JP2001204458A - 微生物キャリア体、微生物数測定装置及び微生物数測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 低誘電率の微生物であっても、誘電泳動によ
って簡易で高感度な測定を行う微生物キャリア体の提供
することを目的とする。 【解決手段】 本発明の微生物キャリア体は、測定対象
の微生物が有す誘電率より高誘電率の材質で構成され、
表面に前記微生物と特異的に結合できる結合基が設けら
れた微生物キャリア体であって、誘電泳動力が作用する
と前記結合基に結合した微生物が一体となって泳動され
ることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、結合基が設けら
れ、誘電泳動力が作用するとこの結合基に結合した微生
物を一体にして集めることができる微生物キャリア体、
及びこの微生物キャリア体を用いて溶液中の微生物数を
測定する微生物数測定装置、及び微生物数測定方法に関
するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、溶液中の微生物数を測定する方法
として特開平５７−５０６５２号公報に記載されたもの
等の多数の技術が知られている。しかし、従来の技術に
よる微生物数の測定方法は、試料液に専用の薬剤、例え
ば酵素や色素を投入して生化学反応を起こさせ、その反
応経過または結果を蛍光や発光によって測定するもので
あり、測定感度は比較的高いが微生物分野及び生化学分
野に関する専門知識が必要であったり、また専用で高価
な大型の測定装置が必要となり、さらには専任者による
作業が必要となる等、とても一般的かつ簡易に微生物数
を測定することができるものではなかった。

【０００３】そこで、特開平５９−９１９００号公報に
記載されたものをはじめとする、物理的手段のみを使
い、薬剤を一切用いないで、小型で、試料系に組み込ん
での自動測定が可能な、簡易な微生物数検出装置が提案
されたが、微生物数が１０の８乗ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（１
ｍｌ中に微生物数が１億個）以上にならないと検出でき
ないためその応用範囲に著しい制限が加えられていた。
このように、従来の技術による微生物数測定装置で測定
感度を上げるためには、何らかの薬剤の使用や、専用の
測定装置，専門知識を持った専任者による操作が必要で
あった。また薬剤を使用しない簡易型の装置では、専任
者を必要とせず測定が可能になるが、微生物数が非常に
多くないと測定が難しく、低感度の測定器しか得られな
いし、微生物を移動させて局部的に濃度を上げて感度を
向上させたくても簡易でメンテナンスフリーな手段がな
いという問題があった。

【０００４】本発明者らは、このため特開平１１−１２
７８４６号公報において、測定試料中の微生物に誘電泳
動力を作用させ、電界が集中した個所に微生物を集めて
濃度測定するという新しい測定方法を提案した。この測
定方法によれば、薬剤や特別な装置などは必要でなく、
簡易で高感度な測定ができ、メンテナンスフリーの微生
物測定が可能になった。

【０００５】しかし、微生物を測定する環境は、微生物
が生息していくためのミネラル分や有機物等を含有して
いることが多く、これらは微生物が生息している液中の
導電率を押し上げ、この液を測定試料として微生物数を
測定しようとすると導電率が高くて誘電泳動によって微
生物濃度を上げられないという問題があった。さらに、
微生物には低誘電率のものが多く、これらは溶液の導電
率が低くても本来的に誘電泳動力が弱く、同様に濃度を
上げられないという問題があった。このうち測定試料の
導電率が高い場合は、導電率を下げるために透析や希釈
等を行うことで誘電泳動が可能になるが、微生物自体が
低誘電率の場合には誘電泳動力を大きくする手段がな
く、微生物を移動させて濃度を上げることができないた
め、誘電泳動による微生物数の測定を困難ならしめてい
た。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】そこでこれらの問題を
解決するため、本発明は、低誘電率の微生物であって
も、誘電泳動によって簡易で高感度な測定ができる微生
物数キャリア体を提供することを目的とする。

【０００７】また、本発明は薬剤や特別な装置を必要と
することなく、低誘電率の微生物であっても、簡易で高
感度な測定ができ、自動測定が可能でメンテナンスフリ
ーの微生物数測定装置を提供することを目的とする。

【０００８】さらに、本発明は、低誘電率の微生物であ
っても、簡易で高感度な測定ができ、自動測定が可能で
メンテナンスフリーの微生物数測定方法を提供すること
を目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに本発明の微生物キャリア体は、測定対象の微生物が
有す誘電率より高誘電率の材質で構成され、表面に前記
微生物と特異的に結合できる結合基が設けられた微生物
キャリア体であって、誘電泳動力が作用すると前記結合
基に結合した微生物が一体となって泳動されることを特
徴とする。

【００１０】これにより、薬剤や特別な装置を必要とす
ることなく、低誘電率の微生物であっても、誘電泳動に
よって簡易で高感度な測定ができる。

【００１１】

【発明の実施の形態】請求項１に記載された発明は、測
定対象の微生物が有す誘電率より高誘電率の材質で構成
され、表面に前記微生物と特異的に結合できる結合基が
設けられた微生物キャリア体であって、誘電泳動力が作
用すると前記結合基に結合した微生物が一体となって泳
動されることを特徴とする微生物キャリア体であるか
ら、誘電泳動力の作用を受けにくい低誘電率の微生物で
あっても、微生物キャリア体でみかけの誘電率を上げ、
これを微生物キャリア体とともに誘電泳動力によって電
界集中部に集めることができる。

【００１２】請求項２に記載された発明は、微生物キャ
リア体が微生物の代表寸法と同程度もしくは数倍程度ま
での代表寸法を有すとともに、前記微生物の表面導電率
より低い表面導電率を有することを特徴とする請求項１
記載の微生物キャリア体であるから、誘電泳動力を受け
にくい低誘電率の微生物であっても、微生物キャリア体
とともに誘電泳動力により電界集中部に集めることがで
きるし、１つの微生物キャリア体には１個から数個の微
生物が微生物濃度に比例して結合するため、微生物濃度
が高ければ両者の結合体の表面導電率が変化し、微生物
数を表面導電率で測定できる。

