VACUNA PARA AUMENTAR EL CRECIMIENTO BASADA EN EPITOPES NEUTRALIZANTES
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a proteínas de fusión formadas mediante la expresión del factor de crecimiento y diferenciación 8, y fragmentos peptidicos antigenicos del factor de crecimiento y diferenciación 8, y antígenos y vacunas relacionadas, en plantas usando un vector de virus de plantas, y a métodos para tratar animales con tales proteínas de fusión a los efectos de modular la actividad del factor de crecimiento y diferenciación 8
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El factor de crecimiento y diferenciación 8 es una proteína que se clasifica con la superfami a del factor-ß de crecimiento transformante ("TGF-ß") Generalmente, las proteínas de la superfamilia TGF-ß se expresan inicialmente como precursor (también conocido como prohormona) que sufre ruptura proteolítica en un ramillete de residuos básicos de alrededor de 1 10-140 aminoácidos del extremo C-terminal de la proteína precursora Se cree que en cada caso, las especies TGF-ß activas o maduras son un dimero ligado con disulfuro de las regiones C-terminales de la proteína precursora escindida
El factor de crecimiento y diferenciación 8, denominado en adelante GDF8, también se conoce en el arte como miostatina Los genes que codifican el precursor de GDF8 (denominado en adelante "precursor de GDF8") ha sido clonado de una amplia variedad de organismos Ellos incluyen el precursor humano y de mupno GDF8 (Néstor et al , 1998, Proc Nati Acad Sci 95 14938-43, Patente Norteamericana No 5,827,733, incorporada aqui a título de referencia) También se informó que la inmunorreactividad del GDF8 es detectable en músculos esqueléticos humanos en las fibras de ambos tipos 1 y 2 Se describen anticuerpos y ensayos para detectar el GDF8, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No 6,096,506 Se informó ademas que el GDF8 desempeña un papel en la subregulacion del crecimiento y desarrollo del músculo esquelético, como es confirmado por el GDF8 de ratones knock-out (McPherron et al , 1997, Nature 387 83-90) Por esta razón, hubo intentos previos, particularmente en el área de la cría animal, de modular la actividad del GDF8 en los animales utilizando diversos medios, con el objetivo de subregular la actividad del GDF8 a los efectos de aumentar el crecimiento y/o la masa muscular relativa de diversos animales comestibles Por ejemplo, en la Patente Norteamericana No 6,399,312 se describe un gen del GDF8 precursor y un ensayo, con el propósito de utilizar el ensayo para identificar un inhibidor teórico de dicho promotor En la Patente Norteamericana No 6,656,475 se describe un método para inhibir el efecto del GDF8 en una célula, al contactar la célula con un predominio del GDF8
que compite para un receptor del GDF8 y se informa que puede variar el extremo C de GDF8 maduro En la Patente Norteamericana No 6,004,937 se describe el uso de fo statina como un antagonista posible del GDF8 Ninguno de estos métodos dio como resultado alguna aplicación práctica en el campo de cría animal o en aplicaciones clínicas (ya sea humana o veterinaria) En el arte también se intentó emplear la tecnología de anticuerpos y vacunas para reducir la función del GDF8 Por ejemplo, en la Patente Norteamericana No 6,369,201 , incorporada aquí a título de referencia, se describen péptidos, es decir, fragmentos de la proteína GDF8, y una vacuna para obtener anticuerpos ant?-GDF8 En esta patente se informó de un grado no especificado de crecimiento o aumento de peso, respecto de los controles, en roedores inmunizados con varios de los fragmentos de péptidos del GDF8 informados Se describieron también otras funciones fisiológicas para el GDF8 Por ejemplo, en la Patente Norteamericana No 6,368,597, incorporada aquí a titulo de referencia, se sugiere que inhibir la función de GDF8 es útil para el tratamiento de la diabetes tipo II, por ejemplo, al administrar un anticuerpo ant?-GDF8 o una vacuna ant?-GDF8 a un paciente que presenta esa condición Recientemente, en la Patente Norteamericana No 6,730,306, cuyos contenidos son incorporados aquí a título de referencia, se describieron virus recombinantes de planta que expresan proteínas quiméricas Estas proteínas quiméricas se forman mediante la fusión de una proteina de
