CN102348805A

CN102348805A - 己二酸的制备

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Publication number: CN102348805A
Application number: CN2010800114271A
Authority: CN
Inventors: 彼托纳拉·凯瑟琳娜·拉伊马克斯-弗兰肯; 马丁·斯库尔曼; 埃克斯勒·克里斯多佛·特里弗泽; 斯蒂法恩·马莉亚·安德勒·德威尔德曼
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2009-03-11
Filing date: 2010-03-11
Publication date: 2012-02-08
Also published as: EA201101311A1; AU2010221863A1; EA201101312A1; US20120028320A1; EP2406385A2; WO2010104390A3; EP2406384A2; TW201037078A; BRPI1009192A2; JP2012520069A; WO2010104391A2; AU2010221862A1; WO2010104391A3; US20120156737A1; WO2010104390A2; JP2012520070A; CN102892893A; BRPI1009197A2

Abstract

本发明涉及用于制备己二酸的方法，其包括：-将α-酮戊二酸(AKG)转化成α-酮己二酸(AKA)，-将α-酮己二酸转化成α-酮庚二酸(AKP)，-将α-酮庚二酸转化成5-甲酰基戊酸(5-FVA)，以及-将5-甲酰基戊酸转化成己二酸，其中这些转化中至少一种使用异源生物催化剂进行。本发明还涉及包含一种或多种异源核酸序列的异源细胞，所述核酸序列编码能催化所述方法中至少一个反应步骤的一种或多种异源酶。

Description

己二酸的制备

本发明涉及用于制备己二酸的方法。本发明还涉及使用这样制备的己二酸来制备聚酰胺或酯的方法。本发明还涉及可用于本发明方法中的异源细胞。本发明还涉及异源细胞中己二酸制备中的用途。

己二酸(肥酸)等等被用于生产聚酰胺。另外，己二酸酯可在增塑剂、润滑剂、溶剂和多种聚氨酯树脂中使用。己二酸的其它一些用途是用作食物酸化剂，应用于粘附剂、杀虫剂、制革剂(tanning)和染料中。已知的制备方法包括用硝酸氧化环己醇或环己酮或其混合物(KA油)。

考虑到使用更加可持续的技术来制备材料的日益增长的需要，期望提供一种方法，其中由能够从生物可再生来源获得的中间产物化合物或至少由使用生物化学方法被转化成己二酸的中间产物来制备己二酸。此外，期望提供一种方法，其比利用来自石油化工来源的散装化学品的常规化学方法需要的能量更少。

本发明的一个目的是提供制备己二酸的新方法。

另一个目的是提供新的生物催化剂，其适于催化己二酸制备方法中的一个或多个反应步骤。

根据本发明可以解决的一个或多个其它目的将在下文描述。

本发明人认识到，可以使用特异性生物催化剂来制备己二酸。

因此，本发明涉及用于制备己二酸的方法，其包括：

-将α-酮戊二酸(AKG)转化成α-酮己二酸(AKA)，

-将α-酮己二酸转化成α-酮庚二酸(AKP)，

-将α-酮庚二酸转化成5-甲酰基戊酸(5-FVA)，和

-将5-甲酰基戊酸转化成己二酸，

其中这些转化中至少一种使用生物催化剂(特别是异源生物催化剂)进行。

在一个优选实施方案中，AKG到AKA的转化由生物催化剂进行催化。

在另一个优选实施方案中，AKA到AKP的转化由生物催化剂进行催化。

在另一个优选实施方案中，AKP到5-FVA的转化由生物催化剂进行催化。

5-FVA到己二酸的转化可具体包括醛氧化步骤，所述氧化可以以化学方法进行，或以生物催化方法进行。本发明还涉及包含一种或多种核酸序列的异源细胞，所述核酸序列编码一种或多种酶，所述酶在对5-甲酰基戊酸向己二酸的转化方面具有催化活性。

本发明还提供包含一种或多种核酸序列的异源细胞，所述核酸序列编码一种或多种异源酶，所述酶能够催化由α-酮戊二酸制备己二酸的至少一个反应步骤。

这些细胞特别地可用作己二酸制备方法中的催化剂。

本发明使得可以从可再生资源制备己二酸，而不需要石油化工原料。

特别地，预想本发明方法可以以高成本效率或高能量效率的方式操作。

除非另有说明，否则本文所用术语“或”定义为“和/或”。

除非另有说明，本文中使用的术语“一个”(“a”或“an”)被定义为“至少一个”。

提到单数名词(例如化合物、添加剂等等)时，旨在包括复数在内。因此，除非另有说明，否则提到特定部分(如“化合物”)时，这是指“至少一个”该部分，例如“至少一个化合物”。

除非另有说明，在本文中提到羧酸或羧酸酯(例如氨基酸、5-FVA、AKG、AKA、AKP、己二酸/己二酸酯)时，这些术语旨在包括质子化的羧酸(游离酸)、相应的羧酸酯(其共轭碱)及其盐。同样，提到胺时，这旨在包括质子化的胺(通常为阳离子，如R-NH₃ ⁺)和非质子化的胺

(通常不带电，如R-NH₂)。提到氨基酸时，所述术语旨在包括两性离子形式(其中氨基被质子化且羧酸酯基是去质子化的形式)的氨基酸，其中氨基被质子化且羧基为中性形式的氨基酸，和其中氨基为中性形式且羧酸酯基是去质子化形式的氨基酸，以及它们的盐。

提到存在若干异构体(例如顺式和反式异构体、R和S对映异构体)的化合物时，化合物原则上包括可在本发明具体方法中使用的所述化合物的所有对映异构体、非对映异构体和顺式/反式异构体。

参考括号中的酶种类(EC)提到酶时，所述酶种类是以NomenclatureCommittee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology(NC-IUBMB)提供的Enzyme Nomenclature为基础，将酶归类或可以归类在其中的种类，所述命名法可见http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/。(尚)未归类但是可以同样被归类在特定种类中的其它合适的酶旨在包括在内。

除非另有说明，本文参考登记号提到蛋白质或基因时，所述登记号尤其被用于表示具有在2008年3月11日在Uniprot中找到的序列的蛋白质或基因。

本文所用术语核酸的“功能类似物”至少包括编码具有相同氨基酸序列的酶的其它序列，以及编码这些酶的同源物的其它序列。

术语“同源物”在本文中尤其用于具有至少30％、优选地至少40％、更优选地至少60％、更优选地至少65％、更优选地至少70％、更优选地至少75％、更优选地至少80％、尤其是至少85％、更尤其是至少90％、至少91％、92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的多核苷酸或多肽。术语同源物也旨在包括由于遗传密码子的简并性而与另一核酸序列不同并且编码相同多肽序列的核酸序列(多核苷酸序列)。

序列同一性或相似性在本文中被定义为两条或更多多肽序列或两条或更多核酸序列之间的相互关系，通过比较所述序列来测定。通常，序列同一性或相似性在序列全长上比较，但是也可以仅在彼此对齐的序列的一部分上比较。在本领域中，“同一性”或“相似性”也表示多肽序列或核酸序列之间之间的序列相关性程度，根据情况由这类序列之间的匹配来确定。测定同一性或相似性的优选方法被设计为在测试的序列之间给出最大匹配。在本发明的上下文中，测定两条序列之间同一性和相似性的一种优选的计算机程序方法包括BLASTP和BLASTN(Altschul，S.F.et al.，J.Mol.Biol.1990，215，403-410)，公众可以从NCBI和其它来源(BLASTManual，Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894)获得。使用BLASTP进行多肽序列比较的优选参数为缺口开放10.0，缺口延伸0.5，Blosum 62矩阵。使用BLASTN进行核酸序列比较的优选参数为缺口开放10.0，缺口延伸0.5，DNA全矩阵(DNA同一性矩阵)。

本文所用的异源生物催化剂(特别是异源细胞)是包含异源蛋白或异源核酸(通常是作为细胞的DNA或RNA的一部分)的生物催化剂。用于核酸序列(DNA或RNA)或蛋白质时，术语“异源”指这样的核酸或蛋白质，其不作为所存在生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列中的天然部分而存在，或者存在于与其自然界中不同的细胞或者位置或者基因组或DNA或RNA序列的位置。应该理解，异源生物中的异源DNA是该异源生物基因组的一部分。异源核酸或蛋白质对于其所引入的细胞而言不是内源的，而是得自其它细胞或者是合成或重组产生的。通常(但不一定)，这些核酸编码不在转录或表达该DNA的细胞中天然产生的蛋白质。类似地，异源RNA编码不在该异源RNA所存在细胞中天然表达的蛋白质。异源核酸和蛋白质还可称为外源核酸或蛋白质。术语异源核酸或蛋白质包括本领域技术人员认为对于表达细胞而言是异源或外源的任何核酸或蛋白质。

提到来自特定来源的酶或其它生物催化部分时，来自第一种生物但实际在另一(遗传修饰的)生物中产生的重组酶或其它重组生物催化部分也明确地包括在内，作为来自该第一种生物的酶或其它生物催化部分。

在本发明方法中，使用了生物催化剂，即，该方法的至少一个反应步骤由来自生物来源(例如生物或由其衍生的生物材料)进行催化。生物催化剂特别地包括一种或多种酶。生物催化反应可包括一种或多种化学转化，其中至少一种由生物催化剂进行催化。因此，“生物催化剂“可加速由AKG制备AKP的至少一个反应步骤、由AKP制备5-FVA的至少一个反应步骤或者由5-FVA制备己二酸的至少一个反应步骤中的化学反应。

生物催化剂可以任何形式使用。在一个实施方案中，一种或多种酶形成活生物的一部分(如活的完整细胞)。酶可在细胞内发挥催化功能。酶还可能被分泌进所述细胞存在的培养基中。在一个实施方案中，使用从天然环境中分离(从生产它们的生物中分离)的一种或多种酶，例如作为溶液、乳液、分散液、冻干细胞(悬浮液)、裂解物、或固定在支持物上。考虑到调节反应条件时使得反应平衡向想要的一侧偏移的提高的灵活性，从酶的来源生物中分离的酶的用途尤其是有用的。

活细胞可以是生长中的细胞、静止或休眠(dormant)细胞(例如孢子)或稳定期细胞。还可能使用酶形成通透化(即使其对酶的底物或一种或多种酶的底物前体通透)的细胞的部分。

(本发明方法中使用的)生物催化剂原则上可以是任何生物，或者得自或来自任何生物。该生物可以是天然生物或异源生物。所述异源生物通常是包含编码异源酶的至少一种核酸序列的宿主细胞，所述异源酶能够催化本发明方法的至少一个反应步骤。异源核酸序列的来源生物可以是真核生物或原核生物。具体地，所述生物可独立地选自动物(包括人)、植物、细菌、古细菌(archaea)、酵母和真菌。

所述宿主细胞可以是真核宿主细胞或原核宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞选自真菌、酵母、裸藻(euglenoid)、古细菌和细菌。宿主细胞可特别地选自以下属：Aspergillus，Penicillium，Ustilago，Cephalosporium，Trichophytum，Paecilomyces，Pichia，Hansenula，Saccharomyces，Candida，Kluyveromyces，Yarrowia，Bacillus，Corynebacterium，Escherichia，Azotobacter，Frankia，Rhizobium，Bradyrhizobium，Anabaena，Synechocystis，Microcystis，Klebsiella，Rhodobacter，Pseudomonas，Thermus，Deinococcus Gluconobacter，Methanococcus，Methanobacterium，Methanocaldococcus，Methanosphaera，Methanobrevibacter，Methanospirillum和Methanosarcina。

特别地，宿主菌株(和因此用于本发明方法的宿主细胞)可选自Escherichia coli，Azotobacter vinelandii，Klebsiella pneumoniae，Anabaena sp.，Synechocystis sp.，Microcystis aeruginosa，Deinococcus radiourans，Deinococcus geothermalis，Thermus thermophilus，Bacillus subtilis，Bacillusamyloliquefaciens，Bacillus methanolicus，Corynebacterium glutamicum，Aspergillus niger，Penicillium chrysogenum，Penicillium notatum，Paecilomycescarneus，Cephalosporium acremonium，Ustilago maydis，Pichia pastoris，Saccharomyces cerevisiae，Kluyveromyces lactis，Candida maltosa，Yarrowialipolytica，Hansenula polymorpha，Sulfolobus solfataricus，Methanobacteriumthermoautothrophicum，Methanococcus maripaludis，Methanocaldococcusjannashii，Methanosphaera stadtmanae，Methanococcus voltae，Methanosarcinaacetivorans，Methanosarcina barkeri，Methanosarcina mazei，Methanosarcinaacetivorans，Methanospirillum hungatei，Methanosaeta thermophilaMethanobrevibacter smithii，Methanococcus vannielii和Methanococcusaeolicus宿主细胞。

下述会被认为是有利的：宿主细胞是天然地能将5-FVA转化成己二酸或至少能催化必要反应之一的生物。

在一个具体实施方案中，对5-甲酰基庚酸转化成己二酸具有催化活性的酶包含SEQ ID NO：285、SEQ ID NO：287所示序列或其同源物。例如，这种酶由分别包含SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：286所示序列的基因编码。本领域技术人员基于常识将能够获得可用作替代的这些序列的功能类似物。

有利地，宿主细胞是这样的生物，其包含催化赖氨酸生物合成的氨基己二酸途径(也称为AAA途径)或其部分的生物催化剂(如低等真核生物：真菌、酵母、裸藻，某些细菌如Thermus，Deinococcus，古细菌)，或者包含通过固氮酶进行氮固定的生物催化剂。