【００１３】請求項３に記載された発明は、前記結合基
が微生物の官能基に特異的に化学結合することができ、
微生物キャリア体表面に修飾されている化合物であるこ
とを特徴とする請求項１記載の微生物キャリア体である
から、誘電泳動力の作用を受けにくい低誘電率の微生物
であっても、微生物キャリア体とともに誘電泳動力によ
り安定して電界集中部に集めることができる。

【００１４】請求項４に記載された発明は、前記化合物
が微生物のタンパク質に含まれるアミノ酸残基に特異的
に結合する化合物であることを特徴とする請求項１〜３
のいずれかに記載の微生物キャリア体であるから、誘電
泳動力の作用を受けにくい低誘電率の微生物であって
も、アミノ酸残基により生死いずれの微生物に対しても
特異的に結合し、微生物キャリア体とともに誘電泳動力
により安定して電界集中部に集めることができる。

【００１５】請求項５に記載された発明は、前記結合基
が抗原である微生物のエピトープに対して特異的に結合
するパラトープを有する抗体であり、微生物キャリア体
表面に修飾されていることを特徴とする請求項１または
２記載の微生物キャリア体であるから、誘電泳動力の作
用を受けにくい低誘電率の微生物であっても、抗原抗体
反応で速やかに微生物キャリア体に特異的に結合させ、
特定の微生物を微生物キャリア体とともに誘電泳動力に
より電界集中部に集めることができる。

【００１６】請求項６に記載された発明は、内部に複数
の電極を備え、かつ微生物含有の液体を導入するととも
に、請求項１〜５のいずれかに記載の微生物キャリア体
を導入することができるセルと、前記セル内に誘電泳動
力を発生させるための交流電圧を前記電極のうちの何れ
かの電極間に印加する電源回路と、前記電極のうちの何
れかの電極により電界を測定するための電極間の抵抗特
性を測定する測定部と、前記電源回路と前記測定部とを
制御するための制御手段と、前記測定部の測定結果を演
算して微生物数を算出する演算手段とを備えたことを特
徴とする微生物数測定装置であるから、微生物数の少な
い試料においても微生物を電極付近に集中させた後に、
電極間抵抗特性によって微生物数を測定することができ
るため、薬剤や特別な装置を必要とすることなく、簡易
で高感度な測定ができる。

【００１７】請求項７に記載された発明は、前記測定部
が電極間の電流と位相差を測定するとともに、前記電極
間の印加電圧を測定して抵抗を算出することを特徴とす
る請求項６記載の微生物数測定装置であるから、微生物
数の少ない試料においても微生物を電極付近に集中させ
た後に、測定部により電極間の電流と位相差と、電圧を
測定することによって微生物数を測定することができる
ため、簡易で高感度な測定ができる。

【００１８】請求項８に記載された発明は、複数の電極
を備えたセル内に微生物含有の液体と請求項１〜５記載
の微生物キャリア体を導入し、前記複数の電極のうち何
れかの電極間に交流電圧を印加して前記セル内に誘電泳
動力を発生させ、電界集中部に前記微生物キャリア体と
結合した微生物を集めて、前記電極間の抵抗特性の変化
を測定して微生物数を算出することを特徴とする微生物
数測定方法であるから、微生物数の少ない試料において
も微生物を電極付近に集中させた後に電気的な手段によ
って微生物数を測定することができるため、薬剤や特別
な装置を必要とすることなく、簡易で高感度な測定がで
きる。

【００１９】以下、本発明の実施の形態について、図１
〜図７、（数１）〜（数５）を用いて説明する。

【００２０】（実施の形態）本発明の一実施の形態であ
る微生物数測定装置について図面を参照しながら詳細に
説明する。図１は本発明の実施の形態における微生物数
測定装置の全体構成図、図２は本発明の実施の形態にお
ける電極の説明図、図３は本発明の実施の形態における
電極の断面と電極間の電界の状態を説明するための図、
図４は微生物数と測定時間と電極間の抵抗Ｒの関係を説
明するためのグラフ、図５（ａ）は電極間の静電容量の
計算方法を説明するための図、図５（ｂ）は電流と電圧
の間の位相差を示す図、図６は電極間の静電容量の計算
方法を説明するためのもう一つの図、図７は微生物キャ
リア体の分子構造を表す模式図である。

