JP2011512868A - アジピン酸（エステルまたはチオエステル）の合成 - Google Patents

Abstract

本発明は、アジピン酸エステルまたはチオエステルの調製方法に関する。本発明はさらに、前記エステルまたはチオエステルからアジピン酸を調製する方法に関する。さらに本発明は、前記エステルまたはチオエステル用の中間体を調製するための複数の方法を提供する。さらに本発明は、６−アミノカプロン酸（６−ＡＣＡ）の調製方法、５−ホルミル吉草酸（５−ＦＶＡ）の調製方法、およびカプロラクタムの調製方法に関する。さらに本発明は、本発明による方法で使用する宿主細胞に関する。

Description

発明の詳細な説明

本発明は、アジピン酸エステルまたはチオエステルを調製する方法に関する。本発明はさらに、前記エステルまたはチオエステルからアジピン酸を調製する方法に関する。さらに本発明は、前記エステルまたはチオエステル用の中間体を調製するための複数の方法を提供する。さらに本発明は、６−アミノカプロン酸（６−ＡＣＡ）の調製方法、５−ホルミル吉草酸（５−ＦＶＡ）の調製方法、およびカプロラクタムの調製方法に関する。さらに本発明は、本発明による方法に用いる宿主細胞に関する。

アジピン酸（ヘキサン二酸）は、とりわけポリアミドの生産に使用される。さらにアジピン酸のエステルは、可塑剤、潤滑剤、溶剤に、また様々なポリウレタン樹脂に使用することができる。アジピン酸の他の用途は、食品酸味料としてのもの、接着剤、殺虫剤、なめし、および染色における利用である。既知の調製方法には、シクロヘキサノールまたはシクロヘキサノンまたはそれらの混合物（ＫＡ油）の硝酸による酸化が挙げられる。

カプロラクタムは、これもまたポリアミド、例えばナイロン−６またはカプロラクタム−ラウロラクタムコポリマー（ナイロン−６，１２）の生産用に使用することができるラクタムである。バルク化学薬品からカプロラクタムを調製する様々な方法が当該技術分野で知られており、それらにはシクロヘキサノン、トルエン、フェノール、シクロヘキサノール、ベンゼン、またはシクロヘキサンからのカプロラクタムの調製が挙げられる。

アジピン酸またはカプロラクタムを調製するためのシクロヘキサノール、シクロヘキサノン、またはフェノールなどの中間化合物は、一般には鉱油から得られる。より持続可能な技術を用いてこれら材料を調製することへの要求の高まりを考慮して、生物学的に再生可能な供給源から得ることができる中間化合物から、またはせめて生化学的方法を用いてアジピン酸またはカプロラクタムに転化される中間化合物からアジピン酸またはカプロラクタムを調製する方法を提供することが望ましいはずである。

米国特許第５，４８７，９８７号明細書には、細菌細胞を利用するアジピン酸の生産方法が記載されており、そこでは炭素源を一般的な経路で酵素によって３−デヒドロシキミ酸に転化するか、あるいは３−デヒドロシキミ酸の生体触媒転化によりｃｉｓ，ｃｉｓムコン酸を生成する細菌細胞の芳香族アミノ酸生合成によって３−デヒドロシキミ酸に転化する。その後、ｃｉｓ，ｃｉｓムコン酸を化学的に還元（白金触媒を使用）してアジピン酸を生成する。したがってこの最終段階は、化学触媒を必要とする。さらに、この細菌細胞中で形成される芳香族中間体はその細胞にとって有毒である可能性があり、それらの濃度は細胞培養物中のみならずｉｎ ｖｉｖｏでも低いべきであると本発明者等は考えている。

例えば米国特許第Ａ６，１９４，５７２号明細書に記載されているように６−アミノカプロン酸（６−ＡＣＡ）からカプロラクタムを調製することが知られている。国際公開第２００５／０６８６４３号明細書に開示されているように６−ＡＣＡは、６−アミノヘキサ−２−エン酸（６−ＡＨＥＡ）をα，β−エン酸レダクターゼ活性を有する酵素の存在下で転化することによって生化学的に調製することができる。６−ＡＨＥＡはリシンから、例えば生化学的に、または純粋な化学合成によって調製することができる。６−ＡＣＡは、国際公開第２００５／０６８６４３号明細書に開示されている方法による６−ＡＨＥＡの還元により調製することができるが、本発明者等は―還元反応条件下で―６−ＡＨＥＡが自然にかつ大幅に不可逆的環化して望ましくない副生物、特にβ−ホモプロリンを形成する恐れがあることを発見した。この環化は、６−ＡＣＡの生産における障害になり、かなりの収率低下を引き起こす恐れがある。

本発明の目的は、アジピン酸またはカプロラクタム（とりわけポリアミドの調製に使用することができる）、あるいはアジピン酸またはカプロラクタムの中間化合物を調製するための既知の方法に代わって役立つ可能性のある新規な方法を提供することである。

さらなる目的は、前述の欠点の１つまたは複数を克服することになる新規な方法を提供することである。

本発明により解決することができる、１つまたは複数のさらなる目的は、下記の説明から理解されるはずである。

本発明者等は、アジピン酸（あるいはそのエステルまたはチオエステル）は、コハク酸（あるいはそのエステルまたはチオエステル）から生成できることを見出した。具体的には本発明者等は、アジピン酸（チオ）エステルが、図２に示すようにコハク酸（チオ）エステルと酢酸（チオ）エステルから、例えば、生細胞中での逆β−酸化および脂肪酸生合成に似た一連の特異反応により調製することができるという結論に達した。本明細書において各Ｒは独立に、例えば本明細書中で下記に述べるような活性基（反応を促進させる）を表す。各Ｘは独立にＳまたはＯを表す。ＥＤ／ＥＤＨ_２は、酸化された／還元された電子供与体、例えばＮＡＤ／ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤ／ＦＡＤＨ_２、または酸化フェレドキシン／還元フェレドキシンの良い例である。電子の実際の伝達は、直接行われてもよく、また補酵素または電子伝達フラビンタンパク質（ＥＴＦ）などの中間電子伝達体が介在してもよい。Ｙ−ＮＨ_２は、例えば本明細書中で下記に述べるようなアミノ基供与体を指す。

したがって本発明者等は、コハク酸（あるいはそのエステルまたはチオエステル）と酢酸（あるいはそのエステルまたはチオエステル）からカスケード反応によりアジピン酸（あるいはそのエステルまたはチオエステル）を生体触媒作用により調製できるはずであるという結論に達した。さらに本発明者等はアジピン酸を、６−ＡＣＡの調製用中間体である５−ホルミルペンタン酸（「５−ＦＶＡ」、５−ホルミル吉草酸）に生体触媒作用により転化できること、また特異生体触媒をこの転化に対して使用できることを見出した。

したがって本発明は、その反応の少なくとも１つが生体触媒によって触媒される複数の反応により、コハク酸エステルまたはチオエステルからアジピン酸エステルまたはチオエステルを調製するための方法に関する。

具体的には本発明は、生体触媒の存在下で２，３−デヒドロアジピン酸（ＩＵＰＡＣ名：５−カルボキシ−２−ペンタン酸）エステルまたは２，３−デヒドロアジピン酸チオエステルをアジピン酸エステルまたはチオエステルに転化することを含むアジピン酸エステルまたはアジピン酸チオエステルの調製方法に関する。

本明細書中でカルボン酸またはカルボン酸エステル、例えば６−ＡＣＡ、別のアミノ酸、５−ＦＶＡ、アジピン酸／アジピン酸エステル、コハク酸／コハク酸エステル、酢酸／酢酸エステルに言及する場合、別段の指定がない限りこれらの用語には、プロトン化カルボン酸（遊離酸）、その対応するカルボン酸エステル（その共役塩基）、およびそれらの塩が含まれることを意味する。本明細書中でアミノ酸、例えば６−ＡＣＡに言及する場合、この用語には、それらの両性イオン形態のアミノ酸（この場合、そのアミノ基はプロトン化形態であり、カルボン酸基は脱プロトン化形態である）と、アミノ基がプロトン化され、かつカルボン酸基がその中性形態であるアミノ酸と、アミノ基がその中性形態であり、かつカルボン酸基が脱プロトン化形態であるアミノ酸と、それらの塩とが含まれることを意味する。

カルボン酸のエステルまたはチオエステル、例えばアジピン酸エステルまたはチオエステル、酢酸エステルまたはチオエステル、コハク酸エステルまたはチオエステルに言及する場合、これらの用語には、任意の活性基、具体的には補酵素Ａ（ＣｏＡとも呼ばれる）と、アシルまたはペプチジルキャリアタンパク質（それぞれＡＣＰまたはＰＣＰ）に結合することができるホスホ−パンテテインと、Ｎ−アセチル−システアミンと、メチル−チオ−グリコール酸と、メチル−メルカプト−プロピオン酸と、エチル−メルカプト−プロピオン酸と、メチル−メルカプト−酪酸と、メチル−メルカプト−酪酸と、メルカプトプロピオン酸と、同一または類似の機能を与える他のエステルまたはチオエステルとを含めた任意の生物学的活性基が含まれることを意味する。生細胞を生体触媒として使用するこの場合、エステルまたはチオエステル、具体的にはＣｏＡは、その使用する生体触媒によって産生させるか、またはその反応を触媒するのに適した酵素を産生することもまたできる生物から生じさせることができる。ＣｏＡ−リガーゼおよびＣｏＡ−トランスフェラーゼは多くの生物中で同定されており、所望の活性化エステルまたはチオエステルを得ることができる。

コハク酸エステルまたはチオエステルからのアジピン酸エステルまたはチオエステルの調製は、具体的には下記の反応段階、すなわち
（１）コハク酸エステルまたはチオエステルを準備し、前記エステルまたはチオエステルを酢酸エステルまたはチオエステルと反応させ、それによって３−オキソアジピン酸エステルまたはチオエステルを形成する段階、
（２）この３−オキソアジピン酸エステルまたはチオエステルの３−オキソ基を水素化し、それによって３−ヒドロキシアジピン酸エステルまたはチオエステルを形成する段階、
（３）この３−ヒドロキシアジピン酸エステルまたはチオエステルを脱水し、それによって２，３−デヒドロアジピン酸エステルまたはチオエステルを形成する段階、および
（４）この２，３−デヒドロアジピン酸エステルまたはチオエステルのＣ−Ｃ二重結合を水素化し、それによってアジピン酸エステルまたはチオエステルを形成する段階、
を含むことができる（括弧の中の数字は図１にもまた対応する）。

本発明はまた、前記反応段階１〜４の１つまたは複数を、そのような反応段階を触媒する生体触媒の存在下で行うことを含む、アジピン酸の調製方法に使用するのに適した中間化合物の調製方法に関する。

一実施形態ではこのアジピン酸エステルまたはチオエステルが、５−ＦＶＡに転化される（５）。

所望される場合にはこのアジピン酸エステルまたはチオエステルをアジピン酸に転化することができる。これは、そのエステル結合またはチオエステル結合を加水分解し（７）、それによってアジピン酸を形成することにより、あるいはその「アルコール」または「チオール」部分（ＣｏＡなど）をアジピン酸エステルまたはチオエステルからアジピン酸とは異なる酸へ移動させ、それによってアジピン酸およびアジピン酸とは異なる酸の（チオ）エステルを形成する（７）移動反応により達成することができる。コハク酸または酢酸をその異なる酸として使用する場合、この反応は、ＣｏＡなどのそのアルコールまたはチオール部分を再生利用することができる点で有利なこともある。例えばアジピル−ＣｏＡ＋コハク酸または酢酸を転化（一般にはＣｏＡトランスフェラーゼの存在下で）してスクシニル−ＣｏＡまたはアセチル−ＣｏＡ＋アジピン酸を形成することができる。次いでこのスクシニル−ＣｏＡまたはアセチル−ＣｏＡを、本発明の方法における出発化合物として使用することができる。

アジピン酸（あるいはそのエステルまたはチオエステル）を、例えば５−ＦＶＡに転化することができる（８）。

一実施形態では本発明の方法で得られた５−ＦＶＡが、６−ＡＣＡに転化される（６）。その後、６−ＡＣＡを、例えばそれ自体当該技術分野で知られている方法でカプロラクタムに転化することができる。

さらなる実施形態では本発明による方法で得られたアジピン酸またはカプロラクタムが、ポリアミドの調製に使用される。

本明細書中で使用される用語「或る（ａまたはａｎ）」は、別段の指定がない限り「少なくとも１つの」と定義される。

単数形の名詞（例えば化合物、添加剤など）に言及する場合、その複数形も含まれることを意味する。

幾種類かの異性体が存在する化合物（例えばｃｉｓおよびｔｒａｎｓ異性体、ＲおよびＳ鏡像異性体）に言及する場合、原則としてはその化合物には、本発明の特定の方法で使用することができるその化合物のすべての鏡像異性体、ジアステレオマー、およびｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性体が含まれる。

酵素がブラケットの中の酵素分類（ＥＣ）に関して言及される場合、その酵素分類は、国際生化学・分子生物学連合の命名委員会（ｔｈｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ））によって設けられた酵素命名法に基づいて、その酵素がそこに分類されるか、または分類され得る綱であり、この命名法はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／中に見出すことができる。特定の綱に（まだ）分類されていないが、そういうものとして分類され得る他の適切な酵素も含まれることを意味する。

本明細書中で受入番号に関してタンパク質に言及する場合、この番号は、別段の指定がない限り、具体的には２００８年３月１１日付けのＵｎｉｐｒｏｔ中に見出される配列を有するタンパク質を指すために使用される。

用語「ホモログ」は、具体的には本明細書中で、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、より具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して使用される。ホモログという用語にはまた、その遺伝暗号の縮重のせいで別の核酸配列とは異なり、かつ同一のポリペプチド配列をコードする核酸配列（ポリヌクレオチド配列）も含まれることを意味する。

配列同一性または類似性は、本明細書中では配列を比較することによって求められる２つ以上のポリペプチド配列間、または２つ以上の核酸配列間の関係として定義される。一般には配列同一性または類似性はその配列の全長にわたって比較されるが、互いに一致する配列の一部についてのみ比較することもまたできる。当技術分野では「同一性」または「類似性」はまた、場合によってはそのような配列間の合致によって求められるポリペプチド配列間または核酸配列間の配列同系性の程度を意味する。同一性または類似性を求めるための好ましい方法が、その試験される配列間の最大の合致を与えるように設計されている。本発明の文脈においては２つの配列間の同一性および類似性を求めるための好ましいコンピュータプログラム法には、ＮＣＢＩから公的に入手できるＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ,Ｓ.Ｆ.等、Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.１９９０,２１５,４０３〜４１０）、および他の供給源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ,Ａｌｔｓｃｈｕｌ,Ｓ.ら、ＮＣＢＩ ＮＬＭＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ,ＭＤ ２０８９４）が挙げられる。ＢＬＡＳＴＰを用いたポリペプチド配列比較用の好ましいパラメータは、ギャップ開始１０．０、ギャップ伸長０．５、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスである。ＢＬＡＳＴＮを用いた核酸配列比較用の好ましいパラメータは、ギャップ開始１０．０、ギャップ伸長０．５、ＤＮＡ完全マトリックス（ＤＮＡ同一性マトリックス）である。

本発明の方法では生体触媒が使用される。すなわちこの方法の少なくとも１つの反応段階は、生物源、例えば生物またはそれから得られる生体分子から得られる生体物質または部分によって触媒される。この生体触媒は、具体的には１種類または複数種類の酵素を含むことができる。生体触媒は、任意の形態で使用することができる。一実施形態では１種類または複数種類の酵素は、例えば溶液、エマルション、分散液、凍結乾燥細胞（の懸濁液）、溶解産物、または支持体上に固定化されたものとして自然環境から単離して（それが産生された生物から単離して）使用される。その酵素が生じる生物から単離された酵素を使用することは、具体的にはその反応平衡が望ましい側に移動するように反応条件を調整して柔軟性を高めるゆえに有用な場合もある。

一実施形態では１種類または複数種類の酵素は、生体の一部（生きている全細胞など）を形成する。これら酵素は、細胞内で触媒機能を果たすことができる。細胞が存在している培地中にこの酵素を分泌させることもまた可能である。

生細胞は、増殖期細胞、休止または休眠細胞（例えば胞子）、あるいは静止期の細胞であり得る。透過性にした（すなわち酵素の基質に対して透過性にした、あるいは酵素または酵素群の基質の前駆物質に対して透過性にした）細胞の一部を形成する酵素を使用することもまた可能である。

