JP2001041958A - 環境汚染物質の免疫学的測定分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 環境汚染物質またはその分解物の高感度免疫
学的測定方法の提供。 【解決手段】 担体に担持された抗イムノグロブリン抗
体にさらに環境汚染物質またはその分解物に対する抗体
が結合した複合体を構成成分の一つとして免疫学的測定
を行なうことにより、高感度に環境汚染物質、その分解
物またはそれらの混合物を測定または分析することがで
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、環境汚染物質また
はその分解物の免疫学的測定方法、分析方法およびそれ
らに用いるためのキットに関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、環境汚染物質である合成洗剤用界
面活性剤化合物や内分泌攪乱物質による環境汚染が問題
となっている。そこで、環境中の環境汚染物質やその分
解物を測定、分析して、その結果を環境保全に役立たせ
ることが必要となる。

【０００３】このような環境汚染物質や、その分解物を
測定、分析する方法としては、従来から種々の方法が知
られている。例えば、上水、河川水、湖沼水または下水
中の環境汚染物質および分解物を定量測定するための高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマト
グラフィー（ＧＣ）、ガスクロマトグラフィー−高分解
能マススペクトロメトリー（ＧＣ−ＨＲＭＳ）、高速液
体クロマトグラフィー−高分解能マススペクトロメトリ
ー（ＨＰＬＣ−ＨＲＭＳ）などがある。

【０００４】しかしながら、これらは極微量しか存在し
ない環境汚染物質を定量するのには必要な感度が得られ
ないこと、また定量する為には溶媒による抽出等による
高倍率の濃縮が必要であること、さらに非常に高価な機
器であり操作に習熟を要することなどが問題となってい
る。これらの問題から、環境汚染物質について、従来よ
り高感度で、迅速かつ簡単で、特異的で、低コストの高
感度測定法が望まれている。

【０００５】上記の問題を解決する手段として酵素免疫
測定法（以下、ＥＬＩＳＡ法と略記することがある）が
挙げられる。ＥＬＩＳＡ法による、様々な他の環境汚染
物質に対する定量系やキットが構築されており、例え
ば、ＷＯ９４／１２５３６号には、環境における石油燃
料の検出用のＥＬＩＳＡ法や、そのキットが開示されて
いる。酵素と抗体で構成されるこれらの分析キットは非
常に迅速に、通常、数時間で測定が完了する。また、操
作は、従来のＨＰＬＣ、ＧＣ、ＧＣ−ＨＲＭＳやＨＰＬ
Ｃ−ＨＲＭＳなどよりも非常に簡便である。さらに、抗
体、特に、モノクローナル抗体を使用することにより、
非常に特異的な定量が可能になる。また、ＨＰＬＣ、Ｇ
Ｃ、ＧＣ−ＨＲＭＳやＨＰＬＣ−ＨＲＭＳなどは非常に
高価な機器であり、そのメンテナンスにかかる費用もか
なりなものであるが、ＥＬＩＳＡ法にはそのような問題
がない。しかし、環境汚染物質や、その分解物の検出、
測定に使用できる免疫学的分析法、特に、ＥＬＩＳＡ法
は未だ確立されていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、環境
汚染物質や、その分解物を高感度に検出・測定できる免
疫学的分析法、およびそれに供することのできるキット
を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、環境汚染
物質や、それらの分解物の免疫学的分析法、特にＥＬＩ
ＳＡ法による検出、測定法を確立すべく、鋭意研究を重
ねた。その結果、担体に担持された抗イムノグロブリン
抗体（抗Ｉｇ抗体）に環境汚染物質またはその分解物に
対する抗体が結合した複合体を構成成分の一つとして用
いることにより、高感度に環境汚染物質もしくはその分
解物を測定できることを見出した。かかる知見に基づい
てさらに研究を重ねた結果、本発明を完成させるに至っ
た。

【０００８】すなわち、本発明は、（１）担体に担持さ
れた抗イムノグロブリン抗体にさらに環境汚染物質また
はその分解物に対する抗体が結合した複合体を構成成分
の一つとしてなることを特徴とする環境汚染物質、その
分解物またはそれらの混合物の免疫学的測定または分析
用キット、（２）環境汚染物質が、合成洗剤用界面活性
剤化合物または内分泌攪乱物質である上記（１）記載の
キット、（３）合成洗剤用界面活性剤化合物が、陰イオ
ン界面活性剤化合物または非イオン界面活性剤化合物で
ある上記（２）記載のキット、（４）内分泌攪乱物質
が、女性ホルモン類、男性ホルモン類、甲状腺ホルモン
類、アルキルフェノールエトキシレート類、アルキルフ
ェノール類、樹脂成分類、樹脂可塑剤類またはクロロフ
ェノール類である上記（２）記載のキット、および
（５）検体と、担体に担持された抗イムノグロブリン抗
体にさらに環境汚染物質またはその分解物に対する抗体
が結合した複合体と、標識剤で標識した環境汚染物質、
その分解物またはそれらの混合物とを反応させた後、担
体上に保持された標識剤または担体上に保持されなかっ
た標識剤の活性を測定することを特徴とする検体内の該
環境汚染物質、その分解物またはそれらの混合物の免疫
学的測定または分析方法、を提供する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明で用いられる環境汚染物質
には、環境を汚染するいかなる物質も含まれる。環境汚
染物質としては、例えば、合成洗剤用界面活性剤化合
物、内分泌攪乱物質などが挙げられる。

【００１０】合成洗剤用界面活性剤化合物としては、例
えば、陰イオン界面活性剤化合物、非イオン界面活性化
合物などが挙げられる。陰イオン界面活性化合物として
は、例えば、アルキル硫酸、アルキルベンゼンスルホン
酸（以下、ＬＡＳと略称することがある。）、アルキル
ナフタレンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸塩ホルム
アルデヒド縮合物およびそれらの塩（例、ナトリウム、
カリウムなどのアルカリ金属塩）からなる群から選択さ
れる化合物が挙げられる。また、非イオン界面活性剤と
しては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルフェニル
エーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリ
オキシエーテルポリスチリルフェニルエーテル、ポリオ
キシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびそれら
の塩（例、リン酸塩、硫酸塩）からなる群から選択され
る化合物などが挙げられる。ここにアルキルとしては、
炭素数２〜１８程度のものが包含される。