在一个优选实施方案中，宿主细胞是具有通过AAA途径的高流量的生物，例如Penicillium chrysogenum，Ustilago maydis，或者对赖氨酸生产进行了改造(优选优化)的生物。高流量定义为在选定生产条件下供应相应生物中细胞蛋白质生物合成所需赖氨酸速率的至少20％，更优选至少50％，甚至更优选至少70％，最优选至少100％。

在一个优选实施方案中，宿主细胞是产生高水平高柠檬酸的生物，其可以是天然的或是异源生物。这种生物可通过表达用于形成固氮酶中必要辅因子的高柠檬酸合酶或其同源物来获得。

在一个实施方案中，宿主细胞包含来源于动物(特别是其部分，如肝、胰、脑、肾、心或其它器官)的异源核酸序列。动物可特别地选自哺乳动物，更特别地选自Leporidae，Muridae，Suidae和Bovidae。

在一个实施方案中，宿主细胞包含来源于植物的异源核酸序列。合适的植物特别地包括选自以下的植物：Asplenium；Cucurbitaceae，特别是Curcurbita，例如Curcurbita moschata(倭瓜)，或Cucumis；Brassicaceae，特别是Arabidopsis，例如A.thaliana；Mercurialis，例如Mercurialis perennis；Hydnocarpus；和Ceratonia。

在一个实施方案中，宿主细胞包含来源于细菌的异源核酸序列。合适的细菌特别地可选自Vibrio，Pseudomonas，Bacillus，Corynebacterium，Brevibacterium，Enterococcus，Streptococcus，Actinomycetales，Klebsiella，Lactococcus，Lactobacillus，Clostridium，Escherichia，Klebsiella，Anabaena，Microcystis，Synechocystis，Rhizobium，Bradyrhizobium，Thermus，Mycobacterium，Zymomonas，Proteus，Agrobacterium，Geobacillus，Acinetobacter，Azotobacter，Ralstonia，Rhodobacter，Paracoccus，Novosphingobium，Nitrosomonas，Legionella，Neisseria，Rhodopseudomonas，Staphylococcus，Deinococcus和Salmonella。

在一个实施方案中，宿主细胞包含来源于古细菌的异源核酸序列。合适的古细菌特别地可选自Archaeoglobus，Aeropyrum，Halobacterium，Methanosarcina，Methanococcus，Thermoplasma，Thermococcus，Pyrobaculum，Pyrococcus，Sulfolobus，Methanococcus，Methanosphaera，Methanopyrus，Methanobrevibacter，Methanocaldococcus和Methanobacterium。

在一个实施方案中，宿主细胞包含来源于真菌的异源核酸序列。合适的真菌特别地可选自Rhizopus，Phanerochaete，Emericella，Ustilago，Neurospora，Penicillium，Cephalosporium，Paecilomyces，Trichophytum和Aspergillus。

在一个实施方案中，宿主细胞包含来源于酵母的异源核酸序列。合适的酵母特别地可选自Candida，Hansenula，Kluyveromyces，Yarrowia，Schizosaccharomyces，Pichia，Yarrowia和Saccharomyces。

本领域技术人员应当明白，在根据本发明的方法中可以利用具有合适活性的生物催化剂(野生型，其中表达天然生物催化部分)或天然存在的生物催化部分的突变体。可以通过本领域技术人员已知的生物学技术，例如分子进化或合理设计(rational design)改进天然存在的生物催化部分的特性。可例如通过使用本领域技术人员已知的诱变技术修饰下述生物的编码DNA来制造野生型生物催化部分的突变体，所述生物能够发挥生物催化剂的作用或者能够生产生物催化剂部分(如酶)。它们包括随机诱变、定点诱变、定向进化和基因重组。具体地，可以修饰DNA，使其编码与野生型酶差异至少一个氨基酸的酶，使其编码与野生型相比包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的酶，或者使得突变体组合两个或更多亲本酶的序列，或者影响合适的(宿主)细胞中藉此被修饰的DNA的表达。后者可以通过本领域技术人员已知的方法如密码子优化或密码子对优化来实现，例如基于WO 2008/000632中所述方法。

突变体生物催化剂可具有经改进的特性，例如关于一个或多个以下方面：底物选择性、活性、稳定性、溶剂耐受性、pH谱、温度谱、底物谱、对抑制的敏感性、辅因子利用和底物亲和力。可以通过应用例如合适的高通量筛选或选择方法，基于本领域技术人员已知的这类选择方法，来鉴定具有改进的特性的突变体。

根据本发明，从AKG制备AKP。AKG原则上可以任何方式获得。特别地，AKG可通过为异源生物催化剂提供可转化成AKG的合适碳源(例如通过使碳源发酵)而以生物催化方式获得。在一个有利方法中，利用对碳源进行完整细胞转化以形成AKG来制备AKG。

碳源可尤其含有至少一种选自下组的化合物：一元醇、多元醇、羧酸、一氧化碳、脂肪酸、甘油酯，包括任何所述化合物的混合物。合适的一元醇包括甲醇和乙醇。合适的多元醇包括甘油和碳水化合物。合适的脂肪酸或甘油三酯可尤其以食用油的形式提供，优选地为植物来源。

尤其可以使用碳水化合物，因为通常碳水化合物可从生物可更新来源如农产品(优选农业废料)中大量获得。优选地，使用选自下组的碳水化合物：葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、蔗二糖、淀粉、纤维素和半纤维素。尤其优选的是葡萄糖、包含葡萄糖的寡糖和包含葡萄糖的多糖。

在本发明的一个实施方案中，使用将AKG转化成AKA的生物催化剂将AKG转化成AKA，所述生物催化剂的一部分来源于赖氨酸生物合成的AAA途径。这种转化可包括一个或多个反应步骤，所述步骤可由一种或多种生物催化剂催化。

用于催化将AKG转化成AKA的生物催化剂或其部分可以是同源或异源的。特别地，形成赖氨酸生物合成AAA途径一部分的生物催化剂可见于选自以下的生物中：酵母、真菌、古细菌和细菌，特别是选自Penicillium，Cephalosporium，Paecilomyces，Trichophytum，Aspergillus，Phanerochaete，Emericella，Ustilago，Schizosaccharomyces，Saccharomyces，Candida，Kluyveromyces，Yarrowia，Pichia，Hansenula，Thermus，Deinococcus，Pyrococcus，Sulfolobus，Thermococcus，Methanococcus，Methanosarcina，Methanocaldococcus，Methanosphaera，Methanopyrus，Methanobrevibacter，Methanospirillum和Methanothermobacter。合适的生物催化剂可见于能产生高柠檬酸的生物中，例如固氮菌如蓝细菌(如Anabaena，Microcystis，Synechocystis)、根瘤菌(如Rhizobium，Bradyrhizobium)、变形菌(proteobacteria)(如Pseudomonas，Azotobacter，Klebsiella)和放线菌(如Frankia)的固氮酶复合物的生物催化剂。因此，使用基于天然包含赖氨酸生物合成AAA途径或其部分的宿主细胞的生物催化剂，则该系统可以是同源的。

在本发明的一个优选实施方案中，期望通过生物催化剂实现AKA的高生产力。含有赖氨酸生物合成AAA途径或其部分的生物催化剂可通过本领域已知方法进行修饰(例如突变/筛选或代谢工程)以实现该效果。AKA的高水平可以通过提高其形成所涉及的酶活性和/或降低其转化(例如转化成氨基己二酸)所涉及的活性来产生。

AKA形成所涉及的酶包括高柠檬酸合酶(EC 2.3.3.14)高乌头酸酶(EC4.2.1.36)和高异柠檬酸脱氢酶(EC 1.1.1.87)。这些酶在宿主细胞中的活性可通过本领域已知方法来提高，例如(过)表达编码相应酶和/或功能同源物的基因，减轻底物、产物或其它化合物的抑制，或通过分子进化或推理性设计来提高这些酶的催化特性。进行定向进化的优选方法可基于WO 2003/010183。

由于期望所产生的AKA转化成氨基己二酸(AAA)——这将是赖氨酸生物合成途径中的另一步——所以优选的是所述异源生物催化剂不具有催化该转化的酶(特别是氨基转移酶如氨基己二酸氨基转移酶(EC2.6.1.39)或能催化该反应的氨基酸脱氢酶)的活性，或该活性很低。因此，对于提供该生物催化剂的宿主细胞包含编码这种酶之基因的情况，优选对该基因进行失活、敲除，或降低该基因的表达。由于这一步是赖氨酸产生的AAA途径中必要的，所以具有供应生长和维持所需赖氨酸量的有限最低活性但不能够将AKA高水平转化成AAA的宿主细胞是有利的。特别地，对于宿主为Penicillium chrysogenum的情况，氨基转移酶可具有SEQ ID NO 68的序列或其同源物。

可以通过若干方法来失活编码不期望活性的基因。一种方法是使用翻译分子或RNAi分子的瞬时方法(例如基于Kamath et al.2003.Nature421：231-237)。另一种是使用调节型启动子系统，其可使用外来触发剂(如四环素)进行开关(例如基于Park and Morschhauser，2005，Eukaryot.Cell.4：1328-1342)。另一种是应用化学抑制剂或蛋白抑制剂或物理抑制剂(例如基于Tour et al.2003.Nat Biotech 21：1505-1508)。优选得多的方法是除去编码不期望活性的完整基因或其部分。为了或者这样的突变体，可以应用本领域已有方法，例如单交叉重组或双同源重组。为此，需要构建整合型克隆载体，其可整合在宿主细胞染色体的预定靶位点处。在本发明的一个优选实施方案中，整合型克隆载体包含DNA片段，其与宿主细胞基因组中预定靶位点的DNA序列同源，用于将克隆载体的整合靶向至该预定位点。为了促进靶向整合，该克隆载体优选在转化宿主细胞前线性化。优选进行线性化以使得克隆载体的至少一个末端(优选两个末端)的侧翼为与靶位点同源的序列。靶位点侧翼的同源序列的长度优选为至少0.1kb，甚至更优选至少0.2kb，更优选至少0.5kb，甚至更优选至少1kb，最优选至少2kb。实验中最终的最适长度取决于生物、靶DNA的序列和长度。

优选地，通过宿主细胞增强的同源重组能力来提高核酸构建体通过同源重组靶向整合至宿主细胞基因组(即整合在预定靶位点)的效率。细胞的这种表型优选涉及WO 05/95624所述缺陷型hdfA或hdfB基因。WO 05/95624公开了获得靶向整合效率提高的丝状真菌细胞的方法，其通过阻止DNA片段在基因组中的非同源随机整合来实现。载体系统可以是单个载体或质粒，或者两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的全部DNA。

可通过原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生来转化真菌细胞。用于转化真菌宿主细胞的合适方案描述于EP 238023或Yelton et al.(1984.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 81：1470-1474)。使用根癌农杆菌转化丝状真菌宿主细胞的合适方案描述于de Groot M.J.et al.(1998.Nat.Biotechnol.16：839-842.Erratum in：Nat.Biotechnol.1998.16：1074)。也可以应用其它方法，如针对Neurospora crassa描述的电穿孔。

使用共转化来转染真菌细胞，即，将目的基因与选择标记基因一起转化。这可以是与目的基因物理连接(如在质粒上)，或在单独的片段上。转染后，对转化体筛选该选择标记基因的存在，随后分析在优选预定基因组位点的整合。选择标记是提供针对杀生物剂或病毒的抗性、重金属抗性、原养型或营养缺陷型等的产物。有用的选择标记包括但不仅限于amdS(乙酰胺酶)，argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)，bar(膦丝菌素乙酰转移酶)，hygB(潮霉素磷酸转移酶)，niaD(硝酸还原酶)，pyrG(乳清苷-5′-磷酸脱羧酶)，sC或sutB(硫酸腺苷转移酶)，trpC(氨基苯甲酸合酶)，ble(腐草霉素抗性蛋白)及其等同物。最优选的情况是提供第一DNA片段的DNA分子，所述第一DNA片段包含期望的取代序列(及选择标记基因)，其5’和3’侧翼是与靶序列侧翼染色体DNA序列基本同源的DNA序列。可以通过第一DNA片段中选择标记的存在情况来选择染色体DNA序列的靶序列替换为期望的取代序列的细胞。为了提高选择正确突变体微生物菌株的相对频率，可以将包含表达盒的第二DNA片段与上述片段可操作地连接，所述表达盒包含编码选择标记的基因和在真核细胞中有功能的调节序列(即，靶位点的5’侧翼+选择标记基因+靶位点的3’侧翼)，并可通过第一DNA片段中存在选择标记和不存在所述第二选择标记来选择染色体DNA序列中靶序列被替换为期望的取代序列的细胞。

对于形成赖氨酸生物合成的氨基己二酸途径的酶系统对宿主细胞而言是异源的情况下，优选宿主细胞中不包含编码催化酮己二酸转化成氨基己二酸的酶的基因。术语“酶系统”在本文中特别指可催化特定转化的单个酶或酶组。所述转化可包括有已知或位置中间体的一个或多个化学反应，例如AKG转化成AKA或AKA转化成AKP。这种系统可以存在与细胞中，或者从细胞中分离出来。已知氨基转移酶经常具有宽底物范围。可能期望降低宿主细胞中一种或多种这些酶的活性，以使得AKA向AAA的转化被降低，而同时维持其它氨基酸或细胞组分的生物合成的相关催化功能。还优选不含有导致AKA转化成不期望副产物的任何其它酶活性的宿主细胞。

在另一实施方案中，AKG转化成AKA，其中利用催化AKG C₁延伸成AKA的至少一种异源生物催化剂。所述生物催化剂可包括来源于一种或多种来源生物的一种或多种酶(例如包括来源于不同来源生物的多于一种酶)。特别地，用于由AKG制备AKA的合适生物催化剂选自催化α-酮戊二酸C₁延伸成α-酮己二酸和/或α-酮己二酸C₁延伸成α-酮庚二酸的生物催化剂。

