、性別及體重，及疾病嚴重性。

本發明之組成物的總有效劑量可以單劑量給予患者，或根據分次治療方案以多劑量長時間給予。在本發明之醫藥組成物中，活性成分的含量可依疾病嚴重性而變化。具體地，本發明之肽之較佳每日總劑量可為每公斤之患者體重約0.0001μg至500mg。然而，肽的有效劑量取決於除了醫藥組成物的給藥途徑及治療頻率外，要考量各種因素包含患者年齡、體重、健康狀況、性別、疾病嚴重性、飲食及排泄率。關於這點，本領域具有通常知識者可容易地決定適合本發明之醫藥組成物之特別用途的有效劑量。根據本發明之醫藥組成物只要能顯示本發明之效用，並不特別限制於製劑及給藥途徑及方法。

為實現本發明，另一方面，提供治療目標疾病的方法，包含將蛋白質接合物或含有蛋白質接合物的組成物給予在其中有需要的受試者。

蛋白質接合物及含有蛋白質接合物的組成物與以上所說明的相同。

可根據應用在蛋白質接合物中的生理活性多肽之類型而適當地選擇目標疾病。

下文中，將參考下列實施例而更詳細地說明本發明。然而，提供實施例僅用於說明之目的而本發明範圍不應該以任何方式限制於此。

實施例1. 製備包含胰島素類似物、咪唑并乙醯基艾塞那肽-4及免疫球蛋白Fc的異源二聚體接合物

使用3.4K PropionALD(2)PEG(具有2個丙醛基的PEG；3kDa，NOF，日本)，對相較於天然胰島素有增長之半衰期的胰島素類似物(揭露於WO 2014/133324)之N-端進行聚乙二醇化，胰島素類似物及3.4K PropionALD(2)PEG以莫耳比1：4，蛋白質濃度5mg/mL，於溫度4℃至8℃反應約2小時。特別地，該反應係在50mM檸檬酸鈉緩衝液(pH5.0)及異丙醇的混合溶劑中添加3mM氰基硼氫化鈉(NaCNBH₃)還原劑的環境中進行。反應完成後，使用0.25M氯化鉀及含有20mM檸檬酸鈉(pH3.0)及乙醇的緩衝液之濃度梯度，將反應物施用於SP Sepharose High Performance(GE，美國)而純化單聚乙二醇化胰島素類似物。

然後，使純化的單聚乙二醇化胰島素類似物與長效咪唑并乙醯基艾塞那肽-4(亦稱為」CA-艾塞那肽-4」)接合物(揭露於WO 2008/082274)反應。長效咪唑并乙醯基艾塞那肽-4接合物相應於單體接合物，其為其中咪唑并乙醯基艾塞那肽-4的單一單元經由PEG連結免疫球蛋白Fc的單一單元之形式。

具體地，單聚乙二醇化胰島素類似物與長效咪唑并乙醯基艾塞那肽-4接合物以莫耳比1：0.2，蛋白質濃度5mg/mL至10mg/mL，於25℃反應約16小時。反應係在100mM HEPES緩衝液(pH8.2)及氯化鈉中添加20mM氰基硼氫化鈉還原劑的環境中進行。反應完成後，使用20mM Tris(pH7.0)及0.5M氯化鈉的濃度梯度，將反應物施用於PolyWAX LP(PolyLC，美國)，及使用0.25M氯化鈉及20mM bis-Tris(pH6.0)的濃度梯度，將反應物施用於Source15Q(GE，美國)而純化其中胰島素類似物及CA-艾塞那肽-4分別經由PEG而共價連結免疫球蛋白Fc之單元的接合物。

實施例2. 製備包含2單元胰島素類似物及免疫球蛋白Fc的同源二聚體接合物

使用3.4K PropionALD(2)PEG(具有2個丙醛基的PEG；3kDa，NOF，日本)，對相較於天然胰島素有增長之半衰期的胰島素類似物(揭露於WO 2014/133324)之N-端進行聚乙二醇化，胰島素類似物與3.4K PropionALD(2)PEG以莫耳比1：4，蛋白質濃度5mg/mL，於溫度4℃至8℃反應約2小時。特別地，該反應係在50mM檸檬酸鈉緩衝液(pH5.0)及異丙醇的混合溶劑中添加3mM氰基硼氫化鈉(NaCNBH₃)還原劑的環境中進行。反應完成後，使用0.25M氯化鉀及含有20mM檸檬酸鈉(pH3.0)及45%乙醇的緩衝液之濃度梯度，將反應物施用於SP Sepharose High Performance(GE，美國)而純化單聚乙二醇化胰島素類似物。

然後，使純化的單聚乙二醇化胰島素類似物與單體接合物形式的長效胰島素接合物(揭露於WO 2014/133324)反應。長效胰島素接合物相應於單體接合物，其為其中胰島素類似物之單一單元經由PEG連結免疫球蛋白Fc的單一單元之形式。相應單體接合物之胰島素類似物與單聚乙二醇化胰島素類似物是相同種類。

具體地，使單聚乙二醇化胰島素類似物與單體接合物形式的長效胰島素接合物以莫耳比1：0.2，蛋白質濃度15mg/mL，於25℃反應約16小時。反應係在100mM HEPES緩衝液(pH8.2)及氯化鈉中添加20mM氰基硼氫化鈉還原劑的環境中進行。反應完成後，將反應物施用於Sephadex G25(GE，美國)及緩衝液置換成20mM bis-Tris(pH 6.0)。然後，使用0.25M氯化鈉及20mM bis-Tris(pH 6.0)的濃度梯度，將反應物施用於Source15Q(GE，美國)，及使用1.3M硫酸銨及20mM Tris(pH7.5)的濃度梯度，將反應物施用於Source ISO(GE，USA)而純化接合物，其中2單元胰島素類似物經由PEG而分別共價連結免疫球蛋白Fc的單一單元。

