JP2002020399A - ノルウォークウイルス（ｎｖ）を認識するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ノルウォークウイルス （ＮＶ）を病原体とす
る流行性胃腸炎の抗原分析は、従来、RT-RCRもしくはバ
キュロウイルスの系を用いたキャプシッドタンパクを認
識する抗体を用いる方法が主流であったが、前者は操作
が煩雑で時間がかかり、後者は抗体の特異性が高くグル
ープの枠を越えたウイルスの検出は困難であった。した
がって簡便、迅速且つゲノグループの如何を問わないの
検出法が待ち望まれてした。 【解決方法】ゲノグループ IおよびII のいずれのウイ
ルスも認識する抗体を大腸菌の系から発現させたタンパ
クを抗原として作製し、その抗体を用いることにより、
前記課題を解決した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトの流行性胃腸
炎を引き起こすノルウォークウイルス(Norwalk virus：
ＮＶという。)およびそのゲノグループI（genogroupI：
GIという。）およびゲノグループII（genogroupII：GII
という。）のＮＶのキャプシッドタンパク(capsid prote
in：CPという。)分子の共通抗原決定基を認識するモノク
ローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマおよび該モノクローナル抗体を用いて大腸菌で
発現させた融合タンパク等に関する。

【０００２】

【従来の技術】古くから、流行性胃腸炎または流行性嘔
吐下痢症と呼ばれ、罹患する年齢が幅広く、腹痛、吐き
気、嘔吐、下痢、中程度の発熱などを主症状とする胃腸
炎の集団発生が世界各地でしばしば観察されていた。19
68年アメリカ合衆国、オハイオ州、ノルウオーク(Norwa
lk)で集団発生した胃腸炎の患者便から、この胃腸炎の
病原因子であるウイルスが1972年電子顕微鏡下に発見さ
れ、その発見の地名に因んでノルウオークウイルス68と
名付けられた(Kapikian AZ, Wyatt PG, et al. J, Viro
l. 1972 Nov:10(5),1075-1081)。その後、このノルウオ
ークウイルス68と同じ小型で、粒子表面構造が不明瞭な
形状を持つウイルスが各地で相次いで検出され、その形
態的特徴から小型球形ウイルス(small round structure
d virus：SRSVという。)と呼び習わされたが、1999年IC
TV（International Committee on Taxonomy fo Viruse
s)はこのウイルスの種名をノルウォークウイルス(Norwa
lk virus：以下ＮＶという)とすることに決定した。Ｎ
Ｖは、分子量が7.4〜7.7Kbの単一鎖のRNAウイルスであ
り、そのゲノムは、5′から3′側に向かってヘリカー
ゼ、Vpg、ポリメラーゼを包含したORF1とCPを包含するO
RF2および生物学的機能が未だ不明なORF3の3つの翻訳領
域と、末尾のポリAで構成されている。ウイルス粒子の
構成蛋白は1種類で、分子量は58〜63KDaである。

【０００３】このＮＶが、カリシウイルス科(Calicivir
idae)に分類されることについては、既に国際的に同意
が得られている。 ＮＶは、RNAの1本鎖のウイルスであるので変異性が高
く、遺伝的に多様なウイルス株が発見されており、種々
の分類法が提案されてきた。ところが、1990年にNV株68
（NV68）の遺伝子の全塩基配列が解読され(Jiang X, Wa
ng M,et al., Virology 1993 Jul.195(1),51-61)、ＮＶ
の遺伝子構造の解明が進んだ結果、現在、最もよく使わ
れている分類法は、ＮＶ新鮮分離株を既知のウイルスと
比較して系統樹上でGIかGIIに分類する方法である。 GIとGIIにおけるキャプシッド領域のアミノ酸配列の相
同性は約50%と低い。このキャプシッド領域において、ウ
イルス株間の塩基配列の80%程度の相同性を根拠にさら
に分類すると現存するＮＶは、約10種類のクラスターに
分類することができる(Noel JS, Ando T, et al.,Med V
irol. 1997 Dec.53(4), 372-383）。 NV遺伝子の全塩基配列の解読以来、ＮＶの抗原分析は、RT
-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reacti
on)法が主流となったが、患者糞便からRNAを抽出し、RT-
PCR法を行い、DNA産物をハイブリダイゼーション(hybri
dization)するというこの診断法は操作が煩雑で判定結
果を得るまでに1~2日を必要とする。医療機関にとって
も判定結果が出されるまでは適切な対応策が取り難く、
その間にも感染が拡大する可能性がある。

【０００４】さらにＮＶに対して感受性のある培養細胞
株および実験動物が未知のため、免疫学的診断法は未だ
確立されてはいない。 そこで、遺伝子組換え技術を利用してバキュロウイルス
(baculovirus：BVという。)の系を用いたCPの発現が進
められ、遺伝子組換えCPを認識する抗体が報告された。
(Jiang X，Wang M, et al.: J Virol. 1992 Nov; 66(1
1): 6527-6532；Jiang X, Matson DO, et al.: J Clin
Microbiol. 1995 Jun; 33(6): 1452-1455；Dingle KE,
Lambden PR, et al.: J Gen Virol. 1995 Sep; 76 (Pt
9): 2349-2345；Leite JP, Ando T, et al,: Arch Viro
l. 1996; 141(5): 865-875；GreenKY, Kapikian, et a
l.: J Clin Microbiol. 1997 Jul; 35(7): 1909-1914；
HaleAD, Crawford SE, et al.; Clin Diagn Lab Immuno
l. 1999 Jan；6(1)：142-145。） しかし、BVの系を用いたＮＶのCPの発現では自動的にCP
が、ＮＶの粒子形成と同様に二量体を形成して、それが
90個集まり中空の粒子を形成する。この自動的形成粒子
表面にはCPの中間的位置を占める可変領域が存在する。 そのためBV系を用いて作製したCPを認識する抗体は特異
性が高くなり、クラスターやゲノグループの枠を超えた
ＮＶ抗原エピトープを認識するポリクローナル血清抗体
およびモノクローナル抗体の存在は報告されていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】嘔吐、頭痛、下痢、発
熱等を伴う集団食中毒の原因を窮めることは、感染の拡
大の防止を含む予防対策のためにも極めて重要である。 本発明は、ＮＶのゲノグループの種類の如何を問わず、Ｎ
Ｖの共通抗原決定基を認識するもモノクローナル抗体を
提供しようとするものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、免疫原と
してのNVのCPを得るために、従来のBV系を用いないで、
大腸菌の系を採用した。大腸菌系で発現させたCPは、二
量体を形成せず溶媒に溶解し、ＮＶゲノグループ間でもC
P分子上のN末領域に存在する最も保存されているエピト
ープ、C末領域に存在する次に保存されているエピトー
プ、さらに中間的領域を占めている可変エピトープを認
識するモノクローナル抗体が産生されることが判明し
た。このようにして、ＮＶ自体並びにＮＶのGIおよびGI
IのCP分子上の共通抗原エピトープを認識するモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立することに
成功し、さらに研究を重ねた結果本発明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明は、（１）ノルウォーク
ウイルス（Norwalk virus）を認識するモノクローナル
抗体、（２）ＮＶを構成するキャプシッドタンパク（ca
psid protein）を認識する請求項１記載のモノクローナ
ル抗体、（３）ゲノグループI（genogroupI：GIとい
う。)およびゲノグループII（genogroupII：GIIという。)
のＮＶを構成するCP分子上の共通抗原エピトープを認識
する前記（１）記載のモノクローナル抗体、（４）アミ
ノ酸配列：Pro-Val-Ala-Gly-Ala-Ala-Ile-Ala-Ala-Pro-
Leu-Thr-Gly-Gln-Gln-Asn-Ile-Ile-Asp-Pro-Trp-Ile-Me
t-Asn-Asn-Phe-Val-Gln-Ala-Pro-Gly-Gly-Glu-Phe-Thr-
Val-Ser-Pro-Arg-Asn（配列番号：１）を含む抗原を認
識する前記（３）記載のモノクローナル抗体、（５）Ｎ
Ｖ株36（NV36という。）のCPをコードする遺伝子を、発
現ベクターpMAL-c2もしくはpTrx-Fus’に組込み、ベク
ターの宿主である大腸菌XL-blueまたはGI 724を形質変
換させてＮＶのCPとマルトースバインディングプロテイ
ン(maltose binding protein：MBPという。)またはチオ
レドキシン（thioredoxin：TRXという。）との融合タン
パクとして発現させたrMBP-ＮＶ36またはrTRX-ＮＶ36を
免疫原に用いて作製した前記（１）、（２）又は（３）
記載のモノクローナル抗体、（６）固相化したrMBP-Ｎ
Ｖ36またはrTRX-ＮＶ36を抗原として用い、免疫学的方
法により選択した前記（１）〜（４）のいずれかに記載
のモノクローナル抗体、（７）前記（１）記載のモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマ、（８）前記
（２）記載のモノクローナル抗体を産生する前記（７）
記載のハイブリドーマ、（９）前記（３）記載のモノク
ローナル抗体を産生する前記（７）記載のハイブリドー
マ、（10）前記（４） 記載のモノクローナル抗体を産
生する前記（７）記載のハイブリドーマ、（11）受託番
号がFERM BP−7164又はFERM BP-7165である前記（８）
記載のハイブリドーマ、（12）受託番号FERM BP−7164
のハイブリドーマ又はそれから誘導された細胞株により
生産されるモノクローナル抗体、（13）受託番号FERM B
P−7164のハイブリドーマまたはその誘導細胞株の遺伝
子を用いて大腸菌から発現させた抗体フラグメント(scF
vという。)又はヒト化キメラ抗体、（14）受託番号FERM
BP-7165のハイブリドーマ又はそれから誘導された細胞
株により生産されるモノクローナル抗体、（15）受託番
号FERM BP-7165のハイブリドーマまたはその誘導細胞株
の遺伝子を用いて大腸菌から発現させたscFv又はヒト化
キメラ抗体、および（16）大腸菌の系で発現させた融合
タンパクrMBP-ＮＶ36またはrTRX-ＮＶ36、である。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明のモノクローナル抗体を得
るための抗原としては、たとえばＮＶ株のCP遺伝子（Yod
a T，Terano Y．et al；J． Med． Viol．2000 Apr．60
（4）：475−481；PMID：10686033；UI：20150145）
と、例えばプライマーペアーSRSV I-L1とSRSV I-L2、SR
SV II-L1とSRSV II-L2を、発現ベクターpMAL-c2もしく
はpTrx-Fus'（pTrx-Fusをわずかに修飾したもの。）に
組み込み、それを用いて宿主である大腸菌XL-blueまたは
GI 724を形質転換させて、マルトースバインディングプ
ロテイン（maltose-binding protein：ＭＢＰとい
う。）またはチオレドキシン(thioredoxin：TRXとい
う。)とNVのCPとの融合タンパクたとえば、rTRX-ＮＶ36
またはrMBP-ＮＶ36（ＮＶ36タンパクのプライマーを含
めたアミノ酸配列は、配列番号：１として記載）を使用
することができる〔図１〕。