本発明の方法に使用される生体触媒は、原則としては、任意の生物であることも、あるいは任意の生物から得るまたは誘導することもできる。この生物は、真核生物、細菌、または古細菌であり得る。具体的には生物は、動物（ヒトを含めた）、植物、細菌、古細菌、酵母菌、および真菌から選択することができる。

好適な細菌は、具体的にはアブシディア属（Ａｂｓｉｄｉａ）、アクロモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、アゾアルカス属（Ａｒｚｏａｒｃｕｓ）、アゾモナス属（Ａｚｏｍｏｎａｓ）、アゾスピリルム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ベイジュリンキア属（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ブルクホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ビソクラミス属（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ゴッシピウム属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノルカジア属（Ｎｏｒｃａｄｉａ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドスピリリラム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ロドコッカス属（Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、シェワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ザントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、キシレラ属（Ｘｙｌｅｌｌａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、スタヒロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、マイクロシーラ属（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ）の群の中から選択することができる。

好適な真核生物は、具体的には真菌、後生動物、緑色植物亜界（Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ）（具体的にはシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびクラミドモナス目（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ））、ディプロモナス門（Ｄｉｐｌｏｍｏｎａｄｓ）（具体的にはジアルジア亜科（Ｇｉａｒｄｉｉｎａｅ））、エントアメーバ目（Ｅｎｔａｍｏｅｂｉｄａｅ）（具体的にはエントアメーバ属（Ｅｎｔａｂｏｅｂａ））、ユーグレノゾア属（Ｅｕｇｌｅｎｏｚｏａ）（具体的にはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ））、ペロミクサ目（Ｐｅｌｏｂｉｏｎｔｉｄａ）（具体的にはマスチゴアメーバ属（Ｍａｓｔｉｇａｍｏｅｂａ））、アルベオラータ門（Ａｌｖｅｏｌａｔａ）（具体的にはクリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ））の群の中から選択することができる。

好適な真菌には、具体的にはリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、ノイロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、嫌気性ルーメン真菌属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）（例えば、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｙｐｏｌｙｔｉｃａ））の群の中から選択される真菌および酵母菌が挙げられる。

好適な後生動物には、具体的には哺乳動物（ヒトを含めた）の中から選択される、より具体的にはウサギ科（Ｌｅｐｏｒｉｄａｅ）、ネズミ科（Ｍｕｒｉｄａｅ）、イノシシ科（Ｓｕｉｄａｅ）、ウシ科（Ｂｏｖｉｄａｅ）、ヒト科（Ｈｏｍｉｎｉｄａｅ）の群から選択される後生動物が挙げられる。生体触媒は、後生動物の任意の部分、例えば肝臓、膵臓、脳、腎臓、心臓、または他の器官に由来し得る。好適な後生動物にはまた、具体的にはセノラブディチス属（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ）およびキイロショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）を挙げることができる。

本発明の方法の特定の反応段階について述べるときに、その特定の反応段階に適した生体触媒を具体的に提供することができる生物を下記で言及する。

本発明による方法において適切な活性を有する自然に存在する生体触媒（野生型）または自然に存在する生体触媒の変異体を使用できることは当業者には明らかなはずである。自然に存在する生体触媒の特性は、例えば分子進化または合理的設計などの当業者に知られている生物学的手法によって改良することができる。野生型生体触媒の変異体は、当業者に知られている変異誘発手法（ランダム変異誘発、部位特異的変異誘発、定方向進化、遺伝子組み換えなど）を用いて、例えば、生体触媒として働くことができる、または生体触媒部分（酵素など）を産生することができる生物のコード化ＤＮＡを修飾することによって作製することができる。具体的にはこのＤＮＡは、野生型酵素とは少なくとも１個のアミノ酸だけが異なる酵素をコードし、その結果、野生型と比べて１個または複数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含む酵素をコードするように、あるいはその変異体がこうして修飾されたＤＮＡの発現を適切な（宿主）細胞中で引き起こすことによって２種類以上の親酵素の配列を結合させるように修飾することができる。後者は、例えば国際公開第２００８／０００６３２号明細書に記載の方法に基づいて、コドンの最適化またはコドン対の最適化などの当業者に知られている方法によって達成することができる。

変異体生体触媒は、例えば、基質に対する選択性、活性、安定性、溶剤許容度、ｐＨの特徴、温度の特徴、基質の特徴、阻害され易さ、補因子の利用、および基質親和性の側面の１つまたは複数に関して改良された特性を有することができる。改良された特性を有する変異体は、例えば、当業者に知られている方法に基づく適切な高処理能力スクリーニングまたは選択方法を適用することによって識別することができる。

アルキルあるいはアルキルエステルまたはチオエステルに作用する酵素の基質特異性を改変することができる。多様性を生み出す分子進化、およびその後の所望の変異体のスクリーニングおよび／または基質結合ポケットの合理的エンジニアリングを利用することができる。本発明の方法で使用される酵素の基質特異性を改変するための手法は、当該技術分野で知られているものに基づくことができる。例えば、特異的変異を設計するために構造または配列の情報を使用する合理的エンジニアリングは、代わりのアシル基供与体を受け入れるようにエリスロマイシンポリケチドシンターゼ由来のアシルトランスフェラーゼドメイン４の基質特異性を改変するために利用されてきた。提案された基質結合部位の修飾が、代りとなる基質に適応させる能力のある改変された結合ポケットを生じさせて別の生成比率（ｐｒｏｄｕｃｔ ｒａｔｉｏ）をもたらすことが示されている（Ｒｅｅｖｅｓ，Ｃ．Ｄ．，Ｍｕｒｌｉ，Ｓ．，Ａｓｈｌｅｙ，Ｇ．Ｗ．，Ｐｉａｇｅｎｔｉｎｉ，Ｍ．，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｃ．Ｒ．，ＭｃＤａｎｉｅｌ，Ｒ．の論文、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１，４０（５１），１５４６４〜１５４７０）。合理的設計および分子進化の両方の手法が、生体触媒ＢＭ３の基質特異性を変えて、中鎖脂肪酸（例えばミリスチン酸）の天然の基質の代わりにまたはそれに加えて多種多様な異なるアルケン、シクロアルケン、アレーン、およびヘテロアレーンを酸化することができるきわめて他種類の変異体を生じさせるために使用されてきた（Ｐｅｔｅｒｓ，Ｍ．Ｗ．，Ｍｅｉｎｈｏｌｄ，Ｐ．，Ｇｌｉｅｄｅｒ，Ａ．，Ａｒｎｏｌｄ，Ｆ．Ｈ．の論文、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２００３，１２５（４４），１３４４２〜１３４５０、およびＡｐｐｅｌ，Ｄ．，Ｌｕｔｚ−Ｗａｈｌ，Ｓ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．，Ｓｃｈｗａｎｅｂｅｒｇ，Ｕ．，Ｓｃｈｍｉｄ，Ｒ．Ｄ．の論文、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００１，８８（２），１６７〜１７１、およびそれらの中の参考文献）。

特定の供給源由来の生体触媒、具体的には酵素を指す場合、最初の生物に由来するが、実際には（遺伝的修飾を加えた）第二の生物中で産生される組み換え生体触媒、具体的には酵素が、その最初の生物由来の生体触媒、具体的には酵素として含まれることを特に意味する。

［３−オキソアジピン酸（エステルまたはチオエステル）の調製（「反応１」）］
本発明の一実施形態では３−オキソアジピン酸（エステルまたはチオエステル）はコハク酸および酢酸から調製され、これらコハク酸および／または酢酸は、具体的には反応を容易にしてエステルまたはチオエステルを生み出すように、一般には活性基を備える。

３−オキソアジピン酸（エステルまたはチオエステル）は、生体触媒作用により、または化学的に、具体的には酢酸エステルまたはチオエステルとコハク酸エステルまたはチオエステルとを結合させる「クライゼン縮合」によって得ることができる。

本発明の好ましい方法ではこの調製は、アシル基転移を触媒することができる生体触媒の存在下での生体触媒反応を含む。したがってこのような触媒活性を有する酵素は、アシルトランスフェラーゼと呼ぶことができる。

好ましい方法ではアシル基転移は、２種類のアシルチオエステルまたはアシルエステルの間で行われる。好ましいアシルチオエステルは、アセチル−ＣｏＡおよびスクシニル−ＣｏＡである。好ましくは前記生体触媒は、前記アシルチオエステルに関して選択的である。

生体触媒は、具体的には、アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１）の群から選択される、好ましくはアセチル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）、アシル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．１６）、およびスクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡ Ｃ−スクシニルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．１７４、またβ−ケトアジピル−ＣｏＡチオラーゼとしても知られる）の群から選択されるアシル基転移の能力のある酵素を含む。アシルトランスフェラーゼ活性は、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）データベース中には、例えばβ−酸化、脂肪酸生合成、ポリケチド生合成、またはブタン酸代謝において示されている。

アシルトランスフェラーゼは、具体的には、古細菌、細菌、および真核生物の群から選択される生物のアシルトランスフェラーゼである。

具体的には酵素は、芳香族または脂環式の環構造、具体的には５、６、または７員環構造を含む有機化合物を分解する能力のある微生物によって生じさせることができる。この有機化合物は任意選択で、環中に、あるいは置換基または置換基の一部として１種類または複数種類のヘテロ原子を含むことができる。例えばその有機部分は、芳香族化合物、具体的には６員環を含む芳香族化合物であり得る。具体的には芳香族化合物は、フェニル酢酸、安息香酸、カテコール、プロトカテク酸、およびゲンチジン酸の群から選択することができる。この有機化合物は、脂環式化合物、具体的にはシクロヘキサノールなどの環状アルコール、シクロヘキサノンなどの環状ケトン、またはシクロヘキサンなどのシクロアルカンであり得る。この有機化合物は、カプロラクタムなどのラクタムであり得る。一実施形態では酵素は、ジカルボン酸（一般にはＣ_６〜Ｃ_１０）、具体的にはアジピン酸などの直鎖飽和ジカルボン酸を分解することができる生物に由来する。

さらなる実施形態では酵素は、例えば二次代謝産物の一部（例えばマロノマイシン（ｍａｌｏｎｏｍｙｃｉｎ））として３−ケト−アジピン酸を合成することができる生物から、好ましくは、例えばストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）（具体的にはストレプトミセス・リモサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ））から、アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｒｅｓ）から、他の放線菌綱（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）または他の既知の二次代謝産物産生生物に由来する。

３−オキソアジピン酸（エステルまたはチオエステル）の調製を触媒することができる生体触媒を得るための好ましい微生物にはさらに、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）（具体的にはアシネトバクター種ＡＤＰ１株（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＡＤＰ１）およびＡ．カルコアセティカス（Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ））、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（具体的にはＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））、アルカリゲネス属（Ａｌｉｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（具体的にはアルカリゲネスＤ２株（Ａｌｉｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｔｒａｉｎ Ｄ２）およびＡ．ユートロフス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ））、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、アゾアルカス属（Ａｚｏａｒｃｕｓ）（具体的にはＡ．エバンシー（Ａ．ｅｖａｎｓｉｉ））、アゾモナス属（Ａｚｏｍｏｎａｓ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（具体的にはＢ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ））、ベイジュリンキア属（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ブルクホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）（具体的にはＣ．クライベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、Ｃ．ベイジュリンキ（Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ））、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（具体的にはＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）およびＣ．オーランチアカム（Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ））、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）（具体的にはＭ．エルスデニ（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ））、ノルカジア属（Ｎｏｒｃａｄｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）、Ｐ．エールギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびシュードモナス種Ｂ１３株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎＢ１３））、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）（具体的にはＲ．ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ））、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＲ．パルストリス（Ｒ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ））、ロドコッカス属（Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）（具体的にはＲ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、Ｒ．オパカス（Ｒ．ｏｐａｃｕｓ）、およびロドコッカス種ＲＨＡ１株（Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＲＨＡ１））、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（具体的にはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））、ユーグレノゾア属（Ｅｕｇｌｅｎｏｚｏａ）（具体的にはユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ））、ノイロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）（具体的にはアカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ））、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（具体的にはＰ．クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）（具体的にはＴ．クタニウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ））が挙げられる。

特定の実施形態では生体触媒は、配列番号１〜１３またはそのホモログのいずれかで識別されるアミノ酸配列を含む酵素を含む。

［３−ヒドロキシアジピン酸（エステルまたはチオエステル）の調製（「反応２」）］
一実施形態では３−ヒドロキシアジピン酸（エステルまたはチオエステル）が、３−オキソアジピン酸（エステルまたはチオエステル）から調製される。一般にはその３−オキソアジピン酸エステルは、上記の活性基を備える。

原則としてこの３−ヒドロキシアジピン酸（エステルまたはチオエステル）は、化学的に、例えば３−オキソアジピン酸（エステルまたはチオエステル）中の３−オキソ基の選択的水素化によって調製することができる。

具体的にはこの反応は、その反応段階を触媒する生体触媒、具体的には、オキソ基、具体的にはカルボニル基のヒドロキシ基への還元を触媒することができる生体触媒の存在下で行うことができる。

特定の実施形態では３−オキソアジピン酸は、補酵素Ａと共にそのチオエステルとして存在する（以後、この３−オキソアジピン酸のチオエステルおよび補酵素Ａを３−オキソアジピル−ＣｏＡと呼ぶことにする）。

本発明の好ましい方法ではこの調製は、３−オキソアシル（エステルまたはチオエステル）の３−ヒドロキシアシル（エステルまたはチオエステル）への還元を触媒することができる生体触媒の存在下での生体触媒反応を含む。

したがってこのような触媒活性を有する酵素を、３−ヒドロキシアシル（エステルまたはチオエステル）デヒドロゲナーゼと呼ぶことができる。したがって３−ヒドロキシアシルＣｏＡ−チオエステルに関してこのような触媒活性を有する酵素は、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼと呼ぶことができる。好ましくは前記３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼは、基質３−オキソアジピル−ＣｏＡに関して選択的である。

３−オキソアシル（エステルまたはチオエステル）の３−ヒドロキシアシル（エステルまたはチオエステル）への還元を触媒することができる酵素は、具体的にはデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１）の群から、好ましくは３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．３５およびＥＣ １．１．１．３６）、３−ヒドロキシブタノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１５７）、３−ヒドロキシピメロイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２５９）、および長鎖３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２１１）の群から選択することができる。これら酵素は、補因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用することができる。３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性は、例えば、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）データベースにより、脂肪酸代謝、ポリケチド生合成、ポリヒドロキシアルカン酸代謝、ブタン酸代謝、ならび芳香族化合物の分解において示されている。

具体的には上記で特定（「反応１」参照）した有機化合物、具体的にはそれらは、芳香族化合物、脂環式化合物、またはジカルボン酸を分解する能力のある微生物である。

３−ヒドロキシアジピン酸（エステルまたはチオエステル）の調製を触媒することができる生体触媒をもたらす他の好ましい生物には、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）（具体的にはアシネトバクター種ＡＤＰ１株（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＡＤＰ１）およびＡ．カルコアセティカス（Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ））、アルカリゲネス属（Ａｌｉｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（具体的にはアルカリゲネスＤ２株（Ａｌｉｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｔｒａｉｎ Ｄ２）およびＡ．ユートロフス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ））、アゾアルカス属（Ａｒｚｏａｒｃｕｓ）（具体的にはＡ．エバンシー（Ａ．ｅｖａｎｓｉｉ））、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（具体的にはＢ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ））、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）（具体的には百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｕｔｕｓｓｉｓ））、ブルクホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）（具体的には類鼻疸菌（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）およびＢ．ゼノボランス（Ｂ．ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ））、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（具体的にはＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｃ．オーランチアカム（Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）、およびＣ．エフィシエンス（Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ））、デイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）（具体的にはＤ．ラディオデュランス（Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ））、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（具体的にはＫ．ニューモニア（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ））、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）および蛍光菌（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ））、ロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＲ．パルストリス（Ｒ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ））、ロドコッカス属（Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）（具体的にはＲ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、Ｒ．オパカス（Ｒ．ｏｐａｃｕｓ）、およびロドコッカス種ＲＨＡ１株（Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＲＨＡ１））、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（具体的にはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））、ノイロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）（具体的にはアカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ））、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（具体的にはＰ．クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（具体的にはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））が挙げられる。