【００２１】図１において、１はセル、２は基板上の電
極、３は泳動電源回路、４は測定部、５は演算部、６は
制御手段、７は試料系配管、８は電磁弁、９は表示手段
である。また、図２において、１０は電極２の基板、１
１は薄膜電極、１２は薄膜電極１１に挟まれた微小なギ
ャップである。また、図３において１３は薄膜電極１１
間に印加される電圧によって生じる電気力線である。図
５（ａ）において１４は薄膜電極１１の一方の極、１５
は薄膜電極１１の他方の極、１６は微生物や微生物キャ
リア体を電気力線１３中に置いたとき、想定されるＣＲ
並列等価回路を構成する静電容量、図５（ｂ）において
１７は同じくキャリア体を電気力線１３中に置いたとき
ＣＲ等価回路を構成する抵抗である。１８は時間軸、１
９は電圧と電流の大きさを表す軸、２０は電流の変化を
表す曲線、２１は電圧の変化を表す曲線である。また、
図７において２２は測定対象の微生物が有している誘電
率より高誘電率の材質で構成されるキャリア体のコアで
あって、本実施の形態においてはチタン酸バリウムの粒
子、２３はこのコア２２をコーティングしているポリス
チレン等のポリマー、２４はポリマー２３もしくはコア
２２表面に修飾され、微生物と特異的に結合するための
化合物や抗体等の結合基である。コア２２とポリマー２
３と結合基２４は全体として微生物キャリア体（以下、
キャリア体と記す）を構成する。なお、後述するように
コア２２自体をポリマー粒子で高誘電率の微細粒子を分
散させたもの（コーティングするポリマー２３がないも
の）とするのも適当である。また、このキャリア体は、
測定対象である微生物までの代表寸法と同程度もしくは
数倍程度までの代表寸法をもたせるのがよい。この結合
基２４としては化合物によって化学結合する基が代表的
で、中でもタンパク質に含まれるアミノ酸残基と結合す
るカルボキシル基等が有力であるが、このほかにも微生
物のエピトープに対して特異的に結合する抗体であるパ
ラトープも適当である。アミノ酸残基の場合、生死いず
れの微生物に対しても安定して特異的に結合し、キャリ
ア体と一体に誘電泳動力により電界集中部に集めること
ができるし、抗原抗体反応による場合、特定の微生物を
速やかにキャリア体に結合させ、キャリア体とともに電
界集中部に集めることができる。

【００２２】ここで微生物の誘電泳動現象について説明
する。高周波の交流電圧の印加によって発生する交流電
界の作用で、セル１内の微生物はその誘電的な性質によ
って最も電場が強くかつ不均一な部分、すなわち電界集
中部に泳動される。一方、微生物に作用する誘電泳動力
の大きさは、一般的に微生物の誘電率と微生物周辺溶液
の誘電率との差が大きいほど大きくなるにような関係が
ある。したがって、微生物周辺溶液の誘電率が微生物の
誘電率より小さいことを考慮すると、誘電率の大きい微
生物ほど作用する誘電泳動力は大きくなる。上述した通
り、本発明では溶液の導電率が比較的高くなったときで
も、キャリア体により誘電率を高くした結合体を泳動さ
せることができる。本実施の形態では電極２のギャップ
１２付近の構成が電界集中部にあたり、中でも最も電界
が集中するのはギャップ１２である。従ってギャップ１
２部分にもっとも強く微生物が泳動される。図２に示す
ギャップ１２は平行な電極に挟まれた部分であり、電極
の伸びる方向すなわち、電極２の断面を描いた図３の紙
面に垂直な方向については電界の分布は均一である。し
かしながら、基板面に垂直な方向では図３に示すような
電界の分布が生じ、電極のエッジ同志を結んだ長さ方向
の面がもっとも電界が集中することになる。ギャップ１
２付近に浮遊する微生物は電極２間に生じるこのような
電界作用によってギャップ１２に引き寄せられ、電気力
線に沿って整列する。この時、ギャップ１２付近の微生
物の移動状態は、試料液体中に存在する微生物数とギャ
ップ１２の間隔に依存するが、十分に微生物数が多い時
にはギャップ１２が微生物から構成される鎖によって架
橋されるほどになる。この際、当初からギャップ１２付
近に浮遊していた微生物は直ちにギャップ１２部分へ移
動するし、ギャップ１２から離れたところに浮遊してい
た微生物は距離に応じて所定時間経過後にギャップ１２
部に至るため、一定時間後にギャップ１２付近の所定領
域に集まっている微生物の数はセル１内の微生物数に比
例する。これは当然のことながら測定試料の液に存在す
る微生物数に比例するものである。

【００２３】このように、測定対象微生物の誘電率が十
分大きい場合には、誘電泳動力により測定電極位置まで
微生物を速やかに移動させることができるが、微生物の
誘電率が小さい、もしくは周辺溶液の誘電率が大きい場
合には微生物の誘電率と周辺溶液の誘電率との差が小さ
くなることで誘電泳動力も小さくなり、微生物に対する
十分な作用力が得られない。そこで本発明では、微生物
を高誘電率であるキャリア体に複数個結合することによ
り高誘電率の結合体とすることで、十分な作用力を受け
ることができるようになる。これにより、微生物をキャ
リア体との結合体として測定電極位置まで速やかに移動
させることができるし、比較的導電率の高い溶液中の微
生物まで濃度測定が可能になる。

【００２４】本実施の形態においては、図７に示すよう
に、キャリア体はコア２２、ポリマー２３、結合基２４
の３つの要素を備えている。コア２２はチタン酸バリウ
ム粒子が適当で、高誘電率の電気的特性を有する。ま
た、微生物数の算出方法の詳細については後述するが、
電極の電気特性の変化により微生物数を算出することか
ら、感度を上げるためキャリア体と一体となって電界集
中部に集められる微生物によって電極間の抵抗特性の変
化を大きくする必要があり、コーティングするポリマー
２３は、微生物よりも導電率の低いポリスチレン等にす
るのが適当である。そして、キャリア体と微生物が一体
となった状態で高誘電率であることは当然必要である
が、結合する微生物の個数で表面導電率が変化する必要
があるため、キャリア体の大きさは微生物と同程度もし
くは数倍程度までの代表寸法であることが望ましい。ま
た、本実施の形態ではチタン酸バリウム粒子にポリマー
コーティングしたものをキャリア体としているが、チタ
ン酸バリウムの微細粒子を分散させたポリスチレン粒子
をコア２２とし、コーティングしない実施の形態も、電
気的特性は異なるものの、本来の目的である高誘電率、
低表面導電率を満たすため、キャリア体のコア２２とし
て用いることができる。