【００１１】上記内分泌攪乱物質としては、例えば、女
性ホルモン類、男性ホルモン類、甲状腺ホルモン類、ア
ルキルフェノールエトキシレート類、アルキルフェノー
ル類、樹脂成分類、樹脂可塑剤類、クロロフェノール
類、その他の物質が挙げられる。女性ホルモン類として
は、例えば、エストロゲン、エストラジオール（Ｅ
２）、エストロン（Ｅ１）、エストリオール（Ｅ３）な
どが、該男性ホルモン類としては、例えば、アンドロー
ゲン、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロ
ン、アンドロステンジオンなどが、該甲状腺ホルモン類
としては、例えば、チロキシン（Ｔ３）、トリヨードチ
ロニン（Ｔ４）などがそれぞれ挙げられ、また、これら
の生体内代謝物である抱合体（例えば、グルクロニド、
硫酸抱合体など）もこれらに包含される。

【００１２】該アルキルフェノールエトキシレート類
（ＡＰＥ）としては、例えば、式（１）：

【化１】

【００１３】［式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は同一または
異なって、各々、Ｈまたは炭素数１〜２０、好ましくは
１〜１２の直鎖または分枝鎖（含sec−、tert−、iso
−）アルキル、Ｒ⁴は、（ＯＣ₂Ｈ₄）_mＯＨまたは（ＯＣ
₂Ｈ₄）_mＣＯＯＨ、ｍは、酸化エチレン鎖の平均数１〜
７０、好ましくは１〜１５を意味する］で表されるアル
キルフェノールエトキシレート類（ＡＰＥ）［例、ＮＰ
Ｅ（ノニルフェノールエトキシレート、例えば、ＮＰ２
ＥＯ（平均酸化エチレン鎖数＝２）、ＮＰ５ＥＯ（平均
酸化エチレン鎖数＝５）、ＮＰ１０ＥＯ（平均酸化エチ
レン鎖数＝１０）、ＮＰ１０ＥＣ（平均酸化エチレン鎖
数＝１０、末端ＯＨ→カルボン酸）、ＯＰＥ（オクチル
フェノールエトキシレート）など］などが挙げられる。
アルキルフェノール類（ＡＰ）としては、例えば、式
（２）：

【００１４】

【化２】

【００１５】［式中、Ｒ⁵、Ｒ⁶およびＲ⁷は、同一また
は異なって、各々、Ｈまたは炭素数１〜２０、好ましく
は１〜１２の直鎖または分枝鎖（含sec−、tert−、iso
−）アルキルを意味する］で表されるアルキルフェノー
ル類（ＡＰ）、［例、ＤＰ（４−ドデシルフェノー
ル）、ＥＰ（４−エチルフェノール）、ＨＰ（ヘプチル
フェノール）、ＩＰＰ（４−イソペンチルフェノー
ル）、２−ＯＰ（２−オクチルフェノール）、４−ＮＰ
（４−ノニルフェノール）、４−ＯＰ（４−オクチルフ
ェノール）、4−ｓＢＰ（４−sec−ブチルフェノー
ル）、４−ｔＢＰ（４−ｔ−ブチルフェノール）、４−
ｔＰＰ（４−ｔ−ペンチルフェノール）、４−ｔＯＰ
（４−ｔ−オクチルフェノール）など］などが挙げられ
る。樹脂成分類（ＰＲＣ）としては、例えば、式
（３）：

【００１６】

【化３】

【００１７】［式中、Ｒ⁹は、Ｃ、ＣＯまたはＳＯ₂、Ｒ
⁸およびＲ¹⁰は、同一または異なって、各々、Ｈ、Ｏ
Ｈ、ＮＨ₂またはＯ（ＣＨ₂）₂ＯＨ、Ｒ¹¹およびＲ
¹²は、同一または異なって、各々、存在せず、Ｈ、ＣＨ
₃、ＣＨ₂ＯＨまたはＣ₂Ｈ₄ＣＯＯＨ、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵
およびＲ¹⁶は、同一または異なって、各々、Ｈ、ＯＨ、
ＣＨ₃、ＣｌまたはＢｒを意味する］で表される樹脂成
分類（ＰＲＣ）［例、ＢＰＡ（ビスフェノールＡ）、
４，４’−ＥＢＰ（４，４’−エチリデンビスフェノー
ル）、ＢＨＰＭ（ビス（ｐ−ヒドロキシフェニル）メタ
ン）、２，２’−ＢＨＰＰ（２，２’―ビス（４−ヒド
ロキシフェニル）−１−プロパノール）、２，２’−Ｂ
ＭＨＰＰ（２，２’−ビス（ｍ−メチル−ｐ−ヒドロキ
シフェニル）プロパン）、４，４’−ＢＨＰＰ（４，
４’−ビス（ｐ−ヒドロキシフェニル）ペンタン酸）、
４，４’−ＤＤＭ（４，４’−ジアミノジフェニルメタ
ン）、４，４’−ＤＤＥ（４，４’−ジヒドロキシジフ
ェニルエーテル）、４，４’−ＤＯＨＤＳ（４，４’−
ジヒドロキシジフェニルスルフォン）、４，４’−ＤＣ
ｌＤＳ（４，４’−ジクロロジフェニルスルフォン）、
ＢＨＥＤＢｒＰＳ（ビス［４−（２−ヒドロキシエトキ
シ）−３，５−ジブロモフェニル］スルフォン）、ＢＨ
ＥＰＳ（ビス［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニ
ル］スルフォン）、４，４’−ＤＤＥ（４，４’−ジヒ
ドロキシデフェニルエーテル）、ｐ、ｐ’−ＤＢＰ
（ｐ，ｐ’−ジヒドロキシベンゾフェノン）、ＨＢＰ
（４−ヒドロキシビフェニール）など］などが挙げられ
る。樹脂可塑剤類（ＰＰ）としては、例えば、式
（４）：