envoltura viral de una planta (VCP), y un péptido o po péptido de ínteres De acuerdo con la Patente Norteamericana No 6,730,306, al infectar las células de plantas con tales virus recombinantes de plantas, se produce una cantidad relativamente importante de las proteínas de fusión deseadas Cuando una proteina VCP es fusionada con un antigeno de po péptido de interés, debe seleccionarse cuidadosamente la ubicación del antígeno del pohpéptido fusionado que será expuesto a un sistema inmune, el anticuerpo que une y similares Mediante una ingeniería de proteínas adecuada, la VCP de fusión puede usarse como un inmunógeno o un antígeno para inducir una respuesta del anticuerpo y/o una inmunidad de protección contra el pohpéptido de interés, o como un reactivo para desarrollar y conducir inmunoensayos útiles para la detección de tal po péptido de interés Así subsiste en el arte una necesidad persistente de obtener antigenos e inmunógenos mejorados para lograr una respuesta inmune de ant?-GDF8, asi como de anticuerpos del GDF8 mejorados con la capacidad de unirse específicamente con GDF8 La cita de cualquier referencia en la presente, no debe ser considerada como una admisión de que la referencia está disponible como "arte previo" para la presente solicitud
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención resuelve estas y otras necesidades en el arte al suministrar proteínas de fusión como proteina de envoltura viral de plantas (VCP) que comprenden epitopes útiles de la proteina GDF8 ("proteínas de fusión GDF8-VCP"), por ejemplo, proteínas de fusión que comprenden fragmentos de péptidos del GDF8 de 50 residuos o menos, que comprenden al menos un epítope neutralizante especifico para GDF8 La presente invención ademas brinda anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y proteínas de unión relacionadas obtenidas a través de las proteínas de fusión GDF8-VCP y/o fragmentos de la misma, y métodos para preparar y utilizar las mismas En una modalidad de la invención, las proteínas de fusión de la invención incluyen un dominio peptídico de GDF8 que incluye desde aproximadamente el residuo 327 hasta aproximadamente el residuo 346 del precursor de GDF8 natural, humano (SEC ID NO 1 ), que se representa a continuación
MQKLQLCVYIYLFMLIVAGPVDLNENSECKENVEKEGLCNACTWRQNTKSSRIEAIKIQI
LSKLRLETAPNISKDVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETIIT
MPTESDFLMQVDGKPKCCFFKFSSKIQYNKWKAQLWIYLRPVETPTTVFVQILRLIKPM
KDGTRYTGIRSLKLDMNPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVT
FPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIA
PKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQII
YGKIPAMWDRCGCS375
En otra modalidad, el dominio del péptido del GDF8 comprende desde aproximadamente el residuo 327 hasta aproximadamente el residuo 338 y preferentemente comprende desde aproximadamente el residuo 329 hasta aproximadamente el residuo 332 del precursor humano natural del GDF8 El dominio DJ5 (20 mer) del péptido del GDF8 se ilustra a continuación, en ambos códigos de letras individuales y triples, sólo con la numeración de residuo basada en el precursor del GDF8 de la SEC ID NO 1 , para la conveniencia del lector (véase, Solicitud de patente norteamericana Serie No 1 1/019,001 , presentada en Diciembre 21 , 2004, cuyos contenidos se incorporan aquí en su totalidad a título de referencia)
DJ5 (SEC ID NO 8) 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 345 346 V H Q A N P R G S A G P C C T P T K M S Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Mel Ser
Opcionalmente, el dominio del péptido del GDF8 empleado en la proteina de fusión de la invención incluye sustituciones individuales conservativas de aminoácidos Simplemente a modo de ejemplo, éstas pueden ser desde una a al menos cinco posiciones de aminoácidos dentro del péptido En particular, existe opcionalmente al menos una sustitución de aminoácidos conservativa, por ejemplo, entre residuos 327 a 346 de GDF8 En otra opción, el dominio del péptido del GDF8 incluye sustituciones de