【００２５】本実施の形態の結合基２４は、コア２２も
しくはポリマー２３の表面に修飾されているカルボキシ
ル基であり、微生物のタンパク質のアミノ酸残基として
末端に存在するアミノ基と能動的に結合する。このほか
微生物の官能基に特異的に化学結合するのであれば、他
の化合物からなる結合基２４でもかまわない。このよう
に結合基２４がキャリア体表面に多数修飾されているか
ら、結果的に一つのキャリア体と複数個の微生物とで一
つの結合体を形成することになる。生きた微生物も死ん
だ微生物も双方タンパク質から構成されているから、微
生物の生死に係わらず全微生物数を測定できるものであ
る。

【００２６】さらに、結合基２４として抗原抗体反応を
利用したものを用いてもキャリア体と微生物との結合は
可能である。一般的に抗原と抗体の結合はいわゆる鍵と
鍵穴の関係とみることができる。抗原となる微生物のタ
ンパク質は炭素、酸素、水素、窒素、硫黄等からなるア
ミノ酸が多数結合した巨大な高分子であり、アミノ酸の
配列の仕方によって特徴的な三次元的な高次構造をな
す。この高次構造がタンパク質の機能と密接に関係して
おり、機能が異なるタンパク質では必ず一部の構造が互
いに異なっており、エピトープと呼ばれる抗原決定基の
一つとなっている。このような多種多様なタンパク質の
中で、ほとんどの微生物がもつタンパク質もあれば特定
の微生物しか持たないタンパク質もある。一方、抗体
は、抗原の特定タンパク質の特徴的な高次構造とうまく
嵌合するような構造となっており、先に説明したエピト
ープと特異的に結合するパラトープと呼ばれる抗原結合
部位を有している。したがって、官能基の結合位置がわ
ずかに異なるだけの非常に類似したタンパク質が同時に
存在していても、特定のエピトープと結合するパラトー
プを有す抗体が修飾されているのであれば高い特異性を
もって特定タンパク質だけと結合を生じる。すなわち、
抗体を結合基２４としてキャリア体表面に修飾しておけ
ば抗原である微生物との特異的な結合体を速やかに得る
ことができるし、それがある特定の微生物とのみ選択的
結合をする抗体であれば特定微生物とキャリア体との結
合体を得ることができる。これによって特定微生物数を
測定することが可能となる。

【００２７】更に抗原抗体反応の発展的手法の一例とし
て、ＥＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）などの免疫学
的測定や組織染色の分野で広く利用されているビオチン
−アビジン複合体の極めて高い特異的結合性を利用する
こともできる。ビオチンはそれ自身に化学修飾を施すこ
とによりタンパク質の各種の官能基に結合させることが
可能であるため、事前に抗原である微生物にビオチンを
修飾しておくことができ、かつアビジンが結合基２４と
して表面に修飾してあるキャリア体を用いることで、結
果として二段階の結合過程を経て微生物とキャリア体と
の結合体を得ることができるものである。

【００２８】ここで、本発明において検出対象としてい
る微生物について説明する。本発明でいう微生物とは一
般に細菌、真菌、放線菌、リケッチア、マイコプラズ
マ、ウイルス、として分類されているいわゆる微生物学
の対象となっている生物のほかに、原生動物や原虫のう
ちの小型のもの、生物体の幼生、分離または培養した動
植物細胞、精子、血球、核酸、タンパク質等も含む広い
意味での生体または生体由来の微粒子である。また本発
明では、測定対象として液体中の微生物を想定してい
る。

【００２９】次に本実施の形態である微生物数測定装置
の電極について説明する。図１ないし図２に示すよう
に、誘電泳動によって試料液体中の微生物を所定位置に
移動させるために、電極２上の薄膜電極１１が微小なギ
ャップ１２を介して対向して設けられている。本実施の
形態において薄膜電極１１は２つの極１４，１５からな
り、図１および２に示すように櫛歯状の薄膜電極１１が
互いに入れ子になるように配置されている。それぞれの
電極はスパッタリングや蒸着やメッキ等の方法によって
基板１０上に密着して形成された導電体からなり、基板
１０上で薄膜電極１１が密着している部分と基板表面が
むき出しになっている部分の境界である端線によって囲
まれている。２つの極１４，１５によって薄膜電極１１
の端線間に構成されるギャップ１２は、本実施の形態に
おいてはすべて同じ間隔である。誘電泳動のための電圧
印加によってこのギャップ１２付近の電界がもっとも強
くなるため、ギャップ１２が本実施の形態における電界
集中部になる。したがって、微生物はもっとも電界が集
中するこのギャップ１２付近に向かって泳動される。実
施の形態における薄膜電極１１の膜厚は約５ｎｍであ
る。５ｎｍという膜厚は後述するギャップ１２の間隔１
００μｍに比較しても、また検出対象である微生物と比
較しても大変小さいので薄膜電極１１は事実上厚みの無
視できる２次元的な広がりのみをもつ電極と考えること
ができる。そこで、本実施の形態では基板１０上で電極
の密着している部分と基板がむき出しになっている部分
の境界を端線と表現している。この時、電極２における
電界集中部であるギャップ１２付近の電界分布は図３に
示すようなものとなる。この薄膜電極１１の膜厚は約５
ｎｍと薄いために図３に示すように二つの薄膜電極１１
の端線に挟まれた部分にもっとも電界が集中する。薄膜
電極１１は極端に抵抗が高くない限りどのような材料か
ら構成されてもよいが、液体中での使用、特に本実施の
形態のように水中で使用されることを想定すると、なる
べくイオン化傾向が低い金属が望ましい。誘電泳動時に
は電極２間に強い電界が生じるため、印加する周波数と
水中の電解質濃度によっては電気分解が生じることがあ
る。電気分解が生じるとイオン化傾向の大きな金属から
構成された電極では、電極の溶解が生じ電極形状の崩れ
や極端な場合には電極の破断等が生じてしまう。従っ
て、本実施の形態では電極の主材料として白金を使用し
ている。