【００１８】

【化４】

【００１９】［式中、Ｒ¹⁷は、ｏ−フェニレンまたはテ
トラメチレン、Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は、同一または異なっ
て、各々、Ｈ、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１２の
直鎖または分枝鎖（含sec−、tert−、iso−）アルキ
ル、ベンジルまたはシクロヘキシルを意味する］で表さ
れる樹脂可塑剤類［例、ＢＢＰ（フタル酸ブチルベンジ
ル）、ＤＢＰ（フタル酸ジブチル）、ＤＣＨＰ（フタル
酸ジシクロヘキシル）、ＤＥＰ（フタル酸ジエチル）、
ＤＥＨＰ（フタル酸ジ（２−エチルヘキシル））、ＤＥ
ＨＡ（アジピン酸ジエチルヘキシル）、ＤＨＰ（フタル
酸ジヘキシル）、ＤＰＰ（フタル酸ジ−ｎ−ペンチ
ル）、ＤＰｒＰ（フタル酸ジプロピル）など］などが挙
げられる。クロロフェノール類（ＣＰ）としては、例え
ば、式（５）：

【００２０】

【化５】

【００２１】［式中、Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²、Ｒ²³およびＲ
²⁴は、同一または異なって、各々、ＨまたはＣｌを意味
する］で表されるクロロフェノール類（ＣＰ）［例、２
−ＣＰ（２−クロロフェノール）、３−ＣＰ（３−クロ
ロフェノール）、４−ＣＰ（４−クロロフェノール）、
２，３−ＣＰ（２，３−ジクロロフェノール）、２，４
−ＣＰ（２，４−ジクロロフェノール）、２，５−ＣＰ
（２，５−ジクロロフェノール）、２，６−ＣＰ（２，
６−ジクロロフェノール）、２，３，４−ＣＰ（２，
３，４−トリクロロフェノール）、２，４，５−ＣＰ
（２，４，５−トリクロロフェノール）、２，４，６−
ＣＰ（２，４，６−トリクロロフェノール）、２，３，
４，５−ＣＰ（２，３，４，５−テトラクロロフェノー
ル）、２，３，４，６−ＣＰ（２，３，４，６−テトラ
クロロフェノール）、ＰＣＰ（ペンタクロロフェノー
ル）など］などが挙げられる。

【００２２】その他の物質としては、２，３，７，８−
テトラクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ＴＣＤＤ）を
代表とするポリクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ＰＣ
ＤＤ）、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾフラン
（ＴＣＤＦ）を代表とするポリクロロジベンゾフラン
（ＰＣＤＦ）、ポリクロロビフェニル（ＰＣＢ）、ベン
ゾフェノン、ベンゾピラン、クロロベンゼン、ブロモナ
フトール、ニトロトルエン、トリブチル錫、各種農薬、
重金属（例えば、Ｃｄ、Ｈｇ、Ｐｂなど）、合成エスト
ロゲン（例、セントクロマン、エチニルエストラジオー
ル、ジエチルスチルベストロール、ヘキセストール、２
−ヒドロキシエストラジオール、タモキシフェン、ラロ
キシフェンなど）、食品、食品添加物（例えば、ＢＨＡ
（ブチルヒドロキシアニソール）、エコール、エンテロ
ラクトン、フィトエストロゲン、クメストロール、ホル
モノネチン、ダイゼイン、ビオチニンＡ、ゲステニンな
ど）などが挙げられる。これらは、分析する環境汚染物
質や、分解物に応じて適宜選択できる。

【００２３】上記において、炭素数１〜２０の直鎖また
は分枝鎖アルキルの具体例としては、例えば、メチル、
エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｉｓｏ
−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペ
ンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｎｅｏ−ペンチル、ｔｅｒ
ｔ−ぺンチル、ｎ−ヘキシル、ｉｓｏ−ヘキシル、ｎ−
ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、ウ
ンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペン
タデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシ
ル、ノナデシル、イコシルなどが挙げられる。前記の炭
素数２〜１８のアルキルの具体例としては、上記の具体
例においてメチル、ノナデシルおよびイコシル以外のも
のが挙げられる。

【００２４】本発明で用いられる抗Ｉｇ抗体としては、
環境汚染物質またはその分解物に対する抗体であるＩｇ
（イムノグロブリン）に対する抗体が用いられる。該Ｉ
ｇとしては、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒ
ツジ、ヒト、ネコ、イヌ、モルモット、ウマ、ウシ、ブ
タ、ニワトリ、シカ、カンガルーなどの哺乳動物、ニワ
トリ、七面鳥などの家禽類ものが好ましい。

【００２５】ＩｇとしてはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、Ｉ
ｇＤ、ＩｇＥなどが挙げられるが、その部分でもよく、
該部分としては例えばＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＩｇＧ（γ
鎖）、ＩｇＧ（Ｆａｂ）、ＩｇＧ（Ｆｃ）、ＩｇＧ（Ｆ
ａｂモノマー）、ＩｇＧ（Ｆｄ）、ＩｇＧ１、ＩｇＧ
２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、Ｉ
ｇＧ２ｃ、ＩｇＡ（α鎖）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、Ｉｇ
Ｍ（μ鎖）、ＩｇＤ（δ鎖）、ＩｇＥ（ε鎖）、κ軽
鎖、、κ（フリー）鎖、λ軽鎖、λ（フリー）鎖などが
挙げられる。本発明で用いられる抗Ｉｇ抗体としては、
例えば、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＡ抗体、抗ＩｇＭ抗体、
抗ＩｇＤ抗体、抗ＩｇＥ抗体などが挙げられる。なかで
も、抗ＩｇＧ抗体が好ましく、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＡ
抗体および抗ＩｇＭ抗体の混合物であってもよい。

【００２６】環境汚染物質またはその分解物に対する抗
体であるＩｇの製造や、該Ｉｇに対する抗体（すなわち
抗Ｉｇ抗体）の製造は、自体公知の方法、例えば、エン
ザイムイムノアッセイ、第４６頁〜７１頁および第８５
頁〜１１０頁（P. TIJSSEN著、石川栄治監訳、東京化学
同人（1989））に記載される方法あるいはこれに準じる
方法により行うことができる。これらの方法において、
動物に、抗原である環境汚染物質またはその分解物の誘
導体とキャリヤー蛋白質との複合体を接種する際のキャ
リヤー蛋白質としては、例えば、牛血清アルブミン（以
下、ＢＳＡと略す）、卵白アルブミン（以下、ＯＶＡと
略す）、スカシ貝ヘモシアニン（以下、ＫＬＨと略
す）、牛チログロブリン（以下、ＢＴＧと略す）などが
挙げられる。