aminoácidos conservativas en no más de cinco posiciones de aminoácidos dentro del dominio del péptido del GDF8 En otra modalidad existen, por ejemplo, dos sustituciones de aminoácidos conservativas entre residuos 327 a 346 de GDF8 En otra modalidad adicional, existen, por ejemplo, tres sustituciones de aminoácidos conservativas entre residuos 327 a 346 de GDF8 En otra modalidad más, existen, por ejemplo, cuatro sustituciones de aminoácidos conservativas entre residuos 327 a 346 de GDF8 Preferentemente, las sustituciones en el residuo de aminoácidos se realizaron en una o mas posiciones, respecto del precursor humano natural GDF8 (SEC ID NO 1 ) que están marcadas por las variaciones de aminoácidos de la alineación interespecies de la figura 2 Ellos están en los residuos 328, 329, 331 , 333 y 335, y combinaciones de los mismos, donde, (a) el residuo de aminoácidos 328 es His, Leu o Asn, (b) el residuo de aminoácidos 329 es Gln o Lys, (c) el residuo de aminoácidos 331 es Asn o Ser, (d) el residuo de aminoácidos 333 es Arg o Lys, y/o (e) el residuo de aminoácidos 335 es Ser, Pro o Thr Preferentemente, el dominio del péptido del GDF8 sustituido se liga a un anticuerpo monoclonal MAB788 de rata (R& D Systems, Inc, Mmneapolis, MN) Asi, la invención brinda una proteína de fusión que incluyen un dominio del péptido del GDF8, donde el dominio del péptido del GDF8 comprende residuos de aminoácidos 327 a 346 de la SEC ID NO 1 , o un
fragmento antigenico del péptido del GDF8 El fragmento antigénico puede incluir, por ejemplo, residuos 327 a 338 de la SEC ID NO 1 y/o residuos 329 a 332 de la SEC ID NO 1 El dominio del péptido del GDF8 es preferentemente fusionado a un polipéptido que comprende una proteína de envoltura viral o un fragmento de los mismos En una modalidad, una "proteina de envoltura viral" o VCP, como se describió aquí, cuando es una parte de una proteina de fusión de la invención, incluye todos los residuos de aminoácidos encontrados en la VCP nativa (sin fusión) En una modalidad alternativa opcional, el término "proteína de envoltura viral" comprende además un fragmento o fragmentos de una VCP nativa que resulta del enlace del dominio del péptido del GDF8 y/o que resulta de la inserción del dominio del péptido del GDF8 dentro de la secuencia de la VCP nativa (por ejemplo una inserción en las terminales N y/o C y/o en cualquier sitio intermedio) y/o el fragmento que resulta de la eliminación de uno o más residuos de aminoácidos de la proteína VCP como una consecuencia de modificar por ingeniería genética la inserción o fusión del dominio del péptido del GDF8 Así, un "fragmento" VCP como parte de la proteína de fusión es una VCP que opcionalmente carece de 1 hasta aproximadamente 10 residuos respecto de la VCP nativa, y/o que fue dividida en dos o más dominios mediante la inserción del dominio del péptido del GDF8 Puede emplearse cualquier virus adecuado como complemento de fusión, tal como un virus de planta Un virus de planta preferido es, por
ejemplo un tobamovirus Las cepas del tobamovirus pueden incluir, por ejemplo, el virus del mosaico del tabaco ("TMV") cepa tipo (U1 ), virus del mosaico verde suave del tabaco (U5), virus del mosaico del tomate, virus de mancha anillada Odontoglossum, virus del mosaico de gramínea nervada, virus del mosaico Sunn-hemp y/o virus del mosaico de moteado verde del pepino La proteína de fusión preferentemente es seleccionada del grupo de polipéptidos que se citan a modo de ejemplo a continuación, que son según la SEC ID NO 47, SEC ID NO 48, SEC ID NO 49, SEC ID NO 50, SEC ID NO 51 , que tiene un dominio 20 mer del péptido del GDF8, y/o de acuerdo con SEC ID NO 54 o SEC ID NO 55, que presenta el dominio 12 mer del péptido del GDF8 La proteina de fusión generalmente es de la siguiente forma (a) una proteina de envoltura viral de planta de un virus de ARN de cadena simple en el sentido positivo, y (b) el dominio del péptido del GDF8 fusionado a la proteína de envoltura viral en una posición seleccionada de una de las siguientes (i) el extremo N-terminal de la proteína de envoltura viral, (n) el extremo C-terminal de la proteína de envoltura, (ni) 4 aminoácidos del extremo C terminal de la proteina de envoltura, (iv) en un región de bucle expuesta externamente de la proteína de envoltura,