【０００９】本発明のモノクローナル抗体の作製には、
この融合タンパクをそのまま抗原として用いることもで
きるし、あるいは当該融合タンパクの改変体、当該融合
タンパクの部分ペプチドまたはその改変体などを用いる
ことができる。当該融合タンパクの改変体としては、配
列番号：１で示されるアミノ酸配列の１または２個以上
（例えば、１〜１０個）を欠損したアミノ酸配列を他の
アミノ酸を付加したアミノ酸配列などを有するタンパク
などが用いられる。

【００１０】本発明のハイブリドーマは、これらの抗原
を用いて、常法(例えば、Kohler G,Milstein C.，ネイ
チャー（Nature） 1975 Aug 7; 256[5517]:495-497.）
に従って作製することができる。その一例を実施例に記
載した。本発明のモノクローナル抗体は、本発明のハイ
ブリドーマまたはそれから誘導された細胞株を用いて製
造することができる。本発明のモノクローナル抗体は、
例えば、上記ハイブリドーマを自体公知のインビトロ(i
n vitro)またはインビボ(in vivo)培養することにより
製造することができる。インビボ培養法の例を実施例に
具体的に記載した。インビトロ法においてはハイブリド
ーマは、例えばホローファイバー式細胞濃縮培養装置に
より培養した後、にインビボ培養の場合と同様の方法に
従ってモノクローナル抗体を単離精製することができ
る。また、本発明のモノクローナル抗体は、自体公知の
方法に従い、本発明のハイブリドーマまたはその誘導細
胞株の遺伝子を用いて大腸菌から発現させた抗体フラグ
メント(scFvという。)又はヒト化キメラ抗体であっても
よい。

【００１１】本発明のモノクローナル抗体は、rＮＶ36
CP分子のN末端からＣ末端のいずれの領域の抗原決定基
（エピトープ）を特異的に認識してもよいが、例えば、
rＮＶ36分子のN末端側領域のTRX-2（フラグメント２
（配列番号：２））、TRX-7（フラグメント７（配列番
号：３））、rＮＶ36分子のC末端側領域のTRX-13（フラ
グメント１３（配列番号：４））などを認識することが
できる。より具体的には、ハイブリドーマ135-1B4によ
り産生された135-1B4抗体およびハイブリドーマ135-1F6
により産生された135-1F6抗体は、rＮＶ36分子のN末端
側領域であるフラグメント２（配列番号：２）を特異的
に認識することができる。本発明のモノクローナル抗体
の力価をrMBP-ＮＶ36プレートを用いてELISAで測定した
結果、ハイブリドーマ135-1B4により産生された135-1B4
抗体およびハイブリドーマ135-1F6により産生された135
-1F6抗体の抗体力価は共に、512,000ユニット/mgの高力
価であった。

【００１２】rMBP-ＮＶ36プレートを用いてELISA法を行
い、rMBP-ＮＶ36を認識するモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ10株(135-1B4、1F6、2B3、2F9、3E6、4C
3、4D2、4D6、4G4、5C9)を選択した。 次に、TRX、rTRX-ＮＶ36、rＮＶ36-N-fragments(TRX-N、TRX
-1、TRX-2、TRX-3、TRX-4、TRX-5、TRX-6、TRX-7)、rＮＶ36-C-
fragments(TRX-C、TRX-8、TRX-9、TRX-10、TRX-11、TRX-12、T
RX-13、TRX-14、 TRX-15、TRX-16、TRX-17、TRX-18)のプレー
ト(22種類)を用いてELISA法並びにウエスタンブロット
法を行って、各フラグメントに対する抗体の免疫反応特
性を調べた。また感染患者の大便から単離したＮＶにつ
いてウエスタンブロット法による分析を行ったところ、
本発明の 135-1B4 抗体並びに 135-1F6 抗体はＮＶ株を
認識していることが証明された。

【００１３】本発明のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ135-1B4並びに135-1F6からの産物をビオチ
ン化して酵素免疫定量法(ELISA-sandwich法)を行った。 ELISA-サンドイッチ法により135-1B4抗体と135-1F6抗体
の組み合わせが成立し、抗原検出感度は0.2ng/ml、定量
測定領域は1ng/ml〜200ng/mlであった。融合タンパクrM
BP-ＮＶ36またはrTRX-ＮＶ36は、ヒト又は動物（例、マ
ウス、ラット、モルモット、ヒツジ、サル、ウシなど）
の抗ＮＶ血清抗体を定量する免疫化学的測定、探索また
は選択用試薬の抗原製造原料として有用である。このよ
うに、本発明のモノクローナル抗体は、ＮＶを感度良く
検出又は定量することができるので、ＮＶの免疫化学的
測定、探索および選択等に有用である。本発明のハイブ
リドーマは、本発明のモノクローナル抗体の大量生産に
有用である。

【００１４】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commision
on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下
記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合
は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン Ｒ ：ＧまたはＡ Ｗ ：ＡまたはＴもしくはＵ Ｓ ：ＧまたはＣ Ｙ ：ＴもしくはＵまたはＣ Ｋ ：ＧまたはＴもしくはＵ Ｖ ：ＡまたはＧまたはＣ Ｈ ：ＡまたはＣまたはＴもしくはＵ Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン

【００１５】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 〔配列番号：１〕プライマー部分を含めたＮＶ３６キャ
プシッドタンパクのアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２〕〔図８〕に示したフラグメント２のア
ミノ酸配列を示す。 〔配列番号：３〕〔図９〕に示したフラグメント７のア
ミノ酸配列を示す。 〔配列番号：４〕〔図10〕に示したフラグメント１３の
アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：５〕Primer 82MSのＤＮＡ塩基配列を示
す。 〔配列番号：６〕Primer SRSV Ｉ-L1のＤＮＡ塩基配列
を示す。 〔配列番号：７〕Primer SRSV Ｉ-L2のＤＮＡ塩基配列
を示す。 〔配列番号：８〕Primer SRSV II-L１のＤＮＡ塩基配列
を示す。 〔配列番号：９〕Primer SRSV II-L２のＤＮＡ塩基配列
を示す。 〔配列番号：１０〕〜〔配列番号：４７〕ｒＮＶ３６フ
ラグメントの増幅に用いたプライマーの塩基配列を示
す。