實施例3. 製備包含2單元咪唑并乙醯基艾塞那肽-4及免疫球蛋白Fc的同源二聚體接合物

使用3.4K PropionALD(2)PEG(具有2個丙醛基的PEG；3kDa，NOF，日本)，對咪唑并乙醯基艾塞那肽-4(Bachem，美國)(揭露於WO 2008/082274)的離胺酸進行聚乙二醇化，使咪唑并乙醯基艾塞那肽-4及3.4K PropionALD(2)PEG以莫耳比1：15，蛋白質濃度6mg/mL，於溫度4℃至8℃反應約13.5小時。特別地，該反應係在100mMHEPES緩衝液(pH7.5)及異丙醇的混合溶劑中添加20mM氰基硼氫化鈉還原劑的環境中進行。反應完成後，使用0.25M氯化鉀及含有20mM檸檬酸鈉(pH3.0)及異丙醇的緩衝液之濃度梯度，將反應物施用於Source 15S(GE，美國)而純化單聚乙二醇化咪唑并乙醯基艾塞那肽-4。

然後，使純化的單聚乙二醇化咪唑并乙醯基艾塞那肽-4與單體接合物形式的咪唑并乙醯基艾塞那肽-4接合物(揭露於WO 2008/082274)以莫耳比1：5，蛋白質濃度20mg/ mL，於溫度4℃至8℃反應約20小時。反應係在100mM磷酸鉀緩衝液(pH6.0)中添加20mM氰基硼氫化鈉還原劑的環境中進行。反應完成後，使用氯化鈉及5mM Tris(pH7.0)的濃度梯度，經由施用於Source Phenyl(GE，美國)而去除未反應的反應物，然後使用20mM Tris(pH 7.5)及氯化鈉的濃度梯度，將反應物施用於Source15Q(GE，美國)，及使用硫酸銨及20mM Tris(pH7.5)的濃度梯度，將反應物施用於SourceISO(GE，美國)而純化同源二聚體接合物，其中2單元咪唑并乙醯基艾塞那肽-4經由PEG而分別共價連結免疫球蛋白Fc的單一單元。

實施例4. 製備包含胰島素類似物、昇糖素類似物及免疫球蛋白Fc的異源二聚體接合物

使用順丁烯二醯亞胺-10K PEG-PropionALD(分別具有順丁烯二醯亞胺基及丙醛基的PEG；10kDa，NOF，日本)，對昇糖素類似物的半胱胺酸殘基進行聚乙二醇化，使昇糖素類似物及順丁烯二醯亞胺-10K PEG-PropionALD以莫耳比1：1.3，蛋白質濃度3mg/mL，於溫度4℃至8℃反應約1小時。在此，昇糖素類似物為在天然昇糖素的序列上有修飾的類似物且其包含半胱胺酸殘基。特別地，反應係在50mM Tris緩衝液(pH7.5)及異丙醇之混合溶劑的環境中進行。反應完成後，使用含有20mM檸檬酸鈉(pH3.0)及乙醇的緩衝液及0.25M氯化鉀之濃度梯度，將反應物施用於SP Sepharose High Performance(GE，美國)而純化單聚乙二醇化昇糖素類似物。

然後，使純化的單聚乙二醇化昇糖素類似物與單體接合物形式的長效胰島素類似物接合物(揭露於WO 2014/133324)以莫耳比1：7.5，蛋白質濃度25mg/mL，於溫度4℃反應約16小時。反應係在100mM磷酸鉀緩衝液(pH6.0)及異丙醇的混合溶劑中添加20mM氰基硼氫化鈉還原劑的環境中進行。反應完成後，使用20mM bis-Tris(pH6.5)及0.25M氯化鈉的濃度梯度，將反應物施用於Source15Q(GE，美國)，及順著硫酸銨及20mM檸檬酸鈉(pH5.2)的濃度梯度，將反應物施用於SourceISO(GE，美國)而純化異源二聚體接合物，其中胰島素類似物及昇糖素類似物經由PEG而分別共價連結免疫球蛋白Fc的單一單元。

實施例5. 製備包含咪唑并乙醯基艾塞那肽-4(CA-艾塞那肽-4)、昇糖素類似物及免疫球蛋白Fc的異源二聚體接合物

使用順丁烯二醯亞胺-10K PEG-PropionALD(分別具有順丁烯二醯亞胺基及丙醛基的PEG；10kDa，NOF，日本)，對昇糖素類似物的半胱胺酸殘基進行聚乙二醇化，在如實施例4中的聚乙二醇化的反應條件及純化條件下純化單聚乙二醇化昇糖素類似物。在此，昇糖素類似物為在天然昇糖素的序列上有修飾的類似物且其包含半胱胺酸殘基。

然後，使純化的單聚乙二醇化昇糖素類似物與單體接合物形式的長效咪唑并乙醯基艾塞那肽-4接合物(揭露於WO 2008/082274)進行如實施例4中的接合反應條件及純化條件而純化異源二聚體接合物，其中咪唑并乙醯基艾塞那肽-4及昇糖素類似物經由PEG而分別共價連結免疫球蛋白Fc的單一單元。