其后，由AKG制备的AKA可转化成AKP，其中利用催化AKA延伸成AKP的至少一种异源生物催化剂。这些生物催化剂可以与催化AKG通过C₁延伸转化成AKA的生物催化剂相同或不同。可以使用一种或多种生物催化剂将AKA转化成AKP。所述生物催化剂可包括来源于一种或多种来源生物的一种或多种生物催化剂(例如包括来源于不同来源生物的多余一种酶)。

利用C₁延伸的生物合成途径已知作为辅酶B生物合成的一部分和生物素生物合成的一部分存在于产甲烷古细菌中。辅酶B被认为是这些生物中甲烷产生所必需的，α-酮辛二酸是辅酶B生物合成中的一种重要中间体。在这些产甲烷古细菌中，α-酮戊二酸在多个反应步骤中通过逐步添加亚甲基而转化成α-酮己二酸，然后转化成α-酮庚二酸，最终转化成α-酮辛二酸(也参见图1)：

a.C_n的α-酮酸+乙酰CoA→高_n柠檬酸+CoA-SH(图1的步骤1、5和9)

b.高_n柠檬酸←→高_n-乌头酸(由高_n-柠檬酸脱水酶催化(图1的步骤2、6和10)

c.高_n乌头酸←→异高_n-柠檬酸(图1的步骤3、7和11)

d.高_n-异柠檬酸+NADP⁺→长度C_n+1的α-酮酸+NADPH+H⁺+CO₂(图1的步骤4、8和12)

其中n选自1-4。

已经针对产甲烷菌Methanosarcina thermophila和Methanocaldococcusjannashii描述了这一重复反应顺序。其它代谢途径中其它α-酮羧酸的C₁延伸涉及相似的非重复性反应，例如氧化柠檬酸循环中草酰乙酸转化成α-酮戊二酸，作为亮氨酸的异丙基苹果酸途径的一部分的α-异戊酸转化成α-异己酸，赖氨酸的AAA途径中α-酮戊二酸转化成α-酮己二酸，异亮氨酸的丙酮酸途径中丙酮酸转化成α-酮丁酸，以及马来酸转化成丙酮酸。这些反应统称为“C₁延伸”。

已经描述了和表征了来自M.jannashii的涉及C₁延伸的若干基因和酶。这些酶及其编码基因显示彼此相似，并与其它生物中参与C₁延伸的其它酶及其编码基因相似。将α-酮戊二酸经α-酮己二酸和α-酮庚二酸反复延伸成α-酮辛二酸的一个酶的亚组称为“Aks”。已经在M.jannashii基因组中鉴定了编码这些酶的基因中的一些，并提出了另一些。

本发明人意识到，通过向合适的宿主细胞中掺入编码参与C₁延伸之酶系统的一种或多种核酸序列，C₁延伸可用于以工业规模制备AKA或AKP，这样AKA或AKP可供作为制备己二酸的中间体。

特别地，用于催化C₁延伸从而形成AKA或AKP的酶系统可包括选自以下的一种或多种酶：高_n-柠檬酸合酶、高_n-顺乌头酸酶和异高_n-柠檬酸脱氢酶，其中n选自1至4。

特别地，高_n-柠檬酸合酶可催化C₁延伸中的“反应a”。高_n-柠檬酸合酶定义为能使链长C_4+n的α-酮二酸与乙酰CoA缩合而形成高_n-柠檬酸的酶，其中n选自1至4。特别地，高_n-柠檬酸合酶可以是EC 2.3.3或归类为EC 2.3.3。更特别地，合适的高_n-柠檬酸合酶可选自高柠檬酸合酶(EC2.3.3.14)，或者可归类为EC 2.3.3.1、2.3.3.2、2.3.3.4或2.3.3.9。特别优选的是具有高_(n)柠檬酸活性的AksA或其同源物。

特别地，高_n-顺乌头酸酶可催化C₁延伸中的“反应b”和/或“反应c”。高_n-顺乌头酸酶定义为能将高_n-柠檬酸经过高_n-顺乌头酸中间体转化成异高_n-柠檬酸或至少一个可逆半反应(即高_n-顺乌头酸至高_n-柠檬酸或高_n-顺乌头酸至异高_n-柠檬酸)的酶，其中n选自1至4。特别地，高_n-顺乌头酸酶可以是EC 4.2.1，或可归类为EC 4.2.1。更具体地，合适的高_n-顺乌头酸酶可选自高顺乌头酸酶(EC 4.2.1.36)，或者可归类为EC 4.2.1.3、4.2.1.33、4.2.1.79和4.2.1.99。特别优选的是选自以下的酶：AksD、AksE、具有高_n-顺乌头酸酶活性的AksD同源物和AksE同源物。

特别地，高_n-异柠檬酸脱氢酶可催化C₁延伸中的“反应d”。异高_n-柠檬酸脱氢酶定义为能将异高_n-柠檬酸转化成链长C_5+n的α-酮二酸并由此释放CO₂的酶，其中n选自1至4。特别地，异高_n-柠檬酸脱氢酶是EC1.1.1，或可归类为EC 1.1.1。更特别地，合适的异高_n-柠檬酸脱氢酶可选自异高柠檬酸脱氢酶(EC 1.1.1.87)，或可归类为EC 1.1.136、1.1.137、1.1.1.38、1.1.139、1.1.1.40、1.1.1.41、1.1.1.42、1.1.1.82、1.1.1.83、1.1.1.84、1.1.1.85和1.1.1.286。特别优选的是AksF或其具有高_n-异柠檬酸脱氢酶活性的同源物。

产甲烷菌可作为生产AKP的生物催化剂，或者可用作这些生物催化剂的来源。可通过检索与来自C₁延伸途径的已知酶相似的蛋白质和核苷酸序列来鉴定合适的生物催化剂。可以使用本领域熟知的生物信息学技术在序列数据库中高效地鉴定相似的序列。可以使用本领域已知的分子生物学方法(如Southern杂交或使用简并寡核苷酸的PCR技术)在培养生物和环境样品中鉴定相似的基因。克隆和测序后，这些生物催化剂可在异源宿主中用于生产AKP。

特别地，可以使用来自选自以下的产甲烷菌的一种或多种催化C₁延伸的酶：Methanococcus，Methanospirillum，Methanocaldococcus，Methanosarcina，Methanothermobacter，Methanosphaera，Methanopyrus和Methanobrevibacter。更特别地，可以使用来自选自以下的产甲烷菌的一种或多种酶：Methanothermobacter thermoautotropicum，Methanococcusmaripaludis，Methanosphaera stadtmanae，Methanopyrus kandleri，Methanosarcina thermophila，Methanobrevibacter smithii，Methanococcusvannielii，Methanospirillum hungatei，Methanosaeta thermophilaMethanosarcina acetivorans和Methanococcus aeolicus。

此外，用于催化AKG和/或AKA的C₁延伸的合适酶例如可见于这样的生物中，所述生物包含催化通过氨基己二酸途径进行赖氨酸生物合成的酶系统或其部分，或者包含其同源物作为其它代谢的一部分，例如参与氮固定的高柠檬酸合酶。特别是选自以下的生物：酵母和真菌，例如Penicillium，Cephalosporium，Aspergillus，Phanerochaete，Emericella，Ustilago，Paecilomyces，Trichophytum，Yarrowia，Hansenula，Schizosaccharomyces，Saccharomyces，Candida，Kluyveromyces，特别是Penicillium chrysogenum，Penicillium notatum，Paecilomyces carneus，Paecilomyces persinicus，Cephalosporium acremonium，Aspergillus niger，Emericella nidulans，Aspergillys oryzae，Ustilago maydis，Schizosaccharomyces pombe，Saccharomyces cerevisiae，Yarrowia lipolytica，Hansenula polymorpha，Candida albicans，Candida maltosa和Kluyveromyces lactis；细菌，如Azotobacter，Pseudomonas，Klebsiella，Deinococcus，Thermus，特别是Azotobacter vinelandii，Pseudomonas stutzerii，Klebsiella pneumoniae，Deinococcus radiourans，Deinococcus geothermalis，Thermus thermophilus；古细菌，如Pyrococcus，Sulfolobus，Thermococcus，Methanococcus，Methanocaldococcus，Methanosphaera，Methanopyrus，Methanospirillum，Methanobrevibacter，Methanosarcina和Methanothermobacter，特别是Pyrococcus horikoshii，Sulfolobus solfataricus，Thermococcus kodakarensis，Methanococcus maripaludis，Methanococcus aeolicus，Methanococcus vannielii，Methanocaldococcus jannashii，Methanosphaera stadtmanae，Methanopyruskandleri，Methanobrevibacter smithii，Methanosarcina thermophilus，Methanospirillum hungatei，Methanosaeta thermophila，Methanosarcinaacetivorans和Methanothermobacter thermoautotrophicum。特别地，这些酵母、真菌、细菌、古细菌或其它生物可提供能催化AKG延伸成AKA(和任选地AKA延伸成APK)中的“反应a”的高柠檬酸合酶。

此外，用于催化AKP制备中反应步骤的合适生物催化剂可见于Asplenium或Hydnocarpus，特别是Asplenium septentrionale或Hydnocarpusanthelminthica，其天然地能够产生AKP。

在一个优选实施方案中，使用选自以下的一种或多种酶：Aks及其同源物，特别是选自AksA、AksD、AksE、AksF及其同源物。这些Aks酶同源物的实例以及编码这些酶的基因在下表中给出。

特别地，可使用以下序列号中任一项所示的酶：SEQ ID 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、261、264、267、273、276、279、282(AksA)、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、186、189、192、195、225、228、231、234(AksD)、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、198、201、204、207、237、240、243、246(AksE)、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、210、213、216、219、222、249、252、255、258(AksF)、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53(AksA同源物)、54、55、56、57、58、59、60、61(AksD同源物)、62、63、64、65、66、67(AksF同源物)、69、70、71、72、73、74、75、76、77、270(AksA同源物)。

本发明人认识到，可以通过脱羧将AKP转化成5-FVA。

在一个具体实施方案中，在脱羧酶或其它催化这种转化的生物催化剂存在下用生物催化方法将AKP转化成5-FVA。

在一个优选实施方案中，在能催化α-酮酸脱羧的生物催化剂存在下将AKP转化成5-FVA。因此，具有这种催化活性的酶可称为α-酮酸脱羧酶。

所述酸优选是二酸，其中所述生物催化剂对与酮基相邻的酸基团具有选择性。

一般而言，合适的脱羧酶具有α-酮庚二酸脱羧酶活性，能催化AKP转化成5-FVA。

特别地，能使α-酮酸脱羧的酶可选自脱羧酶(E.C.4.1.1)，优选选自支链α-酮酸脱羧酶、α-酮异戊酸脱羧酶(EC 1.2.4.4)、α-酮戊二酸脱羧酶(EC 4.1.1.71)和丙酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.1).

特别地，一种或多种其它合适的脱羧酶可选自草酸脱羧酶(EC4.1.1.2)、草酰乙酸脱羧酶(EC 4.1.1.3)、乙酰乙酸脱羧酶(EC 4.1.1.4)、缬氨酸脱羧酶/亮氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.14)、3-羟基谷氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.16)、2-酮戊二酸脱羧酶(EC 4.1.1.71)和二氨基丁酸脱羧酶(EC 4.1.1.86)。

特别地，脱羧酶可以是选自以下的生物的脱羧酶：倭瓜；黄瓜；酵母；真菌如Saccharomyces cerevisiae，Candida flareri，Hansenula sp.，Kluyveromyces marxianus，Rhizopus javanicus，Zymomonas mobilis，更特别地为Zymomonas mobilis的突变体I472A，以及Neurospora crassa；哺乳动物，特别是来自哺乳动物的脑；以及细菌。特别地可使用来自Pseudomonas的草酰乙酸脱羧酶。

特别地，根据本发明使用的脱羧酶可选自α-酮酸脱羧酶，其来自Lactococcus lactis，Lactococcus lactis var.maltigenes or Lactococcus lactissubsp.Cremoris；支链α-酮酸脱羧酶，其来自Lactococcus lactis菌株B1157或Lactococcus lactis IFPL730；丙酮酸脱羧酶，来自Saccharomycescerevisiae，Candida flareri，Zymomonas mobilis，Hansenula sp.，Rhizopusjavanicus，Neurospora crassa或Kluyveromyces marxianus；α-酮戊二酸脱羧酶，来自Mycobacterium tuberculosis；谷氨酸脱羧酶，来自E.coli，Lactobacillus brevis，Mycobacterium leprae，Neurospora crassa或Clostridiumperfringens；以及天冬氨酸脱羧酶，来自E.coli。

在一个具体实施方案中，AKP用化学方式转化成5-FVA。可以基于Tetrahedron Lett.1982，23(4)，459-462所述方法，通过用仲胺(如吗啉)在除去共沸水并同时失去CO₂的条件下高效地将2-酮酸脱羧成相应的醛。随后使中间体末端烯胺水解成相应的醛。

原则上，(从AKP制备的)5-FVA可以任何化学或生物催化方式转化成己二酸。优选地，通过使醛基氧化而使5-FVA转化成己二酸。这可以化学方式实现，例如通过选择性化学氧化。在本发明的一个优选方法中，所述制备包括在能催化醛基氧化的生物催化剂存在下进行的生物催化剂反应。所述生物催化剂可利用NAD或NADP作为辅因子。

