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JP2011024590A - 中和エピトープベースの成長増強ワクチン - Google Patents

中和エピトープベースの成長増強ワクチン Download PDF

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JP2011024590A JP2010206164A JP2010206164A JP2011024590A JP 2011024590 A JP2011024590 A JP 2011024590A JP 2010206164 A JP2010206164 A JP 2010206164A JP 2010206164 A JP2010206164 A JP 2010206164A JP 2011024590 A JP2011024590 A JP 2011024590A
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Abstract

【課題】５０残基以下のＧＤＦ８のペプチドフラグメントを含む融合タンパク質を提供すること。
【解決手段】本発明は、植物ウイルスコートタンパク質およびＧＤＦ８ペプチドドメイン、またはＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントを含む融合タンパク質を提供する。この融合タンパク質を発現する植物ウイルスベクター、およびこれらのベクターを用いる方法も提供される。本発明は、ＧＤＦ８タンパク質の有用なエピトープを含む植物ウイルスコートタンパク質（ＶＣＰ）融合タンパク質（「ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質」）、例えば、ＧＤＦ８の少なくとも１つの特異的な中和エピトープを含む、５０残基以下のＧＤＦ８のペプチドフラグメントを含む融合タンパク質を提供することによって、当該分野におけるこれらの欠点および他の欠点を解決する。
【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、成長および分化因子８、ならびに成長および分化因子８の抗原性ペプチドフ
ラグメント、ならびに関連の抗原およびワクチンを、植物ウイルスベクターを用いて植物
中で、発現することによって形成された融合タンパク質に、そして成長および分化因子８
の活性を調節するためにこのような融合タンパク質を用いて動物を処置する方法に関する
。
発明の背景
成長および分化因子８は、トランスフォーミング成長因子β（「ＴＧＦ−β」）スーパ
ーファミリーに分類されるタンパク質である。一般には、ＴＧＦ−βスーパーファミリー
のタンパク質は最初に、前駆体（ａ／ｋ／ａプロホルモン）として発現され、これが、前
駆タンパク質のＣ末端から塩基性残基約１１０〜１４０アミノ酸のクラスターでタンパク
質分解性の切断を受ける。各々の場合に、活性または成熟したＴＧＦ−β種は、切断され
た前駆体タンパク質Ｃ末端領域のジスルフィド結合二量体であると考えられる。
成長および分化因子８は、本明細書において以降ではＧＤＦ８であって、これはまたミ
オスタチンとしても当該分野で公知である。ＧＤＦ８の前駆体（本明細書において以降で
は「前駆体ＧＤＦ８（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ＧＤＦ８）」）をコードする遺伝子は、広範
な生物体からクローニングされている。これらとしてはヒトおよびマウスの前駆体ＧＤＦ
８が挙げられる（非特許文献１；特許文献１、本明細書において参照によって援用される
）。ＧＤＦ８免疫反応性は、ヒト骨格筋において１型および２型のファイバーの両方で検
出可能であるということも報告されている。ＧＤＦ８を検出するための抗体およびアッセ
イは、例えば、特許文献２によって記載される。
ＧＤＦ８は、ＧＤＦ８ノックアウトマウスによって確認されるように、骨格筋の成長お
よび発達を下方制御することまたは阻害することに役割を果たすことがさらに報告されて
いる（非特許文献２）。この理由のために、以前に、詳細には、動物の畜産の分野で、動
物のＧＤＦ８活性をいくつかの方法で調節することが試みられており、ここでは種々の食
用動物の成長および／または相対的な筋肉量を強化するためにＧＤＦ８活性を下方制御す
ることが目標である。
例えば、特許文献３は、前駆体ＧＤＦ８遺伝子プロモーターおよびアッセイを記載して
おり、ここでそのプロモーターの理論的インヒビターを同定するためにそのアッセイが用
いられるという提案をしている。特許文献４は、細胞と、ＧＤＦ８レセプターと競合する
ＧＤＦ８プロドメインとを接触させることによってその細胞上でＧＤＦ８の影響を阻害す
る方法を記載しており、そして成熟ＧＤＦ８のＣ末端が変化し得ることを報告している。
特許文献５は、ＧＤＦ８の可能性のあるアンタゴニストとしてホリスタチンの使用を記載
している。動物の畜産または臨床適用の分野で任意の現実的な適用が得られている方法は
ない（ヒトまたは獣医のいずれでも）。
当該技術はまた、ＧＤＦ８機能を下方制御するために抗体およびワクチン技術を使用す
ることを試みている。例えば、本明細書において参照によって援用される米国特許第６，
３６９，２０１号は、ペプチド、すなわちＧＤＦ８タンパク質のフラグメント、および抗
ＧＤＦ８抗体を惹起するためのワクチンを記載する。その特許はまた、報告されたＧＤＦ
８ペプチドフラグメントのいくつかで免疫したげっ歯類での、コントロールに対する、特
定されない程度の成長または体重増加を報告した。
ＧＤＦ８の他の生理学的な役割がまた記載されている。例えば、参照によって本明細書
に援用される、特許文献６は、ＧＤＦ８機能を阻害することが、ＩＩ型糖尿病を処置する
ために、例えば、抗ＧＤＦ８抗体または抗ＧＤＦ８ワクチンを、この状態を有する患者に
投与することによって、有用であることを示唆している。
近年では、その内容が本明細書において参照によって援用される特許文献７は、キメラ
タンパク質を発現する組み換え植物ウイルスを記載している。これらのキメラタンパク質
は、植物ウイルス（またはウイルス）コートタンパク質（ＶＣＰ）および目的のペプチド
またはポリペプチドの融合によって形成される。このような組み換え植物ウイルスを用い
て植物細胞を感染させることによる、特許文献７によれば、比較的大量の所望の融合タン
パク質が生成される。ＶＣＰタンパク質が目的のポリペプチド抗原と融合される場合、こ
の融合されたポリペプチド抗原の位置は、免疫系、結合抗体などに対して曝露されるよう
に注意深く選択されなければならない。適切なタンパク質操作を用いて、この融合ＶＣＰ
は、目的のポリペプチドに対する抗体応答および／または防御的免疫を誘導するための免
疫原または抗原として、あるいはこのような目的のポリペプチドを検出するのにおいて有
用なイムノアッセイを開発および実施するための試薬として用いられ得る。
抗ＧＤＦ８免疫応答を惹起するための改善された抗原および免疫原について、ならびに
ＧＤＦ８に対して高度に特異的に結合し得る改良されたＧＤＦ８抗体については当該分野
では長年にわたって必要性が残存している。
本明細書における任意の引用文献の引用は、このような引用文献が当該出願の「先行技
術（Ｐｒｉｏｒ Ａｒｔ）」として利用可能であるという承認と解釈されるべきではない
。
米国特許第５，８２７，７３３号明細書 米国特許第６，０９６，５０６号明細書 米国特許第６，３９９，３１２号明細書 米国特許第６，６５６，４７５号明細書 米国特許第６，００４，９３７号明細書 米国特許第６，３６８，５９７号明細書 米国特許第６，７３０，３０６号明細書
Ｎｅｓｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ９５：１４９３８〜４３ ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ ３８７：８３〜９０
発明の要旨
本発明は、ＧＤＦ８タンパク質の有用なエピトープを含む植物ウイルスコートタンパク
質（ＶＣＰ）融合タンパク質（「ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質」）、例えば、ＧＤＦ
８の少なくとも１つの特異的な中和エピトープを含む、５０残基以下のＧＤＦ８のペプチ
ドフラグメントを含む融合タンパク質を提供することによって、当該分野におけるこれら
の欠点および他の欠点を解決する。本発明はさらに、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質お
よび／またはそのフラグメントによって惹起される抗体、抗体フラグメントおよび関連の
結合タンパク質、ならびにこれらを作製する方法およびこれらを用いる方法を提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
融合タンパク質であって：
（ａ）配列番号１のアミノ酸残基３２７〜３４６を含む、ＧＤＦ８ペプチドドメイン、ま
たはＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントと；
（ｂ）植物ウイルスコートタンパク質、または植物ウイルスコートタンパク質の少なくと
も１つのフラグメントと；
を含む、融合タンパク質。
（項目２）
前記植物ウイルスコートタンパク質がトバモウイルスコートタンパク質である、項目１
に記載の融合タンパク質。
（項目３）
前記ＧＤＦ８ペプチドドメインまたは前記ＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメン
トが、前記コートタンパク質のフラグメントに融合され；前記トバモウイルスがタバコモ
ザイクウイルス株Ｕ１またはＵ５である、項目２に記載の融合タンパク質。
（項目４）
配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５
４および配列番号５５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む項目１に記載の融
合タンパク質。
（項目５）
前記ＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントが配列番号１のアミノ酸残基３２９
〜３３２を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目６）
前記ＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントが配列番号１のアミノ酸残基３２７
〜３３８を含む、項目５に記載の融合タンパク質。
（項目７）
項目１に記載の融合タンパク質であって、
（ａ）前記コートタンパク質が一本鎖のプラス−センス植物ＲＮＡウイルス由来であり；
（ｂ）前記ＧＤＦ８ペプチドドメインが、
（ｉ）該コートタンパク質のＮ末端
（ｉｉ）該コートタンパク質のＣ末端
（ｉｉｉ）該コートタンパク質のＣ末端由来の４つのアミノ酸、および
（ｉｖ）該コートタンパク質の外部に露出されたループ領域内；
からなる群より選択される位置で該コートタンパク質に融合され；
、該融合タンパク質が、アジュバントがあっても無くても、ＧＤＦ８に対する免疫応答を
惹起する、融合タンパク質。
（項目８）
前記ＧＤＦ８ペプチドドメインが、１つ以上のアミノ酸置換を含み、
配列番号１のアミノ酸残基３２７と残基３４６との間に５つ以下のアミノ酸置換が存在
し、
該融合タンパク質が、ラットモノクローナル抗体７８８に対して特異的に結合する、請
求項１に記載の融合タンパク質。
（項目９）
前記ＧＤＦ８ペプチドドメインが、配列番号１の残基３２８、３２９、３３１、３３３、
３３５、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される位置にアミノ酸置換
を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１０）
項目９に記載の融合タンパク質であって、
（ａ）アミノ酸残基３２８がＨｉｓ、ＬｅｕまたはＡｓｎであり；
（ｂ）アミノ酸残基３２９がＧｌｎまたはＬｙｓであり；
（ｃ）アミノ酸残基３３１がＡｓｎまたはＳｅｒであり；
（ｄ）アミノ酸残基３３３がＡｒｇまたはＬｙｓであり；かつ
（ｅ）アミノ酸残基３３５がＳｅｒ、ＰｒｏまたはＴｈｒである、
融合タンパク質。
（項目１１）
前記融合タンパク質が、ラットモノクローナル抗体７８８に対して特異的に結合する条件
で、残基３２７〜残基３４６の間に１つ以下のアミノ酸置換を含む、項目１０に記載の
融合タンパク質。
（項目１２）
抗ＧＤＦ８抗体の特異的な中和エピトープを含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１３）
前記抗ＧＤＦ８抗体が、ラット抗ＧＤＦ８モノクローナル抗体７８８およびヤギ抗ＧＤＦ
８ポリクローナル抗血清のＩｇＧ画分からなる群より選択される、項目１２に記載の融
合タンパク質。
（項目１４）
アジュバントがあっても無くても、脊椎動物の免疫系に提示される場合、ＧＤＦ８に対す
る免疫応答を惹起する、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１５）
ヒトＧＤＦ８由来の約４〜約１６個連続するアミノ酸残基を含む、ＧＤＦ８ペプチドの抗
原性フラグメントを含む、項目１４に記載の融合タンパク質。
（項目１６）
項目１に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
（項目１７）
配列番号２のヌクレオチド１１１２〜ヌクレオチド１１７１を含む、項目１６に記載の
核酸。
（項目１８）
項目１６に記載の核酸を含む複製可能ベクター。
（項目１９）
プラスミド、ファージ、コスミドおよびウイルスからなる群より選択される、項目１８
に記載の複製可能なベクター。
（項目２０）
トバモウイルスである、項目１９に記載の複製可能ベクター。
（項目２１）
ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ３、ＴＭＶ−ＦＶ４、ＴＭＶ−ＦＶ５、
ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７からなる群より選択されるタバコモザイクウイルス
である、項目２０に記載の複製可能ベクター。
（項目２２）
項目１８に記載の複製可能ベクターを含む宿主細胞。
（項目２３）
植物細胞である、項目２２に記載の宿主細胞。
（項目２４）
項目２３に記載の宿主細胞を含むタバコ植物。
（項目２５）
ＧＤＦ８ペプチドドメインまたはＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントを含む
融合タンパク質を生成する方法であって、以下の工程：
（ａ）項目２２に記載の宿主細胞を培養する工程と；
（ｂ）コードされた融合タンパク質を発現する工程と、
を包含する、方法。
（項目２６）
融合タンパク質を回収する工程をさらに包含する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
ＧＤＦ８ペプチドドメインまたはＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントを含む
融合タンパク質を生成する方法であって、以下の工程：
（ａ）項目２１に記載のタバコモザイクウイルスを用いてタバコ植物を感染させてこれ
によって該タバコモザイクウイルスを複製させる工程と；
（ｂ）該複製されたタバコモザイクウイルスを収集する工程と、
を包含する、方法。
（項目２８）
前記収集された植物ウイルスから前記融合タンパク質を単離する工程をさらに包含する、
項目２７に記載の方法。
（項目２９）
項目２６に記載の方法によって生成される、融合タンパク質。
（項目３０）
項目２７に記載の方法によって生成される、融合タンパク質。
（項目３１）
項目１に記載の融合タンパク質を含む、ワクチン組成物。
（項目３２）
アジュバントをさらに含む、項目３１に記載のワクチン組成物。
（項目３３）
動物における抗ＧＤＦ８免疫応答を惹起する方法であって、項目３１に記載のワクチン
組成物の有効量を該動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目３４）
動物においてＧＤＦ８活性を下方制御する方法であって、項目３１に記載のワクチン組
成物の有効量を用いて該動物を免疫する工程を包含する、方法。
本発明の１実施形態では、本発明の融合タンパク質は、下に列挙される天然のヒト前駆
体ＧＤＦ８（配列番号１）のほぼ３２７残基〜ほぼ３４６残基を含むＧＤＦ８ペプチドド
メインを含む。
Figure 2011024590
別の実施形態では、このＧＤＦ８ペプチドドメインは、ほぼ３２７残基〜ほぼ３３８残
基を含み、そして好ましくは、天然のヒト前駆体ＧＤＦ８のほぼ３２９残基〜ほぼ３３２
残基を含む。ＤＪ５（２０マー）ＧＤＦ８ペプチドドメインは下に、１文字コードおよび
３文字コードの両方で図示されており、読み取りの簡便性のために、配列番号１の前駆体
ＧＤＦ８に基づく残基番号付けを伴う（その内容が全体が参照によって本明細書に援用さ
れる、２００４年１２月２１日出願の米国特許出願第１１／０１９，００１号を参照のこ
と）。
Figure 2011024590
必要に応じて、本発明の融合タンパク質で使用されるＧＤＦ８ペプチドドメインは、保
存的な単一のアミノ酸置換を含む。単なる例として、これらは、このペプチド内の少なく
とも５つのアミノ酸位置のうちの１つに由来してもよい。詳細には、必要に応じて、少な
くとも１つの保存的アミノ酸置換が、例えば、ＧＤＦ８の残基３２７〜３４６に存在する
。別の選択肢では、ＧＤＦ８ペプチドドメインは、ＧＤＦ８ペプチドドメイン内の５つ以
下のアミノ酸位置で保存的アミノ酸置換を含む。別の実施形態では、ＧＤＦ８の残基３２
７〜３４６の間に例えば２つの保存的アミノ酸置換が存在する。さらに別の実施形態では
、ＧＤＦ８の残基３２７〜３４６の間に例えば、３つの保存的アミノ酸置換が存在する。
なおさらに別の実施形態では、ＧＤＦ８の残基３２７〜３４６の間に例えば、４つの保存
的アミノ酸置換が存在する。
好ましくは、このアミノ酸残基置換は、図２の種間アラインメントのアミノ酸のバリエ
ーションによって記される天然のヒト前駆体ＧＤＦ８（配列番号１）に対して、１つ以上
の位置である。これらは、残基３２８、３２９、３３１、３３３およびならびにそれらの
組み合わせであって、ここで
（ａ）アミノ酸残基３２８がＨｉｓ、ＬｅｕまたはＡｓｎであり；
（ｂ）アミノ酸残基３２９がＧｌｎまたはＬｙｓであり；
（ｃ）アミノ酸残基３３１がＡｓｎまたはＳｅｒであり；
（ｄ）アミノ酸残基３３３がＡｒｇまたはＬｙｓであり；そして／または
（ｅ）アミノ酸残基３３５がＳｅｒ、ＰｒｏまたはＴｈｒである。
好ましくは、この置換されたＧＤＦ８ペプチドドメインは、ラットモノクローナル抗体
ＭＡＢ７８８（Ｒ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に
結合する。
従って、本発明は、ＧＤＦ８ペプチドドメインを含む融合タンパク質を提供し、ここで
このＧＤＦ８ペプチドドメインは、配列番号１のアミノ酸残基３２７〜３４６、またはＧ
ＤＦ８ペプチドの抗原性フラグメントを含む。この抗原性フラグメントは、例えば、配列
番号１の残基３２７〜３３８、および／または配列番号１の残基３２９〜３３２を含んで
もよい。ＧＤＦ８ペプチドドメインは好ましくは、ウイルスコートタンパク質、またはそ
のフラグメントを含むポリペプチドに融合される。
１実施形態では、本明細書において記載されるような「ウイルスコートタンパク質（ｖ
ｉｒｕｓ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）」すなわちＶＣＰは、本発明の融合タンパク質の
一部である場合、天然の（非融合）ＶＣＰで見出されるアミノ酸残基の全てを含む。選択
的な別の実施形態では、この「ウイルスコートタンパク質（ｖｉｒｕｓ ｃｏａｔ ｐｒ
ｏｔｅｉｎ）」という用語はまた、ＧＤＦ８ペプチドドメインに対する結合から生じる、
そして／または天然のＶＣＰの配列内のＧＤＦ８ペプチドドメインの挿入（例えば、Ｎ末
端および／またはＣ末端およびまたはその間のいずれかの挿入）から生じる天然のＶＣＰ
のフラグメント（単数または複数）、ならびに／あるいはＧＤＦ８ペプチドドメインの挿
入または融合を操作する結果としてＶＣＰタンパク質からの１つ以上のアミノ酸残基の欠
失から生じるフラグメントを包含する。従って、融合タンパク質の一部としてのＶＣＰ「
フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、天然のＶＣＰに対して１〜約１０残基を必要
に応じて欠失しているか、そして／またはＧＤＦ８ペプチドドメインの挿入によって２つ
以上のドメインに分けられているＶＣＰである。
任意の適切なウイルスが、植物ウイルスのような融合パートナーとして使用され得る。
好ましい植物ウイルスは、例えば、トバモウイルスである。トバモウイルス株としては、
例えば、タバコモザイクウイルス（「ＴＭＶ」）型の株（Ｕ１）、タバコ・マイルド・グ
リーン・モザイクウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ ｍｉｌｄ ｇｒｅｅｎ ｍｏｓａｉｃ ｖ
ｉｒｕｓ）（Ｕ５）、トマトモザイクウイルス、オドントグロッサム・リングスポット（
Ｏｄｏｎｔｏｇｌｏｓｓｕｍ ｒｉｎｇｓｐｏｔ）ウイルス、リブグラス（ｒｉｂｇｒａ
ｓｓ）モザイクウイルス、サンヘンプ（Ｓｕｎｎ−ｈｅｍｐ）モザイクウイルスおよび／
またはキュウリ緑斑モザイクウイルスを挙げることができる。
この融合タンパク質は好ましくは、２０マーのＧＤＦ８ペプチドドメインを有する、配
列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１に従う、および
／または１２マーのＧＤＦ８ペプチドドメインを有する、配列番号５４もしくは配列番号
５５に従う、本明細書において以前に例示されたポリペプチドの群から選択される。
この融合タンパク質は一般には、以下の形態である：
（ａ）一本鎖のプラス−センス植物ＲＮＡウイルス由来の植物ウイルスコートタンパク質
；
（ｂ）このウイルスコートタンパク質に融合されたＧＤＦ８ペプチドドメインであって、
以下の位置：
（ｉ）このウイルスコートタンパク質のＮ末端
（ｉｉ）このコートタンパク質のＣ末端
（ｉｉｉ）このコートタンパク質のＣ末端由来の４つのアミノ酸、
（ｉｖ）該コートタンパク質の外部に露出されたループ領域内；
のうちの１つから選択される位置で融合されたＧＤＦペプチドドメイン；
、ここでこの融合タンパク質は、アジュバントがあっても無くても、ＧＤＦ８に対する免
疫応答を惹起する。
好ましくは、この融合タンパク質は、抗ＧＤＦ８抗体の特定の中和エピトープ、例えば
、ラット抗ＧＤＦ８モノクローナル抗体７８８および／またはヤギ抗ＧＤＦ８ポリクロー
ナル抗血清のＩｇＧ画分を含む。
さらに好ましくは、本発明の融合タンパク質は、アジュバントがあっても無くても、脊
椎動物の免疫系に提示される場合、ＧＤＦ８に対する免疫応答を惹起する。
本発明はまた、例えば、本発明の融合タンパク質をコードする複製可能なベクター、例
えば、配列番号２のヌクレオチド１１１２〜ヌクレオチド１１７１を含む核酸分子の形態
で、核酸分子を提供する。
本発明による複製可能なベクターは必要に応じて、プラスミド、ファージ、コスミド、
および／またはウイルスである。植物ウイルス、例えば、トバモウイルスが好ましい。さ
らに好ましくは、複製可能なベクターは、Ｕ１株またはＵ５株由来のＴＭＶである。ＧＤ
Ｆ８ペプチドドメインを発現する、操作されたキメラＴＭＶは、本明細書において、ＴＭ
Ｖ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ３、ＴＭＶ−ＦＶ４、ＴＭＶ−ＦＶ５、ＴＭ
Ｖ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７として例示される。宿主の細胞および植物、例えば、複
製可能なベクターを発現するＮｉｃｏｔｉａｎａ植物も本発明によって提供される。
本発明はさらに、融合タンパク質を発現するＴＭＶウイルスのような、本発明の融合タ
ンパク質および／または上記の複製可能な発現ベクターを例えば含む、ワクチン組成物を
提供する。必要に応じて、当該分野で公知のアジュバントも、本発明のワクチン組成物に
含まれる。
本発明はまた、多数の有用な方法およびプロセスを提供する。例えば、本発明は、本発
明の融合タンパク質を生成する方法を提供し、この方法は、上記の複製可能な発現ベクタ
ーを含む宿主の植物または植物細胞を培養する工程、コードされた融合タンパク質を発現
する工程、およびこの融合タンパク質を回収する工程を包含する。
好ましくは、本発明の融合タンパク質を生成する方法は、ＧＤＦ８ペプチドドメインを
含む融合タンパク質を発現する組み換えウイルスを用いて、例えば、例示されるＴＭＶ−
ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ３、ＴＭＶ−ＦＶ４、ＴＭＶ−ＦＶ５、ＴＭＶ−
ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７のウイルスのうちの１つ以上を用いて、宿主植物を感染させ
る工程と、次いでこの複製されたウイルスを回収して精製する工程とを包含する。必要に
応じてこの融合タンパク質はさらに、ＴＭＶゲノムＲＮＡから融合コートタンパク質を分
離することによって、精製された組み換えＴＭＶから単離される。
さらなる提供された方法は、動物において抗ＧＤＦ８免疫応答を惹起する方法を包含し
、これには、本発明のワクチン組成物の有効量をこの動物に投与する工程を包含する。
最も好ましくは、本発明は、本発明のワクチン組成物の有効量を用いて動物を免疫する
工程を含む、動物においてＧＤＦ８活性を下方制御する方法を提供する。
図１は、前駆体ＧＤＦ８配列の残基２６６〜３７５由来である、ＧＤＦ８活性領域（すなわち、成熟ＧＤＦ８）における、重複するペプチドＤＪ１〜ＤＪ７を図示する。 図２は、引用されたさらなる動物種の前駆体ＧＤＦ８タンパク質に位置されるような、アナログの２０残基のペプチドに比較したヒトＤＪ５ペプチド配列（配列番号８）のアラインメントを図示する。３２１〜３４７のアミノ酸残基位置は、ヒト前駆体ＧＤＦ８に基づく。Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号（本発明において参照によって援用される）は、各々の個々の種の公開されたタンパク質配列全体を特定する。整列されたペプチドは以下の配列番号を有する。
Figure 2011024590
図３は、トバモウイルスの遺伝子組織化および遺伝子発現ストラテジーを概説する。トバモウイルスは、約６．４ｋｂのゲノムＲＮＡを有する。ゲノムＲＮＡは、ｍＲＮＡとして用いられて、レプリカーゼタンパク質を生成するように翻訳される。ＴＭＶは、２つのレプリカーゼタンパク質を生成し、ここでより大きいタンパク質（１８３ｋＤａ）は、アンバー（ＵＡＧ）停止コドンの翻訳リードスルーによって生成される。全てのトバモウイルスは、２つのより小さいコターミナル（ｃｏｔｅｒｍｉｎａｌ）サブゲノム（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ）ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を産生する。このコートタンパク質は、最も３’側のｓｇＲＮＡ（１７ｋＤａ）によってコードされ、そしてより大きい（３０ｋＤａ）のｓｇＲＮＡによる移動タンパク質である。ビリオンＲＮＡおよびｓｇＲＮＡはキャッピングされる。トバモウイルスＲＮＡは、ポリアデニル化されないが、３’末端にｔＲＮＡ様構造を含む。 図４は、ＴＭＶのゲノム構造ならびにＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓの構築物および有用性を図示する。（１）は、ＴＭＶゲノムのｃＤＮＡコピー、ならびに、それぞれ移動タンパク質（ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＰ）およびコートタンパク質（ＣＰ）をコードするサブゲノムメッセンジャーＲＮＡの発現を駆動する２つのサブゲノムのプロモーターの位置（曲がった矢印）を示す。レプリカーゼタンパク質は、ゲノムＲＮＡから翻訳される。ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）ベクター（３）は、さらなるサブゲノムのＲＮＡプロモーターおよび外来遺伝子（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）配列によって図示される）の挿入のためのマルチクローニング部位の挿入（２）によって構築される。 図５は、ＤＪ５エピトープのコートタンパク質融合物の生成に使用された５つのアクセプターベクター（ｐＬＳＢ２２６８、ｐＬＳＢ２２６９、ｐＬＳＢ２１０９、ｐＬＳＢ２１１０およびｐＬＳＢ１８０６）を図示する。５つのベクター全てが同じベースのベクター（ｐＢＴＩ２１５０）由来であった。コートタンパク質を囲む領域はまた、さらに詳細に示すために拡大されている。略号：Ｕ１およびＵ５は、ウイルスのコートタンパク質が、それぞれＴＭＶのＵ１およびＵ５株由来であったことを示す。 図６Ａは、ＴＭＶのＵ１およびＴＭＶのＵ５というコートタンパク質株へＤＪ５エピトープをクローニングするために使用されたオリゴヌクレオチド対の全般的な設計を図示する。注：ｎ１ｎ２ｎ３などは、フォワードオリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチドに相当し、そしてリバースオリゴヌクレオチドにおけるｎ−１ｎ−２ｎ−３などは、フォワードヌクレオチドのリバースの相補体である。フォワード鎖およびリバース鎖を開示している。 図６Ｂは、ＴＭＶのＵ１コートタンパク質（配列番号５６）、ＴＭＶのＵ５コートタンパク質（配列番号５７）およびＧＤＦ８由来のＤＪ５ペプチドの末端の１２アミノ酸（配列番号４４）についてのアミノ酸配列アラインメントを図示する。 図６Ｃは、ＴＭＶのＵ１コートタンパク質の線図を図示しており、これには表面露出したＮ末端およびＣ末端領域と、ＱＡＮＰ（配列番号５８）残基とを一緒にして、強調している。「ＶＩＳ」は、ウイルス内部表面を示しており、そして「ＶＯＳ」はウイルスの外側表面を示す。 図７は、ＤＪ５領域におけるＧＤＦ８アミノ酸配列（配列番号１の残基３１９〜３４６）を図示しており、そしてＤＪ５（２０）、ＤＪ５（１２）、ＤＪ５（８）、ＳＰ２およびＤＪ４エピトープが示される。「Ｎ ｔｅｒｍ」とは、配列のＮ末端を記しており；「Ｃ ｔｅｒｍ」は、Ｃ末端を記す。 図８Ａおよび図８Ｂは一緒に、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍのコドン利用を図示する。このコドン利用の表が、２０アミノ酸のＤＪ５ペプチド（配列番号４５および配列番号４６）および１２アミノ酸のＤＪ５ペプチド（配列番号５２および配列番号５３）のコートタンパク質融合物の生成のためのコドン最適化オリゴヌクレオチドの作成に使用された。各々のアミノ酸に使用したコドンに下線を引く。 図８Ａおよび図８Ｂは一緒に、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍのコドン利用を図示する。このコドン利用の表が、２０アミノ酸のＤＪ５ペプチド（配列番号４５および配列番号４６）および１２アミノ酸のＤＪ５ペプチド（配列番号５２および配列番号５３）のコートタンパク質融合物の生成のためのコドン最適化オリゴヌクレオチドの作成に使用された。各々のアミノ酸に使用したコドンに下線を引く。 図９Ａおよび図９Ｂはいっしょに、ＧＤＦ８プロホルモン（配列番号１）をコードする天然のＤＮＡ配列（配列番号２）を図示する。このＤＮＡは、当該分野で周知であるが、本明細書においては単に簡便のために提供する。 図９Ａおよび図９Ｂはいっしょに、ＧＤＦ８プロホルモン（配列番号１）をコードする天然のＤＮＡ配列（配列番号２）を図示する。このＤＮＡは、当該分野で周知であるが、本明細書においては単に簡便のために提供する。 図１０は、酵母の好ましいコドンを用いて配列番号１を逆翻訳することによって得られる、実施例１によって例示されるコドン最適化ＤＮＡ配列（配列番号３）を図示する。
発明の詳細な説明
従って、本発明は、植物ウイルスＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質を提供する。これら
のＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質は、動物において抗ＧＤＦ８免疫応答を惹起するため
、例えば、ＧＤＦ８を下方制御するかおよび／または筋肉量の増大を促進するための免疫
原として、そして／あるいはＧＤＦ８に対するＧＤＦ８または抗体の結合の検出の方法の
ための試薬として、直接働き得る。これらのＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質はまた、融
合タンパク質のＶＣＰ部分を実質的に含まない形態で、発現されたＧＤＦ８エピトープの
容易な切断および回収を可能にするように操作され得る。ＧＤＦ８エピトープは一般に、
本明細書においてＧＤＦ８ペプチドまたはペプチドフラグメントと呼ばれる。これらのＧ
ＤＦ８ペプチドの有用性としては、動物における抗ＧＤＦ８免疫応答を惹起するための免
疫原としての使用、およびＧＤＦ８関連アッセイにおける高度に特異的な抗体結合標的と
