JP2012034595A - 微生物数測定装置 - Google Patents

Abstract

【課題】検体中に含まれる微生物数が少ない場合でも、集菌時間を短縮することが可能な微生物数測定装置を提供する。
【解決手段】本発明の細菌数測定装置は、試料液に含まれる微生物を測定する測定室６と、この測定室６に設けられ、試料液が流入する流入口７と、測定室に設けられ、試料液が流出する流出口８と、測定室６の底部に設けられた測定電極１２と、を有する測定セル１と、この測定セル１の測定電極１２に接続した測定部１４および交流電源部１５とを備えている。そして、交流電源部１５が、第１の交流電圧Ｖ１を測定電極１２に印加して微生物をトラップし、次にパルス電圧Ｖ２を測定電極１２に印加して、トラップした微生物を破壊する。その後、第２の交流電圧Ｖ３を測定電極１２に印加して、微生物数を測定する構成とし、第２の交流電圧Ｖ３を、第１の交流電圧Ｖ１よりも小さくした。
【選択図】図１

Description

本発明は、検体中に含まれる微生物数を測定する微生物数測定装置に関するものである。

従来の微生物数測定装置の構成は、以下のような構成となっていた。
すなわち、従来の微生物数測定装置は、測定セルと、この測定セルの前記測定電極に接続した測定部および交流電源部と、を備えている。測定セルは、試料液に含まれる微生物を測定する測定室と、この測定室に設けられ試料液が流入する流入口と、測定室に設けられ前記試料液が流出する流出口と、測定室の底部に設けられた測定電極と、を有している。そして、交流電源部が、第１の交流電圧を前記測定電極に印加して微生物をトラップし、次にパルス電圧を前記測定電極に印加して、トラップした微生物を破壊する。その後、交流電源部は、第２の交流電圧を測定電極に印加して、破壊された微生物からの細胞質流出によるコンダクタンスの上昇を測定し、微生物数を算出する（例えば、特許文献１参照）。

特開平１１−１２７８４６号公報

上記従来例は、検体中に含まれる微生物数を測定することができるという点で、非常に有益なものであった。一方、測定においては、さらなる高感度化、つまり、検体中に含まれる微生物数が少ない場合でも正確に微生物数を測定したいという要望が高まってきた。
この要望に応えるためには、測定時間が長くなるという課題があった。
すなわち、従来の微生物の測定においては、微生物を破壊して、この破壊された微生物の細胞質の流出によるコンダクタンスの上昇を測定し、微生物数を算出するが、この時、コンダクタンスの上昇を伴うブランク応答も発生してしまう。

このブランク応答の影響を避けて、適切に測定を実施するためには、さらに多くの細菌を集め、細菌破壊によるコンダクタンスの上昇を大きくして測定する必要があるが、検体中に含まれる微生物数が少ないために、この収集に多大な時間がかかってしまう。この結果、従来の微生物数測定装置では、全体の測定時間が長くなってしまうという問題があった。

そこで本発明は、検体に含まれる微生物数が少ない場合でも、測定時間を短縮することが可能な微生物数測定装置を提供することを目的とするものである。

この目的を達成するために本発明は、測定セルと、測定部および交流電源部と、を備えている。測定セルは、試料液に含まれる微生物を測定する測定室と、この測定室に設けられた測定電極と、を有する。測定部および交流電源部は、この測定セルの測定電極に接続されている。交流電源部が、測定電極に対して第１の交流電圧を印加して微生物をトラップし、次に測定電極に対してパルス電圧を印加してトラップした微生物を破壊し、その後、測定電極に対して第１の交流電圧よりも小さい第２の交流電圧を印加して、測定部において微生物数を測定する。

本発明によれば、検体中に含まれる微生物数が少ない場合でも、集菌時間を短縮することができる。
すなわち、本発明においては、コンダクタンスの計測を行うための第２の交流電圧を、第１の交流電圧よりも小さくしているため、ブランク応答によるコンダクタンスの上昇を小さくすることができ、ブランク応答の影響を抑制することができる。

したがって、微生物の破壊によるコンダクタンスの上昇が小さくても測定が可能となり、検体中の微生物の数が少なくても測定できるようになる。
その結果として、検体中に含まれる微生物を集めるための時間を短縮することができるので、全体の測定時間を短縮することができる。