【００１６】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではな
い。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュ
ラー・クローニング（Molecular cloning）に記載され
ている方法に従った。

【００１７】実施例１ (1)rＮＶ抗原の作製に用いた材料 新たに分離したウイルス株ＮＶ36およびＮＶ114は胃腸
炎発症患者糞便から単離して大阪府立公衆衛生研究所食
品細菌課に所管されている。 ウイルス株ＮＶ21、ＮＶ38およびＮＶ2は単離して国立感
染症研究所(東京)に所管されている。ウイルス株ＮＶ96
-908(GI type)は愛媛県立衛生研究所のDr.M.Osetaの好
意により供給された。 TAクローニングベクターとして、pT7blue（Novagen In
c.，USA)を採用した。発現フレームは、Bam HI siteにp
TrxFus (Invitrogen, La Jolla, CA)を若干修飾した pT
rxFus’を用いた。 発現ベクターは、pMAL-c2（New England BioLabs, Beve
rly, MA,USA）を約40kd のMBP(maltose binding protei
n)とＮＶ36 CP(ＮＶ36 capsid proteins)との融合タン
パクを発現させる目的に、pTrxFus’は約12kdのTRX(thi
oredoxin)とＮＶ36 CPとの融合タンパクを発現させる目
的に用いた。 大腸菌株XL1-blueは、 pT7blueとpMAL-c2の宿主細胞と
して採用し、一方、大腸菌株GI724はpTrxFus’の宿主細
胞として採用した。 これらのＮＶ株および大腸菌株をそれらのベクターであ
るプラスミドと共に〔表１〕に記載した。

【００１８】

【表１】

【００１９】(2)RT-PCR(Reverse Transcription-Polyme
rase Chain Reaction) NV36のRNAは、10%PBS(燐酸緩衝液)に均質化した大便の
試料からISO-GEN-LS(Nippon Gene, Japan)を用いて抽出
した。抽出操作手順は製造メーカーの実験書に準処して
行った。 RTとPCRは、RNA LA PCRキット(AMV)、バージョン1.1(宝
酒造株式会社)を用いた。RTはキット内容のoligo dT-ada
pter primerでアニーリング(42℃、30分間)した後、DNA
thermal cycler( Perkin-Elmer ABI)で変性(99℃、5分
間)させた。

【００２０】PCRは変性(94℃、1分)、プライマーアニー
リング(55℃、80秒)、増幅(72℃、2分)をGene Amp PCR
System 2400(Perkin-Elmer ABI)を用いて、40周期で構
成した。 プライマーとして、Wang J.らのPrimer82(Journal of V
irology 68, 5982(1994)）をわずかに修飾したPrimer 8
2MS(5'-CCA CTA TGA TGC AGA TTA-3')（配列番号：５）
と、M13primer M4を用いた。 Nested PCRはORF2領域を増幅する目的で、GI ORF2 用プ
ライマーペアーとしてSRSV I-L1（5'-ATA CCC GGG ATG
ATG ATG GCG TCT AAG GAC-3')（配列番号：６）とSRSV
I-L2（5'-TAT ACT AGT TTA TWW WCG GCG CAV WCC AAG C
C-3')（配列番号：７）を用い、他方GII ORF2用プライ
マーペアーとしてSRSV II-L1（5'-CGG GAT CCA TGA AGA
TGG CGT CGA RTS RCG C-3')（配列番号：８）とSRSV I
I-L2（5'-AGT CGA CTT AYW RHR YHC KYC TRC GCC C-3')
（配列番号：９）を用いて、35周期で構成した。GIおよ
びGIIともに、最初の5周期は、変性(94℃、1分)、プラ
イマーアニーリング(37℃、80秒)、増幅(72℃、2分)を
行い、後の30周期は最初の5周期と同様に行ったが、プ
ライマリーアニーリングだけは、GIは58℃、GIIは52℃
で実施した。

【００２１】実施例２ rＮＶ36 フラグメント遺伝子のクローニングと発現 ＮＶ36 ORF2のクローニングと発現系の模式図を〔図
１〕に示た。ORF2は、制限酵素(RE)を含むプライマーペ
アーを用いて増幅した。PCR産物をTAクローニングベクタ
ーであるpT7blueに挿入した。ORF2の２成分は、M13prim
er M1（Takara Biochemicals, 3831)およびRV(Takara B
iochemicals、3830B)で配列され、PRISM Dye-DEoxy Ter
minator Cycle Sequencing kit（Perkin-Elmer ABI）を
用いて各成分のプライマーが設計された。少なくとも各
成分の３クローンが配列された。ＮＶ36、ＮＶ21、ＮＶ
114、およびＮＶ96-908は配列データの解析後に、発現
実験のために選抜した。 ORF2フラグメントは、pT7blueの増幅クローンからSma I
とSpe l(GI)、またはBamHIとSal I(GII)の制限酵素によ
る消化を行い、アガロース電気泳動法により精製した。 ORF2の両側上の都合のよい制限酵素サイトはクローニン
グに用いた。 精製GIもしくはGIIのORF2 fragmentの結合はpMAL-c2はB
am HIとSal IまたはXmn IとXbaIの組み合わせで消化
し、pTrxFus’はBam HIとSal IまたはSma IとXbaIで消
化して、結合物はXL1-blueまたはGI724の宿主細胞を形
質転換するのに使用した〔図１〕。

【００２２】実施例３ rMBP-ＮＶ及び rTRX-ＮＶ誘導と分析 発現系構成成分を担うコロニーを、製造メーカーの手順
書に従ってXL1-blueはIPTG(isopropyl(β-di)thio-gala
ctoside)で、GI724はトリプトファンで誘導した。 融合タンパク発現の有無はCBB染色のSDS-PAGEゲルを用
いて分析した。〔図2〕。 rMBP-ＮＶ36CPの精製は製造者の手順書に従い、細胞融
解緩衝液を用いて超音波処理した試料から遠心分離溶出
後、アミロース樹脂カラムに掛けてクロマトグラフィー
を行った。 rTRX-ＮＶ36の精製は、1mM EDTA、10mM 2-ME(2-mercapt
oethanol)及び10mM E64(thyol protease inhibitor)と1
00mM PMSF(serine protease ingibitor)を含有する10mM
燐酸緩衝液(0.5 M NaCl)にて超音波処理と遠心分離を2
回行った。ついで遠心溶出物を1 mM EDTA、1mM 2-MEおよ
びP-INHを含有する200mMトリス緩衝液 (Tris buffer, p
H12)で処理し、沈殿物を超音波処理および遠心して精製
物を得た。

【００２３】実施例４ 抗体産生ハイブリドーマの作製（１）マウスの免疫注射 実施例３で作製した2.8mg/ml濃度の抗原(rTRX-ＮＶ36)
をダルベッコPBS(-)（以下 PBS(-)という。）で希釈
し、0.1mg/ml濃度の抗原溶液を調製した。初回免疫は前
記抗原溶液とFreundの完全アジュバントの等容量混合乳
濁液をBALB/cマウス(SPF-grade 、雌性、5週齢）に0.06
mg皮下注射した。追加免疫は抗原溶液とFreundの不完全
アジュバントの等容量混合乳濁液を前記マウスに0.03mg
腹腔内注射した。追加免疫は２週間の間隔で4回（初回
免疫を含め5回）行った。最終免疫の1週間〜10日後にマ
ウスの眼底静脈叢から試験採血して血清抗体の力価を後
記のELISA法により測定して高度免疫されたマウスを選
択した。細胞融合実施４日前に0.04mg の抗原（rTRX-Ｎ
Ｖ36）をマウスに腹腔内注射した。