【００３０】基板１０は、薄膜電極１１を保持でき、か
つ絶縁性の高いものであればどのような材料から構成さ
れてもよいが、誘電率は低いほう（低誘電率基板）が望
ましい。なぜ誘電率の低い基板がより望ましいのかとい
うと、薄膜電極１１間の電界は図３には詳細に記載して
いないが基板内部にも分布するからである。基板内部の
電界と基板外部に広がる電界すなわち誘電泳動のための
電界との強度の比率は誘電率の比によって決まる。本実
施の形態では平滑性が高く、また、微細加工が行いやす
く誘電率も比較的低いことから、低誘電率基板としてホ
ウ珪酸ガラス基板を使用している。本実施の形態におい
て、基板１０上への薄膜電極１１の作成は一般的なフォ
トリソグラフィーを用いた方法で行っている。本実施の
形態におけるギャップ１２の間隔は１００μｍに設定さ
れているが、ギャップ１２の間隔は測定対象となる微生
物の大きさ等の影響を受けるため必要に応じて調節され
る。例えば、酵母や単離細胞のような大きなものでは広
く、リケッチアのように小さなものについては狭くする
必要がある。また、ギャップ１２の間隔は、広いほど大
量の微生物を濃縮することができ、測定のダイナミック
レンジも広くなるが、測定までの時間が長く必要にな
り、誘電泳動のために必要な電力も大きくなる。逆にギ
ャップ１２を狭くすると、電力と測定のために必要とな
る時間は少なくなるが、測定のダイナミックレンジは狭
くなってしまうものである。以上のような理由から本実
施の形態においては、ギャップ１２の間隔を１００μｍ
としているが、この値は検出対象とする微生物に合わせ
て０．２〜３００μｍの範囲で適宜調節されることが望
ましい。

【００３１】泳動電源回路３は誘電泳動を起こすための
交流電流を電極２間に供給するものである。本実施の形
態では、後述するように、誘電泳動を起こすための交流
電流を一旦遮断し、電極間のインピーダンス変化の測定
を行っている。電極２を複数設けてそのうちの２つを測
定用の電極とするのでもよい。この泳動電源回路３は電
磁弁８等と共に制御手段６によって制御される。制御手
段６は、図示しないマイクロプロセッサと、予め設定さ
れたプログラムを保存するためのメモリ、タイマー、さ
らに測定部４との間の信号線等から構成され、前記プロ
グラムにしたがって電磁弁８の開閉を行い、泳動電源回
路３を制御して、電極２へ特定の周波数と電圧をもった
交流電圧を印加する。さらに制御手段６は測定部４と演
算部５と信号の送受信を行ない適宜制御を行うことで測
定動作全般の流れを管理する。

【００３２】実施の形態において測定部４は、電極２間
のインピーダンスを調べるための交流電圧（以下、測定
のための電圧という）を印加する回路、この印加によっ
て電極２にかかる電圧と、このとき流れる電流と、この
電圧と電流の位相の差を測定するための回路、演算部５
や制御手段６との間の信号を伝える信号線等から構成さ
れる。これにより、誘電泳動によって微生物が移動し、
電界集中部近傍に濃縮されて電極２のインピーダンスの
変化を生じ、これを測定する。電極２間にかかる電圧
と、この測定部４で測定された電流、及び電圧と電流の
位相の差を示すデータは演算部５に渡され、後述する手
順によって演算が行われる。本実施の形態では、測定部
４は制御手段６によって制御されており、予め設定され
たプログラムに従って一連の測定動作が連携して円滑に
進められる。演算部５は、図示しないマイクロプロセッ
サ、メモリ等から構成され、詳細は後述するが、測定部
４にて測定された結果から電極２のインピーダンスを解
析し、電極２間の抵抗成分を演算する。そして必要に応
じて演算結果をメモリ１４に格納したり、予め保存され
ているデータを読み出して比較を行なう等して、最終的
に測定試料に含まれている微生物数を算出する。なお、
このマイクロプロセッサは制御手段６と演算部５とで共
用することができる。また、演算部５も測定部４と同様
に制御手段６によって制御される。

【００３３】表示手段９は算出された微生物数を試料１
ｍLあたりの微生物数としてデジタル表示する。表示手
段９の表示が実施の形態における微生物数測定装置の最
終出力となる。本実施の形態では使用者は測定された微
生物数を試料１ｍLあたりの微生物数として直接知るこ
とができるが、表示手段９としては例えば多いまたは少
ない、といった概数であるとか、目的に応じてほかの表
示方法であってもよい。さらに、試料中の微生物数を調
べて殺菌装置を制御するとか、温度などの培養条件を制
御するなど、使用者が直接微生物数を知る必要がなく、
装置の制御を行うために微生物数を把握すればよい場合
には、表示手段９を設ける必要はない。