しての使用が挙げられる。本発明はまた、ウイルス粒子、すなわち、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融
合タンパク質を含む、ビリオン、および同じものを含む植物細胞を提供する。コレラは必
要に応じて、供給源として使用され、これからＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質が精製さ
れるか、または免疫原として直接使用され得る。
好ましくは、植物ウイルスは、トバモウイルス群の種である。トバモウイルス種として
は、例えば、タバコモザイクウイルス（Ｕ１株型）、キュウリ緑斑モザイウウイルス（Ｓ
Ｈ株）、フランジパニモザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクウイルス（ｋｙｕｒｉ
ｇｒｅｅｎ ｍｏｔｔｌｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、オドントグロッサム・リング
スポットウイルス（Ｏｄｏｎｔｏｇｌｏｓｓｕｍ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ）、パ
プリカ・マイルド・モットル（ｐａｐｒｉｋａ ｍｉｌｄ ｍｏｔｔｌｅ）ウイルス、ペ
ッパー・マイルド・モットル（ｐｅｐｐｅｒ ｍｉｌｄ ｍｏｔｔｌｅ）ウイルス（Ｓ株
）、リブグラス（ｒｉｂｇｒａｓｓ）モザイクウイルス、サーモンズ・オプンチア（Ｓａ
ｍｍｏｎｓ’ Ｏｐｕｎｔｉａ）ウイルス、サンヘンプ（Ｓｕｎｎ−ｈｅｍｐ）モザイク
ウイルス、タバコ・マイルド・グリーン・モザイク（ｔｏｂａｃｃｏ ｍｉｌｄ ｇｒｅ
ｅｎ ｍｏｓａｉｃ）ウイルス（Ｕ５）、タバコモザイクウイルス（Ｖｕｌｇａｒｅ株；
ｓｓｐ．ＮＣ８２株）、トマトモザイクウイルスおよびＵｌｌｕｃｕｓマイルド・モット
ルウイルスが挙げられる。本明細書に例示されるトバモウイルスは、タバコモザイクウイ
ルスＵ１およびタバコ・マイルド・グリーン・モザイクウイルスＵ５であって、そうでな
ければ、それぞれＴＭＶのＵ１およびＴＭＶのＵ５と呼ばれる。
ＧＤＦ８の特定の結合エピトープは、抗ＧＤＦ８抗血清と、重複するＧＤＦ８ペプチド
の集団とを接触すること、およびペプチドと抗血清ＩｇＧ抗体との間の結合活性の程度を
決定することによって最初に同定された。この抗ＧＤＦ８抗血清は、発現および抗原性の
ために最適化された構造を有する、前駆体ＧＤＦ８タンパク質で免疫されたヤギから得ら
れた。
本発明をさらに完全に評価するために、以下の定義が提供される。説明の簡便性のため
の単数の用語の使用は、決してそれに限定されるものではない。従って、例えば、「ポリ
ペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」を含む組成物についての言及は、このようなポリ
ペプチドの１つ以上についての言及を包含する。
本明細書において用いる場合、「約、ほぼ、およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」
という用語は、「約、ほぼ、およそ（ａｂｏｕｔ）」という用語と交換可能に用いられ、
そしてある値が示された値の２０％内であることを意味し、すなわち、「約、ほぼ、およ
そ」５０個のアミノ酸残基を含むペプチドは、４０〜６０個のアミノ酸残基を含んでもよ
い。
本発明は、本明細書に開示される特定の構成、工程段階、および物質には限定されず、
従ってこのような構成、工程段階および物質はある程度変化してもよいことも理解される
べきである。本明細書に使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のために用い
られるだけであって、限定されるものではないことも理解されるべきである。なぜなら本
発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ限定されるからであ
る。
本明細書において用いる場合、「ポリペプチド」という用語は、「タンパク質」という
用語と交換可能に用いられ、そしてペプチド結合によって接続される２つ以上のアミノ酸
を含むポリマーを意味する。好ましくは、本明細書において他に言及しない限り、ポリペ
プチドという用語は、サイズまたは鎖の長さによって、本明細書において使用されるよう
な「ペプチド」という用語とは区別され、ここで「ペプチド」とは、約５０またはそれよ
り少ないアミノ酸のポリマー鎖を指し、そしてポリペプチドまたはタンパク質は、他に特
定されない限り、約５０個を超えるアミノ酸を含むポリマー鎖をいう。必要に応じて、ペ
プチドまたはポリペプチドは、遺伝子によってまたはｍＲＮＡによってコードされる特定
のアミノ酸残基を欠いてもよい。例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ分子は、最終のタンパク
質から切断され、従って最終のタンパク質の一部ではなくてもよい、ポリペプチドのＮ末
端上のアミノ酸残基の配列（すなわち、シグナル配列）をコードし得る。
本発明に従う、融合タンパク質の「ＧＤＦ８ペプチドドメイン（ＧＤＦ８ ｐｅｐｔｉ
ｄｅ ｄｏｍａｉｎ）」を含む「ＧＤＦ８ペプチド（ＧＤＦ８ ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、
ＧＤＦ８タンパク質由来の比較的短いフラグメント、例えば、本明細書において同定され
たＤＪ５の２０マーである。この用語は必要に応じて、これらのペプチドまたはペプチド
ドメインのそれよりさらに小さいフラグメントさえ、例えば、本明細書においてやはり同
定される１２マーおよび４マーのドメインさえ含み、そしてこれはまた必要に応じて、本
明細書に記載のアミノ酸置換を含む。ＧＤＦ８ペプチドまたはペプチドドメインの最大サ
イズを限定することは意図しないが、ペプチドドメインのサイズは、約４〜約５０残基に
およぶことが好ましく、より好ましくは、これは約４〜約２０残基のサイズにおよび、そ
して必要に応じて、本発明によるＧＤＦ８ペプチドドメインは、約８〜約１２残基のサイ
ズにおよぶ。１つの特定の実施形態では、ペプチドドメインのサイズは、約５〜約１６の
アミノ酸残基におよぶ。
本明細書において用いる場合、「抗原性フラグメント（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｆｒａｇ
ｍｅｎｔ）」という用語とは、特定のタンパク質および／またはペプチドに関して、抗原
性であるタンパク質／ペプチドのフラグメントである。例えば、ＧＤＦ８ペプチドドメイ
ンの抗原性フラグメントとは、抗原性であるＧＤＦ８ペプチドドメインのフラグメントで
ある。本明細書において用いる場合、ＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントは
、全長ペプチドから単一のアミノ酸程度の小さいアミノ酸を欠失しているＧＤＦ８ペプチ
ドドメインの任意のフラグメントであってもよい。特定の実施形態では、ＧＤＦ８ペプチ
ドドメインの抗原性フラグメントは、約３〜約２０個のアミノ酸残基を含む。特定の実施
形態では、ＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントは、約４〜約１６個のアミノ
酸を含む。特定の実施形態では、ＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントは、約
８〜約１２個のアミノ酸を含む。別の特定の実施形態では、ＧＤＦ８ペプチドドメインの
抗原性フラグメントは、約８〜約１２個のアミノ酸を含む。所定のＧＤＦ８ペプチドドメ
インの抗原性フラグメントは、ＧＤＦ８ペプチドドメイン自体として、組み換え供給源か
ら、天然の供給源から単離されたタンパク質から、および／または化学的／ペプチド合成
を通じて得られてもよい。従って、抗原性フラグメントは、例えば、（ｉ）天然に存在す
るＧＤＦ８もしくはそのペプチドフラグメントのタンパク質分解性消化後、（ｉｉ）組み
換えＧＤＦ８もしくはそのペプチドフラグメントのタンパク質分解性消化後、（ｉｉｉ）
それ自体として、もしくは融合タンパク質としてのいずれかによるその組み換え発現を直
接通じて、得られてもよく、そして／または（ｉｖ）例えばペプチド合成を通じて新規に
生成されてもよい。
別の特定の実施形態では、ＧＤＦ８ペプチドは、ＧＤＦ８の天然に存在するヒト前駆体
（配列番号１）の残基番号３２７〜３４６（配列番号８）によって規定されるペプチドに
対して約５０％の類似性（好ましくは同一性）〜１００％の類似性におよぶ、ある程度の
類似性（そして好ましくは同一性の程度）を有するペプチドドメインを含む。
本明細書において使用される場合、「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」または「単離
された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は、無関係の物質、すなわち、混入物または不
純物であって、その物質が由来する天然の物質を含む物質の存在を減少させるかまたは排
除する条件下で分けられた物質をいう。例えば、精製されるかまたは単離されたタンパク
質は好ましくは、細胞内で見出され得る他のタンパク質または核酸を含まない。精製され
た物質は、もともと関連する細胞成分のうち約２５％未満、好ましくは約５０％未満、さ
らに好ましくは約７５％未満、そして最も好ましくは約９０％未満を含んでもよい。純度
は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成物分析、生物学的アッセ
イおよび当該分野で公知の他の方法によって評価され得る。機能的な局面から、本発明に
よる単離されたＧＤＦ８ペプチドは、ＧＤＦ８ペプチドに特異的である免疫応答を惹起し
得るために、前駆体ＧＤＦ８タンパク質および／または成熟ＧＤＦ８タンパク質を含む他
の物質から実質的に分離されているＧＤＦ８ペプチドであってもよい。
精製のための方法は当該分野で周知である。例えば、核酸は、沈降、クロマトグラフィ
ー、超遠心および他の方法によって精製され得る。タンパク質およびポリペプチド、なら
びにペプチドは、限定はしないが、分取ディスク−ゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＨＰ
ＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換および分配クロマトグラフィー、沈降および
塩析クロマトグラフィー、抽出および向流分配を含む種々の方法によって精製され得る。
いくつかの目的のために、組み換え系においてポリペプチドを生成することが好ましく、
ここでは、限定はしないがポリヒスチジン配列、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＧＳＴおよび／
または抗体に対して特異的に結合する配列のような、精製を容易にするさらなる配列タグ
を、タンパク質が含む。次いで、このポリペプチドは、適切な固相マトリックス上のクロ
マトグラフィーによって宿主細胞の粗溶解物から精製され得る。あるいは、ポリペプチド
に対して生成される、抗体またはその結合フラグメントは、精製試薬として用いられ得る
。
「実質的に純粋な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ）」という用語は、当該分
野で公知の従来の精製技術を用いて達成され得る最高程度の純度を示しており、そしても
ともとの供給源の生物体または組み換えＤＮＡ発現系由来の他の混入するタンパク質、核
酸および他の生物学的物質を含まない、核酸、ポリペプチド、ペプチドまたは他の物質を
意味する。実質的な純度は、標準的な方法によってアッセイされてもよく、そして代表的
には、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも
約９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９９％の純度を超える。純度の評価は、質
量およびモルに基づいて行われてもよい。
「ポリヌクレオチド」または「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌ
ｅ）」とは、限定はしないが、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびさらに合成ＤＮＡ
配列さえ含むヌクレオチドを含む分子である。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの任
意の当該分野で公知のベースのアナログを含む核酸分子を包含するものとする。
「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」または「複製ベクター（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｖｅ
ｃｔｏｒ）」はレプリコン、例えば、プラスミド、ファージまたはコスミドであって、こ
れに対して、付着されたセグメントの複製をもたらすように別の核酸セグメントが結合さ
れてもよく、または組み込まれてもよい。この用語はまた、組み込まれるかまたは結合さ
れた目的の核酸セグメントを含むレプリコンを含む。
本発明において用いられ得るベクターとしては、微生物プラスミド、ウイルス、バクテ
リオファージ、組み込み可能なＤＮＡフラグメントおよび、宿主のゲノムへの核酸の組み
込みを容易にし得る他のビヒクルが挙げられる。プラスミドはベクターの最も一般に用い
られる形態であるが、等価な機能を果たし、そして当該分野で公知となるベクターの全て
の他の形態が、本明細書における使用のために適切である。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，１９８５、ならびに補遺、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ
ｅｔ ａｌ．（編），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔ
ｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡを参照のこと。
本発明のＧＤＦ８ペプチド（単数または複数）をコードするＤＮＡのベクターへの挿入
は、このＤＮＡおよびベクターの両方の末端が適合する制限部位を有する場合には容易に
達成される。これを行うことができない場合、制限エンドヌクレアーゼ切断によって生成
される一本鎖ＤＮＡオーバーハングに戻って消化することによってＤＮＡおよび／または
ベクターの末端を改変して、平滑末端を生成するか、あるいは適切なＤＮＡポリメラーゼ
で一本鎖末端を充填することによって同じ結果を得る必要があるかもしれない。あるいは
、所望の部位は、例えば、ヌクレオチド配列（リンカー）を末端に連結することによって
、生成されてもよい。このようなリンカーは、所望の制限部位を規定する特定のオリゴヌ
クレオチド配列を含んでもよい。制限部位はまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使
用を通じて生成され得る。例えば、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２３９：４８７を参照のこと。切断されたベクターおよびＤＮＡフラグメントはまた
、必要に応じて、ホモポリマーのテーリングによって改変され得る。
本発明において用いられる組み換え発現ベクターは代表的には、適合する宿主細胞中で
核酸の発現を調節し得る適切な遺伝子制御エレメントに通常作動可能に連結された、本発
明のＧＤＦペプチド（単数または複数）の１つをコードする核酸を含む自己複製するＤＮ
ＡまたはＲＮＡ構築物である。遺伝子制御エレメントとしては、原核生物プロモーター系
または真核生物プロモーター発現制御系を含んでもよく、そして代表的には、転写プロモ
ーター、転写の発現を制御する選択的プロモーター、ｍＲＮＡ発現のレベルを上昇させる
転写エンハンサー、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻
訳を終結させる配列が挙げられる。発現ベクターはまた、ベクターが宿主細胞と独立して
複製することを可能にする複製起点を含んでもよい。
本発明のＧＤＦ８ペプチド（単数または複数）をコードする核酸の発現は、原核生物細
胞または真核生物細胞のいずれかにおいて従来の方法によって行われ得る。
核酸「コード配列（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または特定のタンパク質もし
くはペプチドを「コードする配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」とは、適切
な調節性エレメントの制御下においた場合、インビトロまたはインビボでポリペプチドに
転写および／または翻訳される核酸配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。コード
配列の境界は、５’末端の開始コドンおよび３’末端の終止コドンによって決定される。
コード配列としては、限定はしないが、ＲＮＡウイルス配列、原核生物配列、原核生物ｍ
ＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、
およびさらに合成のＤＮＡ配列さえ挙げることができる。転写終止配列は通常、コード配
列に対して３’に位置する。
本明細書において用いる場合、「融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）」
および「融合ペプチド（ｆｕｓｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、交換可能に用
いられて、「キメラタンパク質および／またはキメラペプチド（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ／ｏｒ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」および融合「タ
ンパク質／ペプチド（ｉｎｔｅｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ／ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」を包含す
る。融合タンパク質は、別のタンパク質の少なくとも一部に結合されたペプチドを介して
連結された本発明のＧＤＦ８ペプチドの少なくとも一部を含む。例えば、融合タンパク質
は、マーカータンパク質もしくはペプチド、あるいは本発明のＧＤＦ８ペプチドの単離お
よび／または精製および／または抗原性を補助するタンパク質もしくはペプチドを含んで
もよい。ＧＤＦ８融合タンパク質は、ＧＤＦ８ポリペプチドの少なくとも一部に結合され
たペプチドを介して結合された非ＧＤＦ８タンパク質の少なくとも一部を含み得る。好ま
しい実施形態では、ＧＤＦ８の一部は機能的であって、すなわち、その抗原性を保持する
。非ＧＤＦ８配列は、ＧＤＦ８配列に対してアミノ末端であっても、および／またはカル
ボキシ末端であってもよい。これはまた、ＤＪ５ペプチドドメインがキャリアポリペプチ
ド内に挿入される、ループ融合物を必要に応じて含むと考えられる。
このような融合タンパク質をコードする組み換え核酸分子は、ＧＤＦ８コード配列に対
してインフレームで結合された非ＧＤＦ８タンパク質の少なくとも一部をコードする配列
を含み、そして特定のプロテアーゼ、例えば、トロンビンまたは第Ｘａ因子の切断部位を
、好ましくは、ＧＤＦ８配列と非ＧＤＦ８配列との間の接合部でまたはその近辺でコード
し得る、１つの特定の実施形態では、この融合タンパク質は、ＣＨＯ細胞中で発現される
。このような融合タンパク質は、ＧＤＦ８ペプチドに融合されたタンパク質および／また
はタグに特異的であるアフィニティーカラムの使用を通じて、本発明のＧＤＦ８ペプチド
を単離するために用いられ得る。例えば、精製されたＧＤＦ８ペプチドは、次に、上記さ
れているような、タンパク質分解性酵素および切断部位の使用を通じて融合タンパク質か
ら遊離され得る。
別の実施形態では、キメラＧＤＦ８ペプチド、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフ
ェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質、マルトース結合（ＭＢＰ）タンパク質融合タンパク
質、またはポリ−ヒスチジン−タグ化融合タンパク質が、任意の細胞における、あるいは
無細胞系における発現のために、調製され得る。例えば、ＧＳＴは、固体支持体マトリッ
クスに結合体化されたグルタチオンを結合し、ＭＢＰは、マルトースマトリックスに結合
し、そしてポリ−ヒスチジンは、Ｎｉ−キレート化支持マトリックスに対してキレートす
る。この融合タンパク質は、適切な緩衝液を用いて、またはＧＤＦペプチドと下に例示さ
れるような融合パートナー（例えば、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＦＬＡＧ（登録商標））との間で
通常操作された切断部位に特異的なプロテアーゼ、もしくは上記のようなポリ−Ｈｉｓを
用いて処理することによって特定のマトリックスから溶出され得る。本発明の特定の融合
タンパク質としては、下に例示されたＴＭＶコートタンパク質−ＧＤＦ８ペプチドを含む
融合タンパク質が挙げられる。
本明細書において用いる場合、「異種ヌクレオチド配列（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、現実には通常には形成されない核酸を
形成するように組み換え方法によって、本発明のヌクレオチド配列に付加されるヌクレオ
チド配列である。このような核酸は、融合（例えば、キメラ）タンパク質をコードし得る
。したがって、この異種ヌクレオチド配列は、調節特性および／または構造特性を含むペ
プチドおよび／またはタンパク質をコードし得る。別のこのような実施形態では、異種ヌ
クレオチド配列は、組み換え核酸が発現された後に、本発明のヌクレオチド配列によって
コードされるタンパク質またはペプチドを検出する方法として機能するタンパク質または
ペプチドをコードし得る。さらに別の実施形態では、この異種ヌクレオチド配列は、本発
明のヌクレオチド配列を検出する方法として機能し得る。異種ヌクレオチド配列は、制限
部位、調節部位、プロモーターなどを含む非コード配列を含んでもよい。
「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」とは、一過性にまたは永続的にいずれかで、外因
性の核酸分子を含むか、または含んで、かつ発現し得る細胞である。外因性の核酸（ＤＮ
ＡまたなＲＮＡ）は、細胞のゲノムを作製する染色体ＤＮＡに組み込まれ（共有結合され
）てもよいし、または組み込まれなくてもよい。例えば、原核生物および酵母では、この
外因性の核酸は、エピソームのエレメント、例えばプラスミド上で維持されてもよい。真
核生物細胞に関しては、適切に形質転換された細胞は、１つであって、ここでは外因性の
核酸は、染色体に組み込まれて、その結果、染色体複製を通じて娘細胞によって遺伝され
る。この安定性は、真核生物細胞が、外因性核酸を含む娘細胞の集団からなる細胞株また
はクローンを樹立する能力によって実証される。本明細書において例示されるように、「
宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」は、組み換えトバモウイルスで感染される真核生物植
物細胞を包含する。例示的なトバモウイルスベクターは、ＴＭＶベクターであり、そして
感染したＮｉｃｏｔｉａｎａ植物、例えば、タバコ植物の細胞質においてのみ複製するこ
とが公知である。このＴＭＶベクターは、核には入らず、感染した植物細胞を安定に形質
転換することはない。
原核生物としては、グラム陰性およびグラム陽性の両方の生物体、例えば、Ｅ．ｃｏｌ
ｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓが挙げられる。それより高度な真核生物としては、下に例
示されるように、動物細胞、非哺乳動物由来、例えば昆虫細胞、および鳥類、ならびに哺
乳動物由来、例えば、ヒト、霊長類、およびげっ歯類の両方の動物細胞、または植物に由
来する、樹立された組織培養細胞株が挙げられる。
原核生物の宿主ベクター系としては、多くの異なる種についての広範な種々のベクター
が挙げられる。本明細書において用いる場合、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ「Ｅ．
ｃｏｌｉ」およびそのベクターとは、他の原核生物において用いられる等価なベクターを
含むとして一般に用いられる。ＤＮＡを増幅するための代表的なベクターは、ｐＢＲ３２
２またはその多くの誘導体である。ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ８ペプチドを発現する
ために用いられ得るベクターとしては、限定はしないが、ｌａｃプロモーター（ｐＵＣ−
シリーズ）；ｔｒｐプロモーター（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）；ｌｐｐプロモーター（ｐｌ
Ｎ−シリーズ）；λ−ｐＰまたはｐＲプロモーター（ｐＯＴＳ）；またはハイブリッドの
プロモーター、例えば、ｐｔａｃ（ｐＤＲ５４０）が挙げられる。Ｂｒｏｓｉｕｓ ｅｔ
ａｌ．，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｌａｍｂｄ
ａ−，ｔｒｐ−，ｌａｃ−，ａｎｄ ｌｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」，
ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ（編）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ
ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕ
ｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｐ．２０５〜２３６を
参照のこと。
酵母、およびより高度な真核生物組織培養細胞は、本発明のＧＤＦペプチドの、および
／または抗ＧＤＦ８抗体の、および／またはそれらの抗体のフラグメントの組み換え産生
のための宿主として用いられ得る。昆虫のバキュロウイルス発現系を含む、任意のより高
度な真核生物組織培養細胞株が用いられ得るが、哺乳動物細胞が好ましい。このような細
胞の形質転換またはトランスフェクションおよび増殖は、慣用的な手順になっている。有
用な細胞株の例としてはＨｅＬａ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株
、ラット胎児腎（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株、鳥類細胞株およびサル（ＣＯＳ）細胞株
が挙げられる。
このような細胞株のための発現ベクターは、例えば、複製起点、プロモーター、翻訳開
始部位、ＲＮＡスプライス部位（ゲノムＤＮＡが用いられる場合）、ポリアデニル化部位
、および転写終止部位を含む。これらのベクターはまた通常、選択遺伝子または増幅遺伝
子を含む。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス
、ワクシニアウイルス、またはサイトメガロウイルスのような供給源から誘導されたプロ
モーターを担持するプラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスであってもよい。適切な
発現ベクターの代表的な例としては、ｐＣＲ（登録商標）３．１、ｐＣＤＮＡ１、ｐＣＤ
［Ｏｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１１３
６］、ｐＭＣ１ｎｅｏ ＰｏＩｙ−Ａ ［Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅ
ｌｌ ５７：５０３］、ｐＵＣ１９、ｐＲＥＰ８、ｐＳＶＳＰＯＲＴおよびその誘導体、
ならびにバキュロウイルスベクター、例えば、ｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０が挙げら
れる。
代表的に用いられる原核生物発現制御配列としては、プロモーターが挙げられ、これに
は、βラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系由来のプロモーター［Ｃｈａｎｇ
ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｎａｔｕｒｅ，７９８：１０５６］、トリプトファン（ｔｒｐ
）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ，１９８０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．８：４０５７］、λＰＬプロモーター系［Ｓｈｉｍａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ
．，１９８１ ，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：１２８］およびｔａｃプロモーター［Ｄｅ Ｂ
ｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２
９２：１２８］（全て、参照によって本明細書に援用される）が挙げられる。このような
制御配列を含む多数の発現ベクターが、当該分野で公知であって、市販されている。
「作動可能に連結された（Ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、エレメントの配
置であって、そのように記載された成分が、その有用な機能を行うように構成されている
、エレメントの配置をいう。従って、コード配列に対して作動可能に連結された制御エレ
メントは、コード配列の発現を達成し得る。この制御エレメントは、それらがその発現を
指向するように機能する限り、コード配列と連続する必要はない。従って、例えば、介在
する非翻訳のまだ転写されていない配列が、プロモーターとコード配列との間に存在して
もよく、そしてこのプロモーターはそれでも、コード配列に対して「作動可能に連結され
た」とみなすことができる。
一般的なＧＤＦ８ベクターの設計
コードする核酸配列は好ましくは、できるだけ哺乳動物の核酸配列から相違するように
設計した。例えば、１実施形態では、前駆体ＧＤＦ８のアミノ酸配列は、酵母の好ましい
コドンを用いて逆翻訳された。得られた配列は、コドンについて調査して、これはヒトＧ
ＤＦ８核酸配列に対してその相同性を保持していた。可能性のあるこれらのコドンを、同
じアミノ酸をコードする次に最も好ましい酵母コドンで置換した。
得られた最適化遺伝子（配列番号３）は、例えば、当該分野で公知の昆虫、哺乳動物、
細菌、ウイルスおよび酵母発現系を含む、任意の適切な宿主系で発現され得る。例えば、
昆虫細胞発現系、例えば、バキュロウイルス系は、当該分野で公知であって、例えば、Ｓ
ｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載され
ている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、キットの形態で、とり
わけ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ．（「ＭａｘＢａｃ」キ
ット）から市販されている。同様に、細菌および哺乳動物の細胞発現系は、当該分野で周
知であって、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ Ｃ
ＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖ
ｏＩｓ．Ｉ ａｎｄ ＩＩ；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）によって記載される。酵母発現系
は当該分野で公知であって、例えば、ＹＥＡＳＴ ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩ
ＮＧ（Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ．，編、１９８９）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏ
ｎによって記載される。多くの他のこのような発現系が、当該分野で公知であって、キッ
トの形態で市販されている。
１つの好ましい実施形態では、改変された前駆体ＧＤＦ８遺伝子（配列番号３）は、下
の実施例１にさらに詳細に記載されるように、Ｆｌｐ−ｌｎ（商標）ＣＨＯ発現系（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で発現された。
さらに好ましくは、ＧＤＦ８ペプチドは、適切な植物ウイルスにおいて融合タンパク質
の一部として発現される。遺伝子的に変更された植物ウイルスは、ペプチド−キャリア融