【００２４】実施例５ 抗体産生ハイブリドーマの作製（２）とマウス血清抗体
の力価測定 コーティング液（0.1M 炭酸緩衝液、pH9.6）を用いてr
MBP-ＮＶ36を0.01mg/mlに希釈してマイクロタイタープ
レートのウエルに0.1ml分注し、4℃で一夜放置した。反
応上清をプレートから除去し、洗浄液（0.1% Tween-20
と 0.02% NaN₃ を含むPBS(-)、pH7.4）で2回洗浄した。
ブロッキング液（0.1W/V% ゼラチン及び 0.02% NaN₃
を含む PBS(-) pH7.4）を0.15ml加えて37℃で30分反応
後、ブロッキング液を除去し、洗浄液で2回洗浄した。
血清試料希釈液（第１抗体）を0.1ml加えて、37℃で1時
間反応後、2回洗浄した。アルカリホスファターゼ標識
抗マウスIgG （第２抗体）を0.1mlを加えて37℃で1時間
反応後、プレートを洗浄液で2回洗浄した。酵素基質
（0.5mM MgCl₂ を含む10mM diethanol amine buffer、p
H9.5を用いてp-nitrophenyl disodium salt ： PNPP を
1mg/ml 含む溶液に調製）を 0.1ml加えて室温で20分反
応後、反応停止液（3N NaOH ）を0.05ml加えてから、吸
光度の自動計測装置を用いて405nmにおける吸光度を計
測した。

【００２５】実施例６ 抗体産生ハイブリドーマの作製（３）細胞融合 血清抗体高力価のマウスを選抜して、全採血を行い、血
清を遠心分離してアッセイ用対照陽性血清として利用す
るために凍結保存した。脱血マウスを頚部脱臼して消毒
用アルコール液（70% ethanol）に約2分間浸けた後、直
ちに腹部を切開して脾臓を摘出し、基本培地（RPMI-164
0、 pH7.4）を入れた容器に収納した。以後の操作はク
リーンベンチ内で無菌的に行った。摘出脾臓をRPMI-164
0で2回洗浄して、RPMI-1640溶液中の脾臓から細胞浮遊
液を調製し、滅菌網を用いて濾過した。濾過した細胞浮
遊液を低速遠心分離（800rpm、3分）を行い上清を除去
して沈殿物の細胞塊をタッピングしてほぐしてから RPM
I-1640に再浮遊して細胞数を計測した。他方、GIT培地
（日本製薬）を用いて3日間で急速に増殖させたマウス
の骨髄腫細胞株(P3X63Ag8U1：P3U1)を低速遠心分離（80
0rpm、3分）して骨髄腫細胞株を回収の後、RPMI-1640に
浮遊させ、細胞数を計測した。RPMI-1640に再浮遊させ
たマウス脾細胞と骨髄腫細胞株の細胞数比率を約10：1
の割合で細胞融合用丸底チューブに入れて低速遠心分離
（800rpm、3分）を行い、上清を除去して細胞塊をタッ
ピングしてほぐした。そこへオートクレーブ滅菌済ポリ
エチレングリコール（PEG-1500)を同容量の基本培地(RP
MI-1640、 pH7.4)に溶解したものを、37℃に保温して、
2mlを約30秒かけてゆっくる滴下しながら緩やかに混和
した。

【００２６】次いで、数秒間軽く振盪して室温で低速遠
心(500rpm、15秒）した後、37℃に保温しながら7mlのRP
MI-1640を底部附近から除々に加えてピペットで混和し
た。さらに、低速遠心分離（室温で800rpm、3分）を行
い、上清を除去して細胞塊をよくほぐして10mlのRPMI-1
640に再浮遊させた。この洗浄操作を2回繰り返した。骨
髄腫細胞株の細胞濃度が1×10^６cell/ml になるようにH
T培地（ヒポキサンチンとチミジンを添加したGIT培地）
に再浮遊させた。これを細胞培養用96ウエル平底マイク
ロプレートの各ウエルに0.1ml分注して細胞培養装置（5
%CO₂ 、37℃）内で培養した。培養2日目にHAT培地（ヒ
ポキサンチン・チミジン・アミノプテリン添加 GIT培
地）を各ウエルに 0.05ml添加した。さらに3日間隔で H
AT培地(0.1ml/ well)で培地交換を行った。10日後に、
細胞コロニーの増殖度を光学位相差顕微鏡下で観測し
た。増殖した細胞コロニーの観察されたウエルの培地上
清について、MBP-ＮＶ36の吸着マイクロプレートを用い
て前記実施例５に記載のELISA 法により、TRX-ＮＶ36に
よる免疫マウス血清を対照陽性としてIgG抗体力価を測
定した。抗体産生細胞はHAT培地から HT培地に置換して
細胞増殖を促し、GIT培地を用いて順次、1ml、 10ml、
100ml〜250mlへとスケールアップした。可能な限り早期
に細胞のクローニングと凍結保存を行った。

【００２７】実施例７ 抗体産生ハイブリドーマの作製（４）細胞の凍結保存 培養細胞を低速遠心分離(800rpm、3分）で集め、上清を
除去し、細胞塊をほぐして、氷冷した凍結保存溶液(10%
DMSO ：dimethly sulphoxide, 50% FCS：fetalcalf ser
um を含む GIT培地）を用いて細胞浮遊液（5×10６cell
/ml）を調製して、凍結用チューブ(1.8ml)に1ml分注し
た。-80℃で一夜以上保存した、長期保存用として、-15
4℃~-194℃の冷却保存容器に移した。

【００２８】実施例８ 抗体産生ハイブリドーマの作製（５）ハイブリドーマに
よるクローニング 雌性マウス(BALB/c,4週齢）の胸腺を摘出して細胞をHT
培地に浮遊させた（5×1０^６/ml）。この胸腺細胞浮遊
液を用いてハイブリドーマを限界希釈法で調製し(10cel
l/0.1ml、5cell/0.1、2.5cell/0.1ml、1.25cell/0.1m
l、0.625cell/0.1ml）、96ウエル平底プレートの各ウエ
ルに0.1ml分注して細胞培養装置（5%CO₂ 、37℃）で10
日間〜2週間培養した後、細胞増殖度及び培養上清のrＮ
Ｖ36に対する抗体力価を測定した。必要に応じて細胞を
再度クローニングして、継代培養、凍結保存を実施し
た。こうして、10 株のrＮＶ36を認識する抗体を産生す
る細胞株を取得した。

【００２９】実施例９ 抗体産生ハイブリドーマの作製（６）抗体IgGサブクラ
スの決定 培養細胞株の培養上清に含まれる抗体のIgGサブクラス
を前記実施例５に記載のELISA法を用いて同定した。MBP
-ＮＶ36融合タンパク吸着プレートを用いて行い、第２
抗体は、AP(alkaline phosphatase）標識抗マウスIgG抗
体の代わりに AP 標識抗マウスIgG1、IgG2a、IgG2b、Ig
G3、IgL-κ IgL-λ抗体を採用した。その他の操作手順
はすべて前記のELISA法の場合と同様に行った。抗体IgG
サブクラスは、IgG1-κ（8クローン）とIgG2b-κ（2ク
ローン）であった。得られた細胞株のうち、135-1B4お
よび135-1F6株から産生される抗体の力価が特に高かっ
た。ハイブリドーマ135-1B4はMurine hybridoma 135-1B
4と命名され2000年5月19日に、通省産業省工業技術院生
命工業技術研究所（以下NIBHという）に受託番号FERM B
P-7164として寄託され、そしてハイブリドーマ 135-1F6
は、 Murine hybridoma 135-1F6と命名され、NIBH にFE
RM BP-7165として、2000年5月19日に寄託された。

【００３０】実施例１０ モノクローナル抗体の製造（１）ハイブリドーマのマウ
ス腹腔内移植 ハイブリドーマ135-1B4及び135-1F6をGIT培地で培養
し、基本培地(RPMI-1640、pH7.4)で2回洗浄して細胞浮
遊液(1x10⁷ cell/ml)を調製した。5〜6週齢の雌性BALB/
cマウスにプリスタン(2,6,10,14-tetramethyl pentadec
ane, Aldrich Chemicals,MW,USA) 0.5mlを腹腔内注射
し、約1〜2週間前後に前記の細胞浮遊液を0.5ml腹腔内
注射した。約6~10日間で腹水が貯留して腹部が肥大した
ので、注射器により腹水採取した。こうしてマウス1匹
当り5〜10mlの腹水が得られた。