【００３４】続いて、測定試料の液の導入からセル１内
の微生物の濃縮、測定、洗浄にいたるまでの一連の流れ
を説明する。初期状態では試料系配管７とセル１を遮断
するための電磁弁８は開放状態にあり、測定試料の液は
セル１内を自由に通過している。ここでいう測定試料の
液というのは測定対象である微生物を含む溶液にキャリ
ア体を混合したものである。所定のタイミングで、予め
プログラムによって設定された測定動作に入ると制御手
段６は電磁弁８を閉状態にし、セル１を試料系配管７か
ら遮断し、セル１内のみの閉鎖系を構成する。その後、
制御手段６は、セル１内の液体の流動が収まると予想さ
れる予め設定された所定時間が経過すると、測定部４に
測定開始の信号を送って測定を開始させる。測定開始の
指令を受けた測定部４は、測定のための電圧として直ち
に電極２間に周波数１００ｋＨｚ、電圧１Ｖの正弦波交
流電圧を印加し、その時の電圧、電流、および電圧と電
流の位相の差を測定する。ここで、印加される測定のた
めの交流周波数、電圧は、後述するようにあらかじめ濃
度が明らかな微生物を含有した試料による較正時に最適
なものを選択すればよく、１００ｋＨｚ、１Ｖといった
本実施の形態で例示している値にとらわれる必要はな
い。なお、ここで交流電圧というのは、正弦波のほか、
ほぼ一定の周期で流れの向きを変える電圧のことであ
り、かつ両方向の電流の平均値が等しいものである。

【００３５】測定結果は演算部５に送られる。演算部５
は得られた測定結果から、電極２間のインピーダンス、
電極２間に存在する微生物やキャリア体、溶液等を抵抗
と静電容量からなるＣＲ並列等価回路であるとみなした
ときの抵抗値を算出する。詳細は以下で説明するが、イ
ンピーダンスは印加電圧と電流の除算で、また抵抗値Ｒ
はそれぞれインピーダンスと電圧と電流の位相の差を角
周波数の角度差で表現した値（以下、位相角という）を
用いて計算されるリアクタンスと抵抗値を、ＣＲ並列等
価回路の合成インピーダンスをあらわす式に代入し、連
立方程式を解くことによってＣと共に算出することがで
きる。

【００３６】以下、インピーダンスをＺ、静電容量を
Ｃ、リアクタンスをｘ、抵抗値をｒとして、図５、図６
と（数１）〜（数５）の式を用いて詳細に説明する。
（数１）はＣＲ並列等価回路の合成インピーダンスを表
す式、（数２）はＣＲ並列等価回路のレジスタンス表す
式、（数３）はＣＲ並列等価回路のリアクタンスを表す
式、（数４）はＣＲ並列等価回路の抵抗値を表す式、
（数５）はＣＲ並列等価回路の静電容量値を表す式であ
る。

【００３７】

【数１】

【００３８】

【数２】

【００３９】

【数３】

【００４０】

【数４】

【００４１】

【数５】

【００４２】薄膜電極１１の極１４，１５の間には微生
物を含んだ水が存在しており、誘電泳動によってキャリ
ア体とともに微生物が電極間のギャップに移動する前に
は、水を電極間誘電体として構成される静電容量Ｃ１６
と水による抵抗Ｒ１７が並列に２つの極１４と１５間を
結んでいると考えられる。また、誘電泳動によって結合
体として微生物が移動した後も、後述するように、静電
容量Ｃ１６と抵抗Ｒ１７の絶対値は変化しても等価回路
の接続形態は変わらないと考えることができる。このよ
うなＣＲ並列回路に交流電圧を印加すると、回路に流れ
る電流２１と印加した電圧２０の間に図５（ｂ）に示す
ような位相の差が現れる。

【００４３】図５（ｂ）は電流と電圧の間の位相差を示
す図である。位相差を印加した電圧の周波数を角周波数
ωであらわしたときの角度差θを用いて複素平面上に極
座標表示すると、電圧、電流、位相角の間には図６に示
す関係がある。インピーダンスＺは測定される印加電圧
と電流の除算で得られ、図６に示されたベクトルの絶対
値に相当する。この時、インピーダンスＺはＺ＝ｒ＋ｊ
ｘ（ｊは虚数単位）の形で表現することができ、抵抗値
ｒはｒ＝Ｚｓｉｎθとして図５（ａ）に示されたＣＲ並
列回路の合成インピーダンスの抵抗成分、リアクタンス
ｘはｘ＝Ｚｃｏｓθとして同回路の容量成分の逆数に関
連付けられる。一方図５（ａ）のＣＲ等価回路の合成イ
ンピーダンスは（数１）で表現され、（数１）の式をＺ
＝ｒ＋ｊｘの関係から抵抗値ｒとリアクタンスｘに分解
して（数２）と（数３）を得る。（数２）と（数３）を
連立させて変形すると（数４）と（数５）を得る。（数
４）と（数５）に測定のための電圧値、その時の電流
値、電圧と電流の位相角の測定値から演算したｒ、ｘ、
ωを代入することにより抵抗Ｒ１７と静電容量Ｃ１６を
知ることができる。

【００４４】演算部５は図示しないマイクロプロセッサ
によって一連の演算を一瞬のうちに終了する。演算部５
は算出された抵抗Ｒの値を初期値としてメモリに格納
し、初期値の測定が終了したことを信号を送って制御手
段６に伝える。なお、予め測定値に対応した演算を行っ
ておき、これをテーブルにしてメモリしておけば演算を
測定の都度行うのではなく、テーブルを参照するだけで
微生物に換算することもできる。すなわち、予め設定さ
れた時間に誘電泳動による微生物の濃縮を行なった後に
測定を行い、測定のための電圧値、その時の電流値、電
圧と電流の位相差を測定した後、この３つの値でメモリ
上のテーブルを参照すればそこに予め演算された微生物
数がメモリされているというものである。このような構
成にすれば演算部５を設けることなく、迅速測定が可能
でさらに簡易な構造の微生物数測定装置とすることがで
きる。