實施例6. 製備包含咪唑并乙醯基艾塞那肽-4(CA-艾塞那肽-4)、成纖維細胞生長因子21(FGF21)及免疫球蛋白Fc的異源二聚體接合物

使用3.4K PropionALD(2)PEG(具有2個丙醛基的PEG；3kDa，NOF，日本)，對成纖維細胞生長因子21的N-端進行聚乙二醇化，使成纖維細胞生長因子21與3.4K PropionALD(2)PEG以莫耳比1：3，蛋白質濃度5mg/mL，於溫度4℃至8℃反應約2小時。特別地，用基於FGF21 cDNA(OriGene，RC204538)而製備的FGF21表現載體轉殖E.coli，用E.coli周質表現FGF21，隨後萃取及純化所得物而得到成纖維生長因子21。特別地，反應係在100mM磷酸鉀緩衝液(pH6.0)中添加20mM氰基硼氫化鈉還原劑的環境中進行。反應完成後，使用0.25M氯化鈉及含有20mM Tris(pH7.0)之緩衝液的濃度梯度，將反應物施用於Source15Q(GE，美國)而純化單聚乙二醇化成纖維細胞生長因子21。

然後，使純化的單聚乙二醇化成纖維細胞生長因子21與長效咪唑并乙醯基艾塞那肽-4接合物(揭露於WO 2008/082274)以莫耳比1：3，蛋白質濃度30mg/mL，於溫度4℃至8℃反應約16小時。反應係在100mM磷酸鉀緩衝液(pH6.0)中添加20mM氰基硼氫化鈉還原劑的環境中進行。反應完成後，使用20mM bis-Tris(pH6.0)及0.25M 氯化鈉的濃度梯度，將反應物施用於Source15Q(GE，美國)，及使用硫酸銨及20mM Tris(pH 7.5)的濃度梯度，將反應物施用於Source ISO(GE，美國)而純化異源二聚體接合物，其中咪唑并乙醯基艾塞那肽-4及成纖維細胞生長因子21經由PEG而分別共價連結免疫球蛋白Fc的單一單元。

實施例7. 包含胰島素類似物、咪唑并乙醯基艾塞那肽-4(CA-艾塞那肽-4)及免疫球蛋白Fc之異源二聚體接合物的分析

進行RP-HPLC、IE-HPLC及SE-HPLC分析而確定根據實施例1所製備的異源二聚體接合物的純度。表1中，RP-HPLC(%)、IE-HPLC(%)及SE-HPLC(%)表示異源二聚體接合物的純度，以面積(%)計。

如上述結果可見，經由RP-HPLC、IE-HPLC及SE-HPLC的純度分析結果皆確定為95%或更高。

將異源二聚體接合物與單體接合物，即，長效胰島素類似物接合物及長效咪唑并乙醯基艾塞那肽-4接合物，一起分析比較。第1圖顯示RP-HPLC、IE-HPLC及SE-HPLC的分別結果及第2圖顯示SDS-PAGE的結果。第3圖、第4圖及第5圖分別顯示使用抗免疫球蛋白Fc、抗艾塞那肽-4及抗胰島素之西方墨點結果。

實施例8. 包含2單元胰島素類似物及免疫球蛋白Fc之異源二聚體接合物的分析

進行IE-HPLC及SE-HPLC分析而確定根據實施例2所製備的長效胰島素類似物同源二聚體接合物的純度。表2中，IE-HPLC(%)及SE-HPLC(%)表示長效胰島素類似物同源二聚體接合物的純度，以面積(%)計。

如上述結果可見，經由IE-HPLC及SE-HPLC的純度分析結果皆確定為95%或更高。

長效胰島素類似物同源二聚體接合物與長效胰島素類似物單體接合物，一起分析比較。第6圖顯示IE-HPLC及SE-HPLC的分別結果及第7圖顯示SDS-PAGE的結果。

實施例9. 包含2單元咪唑并乙醯基艾塞那肽-4(CA-艾塞那肽-4)及免疫球蛋白Fc之同源二聚體接合物的分析

進行SE-HPLC及RP-HPLC分析而確定根據實施例3所製備的長效咪唑并乙醯基艾塞那肽-4同源二聚體接合物的純度。表3中，SE-HPLC(%)及RP-HPLC(%)表示長效咪唑并乙醯基艾塞那肽-4同源二聚體接合物的純度，以面積(%)計。

如上述結果可見，經由IE-HPLC及SE-HPLC的純度分析結果皆確定為80%或更高。

長效咪唑并乙醯基艾塞那肽-4同源二聚體接合物及長效咪唑并乙醯基艾塞那肽-4單體接合物，一起分析比較。特別地，第8圖顯示SE-HPLC及RP-HPLC的分別結果及第9圖顯示SDS-PAGE的結果。

實施例10. 包含胰島素類似物、昇糖素類似物及免疫球蛋白Fc之異源二聚體接合物的分析

進行RP-HPLC、IE-HPLC及SE-HPLC分析而確定根據實施例4所製備的異源二聚體接合物的純度。表4中，RP-HPLC(%)、IE-HPLC(%)及SE-HPLC(%)表示異源二聚體接合物的純度，以面積(%)計。

異源二聚體接合物與長效胰島素類似物接合物及長效昇糖素類似物接合物，一起分析比較。特別地，第10圖顯示RP-HPLC、IE-HPLC及SE-HPLC的分別結果及第11圖顯示SDS-PAGE的結果。

實施例11. 包含咪唑并乙醯基艾塞那肽-4(CA-艾塞那肽-4)、昇糖素類似物及免疫球蛋白Fc的異源二聚體接合物的分析

進行RP-HPLC、IE-HPLC及SE-HPLC分析而確定根據實施例5所製備的異源二聚體接合物的純度。表5中，RP-HPLC(%)、IE-HPLC(%)及SE-HPLC(%)表示異源二聚體接合物的純度，以面積(%)計。

如上述結果可見，經由RP-HPLC、IE-HPLC及SE-HPLC的純度分析結果皆確定為90%或更高。

異源二聚體接合物與長效咪唑并乙醯基艾塞那肽-4接合物及長效昇糖素類似物接合物，一起分析比較。特別地，第12圖顯示RP-HPLC、IE-HPLC及SE-HPLC的分別結果及第13圖顯示SDS-PAGE的結果。