【００３１】実施例１１ モノクローナル抗体の製造（２）マウス腹水型抗体の精
製 得られた腹水を冷凍遠心分離（4℃、3000rpm、10分）し
て上清を集め、この上清に等容量の飽和硫酸アンモニア
溶液（アンモニア水でpH7.4に調製）を滴下して塩析を
行った。高速遠心分離（4℃、14,000rpm：10,000xG, 30
分）して上清を除去し、塩析沈殿物を適当量のPBS(-)に
溶解し、Sephadex G25Mカラムを用いてゲル濾過を実施
して残留する硫酸アンモニウムを除去した。ネスラー試
薬を用いて硫酸アンモニウムの確認試験を行った。次い
で、ガラス製の共栓付き遠心管を用意して抗体溶液と氷
冷した清澄剤(Friegen)を容量3：2の割合で入れて密栓
して激しく攪拌振盪後、冷凍遠心分離（4℃、3000rpm,
10分）して、上清を回収し、タンパク濃度を測定した。
塩析した抗体は、次の実験に試料として用い、残りを凍
結保存した。次にProtein G-Sepharoseカラムクロマト
グラフィーにより抗体の精製を行った。Protein G-Seph
arose充填カラムを20ベット容量の結合緩衝液（pH9.0：
BioRad)で洗浄し、タンパク濃度約5〜10mg/mlの抗体試
料を前記結合緩衝液と等容量の割合で混合して前記のカ
ラムに掛け、15ベット容量の結合緩衝液によりカラムを
洗浄した。10ベット容量の溶出緩衝液(pH3.0 BioRad)に
よりマウスIgG画分を溶出した。溶出液のpHを中性に中
和する目的で、溶出液25ml当り8mlの1M Tris-HCl緩衝液
を予め受器に入れておいた。精製抗体画分は分子篩（分
子量：30,000）を用いる限外濾過により溶媒を生理食塩
液に置換濃縮した。得られた精製抗体溶液のタンパク濃
度を5mg/mlに調製した後、凍結保存した。

【００３２】実施例１２ 抗体の力価測定 モノクローナル抗体は、実施例５に記載したELISA法に
よりMBP-ＮＶ36抗原プレートを用いて実施した結果、抗
体135-1B4および抗体135-1F6の力価はいずれもの場合
も、512,000ユニット/mgであった。

【００３３】実施例１３ 抗体の特性試験（１）とrＮＶ36フラグメントの作製 A）pTrxFus’発現ベクターからのrＮＶ36フラグメント
遺伝子のクローニング pTrxFus’は、TRX(約12kDa)とＮＶフラグメント（約40
アミノ酸残基）との融合タンパクを構築するために用い
た。20種類の重複フラグメント［約40アミノ酸残基から
成る18種類の小さいフラグメント、N-端末側フラグメン
ト（ＮＶ36 residues 1-220）およびC-端末側フラグメ
ント(ＮＶ36 residues 210-548）］の場合も前記のＮＶ
36キャプシッドタンパクの場合と同様にして製造した。
大腸菌で発現させたＮＶ36CPフラグメントの模式図を
〔図３〕に示した。全てのrＮＶ36フラグメントは、LA
Taq DNAポリメラーゼ(Takara Biomedicals)によるPCRを
用いて生成した。PCR実験は変性（94℃、30分）、プラ
イマーアニリング（55℃、30分）、増幅（72℃、1分）
の30周期で構成した。プライマーE-3、-4、-6、-7およ
び-17、P-3、-4、-6および-9およびL-2の場合は、プラ
イマーアニリングを50℃で行った以外は前記のPCR条件
下で実施した。使用した各プライマーの塩基配列を〔表
２〕に示した。

【００３４】

【表２】 E．LおよびＰプライマーは、NV36由来のDNA断片の増幅
に用いた。Trx-upとTrx-downプライマーは、組換えプラ
スミド中の挿入断片およびその前後の配列の増幅に用い
た。これら２つのプライマーは、プラスミド挿入断片の
塩基配列の確認にも用いた。ＥとL1プライマーおよびＰ
とL2プライマーの下線を施した部分は、それぞれ制限酵
素Bam H IおよびXba I認識切断配列を示す。すべてのPC
R産物は、アガロースゲルを用いて精製したBam H Iおよ
び Ｘba Iで消化し、Bam H IとＸba Iで消化したpTrxFu
s’と結合させた。結合混合物は、GI-742反応性の細胞
に変換するために使用した。大腸菌による融合タンパク
の発現の模式図を〔図１〕に示した。

【００３５】B)遺伝子組換え産物の誘導と分析 遺伝子組換え発現生成物を担うコロニーは、実施例２に
記載の条件に従って培養、誘導と分析を行った。組換え
生成物をSDS-PAGEにより分析した〔図４〕。また、組換
えベクター中の挿入断片の確認をPCRダイレクトシーク
エンスにより行った。PCRは、30周期の変性（94℃、30
秒）、プライマーアニーリング（55℃、30秒）および増
幅（72℃、30秒）により構成した。組換えベクターの塩
基配列は、PCR用と同一のプライマーによりPRISM（商品
名） Dye-Deoxy Terminator Cycle Sequencingキット(P
erkin Elmer ABI, USA)を用いて配列決定反応を行い、3
10 Genetic Analyser(Perkin Elmer ABI, USA)を用いて
分析した。

【００３６】C)遺伝子組換えタンパクの生産と精製 組換えタンパクは、変換大腸菌のトリプトファン誘導培
地100mlから発生した。TRX-ＮＶ36融合タンパクの精製
は、前記したｐＨ７の溶液にて１回の超音波処理と遠心
分離により行った。rTRX-ＮＶ36フラグメントが可溶性
画分に溶けている場合は飽和硫酸アンモニウムで塩析を
行い、SDS-PAGE で分析した。rTRX-ＮＶ36フラグメント
が沈殿物中にある場合は、溶解した沈殿物をアルカリ性
緩衝液中でさらに超音波処理して遠心分離した可溶性画
分を回収した。融合タンパクの純度とタンパク濃度は、
CBB(Coomassie Brilliant blue)で染色したSDS-PAGEゲ
ルから評価した。

【００３７】実施例１３ 抗体の特性試験（２）rＮＶ36フラグメントに対する免
疫交叉反応 本発明の135-1B4抗体および135-1F6抗体、その他のrMBP
-ＮＶ36を認識するモノクローナル抗体（10種類）およ
び精製家兎血清抗体(R-JMV60 ：Yoda T, Terano Y.et a
l.: J．Med．Viol., 2000; 60(4): 475-481.）について
rTRX-ＮＶ36および各種rTRX-ＮＶ36 fragmentsに対する
交叉反応を試験した。96-ウエルのマイクロプレートの
ウエルに0.001mgの各種抗原（rTRX-ＮＶ36、rTRX-ＮＶ3
6 fragments、およびTRX）を4℃一夜放置して吸着し、4
回洗浄してから種々の濃度に段階的希釈した前記抗体を
加えて37℃で１時間反応した。次いで洗浄操作を行いHR
P(horseradish peroxidase)標識抗体（HRP-labeled ant
irabbit IgsもしくはHRP-labelde anti-mouse IgG）を
第2抗体として加えた。37℃で1時間反応後、洗浄操作を
行い、TMBZ(5'-tetramethylbenzidine)を基質として加
えて室温で30分反応した。酵素反応停止液（1M-燐酸）
を加え、ELISAマイクロプレート用計測装置モデル550(B
io-Rad, USA)を用い波長450 nmにおける吸光度を測定し
た。まず、rＮＶ36のＮフラグメント及びＣフラグメン
トに対する各種特異抗体の交叉反応をELISA法とウエス
タンブロット法により調べ、その結果を〔表３〕に示し
た。

【００３８】

【表３】 Ｎフラグメントに反応したモノクローナル抗体及びＣフ
ラグメントに反応したモノクローナル抗体について、そ
れぞれを細分化したフラグメントについての反応性を調
べ、その結果を〔図５〕および［図６］に示した。モノ
クローナル抗体135-1B4および135-1F6は、いずれの場合
もTRX-ＮＶ36、TRX-ＮＶ-NおよびTRX-ＮＶfragment 2に
対して強い反応を示し、他方、TRX-ＮＶ-C、TRX-ＮＶfr
agment 1、3、4、5、6および7に対して全く無反応であ
った。