【００４５】次いで制御手段６は泳動電源回路３を制御
して電極２間に周波数１ＭＨｚでピーク電圧１００Ｖの
正弦波交流電圧（以下、泳動のための電圧）を印加す
る。このとき印加される交流の周波数は誘電泳動が生じ
る周波数範囲であれば任意に選ぶことが可能であるが、
あまりに周波数が低いと電極２間で望ましくない電気分
解が発生し、また逆にあまりに周波数が高いと電源回路
が複雑になる。そこで、本実施の形態では十分に誘電泳
動を起こすことができ、かつ泳動電源回路３も比較的簡
易なものですむということで１ＭＨｚという周波数を選
択している。また、泳動のための電圧は実施の形態では
１００Ｖとしているが、試料の導電率が大きい場合に
は、電気分解が発生することがないようにより低い電圧
を選択するのが適当である。測定対象となる微生物の種
類によっては、測定のための電圧と泳動のため電圧は別
の電圧で異なった周波数である必要はなく、同一の周波
数を用いてもよい。すなわち、任意の微生物についてそ
れらをもっとも効率よく泳動するために印加すべき交流
の周波数ともっとも効率よく測定するために印加する交
流の周波数は必ずしも同じではないが、微生物の種類に
よっては泳動と測定の最適周波数は同じになる。この場
合には、単一周波数で泳動と測定を行うことができるた
めに泳動電源回路３を簡素化することができる上に、泳
動を行いながら連続的に測定を行うことが可能になり、
より精密な結果を得ることができるようになる。

【００４６】その後、予め設定された時間毎に、制御手
段６と測定部４と演算部５は連携して泳動と測定を繰り
返し、演算部５は算出された抵抗Ｒを都度メモリに格納
する。このように、誘電泳動による微生物のギャップ１
２付近への移動と電極２のインピーダンス測定を繰り返
すことによって、電極２間の抵抗Ｒの時間変化を調べる
ことができる。誘電泳動のための交流電圧印加開始後、
予めプログラムされた所定回数の電極２のインピーダン
ス測定を行うと、演算部５はメモリに格納されている複
数の時点における抵抗Ｒの演算結果から、図４に示すよ
うにその時までの電極２間の抵抗Ｒの時間変化の変化率
を計算し、後述する変換式に従って測定試料の微生物数
を算出する。

【００４７】この抵抗Ｒの時間変化の変化率を測定すれ
ば微生物数を算出することができるという理由を説明す
る。測定対象である微生物はイオンリッチで比較的導電
率が大きな細胞壁と、リン脂質からなり、外側を細胞膜
に囲まれており、微小な誘電体粒子となっており、キャ
リア体は微生物と比較して高い誘電率、低い表面導電率
を有するものである。キャリア体と複数の微生物と結合
した後の結合体は高誘電率、高表面導電率となる。した
がって、誘電泳動によってギャップ１２付近にキャリア
体単体と結合体がある割合で移動してくる場合を考える
と、キャリア体のみが移動してくるのに比較して、結合
体の数が増えるに連れてギャップ１２付近の抵抗Ｒは低
下していく。よって、電極２間の抵抗Ｒ変化を測定すれ
ばその値はギャップ１２付近に移動してきた結合体数、
ひいては測定試料に存在する微生物数に相関した測定結
果を得ることができる。このような抵抗Ｒの時間変化の
一例を示したのが図４である。そして図４からも分かる
ように、測定初期の抵抗Ｒの時間変化の変化率（勾配）
も抵抗Ｒの絶対値の時間変化と同様に、微生物数に対応
して減少しているのが分かる。抵抗Ｒの絶対値で微生物
数を算出する場合、過渡状態をすぎてから測定した方が
正確であるから、どうしても時間が長くかかるが、測定
初期の抵抗Ｒの変化率（勾配）によって微生物数を算出
する場合は、比較的短時間で微生物数を算出できるとい
う特徴がある。さて、抵抗Ｒ変化と測定試料の微生物数
を関連付けるためには抵抗Ｒと微生物数間の変換式が必
要である。この変換式は微生物数が明らかな較正用試料
を、本実施の形態で説明した微生物数測定装置の測定系
を用いて予め測定し、その時の微生物数と抵抗Ｒの間の
相関関係からばらつきを回帰分析して得られる曲線をあ
らわす関数をもちいる。この変換式を演算部５のメモリ
に記憶させ、微生物数が未知の試料を測定する場合に
は、所定時間内における抵抗Ｒの変化率を代入すること
により測定試料の微生物数を算出できる。なお、換算テ
ーブルを用いるものは変換式による演算結果を予めメモ
リさせている。ここで実施の形態の試料としては、例え
ば酵母の培養液等の単一微生物系を想定しているが、混
合微生物系であっても、キャリア体に修飾する結合基の
特異性を利用して、特定の微生物だけをキャリア体に結
合して結合体を誘電泳動することで、特定の微生物だけ
集め測定することが可能である。

【００４８】以上説明したように、微生物数を算出後、
予めプログラムされた所定の時間が経過すると、演算部
５は測定終了の通知を制御手段６に送る。これを受け、
制御手段６は電極２への通電を停止するとともに電磁弁
８を開放して洗浄に入る。ギャップ１２付近に集まった
結合体は、電磁弁８の開放により流入する試料系配管７
の液体によって洗い流され、一連の測定動作が終了す
る。

【００４９】さて、本実施の形態では、単一組の薄膜電
極１１を使用した場合について説明したが、これは、薄
膜電極１１が複数組用いられることを妨げるものではな
い。即ち電極２と同一形状を持った、即ち同一条件下で
同一のインピーダンスを持った電極が複数組セル１内に
設置されていてもかまわない。その場合には、それぞれ
の電極２のインピーダンスを独立に測定しその値を平均
化するなどの統計処理を行った上で抵抗Ｒを算出するこ
とで、より精度の高い測定結果を得ることが可能にな
る。たとえば複数の電極２のうちで望ましくない不純物
やごみの付着による影響で微生物数と関連しない値が測
定されたとしても、測定値を平均化することでその影響
を小さくすることができるし、より高度には他の電極２
での測定結果を参照して異常値として切り捨てる等の処
理も可能となる。このように同一形状を持った電極２を
複数組用いて測定を行うことは、構造がやや複雑になる
ことを除けば、精度向上の面からむしろ望ましいことで
あるといえる。