特别地，能催化醛基氧化的酶可选自氧化还原酶(EC 1.2.1)，优选选自醛脱氢酶(EC 1.2.1.3，EC 1.2.1.4和EC 1.2.1.5)、丙二酸半醛脱氢酶(EC1.2.1.15)、琥珀酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.16和EC 1.2.1.24)、乙醛脱氢酶(乙酰化)(EC 1,2,1,10)、天冬氨酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.11)、戊二酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.20)、氨基己二酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.31)、己二酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.63)。已经在KEGG数据库中描述了例如己内酰胺降解途径的己二酸半醛脱氢酶活性。

醛脱氢酶原则上可来自或衍生自任何生物。生物可以是原核生物或真核生物。所述生物可尤其选自细菌、古细菌、酵母、真菌、原生生物、植物和动物(包括人)。

在一个实施方案中，所述细菌选自Acinetobacter(尤其是Acinetobacter baumanii和Acinetobacter sp.NCIMB9871)、Azospirillum(尤其是Azospirillum brasilense)、Ralstonia、Bordetella、Burkholderia、Methylobacterium、Xanthobacter、Sinorhizobium、Rhizobium、Nitrobacter、Brucella(尤其是B.melitensis)、Pseudomonas、Agrobacterium(尤其是Agrobacterium tumefaciens)、Bacillus、Listeria、Alcaligenes、Corynebacterium、Escherichia和Flavobacterium的组。

在一个实施方案中，所述生物选自酵母和真菌的组，尤其是选自Aspergillus(尤其是A.niger和A.nidulans)和Penicillium(尤其是P.chrysogenum)的组。

在一个实施方案中，所述生物是植物，特别是Arabidopsis，尤其是A.thaliana。

在一个具体实施方案中，所述生物催化剂包括SEQ ID 78，79，80，81所示的酶或其同源物。

本发明方法中的反应条件可根据生物催化剂、尤其是酶的已知条件，本文公开的信息和任选地一些常规实验来选择。

原则上，使用的反应培养基的pH可以在宽泛的界限内选择，制药生物催化剂在所述pH条件下有活性即可。可以使用碱性、中性或酸性条件，取决于生物催化剂和其它因素。当所述方法包括使用微生物(例如用于表达催化本发明方法的酶)时，选择pH使得所述微生物能够发挥其预期的一种或多种功能。在25℃下基本水性体系的情况下，尤其可在低于中性pH四个pH单位和高于中性pH两个pH单位的范围内选择pH，即在pH 3和pH9之间选择。如果水是唯一的溶剂或主要的溶剂(以总液体为基础＞50wt.％，尤其是＞90wt.％)，则系统被认为是水性的，其中例如小量(以总液体为基础＜50wt.％，尤其是＜10wt.％)的醇或另一种溶剂可以下述浓度溶解(例如作为碳源)，所述浓度使得可以存在的微生物保持活性。尤其是在使用酵母和/或真菌的情况下，可优选酸性条件，尤其是25℃下基于基本水性体系的pH可以在pH 3到pH 8的范围内。需要时可以使用酸和/或碱调节或者用合适的酸和碱的组合缓冲pH。

原则上，孵育条件可以在在广阔的界限内选择，只要生物催化剂显示足够的活性和/或生长即可。这包括需氧、微需氧、限氧和厌氧的条件。

厌氧条件在本文中被定义为下述条件：无任何氧，或其中生物催化剂(尤其是微生物)基本不消耗氧并且通常对应于少于5mmol/l.h的氧消耗，尤其是小于2.5mmol/l.h的氧消耗，或小于1mmol/l.h的氧消耗。

需氧条件是下述条件，其中对不受限制的生长而言足够水平的氧溶于培养基中，能够支持至少10mmol/l.h、更优选地多于20mmol/l.h、进一步更优选地多于50mmol/l.h、最优选地多于100mmol/l.h的氧消耗速率。

限氧条件被定义为下述条件：其中氧消耗由从气体转移至液体的氧限制。限氧条件的下限由厌氧条件的上限决定，即至少1mmol/l.h，尤其是至少2.5mmol/l.h，或至少5mmol/l.h。限氧条件的上限由需氧条件的下限决定，即少于100mmol/l.h、少于50mmol/l.h、少于20mmol/l.h或少于10mmol/l.h。

条件是需氧、厌氧还是限氧取决于所述方法进行的条件，尤其是进入气流的量和组成、使用的设备的实际混合/质量转移特性、使用的微生物的类型和微生物密度。

在本发明的一个优选实施方案中，至少AKP的制备是在发酵条件下进行的。

原则上，使用的温度不是关键性的，只要生物催化剂(尤其是酶)显示大量活性即可。通常，温度可以是至少0℃，尤其是至少15℃，更尤其是至少20℃。想要的最大温度取决于生物催化剂。通常这类最大温度是本领域已知的，例如在可商业获得的生物催化剂的情况下在产品数据表中指出，或者可以基于公知常识和本文公开的信息常规地测定。温度通常是90℃或更少，优选地是70℃或更少，尤其是50℃或更少，更尤其是40℃或更少。

具体地，如果生物催化反应在宿主生物外进行，则可以高浓度(例如大于50％，或大于90wt.％)使用包含有机溶剂的反应培养基，使得使用的酶在这样的培养基中保持足够的活性。

在本发明方法中制备的化合物可从其制备培养基中回收。回收条件可根据回收具体化合物的已知条件、本文公开的信息和任选地一些常规实验来选择。

可以使用本领域本身已知的分子生物学技术，构建包含用于在本发明方法中催化反应步骤的一种或多种酶的异源细胞。例如，这类技术可以被用于提供下述载体，所述载体包含一个或多个编码一种或多种所述生物催化剂的基因。包含一个或多个这类基因的载体可包含一个或多个调节元件，例如一个或多个启动子，所述启动子可与编码生物催化剂的基因可操作地连接。

在本文中使用时，术语“可操作地连接”是指功能性相互关系中多核苷酸元件(或编码序列或核酸序列)的一种连接。当核酸序列被置于与另一核酸序列的功能性相互关系之中时，所述核酸序列是“可操作地连接”的。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则所述启动子或增强子与所述编码序列可操作地连接。

在本文中使用时，术语“启动子”是指一种核酸片段，其功能是控制一个或多个基因的转录，根据转录的方向位于基因的转录起点上游，并且结构上由DNA-依赖性RNA聚合酶、转录起点和任何其它DNA序列的存在识别，所述任何其它DNA序列包括但不限于转录因子结合位点、阻抑因子和激活因子蛋白结合位点和本领域技术人员已知的直接或间接地作用以调节来自启动子的转录量的任何其它核苷酸序列。“组成型”启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。当用于指出给定的(重组的)核酸或多肽分子与给定的宿主生物或宿主细胞之间的相互关系时，术语“同源的”应当被理解为表示该核酸或多肽分子天然地由相同物种(优选地相同变种或菌株)的宿主细胞或生物生产。

可用于实现编码本发明方法中使用的酶(如上文所述)的核苷酸序列表达的启动子对编码要表达的酶(特别是氨基转移酶、氨基酸脱氢酶或脱羧酶)的核苷酸序列而言可以是天然的，或者可以对与之可操作地连接的核苷酸序列(编码序列)而言是异源的。优选地，启动子是同源的，即对宿主细胞而言是内源的。

如果使用(对编码感兴趣的酶的核苷酸序列而言)异源启动子，则所述异源启动子优选地能够生产比编码序列的天然启动子更高稳态水平的包含所述编码序列的转录本(或者单位时间能够生产更多转录本分子，即mRNA分子)。本发明上下文中合适的启动子包括本领域技术人员公知的组成型和诱导型启动子以及经改造的启动子。

“强组成型启动子”是与天然宿主细胞相比引起mRNA以高频率起始的启动子。革兰氏阳性微生物中这类强组成型启动子的例子包括SP01-26、SP01-15、veg、pyc(丙酮酸羧化酶启动子)和amyE。

革兰氏阳性微生物中诱导型启动子的例子包括IPTG诱导型Pspac启动子，木糖诱导型PxylA启动子。

革兰氏阴性微生物中组成型和诱导型启动子的例子包括但不仅限于tac、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara(P_BAD)、SP6、λ-P_R和λ-P_L。

用于(丝状)真菌细胞的启动子为本领域已知，并可包括如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶gpdA启动子，蛋白酶启动子如pepA、pepB、pepC，葡萄糖淀粉酶glaA启动子，淀粉酶amyA、amyB启动子，过氧化氢酶catR或catA启动子，葡萄糖氧化酶goxC启动子，β-半乳糖苷酶lacA启动子，α-葡萄糖苷酶aglA启动子，翻译延伸因子tefA启动子，木聚糖酶启动子如xlnA、xlnB、xlnC、xlnD，纤维素酶启动子如eglA、eglB、cbhA，转录调节子启动子如areA、creA、xlnR、pacC、prtT等或任何其它启动子，可见于NCBI网址(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)。

本发明还涉及新的异源细胞，其可提供能催化己二酸制备中至少一个反应步骤的一种或多种生物催化剂。本发明还涉及新载体，其包含编码能催化己二酸制备中至少一个反应步骤的一种或多种酶的一种或多种基因。特别地，一种或多种合适的基因选自编码上文所述酶的基因，更特别地选自编码催化将5-FVA转化成己二酸的酶的基因。特别地，至少一种所述酶对于宿主生物而言是异源的。

在一个特别有利的实施方案中，宿主细胞或载体包含AksD、AksE、AksF和NifV基因。在另一个特别有利的实施方案中，异源细胞还包含AksA基因。优选的AksA、AksD、AksE和AksF基因来自M.jannashii，from S.cerevisiae，来自M.Maripaludis，来自Methanosarcina acetivorans，来自Methanospirillum hungatei或来自E.coli。NifV基因优选来自Azotobacter vinelandii。

在一个特别优选的实施方案中，NifV基因包含SEQ ID NO：149所示序列或其功能类似物。

优选地，对于选自AksA、AksD、AksE和AksF基因的基因而言，本发明(所用)细胞的基因组包含至少至少一种以下核酸序列：SEQ ID NO145、146、147、148；SEQ ID NO 167、168、169、170、171、172、173、174；SEQ ID NO 177、178、179、180、181、182、183、184；SEQ ID NO224、226、236、238、248、250、260、262；SEQ ID NO 227、229、239、241、251、253、263、265；SEQ ID NO 194、196、206、208、221、223、281、283；SEQ ID NO 188、190、200、202、215、217、272、274及其功能类似物。在一个具体实施方案中，细胞包含选自所述序列的AksA、AksD、AksE和AksF基因。在另一个具体实施方案中，细胞包含含有SEQ ID NO：149所示序列的NifV基因或其功能同源物、选自所述序列AksD、AksE和AksF。

在一个特别优选的实施方案中，选自AksA、AksD、AksE和AksF基因的这些基因中的一个、两个、三个或每一个分别包含选自SEQ ID NO：145、146、147、148所示序列(分别为AksA、D、E和F)及其功能类似物的序列。在另一个特别优选的实施方案中，这些基因中的一个、两个、三个或每一个分别包含选自SEQ ID NO：167、168、169、170所示序列(分别为AksA、D、E和F)及其功能类似物的序列。

在一个特别优选的实施方案中，选自AksA、AksD、AksE和AksF基因的这些基因中的一个、两个、三个或每一个分别包含选自SEQ ID NO：260、224、236、248所示序列(分别为AksA、D、E和F)及其功能类似物的序列。

在一个特别优选的实施方案中，选自AksA、AksD、AksE和AksF基因的这些基因中的一个、两个、三个或每一个分别包含选自SEQ ID NO：262、226、238、250所示序列(分别为AksA、D、E和F)及其功能类似物的序列。

在一个特别优选的实施方案中，选自AksA、AksD、AksE和AksF基因的这些基因中的一个、两个、三个或每一个分别包含选自SEQ ID NO：263、227、239、251所示序列(分别为AksA、D、E和F)及其功能类似物的序列。

在一个特别优选的实施方案中，选自AksA、AksD、AksE和AksF基因的这些基因中的一个、两个、三个或每一个分别包含选自SEQ ID NO：265、229、241、253所示序列(分别为AksA、D、E和F)及其功能类似物的序列。

在一个特别优选的实施方案中，选自AksA、AksD、AksE和AksF基因的这些基因中的一个、两个、三个或每一个分别包含选自SEQ ID NO：281、194、206、221所示序列(分别为AksA、D、E和F)及其功能类似物的序列。

在一个特别优选的实施方案中，选自AksA、AksD、AksE和AksF基因的这些基因中的一个、两个、三个或每一个分别包含选自SEQ ID NO：283、196、208、223所示序列(分别为AksA、D、E和F)及其功能类似物的序列。

在一个特别优选的实施方案中，选自AksA、AksD、AksE和AksF基因的这些基因中的一个、两个、三个或每一个分别包含选自SEQ ID NO：272、188、200、215所示序列(分别为AksA、D、E和F)及其功能类似物的序列。

在一个特别优选的实施方案中，选自AksA、AksD、AksE和AksF基因的这些基因中的一个、两个、三个或每一个分别包含选自SEQ ID NO：274、190、202、217所示序列(分别为AksA、D、E和F)及其功能类似物的序列。

在一个特别优选的实施方案中，选自AksA、AksD、AksE和AksF基因的这些基因中的一个、两个、三个或每一个分别包含选自SEQ ID NO：161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174所示序列(分别为AksA、D、E和F)及其功能类似物的序列。在一个特别优选的实施方案中，选自AksA、AksD、AksE和AksF基因的这些基因中的一个、两个、三个或每一个分别包含选自SEQ ID NO：177、178、179、180所示序列(分别为AksA、D、E和F)及其功能类似物的序列。