【００３９】実施例１５ 抗体の特性試験（３）抗体が認識するＮＶ36抗原エピト
ープ Direct ELISA法をTRX-ＮＶ36およびTRX-ＮＶ36 fragmen
tsを用いて各種抗体免疫反応性を調べるために行った。
各種MAbs(monoclonal antibodies)のrＮＶ36のCPフラグ
メント(capsid protein fragments：CPFs)に対する免疫
反応性を基本としてＮＶ36CPFsの抗原性構造を考察する
と〔図７〕に示すごとく３つの主な領域により支配され
ている。10種類のMAbsのうち、6種類のMAbsは、40個の
アミノ酸残基で構成されるfragment 2を認識していた。
fragment2のアミノ酸配列（配列番号６）は次のとおり
である。 Pro−Val−Ala−Gly−Ala−Ala−Ile−Ala−Ala−Pro−
Leu−Thr−Gly−Gln−Gln−Asn−Ile−Ile−Asp−Pro−
Trp−Ile−Met−Asn−Asn−Phe−Val−Gln−Ala−Pro−
Gly−Gly−Glu−Phe−Thr−Val−Ser−Pro−Arg−Asn この免疫支配領域は、数個所の抗原エプトープを含んで
いると思われる。その理由は抗体135-1B4および1F6がfr
agment 2の分子上の異なる抗原エプトープを認識してい
るからである。抗体135-1F6がrＮＶ96-908(KY 89 type)
およびrＮＶ36(Mexico type)の双方を認識した事実から
fragment 2の分子上には、さらにGIとGIIの共通抗原エ
ピトープの存在が推定される。10種類の抗体のうち3種
類は43個のアミノ酸残基で構成されるfragment 13を認
識し、1種類の抗体は40個のアミノ酸残基で構成されるf
ragment 7を認識した。rＮＶ36CPのフラグメント２、７
および１３と他株のアミノ酸配列の比較を〔図８〕〔図
９〕および〔図１０〕に示した。

【００４０】実施例１６ 抗体の特性試験（４）患者大便からのＮＶに対する免疫
反応 患者大便から精製したＮＶのウェスタンブロット写真を
〔図１１〕に示した。rＮＶ36を認識するrabbit IgG
(A),抗体135-1F6 (B)、抗体135-1B4（C）は、ウェスタ
ンブロット法により感染患者便から精製したＮＶ株と確
実に免疫反応を認めた。

【００４１】実施例１７ 抗体の特性試験（５）DAS-ELISA法による各種rＮＶの免
疫定量 ２重抗体サンドウイッチELISA法を異なるＮＶ株の測定
感度と同様にfragment2（すなわちrabbit serum IgG, m
ouse monoclonal IgG：抗体135-1B4と抗体135-1F6はこ
のフラグメントを認識している）のエプトープ競合の存
在を確定するために用いた。Rabbit serum IgGおよびmo
use monoclonal IgG（抗体135-1B4、抗体135-1F6、抗体
135-4D2）を製造者のプロトコールに準処してEL-Link N
HS-Biotin(Pierce,USA)を用いてビオチン化した。96-ウ
エルマイクロプレートを0.001mgの各種抗体（1B4、 1F
6、4D2）でコーティングした。洗浄した後、rＮＶ株(TR
X-ＮＶ36、21、114および96-908）およびTRXを濃度調整
したもの（0、3.125、6.25、12.5、25、50、100および2
00ng/ml）を各ウエルに加えて37℃、1時間反応した。洗
浄後、ビオチン化抗体（Biotinated rabbit IgG, mouse
monoclonal IgG：抗体135-1B4、1F6、4D2）を加えて37
℃、1時間反応した。 Vectastain ABC kit PK-6100(Vec
tor Laboratories, USA)を結合体として用いた。Vectas
tain ABCを加えて37℃、30分間反応後、結合抗体を前記
のdirect ELISA試験と同様に計測した。抗体135-1B4と1
F6が同一のエピトープを認識するか否かを見い出すため
に、DAS-ELISAは、精製抗体（1F6とbiotinated 1B4、1B
-4とbiotinated 1F6）を用いて行った。その結果、２種
の抗体は、rＮＶ-fragment 2の異なるエピトープを認識
して互いにrＮＶ-fragment 2への結合を阻害しなことを
示した。〔図１２〕に示すごとく捕獲抗体としては1B
4、測定抗体としてbiotinated 1F6を用いると最高感度
の測定成績が得られた。この測定系では、組換え型GI,
rＮＶ96-908(KY89 type)capsid proteinをGII、 rＮＶ3
6(Mexico type)capsidsと同じ感覚で測定できるが、Mex
ico type以外のGIIは測定不能であった。他のモノクロ
ーナル抗体の組み合わせは、1B4とbiotinatd 1F6の組
み合わせ程良好には働かなかった。

【００４２】

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体を用いれば
感染患者の大便や汚染した食料品中のＮＶの免疫化学的
検出、定量分析が可能であり、またＮＶ感染者における
血清抗体の力価測定に直接役立つものと期待される。

【００４３】

【配列表】 <110> Osaka Prefecture <120> Monoclonal Antibodies recognizing CP of NV <130> P0241 <160> 47 <210> 1 <211> 548 <212> PRT <213> Virus <400> 1 Met Lys Met Ala Ser Ser Arg Ala Ala Pro Ser Asn Asp Gly Ala Ala 5 10 15 Gly Leu Val Pro Glu Ile Asn Asn Glu Ala Met Ala Leu Asp Pro Val 20 25 30 Ala Gly Ala Ala Ile Ala Ala Pro Leu Thr Gly Gln Gln Asn Ile Ile 35 40 45 Asp Pro Trp Ile Met Asn Asn Phe Val Gln Ala Pro Gly Gly Glu Phe 50 55 60 Thr Val Ser Pro Arg Asn Ser Pro Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Glu 65 70 75 80 Leu Gly Pro Glu Ile Asn Pro Tyr Leu Ala His Leu Ala Arg Met Tyr 85 90 95 Asn Gly Tyr Ala Gly Gly Phe Glu Val Gln Val Val Leu Ala Gly Asn 100 105 110 Ala Phe Thr Ala Gly Lys Ile Ile Phe Ala Ala Ile Pro Pro Asn Phe 115 120 125 Pro Ile Asp Asn Leu Ser Ala Ala Gln Ile Thr Met Cys Pro His Val 130 135 140 Ile Val Asp Val Arg Gln Leu Glu Pro Val Asn Leu Pro Met Pro Val 145 150 155 160 Val Arg Asn Asn Phe Phe His Tyr Asn Gln Gly Ser Asp Ser Arg Leu 165 170 175 Arg Leu Ile Ala Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Ala Asn Asn Ser Gly 180 185 190 Asp Asp Val Phe Thr Val Ser Cys Arg Val Leu Thr Arg Pro Ser Pro 195 200 205 Asp Phe Ser Phe Asn Phe Leu Val Pro Pro Thr Val Glu Ser Lys Thr 210 215 220 Lys Pro Phe Thr Leu Pro Ile Leu Thr Ile Ser Glu Met Ser Asn Ser 225 230 235 240 Arg Phe Pro Val Pro Ile Glu Ser Leu His Thr Ser Pro Thr Glu Asn 245 250 255 Ile Val Val Gln Cys Gln Asn Gly Arg Val Thr Leu Asp Gly Glu Leu 260 265 270 Met Gly Thr Thr Gln Leu Leu Pro Ser Arg Ile Cys Ala Phe Arg Gly 275 280 285 Val Leu Thr Arg Ser Thr Ser Arg Ala Ser Asp Gln Ala Asp Ile Ala 290 295 300 Thr Pro Arg Leu Phe Asn Tyr Tyr Trp His Val Gln Leu Asp Asn Leu 305 310 315 320 Asn Gly Thr Pro Tyr Asp Pro Ala Glu Asp Ile Pro Gly Pro Leu Gly 325 330 335 Thr Pro Asp Phe Arg Gly Lys Val Phe Gly Val Ala Ser Gln Arg Asn 340 345 350 Pro Asp Ser Thr Thr Arg Ala His Glu Ala Lys Val Asp Thr Thr Ala 355 360 365 Gly Arg Phe Thr Pro Lys Leu Gly Ser Leu Glu Ile Ser Thr Glu Ser 370 375 380 Ser Asp Phe Asp Gln Asn Gln Pro Thr Arg Phe Thr Pro Val Gly Ile 385 390 395 400 Gly Val Asp Asn Glu Ala Asp Phe Gln Gln Trp Ser Leu Pro Asp Tyr 405 410 415 Ser Gly Gln Phe Thr His Asn Met Asn Leu Ala Pro Ala Val Ala Pro 420 425 430 Asn Phe Pro Gly Glu Gln Leu Leu Phe Phe Arg Ser Gln Leu Pro Ser 435 440 445 Ser Gly Gly Arg Ser Asn Gly Val Leu Asp Cys Leu Val Pro Gln Glu 450 455 460 Trp Val Gln His Phe Tyr Gln Glu Ser Ala Pro Ala Gln Thr Gln Val 465 470 475 480 Ala Leu Val Arg Tyr Val Asn Pro Asp Thr Gly Arg Val Leu Phe Glu 485 490 495 Ala Lys Leu His Lys Leu Gly Phe Met Thr Ile Ala Lys Asn Gly Asp 500 505 510 Ser Pro Ile Thr Val Pro Pro Asn Gly Tyr Phe Arg Phe Glu Ser Trp 515 520 525 Val Asn Pro Phe Tyr Thr Leu Ala Pro Met Gly Thr Gly Asn Gly Arg 530 535 540 Ser Glu His Asn 548 545