【００５０】このように本実施の形態の微生物キャリア
体は、結合基により微生物との結合体を作り、低誘電率
で測定が難しい微生物であっても測定を可能にするし、
誘電泳動のための交流電圧と、測定のための電圧を交互
に印加するため、誘電泳動による微生物の濃縮を行いな
がら、定期的に測定部４による電極２のインピーダンス
を測定することができ、演算部５によって電極２間の抵
抗Ｒの時間変化を検出することができるので、比較的短
時間で、簡易な構造でありながら、測定感度が高く、ま
た自動測定も可能でメンテナンスフリーの微生物数測定
装置を提供することができる。

【００５１】

【発明の効果】本発明の微生物キャリア体によれば、低
誘電率の微生物であっても、誘電泳動によって簡易で高
感度な測定を行うことができる。

【００５２】また、本発明の微生物数測定装置によれ
ば、薬剤や特別な装置を必要とすることなく、低誘電率
の微生物であっても、簡易で高感度な測定ができ、自動
測定が可能でメンテナンスフリーにすることができる。

【００５３】さらに、本発明の微生物数測定方法は、低
誘電率の微生物であっても、簡易で高感度な測定がで
き、自動測定が可能でメンテナンスフリーを実現するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施の形態における微生物数測定装置
の全体構成図

【図２】本発明の実施の形態における電極の説明図

【図３】本発明の実施の形態における電極の断面と電極
間の電界の状態を説明するための図

【図４】微生物数と測定時間と電極間の抵抗Ｒの関係を
説明するためのグラフ

【図５】（ａ）電極間の静電容量の計算方法を説明する
ための図（ｂ）電流と電圧の間の位相差を示す図

【図６】電極間の静電容量の計算方法を説明するための
もう一つの図

【図７】微生物キャリア体の分子構造を表す模式図

【符号の説明】

１ セル ２ 電極 ３ 泳動電源回路 ４ 測定部 ５ 演算部 ６ 制御手段 ７ 試料系配管 ８ 電磁弁 ９ 表示手段 １０ 基板 １１ 薄膜電極 １２ ギャップ １３ 電気力線 １４，１５ 極 １６ 静電容量 １７ 抵抗 １８ 時間軸 １９ 電圧および電流の大きさを表す軸 ２０ 電流の変化を表す曲線 ２１ 電圧の変化を表す曲線 ２２ コア ２３ ポリマー ２４ 結合基

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中島 祐一 大阪府門真市大字門真1006番地 松下電器 産業株式会社内 Ｆターム(参考） 2G060 AA16 AD08 AE20 AF07 AG06 AG08 AG10 GA01 HA02 HC10 KA09 4B029 AA07 BB01 CC03 CC08 FA10 FA11

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】測定対象の微生物が有す誘電率より高誘電
   率の材質で構成され、表面に前記微生物と特異的に結合
   できる結合基が設けられた微生物キャリア体であって、
   誘電泳動力が作用すると前記結合基に結合した微生物が
   一体となって泳動されることを特徴とする微生物キャリ
   ア体。
2. 【請求項２】微生物キャリア体が微生物の代表寸法と同
   程度もしくは数倍程度までの代表寸法を有すとともに、
   前記微生物の表面導電率より低い表面導電率を有するこ
   とを特徴とする請求項１記載の微生物キャリア体。
3. 【請求項３】前記結合基が微生物の官能基に特異的に化
   学結合することができ、微生物キャリア体表面に修飾さ
   れている化合物であることを特徴とする請求項１記載の
   微生物キャリア体。
4. 【請求項４】前記化合物が微生物のタンパク質に含まれ
   るアミノ酸残基に特異的に結合する化合物であることを
   特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の微生物キャ
   リア体。
5. 【請求項５】前記結合基が抗原である微生物のエピトー
   プに対して特異的に結合するパラトープを有する抗体で
   あり、微生物キャリア体表面に修飾されていることを特
   徴とする請求項１または２記載の微生物キャリア体。
6. 【請求項６】内部に複数の電極を備え、かつ微生物含有
   の液体を導入するとともに、請求項１〜５のいずれかに
   記載の微生物キャリア体を導入することができるセル
   と、前記セル内に誘電泳動力を発生させるための交流電
   圧を前記電極のうちの何れかの電極間に印加する電源回
   路と、前記電極のうちの何れかの電極により電界を測定
   するための電極間の抵抗特性を測定する測定部と、前記
   電源回路と前記測定部とを制御するための制御手段と、
   前記測定部の測定結果を演算して微生物数を算出する演
   算手段とを備えたことを特徴とする微生物数測定装置。
7. 【請求項７】前記測定部が電極間の電流と位相差を測定
   するとともに、前記電極間の印加電圧を測定して抵抗を
   算出することを特徴とする請求項６記載の微生物数測定
   装置。
8. 【請求項８】複数の電極を備えたセル内に微生物含有の
   液体と請求項１〜５記載の微生物キャリア体を導入し、
   前記複数の電極のうち何れかの電極間に交流電圧を印加
   して前記セル内に誘電泳動力を発生させ、電界集中部に
   前記微生物キャリア体と結合した微生物を集めて、前記
   電極間の抵抗特性の変化を測定して微生物数を算出する
   ことを特徴とする微生物数測定方法。