【００２７】環境汚染物質またはその分解物の誘導体と
キャリヤー蛋白質との複合体の形成は、例えば、式
（６）：

【化６】Ａ−Ｒ （６） （式中、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＮＨ₂またはＳＨを、Ａは、
Ｒ基の離脱により、環境汚染物質またはその類縁化合物
となる基を示す。）で表される化合物を、自体公知の方
法によりキャリヤー蛋白質に結合させることにより行う
ことができる。式（６）で表される化合物も、自体公知
の方法で、適宜の原料に、カルボキシル基、アミノ基、
スルフヒドリル基を形成または導入することにより、化
学的に合成できる。

【００２８】例えば、ＲがＣＯＯＨで、Ａがポリオキシ
エチレンアルキルフェニルエーテルとなる式（６）で表
される化合物は、ポリオキシアルキルフェニルエーテル
と無水コハク酸を脱水縮合（ハーフエステル）すること
により製造できる［キャンサー・バイオケミストリー・
バイオフィジックス（Cancer Biochem. Biophys.），
７，１７５（１９８４）］。ＲがＮＨ₂で、Ａがポリオ
キシエチレンアルキルフェニルエーテルとなる式（６）
で表される化合物は、ポリオキシアルキルフェニルエー
テルの水酸基を塩化チオニルにより塩素化した後［ジャ
ーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー
（J. Am. Chem. Soc.），６０，２５４０（１９３
８）］、アンモニアで処理することにより製造できる
［オーガニック・ファンクショナル・グループ・プレパ
レーションズ（Organic Functional Group Preparation
s），第１巻，３８２頁］。ＲがＳＨで、Ａがポリオキ
シエチレンアルキルフェニルエーテルとなる式（６）で
表される化合物は、ポリオキシアルキルフェニルエーテ
ルの水酸基を塩化チオニルにより塩素化した後［ジャー
ナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（J.
Am. Chem. Soc.），６０，２５４０（１９３８）］、
水硫化ナトリウムと反応させることにより製造できる
［ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテ
ィー（J. Am. Chem. Soc.），７２，１８４３（１９５
０）］。

【００２９】本発明で用いる担体としては、免疫学的測
定法において適常用いられるものを用いることができ
る。その例としては、例えば、マイクロプレート（例、
９６ウェルマイクロプレート、２４ウェルマイクロプレ
ート、１９２ウェルマイクロプレート、３８４ウェルマ
イクロプレートなど）、試験管（例、ガラス試験管、プ
ラスチック試験管）、ガラス粒子、ポリスチレン粒子、
修飾ポリスチレン粒子、ポリビニル粒子、ラテックス
（例、ポリスチレン・ラテックス）、ニトロセルロース
膜、臭化シアン活性化濾紙、ＤＢＭ活性化濾紙、粒状固
相（例、Sepharose、Sephadex、アガロース、セルロー
ス、Sephacrylなど）、鉄含有ポリカーボネート膜、マ
グネット含有ビーズなどが挙げられる。担体に抗Ｉｇ抗
体を担持させるには、自体公知の方法［例、上記「エン
ザイムイムノアッセイ」第２６８〜２９６頁、「アフィ
ニティークロマトグラフィーハンドブック」（アマシャ
ム ファルマシア バイオテク（株）（１９９８年１２月
２０日発行）］などで担持できる。

【００３０】本発明で用いる抗体は、自体公知の方法、
すなわち、環境汚染物質またはその分解物の誘導体とキ
ャリアー蛋白質との複合体で免疫した動物から得られる
ポリクローナル抗体または該免疫した動物の脾細胞また
はリンパ節細胞と、骨髄腫細胞とを融合させて得られる
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに産生さ
せることにより製造することができる。

【００３１】動物を免疫するには、環境汚染物質または
上記で得られた複合体を動物に接種する。接種する動物
としては、例えば、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ラット、マ
ウス、モルモット、ニワトリなどが用いられるが、環境
汚染物質に対するモノクローナル抗体が所望の場合に
は、マウスが特に好ましく用いられる。接種方法として
は、通常実施される方法でよく、例えば、マウスに１回
に約１〜１００μg、好ましくは約５０〜１００μgを等
容量（０.１ml）の生理食塩水およびフロイントの完全
アジュバンドまたはＲＩＢＩアジュバンドシステム^TMで
乳化して、背部、腹部の皮下あるいは腹腔内に２〜３週
毎に３〜６回接種する方法がとられる。ポリクローナル
抗体を得る場合には接種された動物の血清から、採取す
ることにより行われる。モノクローナル抗体を得るに
は、さらに次の操作が行われる。

【００３２】これらの免疫動物、例えば、マウスから抗
体価の高い個体を選び、最終免疫３〜５日後に脾臓ある
いはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞
を骨髄腫細胞と融合させる。融合操作は既知の方法に従
って実施でき、融合促進剤としては、ポリエチレングリ
コール（以下、ＰＥＧと略す）や、センダイウイルスな
どが挙げられるが、好ましくは、ＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としてはＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、Ｓp２／Ｏな
どが用いられ、特にＰ３Ｕ１が好ましい。例えば、脾細
胞と骨髄腫細胞との好ましい比率は約１:１〜１０:１
で、これに分子量約１,０００〜６,０００のＰＥＧが約
１０〜８０％の濃度で添加され、約２０〜３７℃、好ま
しくは約３０〜３７℃で約３〜１０分インキュベートす
るのがよい。

【００３３】所望の抗体産生ハイブリドーマのスクリー
ニングには、種々の方法が使用できるが、例えば、環境
汚染物質類似化合物（ハプテン）を結合させたＯＶＡを
吸着させたマイクロプレートにハイブリドーマ培養上清
を添加し、ついで、西洋わさびペルオキシダーゼ（以
下、ＨＲＰと略す）標識した抗マウス免疫グロブリン抗
体を加え、プレート固相に結合した抗体を検出するＥＬ
ＩＳＡ法などが挙げられる。抗体活性陽性のハイブリド
ーマを直ちにクローニングに供するが、通常これは限界
希釈法などで容易に実施される。クローン化されたハイ
ブリドーマ上清の抗体価を上記の方法で測定し、安定的
に力価の高い抗体を産生するハイブリドーマを選択し、
目的とするモノクローナルなハイブリドーマを取得する
ことができる。