【００４４】 <210> 2 <211> 40 <212> PRT <213> Virus <400> 2 Pro Val Ala Gly Ala Ala Ile Ala Ala Pro Leu Thr Gly Gln Gln Leu 5 10 15 Ile Ile Asp Pro Trp Ile Net Asn Asn Phe Val Gln Ala Pro Gly Gly 20 25 30 Glu Phe Thr Val Ser Pro Arg Asn 40 35 40

【００４５】 <210> 3 <211> 40 <212> PRT <213> Virus <400> 3 Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Ala Asn Asn Ser Gly Asp Asp Val Phe 5 10 15 Thr Val Ser Cys Arg Val Leu Thr Arg Pro Ser Pro Asp Phe Ser Phe 20 25 30 Asn Phe Leu Val Pro Pro Thr Val 40 35 40

【００４６】 <210> 4 <211> 40 <212> PRT <213> Virus <400> 4 Glu Ala Lys Val Asp Thr Thr Ala Gly Arg Phe Thr Pro Lys Leu Gly 5 10 15 Ser Leu Glu Ile Ser Thr Glu Ser Ser Asp Phe Asp Gln Asn Gln Pro 20 25 30 Thr Arg Phe Thr Pro Val Gly Ile 40 35 40

【００４７】<210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Virus <400> 5 CCACTATGAT GCAGATTA 18

【００４８】<210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Virus <400> 6 ATACCCGGGA TGATGATGGC GTCTAAGGAC 30

【００４９】<210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Virus <400> 7 TATACTAGTT TATWWWCGGC GCAVWCCAAG CC 32

【００５０】<210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Virus <400> 8 CGGGATCCA GAAGATGGCG TCGARTSRCG C 31

【００５１】<210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Virus <400> 9 AGTCGACTTA YWRHRYHCKY CTRCGCCC 28

【００５２】<210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 CGGGATCCCG CCAGTGGCGG GTGCAGCGAT 30

【００５３】<210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 CGGGATCCCG CTGGTGGTGA GTTTACATGG 30

【００５４】<210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 CGGGATCCCG CATCTTGCTA GAATGTATAA 30

【００５５】<210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 CGGGATCCCG GATAATCTTT GCAGCTATAA 30

【００５６】<210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 CGGGATCCCG CAGTTGGAAC CGGTCAACCT 30

【００５７】<210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 CGGGATCCCG CAATGCTGTA TACACCTCTT 30

【００５８】<210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 CGGGATCCCG TTTTCATTCA ATTTCCTTGT 30

【００５９】<210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 CGGGATCCCG GTCCAATTCT AGGTTTCCAG 30

【００６０】<210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 CGGGATCCCG ATGGTGAGTT GATGGGCACC 30

【００６１】<210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 CGGGATCCCG AGTGATCAGG CCGATATAGC 30

【００６２】<210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 20 CGGGATCCCG TCCTGCAGAA GACATACCAG 30

【００６３】<210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 21 CGGGATCCCG ATGAAGCAAA GGTGGACACA 30

【００６４】<210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 22 CGGGATCCCG GACCAAAACC AACCAACAAG 30

【００６５】<210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 23 CGGGATCCCG CACCCACAAC ATGAACTTGG 30

【００６６】<210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 24 CGGGATCCCG ATCCAACGGG GTCCTAGACT 30

【００６７】<210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 25 CGGGATCCCG GTGGCCCTGG TTAGGTATGT 30

【００６８】<210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 26 CGGGATCCCG GGTGATTCTC CAATAACTGT 30

【００６９】<210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 27 CGGGATCCAT GAAGATGGCG TCGARTSRCG C 31

【００７０】<210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 28 TTCCTCGACG CTAACCTGGC 20

【００７１】<210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 29 GCTCTAGAGC GCTGCTATCG CTGCACCCG 29

【００７２】<210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 30 GCTCTAGAGC ATTCCTAGGG GACACTGTAA 30

【００７３】<210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 31 GCTCTAGAGC TTCAAATCCA CCTGCATAAC 30

【００７４】<210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 32 GCTCTAGAGC TGGAAAATTA GGGGGTATAG 30

【００７５】<210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 33 GCTCTAGAGC ACGACAGGCA TCGGAAGGTT 30

【００７６】<210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 34 GCTCTAGAGC CTAAGAGGTG TATACAGCAT 30

【００７７】<210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 35 GCTCTAGAGC TCCACGGTGG GTGGGACAAG 30

【００７８】<210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 36 GCTCTAGAGC TGGTGTGCAA AGACTCAAT C 30

【００７９】<210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 37 GCTCTAGAGC AATTCGACTC GGTAAGAGTT 30

【００８０】<210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 38 GCTCTAGAGC AGCCTAGGGG TTGCTATATC 30

【００８１】<210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 39 GCTCTAGAGC AAGACCTTGC CCCGGAAGTC 30

【００８２】<210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 40 GCTCTAGAGC TTGGGGTGAA ACGACCAGC T 30

【００８３】<210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 41 GCTCTAGAGC TGTCAACCCC AATGCCAACT 30

【００８４】<210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 42 GCTCTAGAGC GTTGGGAGCA ACAGCTGGGG 30

【００８５】<210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 43 GCTCTAGAGC CAGACAGTCT AGGACCCCGT 30

【００８６】<210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 44 GCTCTAGAGC ATAGCACTCT ACCAGTGTCA 30

【００８７】<210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 45 GCTCTAGAGC ATTTGGGGGA ACAGTTATTG 30

【００８８】<210> 46 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 46 GCTCTAGAGC TTAYWRHRYH CKYCTRCGCC C 31

【００８９】<210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 47 GTAAAACGAC GGCCAGTGCC 20

【図面の簡単な説明】

【図１】rＮＶ ORF2の大腸菌発現系模式図 患者糞便からISOGEN-LS（日本ジーン）を用いてRNAを抽
出し、RT-LA-PCRキット（宝酒造）でRT-PCRを行い、目
的とするノルウォークウイルス株NV36キャプシッドのコ
ード遺伝子をpT7blueに組込み増幅してから、各々のイ
ンサートを含むpT7blueをBam H I/SAL Iで切断してから
同一酵素で切断したpMAL-c2またはpTrx-Fus'を発現ベク
ターと連結して、宿主である大腸菌XL1-blueまたはGI-7
24に組み込んで形質変換させる発現系の工程を示す。

【図２】大腸菌によるＮＶ36PC融合タンパクの発現のSD
S-PAGEの写真 シリーズＡはrMBP-N36、シリーズＢはrTRX-NV36のSDS-P
AGEを示す。各々の第１列はマーカー、第２列はコント
ロール試料、第３列は該当する融合タンパクの発現大腸
菌の細胞溶解質画分、そして第４列は該当する精製融合
タンパク（矢印）画分の泳動パターンである。ゲル染色
標本による分析結果を示す写真である。１はマーカー、
２は誘導前、３は誘導後、４は精製rMBP-N36についての
ものである。Ｂは、rTRX-N36の発現を確認するためのSD
S-PAGEゲル染色標本による分析結果を示す写真である。
１はマーカー、２は誘導前、３は誘導後、４は精製rTRX
-N36についてのものである。

【図３】rNV36CPフラグメントの模式図 ＮＶキャプシッドタンパクの全ブラックボックスは不明
である。ブラックボックスの近くに記載の番号は、ＮＶ
キャプシッドの核酸番号を示す。ブラックボックスの上
方に記載の番号はフラグメント末端の推定位置を示し、
実際の位置ではない。番号を記載した小さいオープンボ
ックスは各フラグメントを示す。フラグメントNは frag
ment 1-7、フラグメントCは fragment 8-18から成り立
っている。