本発明の一実施形態の全体を示すブロック図。 その測定電極部の拡大斜視図。 その動作時の要部拡大断面図。 （ａ）（ｂ）（ｃ）は、その動作時の要部拡大図。 その動作時の電圧波形を示す図。 その動作時のブランク応答を示す図。 その動作時のブランク応答と、測定値を示す図。 その動作時の要部拡大図。

以下、本発明の一実施形態に係る細菌数測定装置（微生物数測定装置）について、添付図面を用いて説明する。
図１は、微生物、例えば、細菌の数を測定するための細菌数測定装置を示している。図１中の１は、細菌数を測定する測定セルである。
測定セル１は、長方形状の基板２の上部に、中央に長方形状の貫通孔３を有する薄板状のスペーサ４を積層し、このスペーサ４の上部に、長方形状の蓋体５を積層したものである。これにより、測定セル１の内部には、天地方向（上下方向）に薄い、長方体形状の測定室６が形成されている。

また、測定室６の天井部の一端側には、細菌を含んだ試料液を流入させるための流入口７が設けられ、測定室６の天井部の他端側には、試料液が流出する流出口８が設けられている。これらの流入口７、流出口８は、それぞれ蓋体５の上部に突き出した構成となっている。
さらに、流入口７には、試料液を収納した検体リザーバ９が、送水チューブ１０を介して接続されている。一方、流出口８には、ポンプ１１および送水チューブ１０を介して検体リザーバ９が接続されている。これにより、測定室６の試料液が、検体リザーバ９に戻るための帰還路が形成される。

ここで、ポンプ１１を動作させると、検体リザーバ９に収納された試料液は、送水チューブ１０を通って蓋体５の上部の流入口７から測定室６に流入する。そして、試料液は、測定室６内において、図１中の左手から右手方向へと流れていき、その後、測定室６から流出口８を通って流れ出した後、ポンプ１１を介して検体リザーバ９へと帰還する。
なお、測定室６の底部、つまり基板２の上面には、測定液中の細菌数を計測するための測定電極１２が設けられている。測定電極１２において、測定液中の細菌を集菌し、細菌を破壊し、試料液中の細菌の数を測定する。

また、測定電極１２は、基板２の基材として用いたＰＥＴ上に銀を蒸着させ、例えば、レーザーによって加工形成している。なお、この測定電極１２は、図２に示すように、櫛歯状の電極１２ａ，１２ｂによって構成されている。これら櫛歯状の電極１２ａ，１２ｂは、長い経路に渡って、両者が極めて接近した対向状態となっており、ここに交流電圧を印加することで、両者間に電界を発生させ、誘電泳動現象によって電極１２ａ，１２ｂが対向するギャップ部分に測定液中の細菌をトラップし、集菌することができる。

また、櫛歯状の電極１２ａ，１２ｂは、図１に示すように、測定電極１２からそれぞれ引き出されて、基板２の端部に設けられた接続部１３に接続されている。櫛歯状の電極１２ａ，１２ｂは、この接続部１３を介して、測定部１４および交流電源部１５に接続されている。
そして、交流電源部１５が測定セル１の測定電極１２に交流電圧を印加し、この測定電極１２のコンダクタンスを測定部１４において測定する。次に、その測定データが制御演算部１６に送られ、この制御演算部１６で細菌数を演算算出する。最後に、その算出結果は、表示部１７に表示される。

なお、これらの測定の指示を行う操作部１８が、制御演算部１６に接続されている。そして、この制御演算部１６には交流電源部１５が接続されている。
図３は、測定室６において、測定液が流れる様子を表した図である。
本実施形態においては、図１のスペーサ４の厚さを、例えば、２５０μｍとしているため、測定室６の高さは、２５０μｍとなっている。この天地方向（上下方向）に狭い測定室６の中を、図１の流入口７から流出口８方向に向けて、上流側（図３の左手側）から下流側（図３の右手側）に向かって、測定液が流れていく。

なお、測定室６の底部には、測定電極１２が設けられている。これにより、測定液中の細菌が測定電極１２が形成した電界によって生じる誘電泳動力によって測定電極にトラップされる領域、つまりトラップ領域１９において、ここを通過する細菌がトラップされて集菌される。
ここで、本実施形態における集菌から測定までの動作を、図１、図４および図５を用いて説明する。