【００３４】このような方法により得られるハイブリド
ーマとしては、例えば、界面活性剤化合物に対するモノ
クローナル抗体を産生する、ハイブリドーマＧＯＴ９３
０−９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０６５）、ＧＯＴ９３５−
５４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０６６）およびＭＯＦ３−１
３９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５９）（特開平１０−１５
５４８４号公報、ＥＰ−Ａ ８３４５５７号公報）、内
分泌撹乱物質に対するモノクローナル抗体を産生する、
ハイブリドーマＭＯＦ３−１３９（ＦＥＲＭＢＰ−６０
５９）、ＡＰ−１４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６３３）、Ｂ
Ｐ２−１７７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６３４）、ＤＦ−３
４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６３５）およびＣＰ−８（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−６６３６）（ＰＣＴ／ＪＰ９９／００６８
４号、以下の参考例３において示す）が挙げられる。

【００３５】ハイブリドーマによるモノクローナル抗体
の産生、精製も自体公知の方法で行うことができる。得
られたモノクローナル抗体は、環境汚染物質、その分解
物のみならず、式（６）で表される化合物に対する抗体
となる。抗体の産生、精製方法の具体例としては、例え
ば、前記「エンザイム・イムノアッセイ」第４６〜７１
頁、第８５〜１１０頁に記載され、塩折（Ｎａ₂ＳＯ₄、
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄）、イオン交換体（ＤＥＡＥ、ＱＡ
Ｅ、ＣＭ／cellulose、Sephadex、Sepharose、Servacel
など）、疎水クロマトグラフィー（Ｌ−フェニルアラニ
ル−Sepharoseなど）、ゲル濾過（Sephadex G-200、Bio
-Gel P-300など）、電気泳動（アガロースゲルによるゾ
ーン電気泳動、等電点電気泳動、等速電気泳動など）、
超遠心（ショ糖密度勾配遠心法）、アフィニティークロ
マトグラフィー（固定化プロテインＡ（Protein A Seph
arose、Protein-A superoseなど））などの方法が挙げ
られる。

【００３６】上記で得られた担体に担持させた抗Ｉｇ抗
体に上記抗体を結合させるには、自体公知の抗原抗体反
応を利用することにより行うことができる。これらを、
例えば、ＥＬＩＳＡ用の酵素剤や、緩衝剤等と組み合わ
せて、環境汚染物質、その分解物またはそれらの混合物
の免疫学的分析用キットまたは免疫学的濃縮用キットと
することができる。

【００３７】本発明の免疫化学的分析方法においては、
検体（例、環境汚染物質、その分解物またはそれらの混
合物を含有する水や土壌試料）と、既知の量の標識され
た環境汚染物質、その分解物またはそれらの混合物と
の、本発明のモノクローナル抗体に対する結合の量的な
競合反応によって定量するいわゆる競合法が用いられ
る。競合法においては、担体上の抗Ｉｇ抗体に結合させ
た一定量の抗体に、未知の抗原を含む検体液および標識
剤で標識した一定量の抗原を加える。担体上に保持され
た標識剤または担体上に保持されなかった標識剤の活性
を測定する。抗体と標識された抗原の添加は、ほぼ同時
に行うことが望ましい。この競合法は、サンドウィッチ
法などに比べて、操作が簡便で比較的短時間での測定が
可能である。

【００３８】抗原を標識する標識剤としては、放射性同
位元素（以下、ＲＩと略す、例、³Ｈ、¹⁴Ｃ、¹⁵Ｎ、³²
Ｐ、¹³¹Ｉ、など）、酵素（例、ペルオキシダーゼ、β
―ガラクロシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ウレ
アーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、
カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラ
ーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、リボヌクレアー
ゼ、シトクロムＣ）、酵素基質（例、３，３’，５，
５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、オルソフ
ェニレンジアミン（ＯＰＤ）、ｏ−トルイジン、過酸化
水素、メチルヒドロペルオキシド、エチルヒドロペルオ
キシド、プロピルヒドロペルオキシド、ウレアヒドロゲ
ンペルオキシド、ｐ−ニトロペルオキシ安息香酸、カテ
コール、レゾルシノール、ヒドロキノン、ピロガロー
ル、ｏ−ジアミノベンゼン、グアイアコール、ベンジジ
ン、ラクトース、ｏ−ニトロフェニル-β−Ｄ−ガラク
トシド、ｐ−ニトロフェニルリン酸、β−Ｄ−グルコー
ス、ウレア、アンフェタミン、バルビツール酸、ベンゾ
ジアゼピン、ベンゾイルエクゴニン）、メサドン、モル
フィネ、プロポキシフェン、Ｌ−リンゴ酸、チロキシ
ン、モルフィネ、コデイン、トリヨードチロニン、テト
ラヒドロカンナビノール、リドカイン、フェンシクリジ
ン、テオフィリン、ジゴキシン、コルチゾール、フェニ
トイン、フェノバルビタール、プリミドン、ベンゾジア
ゼパム、カルバマゼピン、エトスクシミド、ゲンタマイ
シン、キニジン、プロカインアミド、メトトレキセー
ト）、蛍光物質（例、ガラクトシルウンベリフェリ
ル）、発光物質（例、ルシフェラーゼ）、ビオチンなど
が挙げられる。これら抗原と標識剤の結合には、マレイ
ミド法［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J. B
iochem.) ,７９,２３３（１９７６）］、活性化ビオチ
ン法［ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサ
エティー（J. Am. Chem. Soc.)、１００、３５８５（１
９７８）］などが用いられる。

【００３９】例えば、競合法による特異的免疫化学的測
定方法を実施するには、抗体を結合させた固相に未知量
の環境汚染物質を含有する被検試料を加えて反応させ、
同時に標識剤で標識した抗原の一定量を加えて反応させ
る。つぎに、通常、固相をよく洗浄し、固相上に保持さ
れている標識剤の活性を測定する。標識剤がＲＩである
場合、ウェル・カウンターまたは液体シンチレーション
・カウンターで測定する。標識剤が酵素である場合、基
質を加えて放置し、比色法もしくは蛍光法で酵素活性を
測定する。標識剤が蛍光物質、発光物質であっても、そ
れぞれ公知の方法に従って測定する。