在一个特别优选的实施方案中，所述细胞的基因组包含SEQ ID 145所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 146所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 147所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 148所示核酸序列或其功能类似物以及SEQ ID 149所示核酸序列或其功能类似物。

在一个特别优选的实施方案中，所述细胞的基因组包含SEQ ID 146所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 147所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 148所示核酸序列或其功能类似物以及SEQ ID 149所示核酸序列或其功能类似物。

在一个特别优选的实施方案中，所述细胞的基因组包含SEQ ID 172所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 173所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 174所示核酸序列或其功能类似物以及SEQ ID 149所示核酸序列或其功能类似物。

在一个特别优选的实施方案中，所述细胞的基因组包含SEQ ID 224所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 236所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 248所示核酸序列或其功能类似物以及SEQ ID 149所示核酸序列或其功能类似物。

在一个特别优选的实施方案中，所述细胞的基因组包含SEQ ID 227所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 239所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 251所示核酸序列或其功能类似物以及SEQ ID 149所示核酸序列或其功能类似物。

在一个特别优选的实施方案中，所述细胞的基因组包含SEQ ID 194所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 206所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 221所示核酸序列或其功能类似物以及SEQ ID 149所示核酸序列或其功能类似物。

在一个特别优选的实施方案中，所述细胞的基因组包含SEQ ID 188所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 200所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 215所示核酸序列或其功能类似物以及SEQ ID 149所示核酸序列或其功能类似物。

在一个特别优选的实施方案中，所述细胞的基因组包含SEQ ID 177所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 178所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 179所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 180所示核酸序列或其功能类似物以及SEQ ID 149所示核酸序列或其功能类似物。

在一个特别优选的实施方案中，所述细胞的基因组包含SEQ ID 224所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 236所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 248所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 260所示核酸序列或其功能类似物以及SEQ ID 149所示核酸序列或其功能类似物。

在一个特别优选的实施方案中，所述细胞的基因组包含SEQ ID 227所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 239所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 251所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 263所示核酸序列或其功能类似物以及SEQ ID 149所示核酸序列或其功能类似物。

在一个特别优选的实施方案中，所述细胞的基因组包含SEQ ID 194所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 206所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 221所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 281所示核酸序列或其功能类似物以及SEQ ID 149所示核酸序列或其功能类似物。

在一个特别优选的实施方案中，所述细胞的基因组包含SEQ ID 188所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 200所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 215所示核酸序列或其功能类似物、SEQ ID 272所示核酸序列或其功能类似物以及SEQ ID 149所示核酸序列或其功能类似物。

已经使用大肠杆菌宿主细胞获得了在AKP生产方面的良好结果，所述宿主细胞的基因组包含SEQ ID NO：149、167、168、169和170所示异源核酸序列。

已经使用大肠杆菌宿主细胞获得了在AKP生产方面的良好结果，所述宿主细胞的基因组包含SEQ ID NO：149、168、169和170所示异源核酸序列。

已经使用S.cerevisiae宿主细胞获得了在AKP生产方面的良好结果，所述宿主细胞的基因组包含SEQ ID NO：149、172、173和174所示异源核酸序列。

已经使用大肠杆菌宿主细胞获得了在AKP生产方面的良好结果，所述宿主细胞的基因组包含SEQ ID NO：149、177、178、179、180所示异源核酸序列。

已经使用大肠杆菌宿主细胞获得了在AKP生产方面的良好结果，所述宿主细胞的基因组包含SEQ ID NO：149、224、236和248所示异源核酸序列。

已经使用大肠杆菌宿主细胞获得了在AKP生产方面的良好结果，所述宿主细胞的基因组包含SEQ ID NO：149、227、239和251所示异源核酸序列。

已经使用大肠杆菌宿主细胞获得了在AKP生产方面的良好结果，所述宿主细胞的基因组包含SEQ ID NO：149、194、206和221所示异源核酸序列。

已经使用大肠杆菌宿主细胞获得了在AKP生产方面的良好结果，所述宿主细胞的基因组包含SEQ ID NO：149、188、200和251所示异源核酸序列。

所述异源细胞可以特别地是上文在描述生物催化剂时所提到的细胞。

在一个具体实施方案中，所述细胞包含一种或多种编码酶系统的核酸序列，其可以是同源或异源的，所述酶系统能催化α-酮戊二酸转化成α-酮己二酸，其中所述酶系统形成赖氨酸生物合成的AAA生物合成途径的一部分，如上文所述。

所述异源细胞优选不具有能催化α-酮己二酸转化成α-氨基己二酸的氨基转移酶活性。如果在细胞中天然存在，则可通过失活、修饰或缺失细胞DNA中编码这些酶的基因来除去、降低或修饰该活性。该活性可来源于一种或多种生物催化剂。也可通过如分子进化或合理设计将它们修饰成不再具有任何不期望的活性，但仍保留任何期望的活性(例如本发明情况下的任何活性或宿主细胞代谢所需的活性)。

所述异源细胞优选不具有能将AKP、5-FVA或己二酸降解或转化成任何不期望的副产物的酶。如果鉴定出了任何这种活性(例如作为己二酸降解途径的一部分)，则可如上文所述除去、降低或修饰该活性。

优选地，所述细胞包含编码一种或多种酶的一种或多种异源核酸序列，所述酶催化α-酮戊二酸至成α-酮己二酸的C₁延伸和/或α-酮己二酸至α-酮庚二酸的C₁延伸。特别地，合适的核酸序列可选自编码Aks酶或其同源物的核酸序列，如上文所述。

特别地，对于旨在将细胞用于制备AKP(其将转化成下一产物，如5-FVA或己二酸)的情况，优选所述异源细胞包含编码催化这种转化的酶的核酸序列。这可以是有利的，例如因为至少一些可在细胞中有活性的催化C₁延伸的酶可能催化AKP不期望的延伸。如果催化该延伸的酶原则上能利用AKP作为底物，则通过在细胞中表达催化AKP转化成期望产物(如5-FVA)的酶，认为这种不期望的延伸可被降低或基本避免，

应该注意，一些参与C₁延伸的酶(如M.jannashii或A.vinelandii)中具有宽松的底物特异性，并能够转化不同碳长度的底物。已知许多酶具有宽松的底物特异性，使得它们能转化非天然底物。为了提高本发明(方法中所用)异源细胞的效率，特别优选的是提供能够催化从AKG制备AKP的反应步骤的酶系统，其对AKG延伸成AKA和/或AKA延伸成AKP显示高催化活性，而对AKP的进一步延伸显示低催化活性。可通过诸如上文所述的技术修饰能催化从AKG制备AKP的反应步骤的一种或多种酶(的编码核酸序列)以提高针对AKG和/或AKA延伸的反应特异性，和/或可修饰这些酶(的编码核酸序列)意识到对AKP(作为底物)的结合亲和力降低，从而降低对于AKP延伸的催化活性。

这种修饰可包括分子进化以产生多样性然后筛选期望的突变体和/或底物结合袋的合理改造。改变本发明方法所用酶的底物特异性的技术可以基于本领域描述的那些。具体地，可包括能催化C₁延伸中“反应a”的AksA酶或其同源物，以使得催化AKP延伸成α-酮辛二酸的活性相对于催化AKA延伸成AKP和/或AKG延伸成AKA的催化活性而言被降低。优选地，这些酶对于催化AKP延伸成α-酮辛二酸而言不显示显著活性。特别地，认为催化“反应a”的酶控制可通过C₁延伸获得的最大链长。

例如，使用结构和序列信息设计特定突变的合理改造已被用于修饰来自红霉素聚酮合酶的酰基转移酶结构域4的底物特异性，使其接受替代性的酰基供体。已经显示修饰提出的底物结合位点得到经修饰的结合袋，所述结合袋能够适应替代性的底物，得到不同的产物比例(Reeves，C.D.；Murli，S.；Ashley，G.W.；Piagentini，M.；Hutchinson，C.R.；McDaniel，R.Biochemistry 2001，40(51)，15464-15470)。合理设计和分子进化途径二者均已被用于改变生物催化剂BM3的底物特异性得到大量下述突变体，所述突变体能够氧化大量多种不同烯烃、环烯烃、芳烃和杂芳烃来代替重链脂肪酸(例如肉豆蔻酸)的天然底物，或除所述天然底物以外还能氧化大量多种不同烯烃、环烯烃、芳烃和杂芳烃(Peters，M.W.；Meinhold，P.；Glieder，A.；Arnold，F.H.Journal of the AmericanChemical Society 2003，125(44)，13442-13450；Appel，D.；Lutz-Wahl，S.；Fischer，P.；Schwaneberg，U.；Schmid，R.D.Journal ofBiotechnology 2001，88(2)，167-171和其中的参考文献)。

在一个实施方案中，所述异源细胞包含编码高柠檬酸合酶的异源核酸序列，所述高柠檬酸合酶已由接受α-酮戊二酸作为底物但α-酮己二酸不是合适底物的高柠檬酸合酶进化成也接受α-酮戊二酸作为底物。特别地，这种酶可以是通过AAA途径参与赖氨酸生物合成的真菌酶或者细菌酶，例如来自Penicillium，Cephalosporium，Ustilago，Cephalosporium，Paelicomyces，Trichophytum，Phanerochaete，Emericella，Aspergillus，Yarrowoa，Schizosaccharomyces，Pichia，Hansenula，Klyuveromyces，Candida，Saccharomyces，Thermus，or Deinococcus，or from nitrogen fixing bacteria，e.g.Azotobacter，Frankia，Synecchocystis，Anabaena，Microcyctis，Rhizobium，Bradyrhizobium，Klebsiella或Pseudomonas。特别地，可以使用例如来自Azotobacter vinelandii的NifV，其已证实对AKA具有原始活性(Zheng，L.；White，R.H.；Dean，D.R.The Journal of Bacteriology 1997，179(18)，5963-5966)。编码所述酶的基因示于SEQ ID 149。

特别地，所述异源细胞可包含编码上文所述Aks酶或其同源物的核酸序列，更特别地，所述细胞可至少包含编码Aks酶或其同源物的核酸序列，优选为编码SEQ ID 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、69、70、71、72、73、74、75、76、77、261、264、267、270、273、276、279、282中任一序列所代表的酶或其同源物的核酸序列。

在另一优选实施方案中，所述细胞包含编码SEQ ID14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、54、55、56、57、58、59、60、61、186、189、192、195、225、228、231、234中任一序列所代表的酶或其同源物的至少一个核酸序列。

在另一优选实施方案中，所述细胞包含编码SEQ ID24、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、198、201、204、207、237、240、243、246中任一序列所代表的酶的至少一个核酸序列。

在另一优选实施方案中，所述细胞包含编码SEQ ID34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、62、63、64、65、66、67、210、213、216、219、222、249、252、255、258中任一序列所代表的酶的至少一个核酸序列。

在一个实施方案中，所述异源生物是基于具有用于赖氨酸生物合成的AAA途径的宿主细胞，其中可以异源表达能催化C₁延伸中“反应a”的高柠檬酸合酶(如AksA或其同源物)。这种高柠檬酸合酶优选能够选择性催化AKG和/或AKA延伸中的反应步骤(反应a)，而不显著催化AKP延伸。在这种情况下，缺失任何内源性高柠檬酸合酶可以是有益的，特别是如果它能够催化AKP延伸反应中的“反应a”的话。然后，这种宿主细胞可有效地含有一种或多种在AKG向AKA和/或AKA向AKP的C₁延伸中有功能活性的高柠檬酸合酶。然后可以通过内源性酶(例如参与氨基己二酸途径的酶)来催化实现AKG和/或AKA延伸的其它反应。

在一个优选实施方案中，本发明的异源细胞包含编码具有AKP脱羧酶活性的酶的核酸序列。

在一个优选实施方案中，本发明的异源细胞包含编码具有AKP脱羧酶活性的酶的核酸序列以及编码具有己二酸脱氢酶活性的酶的核酸序列。

根据本发明制备的己二酸可用作生产其它化合物(例如己二酸酯或聚合物)的中间体。特别地，所述聚合物可选自聚酯、聚氨酯和聚酰胺。

因此，本发明还涉及制备聚合物的方法，包括将在本发明己二酸制备方法中制备的己二酸与具有至少两个能与己二酸的羧酸官能团反应之官能团的化合物反应，从而形成所述聚合物。能与羧酸官能团反应的官能团是公知的，包括羟基、胺基(特别是伯胺基)和异氰酸基。

为了制备聚合物，可使具有至少两个胺官能团的胺与己二酸反应。原则上，任何这种多胺均可使用，特别是任何具有2至12个碳原子的胺基烷。在一个优选的实施方案中，将己二酸与环己二胺或1，4二氨基丁烷反应。该反应可以本领域公知的方式进行。

为了制备聚酯，可将具有至少两个羟基官能团的醇与己二酸反应。原则上，任何这种多元醇均可使用，特别是任何具有2至12个碳原子的多元醇。该反应可以本领域公知的方式进行。

此外，己二酸可用于制备己二酸酯，其可用作例如用于聚合物材料的增塑剂。

因此，本发明还涉及用于制备己二酸酯的方法，包括将在本发明己二酸制备方法中制备的己二酸与醇反应。原则上，任何有机酸均可使用，特别是任何具有2至12个碳原子的醇。该反应可以本领域公知的方式进行。

现将通过以下实施例描述本发明。

实施例

实施例1

一般方法

分子和遗传技术

标准遗传和分子生物学技术是本领域普遍已知的，并且先前已被描述(Maniatis et al.1982“Molecular cloning：a laboratory manual”.Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.；Miller 1972“Experiments inmolecular genetics”，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor；Sambrook and Russell 2001″Molecular cloning：a laboratory manual”(3rdedition)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress；F.Ausubel et al，eds.，″Current protocols in molecular biology″，Green Publishing and Wiley Interscience，New York 1987)。