實施例12. 包含咪唑并乙醯基艾塞那肽-4(CA-艾塞那肽-4)、成纖維細胞生長因子21(FGF21)及免疫球蛋白Fc之異源二聚體接合物的分析

進行RP-HPLC、IE-HPLC及SE-HPLC分析而確定根據實施例6所製備的異源二聚體接合物的純度。表6中，RP-HPLC(%)、IE-HPLC(%)及SE-HPLC(%)表示異源二聚體接合物的純度，以面積(%)計。

異源二聚體接合物與長效咪唑并乙醯基艾塞那肽-4接合物及長效成纖維細胞生長因子21接合物，一起分析比較。特別地，第14圖顯示RP-HPLC、IE-HPLC及SE-HPLC的分別結果及第15圖顯示SDS-PAGE的結果。

實施例13. 包含胰島素類似物、咪唑并乙醯基艾塞那肽-4(CA-艾塞那肽-4)及免疫球蛋白Fc之異源二聚體接合物的效價分析

使用各製備之細胞系於測量體外細胞活性的方法確定包含實施例1所製備的胰島素類似物及艾塞那肽-4之異源二聚體、實施例2所製備的胰島素類似物之同源二聚體及實施例3所製備的咪唑并乙醯基艾塞那肽-4之同源二聚體的效價。

轉殖分別的細胞系而使得能夠在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表現人類GLP-1受體及人類胰島素受體β基因且彼等適合於測量GLP-1及胰島素的活性。據此，使用各轉殖細胞系測量各同源二聚體的活性。

為了確定胰島素類似物的效價及比較異源二聚體與長效胰島素類似物單體接合物的效價，將人類胰島素進行344.4nM至0.2nM的3倍連續稀釋，亦將長效胰島素類似物單體接合物、包含胰島素類似物及咪唑并乙醯基艾塞那肽-4之異源二聚體及胰島素類似物之同源二聚體及免疫球蛋白Fc進行20037.1nM至9.2nM的3倍連續稀釋。用KRB緩衝液洗滌表現人類胰島素受體β之培養的CHO細胞，將連續稀釋之各100μL材料添加至CHO細胞，於37℃，CO₂培養箱培養10分鐘。然後，將25μL細胞裂解緩衝液添加至細胞中以裂解細胞，將細胞裂解液施用於Phospho-Insulin Receptor β Sandwich ELISA試劑盒(Cell signaling，美國)以測量磷酸化胰島素受體β，由此計算EC₅₀值並互相比較。以下表7顯示EC₅₀值及相對於人類胰島素的相對效價。

為了確定咪唑并乙醯基艾塞那肽-4的效價並與長效咪唑并乙醯基艾塞那肽-4單體接合物比較，將咪唑并乙醯基艾塞那肽-4進行50nM至0.000048nM的4倍連續稀釋，並將包含胰島素類似物及咪唑并乙醯基艾塞那肽-4之異源二聚體、咪唑并乙醯基艾塞那肽-4之同源二聚體及免疫球蛋白Fc進行400nM至0.00038nM的4倍連續稀釋。自表現人類GLP-1受體之培養的CHO細胞移除培養基，將連續稀釋之各5μL材料添加至細胞，於室溫培養15分鐘。然後，將10μL含有細胞裂解緩衝液的檢測混合物添加至細胞中以裂解細胞，並在室溫反應90分鐘。反應完成後，將細胞裂解液施用於LANCE cAMP試劑盒(PerkinElmer，美國)以測量蓄積的cAMP量，由此計算EC₅₀值並互相比較。以下表7顯示EC₅₀值及相對於咪唑并乙醯基艾塞那肽-4的相對效價。

實驗結果確定，在其中2種或更多種生理活性多肽材料分別經由非肽聚合物而連結免疫球蛋白Fc之接合物的情況，該接合物具有與其中單一種生理活性多肽經由非肽聚合物而連結免疫球蛋白Fc之接合物相似的生理活性。

實施例14. 包含胰島素類似物、昇糖素類似物及免疫球蛋白Fc之異源二聚體接合物的體外效價分析

採用測量體外細胞活性的方法以確定包含實施例4中製備的胰島素類似物及昇糖素類似物之異源二聚體的效價。

首先，為了分析胰島素之效價，使用源自小鼠3T3-L1細胞系分化成脂肪細胞以進行葡萄糖攝取(或脂質合成能力)試驗。使用含有10%新生牛血清(NBCS)的Dulbeco's Modified Eagle培養基(DMEM,Gibco,Cat.No.12430)，每週2或3次繼代培養而維持3T3-L1細胞系(ATCC,CL-173)。將3T3-L1細胞系懸浮於分化用培養基中(含10% FBS之DMEM)，以5×10⁴細胞/孔接種到48孔盤中，並於37℃培養48小時。為了分化為脂肪細胞，將1μg/mL人類胰島素(Sigma,Cat.No.I9278)、0.5mM 3-異丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX,Sigma,Cat.No.I5879)及1μM地塞米松(dexamethasone)(Sigma,Cat.No.D4902)混合至分化培養基中。移除現有的培養基後，將混合物以250μL/孔的量添加至各孔中。48小時之後，用只含有人類胰島素(1μg/mL)的培養基置換各孔中的培養基。然後，每48小時用含有人類胰島素(1μg/mL)的分化培養基置換各孔中的培養基並在10天至14天確定誘導分化成脂肪細胞。