３−ケトヘキサノイル−ＣｏＡに作用するＥＣ １．１．１．３５の酵素をもたらす好適な生物は、哺乳動物、具体的にはウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、イノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）、およびホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）の群から選択される哺乳動物を含めた任意の生物であり得る。

（嫌気性）脂肪酸合成、ポリケチド生合成、またはポリヒドロキシアルカン酸代謝に関与する好適な生体触媒は、任意の生物、具体的にはクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）（具体的にはＣ．アセトブチリクム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）およびＣ．クライベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ））、ユーグレノゾア属（Ｅｕｇｌｅｎｏｚｏａ）（具体的にはユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ））、メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）（具体的にはメガスフェラ・エルスデニ（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ））、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）（具体的にはラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ））、ズーグレア属（Ｚｏｏｇｌｏｅａ）（具体的にはズーグレア・ラミゲラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ））を含めた微生物由来のものであってもよい。

特定の実施形態では生体触媒（「反応２」を触媒する）は、配列番号１５〜２６、２９、またはそのホモログのいずれかで識別されるアミノ酸配列を含む酵素を含む。特に配列番号２６によるアミノ酸配列を含む酵素は、「反応２」および「反応３」の両方を触媒することができると予想している。

［２，３−デヒドロアジピン酸（エステルまたはチオエステル）の調製（「反応３」）］
一実施形態では２，３−デヒドロアジピン酸（５−カルボキシ−２−ペンテン酸）（エステルまたはチオエステル）は、３−ヒドロキシアジピン酸（エステルまたはチオエステル）から調製される。任意選択でこの２，３−デヒドロアジピン酸および３−ヒドロキシアジピン酸を、上記のように補酵素、ＡＣＰ、または別の活性基と結合させる。

本発明の一実施形態ではこの２，３−デヒドロアジピン酸（エステルまたはチオエステル）は、３−ヒドロキシアジピン酸（エステルまたはチオエステル）を化学的に、例えば硫酸の存在下の水のない環境において、例えば脱水により転化することによって調製される。

具体的には２，３−デヒドロアジピン酸は、少なくとも１種類の生体触媒を用いて３−ヒドロキシアジピン酸から調製することができる。

好ましい生体触媒は、３−ヒドロキシアシルエステルまたはチオエステルを脱水してその２−エノイルエステルまたは２−エノイルチオエステルにするのを触媒することができる生体触媒である。

特定の実施形態では２，３−デヒドロアジピン酸は、そのチオエステルとして補酵素Ａと共に存在する（以後、この２，３−デヒドロアジピン酸のチオエステルおよび補酵素Ａを５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡと呼ぶことにする）。

特定の実施形態では生体触媒は、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを脱水して５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡにするのを触媒する。

具体的にはこの生体触媒反応は、３−ヒドロキシアシル（チオ）エステルを脱水して２，３−デヒドロアシルチオエステルにするのを触媒することができる生体触媒の存在下で行うことができる。

したがってこのような触媒活性を有する酵素は、３−ヒドロキシアシル（エステルまたはチオエステル）デヒドラターゼと呼ぶことができる。したがって３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ−チオエステルに関してこのような触媒活性を有する酵素は、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼと呼ぶことができる。好ましくは前記３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、基質３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡに関して選択的である。

３−ヒドロキシアシル（エステルまたはチオエステル）を脱水して２，３−デヒドロアシル（エステルまたはチオエステル）にするのを触媒することができる酵素は、具体的にはヒドロリアーゼ（ＥＣ ４．２．１）の群から、好ましくはエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ ４．２．１．１７）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ ４．２．１．５５）、および長鎖エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ ４．２．１．７４）の群から選択することができる。３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ活性は、ＫＥＧＧデータベースにより、例えば脂肪酸代謝、ポリケチド合成、またはブタン酸代謝、ならびに芳香族化合物の分解において示されている。

３−ヒドロキシアシル（エステルまたはチオエステル）デヒドラターゼは、古細菌、細菌、および真核生物の群から、例えば酵母菌、真菌、および哺乳動物の群から選択される生物の３−ヒドロキシアシル（エステルまたはチオエステル）デヒドラターゼであり得る。

具体的には、上記で特定（「反応１」参照）したような有機化合物、具体的には芳香族化合物、脂環式化合物、またはジカルボン酸を分解する能力のある微生物が、２，３−デヒドロアジピン酸（エステルまたはチオエステル）の調製を触媒する生体触媒にとって好ましい供給源である。

芳香族化合物、脂環式化合物、またはジカルボン酸を分解することができる微生物には、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）（具体的にはアシネトバクター種ＡＤＰ１株（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＡＤＰ１）およびＡ．カルコアセティカス（Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ））、アルカリゲネス属（Ａｌｉｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（具体的にはアルカリゲネスＤ２（Ａｌｉｃａｌｉｇｅｎｅｓ Ｄ２））、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（具体的にはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））、アゾアルカス属（Ａｚｏａｒｃｕｓ）（具体的にはＡ．エバンシー（Ａ．ｅｖａｎｓｉｉ））、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（具体的にはＢ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ））、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（具体的にはＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）およびＣ．オーランチアカム（Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ））、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノイロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）（具体的にはアカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ））、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（具体的にはＰ．クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）および蛍光菌（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、ロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＲ．パルストリス（Ｒ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ））、ロドコッカス属（Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）（具体的にはロドコッカス種ＲＨＡ１株（Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＲＨＡ１））が挙げられる。

３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡに作用するＥＣ ４．２．１．１７の酵素をもたらす好ましい生物には、哺乳動物および微生物の群から選択される生物が挙げられる。哺乳動物由来のＥＣ ４．２．１．１７の好適な酵素は、具体的にはウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、およびイノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）の群から選択される哺乳動物由来のものであり得る。微生物由来のＥＣ ４．２．１．１７の好適な酵素は、具体的にはエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＡ．キャビエ（Ａ．ｃａｖｉａｅ））、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）（具体的にはＣ．アセトブチリクム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍｉ））、ゴッシピウム属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）（具体的には４倍体栽培ワタ（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ））、ロドスピリラム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、（具体的にはＲ．ラブラム（Ｒ．ｒｕｂｒｕｍｉ）、およびラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）（具体的にはラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ））の群から選択される微生物由来のものであり得る。

（嫌気性）脂肪酸生合成能力のある微生物もまた好ましい。このような微生物には、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）（具体的にはＣ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）およびＣ．クライベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ））、ユーグレノゾア属（Ｅｕｇｌｅｎｏｚｏａ）（具体的にはユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ））、メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）（具体的にはＭ．エルスデニ（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ））、およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（具体的にはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））が挙げられる。

好適な酵素は、具体的には配列番号１４、２７、２８、３０〜４１、９２、またはそのホモログのいずれかに一致するアミノ酸配列を含むことができる。

［２，３−デヒドロアジピン酸（エステルまたはチオエステル）からアジピン酸（エステルまたはチオエステル）の調製（「反応４」）］
一実施形態ではアジピン酸（エステルまたはチオエステル）は、２，３−デヒドロアジピン酸（エステルまたはチオエステル）から調製される。アジピン酸（エステルまたはチオエステル）は、例えばＣ_２〜Ｃ_３二重結合の選択的水素化により、または生体触媒作用により２，３−デヒドロアジピン酸（エステルまたはチオエステル）から化学的に調製することができる。

一般にはこの２，３−デヒドロアジピン酸は、上記のように活性基を備えている。

アジピン酸（エステルまたはチオエステル）は、好ましくは、５−カルボキシ−２−ペンテン酸（エステルまたはチオエステル）の炭素−炭素二重結合の水素化を触媒する少なくとも１種類の生体触媒を用いて２，３−デヒドロアジピン酸（エステルまたはチオエステル）から調製される。

本発明の好ましい方法ではこの調製は、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ ２−エノイル（エステルまたはチオエステル）のアシル（エステルまたはチオエステル）への還元を触媒することができる生体触媒の存在下での生体触媒反応を含む。この生体触媒は、ある範囲の電子供与体、例えばＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤＨ_２、および還元フェレドキシンの群から選択される電子供与体を使用することができる。電子は、電子供与体から生体触媒へ直接伝達することができ、また別法では、特にいわゆる電子伝達フラボタンパク質（ＥＴＦ）が介在することもできる。したがってこのような触媒活性を有する酵素を、２−エノイル（エステルまたはチオエステル）レダクターゼ（ＥＲ）と呼ぶことができる。したがって２−エノイルＣｏＡ−チオエステルに関してこのような触媒活性を有する酵素を、２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼと呼ぶことができる。好ましくは前記２−エノイルＣｏＡレダクターゼは、基質２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡに関して選択的である。

２−エノイル（エステルまたはチオエステル）の還元を触媒することができる酵素は、具体的にはオキシドレダクターゼ（ＥＣ １．３．１およびＥＣ １．３．９９）の群から、好ましくはエノイル−ＣｏＡレダクターゼＥＣ １．３．１．８、ＥＣ １．３．１．３８、およびＥＣ １．３．１．４４の群から、またエノイル−［アシル−キャリアタンパク質］レダクターゼＥＣ １．３．１．９、ＥＣ １．３．１．１０、およびＥＣ １．３．１．３９の群から、またブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．２）、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．３）、および長鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．１３）の群から選択することができる。ｔｒａｎｓ−２−エノイル（エステルまたはチオエステル）レダクターゼ活性は、ＫＥＧＧデータベースにより、例えば脂肪酸代謝、ポリケチド合成、ブタン酸代謝、およびミトコンドリア脂肪酸生合成において示されている。

原則としては２−エノイル（エステルまたはチオエステル）レダクターゼは、任意の生物から得るか、または誘導することができる。具体的にはその生物は、細菌、古細菌、または真核生物から、例えば、酵母菌、真菌、原生生物、植物、および動物（ヒトを含めた）の群から選択することができる。

一実施形態ではこの生物は、細菌、すなわち大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（具体的にはＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）（具体的にはＣ．クライベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、Ｃ．ベイジュリンキ（Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、およびウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）（具体的にはＳ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）および放線菌（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ））、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）およびＰ．エールギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シェワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ザントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、キシレラ属（Ｘｙｌｅｌｌａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）（具体的にはＴ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ））、エロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）（具体的にはエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ））、マイクロシーラ属（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ）（具体的にはマイクロシーラ・マリナ（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ））、メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）（具体的にはメガスフェラ・エルスデニ（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ））、デイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）（具体的にはデイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｕｒａｎｓ））、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）（例えば、アルカン資化酵母（Ｙ．ｌｙｐｏｌｙｔｉｃａ））、およびユウバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、Ｅ．ピルバチボランス（Ｅ．ｐｙｒｕｖａｔｉｖｏｒａｎｓ））から選択することができる。

一実施形態では２−エノイル（エステルまたはチオエステル）レダクターゼは、ユーグレノゾア属（Ｅｕｇｌｅｎｏｚｏａ）の群から選択される生物体由来のもの、具体的にはユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）である。

一実施形態では２−エノイル（エステルまたはチオエステル）レダクターゼは、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（具体的にはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）（具体的にはＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ））、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（具体的には分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ））、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）（具体的にはＣ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ））の群から選択される生物由来のものである。

一実施形態では２−エノイル（エステルまたはチオエステル）レダクターゼは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（具体的にはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）およびＡ．ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ））、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（具体的にはＰ．クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））の群から選択される生物由来のものである。

一実施形態では２−エノイル（エステルまたはチオエステル）レダクターゼは、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（具体的にはシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ））の群から選択される生物由来のものである。

一実施形態では２−エノイル（エステルまたはチオエステル）レダクターゼは、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、イングリッシュ・モルモット種（Ｃａｖｉａ ｓｐ．）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、およびキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の群から選択される。

好適な酵素は、具体的には配列番号４２〜６７、９４、９６、９８、１００、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、またはそのホモログのいずれかに一致するアミノ酸配列、特に配列番号６０、６３、９６、１００、またはそのホモログのいずれかに一致するアミノ酸配列を含むことができる。「反応４」を触媒するのに適した酵素をコードするヌクレオチド配列の実例は、２−エノイル（エステルまたはチオエステル）レダクターゼ９３、９５、９７、９９、１０４、１０６、１０８、１１０、および１１２によって表される。

有利な実施形態では、２−エノイル（エステルまたはチオエステル）レダクターゼに加えてＥＴＦが使用され、これは前記レダクターゼの活性に役立つ場合がある。このようなＥＴＦは、上記で特定したようなレダクターゼをそれから得るか、または誘導することができる生物体から得るか、または誘導することができる。具体的にはこれは、その使用されるレダクターゼと同じ属の、より具体的には同じ種の生物から得ることか、またはそれから誘導することができる。これら特異的ＥＴＦは、配列番号１０２、１０３、１１５、１１６によって表されるアミノ酸配列を含む。配列番号１０１および１１４は、ある特異的ＥＴＦをコードするヌクレオチド配列を表す。一般にこのようなＥＴＦは、２つの異なる遺伝子によってコードされる２つのサブユニット（ｅｔｆＡおよびｅｔｆＢ）を含む。これらは、ＥＴＦタンパク質を活性にするために一般に併用される。例えば、配列番号１０２と配列番号１０３の組合せ、または配列番号１１６と配列番号１１５の組合せを使用することができる。当業者は、当該技術分野で本来知られている他の適切なＥＴＦの組合せを選択することができるはずである。

本発明の一実施形態では、本質的に所望の活性または基質特異性を有しない生体触媒を、当該技術分野で知られている方法によって、例えば合理的設計または分子進化によって改変して、望ましい速度または選択率で２，３−デヒドロアジピン酸（エステルまたはチオエステル）のアジピン酸（エステルまたはチオエステル）への転化を触媒する能力のある変異体を作り出すことができる。６個の鎖長を有する２−エノイル−ＣｏＡ誘導体による活性を有する生体触媒、具体的にはＣ．クライベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）、イングリッシュ・モルモット種（Ｃａｖｉａ ｓｐ．）、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、およびＥ．ピルバチボランス（Ｅ．ｐｙｒｕｖａｔｉｖｏｒａｎｓ）由来のそのような生体触媒が好ましい。

［アジピン酸の調製（「反応７」）］
本発明によればアジピン酸エステルまたはチオエステルを用いて、そのエステルまたはチオエステル結合の加水分解によってアジピン酸を調製することができる。これは化学的に、例えば酸または塩基の存在下での化学的加水分解により、あるいは生体触媒作用により達成することができる。

本発明の好ましい方法ではこの調製は、アシル（チオ）エステルの加水分解を触媒することができる生体触媒の存在下での生体触媒反応を含む。

したがってこのような触媒活性を有する酵素を、アシル（チオ）エステルヒドロラーゼと呼ぶことができる。したがってアシル−ＣｏＡチオエステルに関してこのような触媒活性を有する酵素をアシル−ＣｏＡヒドロラーゼと呼ぶことができる。好ましくは前記アシル−ＣｏＡヒドロラーゼは、基質アジピル−ＣｏＡに関して選択的である。

アシル（チオ）エステルの加水分解を触媒することができる酵素は、具体的にはヒドロラーゼ（ＥＣ ３．１．２）の群から、好ましくはアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ ３．１．２．２０）、アセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ ３．１．２．１）、長鎖脂肪−アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ ３．１．２．２）、スクシニル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ ３．１．２．３）、およびアシル−［アシル−キャリアタンパク質］ヒドロラーゼ（ＥＣ ３．１．２．１４）の群から選択することができる。

この生体触媒は、古細菌、細菌、または真核生物を含めた任意の生物に由来する酵素を含むことができる。

具体的にはこの生体触媒は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）（具体的にはブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ））、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（具体的にはＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））、ザントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）（具体的にはシノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ））、根粒菌属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）（具体的にはミヤコグサ根粒菌（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ））、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）（具体的にはＳ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）および放線菌（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ））、ロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（具体的にはロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ））、キシレラ属（Ｘｙｌｅｌｌａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）およびＰ．エールギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、シェワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ハイフォモナス属（Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ）（具体的にはハイフォモナス・ネプチュニウム（Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｎｅｐｔｕｎｉｕｍ））、およびプロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の群から選択される細菌の酵素を含むことができる。

好適な生体触媒は、具体的にはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（具体的にはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））およびクルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）（具体的にはＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ））の群から選択される酵母菌中に見出すことができる。

好適な生体触媒は、具体的にはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（具体的にはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、およびＡ．ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ））、およびペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（具体的にはＰ．クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））の群から選択される真菌中に見出すことができる。