【図４】大腸菌発現rNV CPフラグメントのSDS-PAGE写真 大腸菌で発現させたTRX-融合キャプシッドタンパクフラ
グメントの生成物をSDS-PAGEゲル染色標本により分析し
た。左側から1番目と21番目のレーン（Ｍ）は分子量〔k
Da〕マーカー、2番目のレーン（Co）は対照に用いた組
換え大腸菌非誘導生成物である。21番目を除く3番目の
レーン（Ｎ）から23番目のレーンは、TRX-ＮＶ36N-末端
側のフラグメント、フラグメント1、2、3、4、5、6、7
およびC-末端側のフラグメント、フラグメント8、9、1
0、11、12、13、14、15、16、17、18である。組換え型
キャプシッドタンパクフラグメントの位置を矢印で示し
た。大部分の小さいフラグメントは、類似の分子量で認
められる。発現が非常に弱いフラグメント３の画面上の
該当する位置に黒丸印を付けた。

【図５】rNV36CP-N末フラグメントに対する各種抗体の
交叉反応レベル 各種抗体の名称と希釈倍数を棒グラフを底面に示した。
モノクローナル抗体135-4G4と同様の反応パターンを示
す135-4G3の結果は省略した。

【図６】rNV36CP-C末フラグメントに対する各種抗体の
交叉反応レベル 各種抗体の名称と希釈倍数を棒グラフを底面に示した。
モノクローナル抗体135-4G4と同様の反応パターンを示
す135-4G3の結果は省略した。

【図７】モノクローナル抗体が認識するＮＶ36の抗原エ
ピトープ 最上段の点線を付したボックスは、ＮＶキャプシッドタ
ンパクの全長を表している。黒い矢印はトリプシン分解
場所の推定位置を示す。N-末端およびC-末端不不を各々
白いボックスで示す。フラグメント2、7および13の抗原
領域を縞模様ボックスで示す。反応するモノクローナル
抗体（反応性MAbs）を対応するフラグメントの下に示
す。ＮＶキャプシッドと抗原フラグメントのボックスの
上部に記載の番号は最初と最後のアミノ酸残基を指示し
ている。

【図８】rＮＶ36CPフラグメント２と他の株のアミノ酸
配列の比較 ★はフラグメント２と同一のアミノ酸、下線を付したア
ミノ酸配列はフラグメント2に特有の配列領域である。
他の配列領域は近接したフラグメントで重複している。

【図９】rＮＶ36CPフラグメント７と他の株のアミノ酸
配列の比較 ★フラグメント２と同一のアミノ酸、−は削除箇所を示
す。下線を付したアミノ酸配列は、フラグメント７に特
有の領域である。

【図１０】rＮＶ36CPフラグメント13と他の株のアミノ
酸配列の比較 ★及び−は前記と同意義、下線を付したアミノ酸配列は
フラグメント１３に特有の配列領域である。

【図１１】感染患者糞便から単離したＮＶのウェスタン
ブロット写真 Western blottingによる感染症患者大便から精製された
ＮＶsに対するrＮＶ36認識特異抗体：rabbit IgG(A),13
5-1F6抗体（Ｂ）および135-1B4抗体（C）の免疫反応性
を証明している。A、B、Cの各々レーン1：分子量マーカ
ー（kDa）、レーン2：rTRX、レーン3：rTRX-ＮＶ36、レ
ーン4：精製ＮＶ1046(GII)、レーン5：精製ＮＶ2928(GI
I：Mexico type)、レーン6：ＮＶ1890(GII：Camberwell
type)。矢印は精製ＮＶ CPの分子量(kDa)の位置を指
示している。

【図１２】各種rＮＶCPのELISA法による定量曲線 最も高感度を示したモノクローナル抗体の組み合わせ
は、捕獲抗体に135-1B4抗体、標定抗体にビオチン化 13
5-1F6抗体を用いた場合であったので、その他の組み合
わせの結果は省略する。黒丸印はTRX-ＮＶ36(GII Mexic
o type)、白丸印はTRX-ＮＶ96-908(GI KY89 type）、黒
三角印はTRX-ＮＶ21(GII Lordsdale type)、白三角印は
TRX-ＮＶ114(GII untyped)、そして白四角印はTRXを表
示している。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/569 (Ｃ１２Ｎ 1/21 33/577 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 ） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 柴田 忠良 大阪府大阪市東成区中道１丁目３番69号 大阪府立公衆衛生研究所内 (72)発明者 鈴木 定彦 大阪府大阪市東成区中道１丁目３番69号 大阪府立公衆衛生研究所内 (72)発明者 依田 知子 大阪府大阪市東成区中道１丁目３番69号 大阪府立公衆衛生研究所内 (72)発明者 寺野 由剛 大阪府池田市旭丘３丁目４−17 (72)発明者 松浦 司郎 東京都千代田区東神田１丁目11番４号 株 式会社ヤトロン内 Ｆターム(参考） 4B024 BA32 BA51 CA04 DA02 DA06 EA04 GA03 GA11 HA01 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA15 4B065 AA26X AA92X AA97Y AB01 AB05 BA02 BA08 CA24 CA25 CA46 4H045 AA11 BA10 CA01 DA76 EA52 FA74

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ノルウォークウイルス（Norwalk virus：
   ＮＶという。）を認識するモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】ＮＶを構成するキャプシッドタンパク（ca
   psid protein：CPという。）を認識する請求項１記載の
   モノクローナル抗体。
3. 【請求項３】ゲノグループI（genogroupI：GIという。）
   およびゲノグループII（genogroupII：GIIという。）の
   ＮＶを構成するＣＰ分子上の共通抗原エピトープを認識
   する請求項1記載のモノクローナル抗体。
4. 【請求項４】アミノ酸配列：Pro-Val-Ala-Gly-Ala-Ala-
   Ile-Ala-Ala-Pro-Leu-Thr-Gly-Gln-Gln-Asn-Ile-Ile-As
   p-Pro-Trp-Ile-Met-Asn-Asn-Phe-Val-Gln-Ala-Pro-Gly-
   Gly-Glu-Phe-Thr-Val-Ser-Pro-Arg-Asnを含む抗原を認
   識する請求項3記載のモノクローナル抗体。
5. 【請求項５】ＮＶ株36（ＮＶ36という。）のCPをコード
   する遺伝子を、発現ベクターpMAL-c2もしくはpTrx-Fu
   s’に組込み、ベクターの宿主である大腸菌XL-blueまた
   はGI 724を形質変換させてＮＶのCPとマルトースバイン
   ディングプロテイン(maltose binding protein：MBPと
   いう。)またはチオレドキシン（thioredoxin：TRXとい
   う。）との融合タンパクとして発現させたrMBP-ＮＶ36
   またはrTRX-ＮＶ36を免疫原に用いて作製した請求項
   １、２又は３記載のモノクローナル抗体。
6. 【請求項６】固相化したrMBP-ＮＶ36またはrTRX-ＮＶ36
   を抗原として用い、免疫学的方法により選択した請求項
   1〜4のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
7. 【請求項７】請求項1記載のモノクローナル抗体を産生
   するハイブリドーマ。
8. 【請求項８】請求項2記載のモノクローナル抗体を産生
   する請求項7記載のハイブリドーマ。
9. 【請求項９】請求項3記載のモノクローナル抗体を産生
   する請求項7記載のハイブリドーマ。
10. 【請求項１０】請求項4記載のモノクローナル抗体を産
    生する請求項7記載のハイブリドーマ。
11. 【請求項１１】受託番号がFERM BP-7164又はFERM BP-71
    65である請求項8記載のハイブリドーマ。
12. 【請求項１２】受託番号FERM BP-7164のハイブリドーマ
    又はそれから誘導された細胞株により生産されるモノク
    ローナル抗体。
13. 【請求項１３】受託番号FERM BP-7164のハイブリドーマ
    またはその誘導細胞株の遺伝子を用いて大腸菌から発現
    させた抗体フラグメント(scFvという。)又はヒト化キメ
    ラ抗体。
14. 【請求項１４】受託番号FERM BP-7165のハイブリドーマ
    又はそれから誘導された細胞株により生産されるモノク
    ローナル抗体。
15. 【請求項１５】受託番号FERM BP-7165のハイブリドーマ
    またはその誘導細胞株の遺伝子を用いて大腸菌から発現
    させたscFv又はヒト化キメラ抗体。
16. 【請求項１６】大腸菌の系で発現させた融合タンパクrM
    BP-ＮＶ36またはrTRX-ＮＶ36。