【００４０】本発明の免疫学的測定もしくは分析の方法
においては、担体に抗Ｉｇ抗体を担持させ、さらに該抗
Ｉｇ抗体に環境汚染物質またはその分解物に対するモノ
クローナル抗体を結合させた複合体を固相として用いて
いるので、高感度に環境汚染物質またはその分解物を測
定もしくは分析することができる。

【００４１】

【実施例】以下に参考例および実施例を挙げ、本発明を
さらに具体的に説明するが、これらは、本発明の範囲を
限定するものではない。上記したハイブリドーマおよび
以下の参考例３におけるハイブリドーマは、ブダペスト
条約の下、日本国茨城県つくば市東１−１−３の通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に
寄託されており、以下の表にその寄託日および受託番号
を示す。

【００４２】

【表１】

【００４３】参考例１ 抗マウスＩｇＧ抗体固相化担体の製造：抗マウスＩｇＧ
抗体［マウスＩｇＧを免疫原とする。ＩＣＮファーマシ
ューティカル社（カッペルプロダクト）コスモバイオ
（株）から購入。カタログ番号（５５４７９）］をダル
ベッコリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に５０μｇ／ｍｌで溶解
し、マイクロプレートに１００μｌ／ウェルで添加し
た。４℃で一晩反応させた後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ
２０を含むリン酸バッファー（ＴＰＢＳ）にて洗浄後、
ＰＢＳにて４倍稀釈したブロックエース（雪印乳業株式
会社製 （東京））を１５０μｌ／ウェルを添加した。
３７℃１時間以上反応させ、抗マウスＩｇＧ抗体固相化
担体を製造し、使用時まで４℃で保存した。

【００４４】参考例２ 抗マウスＩｇＡ抗体固相化担体の製造法：抗マウスＩｇ
Ａ抗体［ＩｇＡを免疫原とする。参考例１に記載の抗体
の購入先と同じカタログ番号（５５４７８）］をダルベ
ッコリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に５０μｇ／ｍｌで溶解
し、マイクロプレートに１００μｌ／ウェルで添加し
た。４℃で一晩反応させた後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ
２０を含むＴＰＢＳにて洗浄後、ＰＢＳにて４倍稀釈し
たブロックエースを１５０μｌ／ウェルを添加した。３
７℃で１時間以上反応させ、抗マウスＩｇＡ抗体固相化
担体を製造し、使用時まで４℃で保存した。

【００４５】参考例３ モノクローナル抗体の取得： （１）樹脂成分類抗体用ハプテンの作成 ビスフェノールＡ２５ｇとグルタル酸無水物１２．５ｇ
を窒素雰囲気下、１００℃にて１８時間反応させた。反
応物を酢酸エチルに溶解し、シリカゲルカラム、オクタ
デシルシリカゲル（ＯＤＳ）カラムで精製後、ヘキサン
にて結晶化させて、ビスフェノールＡ−グルタル酸縮合
物２．１ｇを得た。

【００４６】（２）免疫原の調製 （１）で得られたハプテン０．１モル、水溶性カルボジ
イミド０．１４モル、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド
０．１４モルをジメチルスルフオキシド２ｍｌ中で室温
で一晩反応させて、活性化エステルを作成した。次に、
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１０ｍｇを０．１３モル重
炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ₃）溶液に溶解し、本活性
化エステル２００μｌを添加後、一晩４℃で反応させ
た。限外濾過により未反応の試薬を除去し、免疫原とし
て凍結保存した。

【００４７】（３）免疫 （２）で得られた免疫原とＢＳＡの複合体を５００μｇ
／ｍｌとなるように生理食塩水に溶解し、等量のフロイ
ンドアジュバンドまたはＲＩＢＩアジュバンドに添加し
た。充分乳濁後、ＢＡＬＢ／Ｃマウス（メス）に１００
μｇ／マウスで皮下投与し、２週間（フロインド）もし
くは３週間（ＲＩＢＩ）間隔で追加免疫を実施した。５
〜６回の追加免疫後、最大の血清抗体価を示した個体に
ついて同じ複合体溶液（５〜１０μｇ／０．１ｍｌ生理
食塩水／マウス）を静脈投与し最終免疫とした。

【００４８】（４）細胞融合 最終免疫から３日後、マウスの腹腔中から脾臓を摘出
し、脾細胞懸濁液を常法により調製した（約１０
⁸個）。ついで、血清無添加培地で３回洗浄したマウス
骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ１）２×１０⁷個を添加し、ＰＥＧ
６０００を用いてケーラーとミルスタインの方法［Ｎａ
ｔｕｒｅ， ２５６， ４９５（１９７５）］に準じて
細胞融合に供した。融合終了後、細胞混液をヒポキサン
チン、アミノプテリン、チミジンを含むいわゆるＨＡＴ
培地に懸濁し、１０日間培養した。１０日間の培養期間
中に脾臓由来の細胞は自然に死滅し、ＨＡＴ培地により
脾細胞と融合しなかったマウス骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ１）
も死滅した。培地中に生存した細胞をバイブリドーマと
し、以後はＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたＨＴ
培地にて培養を続けた。

【００４９】（５）ハイブリドーマの一次選択およびク
ローニング 免疫原と同様の方法で作成したハプテンとＯＶＡの複合
体（ハプテン−ＯＶＡ）を吸着させたマイクロプレート
を用いるＥＬＩＳＡ法によりハイブリドーマ培養上清の
抗体価を測定した。融合から１０日から２０日後にハイ
ブリドーマの出現を認め、かつハプテン−ＯＶＡに結合
する抗体の出現が認められた。特に産生抗体の結合活性
が強いハイブリドーマについて、限界稀釈法によるクロ
ーニングに供した。

【００５０】（６）ハイブリドーマの二次選択 （５）の方法で取得したハイブリドーマについて、対象
化合物（樹脂成分類、ビスフェノールＡ）を培養上清に
加えて、ハプテン−ＯＶＡプレートを吸着させたマイク
ロプレートへの結合能の阻害を調べる阻害試験を行い、
対象化合物のみにより結合が阻害されるものを選択し
た。以上の方法により、対象化合物に特異的に結合する
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（ＢＰ２−１７
７）を取得した。