さらなる実施形態では生物は、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（具体的にはシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ））、ネズミ科（Ｍｕｒｉｄａｅ）（具体的にはドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、ウシ科（Ｂｏｖｉｄａｅ）（具体的にはウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、ヒツジ（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ））、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、セノラブディチス属（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ）（具体的には線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ））の群から選択される。

本発明の一実施形態では本質的に所望の活性または基質特異性を有しない生体触媒を、当該技術分野で知られている方法によって、例えば合理的設計または分子進化によって改変して、アジピン酸エステルまたはチオエステルをアジピン酸に効率的に転化することができる変異体を作り出すことができる。好ましくはジカルボン酸を含めたＣ_４〜Ｃ_８酸のアシル−ＣｏＡ誘導体による初期活性を有する生体触媒が好ましい。例えば変異体を、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕａ）由来のアシル−ＣｏＡ−チオエステラーゼ（例えば、配列番号７３で与えられる）に基づいて作り出すことができる。

本発明の特定の実施形態ではこの調製は、活性基の転移を触媒することができる生体触媒、具体的にはエステルまたはチオエステル、最も具体的にはＣｏＡの存在下での生体触媒反応を含む。

したがってこのような触媒活性を有する酵素を、ＣｏＡトランスフェラーゼと呼ぶことができる。好ましくは前記ＣｏＡトランスフェラーゼは、ＣｏＡ供与基質としてのジカルボン酸−ＣｏＡに関して選択的である。より好ましくは前記ジカルボン酸−ＣｏＡはアジピル−ＣｏＡである。好ましくは前記ＣｏＡトランスフェラーゼは、ＣｏＡ受容基質としての酢酸に関して選択的である。

ＣｏＡ基の転移を触媒することができる酵素は、具体的にはＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．８．３）の群から、好ましくはジカルボン酸ＣｏＡ：ジカルボン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、アジピン酸ＣｏＡ：スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．８．３．５）、３−オキソアジピン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．８．３．６）、および酢酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．８．３．８）の群から選択することができる。

ＣｏＡトランスフェラーゼは、原則として任意の生物から得るか、またはそれから誘導することができる。この生物は、細菌、古細菌、または真核生物であり得る。具体的にはジカルボン酸、特にアジピン酸を分解する能力のある生物体が好ましい。

この生物は、具体的にはアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）（具体的にはアシネトバクターＡＤＰ１株（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｔｒａｉｎ ＡＤＰ１）およびＡ．カルコアセティカス（Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ））、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）（具体的にはＣ．クライベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、またはＣ．ベイジュリンキ（Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ））、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）および蛍光菌（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ））、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アルスロバクター属（Ａｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、アゾモナス属（Ａｚｏｍｏｎａｓ）、アゾスピリルム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ベイジュリンキア属（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ブルクホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノルカジア属（Ｎｏｒｃａｄｉａ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびロゼブリア種（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｓｐ．）の群から選択される細菌であり得る。

この生物は、具体的にはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（具体的にはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（具体的にはＰ．クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））、およびノイロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）の群から選択される酵母菌または真菌であり得る。

具体的には好適なＣｏＡトランスフェラーゼは、ヒト科（Ｈｏｍｉｎｉｄｅａ）由来の、より具体的にはホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）由来の種から得るか、またはそれから誘導することができる。

反応７のための好適な酵素は、具体的には配列番号６８〜７３、８５、１１６、１１７、１１９〜１２４、またはそのホモログのいずれかに一致するアミノ酸配列を含むことができる。

チオエステルからのアジピン酸の調製は、具体的には、配列番号６８〜７３、１１７、１１９、またはそのホモログのいずれかに一致するアミノ酸配列を含むアシル−ＣｏＡヒドロラーゼを含む生体触媒によって触媒することができる。

チオエステルからのアジピン酸の調製は、具体的には、配列番号８５、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、またはそのホモログのいずれかに一致するアミノ酸配列を含むＣｏＡトランスフェラーゼを含む生体触媒によって触媒することができる。

このＣｏＡ−トランスフェラーゼは、単一遺伝子によって、または２つ以上の遺伝子によってコードされ得る。例えば、幾つかのＣｏＡ−トランスフェラーゼは、２つの異なる遺伝子によってコードされる２つのサブユニットを含む。これらは、ＣｏＡトランスフェラーゼタンパク質を活性にするために一般に併用される。例えば、配列番号１２１の配列番号１２２との、または配列番号１２５の配列番号１２６との組合せを使用することができる。

［アジピン酸エステルまたはアジピン酸チオエステルからの５−ＦＶＡの調製（「反応５」）］
一実施形態では５−ホルミルペンタン酸（５−ＦＶＡ）が、アジピン酸エステルまたはアジピン酸チオエステルから調製される。これは化学的または生体触媒作用により行うことができる。このアジピン酸は、具体的には上記のようにＣｏＡまたは別の活性基と結合してもよい。

具体的には本発明はまた、アジピン酸エステルまたはアジピン酸チオエステルから５−ＦＶＡを調製するための方法、具体的にはアシルエステルまたはチオエステルのアルデヒドへの還元を触媒することができる生体触媒の存在下でアジピル−ＣｏＡチオエステルから５−ＦＶＡを調製するための方法を提供する。

したがってこのような触媒活性を有する酵素を、アルデヒドデヒドロゲナーゼと呼ぶことができる。したがってアシルエステルまたはアシルチオエステル―例えばアシル−ＣｏＡチオエステル―に関してこのような触媒活性を有する酵素を、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）と呼ぶことができる。好ましくはこの生体触媒―アルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）を含む―は、基質アジピン酸エステルまたはチオエステルに関して選択的である。

アシル（チオ）エステルの還元を触媒することができる酵素は、具体的にはオキシドレダクターゼ（ＥＣ １．２．１）の群から、好ましくはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（ＥＣ １．２．１．１０）、脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．４２）、長鎖脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．５０）、ブタナールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．５７）、およびコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）の群から選択することができる（例えば、Ｓｏｈｌｉｎｇらの論文、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１〜８８０参照）。

アルデヒドデヒドロゲナーゼは、原則としては任意の生物から得るか、またはそれから誘導することができる。この酵素はまた、コード化核酸の直接単離およびそれに続く異種宿主中での活性の測定によって、またはそのメタゲノムＤＮＡ中に見出される配列相同性によってメタゲノム源から得ることができる。この生物は、細菌、古細菌、または真核生物であり得る。具体的にはこの生物は細菌から、より具体的には大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）（具体的にはＣ．クライベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、Ｃ．ベイジュリンキ（Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、Ｃ．ボチリクム（Ｃ．ｂｏｔｙｌｉｃｕｍ）、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）、ウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、およびＣ．ノビイ（Ｃ．ｎｏｖｙｉ））、ポルフィロモナス・ギンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、プロピオニバクテリウム属（具体的にはＰ.フリューデンレイッヒイ（Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ））、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（具体的にはＬ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（具体的にはＢ．チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ブルクホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）（具体的にはＢ．タイランデンシス（Ｂ．ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）およびＢ．マレイ（Ｂ．ｍａｌｌｅｉ））、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ））、ロドコッカス属（Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）（具体的にはＲ．種ＲＨＡ１（Ｒ．ｓｐ．ＲＨＡ１））、およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（具体的にはネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））の群の中から選択することができる。この生物はまた、真核生物、より具体的にはジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）（具体的にはランブル鞭毛虫（Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ））、エントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）（具体的には赤痢アメーバ（Ｅ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ））、マスチガモエバ・バラムチ（Ｍａｓｔｉｇａｍｏｅｂａ ｂａｌａｍｕｔｈｉ）、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ポリトメラ属（Ｐｏｌｙｔｏｍｅｌｌａ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、およびスピロヌクレウス・バルカヌス（Ｓｐｉｒｏｎｕｃｌｅｕｓ ｂａｒｋｈａｎｕｓ）の群の中から選択することができる。

好適なデヒドロゲナーゼは、具体的には配列番号７４〜８１、１３９〜１４８、またはそのホモログのいずれかに一致するアミノ酸配列を含むことができる。

本発明の一実施形態では、本質的に所望の活性または基質特異性を有しない生体触媒を、当該技術分野で知られている方法によって、例えば合理的設計または分子進化によって改変して、アジピン酸エステルまたはチオエステルを５−ＦＶＡに転化する能力のある変異体を作り出すことができる。これらには限定されないが、Ｃ．クライベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）（配列番号７４）またはＰ．ギンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（配列番号７５）由来のコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）と、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（配列番号８０、８１）またはプロピオニバクテリウム・フリューデンレイッヒイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）（配列番号７９）由来のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）などの生体触媒を含めた、４〜８個の鎖長を有するアシルＣｏＡ誘導体によるアシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼを有する生体触媒が好ましい。

［アジピン酸からの５−ＦＶＡの調製（「反応８」）］
本発明によればアジピン酸を用いて、そのカルボン酸基の１つを還元することによって５−ＦＶＡを調製することができる。これは化学的に、例えば、任意選択で１つのカルボン酸基を保護することを含む選択的な化学的還元により、あるいは生体触媒作用により達成することができる。本発明の好ましい実施形態ではこの調製は、カルボン酸の還元を触媒することができる生体触媒の存在下での生体触媒反応を含む。この生体触媒は、電子供与体としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用することができる。

したがってこのような触媒活性を有する酵素は、アルデヒドデヒドロゲナーゼと呼ぶことができる。好ましくは前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、基質アジピン酸に関して選択的である。

カルボン酸の還元を触媒することができる酵素は、具体的にはオキシドレダクターゼ（ＥＣ １．２．１）の群から、好ましくはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．３、ＥＣ １．２．１．４、およびＥＣ １．２．１．５）、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．１５）、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．１６およびＥＣ １．２．１．２４）、グルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．２０）、アミノアジピン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．３１）、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼと呼ぶこともできるアジピン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．６３）の群から選択することができる。アジピン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、例えばＫＥＧＧデータベース中でカプロラクタム分解経路の中に述べられている。具体的には６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼを使用することができる。６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼの例は、配列番号１２７、１２８、またはそのホモログによって表される配列を含む酵素である。

アルデヒドデヒドロゲナーゼは、原則としては任意の生物から得るか、または誘導することができる。この生物は、原核生物または真核生物であり得る。具体的にはこの生物は、細菌、古細菌、酵母菌、真菌、原生生物、植物、および動物（ヒトを含めた）であり得る。

一実施形態ではその細菌は、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）（具体的にはアシネトバクター種ＮＣＩＭＢ９８７１（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＮＣＩＭＢ９８７１）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ブルクホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ザントバクター属（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ニトロバクター属（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）（具体的にはＢ．メリテンシス（Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ））、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（具体的にはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびフラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の群から選択される。

一実施形態では生物は、酵母菌および真菌の群から、具体的にはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（具体的にはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）およびＡ．ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ））およびペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（具体的にはＰ．クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））の群から選択される。

一実施形態では生物は植物、具体的にはシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、より具体的にはシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）である。

［６−ＡＣＡの調製（「反応６」）］
本発明の一実施形態では５−ＦＶＡを用いて６−ＡＣＡを調製する。

一実施形態では６−ＡＣＡは、５−ＦＶＡとヒドロキシルアミンの反応によって調製される６−オキシモカプロン酸のＰｔＯ_２による水素化によって得られる（例えば、その同族の１２−アミノドデカン酸の合成についてのＦ．Ｏ．Ａｙｏｒｉｎｄｅ，Ｅ．Ｙ．Ｎａｎａ，Ｐ．Ｄ．Ｎｉｃｅｌｙ，Ａ．Ｓ．Ｗｏｏｄｓ，Ｅ．Ｏ．Ｐｒｉｃｅ，Ｃ．Ｐ．Ｎｗａｏｎｉｃｈａの論文、Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，７４，５３１〜５３８を参照されたい）。

６−ＡＣＡは、欧州特許第Ａ−６２８ ５３５号明細書またはドイツ特許第４ ３２２ ０６５号明細書中に９−アミノノナン酸（９−アミノペラルゴン酸）および１２−アミノドデカン酸（１２−アミノラウリン酸）について述べられているように、水素化触媒、例えば支持体ＳｉＯ_２／Ａｌ_２Ｏ_３上に坦持されたＮｉにより５−ＦＶＡをアンモニアで還元的アミノ化することによって高収率で調製することができる。

さらなる実施形態では６−ＡＣＡは、生体触媒作用により調製される。好ましい方法では５−ＦＶＡからの６−ＡＣＡの調製は、アミノ基供与体の存在下でアミノ交換反応を触媒することができ、アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１）の群から選択される酵素の存在下での酵素的反応を含む。

一般には好適なアミノトランスフェラーゼは、５−ＦＶＡの６−ＡＣＡへの転化を触媒することができる６−ＡＣＡ ６−アミノトランスフェラーゼ活性を有する。

具体的にはこのアミノトランスフェラーゼは、哺乳動物、もしくはメルクリアリス属（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ）、具体的にはメルクルアリス・ペレンニス（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ ｐｅｒｅｎｎｉｓ）、より具体的にはメルクルアリス・ペレンニス（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ ｐｅｒｅｎｎｉｓ）の苗条、もしくはアスプレニウム属（Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ）、より具体的にはホウビシダ（Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ ｕｎｉｌａｔｅｒａｌｅ）またはアスプレニウム・セプテントリオナーレ（Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ ｓｅｐｔｅｎｔｒｉｏｎａｌｅ）、もしくは長角果属（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ）、より具体的にはイナゴマメ（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ ｓｉｌｉｑｕａ）、もしくはロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、具体的にはロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｓｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、もしくはスタヒロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、具体的には黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、もしくはビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、具体的にはビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、もしくはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、具体的にはシュードモナス・エールギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、もしくはロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、もしくはバシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、具体的にはバシルス・ウェイヘンステファネンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）およびバシルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、もしくはレジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、もしくはニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍａｓ）、もしくはナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、もしくは酵母菌、具体的にはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のアミノトランスフェラーゼの中から選択することができる。

酵素が哺乳動物のものである場合、それは具体的には哺乳動物の腎臓によって、哺乳動物の肝臓に、哺乳動物の心臓に、または哺乳動物の脳に由来し得る。例えば好適な酵素は、哺乳動物の腎臓由来のβ−アミノイソ酪酸：α−ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼ、具体的にはブタの腎臓由来のβ−アミノイソ酪酸：α−ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼと、哺乳動物の肝臓由来のβ−アラニンアミノトランスフェラーゼ、具体的にはウサギの肝臓由来のβ−アラニンアミノトランスフェラーゼと、哺乳動物の心臓由来のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、具体的には子ブタの心臓由来のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼと、哺乳動物の肝臓由来の４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、具体的には子ブタの肝臓由来の４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼと、哺乳動物の脳由来の４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、具体的にはヒト、子ブタ、またはラットの脳由来の４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼと、ノイロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）由来のα−ケトアジピン酸：グルタミン酸アミノトランスフェラーゼ、具体的にはアカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）由来のα−ケトアジピン酸：グルタミン酸アミノトランスフェラーゼと、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、またはサーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）由来のα−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、具体的にはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のα−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼと、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、具体的にはクロストリジウム・アミノバレリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃｕｍ）由来の５−アミノ吉草酸アミノトランスフェラーゼとの群の中から選択することができる。好適な２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼは、例えばピロバクルム・イソランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）によって得ることができる。

特定の実施形態では配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、またはこれらの配列のいずれかのホモログに一致するアミノ酸配列を含むアミノトランスフェラーゼが使用される。配列番号８６（野生型）および８８（コドン最適化）は、配列番号８２（＝８７）によって表される酵素をコードする配列を表す。配列番号８９（野生型）および９１（コドン最適化）は、配列番号８３（＝９０）によって表される酵素をコードする配列を表す。配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７は、それぞれ配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８のコード配列を表す。

具体的にはそのアミノ基供与体は、アンモニア、アンモニウムイオン、アミン、およびアミノ酸の群から選択される。好適なアミンは、第一アミンおよび第二アミンである。このアミノ酸は、Ｄ−またはＬ−立体配置を有することができる。アミノ基供与体の例は、アラニン、グルタミン酸、イソプロピルアミン、２−アミノブタン、２−アミノヘプタン、フェニルメタンアミン、１−フェニル−１−アミノエタン、グルタミン、チロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、β−アミノイソ酪酸、β−アラニン、４−アミノ酪酸、およびα−アミノアジピン酸である。