合タンパク質をコードする遺伝子で植物をトランスフェクトするという効率的な方法を提
供する。例えば、ＴＭＶコートタンパク質融合物の考察は、Ｔｕｒｐｅｎ ｅｔ ａｌ．
，１９９９、米国特許第５，９７７，４３８号に提供される。また以下も参照のこと：そ
の全てが参照によって本明細書に援用される、Ｙｕｓｉｂｏｖ Ｖ．ｅｔ ａｌ．，１９
９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：５７８４〜５７８８；Ｍ
ｏｄｅｌｓｋａ，Ａ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９５：２４８１〜２４８５。
従って、本発明はまた、新規な組み換え植物ウイルスであって、上記で考察されるよう
に、植物ウイルスコートタンパク質（「ＶＣＰ」）およびＧＤＦ８ペプチドをコードする
、それらの遺伝物質のヌクレオチド配列を含む新規な組み換え植物ウイルスを提供する。
このコードされた融合タンパク質は、本明細書においてＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質
と記載される。組み換え植物ウイルスによって、感染された植物における融合タンパク質
の全身的な発現が可能になる。これによって、これらの組み換え植物ウイルスを使用する
ことによって、大量のＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質を生成してもよい。必要に応じて
、この融合タンパク質は、ＧＤＦ８ペプチドが融合タンパク質から容易に切断されて分離
されるように操作される。
ＧＤＦ８ペプチドがＶＣＰに結合（融合）されるＶＣＰにおける位置（単数または複数
）は、本明細書においては「融合ジョイント（ｆｕｓｉｏｎ ｊｏｉｎｔ）」と呼ばれる
。所定の融合タンパク質は、１つまたは２つの融合ジョイントを有してもよい。この融合
ジョイントは、ＶＣＰのＣ末端に位置してもよく、ここで目的のペプチドのＮ末端に融合
される。この融合ジョイントは、ＶＣＰのＮ末端に位置してもよく、ここでＧＤＦ８ペプ
チドのＣ末端に融合される。本発明の他の実施形態では、ＧＤＦ８ペプチドは、ＶＣＰの
内部に位置して；この場合、この融合タンパク質は２つの融合ジョイントを有する。これ
は、内部融合タンパク質と名付けられる。内部融合タンパク質は、ＧＤＦ８ペプチドによ
って「中断される（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）」植物ＶＣＰ全体またはそのフラグメント
を含んでもよい。
融合ジョイントは、コートタンパク質内の種々の部位に位置してもよい。そのペプチド
の全体は、ＶＣＰのＮ末端部分またはＣ末端部部分に存在してもよい。融合ジョイントに
適切な部位は、得られた内部融合タンパク質を所望の特性について試験する、慣用的な体
系的バリエーションを通じて決定され得る。融合ジョイントの適切な部位はまた、融合タ
ンパク質のＶＣＰ部分の構造的および生物学的機能を有意に妨害しないペプチドの「挿入
（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）」のための部位を決定するために、コートタンパク質の三次元構
造の検討によって決定されてもよい。植物ＶＣＰの詳細な三次元構造およびウイルス中で
のそれらの方向は、決定されており、そして当業者に公的に利用可能である。例えば、キ
ュウリ緑斑モザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｔｔｌｅ Ｍｏｓａ
ｉｃ Ｖｉｒｕｓ）のコートタンパク質（他のトバモウイルスのコートタンパク質に対し
て強力な構造的類似性を保有するコートタンパク質）およびウイルスの解像モデルは、Ｗ
ａｎｇおよびＳｔｕｂｂｓ，１９９４，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２３９：３７１〜３８４
に見出され得る。ＴＭＶの詳細な構造情報は、とりわけ、Ｎａｍｂａ ｅｔ ａｌ．，１
９８９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０８：３０７〜３２５ならびにＰａｔｔａｎａｙｏｋ
およびＳｔｕｂｂｓ，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２８：５１６〜５２８に見出
され得る。
植物ウイルス粒子の三次元構造およびウイルス粒子のアセンブリプロセスの知識によっ
て、当業者は、挿入および部分的な置換を含んで、本発明の種々のＧＤＦ８−ＶＣＰ融合
タンパク質を設計することが可能になる。例えば、ＧＤＦ８ペプチドが親水性である場合
、表面ループ領域として配向されることが公知であるＴＭＶコートタンパク質（ＴＭＶＣ
Ｐ）領域に対してペプチドを融合することが適切であり得る。同様に、サブユニット接触
を維持するらせん状セグメントは、ゲノムに向かって配向されたＴＭＶＣＰの領域中で発
現されるＴＭＶＣＰらせんまたは核酸結合ドメインの適切な領域と置換され得る。
ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、融合ジョイン
トで「リーキー（ｌｅａｋｙ）」終止コドンを含んでもよい。この終止コドンは、融合ジ
ョイントに直に隣接したコドンとして存在してもよいし、または融合ジョイントをコード
するコドンの近位（例えば、９塩基内）に位置してもよい。このようなリーキー終止コド
ンの目的は、野性型コートタンパク質に対して融合タンパク質の所望の比を維持すること
である。「リーキー」終止コドンは、常に翻訳終止をもたらすわけではなく、周期的に翻
訳される。所定の開始／終止コドンでの開始または終止の頻度は、状況次第である。リボ
ソームは、最初のＡＴＧコドンのｍＲＮＡの５’−末端からスキャンする。最適でない配
列状況である場合、リボソームは特定の頻度で、次の利用可能な開始コドンに通過して、
翻訳を最初の下流で開始する。同様に、翻訳の間に遭遇される最初の終止コドンは、それ
が特定の配列状態にある場合、常には機能しない。
結果として、多くの天然に存在するタンパク質は、異種のＮ末端および／またはＣ末端
伸長を有する集団として存在する。ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質をコードする組み換
えウイルスベクター中に、融合ジョイントコード領域でリーキー終止コドンを含むことに
よって、このベクターを用いて、より長い融合タンパク質および第二のより短いタンパク
質、例えば、ＶＣＰ自体の両方を生成することができる。リーキー終止コドンは、融合タ
ンパク質の融合ジョイントで、またはその近位で用いられ得、ここで目的のペプチド部分
は、コートタンパク質領域のＣ末端に接続されて、それによって単独の組み換えウイルス
ベクターでＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質およびＶＣＰの両方を生成し得る。さらに、
リーキー終止コドンを融合ジョイントでまたはその付近で用いて、同様の結果を得てもよ
い。ＴＭＶＣＰの場合、Ｎ末端およびＣ末端の伸長は、ウイルス粒子の表面に位置して、
らせん軸から離れて突出することが予想され得る。リーキー終止配列の例は、何年か前に
記載されたようにＴＭＶの１２６／１８３ｋＤａのリーディングフレームの接合部に存在
する［Ｐｅｌｈａｍ，Ｈ．Ｒ．Ｂ．，１９７８，Ｎａｔｕｒｅ ２７２：４６９〜４７１
．Ｓｋｕｚｅｓｋｉ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：
３６５〜３７３，ｄｅｆｉｎｅｄ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ３’ ｃｏｎｔｅｘｔ ｒｅｑ
ｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｒｅｇｉｏｎ ｔｏ ｃｏｎｆｅｒ ｌｅａｋｉ
ｎｅｓｓ ｏｆ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｎ ａ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒ
ｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ（ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）ａｓ
ＣＡＲ−ＹＹＡ（Ｒ＝ｐｕｒｉｎｅ；Ｙ＝ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）］。
本発明の別の実施形態では、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質上の融合ジョイントは、
プロテアーゼの基質であるアミノ酸配列を有することによって切断可能であるように設計
される。これによって、適切なタンパク質分解性酵素を用いてＧＤＦ８ペプチドの分離お
よび単離が可能になる。このタンパク質分解性酵素は、インビトロまたはインビボのいず
れで融合タンパク質と接触してもよい。
ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質の発現は、組み換え植物ウイルスベクターおよび宿主
植物の状況で機能的な任意の種々のプロモーターによって駆動され得る。好ましい実施形
態では、植物ウイルスのサブゲノムのプロモーターが用いられる（例えば、本明細書に参
照によって援用される、米国特許第５，３１６，９３１号を参照のこと）。
組み換え技術によって、多数の植物ＲＮＡウイルスのライフサイクルが、ウイルスゲノ
ムの操作を容易にするＤＮＡ段階を人工的に通じて伸長することが可能にされている。こ
れらの技術は、本発明の組み換え植物ウイルスを作成および使用するために、当業者によ
って適応され得る。ＴＭＶゲノムのｃＤＮＡ全体を、クローニングして、Ｅ．ｃｏｌｉの
プラスミドにおける細菌プロモーターに対して機能的に結合させた（Ｄａｗｓｏｎ，Ｗ．
Ｏ．ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：
１８３２〜１８３６）。感染性の組み換え植物ウイルスＲＮＡ転写物はまた、他の周知の
技術、例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６由来の市販のＲＮＡポリメラーゼを用いて生成さ
れてもよい。ビリオンＲＮＡの正確なレプリカは、ＲＮＡポリメラーゼおよびジヌクレオ
チドｃａｐ，ｍ７ＧｐｐｐＧを用いてインビトロで生成され得る。これによって、逆遺伝
学のウイルスゲノムの操作が可能になるだけでなく、外来遺伝子を発現するためのベクタ
ーへのウイルスの操作も可能になる。ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡフラグメントを操作
することに基づいて植物ＲＮＡウイルスベクターを生成する方法が記載されている（Ｐｅ
ｌｃｈｅｒ，Ｌ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，１９８２，欧州特許第６７５５３号Ａ２）。組み換
えＲＮＡ植物ウイルスを作成および使用する方法に対する詳細な情報は、とりわけ、参照
によって本明細書に援用される、米国特許第５，３１６，９３１号（Ｄｏｎｓｏｎら）に
おいて見出され得る。本発明は、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質の発現のための組み換
えＲＮＡ植物ベクターを含む核酸を提供する。本発明はまた、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タン
パク質をコードするベクターの一部（単数または複数）を含む核酸を提供する。本明細書
において参照によって援用される、米国特許第５，３１６，９３１号に記載されるベクタ
ーは、本発明の融合タンパク質を発現するために特に好ましい。
植物ＶＣＰ部分は、この発現ベクターのゲノムが由来する同じウイルスに由来してもよ
い。すなわち、このコートタンパク質は必要に応じて、組み換えウイルスゲノムに対して
天然である。あるいは、このコートタンパク質融合パートナーは、異種であってもよく、
すなわち、組み換えウイルスゲノムに寄与するウイルスとは異なるウイルスに由来すると
いう点で、天然ではない。好ましい実施形態では、ＴＭＶの１７．５ｋＤａのコートタン
パク質を、ＴＭＶ由来ベクターと接続して用いる。
タンパク質における目的のペプチド／ポリペプチドは、本明細書に規定されるとおり任
意のＧＤＦ８ペプチドから構成されてもよく、ただしこれは、ＧＤＦ８ペプチドドメイン
が、ただ２〜３例を挙げれば、意図される（ｉ）融合タンパク質が、抗体およびＴ細胞レ
セプターに対するものを含む、レセプター分子に対して結合する能力；（ｉｉ）免疫応答
を誘導する能力；および／または（ｉｉｉ）ホルモン活性、免疫調節性活性、酵素の基質
として，または金属キレート活性を含む、融合タンパク質に必要であり得る任意の生物学
的活性、を有意に妨害しないという条件下である。
詳細には、ＴＭＶに基づく、Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ（「ＬＳＢＣ」）から入手可能なＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）系を使用した
。例えば、本明細書によって参照によって援用される、Ｐｏｇｕｅ，ｅｔ ａｌ．２００
２，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ ４０：４５〜７４を参照のこと。ＴＭＶ
は、約６４００個のヌクレオチドのプラスのサンスの一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。ＲＮ
Ａ複製に関与するウイルスタンパク質はゲノムのＲＮＡから直接転写されるが、内部遺伝
子の発現は、サブゲノムＲＮＡの生成を通じている。サブゲノムのＲＮＡの生成は、サブ
ゲノムのプロモーターとして機能する、ＴＭＶゲノムにおける配列によって制御される。
ＶＣＰは、サブゲノムのＲＮＡから翻訳され、そして感染された細胞において生成される
最も豊富なタンパク質およびＲＮＡである（概説は図３によって提供される）。ＴＭＶ感
染植物では、感染された組織の１グラムあたり数ミリグラムのＶＣＰが生成される。ＧＥ
ＮＥＷＡＲＥ（登録商標）発現ベクターは、植物宿主細胞の翻訳優先度を再プログラムす
るこのプロモーターの活性の強度および期間の両方を利用して、この結果、ウイルスにコ
ードされるタンパク質は、ＴＭＶ ＶＣＰと同様に高レベルで合成される。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下のＴＭＶ ＲＮＡゲノムの全長ｃＤＮ
Ａコピーは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ適合性プラスミド中で構築された。ウイ
ルスｃＤＮＡに対する操作は、標準的な組み換えＤＮＡ手順およびＴ７ ＲＮＡポリメラ
ーゼを用いてインビトロで転写された組み換えＤＮＡを用いて行われ、感染性ＲＮＡが生
成された（図４に概説を示す）。感染性転写物を用いて、ｔａｂａｃｕｍ、ｂｅｎｔｈａ
ｍｉａｎａ、および研磨によって誘発される傷を介するＬＳＢＣ−作成Ｎｉｃｏｔｉａｎ
ａ ｅｘｃｅｌｓｉａｎａ種（参照によって本明細書に援用される、Ｆｉｔｚｍａｕｒｉ
ｃｅ，Ｗ．Ｐ．，２００２．米国特許第６，３４４，５９７号）を含む、種々のタバコ関
連の種（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属）を感染させた。ＴＭＶは最初の細胞で複製して、隣接す
る細胞に移動して、円形の感染病巣を生成し、次いで気葉へ輸送するための植物維管束に
入る。これは各々の感染した葉における細胞のほとんどに系統的に感染する。外来の遺伝
子は、レプリカーゼ、移動タンパク質およびコートタンパク質を含む他のウイルスタンパ
ク質生成物を発現する全ての細胞で発現される。外来タンパク質は、そのタンパク質配列
によって決定される部位に沈着される。細胞質タンパク質は、植物細胞質に蓄積し（例え
ば、緑色蛍光タンパク質；ＧＦＰ）；分泌されたタンパク質は、外来タンパク質内に存在
する特定のタンパク質標的配列に依存して、植物のＥＲ、維管束画分またはアポプラスト
に蓄積するか、または遺伝子操作を通じて付加される。この系によって、逆遺伝学のウイ
ルスゲノムの操作だけでなく、標準的な組み換えＤＮＡ方法によるウイルスの操作も可能
になる。
ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）ベクターによって、２つの別個の方法によって外来のタ
ンパク質またはペプチドの発現が可能になる：１）依存性遺伝子発現：ウイルスコートタ
ンパク質の代わりに発現のための外来遺伝子を付加して、これによって内因性のウイルス
コートタンパク質から発現されることによって。配列において転写の活性の程度が低くそ
して同一性がない第二のコートタンパク質プロモーターは、異種コード領域の下流に配置
されて、次いで、ウイルスコートタンパク質遺伝子が付加される。これは、過剰発現につ
いて意図される異種遺伝子に加えて、ウイルスベクターがウイルス複製および浸透移行性
の移動の全ての必須の遺伝子を発現することを可能にさせる第三のサブゲノムのＲＮＡを
コードする。２）ウイルス粒子の表面上の免疫原性ペプチドの提示：ＴＭＶビリオンは、
約１８ｎｍの直径でかつ３００ｎｍの長さの堅いロッドである。このビリオンおよびコー
トタンパク質の構造は、Ｘ線回折によって決定され、これによって、１ターンあたり１６
．３のサブユニットを有する、ゲノムＲＮＡをカプシドで包んでいる右回りらせんに配置
された約２，１３０のコートタンパク質サブユニットの構造が明らかになる。
本発明はまた、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質を含むウイルス粒子またはビリオンを
提供する。例えば、本発明のウイルス粒子のコートは全体として、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合
タンパク質から構成され得る。別の実施形態では、このウイルス粒子は、ＧＤＦ８−ＶＣ
Ｐ融合タンパク質および融合されていないＶＣＰの混合物からなり、ここで２つのタンパ
ク質の比は、変化し得る。トバモウイルスのコートタンパク質は、ウイルス粒子に自己ア
センブリし得るので、本発明のウイルス粒子は、インビボでまたはインビトロでアセンブ
リされてもよい。このウイルス粒子はまた、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質またはその
一部の精製を簡単にするために、周知の技術を用いて都合良く分解されてもよい。
本発明はまた、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質を含む組み換え植物細胞、および／ま
たはＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質を含むウイルス粒子を提供する。これらの植物細胞
は、本発明の感染性組み換えウイルス粒子で、または本発明の感染性ウイルス粒子のゲノ
ムを含むポリヌクレオチドで、植物細胞（培養物において、または植物全体において）を
感染させることによって生成され得る。本発明の組み換え植物細胞は、多くの用途を有し
、とりわけ本発明の融合コートタンパク質の供給源として役立つ。
必要に応じて、本発明のベクターは、選択された宿主生物体、例えば、Ｎｉｃｏｔｉａ
ｎａ属の植物のコドン用途のためにコドン最適化される。
抗ＧＤＦ８および抗−ＶＣＰ−ＧＤＦ８抗体
本発明の方法は、ポリクローナル抗ＧＤＦ８抗血清に対してＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タン
パク質および／またはＧＤＦ８ペプチドをスクリーニングするプロセスを包含した。この
プロセスは、抗ＧＤＦ抗体が特異的に結合するＧＤＦ８のいくつかのエピトープを同定す
るために使用された。１実施形態では、抗ＧＤＦ８抗血清は、前駆体ＧＤＦ８を用いて動
物を免疫することによって得た。前駆体ＧＤＦ８遺伝子は、発現および免疫原性について
最適化された形態を提供するように改変された。例えば、ＧＤＦ８プロホルモン（配列番
号２）の天然のＤＮＡ配列は、哺乳動物およびウイルスの発現系における発現のために最
適化された。さらに、ウイルス宿主のシャットオフ（遮断）機構の負の効果を回避するた
めに変化を作成した。代表的には、ウイルス宿主シャットオフ機構は、転写制御、ＲＮＡ
安定性（スプライシング）などを含む。これらの変化は、核酸を宿主のようではなくさせ
、よりウイルスのようにさせた。
本発明はまた、本発明のＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質に対して、ならびに／または
ＧＤＦ８およびそのペプチドフラグメントに対して特異的に結合するポリクローナル抗体
およびモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む。本明細書において用いる場合、「抗体（ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、免疫グロブリンおよび／またはそのフラグメントをい
う。天然に存在する免疫グロブリンは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードさ
れる１つ以上のポリペプチドからなる。この認識された免疫グロブリン遺伝子としては、
κ、λ、α、γ、δ、εおよびμの定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変
領域遺伝子が挙げられる。本発明による抗体（単数または複数）はまた、抗体フラグメン
ト、すなわち、抗原結合フラグメント、例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２、操
作された単鎖結合タンパク質（例えば、その全体が参照によって本明細書に援用される、
Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．，８５，５８７９〜５８８３，およびＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ
，１９８８，２４２，４２３〜４２６）、ならびに二機能的なハイブリッド抗体（例えば
、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１７，１０５）を包含する。［一般には、Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎ．Ｙ．，第２版，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ
，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）ならびにＨｕｎｋａｐｉｌｌ
ｅｒおよびＨｏｏｄ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２３，１５〜１６、前述の全ては、本
明細書において参照によって援用される］。
例えば、標準的な方法を用いて、本発明のＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質および／ま
たはＧＤＦ８ペプチドによって免疫された動物から生成された血清が、直接用いられても
よく、またはＩｇＧ画分が、血漿分離交換法または吸着クロマトグラフィーであって、Ｉ
ｇＧ特異的吸着剤、例えば、固定されたプロテインＡまたはプロテインＧを用いるような
標準的な方法を用いて血清から分離されてもよい。あるいは、モノクローナル抗体が、そ
して必要に応じて、このようなｍＡｂに由来する抗原結合フラグメントまたは組み換え結
合タンパク質が調製されてもよい。このようなｍＡｂまたはそのフラグメントは当該分野
で公知の方法によって必要に応じてヒト化されてもよい。
本発明のＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質および／またはＧＤＦ８ペプチドに選択的に
結合するｍＡｂを産生するハイブリドーマは、周知の技術によって生成される。通常は、
このプロセスは、不死化細胞株と所望の抗体を生成するＢリンパ球との融合を包含する。
あるいは、不死の抗体産生細胞株を生成するための非融合技術、例えば、ウイルス誘導性
形質転換（ｖｉｒａｌｌｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）［Ｃａｓ
ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：４７６（１９８６）］が用いられ得る
。不死化細胞株は通常形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト由来
の黒色腫細胞である。最も頻繁には、ラットまたはマウスの黒色腫細胞株が、簡便性およ
び利用性の問題として使用される。
抗原を注射された哺乳動物から抗体産生リンパ球を得る技術は周知である。一般には、
ヒト由来の細胞を使用する場合、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が用いられ、または非ヒト哺
乳動物供給源由来の脾臓もしくはリンパ節細胞が用いられる。宿主動物は、精製された抗
原の反復用量を注射されて（ヒト細胞はインビトロで感作される）、そして動物は、所望
の抗体産生細胞を生成させられて、その後にそれらが不死化細胞株との融合のために回収
される。融合のための技術はまた、当該分野で周知であって、一般に、ポリエチレングリ
コールのような融合因子と細胞とを混合する工程を包含する。
ハイブリドーマは、ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）選択のよう
な標準的な手順によって選択される。所望の抗体を分泌するハイブリドーマは、ウエスタ
ンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノア
ッセイ）などのような標準的なイムノアッセイを用いて選択される。抗体は、標準的なタ
ンパク質精製技術を用いて培地から回収される［Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａ
ｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅ
ｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）］。
上記の技術を適用することに手引きを提供するために多くの引用文献が利用可能である
［Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０）
；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）；Ｃａｍ
ｐｂｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８４）；Ｈｕｒｒｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８２）］
．モノクローナル抗体はまた、周知のファージライブラリー系を用いて生成され得る。例
えば、Ｈｕｓｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５；Ｗａｒ
ｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４を参照のこと。
このように生成された抗体は、ポリクローナルであろうとまたはモノクローナルであろ
うと、例えば、イムノアフィニティークロマトグラフィーによりＧＤＦ８ペプチドを精製
するために周知の方法によって固体支持体に結合された固定型で用いられ得る。
ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質および／またはＧＤＦ８ペプチドに結合する抗体も、
ＧＤＦ８エピトープ、例えば、天然のＧＤＦ８タンパク質、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパ
ク質および／またはＧＤＦ８ペプチドを含むタンパク質またはペプチドを検出または定量
するためのイムノアッセイの基礎として、標準的な方法によって、用いられても、未標識
であっても、標識されてもよい。用いられる特定の標識は、イムノアッセイのタイプに依
存する。用いられ得る標識の例としては、限定はしないが、放射性標識、例えば、３２Ｐ
、１２５Ｉ、３Ｈおよび１４Ｃ；蛍光標識、例えば、フルオレセインおよびその誘導体、
ローダミンおよびその誘導体、ダンシルおよびウンベリフェロン；化学発光因子（ｃｈｅ
ｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒｓ）、例えば、ルシフェリアおよび２，３−ジヒドロフタラジ
ンジオン；および酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ
、リゾチームおよびグルコース−６−リン酸脱水素酵素が挙げられる。
抗体は、公知の方法によってこのような標識でタグ化されてもよい。例えば、カップリ
ング剤、例えば、アルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、イミダート、スクシンイ
ミド、ビスジアゾ化ベンザジンなどを用いて、蛍光標識、化学発光標識または酵素標識で
抗体をタグ化してもよい。関与する一般的な方法は、当該分野で周知であって、例えば、
Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，１９８７，Ｃｈａｎ（
編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬに記載されてい
る。このようなイムノアッセイは、例えば、レセプターの精製の間に得られた画分に対し
て行われてもよい。
本発明の抗体はまた、発現クローニング系においてＧＤＦ８関連ポリペプチドを発現す
る特定のｃＤＮＡクローンを同定するために用いられ得る。
レセプターのリガンド結合部位に特異的な中和抗体も、ＧＤＦ８機能をブロックするか
または下方制御するアンタゴニスト（インヒビター）として用いられ得る。このような中
和抗体は、下に提供される実施例によって例証されるように、慣用的な実験を通じて容易
に同定され得る。
インビボまたはインビトロにおけるＧＤＦ８活性のアンタゴニズムは、完全な抗体分子
、または周知の抗原結合フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖ
フラグメントを用いて達成され得る。このようなフラグメントの定義は、本明細書の上記
に記載されるように、または例えば、Ｋｌｅｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗ
ｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２）；Ｐａｒｈａｍ，第１４章，Ｗｅｉｒ，編．Ｉ
ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８６）に見出され得る。抗体フラグメントの
使用および生成も記載されている、例えば：Ｆａｂフラグメント［Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒ
ａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ
（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）］、Ｆｖフラグメント［Ｈｏｃｈ
ｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：１１３０；Ｓｈａ
ｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９７６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７５：１５９１；Ｅｈｒ
ｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，３５５，０２３号］および抗体の半分子（Ａｕ
ｄｉｔｏｒｅ−Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ，米国特許第４，４７０，９２５号）。公知の抗体
重鎖および軽鎖の可変領域配列に基づいて組み換えＦｖフラグメントを作成するための方
法は、例えば、Ｍｏｏｒｅら（米国特許第４，６４２，３３４号）およびＰｌｕｅｃｋｔ
ｈｕｎ，１９９１，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５にさらに記載されている
。あるいは、それらは、標準的な方法によって化学的に合成されてもよい。
本発明はまた、抗原として上記の抗体を用いて生成される、ポリクローナルおよびモノ
クローナルの両方の、抗イディオタイプ抗体を包含する。これらの抗体はリガンドの構造
を模倣し得るので有用である。
ワクチン組成物および投与
好ましい実施形態では、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タン