まず、図４（ａ）〜図４（ｃ）は、測定電極１２に集菌される細菌の様子を説明するための図である。図４（ａ）は、測定電極１２に細菌をトラップした時の様子を表し、図４（ｂ）は、このトラップした細菌を破壊する時の様子を表し、図４（ｃ）は、図１の測定部１４が細菌数を測定している時の様子を表している。
また、図５は、測定電極１２に印加する電圧の状態を示している。図５中のＰ１は集菌期間を示し、Ｐ２は細菌の破壊期間を示し、Ｐ３はコンダクタンスの測定期間を示している。

本実施形態では、例えば、１ミリリットル中に１００個の大腸菌が含まれる試験液の測定を例として挙げて説明する。
まず、集菌期間Ｐ１においては、図１のポンプ１１を起動し、検体リザーバ９に収納された測定液を、流入口７を介して測定室６に流入させる。すると、図３に示すように、測定室６の底部に設けられた測定電極１２上を測定液が流動する。

このとき、図１の制御演算部１６の指示を受けた交流電源部１５が、図５に示すように、集菌用の第１の交流電圧Ｖ１を、測定電極１２に対して印加する。すると、測定電極１２には、第１の交流電圧Ｖ１の印加によって発生した電界により、図３に示すように、トラップ領域１９が形成され、このトラップ領域１９を通過する測定液の細菌が誘電泳動力により測定電極１２にトラップされて集菌される。

このように測定液中に含まれる細菌の数が１ミリリットル中に１００個と非常に少ない場合には、従来は数時間もの長い集菌時間が必要であった。
本実施形態の細菌数測定装置では、集菌用の第１の交流電圧Ｖ１は、その電圧が大きいほど電界が大きくなり、トラップ領域１９の高さが高くなる。このため、細菌を効率よくトラップでき、その結果として、集菌時間を従来よりも短縮することができる。

本実施形態においては、図５に示すように、集菌用の第１の交流電圧Ｖ１を、例えば、７Ｖｐｐ、１００ｋＨｚの大きさで、測定電極１２に印加している。
すると、図４（ａ）に示すように、測定電極１２上に細菌が集菌された状態となる。この時、図５の下部分に示すように、集菌期間Ｐ１では、測定電極１２上に集まる細菌によってコンダクタンスが徐々に上昇していき、集菌期間Ｐ１の終わりには、集菌コンダクタンスＧＴ０となる。しかしながら、ＧＴ０に至るまでのコンダクタンス変化から測定液中に含まれる細菌数を測定することは困難である。その理由は、測定液中に含まれる細菌の数が非常に少ないために、ＧＴ０に至るまでの変化もごく僅かであり、測定液の温度変化等に起因するコンダクタンス変化が支配的となって、細菌によるコンダクタンス変化のみを測定することが非常に困難なためである。

次に、細菌の破壊期間Ｐ２で、測定電極１２上に集菌した細菌を破壊する。この時には、細菌破壊用のパルス電圧Ｖ２を、例えば、２０Ｖｐｐ、１００ｋＨｚの大きさで、交流電源部１５が、１０ｍｓ間、測定電極１２へと印加する。すると、測定電極１２では、エネルギーの大きなパルス電圧が印加されたことにより、図４（ｂ）に示すように、細菌の外側を覆った細胞膜が破壊され、細胞膜に多くの小孔が空き、図４（ｃ）に示すように、細菌の中身の細胞質が、この小孔を通じて外部へと溶出していく。

この溶出した細菌の細胞質は、そのほとんどが高導電率の細胞質であるため、測定電極１２の近傍では一時的に電解質濃度が上昇する。このことは同時に、測定電極１２で測定されるコンダクタンスの上昇を意味する。
最後に、コンダクタンスの測定期間Ｐ３においては、交流電源部１５が細菌破壊用のパルス電圧Ｖ２の印加を止め、測定用の第２の交流電圧Ｖ３を、例えば、２．５Ｖｐｐ、１００ｋＨｚの大きさで、３秒間、測定電極１２へと印加する。すると、細菌の中身の細胞質が溶出したために、測定期間Ｐ３の開始時に、測定電極１２の近傍では急激に電解質濃度が上昇している。つまり、測定電極１２の近傍のコンダクタンスが上昇した状態となっている。