於葡萄糖攝取試驗，用不含血清的DMEM培養基將最終分化成脂肪細胞的細胞洗滌一次並將250μL不含血清的DMEM培養基添加至各孔以誘導4小時的血清消耗。用不含血清的DMEM培養基從10,000nM至0.01nM依序稀釋10倍以製備人類胰島素、人類昇糖素、長效胰島素類似物單體、長效昇糖素類似物單體、胰島素/昇糖素類似物異源二聚體及免疫球蛋白Fc。將250μL所製備的各樣本分別添加至細胞中，並於37℃，5%CO₂培養箱中培養24小時。培養完成後，收集200μL培養基，分別用D-PBS稀釋5倍，並進行GOPOD分析(GOPOD Assay Kit,Megazyme,Cat.No.K-GLUC)以測量培養基中的葡萄糖殘留量。基於標準葡萄糖溶液的吸光度以計算培養基中殘留葡萄糖的濃度，並計算相對於葡萄糖攝取能力之各樣本的EC₅₀值，以下表8顯示其結果。

然後，為了測量昇糖素的效價，採用使用轉殖細胞系而能夠在上文明確說明的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表現人類昇糖素受體的測量體外細胞cAMP活性之方法，。

為了確定包含胰島素類似物、昇糖素類似物及免疫球蛋白Fc之異源二聚體的效價，及與長效昇糖素類似物接合物比較，將人類昇糖素進行50nM至0.000048nM的4倍連續稀釋，並將長效昇糖素類似物單體接合物；長效胰島素類似物單體接合物；包含胰島素類似物、昇糖素類似物及免疫球蛋白Fc之異源二聚體；及最後免疫球蛋白Fc進行400nM至0.00038nM的4倍連續稀釋。自表現昇糖素受體之培養的CHO細胞移除培養基，將連續稀釋之各5μL材料添加至細胞，於室溫培養15分鐘。然後，將10μL含有細胞裂解緩衝液的檢測混合物添加至細胞中以裂解細胞，並在室溫反應90分鐘。反應完成後，將細胞裂解液施用於LANCE cAMP試劑盒(PerkinElmer，美國)以測量蓄積的cAMP量，由此計算EC₅₀值並互相比較。以下表8顯示 EC₅₀值及相對於人類昇糖素受體的相對效價。

如表8所示，根據本發明之包含胰島素類似物及昇糖素類似物的異源二聚體顯示10.1%的胰島素活性及10.7%的昇糖素活性，而這些值確定分別與長效胰島素類似物單體及長效昇糖素類似物單體的值相似。

從以上結果，在其中2種或更多種生理活性多肽材料經由非肽聚合物而分別與免疫球蛋白Fc連結之接合物的情況，該接合物具有與其中單一種生理活性多肽材料經由非肽聚合物而連結免疫球蛋白Fc之接合物相似的生理活性。

實施例15. 包含咪唑并乙醯基艾塞那肽-4(CA-艾塞那肽-4)、昇糖素類似物及免疫球蛋白Fc之異源二聚體接合物的體外效價分析

採用使用各細胞系測量體外cAMP活性的方法，以確定實施例5中所製備的包含咪唑并乙醯基艾塞那肽-4及昇糖素類似物的異源二聚體之效價。

轉殖各個細胞系以能夠在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表現人類昇糖素受體及人類類昇糖素肽-1(GLP-1)受體基因而其適合於測量昇糖素類似物及咪唑并乙醯基艾塞那肽-4的活性。據此，使用各轉殖細胞系測量各異源二聚體的活性。

為了確定包含咪唑并乙醯基艾塞那肽-4及昇糖素類似物及免疫球蛋白Fc之異源二聚體的效價，並與長效咪唑并乙醯基艾塞那肽-4單體接合物及長效昇糖素類似物單體接合物比較，將人類昇糖素及類昇糖素肽-1(GLP-1)進行50nM至0.000048nM的4倍連續稀釋，將長效昇糖素類似物單體接合物；長效咪唑并乙醯基艾塞那肽-4單體接合物；包含昇糖素類似物、咪唑并乙醯基艾塞那肽-4及免疫球蛋白Fc的異源二聚體；及最後免疫球蛋白Fc進行400nM至0.00038nM的4倍連續稀釋。自表現人類昇糖素受體及人類類昇糖素肽-1受體之培養的CHO細胞移除培養基，將連續稀釋之各5μL材料添加至細胞，並於此添加5μL含有抗cAMP抗體的緩衝液，將細胞在室溫培養15分鐘。然後，將10μL含有細胞裂解緩衝液的檢測混合物添加至細胞而用於裂解細胞，並在室溫反應90分鐘。反應完成後，將細胞裂解液施用於LANCE cAMP試劑盒(PerkinElmer，美國)而測量蓄積的cAMP量，由此計算EC₅₀值並互相比較。以下表9顯示EC₅₀值及相對於人類昇糖素及人類GLP-1的相對效價。

如表9所示，根據本發明之包含咪唑并乙醯基艾塞那肽-4及昇糖素類似物的異源二聚體顯示4.6%的GLP-1活性及5.1%的昇糖素活性，而這些值確定分別與長效咪唑并乙醯基艾塞那肽-4單體及長效昇糖素類似物單體的值相似。

由上述，與本發明有關的本領域領域具有通常知識者將能夠瞭解本發明可用不改變本發明之技術概念或主要特徵之其他具體形式來實現。關於這點，本文所揭露之具體實施例只作為說明性的目的而非意圖限制本發明之範圍。相反地，本發明旨在不但涵蓋具體實施例而且涵蓋可包含於所附權利要求所定義的本發明的精神及範圍內的各種選擇形式、修改形式、等價形式及其他具體例。

<110> 韓美藥品股份有限公司(HANMI PHARM.CO.,LTD.)