パク質および／またはそれらに由来するＧＤＦ８ペプチドを発現するビリオンは、任意の
適切なワクチン組成物に組み込まれる。このようなワクチン組成物は、当該分野で周知で
あって、そしてこれには例えば、生理学的に適合性の緩衝液および生理食塩水など、なら
びに本明細書において下にさらに詳細に記載されるアジュバントが挙げられる。提供され
たワクチン組成物は、例えば、抗ＧＤＦ８抗体の特異的な中和エピトープをスクリーニン
グおよび同定するための抗血清を惹起するために使用される。
本明細書において例示されるとおり、配列番号３を含むベクターによって発現される精
製された前駆体ＧＤＦ８タンパク質を、ワクチン組成物中でヤギに注射し、この組成物は
、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）に乳化された０．５ｍｇの前駆体ＧＤＦ８タ
ンパク質を含んだ。このワクチン組成物は好ましくは、ヤギの皮膚の下に皮下（ＳＣ）注
射された。その後のブースター（追加）免疫が好ましい。これらは、例えば、最初の注射
後２〜５週の範囲におよぶ間隔で、同じ量または減少した用量のタンパク質とともに適切
なさらなる間隔で投与され得る。
最初の注射の約２週後から開始し、ただし好ましくは、それより長期間、例えば、３〜
１５週、またはそれ以上後に開始して、免疫した動物から、必要に応じて血清を収集する
。次いで、この収集された血清を好ましくは、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、
プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、プロテインＧアガロース、ヒドロキシルアパタイト
クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析または適切なリガンドでのアフィニティークロ
マトグラフィーなどによって精製および／または分画する。本明細書において例示される
ように、血清のＩｇＧ画分は、プロテインＧアガロースカラムでさらに分画した。
次いで、抗ＧＤＦ８抗血清ＩｇＧ画分は、本明細書において下記の実施例３にさらに詳
細に記載されるように、成熟ＧＤＦ８のペプチドのある範囲のペプチドに対するスクリー
ニングについて利用可能である。
１つの好ましい実施形態では、このワクチンは、例えば、適切な生理学的な組成物に懸
濁された、免疫原としてＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質を発現するインタクトな植物ウ
イルスを含む。別の好ましい実施形態では、このワクチンは、このビリオンから実質的に
単離されたＶＣＰタンパク質を含み、そして必要に応じて、１つ以上の当該分野で公知の
アジュバントを含む。さらに好ましい実施形態では、このワクチン組成物は、適切なアジ
ュバントとともに、１つ以上のＧＤＦ８ペプチドを含む。なおさらなる実施形態では、こ
のワクチン組成物は、前述の組み合わせを含む。
このワクチン組成物は、免疫応答を惹起するために十分な量の所望の免疫原、例えば、
ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質を含む。１用量あたりに投与される量は、動物の量に対
して、約１μｇ／ｋｇ〜約１．０ｇ／ｋｇの範囲にわたってもよい。
免疫がポリクローナル抗体または活性化されたリンパ球を（さらなるスクリーニングお
よびハイブリダイゼーションのために）惹起することを意図する場合、任意の適切な脊椎
動物が容易に使用される。好ましくは、動物とは哺乳動物であり、そしてこれには限定は
しないが、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ
（ｐｏｒｃｉｎｅ）、例えば、ブタ（ｐｉｇおよびｈｏｇ）、ヒツジ、例えば、ヤギおよ
びヒツジ、霊長類、例えば、サル、大型の類人猿およびヒト、などが挙げられる。
「アジュバント（Ａｄｊｕｖａｎｔｓ）」とは、特定の抗原に対する免疫応答を非特異
的に増大し、これによって、任意の所定のワクチンに必要な抗原の量、および／または目
的の抗原に対して適切な免疫応答を生じるのに必要な注射の頻度を減少させる、因子であ
る。動物のワクチン接種に適切なアジュバントとしては、限定はしないが、Ａｄｊｕｖａ
ｎｔ ６５（ピーナツ油、マンニドモノオレエート（ｍａｎｎｉｄｅ ｍｏｎｏｏｌｅａ
ｔｅ）およびモノステアリン酸アルミニウムを含む）；フロイントの完全または不完全ア
ジュバント；鉱物ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびミョウ
バン；サーファクタント、例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシ
チン、ジメチルヂオクタデシル臭化アンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’
−ビス（２−ヒドロキシメチル）プロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロール
およびプルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌｓ）；ポリアニオン、
例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、ポリアルコール酸およびカルボポール；
ペプチド、例えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシンおよびタフトシン；ならびに
油状エマルジョンが挙げられる。このタンパク質またはペプチドはまた、リポソームまた
は他のマイクロキャリアへの組み込み後に投与され得る。イムノアッセイのアジュバント
および種々の局面に関与する情報は、例えば、本明細書において参照によって援用される
、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎによるシリーズ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ
Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，第３版，１９８７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋに開示される。
本発明のＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質、そのフラグメント、またはＧＤＦ８−ＶＣ
Ｐタンパク質もしくはフラグメントを発現するウイルス粒子がインビボで投与される場合
、それらは代表的には、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む薬学的組成物と
して与えられる。このようなキャリアは、身体への所望の化合物の送達のために適切な任
意の適合性の非毒性の物質であってもよい。滅菌水、アルコール、脂肪、ワックスおよび
不活性な固体が、キャリアに含まれてもよい。薬学的に受容可能な緩衝化剤、分散剤など
も薬学的組成物中に組み込まれてもよい。さらに、融合タンパク質またはフラグメントが
、免疫応答（防御的またはその他）を誘導するために用いられる場合、この処方物は、よ
り強力な所望の免疫応答を刺激するために１つ以上の免疫学的アジュバントを含んでもよ
い。
ヒトを含む動物に対して組成物を与える場合、任意の多数の投与経路が用いられ得る。
標準的な投与経路としては、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内および／また
は口腔が挙げられる。魚類の種のためには、ワクチン組成物または免疫原性組成物を投与
する方法としては、前述に加えて、抗原性濃度のペプチドを含む水へこの魚を浸すこと、
魚を水から短時間出している間に抗原性濃度のペプチドをこの魚に噴霧することなどが挙
げられる。当業者は、このワクチン組成物が好ましくは各々のタイプのレシピエント動物
および投与経路に適切に処方されることを理解する。非経口投与のための組成物は、受容
可能なキャリア、好ましくは水性キャリア、例えば、水、緩衝化水、０，４％生理食塩水
、緩衝化生理食塩水、０．３％グリセリンなどに溶解された融合タンパク質（または誘導
体）の溶液またはそのカクテルを含む。これらの溶液は、無菌であって、一般には粒子性
の物質を含まない。これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌され得る。組成物は
、適切な生理学的状態に必要な薬学的に受容可能な補助物質、例えば、ｐＨ調節剤および
緩衝化剤、毒性調節剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、
塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含んでもよい。
これらの処方物におけるＧＤＦ８ペプチドおよび／またはＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパ
ク質（またはその一部）の濃度は、特定のアミノ酸配列および所望の生物学的活性に依存
して広範に、例えば、約０．５％未満、通常は少なくとも約１％から１５または２０重量
％程度の大きさまで変化し得、そして選択された特定の投与の様式およびレシピエントの
条件に従って、主に液体の容積、粘度などに基づいて選択される。
非経口的に投与可能な組成物および被験体への投与に必要な調節物を調製するための正
確な方法は、公知であるかまたは当業者に明白であって、例えば、本明細書において参照
によって援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，現行版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，
Ｐａ．にさらに詳細に記載される。
ＧＤＦ８結合エピトープの同定
適切な抗ＧＤＦ８モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を、ＧＤＦ８タンパク
質に対して抗体が選択的に結合するのに十分な時間、このタンパク質と接触させた。その
後に、ＧＤＦ８バイオアッセイによって、この抗体が、ＧＤＦ８タンパク質活性の実質的
に全てを中和したことが確認された。任意のＧＤＦ８バイオアッセイが、この目的のため
に使用され得るが、実施例３によって本明細書の下に例示されるとおり、Ｔｈｉｅｓら，
２００１，（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １８，２５１）によるインビトロの転写活
性アッセイが好ましい。
一般には、本発明による抗原または結合エピトープとして有用なＧＤＦ８ペプチドは、
ＧＤＦ８（配列番号１）のほぼ残基３１２〜ほぼ残基３６１を含む。詳細には、本発明に
よるペプチドとしては、ＧＤＦ８（配列番号１）の残基約３２０〜残基約３５０を含む。
このペプチドは好ましくは、ＧＤＦ８（配列番号１）の約残基３２１〜約残基３４６を含
む。
当業者は、本発明のＧＤＦ８ペプチドは、ポリペプチドが本明細書において下に例示さ
れるようなラットモノクローナル抗体ＭＡＢ７８８に特異的に結合する条件下で、任意の
位置で少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むように容易に改変され得ることを理解
する。このような保存的置換としては、例えば、残基３２８、３２９および３３５ならび
にその組み合わせでのバリエーションを挙げることが可能で、ここでアミノ酸残基３２８
は、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、ＡｓｎまたはＶａｌであり；アミノ酸残基３２９は、Ｌｙｓまたは
Ｌｅｕであり；そしてアミノ酸残基３３５は、ＳｅｒまたはＰｒｏまたはＴｈｒである。
前駆体ＧＤＦ８残基３２８、３２９および３３５は、図２に図示されるように、種にまた
がってＧＤＦ８タンパク質配列内で変化するが、それにもかかわらず、成熟ＧＤＦ８は機
能を保持する。
図１は、ＧＤＦ８活性領域（成熟タンパク質を形成する）のマップを、その前駆体タン
パク質の状況において図示する。ＧＤＦ８活性領域のマップ上に重ね合わせたのは、７つ
の重複するペプチドの位置である。これらの重複するペプチドは、ＧＤＦ８の抗体結合エ
ピトープ（単数または複数）を同定するための標的を提供するように設計された。ＤＪ５
と表示されたペプチドは、例示されたヤギ抗ＧＤＦ８抗血清のＩｇＧ画分内でスクリーニ
ングすることによって、例示された抗血清についてのＧＤＦ８の唯一の有意な結合エピト
ープとして同定された。このペプチドは、前駆体ＧＤＦ８（配列番号１）の残基３２１〜
残基３４６に相当する配列（配列番号８）を有する。
処置されるか、および／または免疫されるべき動物
ＧＤＦ８中和抗体を惹起する首尾よい免疫の結果は、免疫された動物におけるＧＤＦ８
機能の下方制御である。１つの好ましい実施形態では、動物は、「食物生産（ｆｏｏｄ−
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）」動物であって、能動免疫または受動免疫の結果は、免疫されてい
ない動物に対する、動物の体重、特に筋肉量の増加である。受動免疫は、中和抗ＧＤＦ８
抗体および／またはその抗体フラグメントを用いて動物を処置することによって、例えば
、行われ得る。
別の好ましい実施形態では、動物は、ヒトまたは他の動物、例えば、ペットまたはコン
パニオン・アニマルであって、ＧＤＦ機能は、能動免疫または受動免疫によって下方制御
される。この選択的な別の実施形態では、ＧＤＦ８下方制御の目的は、例えば、筋肉の消
耗状態を相殺するために、食物目的のために飼育されているのではない動物において研究
目的のために、および／または医学的または獣医学的処置を提供することである。選択的
な別の好ましい実施形態では、獣医目的のために処置される動物としては、例えば、上で
列挙されたような、ただし詳細にはヒトを除く、このような処置が有益である全ての動物
が挙げられる。
動物は好ましくは脊椎動物であり、そしてより好ましくは、哺乳動物、トリまたは魚で
ある。食用動物の定義は、異なる文化の人の間では変化することが理解されるべきである
。さらに、ヒトの消費に通常使用されない食用動物は、例えば、米国では、他の動物、例
えば、ペット、外来のペット、コンパニオン・アニマルおよび／または研究用動物に給餌
するための食用動物として使用され得る。従って、以下のリストは、限定する意図ではな
く、単なる例として提供される。
１つの特定の実施形態では、動物被験体は哺乳動物である。他の哺乳動物被験体として
は非ヒト霊長類（例えば、サル）、ウシ（例えば、肉牛または乳牛）、ブタ（ｐｏｒｃｉ
ｎｅ）（例えば、雄豚（ｈｏｇ）または豚（ｐｉｇ））、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）（例えば
、ヤギ（山羊）または羊（ｓｈｅｅｐ））、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）（例えば、馬（ｈｏｒ
ｓｅ））、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）（例えば、犬）、ネコ（例えば、家ネコ）、ラクダ、シ
カ、アンテロープ、ウサギおよびげっ歯類（例えば、モルモット、リス、ラット、マウス
、スナネズミおよびハムスター）が挙げられる。トリとしては、Ａｎａｔｉｄａｅ（ガン
カモ科）（白鳥、カモおよびガチョウ）、Ｃｏｌｕｍｂｉｄａｅ（ハト科）（例えば、ハ
ト（ｄｏｖｅ）およびハト（ｐｉｇｅｏｎ））、Ｐｈａｓｉａｎｉｄａｅ（キジ科）（例
えば、ヤマウズラ、ライチョウおよびシチメンチョウ）、Ｔｈｅｓｉｅｎｉｄａｅ（例え
ば、家禽）、Ｐｓｉｔｔａｃｉｎｅｓ（例えば、インコ、コンゴウインコおよびオウム）
、狩猟鳥および、走鳥類（例えば、ダチョウ）が挙げられる。
鳥類は、商業的または非商業的いずれかの鳥類飼育に関連し得る。これらとしては、例
えば、Ａｎａｔｉｄａｅ（ガンカモ科）、例えば、ガチョウおよびカモ、Ｃｏｌｕｍｂｉ
ｄａｅ（ハト科）、例えば、ドバトを含む、ハト（ｄｏｖｅ）およびハト（ｐｉｇｅｏｎ
）、Ｐｈａｓｉａｎｉｄａｅ（キジ科）、例えば、ヤマウズラ、ライチョウおよびシチメ
ンチョウ、Ｔｈｅｓｉｅｎｉｄａｅ、例えば、家禽が挙げられる。
他の食用動物としては、例えば、有袋類（例えば、カンガルー）、爬虫類（例えば、養
殖カメ）および他の経済的に重要な家畜が挙げられ、このために本発明の方法は、体重を
増強すること、および／または筋肉増殖を促進することに安全かつ有効である。
本発明の目的のためには、「魚の（ｐｉｓｃｉｎｅ）」または「魚（ｆｉｓｈ）」とい
う用語は、限定はしないが、Ｔｅｌｅｏｓｔｉ群の魚、すなわち、硬骨魚を包含すること
が理解される。Ｓａｌｍｏｎｉｆｏｒｍｅｓ（サケ目）（Ｓａｌｍｏｎｉｄａｅ（サケ科
）を含む）およびＰｅｒｃｉｆｏｒｍｅｓ（スズキ目）（Ｃｅｎｔｒａｒｃｈｉｄａｅ（
クロマス科）を含む）の両方とも、Ｔｅｌｅｏｓｔｉ分類内に含まれる。
可能性のある魚のレシピエントの例としては、サケ科（Ｓａｌｍｏｎｉｄａｅ ｆａｍ
ｉｌｙ）、ハタ科（Ｓｅｒｒａｎｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）、タイ科（Ｓｐａｒｉｄａｅ
ｆａｍｉｌｙ）、カワスズメ科（Ｃｉｃｈｌｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）、クロマス科（
Ｃｅｎｔｒａｒｃｈｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）、三本線のイサキ（ｔｈｒｅｅ−Ｌｉｎｅ
Ｇｒｕｎｔ）（Ｐａｒａｐｒｉｓｔｉｐｏｍａ ｔｒｉｌｉｎｅａｔｕｍ）、および青
い眼のプレコストムス（Ｂｌｕｅ−Ｅｙｅｄ Ｐｌｅｃｏｓｔｏｍｕｓ）（Ｐｌｅｃｏｓ
ｔｏｍｕｓ ｓｐｐ）が挙げられる。
Figure 2011024590
Figure 2011024590
Figure 2011024590
さらなる実施形態では、この動物は、コンパニオン・アニマルまたはヒトであって、ワ
クチンは、このようなＧＤＦ８下方制御に応答する任意の獣医のまたは医学の目的のため
のＧＤＦ８の長期の下方制御を提供するために投与される。本発明の目的のためには、こ
の「コンパニオン（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ）」アニマルという用語は、馬（ウマ）、猫（ネ
コ）、犬（イヌ）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットを含む）ウサギ種、およびト
リ、例えば、ハト、オウムなどを含むことが理解されるべきである。
このようなワクチン接種または抗体を投与される鳥類は、商業的または非商業的いずれ
かの鳥類飼育に関連し得る。これらとしては、例えば、Ａｎａｔｉｄａｅ（ガンカモ科）
、例えば、ハクチョウ、ガチョウおよびカモ、Ｃｏｌｕｍｂｉｄａｅ（ハト科）、例えば
、ハト（ｄｏｖｅ）およびハト（ｐｉｇｅｏｎ）、例えば、ドバト、Ｐｈａｓｉａｎｉｄ
ａｅ（キジ科）、例えば、ヤマウズラ、ライチョウおよびシチメンチョウ、Ｔｈｅｓｉｅ
ｎｉｄａｅ、例えば、家禽、オウム科（Ｐｓｉｔｔａｃｉｎｅｓ）、例えば、インコ、コ
ンゴウインコおよびオウム、例えば、ペットまたはコレクターの市場のために飼育される
ものが挙げられる。
別の好ましい実施形態では、任意の上述の動物（好ましくは非ヒト）が、本発明のペプ
チドに特異的に結合する抗ＧＤＦ８抗体を得るために免疫され、そしてその惹起された抗
体は、このようなＧＤＦ８下方制御に応答性の任意の獣医または医学の目的のためにＧＤ
Ｆ８の下方制御を、例えば、提供するために、アッセイにおいて、および／または獣医も
しくはヒトの医薬における使用のために回収される。
本発明は、本発明の例示として提供される、以下の非限定的な実施例を参照することに
よってさらによく理解され得る。以下の実施例は、本発明の実施形態をさらに詳細に例示
するために提示されるものであって、本発明の広範な範囲を限定するとは決して解釈され
るべきではない。
実施例１
材料および方法
Ａ．前駆体ＧＤＦ８（ＧＤＦ８プロホルモン）の発現および精製
前駆体ＧＤＦ８またはプロホルモンの天然のＤＮＡ配列（配列番号２）は、哺乳動物お
よびウイルス発現系における発現のために最適化された。ウイルス宿主のシャットオフ（
遮断）機構の負の影響を回避するために、ＤＮＡ配列は、できるだけ哺乳動物の核酸配列
から相違するように設計した。これを達成するために、ＧＤＦ８プロホルモンのアミノ酸
配列は、酵母の好ましいコドンを用いて逆翻訳させた。得られた配列をコドンについて調
査して、これはヒトＧＤＦ８核酸配列に対してその相同性を保持していた。可能性のある
これらのコドンを、同じアミノ酸をコードする次に最も好ましい酵母コドンで置換した。
得られた核酸分子（配列番号３）は、適切な発現ベクターへの組み込みのために商業的に
合成した。
Ｆｌｐ−ｌｎ（商標）ＣＨＯ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、最適化されたＧＤＦ８プロホルモンを発現した。要するに
、Ｃ末端ＦＬＡＧ（登録商標）−（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）エピトープ融合物を含むＧＤＦ８プロホルモン構築物は、プラスミドｐ
ＣＭＶｔａｇ４Ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）へ、改変ＧＤ
Ｆ８プロホルモンをコードする遺伝子を挿入することによって構築した。ＦＬＡＧ（登録
商標）融合タグによって、抗−ＦＬＡＧ（Ｒ）ゲルカラム上のＦＬＡＧ（登録商標）融合
タンパク質の分離を容易になる。次いで、改変ＧＤＦ８プロホルモン−ＦＬＡＧ（登録商
標）遺伝子を含むＰＣＲ ＤＮＡフラグメントをプラスミド発現ベクターｐｃＤＮＡ５／
ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中にクロー
ニングした。ＧＤＦ８プロホルモン−ＦＬＡＧ（登録商標）融合タンパク質を発現するＦ
ｌｐ−ｌｎ（商標）ＣＨＯ細胞株の生成は、ＧＤＦ８−ＦＬＡＧ（登録商標）遺伝子およ
びＦｌｐリコンビナーゼ発現プラスミドＰＯＧ４４を含むＦｌｐ−ｌｎ（商標）発現ベク
ターを用いるＦｌｐ−ｌｎ（商標）ＣＨＯ細胞株の同時トランスフェクションによって達
成された。Ｆｌｐリコンビナーゼは、部位特異的なＤＮＡリコンビナーゼによる、組み込
まれたＦＲＴ部位でのゲノムへのＦｌｐ−ｌｎ発現カセットの挿入を媒介する。ＦＬＡＧ
（登録商標）エピトープを含むＧＤＦプロホルモンを発現しかつ分泌する安定な細胞株を
、ハイグロマイシンＢ選択を用いて得た。
ＦＬＡＧ（登録商標）タグを含むＧＤＦ８プロホルモンを発現する安定なＣＨＯ細胞株
を、標準的な技術を用いて無血清培地中の懸濁培地に適合させた。分泌されたＧＤＦ８プ
ロホルモンを含む順化培地は、ＷＡＶＥバイオリアクターシステム（ＷＡＶＥ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ ＬＬＣ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）を用いて生成した。ＦＬＡＧ（登録商
標）タグ化ＧＤＦ８プロホルモンの精製は、抗−ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２アフィニティ
ーゲル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて
アフィニティークロマトグラフィーによって達成した。
Ｂ．ＤＪ５特異的な抗体精製
ＤＪ５（配列番号８；下の表２を参照のこと）特異的な抗体画分は、アフィニティーカ
ラムクロマトグラフィーによって精製された。アフィニティーカラムは、０．８ｇの臭化
シアン−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｗｏｏｄｌａ
ｎｄｓ，ＴＸ）に対して１０ｍｇのＤＪ５合成ペプチドをカップリングすることによって
調製された。このカラムは、ＰＢＳを用いて洗浄して平衡化した。約１１ｍｌのヤギＩｇ
Ｇ画分（１０ｍｇ／ｍｌ）を、アフィニティーカラムに加えて、２５ｍｌのＰＢＳで洗浄
した。１．０ｍｌの画分を収集して、２８０ｎｍでの吸光度をモニターした。結合した物
質を約１０ｍｌの０．２Ｍグリシン（ｐＨ １．８５）で溶出した。１．０ｍｌの画分を
収集して、０．２５ｍｌの０．５Ｍのリン酸ナトリウム、０．７５ＭのＮａＣｌ，ｐＨ７
．４で中和した。未結合の画分１〜１０および結合した画分２５〜３５の約２５μｌのア
リコートを、ＤＪ５ペプチドに対するＥＬＩＳＡ反応性についてアッセイした。未結合の
画分は、ＤＪ５反応性について陰性であることが見出された。結合された画分は、ＤＪ５
ペプチドに対する反応性の強力なピークを示した。未結合の画分１〜１１および結合した
画分２６〜３４をプールした。プールしたサンプルを濃縮して、それらの緩衝液を、下に
示されるようにリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で交換した。サンプルの濃度は、ＯＤ
２８０法（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，２．７
．３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）によって確認した。未結合のサ
ンプルを、１０ｍｇ／ｍｌに調節して、結合したサンプルを、引き続く使用のために１ｍ
ｇ／ｍｌに調節した。
実施例２
ヤギ抗ＧＤＦ８ポリクローナルＩｇＧ血清
ヤギ抗前駆体ＧＤＦ８のＩｇＧは、以下の方法によって、免疫されたヤギから得た：
Ａ．ヤギの免疫
ザーネン（Ｓａａｎｅｎ）（乳用）ヤギ（約２歳齢の雄）を、以下のように、精製され
た組み換えＧＤＦ８プロホルモン（上の実施例１によって記載されるように得られた）を
用いて免疫した。０．５ｍｇのタンパク質を、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）
に乳化して、ヤギの皮膚下に皮下（ＳＣ）注射した。３週、６週および１０週でＳＣ投与
した、その後の追加免疫は、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）中に乳化された
０．３ｍｇのタンパク質を含んだ。注射器と針を用いて頸静脈から血液を、収集して、真
空のボトルおよび配管で採取した。血液を抗凝血剤を含むボトル中に収集して、２０分間
２５００ＲＰＭで遠心分離して赤血球を除去した。血漿を再硬化して、血清を生成した。
初回免疫の１５週後に収集した血清サンプルを、さらなる分析に用いた。
Ｂ．ヤギポリクローナルＩｇＧの収集および精製
血清を、１５週後にヤギから収集して、ＩｇＧ画分を以下のようにこの血清から精製し
た。ヤギ血清のＩｇＧ画分は、製造業者のプロトコールに従って、プロテインＧアガロー
スカラム（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉ
ｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で精製した。溶出された画分をプールして、
濃縮し、そして緩衝液を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ遠心分離Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｃｅｎｔｒｉ
ｐｒｅｐ ＹＭ− １０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒ
ｉｃａ，ＭＡ）を利用してリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて交換した。サンプ
ル濃度は、ＯＤ２８０方法によって確認した。
実施例３
ヤギ抗血清の特徴付け
上記の実施例２によって提供されるヤギ抗血清は、ＰＧＡと命名される。ＰＧＡ Ｉｇ
Ｇ画分は、ＧＤＦ８プロホルモン分子上の種々のエピトープに対する抗体を含むと予想さ
れる。ＰＧＡ抗血清は、以下のように、インビトロの活性化アッセイによって特徴付けた
。ＧＤＦ８の生体中和を定量的に測定するために用いたインビトロの転写活性アッセイは
、本質的に、Ｔｈｉｅｓら（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １８，２５１（２００１）
）のアッセイである。９６ウェルの組織培養処理照度計ＶｉｅｗＰｌａｔｅ（商標）アッ
セイプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に、１．０×１０５細胞／ウェルのＡ
２０４ Ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８２）を播種して
、３７℃，５％ＣＯ２、加湿チャンバ中でインキュベートした。完全Ａ２０４培養培地は
、ＭｃＣｏｙの５Ａ培地、１０％ウシ胎仔血清、２％Ｌ−グルタミンおよび１％Ｐｅｎｎ
／Ｓｔｒｅｐからなる。８０％コンフルエンシーより大きく達する際に、細胞を、ＦＵＧ
ＥＮＥトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の製造業者によって推奨されるプロトコ
ールを用いてプラスミドｐＤＰＣ４−ルシフェラーゼおよびＨＣＭＶ ＩＥ−ｌａｃＺの
混合物で一過性にトランスフェクトして、３７℃，５％ＣＯ２、加湿チャンバ中で１６時
間インキュベートした。プラスミドｐＤＰＣ４−ルシフェラーゼは、ヒトプラスミノーゲ
ンアクチベータインヒビター（ＰＡＩ−１）由来のＣＡＧＡボックスの４つのコピーを含
み、これによって、異種プロモーターレポーター構築物にＧＤＦ８反応性が付与される。
プラスミドＨＣＭＶ ＩＥ−ｌａｃＺは、構成的ヒトサイトメガロウイルス最初期プロ
モーターの制御下にβガラクトシダーゼ遺伝子を含む。この遺伝子は、トランスフェクシ
ョン効率を中和するためにコントロールとして添加される。次いで、細胞を１ウェルあた
り１００ｎｇのＧＤＦ８タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａ
ｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で処理して、さらに１６時間、３７℃、５％ＣＯ２、加湿チャンバ中
でインキュベートした。Ｄｕａｌ−Ｌｉｇｈｔ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｔ
ｒｏｐｉｘ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）
を用いて、この処理した細胞中でルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼを定量した。
各々のサンプルは、二連（２ウェル）で行った。各々のウェルについてのシグナルは、ルシフェラーゼシグナルをβガラクトシダーゼシグナルで割って１００倍したものとして算出した。サンプルのシグナルは、２つのウェルの平均として算出した。
抗体サンプルの生体中和活性を試験するために、種々の濃度の精製されたＩｇＧ画分を
、細胞の処理前にＧＤＦ８タンパク質と（４℃で約１６時間）インキュベートした。阻害
パーセントは、１００−（１００×サンプルシグナル）／（ＧＤＦ８単独でのシグナル−
ＧＤＦ添加なしのシグナル）として算出した。インビトロの転写活性化アッセイの結果は
、下の表１にまとめる。
Figure 2011024590
この中和アッセイによって、回収されたヤギ血清のＩｇＧ画分は、この活性アッセイに
おいて用いられるＧＤＦ８の少なくとも９５％を中和し得る抗体を含むことが確認された
。
実施例４
ヤギポリクローナル抗体は、ＧＤＦ８タンパク質の特異的な中和エピトープを規定する
免疫応答を中和する特異性を決定するために、ＰＧＡ ＩｇＧ画分を、活性なＧＤＦ８
タンパク質のコード領域全体にまたがる１セットの７つの重複するペプチド（ＤＪ１〜７
、表２および図１を参照のこと）とのその反応性についてアッセイした。各々の個々のペ
プチドに対するヤギＰＧＡ ＩｇＧの反応性は、酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅｎｚｙｍ
ｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ）によって
決定した。ＧＤＦ８ペプチドのＥＬＩＳＡは本質的に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｏ
ｒ（商標）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ ＨＲＰ，ＡＢＴＳ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒ
ｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ
ｒｇ，ＭＤ）に記載のように行った。以下の改変をこのアッセイで用いた。合成ペプチド
ＤＪ１〜７（下の表２を参照のこと）は、ＰｒｏＳｃｉ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｗａｙ，ＣＡ）