そして、このコンダクタンスを、図１の測定部１４が測定電極１２を用いて測定し、コンダクタンス上昇分ＧＴＰとして制御演算部１６へと送る。
制御演算部１６では、この送られてきたコンダクタンス上昇分ＧＴＰを元に、予め作成しておいた、コンダクタンス上昇分ＧＴＰと細菌数との関連テーブル（図示せず）を参照して、試料液中の細菌数を算出し、表示部１７がその結果を表示する。
本実施形態では、表示部１７に、例えば、１×１０の２乗（ｃｆｕ／ｍｌ）と表示される。

本実施形態における主な特徴点は、測定用の第２の交流電圧Ｖ３を、集菌用の第１の交流電圧Ｖ１よりも小さくしたことである。
その目的は、コンダクタンスの測定時において、外乱としてのブランク応答の影響を抑制するためである。

まず、このブランク応答について、以下で説明する。
図６は、このブランク応答の影響を説明するための図である。ここでは、試料液として純水を用い、測定電極１２に対して、集菌用の第１の交流電圧Ｖ１、細菌破壊用のパルス電圧Ｖ２、コンダクタンス測定用の第２の交流電圧Ｖ３を順次印加し、得られたコンダクタンス上昇値ＧＴＰを縦軸に示している。

また、図６において、横軸は、測定用の第２の交流電圧Ｖ３を、５Ｖｐｐ、および２．５Ｖｐｐの２種類の電圧で測定したことを表している。これらの測定は、それぞれ７回行い、平均値をブランク値Ｂ１，Ｂ２として棒グラフで表し、それぞれのバラツキ値Ｅ１，Ｅ２を細線を用いて表している。
ここで、試料液として純水を用いると、純水は通電しないため、本来、ブランク値Ｂ１，Ｂ２は、０となるはすである。しかしながら、現実には、ブランク応答として、ブランク値Ｂ１，Ｂ２および、バラツキ値Ｅ１，Ｅ２の反応が出てきてしまっている。

この理由は、まだ解明されていないのであるが、測定電極１２の近傍において、おそらく以下のことが起こっているのではないかと考えられている。
つまり、細菌を破壊するときには、測定電極１２に細菌破壊用のパルス電圧Ｖ２を印加するのであるが、このパルス電圧は、集菌用の第一１の交流電圧Ｖ１や、測定用の第２の交流電圧Ｖ３の正弦波交流電圧に比べて振幅が大きく、かつ矩形波であることから、正弦波に比べて非常に大きなエネルギーを持っている。そして、この大きなエネルギーによって、測定電極１２を構成する櫛歯状の電極１２ａ，１２ｂには、トラップした細菌を破壊してしまうほどの強い電界が形成される。

この時、図８に示すように、櫛歯状の電極１２ａ，１２ｂのエッジ部分には、強い電界が集中して、このエッジの部分から、櫛歯状の電極１２ａ，１２ｂの金属イオンが、次々と純水中に溶出し、この金属イオンを介してコンダクタンスがブランク応答として現れるのではないかと考えられる。
その後、この状態で、コンダクタンス測定用の交流電圧Ｖ３を印加すると、この溶出した金属イオンを介して、純水中を電流が流れ、櫛歯状の電極１２ａ，１２ｂ近傍付近において局部的な純水の温度上昇を招くこととなる。

そして、この温度上昇によって、さらに純水のコンダクタンスが上昇してしまい、図６に示すように、コンダクタンスが測定されているのではないかと推測される。
本実施形態における細菌数の測定は、細菌の破壊によるコンダクタンスの上昇を測定し、その値によって細菌の数を算出していくものであるため、細菌のコンダクタンス以外の要因でコンダクタンスが上昇することは非常に好ましくない状態である。つまり、図６のブランク応答は、測定の際に排除されることが好ましい。

なお、図６に示すように、コンダクタンス測定用の交流電圧Ｖ３を、５Ｖｐｐと大きくすると、コンダクタンスの上昇を示すブランク値Ｂ１は大きくなり、バラツキ値Ｅ１も大きくなっている。
逆に、交流電圧Ｖ３を、２．５Ｖｐｐと小さくすると、ブランク値Ｂ２は小さくなり、バラツキ値Ｅ２も小さくなっている。

つまり、交流電圧Ｖ３の大きさに従って、金属イオンを介して流れる電流が変化し、ブランク値Ｂ１，Ｂ２、およびバラツキ値Ｅ１，Ｅ２が変化することが分かる。
そこで、本実施形態においては、測定用の交流電圧Ｖ３を、集菌用の第１の交流電圧Ｖ１よりも小さくし、ブランク応答の影響を抑制している。
また、図７は、このブランク応答の影響を説明する図であり、図６のブランク応答に加えて、大腸菌を実測した値を追加したものである。