质粒和菌株

pMS470(Balzer，D.；Ziegelin，G.；Pansegrau，W.；Kruft，V.；Lanka，E.Nucleic Acids Research 1992，20(8)，1851-1858.)和pBBR1MCS(Kovach ME，Phillips RW，Elzer PH，Roop RM 2nd，Peterson KM.Biotechniques.1994May；16(5)：800-2.pBBR1MCS：a broad-host-range cloning vector)之前已有描述。将大肠杆菌菌株TOP10和DH10B(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)用于所有克隆步骤。用大肠杆菌菌株BL21 A1(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和BL21(Novagen(EMD/Merck)，Nottingham，UK)进行蛋白质表达。

pRS414、pRS415和pRS416(Sikorski，R.S.and Hieter，P.A system ofshuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation ofDNA in Saccharomyces cerevisiae Genetics 122(1)，19-27(1989)；Christianson，T.W.，Sikorski，R.S.，Dante，M.，Shero，J.H.and Hieter，P.Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors.Gene 110(1)，119-122(1992))用于酿酒酵母中的表达。用酿酒酵母菌株CEN.PK 113-6B(ura3，trp1，leu2，MATa)、CEN.PK 113-5D(ura3，MATa)、CEN.PK 102-3A(ura3，leu2，MATa)和CEN.PK 113-9D(ura3，trp1，MATa)进行蛋白质表达。

培养基

2xTY培养基(16g/l tryptopeptone，10g/l酵母提取物，5g/l NaCl)用于培养大肠杆菌。添加抗生素(100μg/ml氨苄青霉素，50-100μg/ml新霉素)以在大肠杆菌中维持质粒。为了诱导大肠杆菌中的表达，以0.02％(阿拉伯糖)和0.2mM(IPTG)的终浓度使用阿拉伯糖(用于BL21-AI衍生物)和IPTG(用于pMS470，pBBR1MCS衍生物)。大肠杆菌的AKP生产在M9基本培养基(12.8g/L Na₂HPO₄.7H₂O，3g/L KH₂PO₄，0.5g/L NaCl，1g/L NH₄Cl，2mMMgSO₄，0.1mM CaCl₂)中进行，葡萄糖(1-4％)或甘油(1-4％)作为碳源，如下文所述。

含有4％葡萄糖的Verduyn培养基用于培养酿酒酵母。

质粒的鉴定

通过本领域普遍已知的遗传、生物化学和/或表型手段鉴定带有不同基因的质粒，如转化体对抗生素的抗性，转化体的PCR诊断性分析或质粒DNA的纯化，经纯化的质粒DNA的限制性分析或DNA序列分析。所有所述新构建体的整合均通过限制性消化并(如果涉及PCR步骤的话)额外通过测序来验证。

用于测定α-酮酸、6-ACA、5-FVA、己二酸和高 _(n) 柠檬酸的UPLC- MS/MS分析法

将Waters HSS T3柱1.8μm，100mm*2.1mm用于分离α-酮酸、6-ACA、5-FVA和高_(n)柠檬酸，洗脱梯度如表1所示。洗脱液A由LC/MS梯度水组成，含有0.1％甲酸，洗脱液B由乙腈组成，含有0.1％甲酸。流速为0.25ml/分钟，柱温保持40℃恒温。

表1：用于分离α-酮酸、6-ACA、5-FVA、己二酸和高_(n)柠檬酸的梯度洗脱程序

时间(分钟)	0	5.0	5.5	10	10.5	15
							％A	100	85	20	20	100	100
％B	0	15	80	80	0	0

利用多反应监测(MRM)，用Waters micromass Quattro micro API进行正电离或负电离模式的电喷雾，这取决于待分析的化合物。离子源温度保持在350℃，流速为500L/hr。

对于AKG、AKA、AKP、5-FVA、己二酸、高柠檬酸和高2-柠檬酸，用10至14eV使去质子化的分子破碎，产生来自例如H₂O、CO和CO₂丢失的特异性片段。

对于6-ACA，用13eV使去质子化的分子破碎，产生来自例如H₂O、CO和CO₂丢失的特异性片段。

为了测定浓度，运行合成制备的外标标准品的校准曲线，以计算各个离子的反应因数。这用于计算样品中的浓度。将样品适当稀释(2至10倍)与洗脱剂A中，以克服离子压抑和基体效应。

实施例2

通过大肠杆菌生产AKP

构建AKP生物合成途径

从数据库中获得以下蛋白质序列：Methanococcus jannaschii蛋白高柠檬酸合酶(AksA，MJ0503，[Sequence ID 4])，高顺乌头酸酶小亚基(AksE，MJ1271，[Sequence ID 24])，高顺乌头酸酶大亚基(AksD，MJ1003，[SequenceID 14])和高异柠檬酸脱氢酶(AksF，MJ1596，[Sequence ID 34])，其来自Methanococcus maripaludis的同源物(高柠檬酸合酶(AksA，MmarC5_1522，[Sequence ID 7])，高顺乌头酸酶小亚基(AksE，MmarC5 1257，[Sequence ID27])，高顺乌头酸酶大亚基(AksD，MmarC5 0098，[Sequence ID 17])和高异柠檬酸脱氢酶(AksF，MmarC5 0688，[Sequence ID 37])，以及A.vinelandii高柠檬酸合酶NifV，[Sequence ID 75])。

将M.jannaschii和M.maripaludis基因针对大肠杆菌进行密码子对优化(利用WO08000632所述方法)并用合成方法构建(Geneart，Regensburg，Germany)。在优化过程中，避免内部限制性位点，并在起点和终点引入通用限制性位点以在表达载体中进行亚克隆。此外，在AksD上游加入来自pMS470的tac启动子序列。每个ORF之前是共有的核酮糖结合位点和前导序列，以驱动在pMS470中翻译。此外，在AksD上游加入来自pMS470的tac启动子序列。用NdeI/XbaI切割合成的AksA[M.jannashii SequenceID 167，M.maripaludis Sequence ID 177]/AksF[M.jannashii Sequence ID 168，M.maripaludis Sequence ID 178]盒，并用XbaI/HindIII切割合成的AksD[M.jannashii Sequence ID 169，M.maripaludis Sequence ID 179]/AksE[M.jannashii Sequence ID 170，M.maripaludis Sequence ID 180]盒。将含有来自M.jannashii的Aks基因的片段插入pMS470的NdeI/HindIII位点中，以获得载体pAKP-180。将含有来自M.maripaluids的Aks基因的片段插入pM470的NdeI/HindIII位点，以获得载体pAKP-182。

含有来自Azotobacter vinelandii的NifV[Sequence ID 149]的大肠杆菌表达构建体(pDB555)得自D.Dean(Zheng L，White RH，Dean DR.Purification of the Azotobacter vinelandii nifV-encoded homocitrate synthase.JBacteriol.1997 Sep；179(18)：5963-6)。使用引物Avine-WT-R-BamHI[Sequence ID 150]和Avine-WT-F-SacI[Sequence ID 151]，使用phusionDNA聚合酶(Finnzymes)从该载体中PCR扩增nifV基因，并利用BamHI/SacI克隆到pAKP-180中AksA上游，产生载体pAKP-281。还使用引物Avine-WT-R-HindIII[Sequence ID 152]和Avine-WT-F-HindIII[Sequence ID 153]从该载体中PCR扩增nifV基因，并用HindIII克隆到pAKP-180和pAKP-182中AksE[Sequence ID 170]下游，分别产生载体pAKP-279和pAKP-280。

为了失活pAKP279和pAKP281中的aksA基因，分别用BamHI和BglII消化质粒，得到三个片段(566bp，1134bp和7776bp)。从琼脂糖凝胶中分离1134bp和7776bp大小的片段，并彼此连接。转化大肠杆菌后，检查质粒的取向，并选择两个片段的取向均与原始质粒pAKP279和pAKP281中相同的质粒，分别产生pAKP322和pAKP323。

大肠杆菌中的蛋白质表达和代谢物生产

将质粒pAKP-279、pAKP-280、pAKP-281、pAKP-322和pAKP-323转化到大肠杆菌BL21中进行表达。用10ml 2*TY培养基将起始培养物在管中培养过夜。将200μl培养物转移至含有20ml 2*TY培养基的摇瓶中。将瓶在定轨摇床上以30℃和280rpm孵育，4小时后以0.2mM终浓度加入IPTG，并将瓶以30℃和280rpm孵育4至16小时。离心收集来自20ml培养物的细胞，并重悬于24孔板中含有合适碳源的4ml M9培养基中。以30-37℃和210rpm孵育24至72小时后，离心收集细胞，分离沉淀和上清液并保持于-20℃用于分析。

制备用于分析的细胞级分

离心收集来自小规模培养(见上段)的细胞。将细胞沉淀重悬于1ml100％乙醇并剧烈振荡。将细胞悬液在95℃下加热2分钟，离心除去细胞碎片。将上清液在真空干燥器中政法，将所得沉淀溶于200μl去离子水。离心除去生育的碎片，并将上清液保持在-20℃。

分析上清液和细胞提取物

在UPLC-MS/MS分析之前，用水将上清液和来自细胞级分的提取物稀释5倍。结果明确显示，重组菌株中存在AKP和AAP。认为AKP向AAP的转化是由大肠杆菌中存在的天然氨基转移酶催化的。

表2：以葡萄糖或甘油作为碳源的AKP生产

质粒	级分	碳源	AKP[mg/l]	AAP[mg/l]
					pAKP-279	上清液	葡萄糖	3	n.d.
pAKP-279	细胞	葡萄糖	2	n.d.
					pAKP-281	上清液	葡萄糖	3	n.d.
pAKP-281	细胞	葡萄糖	2	n.d.
					pAKP-280	上清液	葡萄糖	2	n.d.
pAKP-322	上清液	葡萄糖	10	3
					pAKP-322	细胞	葡萄糖	8	12
pAKP-323	上清液	葡萄糖	7	3
					pAKP-323	细胞	葡萄糖	7	1
-	上清液	葡萄糖	n.d.	n.d.
					-	细胞	葡萄糖	n.d.	n.d.

质粒	级分	碳源	AKP[mg/l]	AAP[mg/l]
					pAKP-281	上清液	甘油	12	1
pAKP-281	细胞	甘油	6	4
					pAKP-322	上清液	甘油	57	5
pAKP-322	细胞	甘油	8	12
					pAKP-323	上清液	甘油	47	4
pAKP-323	细胞	甘油	4	7
					-	上清液	甘油	n.d.	n.d.
-	细胞	甘油	n.d.	n.d.

n.d.＝检测不到

结果明确显示，重组菌株中存在AKP和AAP。认为AKP向AAP的转化是由大肠杆菌中存在的天然氨基转移酶催化的。从构建体中除去AKsA基因对所生产AKP和AAP的量有正影响。

实施例3

通过酿酒酵母生产AKP

构建AKP生物合成途径

将M.jannaschii基因针对酿酒酵母进行密码子对优化(利用WO08000632所述方法)。启动子和终止子序列得自酿酒酵母基因组数据库(www.yeastgenome.org，如08年3月31日所示)将tpi1启动子-5位的T改变成A，以产生用于酿酒酵母的共有kozak序列。合成产生启动子-基因-终止子盒(Geneart，Regensburg，Germany)，如表3所示。

表3：启动子-基因-终止子盒

在优化过程中，避免内部限制性位点，并在起点和终点引入通用限制性位点以在表达载体中进行亚克隆。

用SalI/EcoRI切割合成的AksA盒，并用EcoRI/XbaI切割合成的AksF盒，将两个片段连接至pRS415，以获得pAKP-136。类似地，将合成的AksD和AksE插入pRS416中以获得pAKP-146。用XhoI/KpnI消化来自pAKP-136的The AksA-AksF盒，产生pAKP-141。合成产生类似的构建体，其具有207bp的序列，编码N端与MJ0503、MJ1271、MJ1003和MJ1596融合的线粒体信号肽(mtSP)[Sequence ID 158](Pfanner N，NeupertW.Distinct steps in the import of ADP/ATP carrier into mitochondria.J BiolChem.1987 Jun 5；262(16)：7528-36.)。由启动子-mtSP-基因-终止子组成的合成片段合并在pRS416中，获得pAKP-140。用引物AksA-Avine-F[Sequence ID 154]和AksA-Avine-R1[Sequence ID 155]，使用Phusion DNA聚合酶从pDB555中PCR扩增nifV。用引物Pgal2-F2[Sequence ID 156]和Pgal2-R[Sequence ID 157]，使用phusion DNA聚合酶从pAKP-47中扩增gal2启动子。使用引物Pgal2-F2[Sequence ID 153]和AksA-Avine-R1[Sequence ID 155]，用Phusion DNA聚合酶通过PCR将两个PCR片段融合在一起，并用HpaI/AscI将所得融合产物克隆进pAKP-47，得到pPgal2-nifV-Ttdh1。通过KpnI/SpeI从该构建体中除去pPgal2-nifV-Ttdh1盒，并插入经KpnI/SpeI消化的pAKP-140和pAKP-141代替MJ0503(AksA)[Sequence ID 167]，分别得到构建体pAKP-305和pAKP-306。

构建产生AKP的酿酒酵母菌株

根据Gietz和Woods(Gietz，R.D.and Woods，R.A.(2002)所述方法，用1μg pAKP-305或pAKP-306质粒DNA转化酿酒酵母菌株CEN.PK113-5D。酵母转化通过Liac/SS载体DNA/PEG法进行(Methods in Enzymology350：87-96)。将细胞涂到含有含有1×酵母氮源(无氨基酸)和2％葡萄糖的琼脂平板上。