により本発明者らの指示のもとでカスタム合成した。プレートは、合成ペプチドを１ウェ
ルあたり５００ｎｇで用いてコーティングして、１ウェルあたり２５０ｎｇでＧＤＦ８プ
ロホルモンを精製した。一次抗体は、種々のサンプル由来のＩｇＧ画分であった。二次抗
体は、１：２０００の希釈で用いた。ヤギ一次抗体サンプルについて、二次抗体は、ヤギ
ＩｇＧに対するウサギペルオキシダーゼ標識抗体であった。ラット一次抗体サンプルにつ
いては、二次抗体は、ラットＩｇＧに対するヤギペルオキシダーゼ標識抗体であった。Ｏ
Ｄ４５０ｎｍは、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて１５分間読み取った。ＥＬＩＳＡ
反応性は、１分あたりのＯＤ４０５の１０００倍として算出した。
Figure 2011024590
ＥＬＩＳＡの結果は下の表３にまとめる。
Figure 2011024590
ＰＧＡ ＩｇＧ画分は、精製されたＧＤＦ８プロホルモン、およびＤＪ５ペプチドの両
方と特異的に反応した。ＧＤＦ８活性領域ペプチドのなかで、ＩｇＧ画分は、特異的にか
つ排他的にＤＪ５ペプチドと反応する。このことは、この血清の中和能力が、ＤＪ５ペプ
チドによって規定されるエピトープに対するものであるということを強力に示す。この仮
説を確認するために、ＰＧＡ ＩｇＧのＤＪ５特異的画分を精製した。これは、前出の実
施例１によって記載されるとおりアフィニティークロマトグラフィーによって達成された
。ＰＧＡ抗体は、ＤＪ５ペプチドの結合および未結合の画分に分けられた。両方の画分を
、ＧＤＦ８タンパク質に対する中和活性についてアッセイした。
下の表４の結果によって、ＧＤＦ８中和能力のほとんどがＤＪ５ペプチドに対して特異
的に結合する抗体とともに存在するということが示される。これによって、ＤＪ５ペプチ
ドがＧＤＦ８タンパク質の中和能力を規定するということが明らかに実証される。
Figure 2011024590
不思議なことに、予備的な実験では、中和ＧＤＦ８抗体は、２匹のウサギに、キーホー
ル・リンペット・ヘモシアニンに結合体化したヒトＤＪ５抗原を注射した場合には、得ら
れなかった。図２に示され得るとおり、ウサギおよびヒトＧＤＦ８についてのＤＪ５に対
応するアミノ酸配列は同一であるが、ヤギＤＪ５のアミノ酸配列は異なる。従って、ヤギ
について上で与えられたデータを考慮して、予備的なウサギのデータによって、宿主動物
ＧＤＦ８の領域／部分に相当するものとは異なるアミノ酸配列を含むＤＪ５抗原を用いる
ことが有利であり得るということが示唆される。従って、この場合、組み換えヒトＧＤＦ
８プロホルモンがヤギで生体中和抗体を誘導する能力は、用いられる抗原が、ＧＤＦ８の
ＤＪ５領域／部分において単独のアミノ酸置換で宿主配列のものとは異なるアミノ酸配列
を含んだという事実に、少なくとも一部は起因し得る［図２におけるアミノ酸残基３３３
を参照のこと］。さらに詳細には、図２が示すとおり、ヒト配列におけるＡｒｇ３３３は
、ヤギの配列においてＬｙｓ３３３残基で置換される。この孤立した保存的アミノ酸置換
は、ヤギ免疫監視機構に対してタンパク質を「外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）」にさせるのに有
意に十分である変更を構成し得る。
実施例５
ラットｍＡＢ７８８を中和するＧＤＦ８は、ＧＤＦ８タンパク質の特異的な中和エピト
ープを規定する
ラットモノクローナル抗体ＭＡＢ７８８は、マウスＧＤＦ８の生物活性を中和すること
が報告されている（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，カタログ番号ＭＡＢ７８８，Ｍ
ｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。この結果を確認するために、本発明者らは、ＧＤＦ８タ
ンパク質に対する中和活性についてモノクローナル抗体をアッセイした。この抗体は、上
記の実施例３によって記載されるように特徴付けられた。このアッセイの結果は、下のと
おり、表５にまとめられる。
Figure 2011024590
表５によって、この抗体がＧＤＦ８タンパク質の活性を中和し得ることが確認される。
この中和免疫応答の特異性を確認するために、ラットモノクローナル抗体を、活性なＧＤ
Ｆ８タンパク質のコード領域全体にまたがる１セットの７つの重複するペプチド（ＤＪ１
〜７、表２および図１を参照のこと）との反応性についてアッセイした。各々の個々のペ
プチドに対するモノクローナル抗体の反応性は、ＥＬＩＳＡアッセイによって確認した（
実施例４、前出を参照のこと）。
Figure 2011024590
ラットモノクローナル抗体は、精製されたＧＤＦ８プロホルモンおよびＤＪ５ペプチド
の両方と特異的に反応した。代表的にはモノクローナル抗体は、単一のエピトープに対し
て一特異性を有する。ＧＤＦ活性領域ペプチドの間でも、このモノクローナル抗体は、Ｄ
Ｊ５ペプチドと特異的にかつ排他的に反応する。この結果によって、ＤＪ５ペプチドが、
ＧＤＦ８タンパク質の中和エピトープを規定するというさらなる独立した証拠が得られる
。
実施例６
オリゴヌクレオチドアニーリングを通じてコートタンパク質へのエピトープを挿入する
ためのベクターの構築
ＴＭＶコートタンパク質の種々の位置への種々のエピトープのクローニングは、５つの
異なるアクセプターベクターを作製することによって簡易にされた（図５）。表７は、そ
れらの特性とともにこれらのベクターを列挙する。これらのベクターは、ＴＭＶのＵ１ま
たはＵ５株についてのコートタンパク質オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の適切
な位置に位置されたＮｃｏＩ（５’）およびＮｇｏＭＩＶ（３’）制限部位を含む。ＴＭ
Ｖ Ｕ１株については、制限部位の対は、Ｎ末端ループ、アミノ酸１５５と１５６の間（
ＧＰＡＴ）およびＣ末端に位置していたが、Ｕ５株については、これは、アミノ酸１５５
と１５６との間にのみ位置した（ＴＰＡＴ）。それぞれ「ＣＡＴＧ」および「ＣＣＧＧ」
という５’および３’のオーバーハングを有する、ペプチドをコードするオリゴヌクレオ
チドの任意の対は、これらのアクセプターベクターへ容易にクローニングされ得る。これ
らの３つのベクターの構築物ｐＬＳＢ２２６８、ｐＬＳＢ２２６９およびｐＬＳＢ２１０
９は、Ｐａｌｍｅｒら（２００４年４月；国際特許公開番号ＷＯ ２００４／０３２６２
２Ａ２）によって記載される。残りの２つのベクターの構築物ｐＬＳＢ２１１０およびｐ
ＬＳＢ１８０６は下に記載される。
Figure 2011024590
＊このベクター上のさらに詳細な情報は、Ｐａｌｍｅｒら（本明細書において参照によっ
て援用される、２００４年４月、ＷＯ２００４／０３２６２２Ａ２）で利用可能である。
ｐＬＳＢ２１１０およびｐＬＳＢ１８０６の核酸配列は、コートタンパク質オープンリー
ディングフレームについてである。
「――――」この破線は、それぞれのアクセプターベクターに挿入される、目的のＧＤＦ
８ペプチドドメイン、例えば、ＤＪ５を示す。さらなる天然でない配列は、挿入部位で生
成されたアミノ酸に起因する。
ｐＬＳＢ２１１０を生成するために、ＤＮＡの０．８キロベース（ｋｂ）のフラグメン
トを、ｐＢＴＩ２１５０（Ｐｏｇｕｅら、２００４；米国特許番号ＵＳ ６，７３０，３
０６号Ｂ１）の誘導体であるプラスミドｐＬＳＢ２１０８から増幅したが、以下のプライ
マーを用いて、ＡｆｌＩＩＩ制限部位は除去した：
Figure 2011024590
配列番号３７プライマー（ＡｆｌＩＩＩ ５’コート）は、Ｕ１コートタンパク質の開始
配列を含み、そしてＡｆｌＩＩＩ認識部位には下線を付している。配列番号３８プライマ
ーの場合（ＮｃｏＩ／ＮｇｏＭＩＶ末端でループアウト）、ＮｃｏＩおよびＮｇｏＭＩＶ
認識部位には下線を付している。配列番号３９のオリゴヌクレオチド（３０Ｂ ７７９２
Ｒ）は、ＰｓｔＩ部位のすぐ下流にアニーリングする。このポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）から得られた生成物は、２つのクローニング部位、ＮｃｏＩおよびＮｇｏＭＩＶ、な
らびにウイルスの３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）を提供するためにＣ末端で改変されたコー
トタンパク質を含んだ。この０．８ｋｂのＡｆｌＩＩＩ／ＰｓｔＩフラグメントを、ベク
ターｐＢＴＩ２１５０の８．４ｋｂのＮｃｏＩ／ ＰｓｔＩフラグメントに挿入した。得
られたプラスミドｐＬＳＢ２１１０によって、Ｕ１コートタンパク質のＣ末端で、Ｎｃｏ
ＩおよびＮｇｏＭＩＶオーバーハングの両方を保有する、任意のペプチド配列の挿入が可
能になる。
ｐＬＳＢ１８０６を生成するためには、重複するＰＣＲを使用した。０．５ｋｂおよび
０．３ｋｂのサイズの２つのＤＮＡフラグメントは、テンプレートとしてプラスミドＢＳ
Ｇ１０５７を用いて増幅した（Ｆｉｔｚｍａｕｒｉｃｅら、米国特許第号ＵＳ６，６５６
，７２６Ｂ１）。この０．５ｋｂのフラグメントは、オリゴヌクレオチド
Figure 2011024590
を用いて増幅した。この得られたフラグメントは、Ｕ５コートタンパク質のほとんど（ア
ミノ酸番号１−１５５）を含んだが、２番目のアミノ酸残基（プロリン）は欠く。０．３
ｋｂのフラグメントは、オリゴヌクレオチド
Figure 2011024590
を用いて増幅した。このフラグメントは、Ｕ５コートタンパク質のＣ末端の４つのアミノ
酸、および３’ＵＴＲを含む。さらに、これはまた、アミノ酸番号１５５と１５６との間
に位置する、２つのクローニング部位ＮｃｏＩおよびＮｇｏＭＩＶも保有する。０．５ｋ
ｂおよび０．３ｋｂの両方のフラグメントを精製して、全ての残りのオリゴヌクレオチド
を除去した。これらの精製されたＤＮＡフラグメントを一緒に混合して、２つの最も外側
のオリゴヌクレオチド、ＡｆｌＩＩＩおよびＪＡＬ３０２を用いてＰＣＲによって増幅し
た。得られた０．８ｋｂのＡｆｌＩＩＩ／ＰｓｔＩフラグメントは、プラスミドｐＢＴ２
１５０由来の８．４ｋｂのＮｃｏＩ／ＰｓｔＩフラグメントに引き続きクローニングした
。得られたプラスミドｐＬＳＢ１８０６によって、Ｕ５コートタンパク質の１５５位置（
最後の４つのアミノ酸の前）での、ＮｃｏＩおよびＮｇｏＭＩＶオーバーハングの両方を
保有する、任意のペプチド配列の挿入が可能になる。
実施例７
２０のアミノ酸ＤＪ５ペプチドを提示するコートタンパク質融合物の構築
最初の５つのＤＪ５タンパク質融合構築物は、表８にまとめる。これらの構築物のうち
４つは、ＴＭＶのＵ１株を使用した。２０アミノ酸ＤＪ５ペプチド（ＶＨＱＡＮＰＲＧＳ
ＡＧＰＣＣＴＰＴＫＭＳ；配列番号８）は、コートタンパク質の表面露出されたＮ末端お
よびＣ末端上に、そしてアミノ酸６５（Ａｓｐ）および６６（Ｓｅｒ）の付随する欠失を
伴う、アミノ酸６４（Ｐｒｏ）と６７（Ａｓｐ）との間の表面露出された「６０ｓ」ルー
プ内で融合された。最終のＵ１株融合物において、エピトープは、コートタンパク質のＣ
末端の４アミノ酸に対して内部に位置した（ＧＰＡＴ位置）。１つのＵ５株コートタンパ
ク質融合物について、エピトープがまた、Ｃ末端の４つのアミノ酸に対して内部に位置し
た（ＴＰＡＴ位置）。
Figure 2011024590
これらの５つの位置に、すなわち、実施例６に記載される５つのプラスミドに２０アミ
ノ酸のＤＪ５エピトープを導入するために、１セットのオリゴヌクレオチドを図６Ａに例
示されるとおり設計した。プラスミドｐＬＳＢ−ＦＶ１、ｐＬＳＢ−ＦＶ２、ｐＬＳＢ−
ＦＶ３、ｐＬＳＢ−ＦＶ４およびｐＬＳＢ−ＦＶ５を生成するために、２０アミノ酸のＤ
Ｊ５ペプチドコートタンパク質融合物のクローニングに使用したフォワードおよびリバー
スのオリゴヌクレオチドの配列を、関連の配列番号とともに、下の表９に示す。
Figure 2011024590
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍのコドン利用のデータベースが、例えば、本明細
書において参照によって援用される、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ
／ｃｏｄｏｎでインターネット上で見出されるように、そして図８Ａおよび図８Ｂに例示
されるように、当該分野で周知であって、表９のオリゴヌクレオチド（配列番号４５およ
び４６）を設計するために使用された。これによって、ＤＪ５（２０）ペプチドのコドン
最適化オリゴヌクレオチドが得られた。これらのオリゴヌクレオチドがアニーリングされ
た場合、それらは、二本鎖ＤＮＡフラグメントを生成し、これはそれぞれ、適切な５およ
び３の「ＣＡＴＧ」および「ＣＣＧＧ」というオーバーハングを伴った（実施例６で示さ
れるとおり）。次いで、これらのフラグメントを、表７に概説されるアクセプターベクタ
ーにクローニングした。この二本鎖ＤＮＡフラグメントの挿入は、種々のコートタンパク
質の状況でＤＪ５（２０）ペプチドの位置に生じた。
フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドをアニーリングするために、各々のオリ
ゴヌクレオチドの１００ピコモルを１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で合わせて
、水で最終容積２０μＬに調節した。このオリゴヌクレオチド混合物を、３分間９５℃ま
で加熱して、引き続き１秒あたり０．１℃の速度で徐々に３０℃まで冷却した。この反応
物を３０℃で保持して、８０μＬの水を各々のチューブに添加した。各々のライゲーショ
ン反応のために、１μＬのアニーリングされたオリゴヌクレオチド混合物（各々のオリゴ
ヌクレオチドの１ピコモルを含有）を使用して、目的の４０ｎｇのプラスミドまたはベク
ター（ＮｃｏＩおよびＮｇｏＭＩＶ制限酵素（両方ともＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ）で切断）と、５μＬの２×Ｑｕｉｃｋライゲーション緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ ｂｉｏｌａｂｓ）および０．５μＬのＱｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ ｂｉｏｌａｂｓ）と一緒に合わせた。このライゲーション反応容積は、１
０μＬに調節して、室温で５分のインキュベーションの後に、２μＬの反応物を１．５ｍ
Ｌの微量遠心管に移して、氷上で冷却した。この微量遠心管に、４０μＬのＤＨ５ａコン
ピテント・セル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉａのＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標））を添加して、細胞／ライゲーシ
ョン反応混合物を氷上で３０分間インキュベートした。次いで、その細胞に３７℃で２分
間熱ショックを与え、その微量遠心管を直ちに氷に戻した。９５０μＬのＳＯＣ培地（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）をこの微量遠心管に加えて、これにキャップをして、
２００ｒｐｍで水平に、そして３７℃で１時間振盪した。この細胞を、１００ｍｇ／Ｌの
アンピシリンを含有するＬｕｒｉａブロス（ＬＢ）アガープレート（１プレートあたり５
０または１００μＬ）上にプレートし、そして３７℃で一晩インキュベートした。単一の
コロニーを選択して、２ｍＬの一晩培養物を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有する
ＬＢ培地中で増殖させた。プラスミドをＤＨ５ａ細胞から精製して、配列決定し、２０ア
ミノ酸ＤＪ５エピトープの配列の存在を確認した。出発ベクターと種々の挿入部位に２０
アミノ酸のＤＪ５エピトープを含む最終のベクターとの間の対応を表１０にまとめる。表
１１は、２０アミノ酸のＤＪ５ペプチドを提示する翻訳されたコートタンパク質融合物の
最終アミノ酸配列、およびそれらの関連する配列番号を示す。
Figure 2011024590
。
実施例８
ＤＪ５ペプチドの１２アミノ酸のＮ末端領域を提示するコートタンパク質融合物の構築
２つのさらなるＤＪ５由来コートタンパク質融合構築物を下の表１２にまとめているが
、その両方ともＴＭＶのＵ１株を使用した。この融合物は、コートタンパク質の表面露出
したＮ末端に融合されるか、またはコートタンパク質のＣ末端の４アミノ酸（ＧＰＡＴ位
置）に対して内部に配置されたＤＪ５ペプチドの１２アミノ酸のＮ末端領域（ＶＨＱＡＮ
ＰＲＧＳＡＧＰ；配列番号４４）を提示した。表１２は、植物中でＤＪ５ペプチドの１２
アミノ酸のＮ末端領域を提示する組み換えビリオンを発現するために用いたコートタンパ
ク質融合ベクターを示す。
Figure 2011024590
Figure 2011024590
これらの２つの位置に１２アミノ酸のエピトープ（１２マー）を導入するために、１セ
ットの２つのオリゴヌクレオチドを設計して、その配列を下の表１３に、それに関する配
列番号とともに示した。フォワードオリゴヌクレオチドおよびリバースオリゴヌクレオチ
ドをアニーリングするためには、実施例７に概説される手順に従った。各々のライゲーシ
ョン反応については、１ピコモルの各々のオリゴヌクレオチドを含有する１μＬのアニー
リングされたオリゴヌクレオチド混合物を使用した。これを目的のプラスミド（ＮｃｏＩ
およびＮｇｏｍＩＶ制限酵素で切断）と組み合わせて、そのライゲーション反応プロトコ
ールは、化学的にコンピテントなＤＨ５ａ細胞へのその形質転換とともに、前出の実施例
７に詳細であるとおりであった。下の表１３では、プラスミドｐＬＳＢ−ＦＶ６およびｐ
ＬＳＢ−ＦＶ７を生成するための、ＤＪ５ペプチドの１２アミノ酸のＮ末端領域からなる
コートタンパク質融合物のクローニングにおいて使用したフォワードおよびリバースプラ
イマーを示す。
Figure 2011024590
細胞を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有するＬＢアガープレート（１プレートあ
たり５０または１００μＬ）上にプレートして、３７℃で一晩インキュベートした。単一
のコロニーを選択して、２ｍＬの一晩培養物を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有す
るＬＢ培地中で増殖させた。このプラスミドをＤＨ５ａ細胞から精製し、そして配列決定
して、１２アミノ酸のＤＪ５由来エピトープ配列の存在を確認した。出発ベクターと、２
つの選択挿入部位で１２アミノ酸のＤＪ５由来エピトープを含む最終のベクターとの間の
対応を、下の表１４にまとめる。下の表１５は、ＤＪ５ペプチドの１２アミノ酸のＮ末端
領域を提示する翻訳されたコートタンパク質融合物の最終アミノ酸配列、およびそれらの
関連の配列番号を示す。
Figure 2011024590
Figure 2011024590
。
実施例９
ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ３、ＴＭＶ−ＦＶ４およびＴＭＶ−Ｆ
Ｖ５の生成
ウイルスＴＭＶ−ＦＶ１は、プラスミドｐＬＳＢ−ＦＶ１の転写によって生成した。感
染性転写物は、製造業者の指示に従って、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ａｍｂｉｏｎ）で
の転写反応から合成した。アガロースゲル電気泳動による転写完全性の確認後、ＲＮＡ転
写物を、研磨溶液（ピロリン酸ナトリウムを含むグリシン／リン酸塩緩衝液中に懸濁した
ベントナイト（ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）／セルライト混合物）と合わせて、これを用いて、
２３〜２８日齢の植物のＮｉｃｏｔｉａｎｓ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉に接種した。
接種の約５〜１３日後、感染の重篤度に応じて、組み換えウイルスの浸透移行性の動きを
、ウイルスを含む葉でのモザイク表現型によって、植物組織中で可視化した。浸透移行性
感染した組織を、ウイルス抽出および精製のために回収した。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅ
ｎｔｈａｍｉａｎａ以外の別の宿主植物が、ＴＭＶ−ＦＶ１の生成で使用されてもよいと
いうことに注目すべきである。例えば、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｅｘｃｅｌｓｉａｎａまた
はＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍは、２つの可能な別の植物宿主を示す。後の２つ
の宿主については、組織を、ウイルスの浸透移行伝播後に、接種後２．５〜５週で回収す
る。
ＴＭＶ−ＦＶ２ウイルスを生成するために、転写物をプラスミドｐＬＳＢ−ＦＶ２から
生成して、植物に接種して、ウイルスＴＭＶ−ＦＶ１の生成のために記載されたのと同様
の方式で回収した組織を浸透移行性に感染させた。
ＴＭＶ−ＦＶ３ウイルスを生成するために、転写物をプラスミドｐＬＳＢ−ＦＶ３から
生成して、植物に接種して、ウイルスＴＭＶ−ＦＶ１の生成のために記載されたのと同様
の方式で回収した組織を浸透移行性に感染させた。
ＴＭＶ−ＦＶ４ウイルスを生成するために、転写物をプラスミドｐＬＳＢ−ＦＶ４から
生成して、植物に接種して、ウイルスＴＭＶ−ＦＶ１の生成のために記載されたのと同様
の方式で回収した組織を浸透移行性に感染させた。
ＴＭＶ−ＦＶ５ウイルスを生成するために、転写物をプラスミドｐＬＳＢ−ＦＶ５から
生成して、植物に接種して、ウイルスＴＭＶ−ＦＶ１の生成のために記載されたのと同様
の方式で回収した組織を浸透移行性に感染させた。
実施例１０
ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ３、ＴＭＶ−ＦＶ４およびＴＭＶ−Ｆ
Ｖ５の抽出および精製
組み換えウイルスＴＭＶは、回収直後に感染した植物組織から抽出され得る。あるいは
、組織は、抽出を行う前に、４℃で２時間〜１４日間、または−２０℃〜−８０℃（数日
〜数ヶ月間）保管されてもよい。組織はまた、組織分解を補助するために、抽出前に急速
に凍結されてもよい。
感染した植物組織からの組み換えＴＭＶウイルスの精製のためにはいくつかの手順が証
明されている。例えば、Ｇａｒｇｅｒら（米国特許第６，０３３，８９５号、同第６，０
３７，４５６号および同第６，３０３，７７９号）およびＰｏｇｕｅら（参照によって本
明細書に援用される、米国特許第６，７４０，７４０号および同第６，７３０，３０６号
）は、感染した組織の抽出後に得られた均質な「グリーン・ジュース（ｇｒｅｅｎ ｊｕ
ｉｃｅ）」のｐＨ調節および熱処理に基づく方法を開示している。Ｐｏｇｕｅらはまた、
植物宿主タンパク質および組み換えＴＭＶの分離を補助するポリエチレンイミン（「ＰＥ
Ｉ」）の使用に基づく手順を開示している。抽出および処理の間のエピトープ安定性を改
良する（すなわち、タンパク質分解による分解を最小限にする）、そして組み換えビリオ
ンの溶解度を改良するように設計された、これらの手順およびそれらの改変が、ウイルス
ＴＭＶ−ＦＶ１の精製、ＴＭＶ−ＦＶ２の精製、ＴＭＶ−ＦＶ３の精製、ＴＭＶ−ＦＶ４
の精製、およびＴＭＶ−ＦＶ５の精製において用いられた。
Ａ．植物組織からのＴＭＶ−ＦＶ１融合ＶＣＰの精製
ＴＭＶ−Ｆ１は、以下のように植物組織から精製した。浸透移行性に感染された植物組
織（葉および柄）を回収して、冷却した抽出緩衝液ＥＢ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８
、０．８６Ｍの塩化ナトリウム、０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１０
０）と合わせて、そこに０．０４％（ｗ／ｖ）のメタ重亜硫酸ナトリウムを、緩衝液の容
積（ｍＬ）対組織量（ｇ）の比が２：１で添加した。植物組織および抽出緩衝液は、１Ｌ
のＷａｒｉｎｇ（登録商標）ブレンダー中で１分間ホモジナイズして、エーレンマイヤー
フラスコに移して、さらにＰｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓ
ｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて１分間ホモジナイズした。
このホモジネートを、４層のチーズクロスを通過させて線維を除き、植物抽出物を得て
、これを本明細書において以降では「グリーン・ジュース」と呼ぶ。このグリーン・ジュ
ースを遠心分離ボトルに移して、１０，０００Ｇで１０分間遠心分離して、その上清を破
棄した。不溶性であったＴＭＶ−ＦＶ１融合ＶＣＰのほとんどは、ペレットとして存在し
た。そのペレットは、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）の補助（１分のホモジナイゼーショ
ン）で、抽出緩衝液ＥＢ中においてもとのグリーン・ジュースの容積に再懸濁した。Ｐｏ
ｌｙｔｒｏｎ（登録商標）処置後、再懸濁したペレットを遠心分離ボトルに移して、１０
，０００×Ｇで１０分間遠心分離して、その上清を廃棄した。この工程：抽出緩衝液ＥＢ
中のペレット再懸濁、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）ホモジナイゼーションおよび１０，
０００×Ｇで１０分間の遠心分離は、さらに２回繰り返した。これらの反復工程の目的は
、植物由来のタンパク質および不溶性のＴＭＶ ＤＪ５コートタンパク質融合物からの色
素の分離をもたらすことであり、これは、比較的高い塩化ナトリウム濃度および緩衝液Ｅ
Ｂ中の界面活性剤の存在によって容易になった。
白から淡褐色のペレット得るために、植物由来の全ての色素を除去するために必要な繰
り返しの回数は、回収された組織の年齢および発現されているＴＭＶコートタンパク質融
合物に依存し得る。
緑色の宿主由来色素が、ペレットに会合したままである場合、ＴＭＶコートタンパク質
融合物含有ペレットに対するさらなる洗浄を、高いｐＨの緩衝液、例えば、０．２％（ｖ
／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００および０．０４％（ｗ／ｖ）のメタ重亜硫酸
ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリエチルアミン（緩衝液Ｂ１）を使用して行ってもよ
い。ＴＭＶ−ＦＶ１については、これらのさらなるペレット洗浄を行った。特に、３回の
緩衝液ＥＢ洗浄後に得たペレットを、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）の補助（１分のホモ
ジナイゼーション）の補助で緩衝液Ｂ１中でもとのグリーン・ジュース溶液に再懸濁し、
次いで、遠心分離ボトルに移して、１０，０００×Ｇで１０分間遠心分離し、その上清を
破棄した。このペレットをさらなる緩衝液Ｂ１洗浄に供して、次いで、その得られたペレ
ットを再懸濁し、この時、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）の補助で、１×リン酸緩衝化生
理食塩水（「ＰＢＳ」），ｐＨ７．４のほぼもとのグリーン・ジュース容積中に再懸濁し
て、１０，０００×Ｇで１０分間遠心分離して、その上清を破棄した。このペレットのＰ
ＢＳ洗浄を繰り返して、その最終ペレットを１×ＰＢＳのもとのグリーン・ジュース容積
のほぼ１０分の一に再懸濁した。２回のＰＢＳ洗浄の目的は、ＴＭＶ ＤＪ５コートタン
パク質融合物含有ペレットから残りの界面活性剤を除去すること、そして最終のＴＭＶコ
ートタンパク質融合調製物が天然のｐＨに近いことを確実にすることであった。
１×ＰＢＳに再懸濁した、グリーン・ジュースのアリコート、廃棄された上清および最
終のペレット調製物を、ＰＡＧＥ分析に供した。ＰＡＧＥ分析によって、この上清が含む
ＴＭＶ ＤＪ５ コートタンパク質融合物は最小量であったが、これは最終ペレット調製
物に存在する主なタンパク質種であったことが示された。逆に、植物由来宿主タンパク質
のほとんどが、廃棄された上清に存在し、最終のペレットで検出された宿主タンパク質は
最小であった。ＴＭＶ−ＦＶ２の精製、ＴＭＶ−ＦＶ４の精製およびＴＭＶ−ＦＶ５の精
製に同じ手順を使用して、同じ結果を得た。
Ｂ．植物組織からのＴＭＶ−ＦＶ３融合ＶＣＰの精製
ＴＭＶ−ＦＶ３は、以下のように植物組織から精製された。浸透移行性に感染された葉
および柄の組織を、２：１という緩衝液（ｍＬ）対組織（ｇ）比で、冷却緩衝液ＥＢ１（
０．０４％（ｗ／ｖ）のメタ重亜硫酸ナトリウム）を含有する０．８６Ｍ塩化ナトリウム
）を用いて高い設定で１分間、Ｗａｒｉｎｇ（登録商標）ブレンダー中で浸軟させた。こ
の浸軟させた物質を４層のチーズクロスを通過させて、繊維性物質を除去した。得られた
グリーン・ジュースを、リン酸でｐＨ５．０に調節した。ｐＨ調節したグリーン・ジュー
スを４７℃に加熱して、この温度で５分間保持し、次いで１５℃に冷却した。熱処理した
グリーン・ジュースを６，０００×Ｇで３分間遠心分離して、２つの画分、上清Ｓ１およ
びペレットＰ１を得た。ペレットＰ１画分を、最初のグリーン・ジュースの容積の１／２
に等しい水の容積を用いて蒸留水に再懸濁した。再懸濁したペレットＰ１を、水酸化ナト
リウムを用いてｐＨ７．５に調節して、６，０００×Ｇで３分間遠心分離して、２つの画
分、上清Ｓ２およびペレットＰ２を得た。ウイルスは、両方の上清画分Ｓ１およびＳ２か
ら、４％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６，０００および４％（ｗ／ｖ
）の塩化ナトリウムの添加によって、沈殿させた。４℃でのインキュベーション（１時間
）の後、沈殿したウイルスを１０，０００×Ｇで１０分間の遠心分離によって回収した。
このウイルスペレットを１×ＰＢＳ，ｐＨ７．４に再懸濁して、１０，０００×Ｇで３分
間の遠心分離によって清澄化して、最終の清澄化されたＴＭＶ−ＦＶ３調製物を得た。
このグリーン・ジュースのアリコート、上清Ｓ１およびＳ２ならびに清澄化遠心の前後
の最終ウイルス調製物を、ＰＡＧＥ分析に供した。ＰＡＧＥ分析によって、主なコートタ
ンパク質バンドのほとんどが、上清Ｓ１に分配されたグリーン・ジュースに存在し、上清
Ｓ２には低レベルで存在したことが示された。上清Ｓ１および上清Ｓ２ならびに最終清澄
化遠心のＰＥＧ沈殿によって、ウイルスを、植物宿主タンパク質からさらに精製して、２
つの実質的に純粋なＴＭＶ−ＦＶ３ウイルス調製物を得た。回収されたＴＭＶ−ＦＶ３ウ
イルスのほとんどは、上清Ｓ１のＰＥＧ沈殿後に得られたペレットに存在した。ＴＭＶ−
ＦＶ３ウイルスのわずかな部分が、最終清澄化遠心によって、残りの植物宿主タンパク質
とともに除去された。
Ｃ．植物組織からのＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ４およびＴＭＶ−
ＦＶ５融合ＶＣＰの精製
ＴＭＶ−ＦＶ３について概説した手順（前出）を、他のＤＪ５エピトープＴＭＶコート
タンパク質融合物、すなわちＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ４およびＴ
ＭＶ−ＦＶ５にあてはめた。ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＢ−ＦＶ２およびＴＭＶ−ＦＶ４につ
いては、ＰＡＧＥ分析によって、コートタンパク質のバンドが最初のグリーン・ジュース
には存在したが、このバンドが、上清Ｓ１および上清Ｓ２の両方に存在しないこと、そし
てＴＭＶコートタンパク質融合物は、ＴＭＶ−ＦＶ３について概説された手順によって回
収されなかったことが示された。さらなる分析によって、ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ
２およびＴＭＶ−ＦＶ４は、不溶性であって、植物の色素およびタンパク質と一緒に、ペ
レットＰ２に存在することが示された。
不溶性のＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２およびＴＭＶ−ＦＶ４の融合タンパク質を植
物由来のタンパク質および色素から精製するために、ＴＭＶ−ＦＶ１について上で概説さ
れた手順を使用した。ＴＭＶ−ＦＶ５の場合は、ＴＭＶ−ＦＶ３について概説された手順
は最初には成功しなかった。新鮮に回収された感染した組織の抽出を行う場合、ホモジナ
イゼーションのためにＷａｒｉｎｇ（登録商標）ブレンダーを使用することで、処理の間
に生じる分解に起因して、回収された全長ＴＭＶ−ＦＶ５は最小であった。この手順を改
変することならびに乳鉢および乳棒で処理した凍結組織で開始して、その後にＰｏｌｙｔ
ｒｏｎ（登録商標）ホモジナイゼーションを行うことによって、上清Ｓ１には約３０〜４
０％の全長ＴＭＶ−ＦＶ５が存在した。これを、ＰＥＧ沈殿によってさらに濃縮し、そし
てこのＴＭＶ−ＦＶ５のうち１５〜１７％は、最終の清澄化遠心後に可溶性のままであっ
て、残りが清澄化ペレットに存在した。清澄化ペレットおよび清澄化されたウイルス調製
物の両方が、有意な量の植物宿主タンパク質を含み、これによって、最終生成物は低純度
で生じた。
これらの結果によって、出発組織状態（新鮮対凍結）および／または使用される組織分
解工程（単数または複数）が、エピトープの安定性にある役割を果たすことが示唆された
。
Ｄ．植物組織からのＴＭＶ−ＦＶ５融合ＶＣＰの最適化精製
ＴＭＶ−ＦＶ５は、前出のパートＣの精製方法で部分的な可溶性を示したので、さらな