さらに好ましい実施形態では６−ＡＣＡの調製方法は、供与体のＣＨ−ＮＨ_２基に作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ １．４）の群から、具体的にはアミノ酸オキシドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１）の群から選択されるアンモニア源の存在下において還元的アミノ化を触媒することができる酵素の存在下での生体触媒反応を含む。一般には好適なアミノ酸デヒドロゲナーゼは、５−ＦＶＡの６−ＡＣＡへの転化を触媒する６−アミノカプロン酸６−デヒドロゲナーゼ活性を有するか、またはＡＫＰのＡＡＰへの転化を触媒するα−アミノピメリン酸２−デヒドロゲナーゼ活性を有する。具体的には好適なアミノ酸デヒドロゲナーゼは、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．１６）、リシン６−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．１８）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．３、ＥＣ １．４．１．４）、およびロイシンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．９）の群の中から選択される。

一実施形態ではアミノ酸デヒドロゲナーゼは、受容体としてのＮＡＤまたはＮＡＤＰと共に働くグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．３）、受容体としてのＮＡＤＰと共に働くグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．４）として、ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．９）として、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．１６）として、およびリシン６−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．１８）として分類されるアミノ酸デヒドロゲナーゼの中から選択することができる。

アミノ酸デヒドロゲナーゼは、具体的にはコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）と、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、具体的にはプロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）と、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、具体的にはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）と、ジオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、具体的にはジオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）と、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、具体的にはアシネトバクター種ＡＤＰ１（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＤＰ１）と、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、具体的にはラルストニア・ソラナセラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）と、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、具体的にはネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）と、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、具体的にはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）と、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、具体的にはブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）と、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、具体的にはバシルス・スパリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バシルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、またはバシルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）との群から選択される生物体に由来し得る。例えば好適なアミノ酸デヒドロゲナーゼは、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、具体的にはバシルス・スパリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）由来のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼと、ブレビバクテリウム種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）由来のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼと、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼと、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）由来のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、具体的にはプロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼと、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、具体的にはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のリシン６−デヒドロゲナーゼと、ジオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、具体的にはジオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のリシン６−デヒドロゲナーゼと、アシネトバクター属由来の、補因子としてのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨと共に働くグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．３）、具体的にはアシネトバクター種ＡＤＰ１（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＤＰ１）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼと、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．３）、具体的にはラルストニア・ソラナセラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼと、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）由来の補因子としてのＮＡＤＰＨと共に働くグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．４）、具体的にはネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼと、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．４）、具体的にはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼと、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．４）、具体的にはブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼと、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のロイシンデヒドロゲナーゼ、具体的にはバシルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）またはバシルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のロイシンデヒドロゲナーゼとの中から選択することができる。

一実施形態では本発明の方法で調製した６−ＡＣＡは、カプロラクタムの調製に使用される。このような方法はその６−アミノカプロン酸を、任意選択で生体触媒の存在下で環化することを含む。

本発明の脈略における任意の生体触媒段階の反応条件は、その生体触媒、具体的には酵素にとって既知の条件、本明細書中で開示した情報、および任意選択でいくつかの通常の実験に応じて選ぶことができる。

原則としてはその使用される反応媒体のｐＨは、そのｐＨ条件下でその生体触媒が活性である限り、広い限度内で選択することができる。その生体触媒および他の要因に応じてアルカリ性、中性、または酸性条件を使用することができる。その方法が、例えば、本発明の方法を触媒する酵素を発現させるために微生物の使用を含む場合、ｐＨは、この微生物がその意図する機能または複数機能を果たすことができるように選択される。ｐＨは、具体的には中性ｐＨ未満の４つのｐＨ単位量および中性ｐＨを超える２つのｐＨ単位量の範囲内、すなわち２５℃の本質的に水性系の場合にはｐＨ３とｐＨ９の間の範囲内から選択することできる。系は、水が唯一の溶媒であるか、あるいは水が支配的な溶媒（全液体を基準にして＞５０重量％、具体的には＞９０重量％）であり、例えば、存在する微生物が活性な状態のままであるような濃度で少ない方の量（全液体を基準にして＜５０重量％、具体的には＜１０重量％）のアルコールまたは別の溶媒が溶解（例えば炭素源として）している場合、水性であるとみなす。具体的には酵母菌および／または真菌を使用する場合、酸性条件が好ましい可能性があり、具体的にはそのｐＨは、２５℃における基本的に水性の系を基準にしてｐＨ３からｐＨ８の範囲内にあることができる。所望される場合にはｐＨは、酸および／または塩基を用いて調整することも、また酸および塩基の適切な組合せにより緩衝することもできる。

原則としてはインキュベーション条件は、その生体触媒が十分な活性および／または成長を示す限り、広い限度内で選択することができる。これには好気性条件、微好気性条件、酸素制限条件、および嫌気性条件が含まれる。

本明細書中では嫌気性条件は、酸素が全く存在しないか、またはその生体触媒、具体的には微生物によって実質上酸素が消費されない条件と定義され、一般にはこれは５ｍｍｏｌ／Ｌ・時未満、具体的には２．５ｍｍｏｌ／Ｌ・時未満、または１ｍｍｏｌ／Ｌ・時未満の酸素消費量に相当する。

好気性条件は、媒体中に無制限な成長にとって十分なレベルの酸素を溶解し、少なくとも１０ｍｍｏｌ／Ｌ・時の、より好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ・時を超える、さらに一層好ましくは５０ｍｍｏｌ／Ｌ・時を超える、最も好ましくは１００ｍｍｏｌ／Ｌ・時を超える酸素消費速度を支えることができる条件である。

酸素制限条件は、酸素消費が気体から液体への酸素移動によって制限される条件と定義される。酸素制限条件の下限値は、嫌気性条件の上限値、すなわち一般には少なくとも１ｍｍｏｌ／Ｌ・時、具体的には少なくとも２．５ｍｍｏｌ／Ｌ・時、または少なくとも５ｍｍｏｌ／Ｌ・時によって決まる。酸素制限条件の上限値は、好気性条件の下限値、すなわち１００ｍｍｏｌ／Ｌ・時未満、５０ｍｍｏｌ／Ｌ・時未満、２０ｍｍｏｌ／Ｌ・時未満、または１０ｍｍｏｌ／Ｌ・時未満によって決まる。

それら条件が好気性であるか、嫌気性であるか、または酸素制限であるかは、その方法を実施する条件、具体的には入ってくる気体流の量および組成、使用する設備の実際の混合／物質移動特性、使用する微生物の種類、および微生物密度によって決まる。

原則としてその使用される温度は、その生体触媒、具体的には酵素が事実上の活性を示す限り重要でない。一般には温度は少なくとも０℃、具体的には少なくとも１５℃、より具体的には少なくとも２０℃であり得る。望ましい最高温度は、その生体触媒によって決まる。一般にそのような最高温度は当該技術分野で知られており、例えば市販の生体触媒の場合は製品データシートに示されているか、または普通の一般知識および本明細書中で開示する情報に基づいて日常的に決めることができる。温度は、一般には９０℃以下、好ましくは７０℃以下、具体的には５０℃以下、またはより具体的には４０℃以下である。

さらに、溶媒、追加の試薬、および更なる助剤、例えば補因子（例えば、ＦＡＤ／ＦＡＤＨおよび／またはＮＡＤ／ＮＡＤＨ補因子）は、特定の反応を達成または促進させるように周知の反応原理に基づいて選択することができ、かつ／または測定値を、望ましい側に平衡を移動させるように持っていくことができる。具体的には、生体触媒反応が宿主生物の外側で行われる場合、そのような媒体中で十分な活性を保持する酵素が使用される場合には有機溶媒を含む反応媒体を、高濃度（例えば５０重量％を超える、または９０重量％を超える）で使用することができる。

本発明の方法に使用されるコハク酸（エステルまたはチオエステル）および酢酸（エステルまたはチオエステル）は、原則として任意の方法で得ることができる。

コハク酸は、例えば、細胞代謝におけるクエン酸回路（クレブス回路）の中間体または最終産物として天然に形成される。したがってそれは、適切な生体触媒を使用することによって再生可能な炭素源から得ることができる。生体触媒、具体的には微生物を用いて適切な炭素源からコハク酸を生成することができる。微生物は、原核生物または真核生物であり得る。微生物は、組換えまたは野生型であり得る。

組換え微生物では代謝を変えて、適切な炭素源に対するコハク酸の収率および生産能力を高めることができる。コハク酸生産を増大させる方法は、原核生物についてＳｏｎｇおよびＬｅｅの論文、Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，３９：３５２〜３６１中に記述されている。コハク酸はまた、真核生物中で産生させることもできる。さらに、また別法では米国特許出願第２００７／１１１２９４号明細書に記載のように適応進化を適用することもできる。

コハク酸エステルまたはチオエステルは、任意の方法でコハク酸から得ることができる。具体的にはコハク酸エステルまたはチオエステルは、生体触媒を使用することによってコハク酸から得ることができる。具体的にはスクシニル−ＣｏＡは、酸性チオールリガーゼ（ＥＣ ６．２．１）の群から、好ましくはスクシニル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ ６．２．１．４およびＥＣ ６．２．１．５）の群から選択される酵素を含む生体触媒を使用することによってコハク酸から得ることができる。さらに、また別法ではスクシニル−ＣｏＡは、反応７に関して指定したＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．８．３）の群から選択される酵素を含む生体触媒を使用することによってコハク酸から得ることができる。

コハク酸エステルまたはチオエステルはまた、コハク酸以外の分子から任意の方法で得ることもできる。具体的にはスクシニル−ＣｏＡは、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体を含む生体触媒を用いて２−オキソグルタル酸から得ることができる。２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体は、当業者に知られているＴＣＡ回路に関与する多酵素複合体である。さらに、また別法ではスクシニル−ＣｏＡは、２−オキソグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＥＣ １．２．７．３）を含む生体触媒を用いて２−オキソグルタル酸から得ることができる。

酢酸は、細胞代謝における天然の中間体または最終産物である。したがってこれは、適切な生体触媒を使用することによって再生可能な炭素源から得ることができる。生体触媒、具体的には微生物を用いて、適切な炭素源からコハク酸を生成することができる。この微生物は、原核生物または真核生物であり得る。微生物は、組換えまたは野生型であり得る。

酢酸エステルまたはチオエステルは、任意の方法で酢酸から得ることができる。具体的にはアセチル−ＣｏＡを、酸性チオールリガーゼ（ＥＣ ６．２．１）、好ましくはアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ ６．２．１．１およびＥＣ ６．２．１．１３）の群から選択される酵素を含む生体触媒を使用することによって酢酸から得ることができる。さらに、また別法ではアセチル−ＣｏＡは、反応７に関して指定したＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．８．３）の群から選択される酵素を含む生体触媒を用いて酢酸から得ることができる。

酢酸エステルまたはチオエステルはまた、酢酸以外の分子から任意の方法で得ることもできる。具体的にはアセチル−ＣｏＡは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ^＋）（ＥＣ １．２．１．５１）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＥＣ ２．３．１．５４）、あるいはピルビン酸をアセチル−ＣｏＡへ効果的に転化する生体触媒または酵素の群から選択される酵素を含む生体触媒を用いてピルビン酸から得ることができる。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体は、ピルビン酸をアセチル−ＣｏＡへ転化する多酵素複合体であり、当業者に知られている。

アセチル−ＣｏＡはまた、オキシドレダクターゼ（ＥＣ １．２．１）の群から、好ましくはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（ＥＣ １．２．１．１０）、脂肪アセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．４２）、ブタナールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．５７）、およびコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（Ｓｏｈｌｉｎｇらの論文、１９９６．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１〜８８０に記載されている）の群から選択される酵素を含む生体触媒を用いてアセトアルデヒドから得ることができる。

生体触媒が真核生物である場合、アセチル−ＣｏＡの供給、好ましくはその宿主細胞中の細胞質領域中での供給は、前駆分子のアセチル−ＣｏＡへの転化を触媒する酵素をコードする相同および／または非相同遺伝子を過剰発現させることによって増加させることができる。この前駆分子は、Ｓｈｉｂａらの論文、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００７，９：１６０〜８の記述のように、例えば酢酸であり得る。

本発明の有利な方法、具体的には６−ＡＣＡ、アジピン酸、あるいは６−ＡＣＡまたはアジピン酸の中間化合物の調製方法では、上記反応のいずれかを触媒する１種類または複数種類の酵素を生成する微生物と、その微生物用の炭素源との使用を含む、６−ＡＣＡ、アジピン酸、またはその中間体のための基質の全細胞生体内変換が利用される。

炭素源は、具体的には一価アルコール、多価アルコール、カルボン酸、二酸化炭素、脂肪酸、グリセリドの群から選択される少なくとも１種類の化合物（前記化合物のいずれかを含む混合物を含め）を含有することができる。好適な一価アルコールにはメタノールおよびエタノールが挙げられる。好適な多価アルコールにはグリセロールおよび炭水化物が挙げられる。好適な脂肪酸またはグリセリドは、具体的には食用油の形、好ましくは植物起源の形で得ることができる。

一般に炭水化物は、農産物、例えば農業廃棄物などの生物学的に再生可能な供給源から大量に得ることができるので、具体的には炭水化物を使用することができる。好ましくは使用される炭水化物は、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、サッカロース、デンプン、セルロース、およびヘミセルロースの群から選択される。グルコース、グルコースを含むオリゴ糖、およびグルコースを含む多糖が、特に好ましい。

本発明の特定の方法ではその方法は発酵法である。このような方法は、具体的には生体触媒を含む細胞―任意選択で本明細書中で述べた宿主細胞―を発酵性炭素源と接触させることを含み、その炭素源が、その調製される化合物へ転化されることになる前記化合物のいずれかを含有するか、あるいはその細胞が、その炭素源から調製される化合物へ転化されることになる化合物を調製する。

本発明の方法において反応段階を触媒するための１種類または複数種類の酵素を含む細胞は、それ自体が当該技術分野で知られている分子生物学の手法を用いて構築することができる。例えば、１種類または複数種類の生体触媒を異種系において産生させる場合、このような手法を用いて、前記生体触媒の１種類または複数種類をコードする１個または複数個の遺伝子を含むベクターを得ることができる。このような遺伝子の１個または複数個を含むベクターは、１個または複数個の調節エレメント、例えば生体触媒をコードする遺伝子に作動的に結合することができる１個または複数個のプロモーターを含むことができる。

本明細書中で使用される用語「作動的に結合した」とは、機能的な関係におけるポリヌクレオチドエレメント（あるいはコード配列または核酸配列）の結合を意味する。核酸配列は、それが別の核酸配列と機能的な関係に配置されている場合、「作動的に結合して」いる。例えばプロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、それはコード配列と作動的に結合している。

本明細書中で使用される用語「プロモーター」は、遺伝子の転写開始部位の転写の方向に関して上流に位置して１個または複数個の遺伝子の転写を制御するように機能し、かつＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する結合部位と、転写開始部位と、これらには限定されないが転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位、およびプロモーター由来の転写の量を調節するように直接または間接的にに働くことが当業者に知られているヌクレオチドの任意の他の配列を含めた任意の他のＤＮＡ配列との存在により構造的に識別される核酸フラグメントを意味する。「構成的」プロモーターは、大部分の環境および発生条件下で活性なプロモーターである。「誘導」プロモーターは、環境および発生制御下で活性なプロモーターである。所与の（組換え）核酸またはポリペプチド分子と所与の宿主生物または宿主細胞の間の関係を示すために使用される場合、用語「相同の」とは、自然界ではその核酸またはポリペプチド分子が、同一種の、好ましくは同一品種または株の宿主細胞または生物によって産生されることを意味するものと理解される。

本明細書中で上述したような本発明の方法に用いられる酵素をコードするヌクレオチド配列の発現を達成するために使用することができるプロモーターは、その発現される酵素をコードするヌクレオチド配列に生得のものであってもよく、またそれが作動的に結合しているヌクレオチド配列（コード配列）にとって異種であってもよい。好ましくはプロモーターは、その宿主細胞と相同、すなわち内因性である。

異種プロモーター（当該酵素をコードするヌクレオチド配列にとって）を使用する場合、この異種プロモーターは、そのコード配列に生得のものであるプロモーターと比べて、そのコード配列を含む転写産物のより高い定常状態のレベルを産生することができる（または、単位時間当たり、より多くの転写分子すなわちｍＲＮＡ分子を産生することができる）ことが好ましい。本発明の枠内で好適なプロモーターには、構成的および誘導性の両方の天然プロモーターと、改変プロモーターとが挙げられ、これらは当業者によく知られている。