用酿酒酵母生产AKP

为了生产AKP，将起始培养物在含有Verduym培养基(含有4％葡萄糖)的管中以30℃和280rpm需氧培养过夜。将培养物以25ml新的Verduym培养基(含有4％葡萄糖)中稀释至OD为0.5，并以30℃和280rpm在厌氧和需氧条件下培养2和5天(需氧培养)和4天(厌氧培养)。离心收集细胞，并制备上清液和细胞级分样品用于如实施例2针对大肠杆菌描述的UPLC-MS/MS。

表4：结果

质粒	级分	AKP[mg/l]
			pAKP305	上清液	1
pAKP305	细胞	2
			pAKP306	上清液	1

实施例4

克隆氨基转移酶和脱羧酶的靶基因

设计表达构建体

向所有基因的核糖体结合位点和起始密码子上游和终止密码子下游添加attB位点，以便于使用Gateway技术(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)进行克隆。

基因合成和质粒构建

根据DNA2.0的标准程序，从DNA2.0获得合成的基因并为了在E.coli中表达进行密码子优化。对分别编码V.fluvialis JS17ω-氨基转移酶[SEQ ID No.2]和B.weihenstephanensis KBAB4氨基转移酶(ZP_01186960)[SEQ ID No.83]的氨基酸序列的，来自Vibrio fluvialis JS17[SEQ ID No.1]和Bacillus weihenstephanensis KBAB4[SEQ ID No.82]的氨基转移酶基因进行密码子优化，并通过DNA合成获得得到的序列[SEQ ID No.3]和[SEQID No.85]。

对分别编码V.fluvialis JS17ω-氨基转移酶[SEQ ID No.3]，B.weihenstephanensis KBAB4氨基转移酶(ZP_01186960)[SEQ ID No.84]，Escherichia coli二氨基庚酸脱羧酶LysA[SEQ ID No.106]，Saccharomycescerevisiae丙酮酸脱羧酶Pdc[SEQ ID No.109]，Zymomonas mobilis丙酮酸脱羧酶PdcI472A[SEQ ID No.112]，Lactococcus lactis支链α-酮酸脱羧酶KdcA[SEQ ID No.115]和α-酮异戊酸脱羧酶KivD[SEQ ID No.118]，和Mycobacterium tuberculosisα-酮戊二酸脱羧酶Kgd[SEQ ID No.121]的来自Escherichia coli[SEQ ID No.105]、Saccharomyces cerevisiae[SEQ ID No.108]、Zymomonas mobilis[SEQ ID No.111]、Lactococcus lactis[SEQ ID No.114]、[SEQ ID No.117]和Mycobacterium tuberculosis[SEQ ID No.120]的基因进行密码子优化，并通过DNA合成分别获得得到的序列[SEQ ID No.107]、[SEQ ID No.110]、[SEQ ID No.63]、[SEQ ID No.116]、[SEQ ID No.119]和[SEQ ID No.122]。

如制造商方案(www.invitrogen.com)中所述，通过引入的attB位点和作为进入载体的pDONR201(Invitrogen)，使用Gateway技术(Invitrogen)奖基因构建体克隆进pBAD/Myc-His-DEST表达载体中。借此分别获得表达载体pBAD-Vfl_AT、pBAD-Bwe_AT、pBAD-LysA、pBAD-Pdc、pBAD-PdcI472A、pBAD-kdcA、pBAD-kivD。通过用各个pBAD-表达载体转化化学感受态E.coli TOP10(Invitrogen)，获得相应的表达菌株。

通过PCR克隆

使用下表中所列引物，根据制造商的说明书使用PCR Supermix HighFidelity(Invitrogen)，通过PCR从基因组DNA中扩增编码生物催化剂的多个基因。

表5：用于多种基因的引物的综述

通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)从凝胶中洗脱具有正确大小的PCR产物。如制造商方案中所述，使用Gateway技术(Invitrogen)，通过引入的attB位点和作为进入载体的pDONR-zeo(Invitrogen)，将经纯化的PCR产物克隆进pBAD/Myc-His-DEST表达载体中。通过DNA测序验证通过PCR克隆的基因序列。藉此获得了表达载体pBAD-Pae-_gi9946143_AT、pBAD-Bsu_gi16078032_AT、pBAD-Bsu_gi16080075_AT、pBAD-Bsu_gi16077991_AT、pBAD-Rsp_AT、pBAD-Lpn_AT、pBAD-Neu_AT、pBAD-Ngo_AT、pBAD-Pae_gi9951299_AT、pBAD-Pae_gi9951072_AT、pBAD-Pae_gi9951630_AT和pBAD-Rpa_AT。通过用pBAD构建体转化化学感受态E.coli TOP10(Invitrogen)获得相应的表达菌株。

实施例5

培养用于蛋白质表达的E.coli

在具有940μl含0.02％(w/v)L-阿拉伯糖的培养基的96-深孔平板中进行小规模培养。通过使用96-孔印模(Kühner，Birsfelden，瑞士)将细胞从冻存培养物中转移来进行接种。将平板在定轨摇床(300rpm，5cm振幅)上于25℃下孵育48小时。典型地达到2-4的OD_620nm。

实施例6

制备细胞裂解物

制备裂解缓冲液

裂解缓冲液含有以下成分：

表6：裂解缓冲液

1M MOPS pH 7.5	5ml
		DNAse I级II(Roche)	10mg
溶菌酶	200mg
		MgSO₄.7H₂O	123.2mg
二硫苏糖醇(DTT)	154.2mg
		H₂O(MilliQ)	平衡至100ml

使用前即刻新鲜制备溶液。

通过裂解制备无细胞提取物

通过离心收获来自小规模培养(见前一段)的细胞，弃去上清液。将离心期间形成的细胞沉淀物于-20℃下冷冻至少16小时，然后冰上融化。向每个孔中添加500μl新鲜制备的裂解缓冲液，并通过将平板剧烈振荡2-5分钟使细胞重悬。为了实现裂解，将平板在室温下孵育30分钟。为了去除细胞碎片，将平板在4℃和6000g下离心20分钟。将上清液转移至新鲜平板并置于冰上，直至再次使用。

通过超声制备无细胞提取物

通过离心收获来自小规模培养(见前一段)的细胞，弃去上清液。向0.5g潮湿的细胞沉淀物中添加1ml磷酸钾缓冲液pH7，并通过剧烈震荡重选细胞。为了实现裂解，将细胞超声处理20分钟。为了去除细胞碎片，将裂解物在4℃和6000g下离心20分钟。将上清液转移至新鲜管中，并冷冻于-20℃下直至再次使用。

实施例7

通过5-甲酰基戊酸甲酯的化学水解制备5-甲酰基戊酸

如下通过5-甲酰基戊酸甲酯的化学水解制备用于氨基转移酶反应的底物(即5-甲酰基戊酸)：用NaOH将水中5-甲酰基戊酸甲酯的10％(w/v)溶液设定至pH 14.1。在20℃下孵育24小时后，用HCl将pH设定至7.1。

实施例8

用于将AKP转化成5-甲酰基戊酸的酶促反应

制备在100mM磷酸钾缓冲液，pH 6.5中包含50mM AKP、5mM氯化镁、100μM 5’磷酸吡哆醛(用于LysA)或1mM二磷酸硫胺素(用于所有其它酶)的反应混合物。向每个反应管中分散4ml反应混合物。为了起始反应，向每个孔中添加通过超声获得的1ml无细胞提取物。在商业草酰乙酸脱羧酶(Sigma-Aldrich产品号04878)的情况下，使用50U。使用磁力搅拌器，将反应混合物在37℃下孵育48小时。另外，在相同条件下孵育化学空白混合物(不含无细胞提取物)和生物学空白(具有pBAD/Myc-His C的E.coli TOP10)。通过HPLC-MS分析来自反应期间不同时间点的样品。结果概括于下表中。

表8：存在脱羧酶时来由AKP形成的5-FVA

n.d.：检测不到

显示在存在脱羧酶时由AKP形成5-FVA。

实施例9

在E.coli中生产己二酸酯

制备用于共表达氨基转移酶和脱羧酶的构建体

如实施例4中所述构建含有下述基因的质粒，所述基因编码用于将AKP转化成5-甲酰基戊酸(5-FVA)和将5-FVA转化成6-ACA的酶。应当注意，对于己二酸酯的生产而言，编码催化5-FVA转化成6-ACA的酶的基因不是必需的，并且可以使用含有下述基因的质粒进行重复，所述基因编码用于将AKP转化成5-甲酰基戊酸(5-FVA)的酶，但是用编码催化5-FVA转化成6-ACA的酶的基因则不能重复。

为了允许氨基转移酶和脱羧酶的共表达，使用Phusion DNA聚合酶和引物pF113-F-NsiI(aaattatgcatACAGCATGGCCTGCAACG)与pF113-R-AgeI(aaattaccggtCAGGGTTATTGTCTCATGAG)，从pF113(pJF119EH的衍生物(Fürste，J.P.，W.Pansegrau，R.Frank，H.Blocker，P.Scholz，M.Bagdasarian，and E.Lanka.1986.Molecular cloning of the plasmid RP4primase region in a multi-host-range tacP expression vector.Gene 48：119-131.))中通过PCR扩增tac启动子盒，其分别在第515和5176位含有两个NotI位点(以tac启动子作为编号起点)，并将得到的PCR片段与经NsiI/AgeI消化的pBBR1MCS(Kovach ME，Phillips RW，Elzer PH，Roop RM2nd，Peterson KM.Biotechniques.1994 May；16(5)：800-2.pBBR1MCS：abroad-host-range cloning vector)融合，得到pBBR-lac。对来自Vibriofluvialis JS17的氨基转移酶((Seq ID NO：1)进行密码子优化(Seq ID NO：3)。分别使用引物对AT-Vfl_for_Ec(AAATTT GGTACCGCTAGGAGGAATTAACCATG)+AT-Vfl_rev_Ec(AAATTT ACTAGTAAGCTGGGTTTACGCGACTTC)和AT-Pa01_for_Ec(AAATTT GGTACCGCTAGGAGGAATTAACCATG)+AT-Pa01_rev_Ec，(AAATTTACTAGTACAAGAAAGCTGGGTTCAAG)，根据制造商的说明书，使用Phusion DNA聚合酶，分别从pBAD/Myc-His-DEST-AT-Vfl和pBAD/Myc-his-DEST-PA01中PCR扩增所述经密码子优化的基因和编码AT-Vfl和AT-PA01(Seq ID 85)的来自Pseudomonas aeruginosa PA01的基因。

使用引物Kdc_for_Ec(AAATTT ACTAGTGGCTAGGAGGAATTACATATG)和Kdc_rev_Ec(AAATTT AAGCTTATTACTTGTTCTGCTCCGCAAAC)，根据制造商的说明书使用PhusionDNA聚合酶，从pBAD/Myc-His-DEST-DC-KdcA中扩增编码Lactococcuslactis支链α-酮酸脱羧酶KdcA的来自Lactococcus lactis的脱羧酶基因(SeqID NO：116)。用KpnI/SpeI消化氨基转移酶片段，并用SpeI/HindIII消化脱羧酶片段。两种片段均与经KpnI/HindIII消化的pBBR-lac连接，分别获得pAKP-94(含有编码AT-PA01和KdcA的基因)和pAKP-96(含有编码AT-Vfl和KdcA的基因)。

E.coli中的蛋白质表达和代谢产物生产

将(实施例2中所述)质粒pAKP-323与pAKP96共转化进E.coliBL21中用于表达。培养物如实施例2中所述培养。孵育时间为24小时，培养基为M9最小培养基(见实施例1)。如实施例2中所述制备样品用于分析，并如实施例1中所述通过LC-MS-MS分析。

表9：

该实施例显示，E coli天然具有己二酸酯合成活性。认为用下述E coli能够实现提高的己二酸酯生产，所述E coli未被修饰为含有编码催化5-FVA转化成6-ACA的酶的(异源)基因。

实施例10

构建来自其它古细菌的AKP生物合成途径

从数据库中检索下述蛋白质序列：Methanosarcina activorans高顺乌头酸酶小亚基(AksE，MA3751，[Sequence ID 225])、高顺乌头酸酶大亚基(AksD，MA3085，[Sequence ID 237])和高异柠檬酸脱氢酶(AksF，MA3748，[Sequence ID 249])，它们的来自Methanospirillum hungatei JF-1高顺乌头酸酶小亚基(AksE，Mhun_1799，[Sequence ID 228])、高顺乌头酸酶大亚基(AksD，Mhun_1800，[Sequence ID 240])和高异柠檬酸脱氢酶(AksF，Mhun_1797，[Sequence ID 252])的同源物，它们的来自Methanococcusmaripaludis S2高顺乌头酸酶小亚基(AksE，MMP0381，[Sequence ID 207])、高顺乌头酸酶大亚基(AksD，MMP1480，[Sequence ID 195])和高异柠檬酸脱氢酶(AksF，[Sequence ID 222])的同源物，它们的来自Methanococcusvannielii SB高顺乌头酸酶小亚基(AksE，Mevan_1368，[Sequence ID 201])、高顺乌头酸酶大亚基(AksD，Mevan_0789，[Sequence ID 189])和高异柠檬酸脱氢酶(AksF，Mevan_0040[Sequence ID 216])的同源物，和A.vinelandii高柠檬酸合酶NifV[Sequence ID 75])。