る最適化をＴＭＶ−ＦＶ３手順で行って、最終ＴＭＶ−ＦＶ５ウイルス調製物の回収およ
び純度が改善され得るか否かを決定した。
凍結された、浸透移行性に感染された葉および柄の組織を、２容積の緩衝液ＥＢ１と合
わせて、乳棒および乳鉢で浸軟し、その後にＰｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）を用いてさら
にホモジナイゼーションを行った。この抽出物は、４層のチーズクロスを濾過させて、得
られたグリーン・ジュースを、リン酸でｐＨ５．０に調節した。このｐＨ調節したグリー
ン・ジュースを、６，０００×Ｇで３分間遠心分離して、２つの画分上清Ｓ１およびペレ
ットＰ１を得た、後者はさらに処理はしなかった。この上清Ｓ１を、水酸化ナトリウムの
添加によってｐＨ６に調節して、５％（ｗ／ｖ）の活性炭粉末（例えば、Ｎｕｃｈａｒグ
レードのＳＡ−２０またはＮｏｒｉｔグレードのＫＢ−ＦＦ）とともに４℃で１時間接触
させた。次いで、上清Ｓ１を含む活性炭を、水酸化ナトリウムでｐＨ８に調節して、３０
００×Ｇで１５分間遠心分離して、その活性炭を除いた。これに由来する上清を、進行さ
せて、４％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６，０００および４％（ｗ／
ｖ）の塩化ナトリウムの添加によってＴＭＶ−ＦＶ５を沈殿させた。４℃でのインキュベ
ーション（１時間）後に、沈殿したウイルスを、１０，０００×Ｇで１０分間の遠心分離
によって回収した。このウイルスペレットを、１×ＰＢＳ，ｐＨ７．４に再懸濁して、清
澄化遠心は行わなかった。
グリーン・ジュースのアリコート、種々の処理段階の上清Ｓ１、再懸濁したペレットＰ
１および最終ＴＭＶ−ＦＶ５調製物を、ＰＡＧＥ分析に供した。前に注記したとおり、グ
リーン・ジュースのコートタンパク質の約４０％が、植物の宿主タンパク質のかなりのレ
ベルとともにこの上清Ｓ１に存在したが、実質的にほとんどの緑色色素がペレットＰ１中
に分配していた。ｐＨ６での活性炭処理後、上清中の宿主タンパク質のレベルの実質的な
減少があり、ＴＭＶ−ＦＶ５の７０〜８０％が回収された。ｐＨ８の調節および活性炭を
除くための遠心分離でＴＭＶ−ＦＶ４の損失は最小限であった。上記のとおり、ｐＨ８の
上清からのＰＥＧ沈殿を行って、ＴＭＶ−ＶＦ５をさらに濃縮して、活性炭もｐＨの工程
も使用しない同じ手順から得たウイルスよりも満足な純度および顕著な改善を有する最終
ウイルス調製物を得た。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析およびウエスタンブロット分析（表
１６）を、精製された組み換えウイルスで行って、純度およびエピトープ免疫活性を評価
した。ウエスタンブロット分析については、ＧＤＦ８のプロ型に対して惹起されたヤギ抗
体を使用した。ヤギ＃６６１（Ｇｏａｔ＃６６１）と記されるこのポリクローナル抗体が
、インビトロのＧＤＦ８中和アッセイで中和抗体であることを確認した。ウエスタンブロ
ットはまた、ＰＶＡＳ １３５Ｄ（ＡＴＣＣコレクションから得た）と記された、野生型
ＴＭＶに対して惹起されたウサギ抗体で行った。下の表１６は、ＧＤＦ８中和ヤギ＃６６
１抗体、および抗ＴＮＶ抗体（ＰＶＡＳ−１３５Ｄ）を用いる、２０アミノ酸のＤＪ５ペ
プチド・ヤギ・コートタンパク質融合物の、ウエスタンブロットによる、溶解度、純度、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）プロフィールおよび反応性をまとめた。
Figure 2011024590
表１６に列挙された全ての組み換えＴＭＶ融合物は、９０％を超える純度まで首尾よく
精製された。ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２およびＴＭＶ−ＦＶ４の場合、精製された
ＴＭＶは不溶性であった。ＰＡＧＥによって分析した場合、特徴的なラダーパターンが、
３つのＵ１株融合物について観察された。１０〜２０％のＴｒｉｓ−グリシンゲルでは、
２０アミノ酸のＤＪ５ペプチドコートタンパク質融合物について期待されるとおり、最低
（単量体）のバンドが約２２ｋＤａで泳動した。この単量体の上のタンパク質のバンドは
、４５ｋＤａで泳動して、その上のタンパク質のバンドは６５〜７０ｋＤａで泳動した。
ウエスタンブロットによって、これらのバンドのほとんどが、ヤギ＃６６１抗体および抗
ＴＭＶ ＰＶＡＳ−１３５Ｄ抗体によって検出された（２００ｋＤａより大きい、極めて
高分子量のバンドは、ゲルからメンブレンへの移動が劣るために常には検出されなかった
）。観察された分子量をまとめると、これらの結果によって、さらなるバンドが、２０ア
ミノ酸のＤＪ５ペプチドコートタンパク質融合物の二量体、三量体およびさらに上の多量
体に相当することが示される。ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２およびＴＭＶ−ＦＶ４の
ＰＡＧＥ分析を還元剤の非存在下で行った場合、単量体の割合は減少しており、より高次
のオリゴマーの割合が観察可能なほど増大していた。これによって、２０アミノ酸のＤＪ
５ペプチドコートタンパク質融合物の間のジスルフィド架橋が存在したことが示唆される
。２０アミノ酸のＤＪ５ペプチドは、２つのシステイン残基を含み、これが、この観察さ
れたさらに高次のオリゴマーの形成に関与しているようである。ＴＭＶ−ＦＶ５について
は、最終のウイルス調製物は、部分的に可溶であって、ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッ
ト分析の両方で、ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２およびＴＭＶ−ＦＶ４と同じ、還元剤
依存性のオリゴマー結合パターンを示した。ＴＭＶ Ｕ５のわずかに改善された溶解度は
、Ｕ１株のコートタンパク質に代わるＵ５コートタンパク質の使用に起因し得る。表１５
に列挙されるシリーズからの唯一の可溶性のＴＭＶ融合物はＴＭＶ−ＦＶ３であって、こ
こでは２０アミノ酸のＤＪ５ペプチドが、Ｕ１株コートタンパク質に対するＮ末端融合物
として提示された。ＴＭＶ−ＦＶ３については、このコートタンパク質は、野性型Ｕ１コ
ートタンパク質と同様、ＰＡＧＥゲル上で約１８ｋＤａの質量で泳動した。これによって
、エピトープの短縮が示唆された。オリゴマーのラダーは観察されず、そしてウエスタン
ブロットによって、ＴＭＶ融合物は、抗ＴＭＶ ＰＶＡＳ １３５Ｄ抗体によって検出さ
れたが、ＧＤＦ８中和ヤギ＃６６１抗体によっては検出されなかった。ヤギ＃６６１抗体
との反応性のこの欠失によって、ＴＭＶ−ＦＶ３の場合、２０アミノ酸のＤＪ５ペプチド
融合物のいくつかまたは全ての短縮が支持される。
実施例１１
ＭＡＬＤＩによるＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ３、ＴＭＶ−ＦＶ４
およびＴＭＶ−ＦＶ５の特徴付け
ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析に加えて、ウイルス調製物を、マトリックス支
援レーザー脱離イオン化（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐ
ｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）−飛行時間（Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ）（ＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いて特徴付けた（表１７）。ＰＥＧ沈殿して、再懸濁したウイルス
調製物を、シナピン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｌ）溶液に希釈して、
この希釈は、ウイルス濃度に依存して１：１〜１：２０の範囲に希釈して、１〜１．５ｍ
ｇ／ｍＬの最終濃度を得た。シナピン酸を０．１％の水性トリフルオロ酢酸／アセトニト
リル（容積で７０／３０）中に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。シナピン酸処理したサ
ンプル（１．０μｌ）を、ステンレス鋼のＭＡＬＤＩプレート表面に加えて、室温で風乾
させた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルは、線形方式で作動するＰｅｒＳｅｐｔｉｖ
ｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＤＥ−ＰＲＯ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）で得た。３３７ｎｍ
で作動するパルス・レーザーを、イオン化のために遅発性の抽出方式で用いた。９０％の
格子電圧で２５ｋＶの加速電圧および０．１％のガイドワイヤ電圧を用いた。約１００の
スキャンを行って、２，０００という低質量ゲートで質量範囲２，０００〜１５６，００
０Ｄａにまたがって平均した。イオン原および鏡面圧は、それぞれ約１．２×１０−７お
よび１．６×１０−７Ｔｏｒｒであった。全てのスペクトルは、標準としてウマのアポミ
オグロビン（１６，９５２Ｄａ）およびインスリン（５７３４Ｄａ）を用いて２ポイント
・フィットを用いて質量較正した。下の表１７は、２０アミノ酸のＤＪ５ペプチド融合物
について、ＭＡＬＤＩによる、理論的な分子量および実測の分子量のまとめを示す。
Figure 2011024590
ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ４およびＴＭＶ−ＦＶ５については、
コートタンパク質融合物のＮ末端Ｍｅｔ残基が除去されて、隣接するアミノ酸がアセチル
化される場合に、実測の分子量は、理論的な分子量とマッチした。ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭ
Ｖ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ４およびＴＭＶ−ＦＶ５上のインタクトな２０アミノ酸のＤＪ
５エピトープの存在を、表１６で報告された正の抗ＧＤＦ８ウエスタンブロットと一緒に
すれば、これらのＴＭＶ融合物の４つ全てが可能性のあるワクチン候補物であったことが
確認された。Ｎ末端融合のために、１７，７４５Ｄａという質量のＴＭＶ−ＦＶ３を得て
、これによって、複数の短縮可能性を代表した。ＴＭＶ−ＦＶ３のトリプシン消化物に対
して液体クロマトグラフィーを行い、タンデム型質量分析により、解像されたペプチドフ
ラグメントの分析を行うことによって、ＴＭＶ−ＦＶ３のＣ末端がインタクトであること
、そしてＤＪ５エピトープが切断されて、最後のＣ末端セリンのみが残り、これがアセチ
ル化されたことが確認された。この融合物では、２０アミノ酸のＤＪ５エピトープを保持
できず、そして抗ＧＤＦ８ヤギ＃６６１抗体によるウエスタンブロットでは検出されなか
ったので、これは、ワクチン候補物としてはさらに追及しなかった。ＴＭＶ−ＦＶ３がＤ
Ｊ５エピトープを欠く質量分析およびＰＡＧＥ分析による単一のバンドとしてのその泳動
（表１６）によって確認して、ＤＪ５エピトープ内のアミノ酸残基が、架橋およびより高
次のオリゴマー形成を担っていたことが示される。上記で示されるとおり、ＤＪ５エピト
ープ内の２つのシステインは、この架橋化に関与する可能性の最も高いアミノ酸であると
考えられた。
実施例１２
ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７の抽出および精製
精製され（実施例１０を参照のこと）、そして質量スペクトルによって特徴付けられた
（実施例１１）５つの２０アミノ酸のＤＪ５ペプチド融合物のうち４つが、可能性のある
ワクチン候補物、すなわち、ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ４およびＴ
ＭＶ−ＦＶ５として特定された。しかし、これらの４つのＴＭＶ融合物は、不溶性であっ
た。ＴＭＶ融合物の不溶性は、コートタンパク質の架橋を生じた、２０アミノ酸のＤＪ５
ペプチドの存在と相関していたので、オリゴマー形成は、ＴＭＶ融合の不溶性に関連して
いたという仮説がなされた。さらに、ＤＪ５ペプチドに存在する２つのシステインは、こ
の架橋を担うと考えられ、そのためこれらの２つの残基が排除された２つの新規な構築物
が提唱された。２つの新規な構築物ｐＬＳＢ−ＦＶ６およびｐＬＳＢ−ＦＶ７は、Ｕ１コ
ートタンパク質に対して、それぞれＮ末端およびＧＰＡＴ融合物として、ＤＪ５ペプチド
のＮ末端の１２アミノ酸を提示するように設計した。
実施例１０に挙げた同じ位置は、抽出の前の組織回収および貯蔵に関して、ＴＭＶ−Ｆ
Ｖ６およびＴＭＶ−ＦＶ７にもあてはまる。前出の実施例１０に注記されるとおり、感染
した植物組織からの組み換えＴＭＶウイルスの精製についてはいくつかの手順が実証され
ている。抽出および処理の間のエピトープ安定性を改良する（すなわち、タンパク質分解
による分解を最小限にする）、そしてビリオンの溶解度を改善するように設計された、こ
れらの手順およびそれらの改変を、ウイルスＴＭＶ−ＦＶ６の精製、およびＴＭＶ−ＦＶ
７の精製において用いた。
ＴＭＶ−ＦＶ７については、実施例１０においてＴＭＶ−ＦＶ３について概説した手順
を、新鮮に回収した、浸透移行性に感染した植物組織から開始して使用した。処理中のサ
ンプルおよび最終の清澄化ウイルス調製物のＰＡＧＥ分析によって、上清Ｓ１に分配され
たグリーン・ジュースにはＴＭＶ−ＦＶ７の約８０％が存在し、残りは上清Ｓ２に存在し
たことが示された。上清Ｓ１のみをＰＥＧ沈殿およびその後の最終清澄化遠心のために前
にとって、この遠心ではある程度の残りの宿主タンパク質を沈殿させ、精製されたＴＭＶ
−ＦＶ７のほとんどが可溶性のまま残った。
実施例１０のＴＭＶ−ＦＶ３について概説した手順を、ＴＭＶ−ＦＶ６の精製のために
使用して、新鮮に回収した組織から出発したとき、上清Ｓ１には極低レベルの生成物しか
存在せず、ここではＴＭＶ−ＦＶ６のほとんどがペレットＰ２と会合していた。次いで、
このプロトコールを改変して、その結果、浸透移行性に感染した組織を抽出の前に凍結さ
せ、そして組織浸軟を、乳鉢および乳棒の補助で行った。これらの変更したＰＡＧＥ分析
によって、ＴＭＶ−ＦＶのうち約３０％が上清Ｓ１に分配されて、残りは、上清Ｓ２およ
びペレットＰ２において検出されたことが示された。上清Ｓ１は、前出の実施例１０に記
載されたとおりＰＥＧ沈殿させて、濃縮したウイルスを、清澄化遠心に供した。清澄化遠
心ペレットに分配されたＴＭＶ−ＦＶ６、およびＰＡＧＥ分析によって、植物宿主タンパ
ク質の混入が最小限であることが示された。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析、およびウエスタンブロット分析（
表１８）を、精製された組み換えウイルスで行って純度を評価した。ウエスタンブロット
分析については、ＧＤＦ８のプロ型に対して惹起されたヤギ抗体を使用した。この抗体は
、ヤギ＃６６１と呼ばれ、インビトロでＧＤＦ８中和アッセイにおいて中和することが確
認された。ウエスタンブロットはまた、ＰＶＡＳ １３５Ｄと呼ばれる、野性型ＴＭＶに
対して惹起されたウサギ抗体［ＡＴＣＣコレクション（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＰＶＡＳ １３
５Ｄから入手］でも行った。下の表１８は、溶解度、純度、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＰＡＧＥ）プロフィールについてのデータ、ならびにＧＤＦ８中和ヤギ＃６６１抗
体および抗ＴＭＶ抗体（ＰＶＡＳ− １３５Ｄ）との反応性を、短縮された１２アミノ酸
のＤＪ５ペプチドコートタンパク質融合物について、ウエスタンブロットによって示す。
Figure 2011024590
表１８に列挙される組み換えＴＭＶ融合物は両方とも、９０％より大きい純度まで首尾
よく精製された。ＴＭＶ−ＦＶ６の場合は、最終の精製されたウイルスは部分的に可溶で
あったが、ＴＭＶ−ＦＶ７は完全に可溶性であった。ＰＡＧＥによって分析した場合、Ｔ
ＭＶ融合物の両方とも単一のバンドとして泳動して、これらのコートコートタンパク質融
合物は、抗ＴＭＶ ＰＶＡＳ−１３５および抗ＧＤＦ８ヤギ＃６６１抗体の両方によって
検出された。最小またはそれほど高くない分子量の種は、ＰＡＧＥまたはウエスタンブロ
ットによって検出され、このことは、コートタンパク質架橋において２つのＤＪ５エピト
ープシステインによって果たされる仮説の役割を支持した。観察された改善された溶解度
によって、また、重合化は組み換えＴＭＶビリオンの高分子会合を担っていたことも示さ
れる。
実施例１３
ＭＡＬＤＩによるＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７の特徴づけ
ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析に加えて、ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ
７ウイルスの調製物は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓ
ｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）−飛行時間（
Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ）（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いて特徴付けた（表１９）
。ＰＥＧ沈殿して、シナピン酸に再懸濁したウイルスの調製およびスポッティングは、実
施例１１に概説したとおりであった。ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄ
Ｅ−ＰＲＯ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）で得たＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルはまた、質量
標準としてウマアポミオグロビンおよびインスリンを用いて、実施例１１に記載されるよ
うに行った。下の表１９は、短縮された１２アミノ酸ＤＪ５ペプチド融合物について、Ｍ
ＡＬＤＩによる、理論的および実測された分子量のまとめを示す。
Figure 2011024590
ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７の両方について、実測の分子量は、コートタンパ
ク質の融合物のＮ末端Ｍｅｔ残基が除去され、そして隣接するアミノ酸がアセチル化され
た場合について、理論的な分子量とマッチした。ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７上
のインタクトな１２アミノ酸のＤＪ５エピトープの存在を、表１８に報告された正の抗Ｇ
ＤＦ８ウエスタンブロットのデータとまとめると、これらのＴＭＶ融合物が両方とも潜在
的なワクチン候補物であることが確認された。
実施例１４
ＴＭＶ−ＦＶ５、ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７のＥＬＩＳＡによる特徴付け
ウエスタンブロットによる免疫分析に加えて、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ
）をまた、可溶性および部分的に可溶性のＤＪ５ペプチド融合物、すなわちＴＭＶ−ＦＶ
５、ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７を用いて行った。ＴＭＶ融合物は、抗体との接
触前には変性されないので、ＥＬＩＳＡによって、アセンブルされた組み換えビリオンの
状況ではエピトープの認識および接触性の評価が可能になる。ＥＬＩＳＡは２つの形式で
行った；ＥＬＩＳＡプレート上にＴＭＶ融合物をコーティングすることによって、および
抗ＴＭＶ ＰＶＡＳ−１３５Ｄ抗体を用いてサンドイッチ形式で組み換えＴＭＶ融合物を
提示することによって。組み換えＴＭＶ融合物の検出のためには３つの抗体を使用した：
−ヤギ（Ｇｏａｔ）＃６６１。このヤギポリクローナル抗体は、精製された組み換えＧ
ＤＦ８プロホルモン（実施例２を参照のこと）ＧＤＦ８に対して惹起され、そしてインビ
トロのＧＤＦ８中和アッセイにおいて中和することが確認された（実施例３を参照のこと
）。
−ウサギ（Ｒａｂｂｉｔ）＃１２８６。このウサギポリクローナル抗体は、２０アミノ
酸のＤＪ５ペプチド（配列番号８）のキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）
結合体に対して惹起され、ＥＬＩＳＡ形式ではこのペプチドを認識し得るが、インビトロ
においてＧＤＦ８中和することはできなかった。
−ラット（Ｒａｔ）ＭＡＢ７８８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．；Ｍｉｎｎｅａ
ｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。このモノクローナル抗マウスＧＤＦ８抗体は、ハイブリドーマから
精製され、このハイブリドーマは、精製されたＮＳＯ由来組み換えマウスＧＤＦ８で免疫
されたラットから得られたＢ細胞とのマウス骨髄腫の融合から生じた。このモノクローナ
ル抗体は、マウスＧＤＦ８の生物活性を中和できた。
間接的なＥＬＩＳＡのためには、組み換えＴＭＶ融合物ＴＭＶ−ＦＶ５、ＴＭＶ−ＦＶ
６またはＴＭＶ−ＦＶ７を、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で希釈して、これ
を用いて、９６ウェルのマイクロタイタープレート（ＭａｘＳｏｒｂ，Ｎｕｎｃ）を４℃
で一晩（１ウェルあたり５０μＬ）コーティングした。最大２００ｎｇの標的抗原を、２
倍連続希釈を行ってコーティングした。コントロールとしてＧＤＦ８プロホルモン（実施
例１を参照のこと）を使用して、１ウェルあたり最大１００ｎｇとした。２倍連続希釈は
また、ＧＤＦ８プロホルモンを用いて行った。コーティング溶液を除去して、プレートを
５％（ｗ／ｖ）の脂肪粉乳を含有する１×ＴＢＳＴ緩衝液（ＴＷＥＥＮ（商標）２０によ
るＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水）を用いて室温で１〜２時間ブロックした（１ウェルあたり
２００μＬのブロッキング溶液）。このウェルを１×ＴＢＳＴを用いて２回洗浄して、そ
して０．５％（ｗ／ｖ）の脂肪粉乳を含む１×ＴＢＳＴ中で希釈した５０μｌの抗体（ヤ
ギ＃６６１、ラットＭＡＢ７８８またはウサギ＃１２８６）を１ウェルあたりに添加した
。全ての抗体は、ウサギ＃１２８６以外は１：１０００の希釈で使用し、この抗体は１：
１００で使用した。一次抗体との室温での１時間のインキュベーション後に、プレートを
１×ＴＢＳＴで５回洗浄して、５０μＬの適切なセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）結合体化二次抗体を、０．５％（ｗ／ｖ）の脂肪粉乳を含有する１×ＴＢＳＴ中で１
：１０，０００の希釈で添加した。このプレートを室温で１時間二次抗体とともにインキ
ュベートして、１×ＴＢＳＴで５回洗浄して、１ウェルあたり５０μＬの３，３’，５，
５’−テトラメチルベジジン基質溶液を添加した。ＨＲＰ触媒反応を５〜２０分間進行さ
せて、１Ｎの硫酸の５０μLの添加によって停止させた。プレートの吸光度（ＯＤ）は、
９６ウェルプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）中で４５０ｎｍ
で読み取った。
二抗体サンドイッチ（ＤＡＳ）ＥＬＩＳＡのために、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９
．６）中で１：５００に希釈した５０μｌの抗ＴＭＶポリクローナル抗体ＰＶＡＳ−１３
５Ｄを用いて、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭａｘＳｏｒｂ，Ｎｕｎｃ）を４
℃で一晩コーティングした。このコーティング溶液を、取り出して、そのウェルを、５％
（ｗ／ｖ）脂肪粉乳を含有する２００μＬの１×ＴＢＳＴ緩衝液を用いて室温で１〜２時
間ブロックした。ブロッキング工程後に、このウェルを５回洗浄して、ＴＭＶ−ＦＶ５、
ＴＭＶ−ＦＶ６またはＴＭＶ−ＦＶ７を含有する５０μＬの組み換えＴＭＶビリオン溶液
を１ウェルあたりに添加した（１×ＴＢＳＴと０．２％（ｗ／ｖ）脂肪粉乳を緩衝液とし
て使用した）。最大１１ピコモルのコートタンパク質を１ウェルあたりに使用して、各々
のプレートには組み換えビリオンの２倍連続希釈を存在させた。コーティングされたＰＶ
ＡＳ−１３５Ｄ抗体によるＴＭＶビリオンの捕獲を可能にするために、プレートを室温で
１時間インキュベートした。過剰なＴＭＶビリオンは、１×ＴＢＳＴを用いてプレートを
５回洗浄することによって除去し、そして一次抗体（０．５％（ｗ／ｖ）脂肪粉乳を含有
する１×ＴＢＳＴ中で１：１０００希釈したヤギ＃６６１またはラットＭＡＳ７８８のい
ずれか）を、室温で１時間のインキュベーションの間に添加した。次いで、プレートを１
×ＴＢＳＴで５回洗浄して、５０μＬの適切なセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ
）結合体化二次抗体を０．５％（ｗ／ｖ）の脂肪粉乳含有する１×ＴＢＳＴ中で１：１０
，０００の希釈で添加した。そのプレートを、室温で１時間二次抗体とともにインキュベ
ートして、１×ＴＢＳＴを用いて５回洗浄し、そして１ウェルあたりに５０μｌの３，３
’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質溶液を添加した。ＨＲＰ触媒反応は、５〜２
０分間進行させて、５０μｌの１Ｎ硫酸の添加によって停止させた。このプレートの吸光
度を、４５０ｎｍで９６−ウェルプレートＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読みとった。サンドイッチＥＬＩＳＡも行って、ここ
ではラットＭＡＢ７８８抗体（１：１０００希釈）を捕獲抗体として使用した。これらの
ＥＬＩＳＡについて、使用した一次抗体は、ヤギ＃６６１抗体であった。これらのサンド
イッチＥＬＩＳＡはまた、１ウェルあたり１１ピコモルの最高濃度で存在したＧＤＦ８プ
ロホルモン陽性コントロールを含み、ここでは２倍階段希釈を行った。間接的ＥＬＩＳＡ
およびＤＡＳ ＥＬＩＳＡの両方についてのＥＬＩＳＡデータを下の表２０にまとめてお
り、これは、間接的および二抗体サンドイッチＥＬＩＳＡデータのまとめを示す。間接的
なＥＬＩＳＡではピコモルあたりの反応は、ＣＨＯ ＧＤＦ８プロホルモン陽性コントロ
ールに対して報告される。
Figure 2011024590
表２０について：＋＋＋＋は、ＧＤＦ８プロホルモンコントロールに匹敵する応答を示す
。使用した一次抗体を列挙する。サンドイッチＥＬＩＳＡについては、得られた最高の応
答は、ＦＶ７構築物であって、これを＋＋＋＋に設定した。他の融合物についてのデータ
は、これに対して報告される。Ｃ；捕獲抗体、１３５Ｄ；ＰＶＡＳ−１３５Ｄ抗ＴＭＶ
ＰＡｂ；１°、一次抗体。
直接ＥＬＩＳＡ形式で試験したＴＭＶ−ＦＶ５については、ウサギ＃１２８６抗体を検
出に使用した場合、ＧＤＦ８プロホルモンコントロールと同様の様式で融合物を滴定した
。対照的に、一次抗体としてヤギ＃６１１またはラットＭＡＢ７８８抗体を使用した場合
には最小の応答しか得られなかった。サンドイッチＥＬＩＳＡ方式では、応答はＴＭＶ−
ＦＶ７に比較して弱かった。しかし、捕獲のために使用したＰＶＳ−１３５Ｄ抗体は、Ｔ
ＭＶのＵ１株に対して惹起され、そしてＴＭＶ−ＦＶ５はＵ５株に基づくことに注意しな
ければならない。
１２アミノ酸のＤＪ５由来ペプチド融合物（ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７）の
両方を、直接ＥＬＩＳＡ形式で３つの抗ＧＤＦ８／ＤＪ５抗体のすべてによって検出し、
両方の融合物についての応答プロフィールは同様であって、１ピコモルあたりのＯＤ応答
は、ＴＭＶ−ＦＶ７についてよりもわずかに高かった。しかし、これは単に、この融合物
の溶解度の改善を反映し得る。ウサギ＃１２８６検出では、ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ
−ＦＶ７の両方に対する応答は、ＧＤＦ８プロホルモンコントロールに対して匹敵してい
た。ヤギ＃６６１およびラットＭＡｂの場合は、ＧＤＦ８プロホルモンコントロールに対
する応答は、２〜３倍高かった。二抗体サンドイッチＥＬＩＳＡについては、Ｎ末端融合
物は、全ての場合に示した応答が劣っていた；おそらく、その凝集状態から生じる捕獲が
劣ることに起因する。Ｃ末端（ＧＰＡＴ）融合物については、応答は、一次抗体としてヤ
ギ＃６６１およびラットＭＡＢ７８８の両方を用いて得られ、これは、ＰＶＡＳ−１３５
Ｄポリクローナルで捕獲されている。抗ＧＤＦ８捕獲および検出（ラットＭＡＢ７８８捕
獲およびヤギ＃６６１検出）では、ＴＭＶ−ＦＶ７が示した１ピコモルあたりのＯＤ応答
は、ＧＤＦ８プロホルモンコントロールよりも大きかった。これは、各々の捕獲されたロ
ッドが２０００コピーを超える反応性エピトープを示し、シグナル増幅を生じたという事
実を反映し得る。実施例１２で考察されたウエスタンブロットのデータと一緒にして、Ｅ
ＬＩＳＡデータによって、２０アミノ酸のＤＪ５エピトープの１２アミノ酸のＮ末端部分
は、全長ＧＤＦ８タンパク質に対して抗体を中和することによって認識され、従って実行
可能なワクチン候補物であると考えられるということが示される。
実施例１５
動物試験およびワクチン製造のためのＴＭＶコートタンパク質融合物の選択
表８および１２に詳細に示される、全部で７つの候補組み換えＴＭＶ ＤＪ５融合物を
、Ｎ．ｂｅｎｉｈａｍｉａｎａ中でのそれらの発現および２０アミノ酸のＤＪ５ペプチド
または全長のＧＤＦ８プロホルモンに対する一連の抗体に対する免疫反応性について評価
した。累積データに基づいて、下の表２１に列挙される構築物を、製造のために、動物の
一連のトライアルにおける試験のために、定量、滅菌および不活性化された組み換えビリ
オンの十分な量を生成するために、進行させた。
Figure 2011024590
この選択の背景の理由は以下のとおりであった。ＤＪ５ペプチドの１２アミノ酸Ｎ末端
領域を提示する融合物、すなわちＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７は、植物中での蓄
積に関して最も所望される特徴、抽出および精製を保有した。ウエスタンブロットおよび
ＥＬＩＳＡによる免疫反応性の分析によって、これらの改変したＤＪ５ペプチドＴＭＶ融
合物は、ＧＤＦ８を中和する、ヤギ＃６６１およびラットＭＡＢ７８８抗体によって認識
されることが実証されたので、両方ともワクチン製造のために進行させた。これらの２つ
のワクチンを完成するために、考慮した２０アミノ酸のＤＪ５融合物は、Ｎ末端（ＴＭＶ
−ＦＶ３）またはＧＰＡＴ／ＴＰＡＴ位置（ＴＭＶ−ＦＶ１およびＴＭＶ−ＦＶ５）のい
ずれかにエピトープを担持するものであった。ＴＭＶ−ＦＶ３の場合のエピトープ短縮に
起因して（実施例１０および１１を参照のこと）、ＴＭＶ−ＦＶ１およびＴＭＶ−ＦＶ５
を選択した。この選択によってまた、可溶性（ＴＭＶ−ＦＶ７）から部分的に可溶性（Ｔ
ＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ５）から不溶性（ＴＭＶ−ＦＶ１）までの種々の物理的
形態のワクチンを比較することが可能になる。
動物の使用のための４つのＴＭＶ ＤＪ５融合物の製造のために、使用した手順は、実
施例１０および実施例１２に概説したとおりであって、以下の改変を伴った。このプロセ
スの全ての段階で、注射用水（ＷＦＩ）を使用して、全ての試薬は、専用のストックから
であった。ウイルス調製物を処理するために用いた実験室ウエアはできるだけ、２２５℃
で最低６時間焼いた。これが不可能である場合、実験室ウエアは、１０％の次亜塩素酸ナ
トリウム溶液に２０分間浸漬して、ＷＦＩ中で徹底的にリンスして、１２１℃で２０分間
オートクレーブした。
最終の組み換えウイルスを、滅菌のリン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁した。この調製物
を、滅菌して、ＴＭＶゲノムＲＮＡを、二元性エチレンイミン（「ＢＥＩ」）で処理する
ことによって不活化した。要するに、０．１ＭのＢＥＩストック溶液を、最終濃度の５ｍ
ＭのＢＥＩに添加した。サンプルを、持続して混合しながら３７℃で４８時間インキュベ
ートした。４８時間後、ＢＥＩを３モル過剰のチオ硫酸ナトリウムの添加によって中和し
た。ＢＥＩ不活性化ＴＭＶ ＤＪ５融合調製物のタンパク質含量は、アミノ酸分析（ＡＡ
Ａ）によって確認し、ｐＨは、１０％（ｖ／ｖ）の５０ｍＭのリン酸２水素カリウム溶液
の添加によってほぼ７．４に調節し、そして調製物を、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水で１
ｍｇ／ｍＬに希釈して、その後に２ｍＬの滅菌ガラスバイアルにアリコートした。最終の