「強力な構成的プロモーター」は、天然の宿主細胞と比べて、ｍＲＮＡに高頻度で開始させるものである。グラム陽性微生物におけるこのような強力な構成的プロモーターの例には、ＳＰ０１−２６、ＳＰ０１−１５、ｖｅｇ、ｐｙｃ（ピルビン酸カルボキシラーゼプロモーター）、およびａｍｙＥが挙げられる。

グラム陽性微生物における誘導プロモーターの例には、ＩＰＴＧ誘導Ｐｓｐａｃプロモーター、キシロース誘導ＰｘｙｌＡプロモーターが挙げられる。

グラム陰性微生物における構成的および誘導性プロモーターの例には、ｔａｃ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃｌｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ（Ｐ_ＢＡＤ）、ＳＰ６、λ−Ｐ_Ｒ、およびλ−Ｐ_Ｌが挙げられる。

核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）あるいはタンパク質に関して使用される場合、用語「異種」とは、それが存在する生物、細胞、ゲノム、もしくはＤＮＡまたはＲＮＡ配列の一部として天然には存在しない核酸またはタンパク質を指すか、あるいはそれが自然界に見出されるものとは異なる細胞中に、またはゲノムもしくはＤＮＡまたはＲＮＡ配列中の部位または複数部位中に見出される核酸またはタンパク質を指す。これら異種核酸またはタンパク質は、それが導入される細胞にとって内因性ではないが、別の細胞から得られたか、あるいは合成的または組換えにより生成されたものである。必ずそうとは限らないが、一般にそのような核酸は、そのＤＮＡが転写または発現される細胞により普通では産生されないタンパク質をコードする。同様に外因性ＲＮＡは、その外因性ＲＮＡが存在する細胞中で普通では発現されないタンパク質をコードする。これら異種核酸およびタンパク質はまた、外来核酸およびタンパク質と呼ぶこともできる。それを発現させる細胞にとって異種または外来であると当業者が認める任意の核酸を、本明細書中では異種核酸およびタンパク質の用語によって包含する。

本発明による方法は生物を用いて行うことができ、この生物は宿主生物、具体的には宿主微生物または野生型微生物であり得る。したがって本発明はまた、本発明の方法において少なくとも１つの反応段階を触媒する能力のある生体触媒を含む微生物であり得る新規な（宿主）細胞に関し、好ましくはこの細胞は酵素または複数種の酵素を産生することができ、それによって本発明の方法において２つ以上の反応段階を触媒する。本発明はまた、本発明の方法において少なくとも１つの反応段階を触媒することのできる１種類または複数種類の酵素をコードする１個または複数個の遺伝子を含む新規なベクターに関する。

一実施形態では、組換え型でもよく、５−カルボキシ−２−ペンテノイルエステルまたはチオエステルヒドロゲナーゼ活性、具体的には５−カルボキシ−２−ペンテノイルヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸配列を含む細胞またはベクターを提供する。

好ましくは細胞はさらに、アジピルエステルまたはチオエステル、具体的にはアジピル−ＣｏＡの５−ＦＶＡへの転化を触媒することができる酵素と、アジピルエステルまたはチオエステル、具体的にはアジピル−ＣｏＡのアジピン酸への転化を触媒する酵素との群から選択される酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列（核酸配列を含む組換えベクター）を含む。

具体的には、その細胞がアジピルエステルまたはチオエステルの５−ＦＶＡへの転化を触媒することができる酵素を含む実施形態では、この細胞は、有利には５−ＦＶＡの６−ＡＣＡへの転化を触媒することができる酵素をコードする核酸配列（を含む組換えベクター）を含むことができる。このような酵素は、具体的には５−ＦＶＡアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素であり得る。

さらにまたは別法では各（宿主）細胞のベクターは下記核酸配列、すなわち
スクシニルエステルまたはチオエステルを酢酸エステルまたはチオエステルと反応させることによる３−オキソアジピルエステルまたはチオエステルの形成を触媒することができる酵素をコードする核酸配列、
３−オキソアジピルエステルまたはチオエステルからの３−ヒドロキシアジピルエステルまたはチオエステルの形成を触媒することができる酵素をコードする核酸配列、
３−ヒドロキシアジピルエステルまたはチオエステルからの５−カルボキシ−２−ペンテノイルエステルまたはチオエステルの形成を触媒することができる酵素をコードする核酸配列、および
５−カルボキシ−２−ペンテノイルエステルまたはチオエステルからのアジピルエステルまたはチオエステルの形成を触媒することができる酵素をコードする核酸配列
のうちの少なくも１つを含む。

１個または複数個の適切な遺伝子は、具体的には本明細書中でさきに言及した酵素をコードする遺伝子の中から、より具体的には配列番号１〜６７、９４、９６、９８、１００、１０２、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１６、またはこれらのホモログのいずれかに一致する酵素をコードする遺伝子の中から選択することができる。

この宿主細胞は、原核生物または真核生物であり得る。具体的にはこの宿主細胞は、細菌、古細菌、酵母菌、真菌、原生生物、植物、および動物（ヒトを含めた）の群から選択することができる。

具体的には本発明による宿主細胞は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、酵母属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる属の群から選択することができる。具体的には宿主株、またしたがって宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の群から選択することができる。

コハク酸および／または酢酸などの短鎖脂肪酸および／またはそれらのエステルまたはチオエステルを産生する能力のある宿主細胞が有利である場合がある。この能力のある生物は、反芻動物の第一胃中に一般に存在する。具体的にはコハク酸および酢酸、あるいはそれらのエステルまたはチオエステルを共産生する能力のある生物が好ましい。

この微生物は、組換えまたは野生型であり得る。具体的にはコハク酸を産生することができる微生物には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、アクチノバシルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（具体的にはＡ．サクシノゲネス（Ａ.ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ））、マンヘミア属（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）（具体的には好二酸化炭素性ルーメン細菌（Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ））、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（具体的にはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（具体的にはＰ．クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）およびＰ．シンプリシッシマム（Ｐ．ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ））、およびＫａｅｍｗｉｃｈ Ｊａｎｔａｍａ，Ｍ．Ｊ．Ｈａｕｐｔ，Ｓｐｙｒｏｓ Ａ．Ｓｖｏｒｏｎｏｓ，Ｘｕｅｌｉ Ｓｈａｎｇ，Ｊ．Ｃ．Ｍｏｏｒｅ，Ｋ．Ｔ．Ｓｈａｎｍｕｇａｍ，Ｌ．Ｏ．Ｉｎｇｒａｍの論文、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００７）９９，５：１１４０〜１１５３中で言及されている他の生物が挙げられる。

具体的には酢酸を産生することができる微生物には、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（具体的には大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、および赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ））と、酢酸細菌（アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）（具体的にはアセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ））、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）（具体的にはグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｉｄａｎｓ））、アシドモナス属（Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アサイア属（Ａｓａｉａ）、コザキア属（Ｋｏｚａｋｉａ）、スワミナタニア属（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎｉａ）、サッカリバクター属（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒ）、ネオアサイア属（Ｎｅｏａｓａｉａ）、グラニュリバクター属（Ｇｒａｎｕｌｉｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）（具体的にはＣ．アセチカム（Ｃ．ａｃｅｔｉｃｕｍ）、Ｃ．サーモアセチカム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）、Ｃ．サーモオートトロフィカム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、Ｃ．フォルミコアセチカム（Ｃ．ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ）、Ｃ．クライベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、Ｃ．プロピオニクム（Ｃ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ））、メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）（具体的にはＭ．エルスデニ（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ））、アセトバクテリウム属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（具体的にはＡ．ウッディ（Ａ．ｗｏｏｄｉｉ）およびＡ．ビエリンガエ（Ａ．ｗｉｅｒｉｎｇａｅ））、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（具体的にはＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ブレブム（Ｌ．ｂｒｅｖｕｍ））、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（具体的にはＢ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ））、およびリューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）が含まれる）とが挙げられる。

本発明はさらに、新規なポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするそれぞれのヌクレオチド配列に関する。具体的には本発明はさらに、配列番号５７、６８〜７２、７９、８５、およびそれらのホモログのいずれかに一致するアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。具体的には本発明はさらに、配列番号５７、６８〜７２、７９、８５、およびそれらのホモログのいずれかに一致するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。

次に、本発明を下記の実施例により例示する。

コハク酸エステルまたはチオエステルからのアジピン酸エステルまたはチオエステルの調製を示す図である。 クローニングの方策の概略図であり、関連性のある機構および制限部位のみを示している。 アジピン酸生合成経路を示す図である。 アジピン酸経路組立てのためのクローニングの方策を示す図である。

［実施例］
［実施例１：全般的方法］
［分子および遺伝子の手法］
標準的な遺伝および分子生物学手法については、当該技術分野で一般に知られており、かつ上述している（Ｍａｎｉａｔｉｓら著、１９８２“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；Ｍｉｌｌｅｒ著、１９７２“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ著、２００１“Ｍｏｌｅｃｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８７）。

［プラスミドおよび株］
ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ ＣおよびｐＥＴ２１ｄは、それぞれＩｎｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。ｐＦ１１３（ｔａｃプロモーターがその番号の出発点である５１５番目および５１７６番目にそれぞれ２つのＮｏｔｌ部位を含有するｐＪＦ１１９ＥＨの誘導体（Ｆｕｒｓｔｅ，Ｊ．Ｐ．，Ｗ．Ｐａｎｓｅｇｒａｕ，Ｒ．Ｆｒａｎｋ，Ｈ．Ｂｌｏｃｋｅｒ，Ｐ．Ｓｃｈｏｌｚ，Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ，およびＥ．Ｌａｎｋａの論文、１９８６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＲＰ４ ｐｒｉｍａｓｅ ｒｅｇｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｕｌｔｉ−ｈｏｓｔ−ｒａｎｇｅ ｔａｃＰ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ．Ｇｅｎｅ ４８：１１９〜１３１））と、ｐＡＣＹＣ−ｔａｃ（Ｋｒａｍｅｒ，Ｍ．の記述（２０００），Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇｅｎ ｚｕｍ Ｅｉｎｆｌｕｓｓ ｅｒｈｏｈｔｅｒ Ｂｅｒｅｉｔｓｔｅｌｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｓｅ−４−Ｐｈｏｓｐｈａｔ ｕｎｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔ ａｕｆ ｄｅｎ Ｋｏｈｌｅｎｓｔｏｆｆｆｌｕｓｓ ｉｎ ｄｅｎ Ａｒｏｍａｔｅｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｅｗｅｇ ｖｏｎ Ｅｓｃｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｂｅｒｉｃｈｔｅ ｄｅｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍｓ Ｊｕｌｉｃｈ，３８２４，ＩＳＳＮ ０９４４−２９５２（ＰｈＤ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ）と、ｐＭＳ４７０（Ｂａｌｚｅｒ，Ｄ．，Ｚｉｅｇｅｌｉｎ，Ｇ．，Ｐａｎｓｅｇｒａｕ Ｗ．，Ｋｒｕｆｔ Ｖ．，Ｌａｎｋａ Ｅ．の論文、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９２，２０（８），１８５１〜１８５８）とについては上述した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）をすべてのクローニング手順に使用した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のＴｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｒｖ３０８（ＡＴＣＣ３１６０８）、Ｒｖ３０８△ａｒａＢ、およびＢＬ２１Ａ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）をタンパク質発現用に使用した。

すべてのベクターは、同一クローニングの方策を可能にするために共通のリンカーを挿入することによって適応させた。この適応および全般的クローニングのスキームを図２に示す。

［培地］
２ｘＴＹ培地（１６ｇ／Ｌのトリプトペプトン、１０ｇ／Ｌの酵母抽出液、５ｇ／ＬのＮａＣｌ）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の成長用に使用した。プラスミドを維持するために抗生物質（１００μｇ／ｍＬのアンピシリン）を補った。遺伝子発現を誘発させるためにアラビノース（ｐＢＡＤ誘導体用）、ＩＰＴＧ（ｐＭＳ４７０およびｐＦ１１３誘導体用）、およびアラビノースとＩＰＴＧの組合せ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−Ａ１におけるｐＥＴ２１ｄ誘導体用）を、終濃度０．００５〜０．２％（アラビノース）および０．１〜０．５ｍＭ（ＩＰＴＧ）で使用した。

［プラスミドの識別］
異なる遺伝子を有するプラスミドを、形質転換細胞の抗生物質に対する抵抗性、形質転換細胞のＰＣＲ診断分析またはプラスミドＤＮＡの精製、その精製プラスミドＤＮＡの制限酵素分析、またはＤＮＡ配列分析などの当該技術分野で一般に知られている遺伝的、生化学的、および／または表現型手段によって識別した。

［ＣｏＡ誘導体の測定のためのＨＰＬＣ−ＭＳ分析法］
アジピル−ＣｏＡおよび６−カルボキシ−２，３−エン−ヘキサノイル−ＣｏＡの濃度はＬＣ−ＭＳにより測定した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＢ−Ｃ１８ ２．１×５０ｍｍカラムを、移動相としての７５０ｍｇ／Ｌの酢酸オクチルアンモニウムで緩衝したアセトニトリル／水（ｐＨ＝７．５）による分離のために使用した。流量は３００μＬ／分であり、溶離は勾配により行った（開始：水７０％、３分で５８％まで下げ、４５％まで進め、さらに１．５分で２０％まで下げ、続いて総実行時間が７分になるようにカラムを再平衡させた）。ＬＴＱ ｏｒｂｉｔｒａｐを用いてエレクトロスプレイ陰イオンモードでｍ／ｚ ７６５〜９００まで走査した。アジピルＣｏＡおよび６−カルボキシ−２，３−エン−ヘキサノイル−ＣｏＡを、それぞれ２．２５分および２．５分で溶出した。この方法の選択性を、求められる化合物の正確なプロトン化分子の観察によって高めた（アジピルＣｏＡ：８９４．１５１２３−８９４．１６０１７、６−カルボキシ−２，３−エン−ヘキサノイル−ＣｏＡ：８９２．１３４３７−８９２．１４３２９）。濃度を測定するには合成により調製した化合物の標準曲線を動かしてそれぞれのイオンに対する応答係数を計算した。これを使用して未知試料の濃度を計算した。

アジピン酸は、Ｋｉｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．，Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒ，Ｒ．，Ｍｏｏｒｔｇａｔ，Ｇ．Ｋ．の論文、Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００８，３９２（７〜８），１４５９〜１４７０に記載のように検出し定量した。

［実施例２：６−カルボキシ−２，３−エン−ヘキサノイル−ＣｏＡレダクターゼ活性の測定］
［発現構築物］
推定上の６−カルボキシ−２，３−エン−ヘキサノイル−ＣｏＡレダクターゼをデータベースから選択した（表１）。

これら選択されたタンパク質をコードする標的遺伝子は、コドン対を最適化（国際公開第０８０００６３２号明細書に記載の方法を用いて）し、合成的に構築した（Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。最適化に先立ってターゲッティング配列（例えば、分泌シグナルまたはペルオキシソーム／ミトコンドリアターゲッティング配列）をそのアミノ酸配列から除去した。このようなターゲッティング配列は、Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎらの論文、２００７，Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２：９５３〜９７１に記載されているような当該技術分野でよく知られているバイオインフォマティクス手段によって識別することができる。この最適化手順では内部制限部位を避け、共通制限部位を図２に示す方策によるクローニングを可能にするように出発および停止部に導入した。これらの修飾はそれぞれのタンパク質配列の重要でない変化を引き起こす可能性があるが、それはそれぞれのタンパク質の特性を決して変えないと思われる。各ＯＲＦは、ｐＦ１１３、ｐＭＳ４７０、およびｐＥＴ２１ｄにおける翻訳を行うようにコンセンサスリボソーム結合部位およびリーダー配列によって先導された。ｐＢＡＤ翻訳では開始シグナルはベクターによってもたらされる。標的遺伝子「Ａｄｉ４」、「Ａｄｉ５」、「Ａｄｉ８」、および「Ａｄｉ９」は、リンカー配列によって与えられるＣ末端Ｈｉｓ−ｔａｇの読み抜けのある場合も、またない場合も両方とも４種類のすべてのプラスミドの中にクローン化された。