<120> 包含多個生理多肽及免疫球蛋白Fc區之蛋白質接合物 (A protein conjugate comprising multiple physiological polypeptides and an immunoglobulin Fc region)

<130> OPA16206

<150> KR 10-2015-0136656

<151> 2015-09-25

<160> 69

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 29

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<400> 2

<210> 3

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<400> 3

<210> 4

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<400> 4

<210> 5

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<400> 5

<210> 6

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<400> 6

<210> 7

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<400> 7

<210> 8

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<400> 8

<210> 9

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<400> 9

<210> 10

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<400> 10

<210> 11

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<400> 11

<210> 12

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 12

<210> 13

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<400> 13

<210> 14

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<400> 14

<210> 15

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<400> 15

<210> 16

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<400> 16

<210> 17

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<400> 17

<210> 18

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<400> 18

<210> 19

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 19

<210> 20

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 20

<210> 21

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 21

<210> 22

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 22

<210> 23

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 23

<210> 24

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 24

<210> 25

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 25

<210> 26

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 26

<210> 27

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 27

<210> 28

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 28

<210> 29

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 29

<210> 30

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 30

<210> 31

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(21)

<223> 位置17及21之胺基酸形成環

<400> 31

<210> 32

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(19)

<223> 位置15及19之胺基酸形成環

<400> 32

<210> 33

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<400> 33

<210> 34

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 34

<210> 35

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 35

<210> 36

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 36

<210> 37

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 37

<210> 38

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 38

<210> 39

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 39

<210> 40

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 40

<210> 41

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(20)

<223> 位置16及20之胺基酸形成環

<400> 41

<210> 42

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<400> 42

<210> 43

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<400> 43

<210> 44

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為胺基異丁酸(Aib)

<400> 44

<210> 45

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 昇糖素類似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)

<223> Xaa為組胺酸、去胺基-組胺醯基、N-二甲基-組胺醯基、 β-羥基咪唑并丙醯基、4-咪唑并乙醯基、β-羧基咪唑并丙醯基、色胺酸或酪胺酸，或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa為α-甲基-麩胺酸、胺基異丁酸(Aib), D-丙胺酸、甘胺酸、Sar(N-甲基甘胺酸)、絲胺酸或D-絲胺酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)

<223> Xaa為蘇胺酸、纈胺酸或半胱胺酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)

<223> Xaa為酪胺酸或半胱胺酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)

<223> Xaa為離胺酸或半胱胺酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)

<223> Xaa酪胺酸或半胱胺酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14)

<223> Xaa白胺酸或半胱胺酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)

<223> Xaa為天門冬胺酸、麩胺酸或半胱胺酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)

<223> Xaa為麩胺酸、天門冬胺酸、絲胺酸、 α-甲基-麩胺酸或半胱胺酸，或不存在；

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)

<223> Xaa為天門冬胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、絲胺酸、半胱胺酸或纈胺酸，或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18)

<223> Xaa為丙胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、精胺酸、纈胺酸或半胱胺酸，或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)

<223> Xaa為丙胺酸、精胺酸、絲胺酸、纈胺酸或半胱胺酸，或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)

<223> Xaa為離胺酸、組胺酸、麩醯胺酸、天門冬胺酸、離胺酸、精胺酸、α-甲基-麩胺酸或半胱胺酸，或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (21)

<223> Xaa為天門冬胺酸、麩胺酸、白胺酸、纈胺酸或半胱胺酸，或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (23)

<223> Xaa為異白胺酸、纈胺酸或精胺酸，或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (24)

<223> Xaa為纈胺酸、精胺酸、丙胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、離胺酸、麩醯胺酸、α-甲基-麩胺酸或白胺酸，或不存在；

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (27)

<223> Xaa為異白胺酸、纈胺酸、丙胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、麩醯胺酸或精胺酸，或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (28)

<223> Xaa為麩醯胺酸、離胺酸、天門冬醯胺酸或精胺酸，或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (29)

<223> Xaa為離胺酸、丙胺酸、甘胺酸或蘇胺酸，或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (30)

<223> Xaa為半胱胺酸或不存在

<400> 45

<210> 46

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/M168A類似物

<400> 46

<210> 47

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/dPro/S167T類似物

<400> 47

<210> 48

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/dPro/M168A類似物

<400> 48

<210> 49

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/dPro/M168F類似物

<400> 49

<210> 50

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/D5A/M168A類似物

<400> 50

<210> 51

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/S6A/M168A類似物

<400> 51

<210> 52

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/S7A/M168A類似物

<400> 52

<210> 53

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/P8A/M168A類似物

<400> 53

<210> 54

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/L9A/M168A類似物

<400> 54

<210> 55

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/S172A/M168A類似物

<400> 55

<210> 56

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/S176A/M168A類似物

<400> 56

<210> 57

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/P177A/M168A類似物

<400> 57

<210> 58

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/S178A/M168A類似物

<400> 58

<210> 59

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/dPro/D5A/M168A類似物

<400> 59

<210> 60

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/dPro/S6A/M168A類似物

<400> 60

<210> 61

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/dPro/S7A/M168A類似物

<400> 61

<210> 62

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/dPro/P8A/M168A類似物

<400> 62

<210> 63

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/dPro/L9A/M168A類似物

<400> 63

<210> 64

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/dPro/S172A/M168A類似物

<400> 64

<210> 65

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/dPro/S176A/M168A類似物

<400> 65

<210> 66

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/dPro/P177A/M168A類似物

<400> 66

<210> 67

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FGF21 dHis/dPro/S178A/M168A類似物

<400> 67

<210> 68

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰島素A-鏈

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)

<223> Xaa為丙胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、麩胺酸或天門冬醯胺酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)