【００５１】（７）モノクローナル抗体の作成 クローン化されたハイブリドーマを、１０％ウシ胎児血
清を含むダイゴＴ培地（日本製薬 東京）中、３７℃、
５％二酸化炭素濃度のインキュベーターを用いて培養
し、その上清より抗体を得た。一方、多量の抗体を得る
ためには、予め０．５ｍｌの鉱油を腹腔内投与したＢＡ
ＬＢ／Ｃマウスに５×１０⁶個のハイブリドーマを腹腔
内接種した。細胞を接種したマウスは約１０日後に腹水
の貯留が見られた。腹水の貯留したマウスを開腹し、腹
腔内より腹水を採取した。抗体の精製は常法により、細
胞培養上清または腹水上清より４５〜５０％飽和硫酸ア
ンモニウムで分画後、プロテインＡクロマトグラフィー
にて精製した。このようにして、樹脂成分類に対するモ
ノクローナル抗体である抗ＰＲＣ抗体を得た。

【００５２】（８）その他のハイブリドーマの作成 １）アルキルフェノールエトキシレート類（ＡＰＥ）抗
体用ハプテンおよびアルキルフェノール類（ＡＰ）抗体
用ハプテンの作成ポリエチレングリコールモノノニルフ
ェニルエーテル（ＮＰ５ＥＯ）５．０ｇをトルエン６０
ｍｌに溶解し、無水コハク酸９１８ｍｇ、ｐ−トルエン
スルホン酸１６ｍｇと、窒素雰囲気下、８０℃にて２時
間反応させた。反応液をアルカリ条件下（ｐＨ１２）で
エーテル洗浄後、酸性条件下（ｐＨ２）でクロロホルム
抽出した。抽出液を脱水、蒸発乾固して所望のハプテン
２．１ｇを得た。

【００５３】２）樹脂可塑剤（ＰＰ）抗体用ハプテンの
作成 ８−ブロモオクタン酸１０ｇをテトラヒドロフラン３０
０ｍｌに溶解後、ジフェニルアミノメタン２０ｍｌを添
加し、室温で一晩反応させた。翌日、さらにジフェニル
アミノメタン２０ｍｌを添加し、さらに室温で一晩反応
させた。減圧濃縮後、反応物をヘキサン−酢酸エチル
（９：１）に溶解し、シリカゲルカラムで粗精製した。
この粗精製物２０ｇと、フタル酸２．４２ｇ、１，８−
ジアザビシクロウンデンセン（ＤＢＵ）２．２２ｇとを
ベンゼン６０ｍｌ中で一晩加熱還流した。翌日、ＤＢＵ
２．２２ｇを添加後、さらに６時間加熱還流し、室温に
冷却後、水、クロロホルムを加え、水洗した。クロロホ
ルム層を脱水、濃縮後、ヘキサン−酢酸エチル（９：
１）に溶解し、シリカゲルカラムにて粗精製した。この
粗精製物４．１ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１０
０ｍｌに溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（５０％含水品）０．
４ｇを添加した。Ｈ₂吹き込み（０．３ｍｌ／分、５時
間）後、１０％Ｐｄ／Ｃ１．２ｇを追加した。さらにＨ
₂吹き込み（０．５ｍｌ／分、２時間）後、触媒を除去
し、減圧濃縮した。７５％メタノールに溶解後、ＯＤＳ
カラムにて精製し、所望のハプテン１．９ｇを得た。

【００５４】３）クロロフェノール類（ＣＰ）抗体用ハ
プテンの作成 ５−ブロモ吉草酸５０ｇとトリフェニルホスフィン７
２．５ｇをトルエン４００ｍｌ中で一晩加熱還流後、濾
過し、固体をトルエンで洗浄し、減圧乾燥してホスホニ
ウム塩１２０ｇを得た。別途、ｐ−ヒドロキシベンズア
ルデヒド２５ｇを酢酸１２５ｍｌに溶解し（３５℃）、
５０℃に温度を上げ、塩素ガスを２時間吹き込んだ。室
温まで放冷し（３５℃）、白色結晶１９ｇを得た。この
結晶１９ｇと酢酸３６ｇを混合後、８０℃に加熱し、濃
厚なスラリー状になるまで塩素ガスを吹き込んだ。室温
まで放冷後、析出した白色結晶をクロロホルムから再結
晶させ、３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシベンズアル
デヒド９．３ｇを得た。次に、この結晶９ｇと上記のホ
スホニウム塩３１．３ｇおよびｔ−ブタノール１５．５
ｍｌをトルエン２１０ｍｌに溶解し、５０℃まで加熱し
た時点でt-ＢｕＯＫ２３．７ｇを添加した。５５℃で５
時間反応させた後、室温でさらに一晩反応させた。反応
液を氷中に投入し、トルエン層を捨て、残った液のｐＨ
を２に調整した。酢酸エチルで抽出後、減圧乾燥し、ヘ
キサン−酢酸エチル（９：１）に溶解し、シリカゲルカ
ラムで精製し、精製物５．３ｇを得た。この精製物２．
５５ｇ、１０％Ｐｄ／Ｃ（５０％含水品）０．３６ｇ、
水３０ｍｌおよびメタノール６０ｍｌを混合後、水素を
吹き込んだ（０．２リットル／分、２０分）。触媒を除
去し、減圧濃縮し、イソプロピルエーテル（ＩＰＥ）で
抽出した。減圧濃縮後、シリカゲルカラム、ＯＤＳカラ
ムで精製した。精製物をエーテル／ヘキサンで再結晶さ
せ、所望のハプテン１．７ｇを得た。これらのハプテン
を用いて、上記（２）〜（６）と同様な方法により、ハ
イブリドーマＭＯＦ３−１３９（抗ＡＰＥ抗体産生、Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６０５９）ハイブリドーマＡＰ−１４
（抗ＡＰ抗体産生、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６３３）、ＤＦ
−３４（抗ＰＰ抗体産生、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６３５）
およびＣＰ−８（抗ＣＰ抗体産生、ＦＥＲＭ ＢＰ−６
６３６）を調製した。