［大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのタンパク質発現］
スターター培養物を、２００μＬ／ウェルの培地を含む９６ウェルプレート中で一晩成長させた。４０〜１６０μＬを、培地４ｍＬを含む新鮮な２４ディープウェルプレートに移した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒｖ３０８△ａｒａＢ中のｐＢＡＤ構築物の場合、その培地は誘発用の０．００５％アラビノースを直接含有した。プレートを２５℃においてオービタルシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ、５５０ｒｐｍ）でインキュベートした。４〜６時間後に誘導物質（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒｖ３０８、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０については０．５ｍＭ ＩＰＴＧ、また大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１Ａ１におけるｐＥＴ２１ｄについては０．２％アラビノース）を加え、プレートをさらに４〜４８時間インキュベートしてから細胞を遠心分離によって回収した。

［細胞を含まない抽出物およびＨｉｓ−ｔａｇ精製物の調製］
小規模の成長から得えられた細胞（前節参照）を遠心分離によって集め、上澄みを廃棄した。遠心分離の間に形成された細胞ペレットを−２０℃で少なくとも１６時間冷凍し、次いで氷上で解凍した。新たに調製した溶菌緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、０．１ｍｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ，Ａｌｍｅｒｅ，ＮＬ）、２ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、０．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１ｍＭジチオトレイトール、およびプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ ｔａｂｌｅｔ^ＴＭ、Ｒｏｃｈｅ，Ａｌｍｅｒｅ，ＮＬを製造業者の仕様書に従って使用した））を各ウェルに加え、プレートを２〜５分間激しく渦動させることによって細胞を再懸濁させた。溶菌を達成するためにプレートを室温で３０分間インキュベートした。細胞デブリを除去するためにプレートを４℃および６０００ｇで２０分間遠心分離した。上澄みを新鮮なプレートに移し、さらなる使用まで氷上で維持した。Ｈｉｓ−ｔａｇを付けたタンパク質の精製についてはＨｉｓ Ｍｕｌｔｉｔｒａｐ ＨＰフィルタープレート（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を、製造業者の使用説明書に従って使用した。

［基質の合成］
基質（Ｊ．Ｒ．Ｓｔｅｒｎ，Ａ．ｄｅｌ Ｃａｍｐｉｌｌｏの論文、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９５６，９８５、Ａ．Ｋ．Ｄａｓ，Ｍ．Ｄ．Ｕｈｌｅｒ，Ａ．Ｋ．Ｈａｊｒａの論文、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００，２４３３３、Ｈ．Ｏｋｕ，Ｎ．Ｆｕｔａｍｏｒｉ，Ｋ．Ｍａｓｕｄａ，Ｙ．Ｓｈｉｍａｂｕｋｕｒｏ，Ｔ．Ｏｍｉｎｅ，Ｈ．Ｉｗａｓａｋｉの論文、Ｂｉｏｓｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００３，２１０７、Ｅｌｖｉｄｇｅらの論文、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９５３，１７９３、Ｆ．Ｌｉｕ，Ｈ−Ｙ．Ｚｈａ，Ｚ−Ｊ Ｙａｏの論文、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００３，６６７９〜６６８４）、およびその所望の生化学反応の生成物（国際公開第２００４／１０６３４７号明細書）を、公表されている手順に従ってＳｙｎｃｏｍ（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，ＮＬ）によって合成した。

［酵素的エノイル−ＣｏＡ検定］
５０ｍＭカリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、それぞれ０．７ｍＭのＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ、および約２０μＭの基質６−カルボキシ−２，３−エン−ヘキサノイル−ＣｏＡを含む反応混合物を調製した。反応混合物１９０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに分配した。同じ方法で、空のベクターを有するそれぞれの株から調製された細胞を含まない抽出物１０μＬを、対照反応において使用した。反応を開始させるために、ウェルのそれぞれに細胞を含まない抽出物または精製したタンパク質１０μＬを加えた。反応混合物を、３４０ｎｍにおけるＵＶ吸収のオンライン・モニターを行いながら室温（２０〜２５℃）で１５分間から２４時間インキュベートした。最後に、等体積のＭｅＯＨを加えることによって反応を停止し、試料を遠心分離した。上澄みを新鮮なプレートに移し、ＨＰＬＣ−ＭＳによるさらなる分析まで−８０℃で保管した。表１に示すようにアジピル−ＣｏＡが見出された。

［実施例３：異種微生物によるアジピン酸の産生］
［アジピン酸生合成経路の構築］
表３に示す酵素活性からなる合成経路を設計した。これらの活性をコードする酵素をデータベース中で識別した。これらの酵素をコードする標的遺伝子のコドン対を最適化し、合成的に構築した（Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。この最適化手順では内部制限部位、望ましくないターゲッティング配列（例えば、分泌シグナルまたはペルオキシソームターゲッティング配列）を除去し、図４による発現ベクターの経路の組立てを可能にするように制限部位を出発および停止部に導入した。これらの修飾はタンパク質の重要でない変化を引き起こす可能性があるが、それはそれぞれのタンパク質の特性を決して変えないと思われる。各ＯＲＦは、翻訳を行うようにコンセンサスリボソーム結合部位およびリーダー配列によって先導された。

反応１、２、および３の場合は、ａｄｉ２１＋２２＋２３またはａｄｉ２６＋２７＋２８の組合せを使用した。反応７の場合は、ａｄｉ２９、ａｄｉ３０、またはａｄｉ２４＋２５の組合せを使用した。反応４の場合は、ａｄｉ１〜２０を、ａｄｉ８、ａｄｉ６、ａｄｉ１３＋１２と共に使用することができる。

［大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を産生するアジピン酸の構築］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を産生するアジピン酸を構築するために、完全アジピン酸経路をコードするプラスミドを、クローン化遺伝子発現用の適切な宿主株に形質転換した。全経路を含有するｐＭＳ４７０構築物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１、ＴＯＰ１０、およびＲｖ３０８に形質転換した。ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ｃ構築物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０およびＲｖ３０８△ａｒａＢに形質転換した。ｐＦ１１３またはｐＡＣＹＣ−ｔａｃにおける構築物を、その最終株が完全アジピン酸経路を含有するようなやり方で、適合性があるｐＦ１１３、ｐＡＣＹＣ−ｔａｃ、またはｐＭＳ４７０と共に形質転換した。これらのプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０、ＢＬ２１、およびＲｖ３０８に同時形質転換した。

［アジピン酸の産生］
アジピン酸の産生のためにスターター培養物を、培地２００μＬを有する９６ウェルプレート中で３０℃で一晩成長させた。５０μＬを、培地４ｍＬを有する２４ウェルプレートの新鮮なプレートに移し、２５℃で４〜６時間成長させ、次いでアジピン酸経路の発現を誘発するために誘導物質を加えた。培養物を２５℃でさらに１２時間〜７２時間インキュベートした。プレートを遠心分離し、ＬＣ−ＭＳ分析用の試料を調製した。上澄みをＭｅＯＨと１：１で混合してタンパク質を沈殿させ、次いで直接分析した。細胞由来の代謝物を、エタノール１ｍＬ中にそのペレットを再懸濁させることによって抽出した。細胞懸濁液をねじぶた付きのチューブに移し、沸騰水浴中で３分間加熱した。遠心分離後、上澄みを新鮮なチューブに移し、ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ中で蒸発させた。乾燥試料は、分析の前に１００μＬの移動相中に再懸濁させた。

［実施例４：アジピル−ＣｏＡから５−ＦＶＡの調製］
［５−ＦＶＡの定量のためのＨＰＬＣ−ＭＳ分析法］
５−ＦＶＡは、遷移ｍ／ｚ １２９→８３を測定する選択反応モニタリング（ＳＲＭ）−ＭＳによって検出した。約６分のところで溶出する５−ＦＶＡピークのピーク面積を測定することによって５−ＦＶＡの濃度を計算した。較正は外部標準手順を用いて行った。すべてのＬＣ−ＭＳ実験は、Ａｇｉｌｅｎｔ ６４１０ ＱＱＱ三重四重極ＭＳと連結した、クォータナリポンプ、オートサンプラー、およびカラムオーブンからなるＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＬＣシステム上で行った。
ＬＣ条件：
カラム：２５０×４．６ｍｍ ｉｄ．Ｐｒｅｖａｉｌ Ｃ１８、５μｍ（Ａｌｌｔｅｃｈ）に連結した５０×４．６ｍｍ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ１８、５μｍ（Ｍａｃｈｅｒｙ ＆ Ｎａｇｅｌ）プレカラム
カラム温度：室温
溶離液：Ａ＝０．１％ギ酸を含有する水、
Ｂ＝０．１％ギ酸を含有するアセトニトリル
勾配：

流量：１．２ｍＬ／分（ＭＳに入る前に流量は１：３に分割される）
注入量：２μＬ
ＭＳ条件：
イオン化：陰イオンエレクトロスプレイ
供給源条件：イオンスプレイ電圧：５ｋＶ
温度：３５０℃
フラグメンタ電圧および衝突エネルギーの最適化
走査モード：選択反応モード：遷移ｍ／ｚ １２９→８３

［発現構築物］
推定上のアジピル−ＣｏＡレダクターゼを選択した（配列番号７４、７５、７７、７９、８０、１３９〜１４８）。発現構築物を設計し、ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ ＣおよびｐＥＴ２１ｄを用いて、実施例２に前述したものと同じ方法で調製した。

［タンパク質の発現、抽出、および精製］
すべての段階を実施例２で述べたものと同様に行った。

［酵素的アジピル−ＣｏＡレダクターゼ検定］
５０ｍＭカリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、それぞれ０．７ｍＭのＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ、および１０μＭ〜１０ｍＭの基質アジピル−ＣｏＡを含む反応混合物を調製した。反応混合物１９０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに分配した。アジピル−ＣｏＡを、実施例２で述べたと同様に調製した。反応を開始させるために、細胞を含まない抽出物または精製したタンパク質１０μＬをウェルのそれぞれに加えた。同様に、空のベクターを有するそれぞれの株から調製した細胞を含まない抽出物１０μＬを、対照反応において使用した。反応混合物を、３４０ｎｍにおけるＵＶ吸収のオンライン・モニタリングを行いながら室温（２０〜２５℃）で１５分間から２４時間インキュベートする。最後に、等体積のＭｅＯＨを加えることによって反応を停止し、試料を遠心分離した。上澄みを新鮮なプレートに移し、ＨＰＬＣ−ＭＳによる５−ＦＶＡの検出まで−８０℃で保管した。５−ＦＶＡの測定により、選択された酵素のアジピル−ＣｏＡレダクターゼ活性が実証される。

［実施例５：５−ＦＶＡから６−ＡＣＡの調製］
［６−ＡＣＡの定量のためのＨＰＬＣ−ＭＳ分析］
較正：
較正は、６−ＡＣＡの外部較正線によって行った（ｍ／ｚ １３２→ｍ／ｚ １１４、Ｒｔ ７．５分）。すべてのＬＣ−ＭＳ実験は、クォータナリポンプ、脱気装置、オートサンプラー、カラムオーブン、およびシングル四重極ＭＳを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で行った。ＬＣ−ＭＳ条件は、
カラム：５０×４ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ）＋２５０×４．６ Ｐｒｅｖａｉｌ Ｃ１８（Ａｌｌｔｅｃｈ）、両方とも室温（ＲＴ）
溶離液：Ａ＝超純水に溶かした０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸
Ｂ＝アセトニトリル（ｐａ，Ｍｅｒｃｋ）
流量：１．０ｍＬ／分（ＭＳに入る前に流量は１：３に分割される）
勾配：勾配は、Ａ １００％（ｖ／ｖ）を用いてｔ＝０分で開始し、１５分間とどまり、１５分以内にＢ ８０％（ｖ／ｖ）に変えた（ｔ＝３０分）。３０分から３１分までその勾配をＢ ８０％（ｖ／ｖ）で一定に保った。
注入量：５μＬ
ＭＳ検出：ＥＳＩ（＋）−ＭＳ
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）は、ｍ／ｚ ５０〜５００、フラグメンタ５０Ｖ、ステップ幅０．１ ｍ／ｚ、乾燥気体温度３５０℃、乾燥気体１０Ｌ／分のＮ_２、噴霧器ゲージ圧５０ｐｓｉ、およびキャピラリー電位２．５ｋＶの条件を用いて陽性スキャンモードで実施した。

［標的遺伝子のクローニング］
［発現構築物の設計］
クローニングを容易にするためにすべての遺伝子にａｔｔＢ部位を、リボソーム結合部位かつ出発コドンの上流と、終止コドンの下流とに、Ｇａｔｅｗａｙ技術（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて加えた。

［遺伝子合成およびプラスミドの構築］
合成遺伝子を、ＤＮＡ２．０と、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させるために最適化したコドンとからＤＮＡ２．０の標準的手順に従って得た。ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）ＪＳ１７ω−アミノトランスフェラーゼ［配列番号８２］およびバシルス・ウェイヘンステファネンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）ＫＢＡＢ４アミノトランスフェラーゼ（ＺＰ＿０１１８６９６０）［配列番号８３］をそれぞれコードするＶ．フルビアリス（Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）ＪＳ１７［配列番号８６］およびＢ．ウェイヘンステファネンシス（Ｂ．ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）ＫＢＡＢ４［配列番号８９］由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子をコドン最適化し、その結果としての配列［配列番号８８］および［配列番号９１］をＤＮＡ合成によって得た。

前記遺伝子を備えた細胞を、下記本明細書中ではそれぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＢＡＤ−Ｖｆｌ＿ＡＴおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＢＡＤ−Ｂｗｅ＿ＡＴと呼ぶ。

［ＰＣＲによるクローニング］
ＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を製造業者の仕様書に従って使用するＰＣＲによって、生体触媒をコードする様々な遺伝子を、ゲノムＤＮＡから増幅した。

ＰＣＲ反応物をアガロースゲル電気泳動により分析し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてちょうどよい大きさののＰＣＲ産物をゲルから溶出した。精製ＰＣＲ産物を、導入したａｔｔＢ部位と、製造業者のプロトコルに記載されているエントリーベクターとしてのｐＤＯＮＲ−ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）とを介して、Ｇａｔｅｗａｙ技術（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を用いてｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＤＥＳＴ発現ベクター中にクローン化した。ＰＣＲによってクローン化された遺伝子の配列を、ＤＮＡシークエンシングにより検証した。この方法により発現ベクター、ｐＢＡＤ−Ｂｓｕ＿ｇｉ１６０７７９９１＿ＡＴ（配列番号１３４によって表されるペプチドをコードする、配列番号１３３によって表される遺伝子を含む）と、ｐＢＡＤ−Ｐａｅ＿ｇｉ９９４６１４３＿ＡＴ（配列番号１３０および１３１中で識別されるプライマーを使用する）と、ｐＢＡＤ−Ｐａｅ＿ｇｉ９９５１０７２＿ＡＴ（配列番号１３６によって表されるペプチドをコードする、配列番号１３５によって表される遺伝子を含む）と、ｐＢＡＤ−Ｐａｅ＿ｇｉ９９５１６３０＿ＡＴ（配列番号１３８によって表されるペプチドをコードする、配列番号１３７によって表される遺伝子を含む）とを得た。対応する発現株は、化学的受容能のある大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）をこのｐＢＡＤ構築物により形質転換することによって得られた。

［５−ホルミルペンタン酸の６−ＡＣＡへの転化のための酵素的反応］
別段の指定がない限り、１０ｍＭの５−ホルミルペンタン酸、２０ｍＭのラセミα−メチルベンジルアミン、および５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶かした２００μＭのピリドキサール５’−リン酸を含む反応混合物を調製した。この反応混合物１００μＬをウェルプレートの各ウェルに分配した。反応を開始させるためにウェルのそれぞれに細胞を含まない抽出物２０μＬを加えた。反応混合物をふりまぜ機上で３７℃で２４時間インキュベートした。さらに化学的ブランク混合物（細胞を含まない抽出物なし）および生物学的ブランク（ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ｃを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０）を同一条件下でインキュベートした。試料をＨＰＬＣ−ＭＳにより分析した。結果を下記の表中に要約する。

６−ＡＣＡが、アミノトランスフェラーゼの存在下で５−ＦＶＡから形成されること、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）がこの形成を触媒できることを示している。

Claims (31)