大腸菌の実測例においては、ブランク測定した前記２例（５Ｖｐｐ、および２．５Ｖｐｐ）と同じ集菌用の第１の交流電圧Ｖ１、および細菌破壊用のパルス電圧Ｖ２を用いた。そして、コンダクタンス測定用の交流電圧Ｖ３を２．５Ｖｐｐで測定し、３回の測定の平均値を測定値Ｒ１として棒グラフで表し、バラツキ値Ｅ３を細線で表している。
この図７においては、５Ｖｐｐでのブランク応答のバラツキ値Ｅ１を示す細線は、大腸菌のバラツキ値Ｅ３と、その半分が重なっている。

つまり、この場合、大腸菌の実測は、ブランク応答と区別がつかないこととなり、適切に測定を実施するためには、さらに多くの細菌を集め、コンダクタンスの上昇を大きくして測定する必要がある。
つまり、５Ｖｐｐの測定においては、集菌にさらに時間をかける必要があることが分かる。

一方、２．５Ｖｐｐでのブランク測定のバラツキ値Ｅ２の細線は、５Ｖｐｐでのブランク応答のばらつきを示す細線と比較して、その大きさは抑制されている。その結果として、大腸菌の実測のバラツキ値Ｅ３を示す細線と重なる所はなく、つまり、この場合の大腸菌の実測は、適切な測定が実施されたことを示している。
したがって、本実施形態においては、コンダクタンスの計測に用いる第２の交流電圧を、トラップ時の第１の交流電圧よりも小さくしているので、上述した金属イオンに流れる電流を小さくすることができる。この結果、試料液の温度上昇を抑制し、ブランク応答の影響を抑制して高精度な細菌数の測定を行うことができる。

これにより、ブランク応答の影響を抑制できたので、細菌の破壊によるコンダクタンスの上昇が小さくても測定が可能となり、集める微細菌の数が少なくても精度よく細菌数の測定を実施することができる。
その結果、試料液中に含まれる細菌数が少ない場合でも、測定電極１２上に細菌を集めるための時間を短縮することができるので、全体の測定時間を短縮することができる。

以上のように本発明は、検体中に含まれる微生物数が少ない場合でも集菌時間を短縮することができるという効果を奏することから、微生物数測定装置として、広く活用が期待されるものである。

１ 測定セル
２ 基板
３ 貫通孔
４ スペーサ
５ 蓋体
６ 測定室
７ 流入口
８ 流出口
９ 検体リザーバ
１０ 送水チューブ
１１ ポンプ
１２ 測定電極
１２ａ，１２ｂ 櫛歯状の電極
１３ 接続部
１４ 測定部
１５ 交流電源部
１６ 制御演算部
１７ 表示部
１８ 操作部
１９ トラップ領域
Ｖ１ 第１の交流電圧
Ｖ２ パルス電圧
Ｖ３ 交流電圧
Ｐ１ 集菌期間
Ｐ２ 破壊期間
Ｐ３ 測定期間
ＧＴＰ コンダクタンス上昇分
Ｂ１，Ｂ２ ブランク値
Ｅ１，Ｅ２ バラツキ値

Claims (3)

1. 試料液に含まれる微生物を測定する測定室と、この測定室に設けられた測定電極と、を有する測定セルと、
   この測定セルの前記測定電極に接続された測定部および交流電源部と、
   を備え、
   前記交流電源部が、前記測定電極に対して第１の交流電圧を印加して微生物をトラップし、次に前記測定電極に対してパルス電圧を印加してトラップした微生物を破壊し、その後、前記測定電極に対して前記第１の交流電圧よりも小さい第２の交流電圧を印加して、前記測定部において微生物数を測定する、
   微生物数測定装置。
2. 前記測定セルは、前記測定室に前記試料液を流入させる流入口と、前記測定室から前記試料液を流出させる流出口と、を有している、
   請求項１に記載の微生物数測定装置。
3. 前記流入口には、前記試料液を収納する検体リザーバを接続するとともに、前記流出口には、前記検体リザーバへの帰還路が設けられている、
   請求項２に記載の微生物数測定装置。
   

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