表10：

(使用WO08000632中所述方法)针对E.coli对编码高顺乌头酸酶小亚基(AksE)、高顺乌头酸酶大亚基(AksD)和高异柠檬酸脱氢酶(AksF)的基因进行密码子对优化(表13)。合成(Geneart，Regensburg，德国)制造含有经优化的基因以及野生型nifV基因(Seq ID149)的构建体。在优化程序中避免内部限制性位点，并在起点和终点处引入常见的限制性位点，以允许在表达载体中亚克隆。还在AksD上游添加来自pMS470的tac启动子序列。每个ORF之前是共有的核糖体结合位点和前导序列，以驱动在pMS470中翻译。还在AksD上游添加来自pMS470的tac启动子的序列。用NdeI/XbaI切割合成的AksA/AksF盒，并用XbaI/HindIII切割合成的AksD/AksE盒。将含有Aks基因的片段插入pMS470的NdeI/HindIII位点中，获得载体pAKP-358、pAKP359、pAKP376和pAKP378。

E.coli中的蛋白质表达和代谢产物生产

将质粒转化进E.coli BL21中用于表达。起始培养物在含10ml 2*TY培养基的管中过夜培养。将200μl培养物转移至含20ml 2*TY培养基的摇瓶中。在30℃和280rpm下于定轨摇床中孵育烧瓶。4小时后以0.2mM的终浓度添加IPTG，并将烧瓶于30℃和280rpm下孵育4-16小时。通过离心收集来自20ml培养物的细胞，并重悬于24孔平板中含有合适碳源的4ml M9培养基中。在30-37℃和210rpm下孵育24-72小时后，通过离心收集细胞，并将沉淀物和上清液分离并储存于-20C下用于分析。

制备用于分析的细胞级分

通过离心收获来自小规模培养(见前一段)的细胞。将细胞沉淀物重悬于1ml 100％乙醇中并剧烈震荡。将细胞悬浮液在95℃下加热2分钟，并通过离心去除细胞碎片。在真空干燥器中蒸发上清液，将得到的沉淀物溶于200μl去离子水中。通过离心去除剩余的碎片，并将上清液储存于-20℃。

分析上清液和细胞提取物

将来自细胞级分的上清液和提取物用水稀释5倍，之后进行UPLC-MS/MS分析。展示于表14中的结果清楚地显示重组菌株中AKP和AAP的存在。认为AKP到AAP的转化由E.coli中存在的天然氨基转移酶催化。

表11：使用甘油作为碳源的AKP生产

质粒	级分	碳源	AKP[mg/l]
				-	上清液	甘油	n.d.
-	细胞	甘油	n.d.
				pAKP358	上清液	甘油	21
pAKP359	上清液	甘油	19
				pAKP376	上清液	甘油	3
pAKP378	上清液	甘油	650

n.d.＝检测不到

结果清楚地显示重组菌株中AKP的存在。

实施例11

在E.coli中由AKP生产己二酸酯

制备用于共表达氨基转移酶和脱羧酶的构建体

如实施例4中所述构建编码用于将AKP转化成5-甲酰基戊酸(5-FVA)和将5-FVA转化成6-ACA的酶的质粒，其中质粒pAKP94和pAKP96描述于实施例9中。为了将存在于pAKP 94和pAKP96中的Lactococcuslactis支链α-酮脱羧酶KdcA[SEQ ID No.115]分别与Zymomonas mobilis丙酮酸脱羧酶PdcI472A[SEQ ID No.112]和α-酮异戊酸脱羧酶KivD[SEQ IDNo.118]交换，用Nde1和HinD3消化质粒pBAD-kivD和pBAD-PdcI472A。将含有脱羧酶基因的1.6kb片段分离并连接进经Nde1/HinD3消化的载体中，分别得到pAKP 326和pAKP327。将来自pAKP 326 andpAKP327的1.6kb Nde1/HinD3片段克隆进pAKP96中，得到pAKP330。

E.coli中的蛋白质表达和代谢产物生产

将质粒转化进E.coli BL21中用于表达。起始培养物在含10ml 2*TY培养基的管中过夜培养。将200μl培养物转移至含20ml 2*TY培养基的摇瓶中。在30℃和280rpm下于定轨摇床中孵育烧瓶。4小时后以0.2mM的终浓度添加IPTG，并将烧瓶于30℃和280rpm下孵育4小时。通过离心收集来自20ml培养物的细胞，并重悬于24孔平板中含有1％甘油和500mg/l AKP的4ml 2xTY培养基中。在30℃和210rpm下孵育48小时后，通过离心收集细胞，并将沉淀物和上清液分离并储存于-20C下用于分析。

表12：E.coli中的己二酸酯生产

质粒	氨基转移酶	脱羧酶	mg/l己二酸酯	mg/l 6-ACA
					pAKP326	PA01	kivD	16	21
pAKP327	PA01	pdcl472A	22	20
					pAKP330	Vfl	kivD	18	17

结果清楚地显示重组菌株中己二酸酯和6-ACA的存在。认为5-FVA成为己二酸酯的转化由E.coli中存在的天然醛脱氢酶催化。

实施例12

鉴定与5-FVA到己二酸酯的转化相关的醛脱氢酶

构建pAKP362

为了在E.coli KEIO突变体中引入含有编码来自Vibrio fluvialis JS17(AT-Vfl)的氨基转移酶基因的基因和编码来自Lactococcus lactis(Dc-kdcA)的支链α-酮酸脱羧酶KdcA的脱羧酶基因的质粒，构建收集质粒pAKP362。因此，使用引物Fw_BstB1(AATCGACCGACCTGTCGCATCACCCGACGCACTTTGCGCCG)和rev_Drd1(CTGCTTCGAACCCTGTGGAACACCTACATCTGTAT)从E.coli质粒pACYC(如WO 2009/113853中所述)中PRC扩增编码氯霉素乙酰转移酶的cat基因。用BstB1和Drd1消化所述片段并连接进先前用BstB1和Drd1消化的质粒pAKP96中。

E.coli中的蛋白质表达和代谢产物生产

通过针对下述活性测试推定的酶，来鉴定编码具有将5-甲酰基戊酸(5-FVA)转化成己二酸酯的催化活性的酶的基因。将质粒pAKP362引入E.coliKEIO突变体文库中鉴定的、在这些基因中具有突变(即所述基因被缺失)的E.coli菌株中(Baba T，Ara T，et al.(2006))。

Escherichia coli K-12按照读码框的单基因敲除突变体的构建：Keio收藏(Mol Syst Biol doi：10.1038/msb400050.)，在已知基因中具有单个敲除突变的菌株收藏。将培养物在含10ml 2*TY培养基的管中培养过夜。将200μl培养物转移至含20ml 2*TY培养基的摇瓶中。在30℃和280rpm下于定轨摇床中孵育烧瓶。4小时后以0.1mM的终浓度添加IPTG，并将烧瓶于30℃和280rpm下孵育4小时。通过离心收集来自10ml培养物的细胞，并重悬于含1％甘油和500mg/l AKP的2.5ml 2xTY培养基中。在37℃和210rpm下于24孔平板中孵育24-48小时后，通过离心收集上清液并储存于-20C下用于分析。如实施例2中所述通过LC-MS-MS分析样品。结果展示于表13中。

表13

从这些数据可以看出，尽管在这些突变体中6-ACA的生产水平几乎不受影响，但是己二酸酯水平严重降低。因此得出结论，包含Seq ID NO285和Seq ID NO 287中鉴定的序列的酶催化己二酸酯的形成。

Claims

1.用于制备己二酸的方法，其包括：

-将α-酮戊二酸(AKG)转化成α-酮己二酸(AKA)，

-将α-酮己二酸转化成α-酮庚二酸(AKP)，

-将α-酮庚二酸转化成5-甲酰基戊酸(5-FVA)，和

-将5-甲酰基戊酸转化成己二酸，

其中这些转化中至少一种使用生物催化剂进行。

2.根据权利要求1的方法，其中使用异源生物催化剂。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述α-酮戊二酸利用生物催化方法从碳源制备的，特别是从碳水化合物制备的。

4.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述生物催化剂包括催化α-酮戊二酸至α-酮己二酸的C₁延伸和/或α-酮己二酸至α-酮庚二酸的C₁延伸的生物催化剂。

5.根据权利要求3的方法，其中所述生物催化剂包含

a.具有高_(n)柠檬酸活性的AksA酶或其同源物；

b.至少一种下述的酶，所述酶选自具有高_n-乌头酸酶活性的AksD酶、具有高_n-乌头酸酶活性的AksE酶、所述AksD酶的同源物和所述AksE酶的同源物；和

c.具有高_n-异柠檬酸脱氢酶活性的AksF酶或其同源物。

6.根据权利要求4或5的方法，其中所述酶系统是来源于下述生物的酶系统，所述生物选自产甲烷古细菌的组，特别是选自Methanococcus，Methanocaldococcus，Methanosarcina，Methanothermobacter，Methanosphaera，Methanopyrus和Methanobrevibacter的组。

7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述生物催化剂包括催化将α-酮戊二酸转化成α-酮己二酸的酶系统，其中所述酶系统形成赖氨酸生物合成的氨基己二酸途径的一部分。

8.根据权利要求7的方法，其中所述酶系统来自选自酵母、真菌、古细菌和细菌的组的生物，特别是选自Penicillium，Cephalosporium，Paelicomyces，Trichophytum，Aspergillus，Phanerochaete，Emericella，Ustilago，Schizosaccharomyces，Saccharomyces，Candida，Yarrowia，Pichia，Kluyveromyces，Thermus，Deinococcus，Pyrococcus，Sulfolobus，Thermococcus，Methanococcus，Methanocaldococcus，Methanosphaera，Methanopyrus，Methanobrevibacter，Methanosarcina和Methanothermobacter的组。

9.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中所述生物催化剂，特别是所述异源生物催化剂，包含催化将α-酮戊二酸转化成α-酮己二酸的酶系统，其中所述酶系统中的至少一种酶来源于固氮细菌，所述固氮细菌选自蓝细菌、根瘤菌、变形菌和放线菌的组，特别是选自Anabaena，Microcystis，Synechocystis，Rhizobium，Bradyrhizobium，Pseudomonas，Azotobacter，Klebsiella和Frankia的组。

10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中α-酮庚二酸被以生物催化方式脱羧，由此形成5-甲酰基戊酸。

11.根据前述权利要求中任一项的方法，所述方法包括通过醛氧化酶使5-甲酰基戊酸转化成己二酸。

12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法在发酵条件下进行。

13.异源细胞，其包含编码一种或多种下述酶的一种或多种核酸序列，所述酶具有关于5-甲酰基戊酸向己二酸的转化的催化活性。

14.根据权利要求13的异源细胞，其中所述具有关于5-甲酰基戊酸向己二酸的转化的催化活性的酶包含SEQ ID NO：285、SEQ ID NO：287所示序列或其同源物。

15.根据权利要求14的异源细胞，其包含编码一种或多种下述异源酶的一种或多种核酸序列，所述异源酶能催化由α-酮戊二酸制备α-酮庚二酸的至少一个反应步骤。

16.根据权利要求14或15的异源细胞，其中所述细胞不含能催化α-酮己二酸向α-氨基己二酸的转化的氨基转移酶。

17.根据权利要求14至16中任一项的异源细胞，其包含编码SEQID NO：4-77中任一序列所示酶或其同源物的至少一种核酸序列。

18.根据权利要求14至17中任一项的异源细胞，其包含编码SEQID NO：78-81所示酶或其同源物的至少一种核酸序列。

19.根据权利要求14至18中任一项的异源细胞，其包含下述核酸序列，所述核酸序列编码具有使α-酮庚二酸脱羧形成5-甲酰基戊酸的催化活性的酶，特别是选自脱羧酶(E.C.4.1.1)的组的酶，更特别地，选自谷氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.15)、二氨基庚酸脱羧酶(EC 4.1.1.20)、天冬氨酸1-脱羧酶(EC 4.1.1.11)、支链α-酮酸脱羧酶、α-酮异戊酸脱羧酶、α-酮戊二酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.1)和草酰乙酸脱羧酶(E.C.4.1.1.3)的组的酶。

20.根据权利要求14至19中任一项的异源细胞，其中所述细胞来自选自Penicillium chrysogenum，Aspergillus niger，Ustilago maydis，Saccharomyces cerevisiae，Kluyveromyces lactis，Pichia pastoris，Hansenulapolymorha，Escherichia coli，Azotobacter vinelandii，Pseudomonas stutzerii，Klebsiella pneumoniae，Deinococcus radiourans，Deinococcus geothermalis，Thermus thermophilus，Methanococcus maripaludis，Methanosarcinaacetivorans，Methanospirillum hungatei和Methanocaldococcus jannashii的组的生物。

21.根据权利要求13至19中任一项的异源细胞，其包含至少一种选自SEQ ID NO 149；SEQ ID NO 145，146，147，148；SEQ ID NO 167，168，169，170，171，172，173，174；SEQ ID NO 177，178，179，180，181，182，183，184；SEQ ID NO 224，226，236，238，248，250，260，262；SEQ ID NO 227，229，239，241，251，253，263，265；SEQ ID NO 194，196，206，208，221，223，281，283；SEQ ID NO 188，190，200，202，215，217，272，274，SEQ ID NO 284，286的组的任何序列所示的核酸序列。

22.根据权利要求14至21中任一项的异源细胞用于制备己内酰胺、6-氨基己酸、二氨基己烷或己二酸的用途。

23.用于制备聚合物的方法，所述方法包括：使根据权利要求1至13中任一项所述方法制备的己二酸与具有至少两个能与己二酸的羧酸官能团反应的官能团的化合物反应，由此形成聚合物。

24.根据权利要求22的方法，其中所述能与己二酸的羧酸官能团反应的官能团选自胺基、羟基和异氰酸基。

25.用于制备己二酸酯的方法，包括使通过权利要求1至13中任一项所述方法制备的己二酸与醇反应。