1. 生体触媒の存在下で２，３−デヒドロアジピン酸エステルまたは２，３−デヒドロアジピン酸チオエステルをアジピン酸エステルまたはチオエステルに転化することを含む、アジピン酸エステルまたはアジピン酸チオエステルの調製方法。
2. 前記生体触媒が、２，３−エン酸部分または２−エノイル部分の炭素−炭素二重結合の還元を触媒することができる酵素を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記生体触媒が、供与体のＨＣ−ＣＨ基に作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ １．３．１またはＥＣ １．３．９９）の群から、好ましくはオキシドレダクターゼ（ＥＣ １．３．１およびＥＣ １．３．９９）の群から、好ましくはエノイル−ＣｏＡレダクターゼＥＣ １．３．１．８、ＥＣ １．３．１．３８、およびＥＣ １．３．１．４４の群から、エノイル−［アシル−キャリアタンパク質］レダクターゼＥＣ １．３．１．９、ＥＣ １．３．１．１０、およびＥＣ １．３．１．３９の群から、およびブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．２）、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．３）、および長鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．１３）の群から選択される、請求項２に記載の方法。
4. 前記生体触媒が酵素を含み、その酵素が、配列番号４２〜６７、９４、９６、９８、１００、１０２、１０３、１０５、１０６、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１６、およびそれらのホモログのいずれかによって表されるアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号６０、６３、９６、１００、およびそれらのホモログのいずれかによって表されるアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 前記生体触媒が、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（具体的には大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（具体的にはＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）（具体的にはＣ．クライベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、およびウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）（具体的にはＳ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）および放線菌（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ））、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）およびＰ．エールギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、シェワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ザントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、キシレラ属（Ｘｙｌｅｌｌａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）（具体的にはＴ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ））、ユウバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（具体的にはＥ．ピルバチボランス（Ｅ．ｐｙｒｕｖａｔｉｖｏｒａｎｓ））、マイクロシーラ属（Ｍｉｃｏｒｓｃｉｌｌａ）（具体的にはマイクロシーラ・マリナ（Ｍｉｃｏｒｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ））、エロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）（具体的にはエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ））、メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）（具体的にはメガスフェラ・エルスデニ（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ））、アシネトバクター種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、デイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）（具体的にはデイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｕｒａｎｓ））、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）（具体的にはアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｙｐｏｌｙｔｉｃａ））、ユーグレノゾア属（Ｅｕｇｌｅｎｏｚｏａ）（具体的にはユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ））、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（具体的にはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）（具体的にはＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ））、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（具体的には分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ））、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）（具体的にはＣ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ））、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（具体的にはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）およびＡ．ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ））、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（具体的にはＰ．クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（具体的にはシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ））、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、イングリッシュ・モルモット種（Ｃａｖｉａ ｓｐ．）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、およびキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の群から選択される生物の酵素を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. ２，３−デヒドロアジピン酸エステルまたは２，３−デヒドロアジピン酸チオエステルが、３−ヒドロキシアジピン酸エステルまたは３−ヒドロキシアジピン酸チオエステルの転化によって調製される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 前記３−ヒドロキシアジピン酸エステルまたはチオエステルが、３−ヒドロキシアシルエステルまたは３−ヒドロキシアシルチオエステルを脱水して２−エノイルエステルまたはチオエステルにするのを触媒することができる生体触媒、好ましくはヒドロリアーゼ（ＥＣ ４．２．１）の群から、好ましくはエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ ４．２．１．１７）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ ４．２．１．５５）、および長鎖エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ ４．２．１．７４）の群から選択される酵素を含む生体触媒の存在下で生体触媒作用により転化される、請求項６に記載の方法。
8. 前記生体触媒が、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）（具体的にはアシネトバクター種ＡＤＰ１株（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＡＤＰ１）およびＡ．カルコアセティカス（Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ））、アルカリゲネス属（Ａｌｉｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（具体的にはアルカリゲネスＤ２（Ａｌｉｃａｌｉｇｅｎｅｓ Ｄ２））、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（具体的にはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））、アゾアルカス属（Ａｚｏａｒｃｕｓ）（具体的にはＡ．エバンシー（Ａ．ｅｖａｎｓｉｉ））、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（具体的にはＢ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ））、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（具体的にはＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）およびＣ．オーランチアカム（Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ））、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノイロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）（具体的にはアカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ））、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（具体的にはＰ．クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）および蛍光菌（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ））、ロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＲ．パルストリス（Ｒ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ））、ロドコッカス属（Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）（具体的にはロドコッカス種ＲＨＡ１株（Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＲＨＡ１））、エロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＡ．キャビエ（Ａ．ｃａｖｉａｅ））、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）（具体的にはＣ．アセトブチリクム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍｉ）およびＣ．クライベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ））、ゴッシピウム属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）（具体的には４倍体栽培ワタ（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ））、ロドスピリリラム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、（具体的にはＲ．ラブラム（Ｒ．ｒｕｂｕｒｕｍｉ）、およびラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）（具体的にはラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ））、ユーグレノゾア属（Ｅｕｇｌｅｎｏｚｏａ）（具体的にはユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ））、メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）（具体的にはＭ．エルスデニ（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ））、およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（具体的にはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、および哺乳動物（具体的にはウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、およびイノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ））の群から選択される生物の酵素を含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記３−ヒドロキシアジピン酸エステルまたはチオエステルが、３−オキソアジピン酸エステルまたは３−オキソアジピン酸チオエステルの転化によって調製される、請求項６、７、または８のいずれかに記載の方法。
10. 前記３−オキソアジピン酸エステルまたは３−オキソアジピン酸チオエステルを、生体触媒、具体的にはカルボニル基のアルコール基への還元を触媒することができるか、あるいは３−オキソアシルエステルまたは３−オキソアシルチオエステルのその対応する３−ヒドロキシアシルエステルまたはチオエステルへの還元を触媒することができ、デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１）の群から、好ましくは３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．３５およびＥＣ １．１．１．３６）、３−ヒドロキシブタノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１５７）、３−ヒドロキシピメロイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２５９）、および長鎖３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２１１）の群から選択される生体触媒の存在下で、生体触媒の作用により転化することを含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記生体触媒が、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）（具体的にはアシネトバクター種ＡＤＰ１株（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＡＤＰ１）およびＡ．カルコアセティカス（Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ））、アルカリゲネス属（Ａｌｉｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（具体的にはアルカリゲネスＤ２株（Ａｌｉｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｔｒａｉｎ Ｄ２）およびＡ．ユートロフス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ））、アゾアルカス属（Ａｒｚｏａｒｃｕｓ）（具体的にはＡ．エバンシー（Ａ．ｅｖａｎｓｉｉ））、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（具体的にはＢ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ））、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）（具体的には百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ））、ブルクホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）（具体的には類鼻疸菌（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）およびＢ．ゼノボランス（Ｂ．ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ））、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（具体的にはＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｃ．オーランチアカム（Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）、およびＣ．エフィシエンス（Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ））、デイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）（具体的にはＤ．ラディオデュランス（Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ））、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（具体的にはＫ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ））、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）および蛍光菌（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ））、ロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＲ．パルストリス（Ｒ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ））、ロドコッカス属（Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）（具体的にはＲ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、Ｒ．オパカス（Ｒ．ｏｐａｃｕｓ）、およびロドコッカス種ＲＨＡ１株（Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＲＨＡ１））、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（具体的にはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））、ノイロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）（具体的にはアカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ））、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（具体的にはＰ．クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、イノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）（具体的にはＣ．アセトブチリクム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍｉ）およびＣ．クライベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ））、ユーグレノゾア属（Ｅｕｇｌｅｎｏｚｏａ）（具体的にはユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ））、メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）（具体的にはメガスフェラ・エルスデニ（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ））、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）（具体的にはラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ））、およびズーグレア属（Ｚｏｏｇｌｏｅａ）（具体的にはズーグレア・ラミゲラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ））の群から選択される生物の酵素を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記３−オキソアジピン酸エステルまたは３−オキソアジピン酸チオエステルが、コハク酸エステルまたはコハク酸チオエステルを酢酸エステルまたは酢酸チオエステルと反応させることによって調製される、請求項９、１０、または１１のいずれかに記載の方法。
13. 生体触媒、好ましくは、アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１）、具体的にはアセチル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）、アシル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．１６）、およびスクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡ Ｃ−スクシニルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．１７４）の群から選択されるアシルトランスフェラーゼ、より具体的には配列番号１〜１３またはそのホモログのいずれかで識別されるアミノ酸配列を含む酵素から選択されるアセチル基転移の能力のある酵素を含む生体触媒の存在下で、触媒作用によりコハク酸エステルまたはコハク酸チオエステルを酢酸エステルまたはチオエステルと生体反応させることを含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記生体触媒が、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）（具体的にはアシネトバクター種ＡＤＰ１株（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｓｔｒａｉｎ ＡＤＰ１）およびＡ．カルコアセティカス（Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ））、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（具体的にはＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））、アルカリゲネス属（Ａｌｉｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（具体的にはアルカリゲネスＤ２株（Ａｌｉｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｔｒａｉｎ Ｄ２）およびＡ．ユートロフス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ））、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、アゾアルカス属（Ａｚｏａｒｃｕｓ）（具体的にはＡ．エバンシー（Ａ．ｅｖａｎｓｉｉ））、アゾモナス属（Ａｚｏｍｏｎａｓ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（具体的にはＢ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ））、ベイジュリンキア属（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ブルクホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）（具体的にはＣ．クライベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ））、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（具体的にはＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）およびＣ．オーランチアカム（Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ））、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）（具体的にはＭ．エルスデニ（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ））、ノルカジア属（Ｎｏｒｃａｄｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）、Ｐ．エールギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびシュードモナス種Ｂ１３株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ Ｂ１３））、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）（具体的にはＲ．ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ））、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＲ．パルストリス（Ｒ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ））、ロドコッカス属（Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）（具体的にはＲ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、Ｒ．オパカス（Ｒ．ｏｐａｃｕｓ）、およびロドコッカス種ＲＨＡ１株（Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＲＨＡ１））、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（具体的にはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））、ユーグレノゾア属（Ｅｕｇｌｅｎｏｚｏａ）（具体的にはユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ））、ノイロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）（具体的にはアカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ））、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（具体的にはＰ．クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）（具体的にはＴ．クタニウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ））の群から選択される生物の酵素を含む、請求項１２または１３に記載の方法。
15. 前記エステルのいずれかが、生物学的活性基の群から、具体的には補酵素Ａと、アシルまたはペプチジルキャリアタンパク質に結合することができるホスホ−パンテテインと、Ｎ−アセチル−システアミンと、メチル−チオ−グリコール酸と、メチル−メルカプト−プロピオン酸と、エチル−メルカプト−プロピオン酸と、メチル−メルカプト−酪酸と、メチル−メルカプト−酪酸と、メルカプトプロピオン酸との群から選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
16. 請求項１〜１５のいずれかに記載の方法でアジピン酸エステルまたはチオエステルを調製するステップと、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法で得られる前記アジピン酸エステルまたはアジピン酸チオエステルを加水分解するステップとを含み、前記加水分解が、好ましくは生体触媒によって、具体的にはヒドロラーゼ（ＥＣ ３．１．２）の群から選択される酵素を含む生体触媒によって触媒される、アジピン酸の調製方法。
17. 請求項１〜１５のいずれかに記載の方法でアジピン酸エステルまたはアジピン酸チオエステルを調製するステップと、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法で得られる前記アジピン酸エステルまたはアジピン酸チオエステルの活性基を転移させるステップとを含み、前記活性基の転移が生体触媒、好ましくはイオウ含有基の転移を触媒する酵素（ＥＣ ２．８）を含む、より好ましくはＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．８．３）の群から選択される酵素を含む生体触媒によって触媒される、アジピン酸の調製方法。
18. 請求項１〜１５のいずれかに記載の方法でアジピン酸エステルまたはアジピン酸チオエステルを調製するか、あるいは請求項１６または１７に記載の方法でアジピン酸を調製するステップと、前記アジピン酸エステル、前記アジピン酸チオエステル、または前記アジピン酸を５−ホルミルペンタン酸に転化するステップとを含む、５−ホルミルペンタン酸の調製方法。
19. ５−ホルミルペンタン酸への前記転化が、生体触媒、好ましくはオキシドレダクターゼ（ＥＣ １．２．１）の群から、好ましくはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．３、ＥＣ １．２．１．４、およびＥＣ １．２．１．５）、マロン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．１５）、コハク酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．１６およびＥＣ １．２．１．２４）、グルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．２０）、アミノアジピン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．３１）、アジピン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．６３）の群から、またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（ＥＣ １．２．１．１０）、脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．４２）、長鎖脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．５０）、ブタナールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．５７）、およびコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）の群から選択される酵素を含む生体触媒によって触媒される、請求項１８に記載の方法。
20. 請求項１８または１９に記載の方法で５−ホルミルペンタン酸を調製するステップと、前記５−ホルミルペンタン酸を６−アミノカプロン酸に転化するステップとを含む、６−アミノカプロン酸の調製方法。
21. 前記転化が、生体触媒、具体的にはアミノ基転移および／または還元的アミノ化を触媒することができる生体触媒、好ましくはアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１）およびアミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１）の群から、より好ましくはβ−アミノイソ酪酸：α−ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼ、β−アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、４−アミノ−酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１９）、Ｌ−リシン６−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．３６）、２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．３９）、５−アミノ吉草酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．４８）、２−アミノヘキサン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．６７）、リシン：ピルビン酸６−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．７１）、およびリシン−６−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．１８）の群から選択される酵素を含む生体触媒によって触媒される、請求項２０に記載の方法。
22. 配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、またはこれら配列のいずれかのホモログに一致したアミノ酸配列を含むアミノトランスフェラーゼが使用される、請求項２０または２１に記載の方法。
23. 前記生体触媒が、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、メルクリアリス属（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ）、アスプレニウム属（Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ）、長角果属（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ）、哺乳類、ノイロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ジオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の群から選択される生物由来の酵素を含む、請求項２０、２１、または２２に記載の方法。
24. 請求項２０〜２３のいずれかに記載の方法で６−アミノカプロン酸を調製するステップと、前記６−アミノカプロン酸を環化し、それによってカプロラクタムを形成するステップとを含む、カプロラクタムの調製方法。
25. 請求項２、３、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２１、２２、および２３のいずれかで規定される酵素をコードする１つまたは複数の核酸配列を含む、好ましくは請求項２、３、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２１、２２、および２３のいずれかで規定される異なる酵素をそれぞれコードする少なくとも２つの核酸配列を含む宿主細胞。
26. 配列番号４２〜６７、配列番号７４〜８１、９４、９６、９８、１００、１０２、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１６、またはこれらのホモログのいずれかによって表されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項２５に記載の宿主細胞。
27. 前記生体触媒―その生体触媒は請求項２５または２６に記載の宿主細胞を構成してもよく、また別の生体触媒でもよい―を発酵性炭素源と接触させるステップを含み、前記発酵性炭素源が、調製される前記化合物へ転化されることになる化合物のいずれかを含有するか、あるいは前記細胞が、前記炭素源から調製される前記化合物へ転化されることになる化合物を調製する、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
28. 任意選択で請求項１６または１７に従って、コハク酸またはそのコハク酸のエステルまたはチオエステルから複数の反応を経由して、アジピン酸を調製するための方法であって、前記反応の少なくとも１つが生体触媒によって触媒される、方法。
29. （１）コハク酸エステルまたはチオエステルを準備し、前記エステルまたはチオエステルを酢酸エステルまたはチオエステルと反応させ、それによって３−オキソアジピン酸エステルまたはチオエステルを形成するステップ、
    （２）前記３−オキソアジピン酸エステルまたはチオエステルの３−オキソ基を水素化し、それによって３−ヒドロキシアジピン酸エステルまたはチオエステルを形成するステップ、
    （３）前記３−ヒドロキシアジピン酸エステルまたはチオエステルを脱水し、それによって２，３−デヒドロアジピン酸エステルまたはチオエステルを形成するステップ、
    （４）前記２，３−デヒドロアジピン酸エステルまたはチオエステルのＣ−Ｃ二重結合を水素化し、それによってアジピン酸エステルまたはチオエステルを形成するステップ、および
    （５）前記エステル結合またはチオエステル結合を加水分解し、それによってアジピン酸を形成するステップ
    を含む、請求項２８に記載の方法。
30. 配列番号５７、６８、６９、７０、７１、７２、７９、８５、およびこれらのホモログのいずれかに一致するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
31. 請求項３０に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

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