<223> Xaa為丙胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、組胺酸或天門冬醯胺酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)

<223> Xaa為丙胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、組胺酸或天門冬醯胺酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14)

<223> Xaa為丙胺酸、酪胺酸、麩胺酸、組胺酸、離胺酸、天門冬胺酸或天門冬醯胺酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)

<223> Xaa為丙胺酸、白胺酸、酪胺酸、組胺酸、麩胺酸或天門冬醯胺酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)

<223> Xaa為丙胺酸、酪胺酸、絲胺酸、麩胺酸、組胺酸或天門冬醯胺酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (21)

<223> Xaa為天門冬醯胺酸、甘胺酸、組胺酸或丙胺酸

<400> 68

<210> 69

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰島素B-鏈

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)

<223> Xaa為酪胺酸、麩胺酸或天門冬胺酸，或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (25)

<223> Xaa為苯丙胺酸，或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (27)

<223> Xaa為蘇胺酸，或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (28)

<223> Xaa為脯胺酸、麩胺酸或天門冬胺酸，或不存在

<400> 69

Claims

一種蛋白質接合物，其包括2種或更多種生理活性多肽，其中該蛋白質接合物包括：(i)具有FcRn-結合親合力的免疫球蛋白Fc區單元或Fc區的一部分；(ii)共價連結Fc區或其部分的非肽聚合物；及(iii)共價連結非肽聚合物的生理活性多肽；其中該Fc區或其部分為2條多肽鏈的二聚體，及1個或多個非肽聚合物係與該2條多肽鏈的各肽鏈連結。
如申請專利範圍第1項所述之蛋白質接合物，其中該免疫球蛋白Fc區為非糖基化。
如申請專利範圍第1項所述之蛋白質接合物，其中該免疫球蛋白Fc區係由選自由CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域及CH4結構域所成之群組的1至4個結構域所構成。
如申請專利範圍第1項所述之蛋白質接合物，其中該免疫球蛋白Fc區進一步包括鉸鏈區。
如申請專利範圍第1項所述之蛋白質接合物，其中該免疫球蛋白Fc區係選自由IgG、IgA、IgD、IgE、IgM之Fc區，其組合，及其雜合體所成之群組。
如申請專利範圍第1項所述之蛋白質接合物，其中該免疫球蛋白Fc區係選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之 Fc區，其組合，及其雜合體所成之群組。
如申請專利範圍第1項所述之蛋白質接合物，其中該免疫球蛋白Fc區為IgG4 Fc區。
如申請專利範圍第7項所述之蛋白質接合物，其中該免疫球蛋白Fc區為人類非糖基化IgG4 Fc區。
如申請專利範圍第1項所述之蛋白質接合物，其係使選自由醛基、順丁烯二醯亞胺基及琥珀醯亞胺衍生物所成之群組的非肽聚合物之一端點的反應基團與該Fc區或其部分的胺基或該生理活性多肽的胺基反應而形成共價連結。
如申請專利範圍第9項所述之蛋白質接合物，其中該琥珀醯亞胺衍生物為丙酸琥珀醯亞胺酯、琥珀醯亞胺基羧甲基、羥基琥珀醯亞胺基或碳酸琥珀醯亞胺酯。
如申請專利範圍第9項所述之蛋白質接合物，其中在該非肽聚合物之兩端點的反應基團為醛基。
如申請專利範圍第1項所述之蛋白質接合物，其中該非肽聚合物的一個端點連結選自該免疫球蛋白Fc的N端、離胺酸殘基的側鏈及精胺酸殘基的側鏈之任何一者，而該非肽聚合物的另一個端點連接選自該生理活性多肽的N端、離胺酸殘基的側鏈、精胺酸殘基的側鏈、組胺酸殘基的側鏈及半胱胺酸殘基的側鏈之任何一者。
如申請專利範圍第1項所述之蛋白質接合物，其中該非肽聚合物為選自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-聚丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄糖、聚乙烯基乙基醚、生物可分解的聚合物、脂質聚合物、脂肪酸、幾丁質、玻尿酸及其等之組合所成之群組中的至少一種。
如申請專利範圍第13項所述之蛋白質接合物，其中該非肽聚合物為聚乙二醇。
如申請專利範圍第1項所述之蛋白質接合物，其中該生理活性多肽係選自由激素、細胞介素、酵素、抗體、生長因子、轉錄因子、血液因子、疫苗、結構蛋白、配體蛋白及受體所成之群組。