バイアル生成物を、下の実施例１６に概説されるようにリリース試験した。
実施例１６
動物試験のためのＴＭＶコートタンパク質融合ワクチンの特徴づけ
バイアルにいれたワクチンＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ５、ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴ
ＭＶ−ＦＶ７を、一連の試験に供して、同一性、純度、無菌性、ＴＭＶゲノムＲＮＡ不活
化および内毒素の非存在を確認した。使用したアッセイおよびリリースの基準は、下に簡
略にまとめる。
各々のワクチンの分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定して、リリース
のためには理論的なＭＷ±０．０５％内にあてはまらなければならない。全てのワクチン
を１６％のＴｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。電気泳動後に、ゲル
をクマーシー・ブリリアント・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌ
ｕｅ）で染色して、デンシトメトリーで分析した。ＴＭＶ ＤＪ５コートタンパク質融合
物のバンド（単数または複数）は、検出可能な総タンパク質の９０％以上を構成しなけれ
ばならない。各々のワクチンの同一性を、トリプシン消化ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法
によって確認した。少なくとも４つの固有の変更されていないトリプシン消化したペプチ
ドフラグメントの分子量は、対応する理論的な未同定のトリプシンのペプチドフラグメン
トの分子量±０．５に適合しなければならず、そしてトリプシンのペプチドフラグメント
は、ＤＪ５ペプチド融合物の完全性を確認しなければならない。ワクチンの最終タンパク
質濃度は、アミノ酸分析を用いて決定して、これによってまた、ＴＭＶ ＤＪ５融合物の
アミノ酸組成が得られた。溶液中のワクチンの外見は、視覚検査によって確認して、バイ
アルに入れられた生成物のｐＨは、較正されたｐＨ計（受容可能な範囲、ｐＨ７．４＋／
−０．４）を用いて標準的な方法によって決定した。
ＴＭＶの感染性は、局所病変宿主植物、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ｖａｒ．ｘａｎｔｈｉ，
「Ｇｌｕｒｋ」を用いて測定した。局所病変アッセイは、Ｇｌｕｒｋ植物で播種後４〜６
週間で行った。アッセイしたサンプルのうち１００μｌを、研磨剤として使用した炭化ケ
イ素を用いて葉ごとに接種した。サンプルを三連で泳動して、局所病変を接種の４〜６日
後にスコア付けした。リリースに必要であったのは局所病変の検出が１未満であることで
あった。生体負荷の決定のために１０μＬおよび１００μＬのサンプルを、ラミナー・フ
ローのフードの下で無菌技術を用いて、ＬＢ栄養寒天上にプレートした。このプレートを
反転させて、室温で４日間インキュベートさせた。コロニーの数を４日のインキュベーシ
ョン後に記録し、次いでプレートをさらに４日間、３３℃のインキュベーターに動かし、
２回目のスコア付けをした。リリースのために、コロニー形成単位は検出されてはならな
い。最終的に、バイアルに入れられたＴＭＶ ＤＪ５融合物の内毒素含量は、Ｌｉｍｕｌ
ｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）アッセイを用いて決定した。諸元を
満たすために、各々のワクチン用量は、１０ＥＵ以下の内毒素を送達すべきである。４つ
のワクチンについてのリリース試験の結果を下の表２２Ａおよび表２２Ｂにまとめる。
Figure 2011024590
Figure 2011024590
動物試験のために生成したワクチンロットの結果は以下のとおりであった。ＴＭＶ−Ｆ
Ｖ１については、１ｍｇ／ｍLという標的タンパク質濃度を有する、全部で２４のバイア
ルを調製した（１ｍＬ／バイアル）。還元条件下でのＰＡＧＥ分析によって、ＢＥＩ処理
後の精製されたワクチンに存在する単量体レベルが減少すると考えられた。これはおそら
く、ＢＥＩ不活性化で使用された高いｐＨ条件によって生じるジスルフィド結合形成の増
大に起因し得る。ＢＥＩ処理が融合物の抗原性に影響するか否かを確認するために、ウエ
スタンブロットを、以下の抗体；ＰＶＡＳ １３５Ｄ（抗ＴＭＶ）、ヤギ＃６６１、ウサ
ギ＃１２８６およびラットＭＡＢ７８８を用いてＢＥＩ処理前後の両方のサンプルで行っ
た。４つの抗体全てで観察されたプロフィールは、実質的に同一であって、ＢＥＩの前後
のサンプルは両方とも予想されるオリゴマーのラダーを含んだ。ＥＬＩＳＡは、精製され
た融合物の粒子性の性質のせいで行わなかった。バイアルに入れたＴＭＶ−ＦＶ１の質分
析を完了させて、リリースデータは、表２２Ａおよび表２２Ｂにまとめる。この融合物は
、リリース基準の全てを合格した。純度の場合には、これは、ＰＡＧＥゲルとウエスタン
ブロットのオリゴマーのプロフィールとの間の１対１の対応に基づいて、９０％より大き
いと見積もられた。しかし、正確な純度パーセントは、報告されていない。なぜなら、各
々の個々のバンドのトリプシン消化の確認は行われていないからである。
ＴＭＶ−ＦＶ５については、全部で９つのバイアルを、１ｍｇ／ｍＬという標的タンパ
ク質濃度で、調製した（１．４ｍＬ／バイアル）。融合物に対してＢＥＩ処理の決定的な
影響があったか否かを決定するために、検出のためにＧＤＦ８中和ラットＭＡＢ７８８を
用いてウエスタンブロットを行った。ＢＥＩ処理の前のサンプルについては、単一のバン
ドが観察された。しかし、ＢＥＩ処理後、ＢＥＩ処理の間のアルカリｐＨ条件の結果であ
り得るジスルフィド架橋の増大におそらく起因して、オリゴマーのラダーが存在した。ま
た、ＢＥＩ単量体種については、ウエスタンブロットによって二重線が証明された。ウエ
スタンブロットデータは、全長ＭＡＬＤＩデータと相関しており、これは、複数の短縮物
での生成物を示した。二重線の両方のバンドは、抗体に対して反応性であって、これは、
短縮された生成物がある程度の抗原性を保持したことを示唆している。直接ＥＬＩＳＡを
、３つの抗ＤＪ５／ＧＤＦ８抗体（ヤギ＃６６１、ウサギ＃１２８６およびラットＭＡＢ
７８８）および１つの抗ＴＭＶ抗体（ＰＶＡＳ １３５Ｄ）を用いてサンプル上で行った
。プレ−ＢＥＩサンプルは、ＢＥＩ処理した最終生成物よりも実質的に反応性であった。
これについて可能な説明は、ＴＭＶ融合物の架橋は、エピトープの接近性を減少させるか
、そして／またはビリオンの溶解度を減少させ、これがマイクロタイタープレート上のコ
ーティングレベルの低下を生じるということである。バイアルに入れられたＴＭＶ−ＦＶ
５の品質分析を終わらせて、リリースデータを表２２Ａおよび表２２Ｂにまとめる。純度
の場合には、これは、ＰＡＧＥゲルとウエスタンブロットのオリゴマーのプロフィールと
の間の１対１の対応に基づいて、９０％より大きいと見積もられた。しかし、正確な純度
パーセントは、報告されていない。なぜなら、各々の個々のバンドのトリプシン消化の確
認は行われていないからである。上で注記されたとおり、ＢＥＩ処理した最終生成物にお
ける短縮種は、ウエスタンブロットによって免疫反応性であった。さらに、ゲルおよび液
体のトリプシン質量マッピングによって、この短縮された種は、Ｃ末端の２つのアミノ酸
を除いてＤＪ５エピトープの全てを保持していたことが示された（ＭＳ）。従って、この
ワクチン候補物は、動物試験について進行させた。
ＴＭＶ−ＦＶ６については、全部で９つのバイアルを、１ｍｇ／ｍＬという標的タンパ
ク質濃度で、調製した（１．４ｍＬ／バイアル）。融合物に対してＢＥＩ処理の決定的な
影響があったか否かを決定するために、検出のためにＧＤＦ８中和ラットＭＡｂを用いて
、ＢＥＩの前後のサンプルに対してウエスタンブロットを行った。両方のサンプルについ
て、単一のバンドが観察された。直接のＥＬＩＳＡをまた、３つの抗ＤＪ５／ＧＤＦ８抗
体および１つの抗ＴＭＶ抗体を用いて行った。ＢＥＩの前後の両方のサンプルで同様のプ
ロフィールが観察された。ウエスタンブロットのデータとまとめて、これらの結果によっ
て、ＢＥＩ処理後のエピトープに対して決定的な改変はないことが示される。表２２Ａお
よび表２２Ｂは、バイアルに入れたＴＭＶ−ＦＶ６についての品質分析からのリリースデ
ータをまとめる。ワクチン生成物は、リリース基準の全てを通過し、そして動物試験へ進
めた。
ＴＭＶ−ＦＶ７については、全部で３２のバイアルを、１ｍｇ／ｍＬという標的タンパ
ク質濃度で、調製した（１ｍＬ／バイアル）。ＤＪ５融合物に対してＢＥＩ処理の決定的
な影響があったか否かを決定するために、以下の抗体を用いてウエスタンブロットを行っ
た；ＰＶＡＳ １３５Ｄ（抗ＴＭＶ）、ヤギ＃６６１、ウサギ＃１２８６およびラットＭ
ＡＢ７８８。ＢＥＩの前後の両方のサンプルを、４つの抗体全てによって検出して、融合
物は、単一のバンドとして泳動した。さらに、この融合物は可溶性であったので、直接捕
獲ＥＬＩＳＡおよび二抗体サンドイッチ（ＤＡＳ）ＥＬＩＳＡの両方を行って、ＢＥＩ処
理から生じる、エピトープに対する変更が、未変性のコートタンパク質およびアセンブリ
されたビリオンの状況で検出され得るか否かを決定した。ＣＨＯ由来ＧＤＦ８プロホルモ
ン（実施例１）を、正のコントロールとして使用した。ＤＡＳ ＥＬＩＳＡについては、
ほぼ同一のプロフィールが、ＢＥＩ処理の前後のサンプルの両方について得られ、このこ
とは、ＢＥＩ処理が生成物の抗原性に有する影響が最小限であることを示す。同様に、直
接の捕獲ＥＬＩＳＡについては、ＢＥＩ処理した生成物は、未処理の融合物に匹敵してお
り、４つの抗体のうち３つについては、ＢＥＩ処理後のサンプルは、わずかに高いＯＤ読
み取りを生じた。バイアルに入れられた生成物の品質分析を終わらせて、ＴＭＶ−ＦＶ７
は、リリース基準の全てを通過し（表２Ａおよび表２２Ｂ）、従って、動物試験へ進めた
。
実施例１７
４℃で６ヶ月の貯蔵でのＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ５、ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭ
Ｖ−ＦＶ７についての安定性研究
４つのＢＥＩ処理し、バイアルに入れられたＴＭＶ ＤＪ５融合物を６ヶ月の安定性研
究に供して、４℃での保管で候補ワクチンの完全性を評価した。６ヶ月の期間というのは
、動物研究でワクチンを評価する時間枠をカバーしていた。約１ヶ月の間隔で６つの時点
の全てで採取して、バイアルに入れたワクチンは、ＰＡＧＥゲル、ウエスタンブロットお
よびＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ質量分析法によって分析した。ウエスタンブロット分析について
は、抗ＧＤＦ８ヤギ＃６６１抗体を使用した。６ヶ月の時点の間のＰＡＧＥ分析およびウ
エスタンブロットのデータを表２３にまとめており、そして全ての時点についてのＭＡＬ
ＤＩ−Ｔｏｆ質量分析情報を表２４にまとめる。
詳細には、下の表２３は、４℃で保管したＤＪ５ペプチドのコートタンパク質融合物の
ＰＡＧＥ分析およびウエスタンブロット分析のまとめを提供する。このデータは、６ヶ月
の研究の最終時点についてである。
Figure 2011024590
ＴＭＶ−ＦＶ６、ＴＭＶ−ＦＶ７およびＴＭＶ−ＦＶ１については、ＰＡＧＥプロフィ
ールは、６ヶ月の安定性研究の経過にわたって維持された。同様にウエスタンブロットプ
ロフィールについて、リリースサンプルに対して逸脱は観察されなかった。ＰＡＧＥプロ
フィールに対する、ウエスタンブロットによって検出されたバンド数の相違は、より高分
子量のバンド（２００ｋＤａより大）に相当し、これは、膜にはあまり移動されない。Ｔ
ＭＶ−ＦＶ５の場合、単量体種は、実施例１６に注記されるようにリリースサンプル中で
二重であった。安定性研究の経過にまたがって、単量体の二重線におけるより低い分子量
種への段階的なシフトは、ＰＡＧＥ分析によって観察された。しかし、両方の単量体種と
も、分析の６ヶ月のウインドウにまたがってウエスタンブロットによる免疫反応性を保持
した。ＴＭＶ−ＦＶ５のより高分子量のオリゴマー種はまた、ウエスタンブロットによっ
て証明された。しかし、６ヶ月の時点の間、ＴＭＶ−ＦＶ５の推定上の二量体のみが、お
そらく移行が弱いことに起因して、ウエスタンブロットによって可視であった：４〜６の
バンドが代表的には検出された。
下の表２４は、ＭＷ ＭＡＬＤＩ分析をリリースサンプルについて（Ｒ）そしてＢＥＩ
処理してバイアルに入れられたワクチンについての安定性研究を通じて採取した６つのサ
ンプルについて示す。リリースサンプルについては、主なピークのみを報告する。
Figure 2011024590
質量分析の分析（表２４、上）によって、注記した改変を有する全長の種がＴＭＶ−Ｆ
Ｖ６およびＴＭＶ−ＦＶ７の両方について存在し、そしてコートタンパク質への１つのＢ
ＥＩの添加に相当する、さらなる大きいピークも欠失されたことが示された。これらの２
つの種は、安定性研究を通じて維持された。ＴＭＶ−ＦＶ１については、ほとんどのスペ
クトルにおける主要なピーク（時点３〜６）は、予想よりも約１７０Ｄａ大きかった。こ
れは、１つのコートタンパク質あたり４または５ＢＥＩ部分の付加に相当する。しかし、
ＴＭＶ−ＦＶ１サンプルのスペクトル量は劣っていたことに注意しなければならない。ｐ
ＬＳＢ−ＦＶ５の場合、最小の全長種は、１時点の後に検出された。観察された２つの主
な種は、１９１３０＋／−１００Ｄａおよび１７７１９Ｄａというおよその分子量を有し
た。ＴＭＶ−ＦＶ５についてのリリースサンプルは、正に同定された１９０３８Ｄａの種
を含み、そして２０アミノ酸のＤＪ５エピトープのほとんどを保有することが示された（
実施例１６）。１７７１９Ｄａの種は、ＴＭＶ Ｕ５よりもわずか２〜３アミノ酸大きい
種（１７，４８９Ｄａ，Ｍｅｔ切断）に相当し、従って、単量体二重線の低い方のバンド
には対応せず、これによって、これが１９，１３０＋／−１００Ｄａ種であることが示唆
される。ウエスタンブロットによれば、この１９．１ｋＤａの種は免疫反応性を保持して
いた。
全体として、このデータによって、ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−Ｆ
Ｖ７が、４℃の保管で少なくとも６ヶ月間安定であったことが示される。ＴＭＶ−ＦＶ５
の場合、分解が４℃での保管で生じ、１９．１ＫＤａというおよその分子量を有する主な
種が得られた。この短縮生成物は、保管で安定と考えられ、そしてウエスタンブロットの
データから、ＧＤＦ８中和ヤギ＃６６１抗体と免疫反応性であった。
実施例１８
ＧＤＦ８中和抗体に結合し得るＤＪ５ペプチド領域における洗練
ウエスタンブロット分析の経過の間に、ＧＤＦ８中和ラットモノクローナル抗体（ＭＡ
Ｂ７８８）は、Ｕ１コートタンパク質と強力に反応することが確認された。観察された応
答は、この融合物を並行に分析した場合、ＴＭＶ−ＦＶ７と匹敵すると思われた。対照的
に、これもＧＤＦ８中和であるヤギ＃６６１ポリクローナル血清は、Ｕ１コントロールと
は弱くしか反応しなかった。Ｕ５株コートタンパク質がウエスタンブロット分析に含まれ
た場合、ラットＭＡＢ７８８抗体では交差反応性は検出されなかった。この結果によって
、間接的なＥＬＩＳＡによるＵ１およびＵ５コートタンパク質に対するラットモノクロー
ナル抗体反応性の比較が促された（表２５）。このＥＬＩＳＡについては、ラットＭＡＢ
７８８を最初に１：２０に希釈した；Ｕ５コートタンパク質に対する交差反応性は検出さ
れず、このことは、ウエスタンブロットデータを支持しているが、Ｕ１コートタンパク質
は１：１６２０の終点希釈で検出された。ＴＭＶ ＤＪ５ペプチド融合物陽性コントロー
ル（ＴＭＶ−ＦＶ７）に対する応答は、３倍高かった。間接的なＥＬＩＳＡでは、ビリオ
ンは、ＥＬＩＳＡプレート表面に吸着され、これは、ウイルス構造のいくつかの破壊を生
じることが期待される工程である。
ラットＭＡＢ７８８の反応性における明確な相違は、ＴＭＶ Ｕ１とＴＭＶ−ＦＶ７と
の間でＥＬＩＳＡ形式で観察されたが、ウエスタンブロットによる反応性は匹敵していた
ので、ラットモノクローナル抗体によって検出された推定のＴＭＶ Ｕ１エピトープは、
ウイルス構造に対して内部であったと仮定された。この仮説を試験するために、二抗体サ
ンドイッチＥＬＩＳＡを行った（表２５）が、ここではＴＭＶ Ｕ１またはＴＭＶ−ＦＶ
７のいずれかが、抗ＴＭＶポリクローナル抗体による捕獲を通じてインタクトなビリオン
として提示された。吸着されたＴＭＶ Ｕ１に対するＥＬＩＳＡとは対照的に、インタク
トなビリオンとして提示された場合、野性型Ｕ１ウイルスに対する最小の交差反応性が存
在し、これによって、ＴＭＶ−ＦＶ７ビリオンに対する反応性が、提示されたＤＪ５−由
来のエピトープに特異的であったことが示された。この結果によって、推定上のＵ１エピ
トープが、インタクトなビリオンに曝された表面ではないという仮説が支持された。
下の表２５は、以下のように、ＴＭＶ Ｕ１コートタンパク質およびＵ５コートタンパ
ク質に対する抗ＧＤＦ８ラットモノクローナル抗体（ＭＡＢ７８８）およびヤギ＃６６１
ポリクローナル抗体の反応性を比較するために、間接的ＥＬＩＳＡおよびＤＡＳ ＥＬＩ
ＳＡについての終点希釈の結果を示す。
Figure 2011024590
表２５については、ＴＭＶ−ＦＶ７は、陽性コントロールとして含まれた。ＤＡＳ ＥＬ
ＩＳＡについては、ＴＭＶ Ｕ１またはＴＭＶ−ＦＶ７ビリオンは、抗ＴＭＶポリクロー
ナル抗体ＰＶＡＳ １３５Ｄを用いて捕獲された。陰性コントロールとして、ヤギ前採血
血清を使用した。全てのＥＬＩＳＡについて、抗原は５μｇ／ｍＬで使用した。ラットお
よびヤギの抗体は最初に１：２０に希釈して、各々について、２連で３倍階段希釈を行っ
た。終点希釈は最高の希釈としてとって、ここではＯＤ読み取りはバックグラウンドの２
倍であった。
Ｕ１およびＵ５ ＴＭＶコートタンパク質に対するラットＭＡＢ７８８の反応性におけ
る硬直した相違に起因して、ＤＪ５ペプチドのＮ末端の１２アミノ酸との２つのコートタ
ンパク質配列のアラインメントを行なった（図６Ｂ）。このアラインメントによって、Ｄ
Ｊ５ペプチドおよびＵ１コートタンパク質が、プロリンの存在によってＵ５コートタンパ
ク質の場合に破壊される、共通の４つのアミノ酸配列ＱＡＮＰ（配列番号５８）を共有し
たことが示された。ウイルスのＸ線回折構造から、ＱＡＮＰ（天然のヒト前駆体ＧＤＦ８
の残基３２９〜残基３３２）は、考察されたウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡのデー
タと一致して、ビリオンの内面に位置している（図６Ｃ）。全体として、このデータによ
って、Ｕ１コートタンパク質との観察されたラットＭＡＢ７８８交差反応性についての説
明、そしてＤＪ５ペプチド内の本質的でかつ必須のアミノ酸配列であって、それに対して
中和抗体が惹起され得るアミノ酸配列を描写するのにおける補助が得られる。
興味深い事に、ヤギ＃６６１ポリクローナル抗体は、ウエスタンブロットおよび間接的
なＥＬＩＳＡ形式の両方でＵ１コートタンパク質に対して示す反応性が最小である。ラッ
トモノクローナル抗体と同様に、この抗体は、インビトロの転写活性アッセイでＧＤＦ８
を中和し得る（実施例３）。ヤギ＃６６１血清は、ＴＭＶ−ＦＶ７と強力に反応するので
、これによって、ＧＤＦ８中和抗体を生成し得るＤＪ５ペプチドのＮ末端の１２アミノ酸
のＤＪ５ペプチド内に他の領域が存在することが示され得る。
実施例１９
キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）に対する化学的融合物に対して比較
したＴＭＶに対する分子融合物の状況でのＤＪ５ペプチド提示の優位性
ＤＪ５ペプチドを同定した最初の調査的な研究の間、ＧＤＦ８中和ラットモノクローナ
ル抗体（ＭＡＢ７８８，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）およびヤギ＃６６１抗体を、２つのウ
サギ由来のハイパー免疫血清（表２６）に比較した。ウサギ抗体は、ＳＰ２またはＤＪ５
ペプチドのいずれかのＫＬＨ結合体に対して惹起された。図７によって、ＳＰ２ペプチド
がＣ末端でＱＡＮＰ（配列番号５８）残基を含むことが示される。Ｕ１コートタンパク質
とのラットＭＡＢ７８８の交差反応性（実施例１８）によって、中和応答を生じるのにお
けるＱＡＮＰ（配列番号５８）残基の重要性の強力な証拠が得られた。しかし、どのウサ
ギ血清も、ＧＤＦ８中和できないが、それらは、それらのそれぞれのペプチド免疫原をＥ
ＬＩＳＡ形式で認識した。また、ＥＬＩＳＡ方式でのこのペプチドに対するヤギ＃６６１
およびラットＭＡＢ７８８の相対的な応答も興味深い。どの抗体もＤＪ４ペプチドを検出
せず、ここではＱＡＮＰのプロリン残基（配列番号５８）は存在しなかった（図７）が、
それらは、ＳＰ２に対して反応性が弱く、ＤＪ５エピトープに対して反応性であった。対
照的に、ウサギ＃９２血清（ＳＰ２ペプチド抗原）は、ＤＪ４に対して反応性で、ＤＪ５
に対して非反応性であった。これによって、ＧＤＦ８のこの領域が提示される状況は、中
和応答の生成に重要であり得ることが示唆される。
下の表２６は、市販のそして自家製の抗体の選択のための相対的なＥＬＩＳＡおよびＧ
ＤＦ８中和のまとめを示す。
Figure 2011024590
＊ＧＤＦ成熟領域＝ヒト／ブタ／ニワトリ／ラットのアミノ酸配列。プロＧＤＦ８＝ＧＤ
Ｆ８プロホルモンヒトアミノ酸配列
＊＊ＫＬＨに結合されたペプチド
ヤギ＃６６１、ラットＭＡＢ７８８およびウサギ＃１２８６抗体における相違をさらに
検討するために、一連のＥＬＩＳＡを以下の標的に対して行った：
・ＢＳＡに結合体化されたＤＪ５（２０）ペプチド（ＢＳＡ−ＤＪ５（２０）、図７を参
照のこと）。
・ＢＳＡに結合体化されたＤＪ５（１２）ペプチド（ＢＳＡ−ＤＪ５（１２）、図７を参
照のこと）。
・ＢＳＡに結合体化されたＤＪ５（８）ペプチド（ＢＳＡ−ＤＪ５（８）、図７を参照の
こと）。
・ＢＳＡ単独。
・Ｕ１コートタンパク質に対するＧＰＡＴ融合物としてのＤＪ５（１２）を示すＴＭＶ−
ＦＶ７。このビリオンは、ウサギ抗ＴＭＶ Ｕ１ポリクローナルＰＶＡＳ １３５Ｄを使
用する二抗体サンドイッチ形式でインタクトなロッドとして提示された。
・プロＧＤＦ８ＦＬＡＧ、哺乳動物細胞が生成して、アフィニティー精製されたＧＤＦ８
。
下の表２７は、ＥＬＩＳＡコーティングおよび１ウェルあたりに存在するＤＪ５ペプチ
ドの推定ピコモル数のまとめを示す。
Figure 2011024590
（ａ）ＢＳＡは、全部で５９個のリジンε−アミン基を保有する（これらのうちわずか３
０〜３５が代表的には誘導体化に利用可能である）。グルタルアルデヒド結合体化反応に
ついては、ペプチドが２倍モル過剰で存在し、そして全ての遊離のリジンがロードされた
とみなした、すなわちＢＳＡ１分子あたり３５のペプチド提示。
（ｂ）ＣＨＯ由来プロＧＤＦ８ＦＬＡＧ（ＦＬＡＧタグ化ＧＤＦ８プロホルモン）につい
ては、精製された物質は、５０ｋＤａのプロポリペプチドおよび完全処理された１２．５
ｋＤａのＧＤＦ８の８０：２０の比の異種混合物であった。
（ｃ）１ウェルあたりに吸着された標的抗原のピコモルを算出するのに、コーティング溶
液に存在する全てのタンパク質がプレートに結合したとみなした。全ての抗原について、
２５０ｎｇがコーティング溶液に存在し、そして使用したＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐプ
レートは５００〜６００ｎｇ ＩｇＧ／ｃｍ２という吸着能力を有し、そして０．６ｃｍ
２の表面積がコーティング溶液と接触した。
（ｄ）ウェルに添加されたＴＭＶ−ＦＶ７の全てが、コーティングのＰＶＡＳ １３５Ｄ
抗体によって捕獲されたと仮定する。
（ｅ）１ウェルあたりにコーティングされたＧＤＦ８の理論的な最大ピコモル数は、１２
．５ｋＤａ種に対して処理されたＧＤＦ８プロホルモン１００％であった。
下の表２８は、一連のＤＪ５−由来ペプチド−ＢＳＡ結合体、ＧＤＦ８プロホルモン（
プロＧＤＦ８ＦＬＡＧ）およびＴＭＶ−ＦＶ７（二抗体サンドイッチの形式で提示）に対
する反応性に関して、ヤギ＃６６１、ウサギ＃１２８６およびラットＭＡＢ７８８抗体の
ＥＬＩＳＡ終点希釈比較を示す。
Figure 2011024590
ＴＭＶ Ｕ１／ＰＶＡＳ １３５Ｄ二抗体サンドイッチは陰性コントロールとして存在
しなかったが、前出の表２５は、ビリオンとして示された場合に、ラットＭＡＢ７８８ま
たはヤギ＃６６１抗体のいずれかによるＵ１コートタンパク質に対する反応性が最小であ
ることを示すということに注意のこと。表２８のデータについては、ヤギ＃６６１および
ラットモノクローナルＭＡＢ７８８抗体は最初に、１：１０に希釈して、各々について三
倍階段希釈を二連で行った。精製されたラットモノクローナル抗体については、１：１０
希釈が５０μｇ／ｍＬという抗体濃度に相当した。ウサギ＃１２８６抗体の場合、最初の
希釈は１：１０００であった。終点希釈は、ＯＤ読み取りがバックグラウンドの２倍であ
る最高希釈とした。ＮＤはウサギポリクローナルとして測定せず（ｎｏｔ ｄｅｔｅｒｍ
ｉｎｅｄ）、ビリオン捕獲のために使用した。
ラットモノクローナル抗体については、しかし、ＢＳＡに結合体化された全長ＤＪ５ペ
プチド、ＤＪ５（２０）に対する反応性は弱かったが、それより短いＤＪ５由来ペプチド
も検出されなかった。対照的に、１ウェルあたり約１０倍低いレベルのＤＪ５ペプチド（
ＤＪ５（２０）ＢＳＡに対して）を示したＧＤＦ８プロホルモンについては、終点希釈は
２ｌｏｇ１０倍高かった。また、ＴＭＶ−ＦＶ７に対する強力な反応性があり、終点希釈
は、ＧＤＦ８プロホルモンについてわずか３倍低いだけであった。ＴＭＶ−ＦＶ７につい
ては、１３ピコモルが、約２倍のＧＤＦ８値、１ウェルあたり最大のＤＪ５含量であるこ
とが確認されたが、このことは、コーティング抗体によるビリオンの１００％捕獲を仮定
する。
ＴＭＶ−ＦＶ７対ＤＪ５（１２）ＢＳＡ結合体に対するラットＭＡＢ７８８の反応性の
明確な相違は、特に興味深い。なぜなら両方の場合に同じペプチドが提示されるからであ
る。ＤＪ５（１２）については、ＢＳＡに対するググタルアルデヒド結合は、ペプチドの
Ｎ末端の最初のアミノ基を介する。これは、ペプチドのＱＡＮＰ（配列番号５８）残基に
対する接近性を立体的に妨害し得る（図７）。これは、ＤＪ５（２０）ペプチドが、弱く
ても検出されるという事実によって支持される。ＤＪ５（２０）については、リジン（Ｋ
）は、ペプチドのＣ末端領域に存在し、そしてペプチドのＮ末端領域の改善された提示を
生じるはずである別の結合部位である。別の説明は、ＴＭＶコートタンパク質に対する分
子融合の状況におけるＱＮＡＰ（配列番号５８）残基の提示によって、エピトープは、よ
り「天然（ｎａｔｉｂｅ）」の高次構造をとることが可能になるということである。後者
の仮説は、上記の表２６に提示されるＧＤＦ８中和データによって支持される。表２６は
、ＫＬＨに結合体化されたＳＰ２およびＤＪ５ペプチドが、ＧＤＦ８中和抗体を生成でき
ないが、両方について、ＱＡＮＰ（配列番号５８）領域は、ペプチドＮ末端および／また
は反応性リジンに対するその位置のおかげで、十分に提示されるはずであることを示す（
図７）。しかし、ＤＪ５ペプチドがＴＭＶの状況で提示される場合、強力な免疫応答がヤ
ギおよびブタの両方で観察され（実施例２０および２１を参照のこと）、そして血清は、
インビトロの転写アッセイに基づいてＧＤＦ８中和であった。
ヤギ＃６６１抗体については、種々の標的抗原に対する全体的な応答プロフィールは、
ラットＭＡＢ７８８モノクローナルと質的に同様であった。しかし、ＤＪ５（２０）−Ｂ
ＳＡ結合体とＧＤＦ８プロホルモンとの間の応答の相違は、ＤＪ５（２０）−ＢＳＡに対
する１０倍高い終点希釈のおかげで、ラットモノクローナル抗体についてよりも１ｌｏｇ
１０低かった。さらに、ヤギ＃６６１抗体は、ＤＪ５（１２）およびＤＪ５（８）ペプチ
ドＢＳＡ結合体との反応性が弱かったが、ＴＭＶ−ＦＶ７に対する終点希釈は、ＤＪ５（
１２）−ＢＳＡについてよりも依然として２ｌｏｇ１０倍高かった。ＤＪ５（２０）−Ｋ
ＬＨ結合体に対して惹起されたウサギ＃１２８６ポリクローナル抗体については、終点希
釈は、ＤＪ５（２０）−ＢＳＡ結合体について最大であったが、ＧＤＦ８プロホルモン、
ＤＪ５（１２）−ＢＳＡおよびＤＪ５（８）−ＢＳＡに対する応答は、同様であった。ウ
サギ＃１２８６の場合、終点希釈データは、標的としてＴＭＶ ２２６４については利用
不能であった。なぜならサンドイッチで使用された捕獲抗体はウサギ由来であったからで
ある。
ＧＤＦ８中和ヤギ＃６６１抗体での結果によって、分子融合物の状況でのＤＪ５領域か
らのペプチドの提示は、このペプチドが中和抗体の生成のために適切な高次構造をとるこ
とを可能にするという仮説がさらに支持される。ウサギ＃１２８６のデータから、ＫＬＨ
ペプチド結合体は、強力な免疫原であるということが明らかであるが、このポリクローナ
ル抗体がＧＤＦ８を中和できないことによって、このペプチドは、グルタルアルデヒド結
合体の状況で提示された場合、適切な高次構造をとれないということが示唆される。
実施例２０
ＴＭＶ ２６６５、ＴＭＶ−ＦＶ５、ＴＭＶ−ＦＶ６、ＴＭＶ−ＦＶ７またはプロＧＤ
Ｆ８タンパク質を用いる免疫後のヤギからの採血の血清学的分析
上記のＴＭＶ融合ベクターの免疫原性を測定するために、２つのさらなる研究を、ヤギ
を用いて行った。各々の研究は、場所の点を除いて同一であった：１つは、ＰｒｏＳｃｉ
，Ｉｎｃ．により本発明者らの指示のもとで行い（ヤギ研究（Ｇｏａｔ ｓｔｕｄｙ）＃
１）、そしてもう一方は、自家で行って、盲検とした（ヤギ研究（Ｇｏａｔ Ｓｔｕｄｙ
＃２））。成体の乳用ヤギを各々の研究に用いた。各々の研究は以下のとおり行なった
：
ヤギに、下の表２９に示されるとおり２ｍＬのワクチンをワクチン接種した。初回のワ
クチン（０日目）は、完全フロイントアジュバントを含んだが、その後のワクチン用量は
、不完全フロイントアジュバントを含んだ。第一のワクチン接種は、首の右側で皮下（Ｓ
Ｑ）に与えた。その後のワクチン接種は、首の右側と左側の間で変更した。血液サンプル
は、０日、２８日、４９日、６３日、７７日および９１日に、真空にしたＳＳＴ血液採取
試験管を用いて頸静脈の静脈穿刺によって動物から収集した。血液は、室温で最低２時間
凝固させて、遠心分離して、血清を収集した。血清サンプルには動物番号、標本のタイプ
、収集日および研究番号を表示した。血清は、−１０℃以下で、アッセイするまで保管し
た。
Figure 2011024590
試験したワクチン、その物理的形態は以下であった：
・ＧＤＦ８ Ｐ２−Ｃｔｅｒｍ（Ｐ２）−可溶性の球状タンパク質
・ＴＭＶ−ＦＶ１−不溶性の沈殿物
・ＴＭＶ−ＦＶ５−可溶性ビリオンおよび沈殿したビリオンの混合物
・ＴＭＶ−ＦＶ６−凝集されたビリオンのロッド
・ＴＭＶ−ＦＶ７−可溶性ビリオンのロッド
ヤギ研究＃１については、動物を最初のワクチン接種の前に採血して（「前採血（ｐｒ
ｅ−ｂｌｅｅｄ」）、３度目のワクチン接種の１週後（「採血（ｂｌｅｅｄ）１」）、そ
して三度目のワクチン接種の２週後（「採血２」）に採血した血清をＥＬＩＳＡによって
分析した。ＥＬＩＳＡについては、以下の標的を使用した：
・直接コーティングしたタバコモザイクウイルス（Ｕ１またはＵ５型、ワクチンＴＭＶ足
場に相当する）
・ウサギ抗ＴＭＶ Ｕ１ポリクローナルＰＶＡＳ １３５Ｄを使用する、二抗体サンドイ
ッチ（ＤＡＳ）形式でインタクトなロッドとして提示されたタバコモザイクウイルス（Ｕ
１またはＵ５型、ワクチンＴＭＶ足場に相当する）
・ＢＳＡに対して結合体化したＤＪ５（２０）ペプチド（図７を参照のこと）。
・ＢＳＡに対して結合体化されたＤＪ５（１２）ペプチド（図７を参照のこと）。
・ＢＳＡに対して結合体化されたＤＪ５（８）ペプチド（図７を参照のこと）。
・ＣＨＯで発現され、精製されたＦＬＡＧタグ化ＧＤＦ８プロホルモン。
間接的なＴＭＶ ＥＬＩＳＡについては、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で
５μｇ／ｍＬに希釈した５０μＬのＴＭＶ Ｕ１またはＴＭＶ Ｕ５を用いて、４℃で一
晩または週末にわたって、９６ウェルのマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，
Ｎｕｎｃ）をコーティングした。コーティング溶液を取り出して、プレートを、０．５％
（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（商標）２０および２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有する１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）を用いて室温で２時間ブロックした（１ウェルあたり２００
μＬのブロッキング溶液）。このウェルを１×ＴＢＳＴ緩衝液（ＴＷＥＥＮ（商標）２０
を含有するＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水）を用いて２回洗浄して、１ウェルあたりに２％（
ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む１×ＰＢＳに希釈した５０μＬのヤギ血清を添加した。各々の血清
についての３倍階段希釈は、１：５０の初回希釈で開始して行った。ＧＤＦ８ Ｐ２−Ｃ
ｔｅｒｍ前採血血清を、全てのプレート上で陰性コントロールとして使用した。
室温で血清との１時間のインキュベーション後、マイクロタイタープレート洗浄器（Ｓ
ｋａｔｒｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、このプレートを０．９％（ｗ／ｖ）
塩化ナトリウム，２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００で洗浄した。５０
μＬのウサギ抗ヤギＨＲＰ結合体化二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ
を含有する１×ＰＢＳ中で１：１０，０００の希釈で添加した。このプレートを室温で１
時間インキュベートして、プレート洗浄器で洗浄し、そして１ウェルあたり５０μＬの３
，３’，５，５’−テトラメチルベジジン基質溶液を添加した。ＨＲＰ触媒反応は、５〜
２０分間進行させて、５０μＬの１Ｎの硫酸を添加することによって停止させた。このプ
レート吸光度（ＯＤ）は、９６ウェルプレート分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍ
ｅｔｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で４５０ｎｍで読み取った。
二抗体サンドイッチ（ＤＡＳ）ＥＬＩＳＡについては、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ
９．６）中で１：４０００に希釈した５０μＬの抗ＴＭＶポリクローナル抗体ＰＶＡＳ−
１３５Ｄを用いて、４℃で一晩または週末にわたって、９６ウェルのマイクロタイタープ
レート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）をコーティングした。コーティング溶液を取り出
して、このウェルを、０．５％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（商標）２０、２％（ｗ／ｖ）Ｂ
ＳＡを含有する２００μＬの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）を用いて室温で１時
間ブロックした。このブロック工程の後、このウェルを１×ＴＢＳＴ緩衝液を用いて２回
洗浄して、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む１×ＰＢＳ中で５μｇ／ｍＬまで希釈した５０μ
ＬのＴＭＶ Ｕ１またはＴＭＶ Ｕ５のいずれかを、１ウェルあたりに添加した。このプ
レートを室温で１時間インキュベートし、次いで、マイクロタイタープレート洗浄器（Ｓ
ｋａｔｒｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム
，２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００で洗浄した。ヤギ抗体の添加およ
び希釈、二次抗体の添加、ならびにＥＬＩＳＡプレートの発色は、間接的なＴＭＶ ＥＬ
ＩＳＡについて概説されたプロトコールに従って行った。
ＣＨＯ由来ＧＤＦ８プロホルモンに対するヤギ研究＃１血清の反応性を測定するために
、ＥＬＩＳＡはＧＤＦ８プロホルモンでプレートを直接コーティングすることによって行
った。ＧＤＦ８は、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で５μｇ／ｍＬに希釈して
、１ウェルあたり５０μＬを使用して、４℃で一晩、９６ウェルのマイクロタイタープレ
ート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）をコーティングした。ＥＬＩＳＡプロトコールにお
ける全ての引き続く工程は、間接的なＴＭＶＥＬＩＳＡについて概説されたとおりであっ
た。
ＤＪ５ペプチドに対するＥＬＩＳＡについて（図７）、３つのペプチドであるＤＪ５（
２０）、ＤＪ５（１２）およびＤＪ５（８）を、キャリアＢＳＡに結合体化させた。要す
るに、ペプチドを５０％のＤＭＳＯ中で１ｍｇ／ｍＬに再懸濁して、ＢＳＡおよびグルタ
ルアルデヒドと合わせて、全ての結合対反応について１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび１％の
グルタルアルデヒドという最終濃度を得た。種々の反応におけるペプチドの最終濃度は以
下であった：ＤＪ５（８）、１ｍｇ／ｍＬ；ＤＪ５（１２）、１．４ｍｇ／ｍＬ；および
ＤＪ５（２０），２．６ｍｇ／ｍＬ。この反応は、４℃で一晩回転させ、引き続き、１×
ＰＢＳに対して透析して未反応のペプチドを除いた。結合は、１０〜２０％のＴｒｉｓ−
グリシンゲルでのＰＡＧＥ分析によって確認した。マイクロタイタープレート（９６ウェ
ル）を、３つのＤＪ５ペプチド−ＢＳＡ結合体の各々を用いて４℃で一晩コーティングし
て、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で５μｇ／ｍＬに希釈した。マイクロタイ
タープレートコーティングの後に、間接的ＴＭＶ ＥＬＩＳＡについて概説された手順に
従ってＥＬＩＳＡを行った。
ヤギ研究＃１についての抗ＴＭＶ応答のデータを、表３０に表の形式でまとめる。予想
どおり、ＴＭＶに対する応答は、Ｐ２ワクチン接種動物では観察されなかった。ＴＭＶペ
プチド融合物ワクチンについては、抗ＴＭＶ血清の終点希釈における２〜３ｌｏｇ１０の
増大が、間接的ＥＬＩＳＡおよびＤＡＳのＥＬＩＳＡの両方の形式でほとんどのワクチン
について観察された。ＴＭＶ−ＦＶ５ワクチン接種動物の場合は、ＤＡＳ応答は顕著に低
かった。これは単に、ＴＭＶ Ｕ１に対して惹起されたポリクローナル抗体であるＰＶＡ
Ｓ １３５Ｄ抗体によるＴＭＶ Ｕ５ウイルスの捕獲が劣ることを反映しているのかもし
れない。三度目のワクチン接種後、抗ＴＭＶ応答は、ＴＭＶ−ＦＶ６ワクチン接種動物に
おいて最高であって、ＴＭＶ−ＦＶ１ワクチン接種動物において応答が最低であると考え
られた。この相違は、異なるワクチン形態に起因し得る：ＴＭＶ−ＦＶ６は、溶液中で凝
集するインタクトな部分的に可溶性のビリオンとして存在するが、ＴＭＶ−ＦＶ１は、不
溶性の沈殿物であって、ここではＴＭＶのロッド様構造が損なわれるようであった。下の
表３０は、ヤギ研究＃１由来の血清を試験する、抗ＴＭＶの間接的ＥＬＩＳＡおよび二抗
体サンドイッチ（ＤＡＳ）ＥＬＩＳＡについての終点希釈データのまとめを示す。
Figure 2011024590
表３０に示されたデータについては、採血１および採血２は、それぞれ３度目のワクチン
接種の７および１４日後に採取した。血清は最初に１：５０に希釈して、各々の血液につ
いて二連で３倍階段希釈を行った。終点希釈は、ＯＤ読み取り値がバックグラウンドの２
倍であった最高希釈とした。（−）は、ＯＤ読み取りがバックグラウンドの２倍より下で
あったことを示す。Ｕ１コントロールおよびＵ５コントロールは、それぞれＴＭＶ Ｕ１
またはＴＭＶ Ｕ５を含むウェルに相当しており、これを、Ｐ２前採血血清でプローブし
たが、これはバックグラウンドにおけるプレート間の変動を説明するために全てのプレー
ト上に存在した。
２０アミノ酸のＤＪ５エピトープを使用する、ヤギ研究＃１由来の血清についてのペプ
チド特異的ＥＬＩＳＡの結果を、１２のＮ末端および８つのＣ末端のアミノ酸のペプチド
と一緒にして、表３１にまとめる。２０アミノ酸のＤＪ５ペプチドのＥＬＩＳＡについて
、ＴＭＶペプチド融合ワクチンによって生成された免疫応答は、観察された抗ＴＭＶ Ｕ
１応答と極めて接近しており、ＴＭＶ−ＦＶ６ワクチンは、ＴＭＶ−ＦＶ１ワクチンでの
１ｌｏｇ１０の増大に比較して血清終点希釈の２．５ｌｏｇ１０の増大を生じた。ＧＤＦ
８タンパク質を用いる免疫によって生成された応答は、ＴＭＶ−ＦＶ１ワクチンの応答に
匹敵していた。ＤＪ５の１２アミノ酸のＮ末端領域を捕獲抗原として使用した場合、血清
にまたがるその応答プロフィールは、全長ＤＪ５ペプチド（ＤＪ５（２０））で得られた
エピトープと匹敵していたが、終点希釈は、約１ｌｏｇ１０倍低かった。対照的に、ＤＪ
５のＣ末端の８アミノ酸に対する応答は、全てのワクチンについて最小であった。このデ
ータは、ＤＪ５の推定の中和エピトープが、そのペプチドのＮ末端領域に位置するという
仮説を支持する。ＤＪ５（２０）対ＤＪ５（１２）−ＢＳＡの結合体に対する終点希釈に
おける１ｌｏｇ１０の相違は、実施例１９に考察されるように、エピトープの接近性に起
因し得る。下の表３１は、ヤギ研究＃１由来の血清を試験する、抗ＤＪ５間接的ＥＬＩＳ
Ａについての終点希釈データのまとめを示す。
Figure 2011024590
表３１によって提示されるデータについては、ＢＳＡに結合体化されたペプチドのアミノ
酸配列ＢＳＡ（ＤＪ５（２０）、ＤＪ５（１２）およびＤＪ５（８））を、図７に図示す
る。３つのペプチドＢＳＡ結合体についての十分なコーティング条件は、前出の表２７に
記載した。採血１および採血２は、それぞれ３回目のワクチン接種後７日および１４日で
採取した。血清は最初に１：５０に希釈して、各々の採血について３倍階段希釈を二連で
行った。終点希釈は、ＯＤ読み取り値がバックグラウンドの２倍であった最高希釈とした
。前採血Ｐ２コントロールは、バックグラウンドにおけるプレート間の変動を説明するた
めに全てのプレート上に存在させた。
捕獲抗原としてＧＤＦ８プロホルモンを使用するＥＬＩＳＡも行って、ＤＪ５領域をそ
の天然の状態で認識し得る抗体を惹起するＴＭＶ ＤＪ５ペプチド融合ワクチンの能力を
評価した。表３２はその結果をまとめる。ＴＭＶ ＤＪ５ペプチド融合ワクチンの全てが
ＧＤＦ８を認識する抗体を惹起し、ここで３度目のワクチンの１週後（採血１）に観察さ
れた終点希釈は、前採血に対して１．５〜２ｌｏｇ１０の増大であった。観察された力価
は、全てのＴＭＶワクチンについて採血２で、ＴＭＶ−ＦＶ６を除いて低下したが、力価
は維持された。ＦＶ６ワクチンはまた、最高の終点希釈力価を生じ、これは、抗ＴＭＶお
よび抗ペプチドのＥＬＩＳＡを反映しており、そしてＰ２ワクチン接種動物において観察
されたものに匹敵する応答を生じた。ＥＬＩＳＡプレートをコーティングするために使用
したＦＬＡＧ標的ＧＤＦ８プロホルモンタンパク質の大部分が、通常インビボにおいてフ
リン（ｆｕｒｉｎ）プロテアーゼ活性によって切断される、ＧＤＦ８のプロポリペプチド
領域を保有している。成熟ＧＤＦ８は、種全体にまたがって高度に保存されているが、プ
ロポリペプチド領域は、よりアミノ酸異質性を示す。従って、これらの研究において、陽
性コントロール抗原として使用される、ＧＤＦ８ Ｐ２のＣ−ｔｅｒｍ（ヒト配列）の大
部分は、免疫されたヤギの免疫系によって非自己としてみられるようである。これが観察
されたＥＬＩＳＡ血清終点希釈に影響する程度は、未知であるが、この事実は、異なるワ
クチン群の間の応答を評価および比較することを考慮する必要がある。下の表３２は、ヤ
ギ研究＃１由来の血清を試験する、抗ＧＤＦ８ ＥＬＩＳＡの終点希釈データのまとめを
示す。
Figure 2011024590
表３２については、ＧＤＦ８のウェルコーティング条件は、前出の表２７に記載のとお
りであった。採血１および採血２は、それぞれ三番目のワクチン接種の７および１４日後
に採取した。血清は最初に１：５０に希釈して、各々の採血について三倍階段希釈を二連
で行った。終点希釈は、ＯＤ読み取り値がバックグラウンドの２倍であった最高希釈とし
た。
ヤギ研究＃２については、三度目のワクチン接種の７日後の採血を、以下の標的に対し
てＥＬＩＳＡ形式で評価した：
・直接コーティングしたタバコモザイクウイルス（Ｕ１型のみ）
・ＢＳＡに結合体化されたＤＪ５（２０）ペプチド（図７を参照のこと）
・ＢＳＡに結合体化されたＤＪ５（１２）ペプチド（図７を参照のこと）
ＤＪ５（８）ペプチドは、ヤギ研究＃１について観察されたこの領域に対する応答が劣
ることに基づいて、省略した。この研究については、前採血サンプルは利用できず、従っ
て、ヤギ研究＃１からのＰ２前採血を、各々のプレート上の陰性コントロールとして使用
した。結果を表３３にまとめる。ＢＳＡに結合体化された全長ＤＪ５ペプチド（ＤＪ５（
２０））については、可溶性のＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７ワクチンで最高の終
点希釈が得られたが、不要性のＴＭＶ−ＦＶ１ワクチンに対する応答は、１ｌｏｇ１０低
かった。最初の研究と一緒にして、このデータによって、より可溶性のワクチン型である
ほど、より強力なＤＪ５特異的な応答を生じ得ることが示唆される。最初の研究について
は、ＴＭＶ Ｕ１またはＤＪ５ペプチドのいずれかがＥＬＩＳＡ標的抗原であった場合に
得られた終点希釈の間に良好な相関が存在した。しかし、本研究では、ＴＭＶ−ＦＶ１ワ
クチンは、ＴＭＶ−ＦＶ７ワクチンに匹敵する、最高の抗ＴＭＶ応答の１つを生じたが、
他の２つのワクチンＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ５についての終点希釈は、３倍低
いだけであった。このことは、ワクチンの形態、すなわち、可溶性対沈殿型の間の関係を
示しており、そして観察された免疫応答は、ＴＭＶ足場の場合には明快ではないかもしれ
ない。第一の研究でのように、ＤＪ５（１２）ＢＳＡ結合体に対する応答は、ＦＶ７では
得られた終点希釈が匹敵したことを除けば、２０アミノ酸ＤＪ５ペプチドについて１〜２
ｌｏｇ１０低かった。下の表３３は、ヤギ研究＃２についての非盲検の結果のまとめを示
しており、これは抗ＴＭＶ Ｕ１のＥＬＩＳＡによる血清終点希釈、および全長ＤＪ５ペ
プチド（２０アミノ酸；ＤＪ５（２０））およびＮ末端の１２アミノ酸（ＤＪ５（１２）
）のＢＳＡ結合体に対するＥＬＩＳＡにおける血清終点希釈を比較している。
Figure 2011024590
表３３については、種々の標的についてのウェルコーティング条件は、前出の表２７に
記載のとおりであった。血清サンプルは、三番目のワクチン接種の７および１４日後に採
取した。血清は最初に１／５０に希釈して、各々の採血について三倍階段希釈を二連で行
った。終点希釈は、ＯＤ読み取り値がバックグラウンドの２倍であった最高希釈とした。
（−）は、ＯＤ読み取りがバックグラウンドの２倍より下であったことを示す。
ヤギ研究＃１およびヤギ研究＃２から得られた血清を使用して、ウエスタンブロットは
、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８
）に記載されたとおりに行った。還元および非還元ＰＡＧＥを、５％βメルカプトエタノ
ールを含有する還元サンプル緩衝液を用いた以外は同じ方式で行った。ウエスタンブロッ
トのデータのまとめは、表３４に示す。
ヤギ研究＃１およびヤギ研究＃２由来の種々のヤギ抗血清はまた、下のとおり、インビ
トロの転写活性化アッセイによって特徴付けた。ＧＤＦ８生体中和を定量的に測定するた
めに用いられるインビトロの転写活性アッセイは本質的に、Ｔｈｉｅｓら（Ｇｒｏｗｔｈ
Ｆａｃｔｏｒｓ １８，２５１（２００１））のアッセイである。９６ウェル組織培養
物処理した照度計ＶｉｅｗＰｌａｔｅ（商標）アッセイプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅ
ｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔ
ｏｎ，ＭＡ）に、１．０×１０５細胞／ウェルのＡ２０４ Ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃ
ｏｍａ細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８２）を播種して、３７℃、５％ＣＯ２、加湿チャンバ
中でインキュベートした。完全Ａ２０４培養培地は、ＭｃＣｏｙの５Ａ培地、１０％ウシ
胎仔血清、２％のＬ−グルタミンおよび１％のＰｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐからなる。８０％を
超えるコンフルエンスに達した際、細胞を、ＦＵＧＥＮＥトランスフェクション試薬（Ｒ
ｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉ
ｓ，ＩＮ）の製造業者によって推奨されるプロトコールを用いてプラスミドｐＤＰＣ４−
ルシフェラーゼおよびＨＣＭＶ ＩＥ−ｌａｃＺの混合物で一過性にトランスフェクトし
て、３７℃、５％ ＣＯ２、加湿チャンバ中で１６時間インキュベートした。プラスミド
ｐＤＰＣ４−ルシフェラーゼは、異種プロモーターレポーター構築物に対してＧＤＦ８応
答性を付与する、ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（ＰＡＩ−１）由来
の、４コピーのＣＡＧＡボックスを含む。
プラスミドＨＣＭＶ ＩＥ−ｌａｃＺは、構成的なヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターの制御下にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む。この遺伝子は、トランスフェクション効率の正規化のコントロールとして付加される。次いで、細胞を１００ｎｇ／ウェルのＧＤＦ８タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で処理して、さらに１６時間、３７℃，５％ＣＯ２、加湿チャンバでインキュベートした。ルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼは、デュアル・ライト・ルシフェラーゼ・アッセイ（Ｄｕａｌ−Ｌｉｇｈｔ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ）（Ｔｒｏｐｉｘ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて処理された細胞中で定量した。
各々のサンプルは二連（２ウェル）で行った。各々のウェルについてのシグナルは、ルシフェラーゼシグナルをβガラクトシダーゼシグナルで割って１００倍したものとして算出した。サンプルのシグナルは、２つのウェルの平均として算出した。
ヤギ血清サンプルの生体中和活性を試験するために、２００μＬの血清由来のＩｇＧを
細胞の処理の前にＧＤＦ８タンパク質とともに（４℃で約１６時間）インキュベートした
。阻害パーセントは、１００−（１００×サンプルのシグナル）／（ＧＤＦ８単独でのシ
グナル−ＧＤＦ添加なしのシグナル）として計算した。
インビトロ転写活性アッセイの結果は、下の表３４にまとめる。各々のワクチン名称に
ついてのデータは、ヤギ研究＃１およびヤギ研究＃２について得られた結果の累積である
。成熟ＧＤＦ−８のデータとは、１２．５ｋＤａの成熟ＧＤＦ−８が標的抗原として用い
られるウエスタンブロットをいう。
Figure 2011024590
ＥＬＩＳＡデータと一致して、全ての抗原が、標準的なウエスタンブロット法によって
試験した場合、処置したヤギでＧＤＦ８特異的な免疫応答を惹起した。生体中和について
試験した場合、免疫されたヤギ由来のいくつかの血清は中和された（ＴＭＶ−ＦＶ５、−
ＦＶ６および−ＦＶ７）が、抗原ＴＭＶ−ＦＶ１およびＰｒｏＧＤＦ８Ｐ２は、中和抗体
をアッセイで検出可能として惹起しなかった。
抗体特異性の１つのさらなる試験では、抗原ＴＭＶ−ＦＶ５（ＤＪ５（２０）−ＴＭＶ
Ｕ５−ＴＰＡＴ）は、非変性ウエスタンブロット形式で非変性ＧＤＦ８を認識し得る抗体
を惹起できたことが確認された。比較の目的のために、全ての確認された中和抗体−その
１つはインビボで生物学的活性が報告された（Ａ１６）はまた、ＧＤＦ８の非変性型と反
応する。
このアッセイにおけるＧＤＦ８抗原の非変性型は、科学会ではより「天然（ｎａｔｉｖ
ｅ）」のＧＤＦ８であると認識されており、従って、その推論は、この形式で反応する抗
体が生物学的に関連する可能性が高いということである。
これは、ＧＤＦ８の天然型と反応性である抗体を惹起し、かつバイオアッセイで中和し
得る組み換えＧＤＦ８ペプチドの初めての実証である。
実施例２１
ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ５、ＴＭＶ−ＦＶ６、ＴＭＶ−ＦＶ７またはプロＧＰＦ
８タンパク質での免疫後のブタからの採血の血清学的分析
ブタでの研究のために（ブタ研究＃１）、全部で６つのワクチンを、野性型ＴＭＶ Ｕ
１コントロールと一緒に試験した。各々のワクチンまたはコントロールを、２つのアジュ
バントのうちの１つにおいて２５０μｇの用量で投与して、全部で１４の組み合わせを得
た。考慮したアジュバントは、全ての免疫で与えられたＥｍｕｎａｄｅ（水中油型エマル
ジョン）、または第一のワクチン用量とともに投与された完全フロイントアジュバント（
ＣＦＡ）、およびその後のワクチン接種のための不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ
）のいずれかであった。この盲検研究のために、ワクチン／アジュバントの組み合わせ１
つあたりに１匹の動物、そして全部で１５匹の動物について１匹の免疫されていないコン
トロールとした。試験したワクチンは以下であった：
・ＧＤＦ８ Ｐ２−Ｃｔｅｒｍ（Ｐ２）
・ＧＤＦ８プロホルモン
・野性型ＴＭＶ Ｕ１
・ＴＭＶ−ＦＶ１
・ＴＭＶ−ＦＶ５
・ＴＭＶ−ＦＶ６
・ＴＭＶ−ＦＶ７
３度目のワクチン接種の７日後に得た血清を、ヤギ研究＃２、すなわちタバコモザイク
ウイルス（Ｕ１型のみ）、ＤＪ５（２０）ペプチドＢＳＡ結合体、およびＤＪ５（１２）
ペプチドＢＳＡ結合体からの血清について使用した同じ標的に対してＥＬＩＳＡ形式で評
価した（図７を参照のこと）。マイクロタイタープレートを、標的抗原を、５μｇ／ｍＬ
で炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で用いて４℃で一晩コーティングした。使用
したＥＬＩＳＡプロトコールは、間接的なＴＭＶ ＥＬＩＳＡ（実施例２０）について概
説したものであって、以下の改変をともなった：ウサギ抗ブタＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を、
二次抗体としてウサギ抗ヤギ二次抗体の代わりに用いた。その結果を表３５に表形式でま
とめる。予想どおり、抗ＴＭＶ応答は、ＴＭＶワクチン接種動物に特異的であって、終点
希釈力価は、ワクチン／アジュバント組み合わせのほとんどについてコントロール動物よ
りも少なくとも２ｌｏｇ１０高かった。ＴＭＶ−ＦＶ５／フロイントアジュバント組み合
わせについては、動物には健康を考慮してわずか２用量しか与えず、そして試験した血清
は、第二のワクチン接種の４週後であって、これが観察された応答の低さを説明する。一
般には、抗ＴＭＶ免疫応答は、より強力なフロイントアジュバントとともに投与されたワ
クチンについては、ＴＭＶ−ＦＶ６では逆であったことを除いて、大きかった。ＤＪ５（
２０）−ＢＳＡ結合体ＥＬＩＳＡについて、ＧＤＦ８およびＰ２ワクチン接種した動物の
血清は、ワクチン接種していないおよびＴＭＶ Ｕ１ワクチン接種したコントロール以下
の終点希釈力価を有した。ＴＭＶ ＤＪ５ペプチドワクチンを投与された動物については
、最高の応答は、コントロールよりも１ｌｏｇ１０高く、一般には、フロイントのアジュ
バントと組み合わせて投与されたワクチンについて高かった。ワクチン−ＦＶ６について
のみ両方のアジュバントの応答は同様であった。２つのヤギ研究で観察されたとおり、Ｄ
Ｊ５（１２）−ＢＳＡ結合体のＥＬＩＳＡプレートでの血清の終点希釈は、ＤＪ５（２０
）ＥＬＩＳＡに対して、応答した全ての動物で低かった。
ヤギ研究＃２およびブタ研究＃１のＥＬＩＳＡは、並行して処理した。血清終点希釈は
ヤギ由来血清で実質的に高かったという観察に注意のこと；ヤギ研究でのＥＬＩＳＡは、
ブタの研究のＥＬＩＳＡについての２０分間に比較して、５分間発色させられただけであ
った。このことは、ヤギで得られた抗キャリアおよびペプチド特異的免疫応答が、ブタで
観察されたよりも大きかったことを示唆する。成熟ヤギＧＤＦ８タンパク質配列は、ブタ
、ウシおよびヒトを含む他の哺乳動物種の配列とは１アミノ酸ずつ異なる；ＤＪ５領域に
おいてＱＡＮＰ（配列番号５８）残基に対してＣ末端であるアルギニンはリジンによって
置換される。従って、現在の研究で使用したヒトＧＤＦ８は、ＴＭＶの表面上に提示され
たＤＪ５ペプチドと一緒になって、ヤギの真の自己抗原ではなかった。ヤギおよびブタの
両方で使用したワクチン用量は同一であったので、これは、ヤギで観察されたさらに強固
な応答についての１つの可能性のある説明であり得る。しかし、免疫応答がブタで観察さ
れたという事実は有望である。下の表３５には、ブタ研究＃１についての非盲検の結果の
まとめを示しており、ここでは抗ＴＭＶ Ｕ１のＥＬＩＳＡによる血清終点希釈、ならび
に全長ＤＪ５ペプチド（２０アミノ酸；ＤＪ５（２０））およびＮ末端の１２アミノ酸（
ＤＪ５（１２））のＢＳＡ結合体に対するＥＬＩＳＡにおける血清終点希釈を比較してい
る。
Figure 2011024590
表３５については、種々の標的についてのウェルコーティング条件は、前出の表２７に記
載のとおりであった。血清サンプルは、三番目のワクチン接種の７日後に採取した。血清
は最初に１：５０に希釈して、各々の採血について三倍階段希釈を二連で行った。終点希
釈は、ＯＤ読み取り値がバックグラウンドの２倍であった最高希釈とした。（−）は、Ｏ
Ｄ読み取りがバックグラウンドの２倍より下であったことを示す。（Ｅ）は、Ｅｍｕｎａ
ｄｅアジュバント；（Ｆ）は、フロイントのアジュバント。
実施例２２
植物におけるＧＤＦ８プロホルモンの発現のためのＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）ベク
ターの構築
ｐＬＳＢ２６６１を生成するために、ＦＬＡＧタグ化ＧＤＦ８（ヒトミオスタチンプロ
ホルモン遺伝子）含有フラグメントを、ＰＣＲによってプラスミド１２０２−３７．３９
から増幅した。使用した２つのオリゴヌクレオチドの正確な配列は、それらの関連する配
列番号と一緒に、下の表３６に示す。プラスミド１２０２−３７．３９は、プラスミドｐ
ｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）へＦＬＡＧ−タグ化ヒトｐｒｏＧＤＦ８のヌクレオチド配列を挿
入することによって生成された。
Figure 2011024590
このＰＣＲ増幅フラグメントは、ＧＤＦ８プロホルモンの全体的ＯＲＦを含み、その後
ろにＦＬＡＧエピトープが続いた。このインサートは、ＰａｃＩおよびＳａｌＩで消化さ
れ、そして引き続き、ＢＳＧ１０３７（緑色蛍光タンパク質を発現するＴＭＶベクター；
Ｆｉｔｚｍａｕｒｉｃｅら、米国特許第６，６５６，７２６号Ｂ１）の誘導体である、ベ
クターＤＮ１５の９．５ｋｂのＰａｃＩ／ＸｈｏＩフラグメントに連結され、これは、レ
プリカーゼタンパク質中でアミノ酸＃１１７７での「Ｄ」から「Ｎ」の変化（Ｄ１１７７
Ｎ）、および移動タンパク質中にアミノ酸＃３０での「Ｐ」〜「Ｒ」の変化（Ｐ３０Ｒ）
を含む。これは、プラスミドｐＬＳＢ２６６１の生成を生じ、そしてｐＬＳＢ２６６１に
おけるＦＬＡＧ−タグ化ＧＤＦ８プロホルモンＯＲＦ領域は、配列決定され確認された（
配列番号６１）。下の表３７は、得られた配列に基づいて、ｐＬＳＢ２６６１から発現さ
れたＦＬＡＧタグ化ＧＤＦ８プロホルモン（プロＧＤＦ８ ＦＬＡＧ）の最終アミノ酸配
列を示す。
Figure 2011024590
。
実施例２３
植物において発現されたＧＤＦ８プロホルモンの生成および特徴づけ
ＦＬＡＧタグ化ＧＤＦ８プロホルモンをプラスミドｐＬＳＢ２６６１の転写によって生
成した。転写合成、完全性の検証および植物への接種は、実施例９に記載のとおり行った
。実施例９に注記のとおり、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ以外の別の宿主植物を、ＦＬＡ
Ｇタグ化ＧＤＦ８プロホルモンの生成において使用してもよい。例えば、Ｎ．ｅｘｃｅｌ
ｓｉａｎａまたはＮ．ｔａｂａｃｕｍは、２つの潜在的な別の植物宿主に相当する。接種
後日数（ｐｏｓｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）（ＤＰＩ）の関数としてＧＤＦ８プロホル
モンの発現のレベルを評価するために、浸透移行性に感染された組織の葉の穿孔を５ＤＰ
Ｉ〜８ＤＰＩに採取した。この葉の穿孔サンプルを、処理するまで−２０℃で保管した。
ｐＬＳＢ２６６１を接種された植物について採取した葉の穿孔サンプルに加えて、未接種
の植物、およびＧＦＰを発現するＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）ベクターを接種した植物
を、コントロールとしてサンプリングした。
葉の穿孔サンプルをＰＡＧＥローディン色素中でホモジナイズして、ＰＡＧＥゲルおよ
びウエスタンブロット分析で分析した。ウエスタンブロットを、抗ＧＤＦ８ヤギ＃６６１
ポリクローナルまたは抗ＦＬＡＧモノクローナル（Ｓｉｇｍａ）のいずれかでプローブし
た。ＰＡＧＥゲルから、ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）由来Ｕ５コートタンパク質（約２
０ｋＤａ）に相当する固有のバンドおよび発現されたＧＦＰ（約３０ｋＤａ）は、ＧＦＰ
コントロールについて６および８ＤＰＩ（分析した２つの時点）で検出可能であった。こ
れらのバンドの両方とも、未感染のコントロールの場合には存在しなかった。ｐＬＳＢ２
６６１感染植物については、Ｕ５コートタンパク質のバンドは、８ＤＰＩでのみ検出可能
であったが、植物は５ＤＰＩで症候性であった。他の固有のバンドは、時間経過にまたが
ってＰＡＧＥゲルで証明された。ヤギ＃６６１抗体を使用するウエスタンブロットについ
ては、約５０ｋＤａで泳動する固有のバンドは、ｐＬＳＢ２６６１接種植物については、
７および８ＤＰＩで存在した。このバンドは、５０ｋＤａの分子量を有する未処理のＧＤ
Ｆ８プロホルモンに相当する可能性が最も高い。ヤギ＃６６１抗体はまた、同じＤＰＩ範
囲にまたがって検出された高分子量の種と交差反応した。未感染およびＧＦＯコントロー
ルのレーンにおける非特異的な交差反応性は最小であった。並行なウエスタンブロットを
抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体でプローブした場合、植物宿主タンパク質との交差反応性
は大きかった。しかし、ｐＬＳＢ２６６１感染組織からの抽出物を含むレーンについては
、ヤギ＃６６１抗体で観察された同じ高いＭＷの種は、スクリーニングした全てのＤＰＩ
で検出され、同様の分子量の交差反応するバンドはいずれのコントロールにも存在しなか
った。５０ｋＤａの種がまた、７および８ＤＰＩで検出されたが、弱い交差反応性バンド
が全てのサンプル中で同時に移動した。このデータをまとめると、ＧＤＦ８プロホルモン
発現は、植物においてＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）−に基づく発現を用いて得られたと
いうこと、および未処理のプロホルモンが主な種として蓄積したということが示される。
さらに、高分子量の抗ＦＬＡＧおよび抗ＧＤＦ８反応性種が存在し、これは、ＧＤＦ８プ
ロホルモンの架橋型に相当し得る。しかし、ｐＬＳＢ２６６１ベクターで得られたプロＧ
ＤＦ８ＦＬＡＧ蓄積のレベルは、タンパク質の大規模な経済的な精製および回収を可能に
するには不十分であった。ベクター最適化のさらなる相互作用は、植物中のｐｒｏＧＤＦ
８蓄積を改善するのに可能であることが注目されるべきである。例えば、天然のプロＧＤ
Ｆ８シグナル配列は、植物由来のシグナル配列、例えば、伸長またはαアミラーゼシグナ
ル配列によって、置換されてもよく、このタンパク質は、タンパク質のＣ末端で小胞体（
ＥＲ）保持シグナル、例えば、ＫＤＥＬ配列の付加によって小胞体（ＥＲ）で保持され得
、そしてプロＧＤＦ８ＯＲＦのコドン利用は、最適化され得、その結果Ｎ．ｔａｂａｃｕ
ｍまたはＴＭＶの好ましいコドン利用が使用される。さらに、これらの異なるストラテジ
ーは、蓄積をさらに改善するために組み合わされ得る。
Figure 2011024590
本発明の多くの改変および変化は、当業者に明白であるとおり、その趣旨および範囲か
ら逸脱することなく行なわれ得る。本明細書に記載される特定の実施形態は、例示として
のみ提供され、そして本発明は、添付の特許請求であって、そのような特許請求が題され
る等価物の全範囲とともにその範囲によってのみ限定されるものである。多数の引用文献
が、本明細書に引用されており、これには、その開示がその全体が参照によって援用され
る、公開されたおよび／またはインターネットで公開された核酸およびポリペプチド／タ
ンパク質配列のＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号を含む。
（配列表）
Figure 2011024590
Figure 2011024590
Figure 2011024590
Figure 2011024590
Figure 2011024590
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Figure 2011024590
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Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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