【００５５】実施例１ （１）抗エストロゲンモノクローナル抗体の固定化 参考例１で作成した抗マウスＩｇＧ固相化担体をＴＰＢ
Ｓにて洗浄後、ＰＢＳにて最適濃度（０．１２５μｇ／
ｍｌ）に稀釈した抗エストロゲンモノクローナル抗体
（抗エトストリオール１６グルクロニドモノクローナル
抗体）帝国臓器製薬（株）（東京）から購入）を１００
μｌ／ウェル（０．０１２５μｇ抗体／ウエル）で添加
し、４℃で一晩反応させた。ＴＰＢＳにて洗浄後、ＰＢ
Ｓにて４倍稀釈したブロックエースを１５０μｌ／ウェ
ルを添加した。３７℃で１時間以上反応させ、担体−抗
マウスＩｇＧ抗体−抗エストロゲンモノクローナル抗体
複合体を得、使用時まで４℃で保存した。

【００５６】（２）抗エストロゲン抗体を用いたエスト
ラジオールの測定 抗原酵素複合体（エストリオール１６グリクロニドと西
洋ワサビペルオキシダーゼをカルボジイミド法にて結合
させたもの）を２倍濃縮ＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２
０含有）に稀釈し、エストロゲンを含むサンプルと等量
混合後、アッセイ用プレートに添加した。６０分、室温
で反応度、ＴＰＢＳにて洗浄し、発色基質を添加した。
３０分室温で反応後、１Ｎリン酸にて発色反応を停止さ
せ、吸光度を測定し、図１に示す標準曲線を作成した。
対照として同抗体を直接マイクロプレートに固相化
（０．５μｇ抗体／ウエル）したときの標準曲線を図２
に示す。これらの結果から、抗マウスＩｇＧ抗体を予め
固相化することにより、抗エストロゲン抗体使用量を約
１／４０に低減でき、かつ、感度が約１０倍程度向上す
ることが分かる。

【００５７】実施例２ （１）抗樹脂成分類（ＰＲＣ）モノクローナル抗体の固
定化 参考例２で作成した抗マウスＩｇＡ固相化担体をＴＰＢ
Ｓにて洗浄後、ＰＢＳにて最適濃度（０．３μｇ／ｍ
ｌ）に稀釈した抗ＰＲＣモノクローナル抗体（参考例３
で製造されたもの）を１００μｌ／ウェル（０．０３μ
ｇ抗体／ウエル）で添加し、４℃で一晩反応させた。Ｔ
ＰＢＳにて洗浄後、ＰＢＳにて４倍稀釈したブロックエ
ースを１５０μｌ／ウェル添加した。３７℃で１時間以
上反応させ、担体−抗マウスＩｇＡ抗体−抗ＢＰＡモノ
クローナル抗体複合体を得、使用時まで４℃で保存し
た。

【００５８】（２）抗ＰＲＣ抗体を用いたビスフェノー
ルＡ（ＢＰＡ）の測定 抗原酵素複合体（ＢＰＡと無水グルタル酸のハーフエス
テルと西洋ワサビペルオキシダーゼをカルボジイミド法
にて結合させたもの）を２倍濃縮ＰＢＳに稀釈し、ＢＰ
Ａを含むサンプルと等量混合後、アッセイ用プレートに
添加した。６０分、室温で反応度、ＴＰＢＳにて洗浄
し、発色基質を添加した。３０分室温で反応後、１Ｎリ
ン酸にて発色反応を停止させ、吸光度を測定し、図３に
示す標準曲線を作成した。対照として図４に同抗体を直
接マイクロプレートに固相化（０．５μｇ抗体／ウエ
ル）したときの標準曲線を示す。これらの結果から、抗
マウスＩｇＡ抗体を予め固相化することにより、抗ＰＲ
Ｃ抗体使用量を約１／１７に低減でき、かつ、感度が５
倍程度向上することが分かる。

【００５９】

【発明の効果】担体に担持された抗Ｉｇ抗体にさらに環
境汚染物質もしくはその分解物に対する抗体が結合した
複合体を構成成分の１つとして用いることによる本発明
のキットを用いて免疫学的測定法を行なうと、高感度
に、環境汚染物質もしくはその分解物を検出・測定する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１で得られた、抗マウスＩｇＧ抗体＋
抗エストロゲン抗体を固相化した担体を用いた場合のエ
ストラジオールの標準曲線である。

【図２】 実施例１で得られた、抗エストロゲン抗体を
固相化した担体を用いた場合のエストラジオールの標準
曲線である。

【図３】 実施例２で得られた、抗マウスＩｇＡ抗体＋
抗ＰＲＣ抗体を固相化した担体を用いた場合のＢＰＡの
標準曲線である。

【図４】 実施例２で得られた、抗ＰＲＣ抗体を固相化
した担体を用いた場合のＢＰＡの標準曲線である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 担体に担持された抗イムノグロブリン抗
   体にさらに環境汚染物質またはその分解物に対する抗体
   が結合した複合体を構成成分の一つとしてなることを特
   徴とする環境汚染物質、その分解物またはそれらの混合
   物の免疫学的測定または分析用キット。
2. 【請求項２】 環境汚染物質が、合成洗剤用界面活性剤
   化合物、または内分泌攪乱物質である請求項１記載のキ
   ット。
3. 【請求項３】 合成洗剤用界面活性剤化合物が、陰イオ
   ン界面活性剤化合物または非イオン界面活性剤化合物で
   ある請求項２記載のキット。
4. 【請求項４】 内分泌攪乱物質が、女性ホルモン類、男
   性ホルモン類、甲状腺ホルモン類、アルキルフェノール
   エトキシレート類、アルキルフェノール類、樹脂成分
   類、樹脂可塑剤類またはクロロフェノール類である請求
   項２記載のキット。
5. 【請求項５】 検体と、担体に担持された抗イムノグロ
   ブリン抗体にさらに環境汚染物質またはその分解物に対
   する抗体が結合した複合体と、標識剤で標識した環境汚
   染物質、その分解物またはそれらの混合物とを反応させ
   た後、担体上に保持された標識剤または担体上に保持さ
   れなかった標識剤の活性を測定することを特徴とする検
   体内の該環境汚染物質、その分解物またはそれらの混合
   物の免疫学的測定または分析方法。