如申請專利範圍第15項所述之蛋白質接合物，其中該生理活性多肽係選自由下列者所成之群組：胰島素、昇糖素、類昇糖素肽、調酸催素、艾塞那肽-3、艾塞那肽-4、成纖維細胞生長因子21(FGF21)、人類生長激素(hGH)、生長激素釋放激素、生長激素釋放肽、干擾素、干擾素受體、群落刺激因子、G蛋白偶合受體、介白素、介白素受體、酵素、介白素結合蛋白、細胞介素結合蛋白、巨噬細胞活化因子、巨噬細胞肽、B細胞因子、T細胞因子、蛋白A、過敏抑制物、細胞壞死醣蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制因子、轉移誘導因子、α-1-抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、缺脂脂蛋白-E、紅血球生成素、高糖基化紅血球生成素、血管生成素、血紅素、凝血酶、凝血酶受體活化肽、凝血酶調節素、血液因子VII、VIIa、VIII、IX 及XIII、胞漿素原活化因子、血纖維蛋白結合肽、尿激酶、鏈球菌激酶、水蛭素、蛋白C、C-反應蛋白、腎素抑制劑、膠原酶抑制物、超氧化物歧化酶、瘦素、血小板衍生的生長因子、上皮細胞生長因子、表皮細胞生長因子、血管抑制素、成骨生長因子、骨生成促進蛋白、降鈣素、心房肽、軟骨誘導因子、依降鈣素、結締組織活化因子、組織因子途徑抑制物、濾泡刺激激素、促黃體激素、促黃體激素釋放激素、神經生長因子、副甲狀腺素、鬆弛素、胰泌素、體介素、類胰島素生長因子、腎上腺皮質素、昇糖素、膽囊收縮素、胰多肽、胃泌素釋放肽、促皮質素釋放因子、甲狀腺刺激激素、自體毒素、乳鐵素、肌生成抑制素、受體、受體拮抗劑、細胞表面抗原、病毒衍生疫苗抗原、單株抗體、多株抗體、抗體片段、紅血球生成生長因子、白血球形成素、澱粉素、體抑素、肽YY(PYY)、神經肽Y(NPY)、血管收縮素、緩激肽、降鈣素、促皮質素、章魚唾腺精(eledoisin)、胃泌素、瘦素、催產素、血管加壓素、黃體激素、促黃體激素、濾泡刺激素、副甲狀腺素、胰泌素、舍莫瑞林(sermorelin)、人類生長激素(hGH)、生長激素釋放肽、顆粒細胞群落刺激因子(GCSF)、干擾素(IFN)、介白素、泌乳素釋放肽、食慾激素、甲狀腺釋放肽、膽囊收縮素、胃泌素抑制肽、調鈣素、胃泌素釋放肽、腸動素、血管活性腸肽、心房利鈉肽(ANP)、腦利鈉肽(BNP)、C-型利鈉肽(CNPs)、神經激肽A、神經介素、腎素、內皮素、角蝰毒素肽、酪啡肽(carsomorphin peptide)、皮啡肽(dermorphin)、強啡肽、內啡肽、腦啡肽(enkepalin)、T細胞因子、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子受體、脲激酶受體、腫瘤抑制因子、膠原酶抑制物、胸腺生成素、胸腺九肽(thymulin)、胸腺五肽(thymopentin)、胸腺素、胸腺體液因子、腎上腺髓素、咽側體抑制素、類澱粉β-蛋白片段、抗菌肽、抗氧化肽、鈴蟾素、骨鈣化素、CART肽、E-選滯蛋白、ICAM-1、VCAM-1、leucokine、kringle-5、層黏黏蛋白、抑制素、甘丙肽、纖維接合素、胰抑素、福艾，及其等之類似物。
如申請專利範圍第16項所述之蛋白質接合物，其中該生理活性多肽係選自由胰島素、昇糖素、類昇糖素肽、調酸催素、艾塞那肽-3、艾塞那肽-4、成纖維細胞生長因子21(FGF21)、人類生長激素、α-干擾素、顆粒細胞群落刺激因子(GCSF)、紅血球生成素、Fab’抗體片段及其等之類似物所成之群組。
如申請專利範圍第1項所述之蛋白質接合物，其中該生理活性多肽係連結Fc區或其部分各不同的2條多肽鏈。
如申請專利範圍第1項所述之蛋白質接合物，其中該生理活性多肽之兩單元係各自經由非肽聚合物而連結該免疫球蛋白Fc區的單一單元或其部分，且該兩單元的種類彼此不同。
如申請專利範圍第1項所述之蛋白質接合物，其中該不同種類的生理活性多肽係分別經由非肽聚合物而連結該免疫球蛋白Fc區的單一單元或其部分，且該不同種類的生理活性多肽以不同比率存在。
如申請專利範圍第1項所述之蛋白質接合物，其中經由非肽聚合物而共價連結該免疫球蛋白Fc區或其部分的該生理活性多肽，係在不同於與非肽聚合物連結的位點，進一步與另一個生理活性多肽連結。
如申請專利範圍第1項所述之蛋白質接合物，其中該生理活性多肽的3個或更多個單元係各自經由非肽聚合物而連結該免疫球蛋白Fc區的單一單元或其部分，且該3個或更多個單元的種類彼此不同。
一種生理活性多肽的同源多聚體接合物，其中該生理活性多肽的3個或更多個單元係各自經由非肽聚合物而共價連結該具有FcRn-結合親合力的免疫球蛋白Fc區的單一單元或其部分，且其中該3個或更多個單元展現相同的生理活性。
一種製備申請專利範圍第1至22項中任一項所述之生理活性多肽之蛋白質接合物的方法，包括：提供(a)非肽聚合物，其係一個端點連結生理活性多肽，且在另一個端點包括餘留之反應基團，及(b)生理活性多肽接合物，其中1個或多個生理活性多肽分別連結該具有FcRn-結合親合力的免疫球蛋白Fc區單元或其部分，其中該具有FcRn-結合親合力的免疫球蛋白Fc區單元或其部分包括餘留之反應基團；及共價連結於連結(a)之生理活性多肽之該非肽聚合物的餘留之反應基團，及(b)之生理活性多肽接合物之免疫球蛋白Fc區或其部分的餘留之反應基團。
如申請專利範圍第24項所述之方法，其中(a)之非肽聚合物包括選自由醛基、順丁烯二醯亞胺基及琥珀醯亞胺衍生物所成之群組的餘留之反應基團。
如申請專利範圍第24項所述之方法，其中(b)之免疫球蛋白Fc區或其部分中的餘留之反應基團位於選自該免疫球蛋白Fc區或其部分的N端、離胺酸殘基的側鏈及精胺酸殘基的側鏈之一個位置。
如申請專利範圍第24項所述之方法，其中(a)之生理活性多肽及(b)之生理活性多肽為同種或不同種。
如申請專利範圍第24項所述之方法，其中(a)之生理活性多肽及(b)之生理活性多肽係在單一單元內。