donde la proteina de fusión alcanza una respuesta inmune al GDF8, con o sin los adyuvantes Preferentemente, la proteína de fusión comprende un epítope de neutralización específico para un anticuerpo ant?-GDF8, por ejemplo, anticuerpo monoclonal 788 ant?-GDF8 de rata y/o una fracción IgG de antisuero policlonal ant?-GDF8 de cabra De mayor preferencia, la proteína de fusión de la invención alcanza una respuesta inmune al GDF8, cuando es presenta al sistema inmune de un vertebrado, con o sin los adyuvantes La invención asimismo ofrece moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, en forma de vectores replicables, que codifican la proteína de fusión de la invención, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que comprende del nucleótido 1 1 12 al nucleótido 1 171 de la SEC ID NO 2 Un vector rep cable de acuerdo con la invención es opcionalmente un plásmido, un fago, un cósmido, y/o un virus Es de preferencia un virus de planta, tal como un tobamovirus De mayor preferencia, el vector replicable es un TMV de las cepas U1 o U5 El TMV quimérico intervenido por ingeniería genética que expresa el dominio del péptido del GDF8 se cita a modo de ejemplo aquí como TMV-FV1 , TMV-FV2, TMV-FV3, TMV-FV4, TMV-FV5, TMV-FV6 y TMV-FV7 La presente invención también ofrece las células hospedero y plantas, por ejemplo, plantas Nicotiana, que expresan el vector replicable
La invención asimismo ofrece una composición de vacuna, por ejemplo, que incluye la proteina de fusión de la invención y/o el vector de expresión replicable que se describió anteriormente, tal como el virus TMV que expresa la proteína de fusión Opcionalmente, los adyuvantes conocidos en el arte también se incluyen en la composición de vacuna de la invención La invención asimismo brinda una cantidad métodos y procesos útiles Por ejemplo, la invención brinda un método para producir la proteina de fusión de la invención, incluyendo los pasos de cultivar una planta hospedero o una célula de planta que incluye el vector de expresión replicable que se indicó anteriormente, expresando la proteína de fusión codificada, y recuperando la proteína de fusión Preferentemente, el método para producir la proteina de fusión de la invención incluye los pasos de infectar una planta hospedero con un virus recombinante que expresan una proteína de fusión que incluye el dominio del péptido del GDF8, por ejemplo, con uno o más de los virus TMV-FV1 , TMV-FV2, TMV-FV3, TMV-FV4, TMV-FV5, TMV-FV6 y TMV-FV7 citados a modos de ejemplo, y luego cosechar y purificar el virus replicado Opcionalmente, la proteína de fusión es luego aislada del TMV recombinante purificado al separar la proteina de fusión de envoltura del ARN genómico de TMV Los métodos adicionales brindados incluyen un método de lograr una respuesta inmune ant?-GDF8 en un animal, que incluye administrar al animal una cantidad efectiva de la composición de vacuna de la invención
De mayor preferencia, la invención ofrece un método de reducir la actividad de GDF8 en un animal que incluye inmunizar el animal con una cantidad efectiva de la composición de vacuna de la invención
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 ilustra péptidos superpuestos DJ1 a DJ7, en la región activa GDF8 (es decir, GDF8 maduro), ello es de los residuos 266 - 375 de la secuencia GDF8 precursora La figura 2 ilustra la alineación de la secuencia DJ5 humana de peptidos (SEC ID NO 8) comparado con el residuo de péptidos 20 análogo, como ubicado en el precursor de las proteínas GDF8 de las especies animales indicadas Las posiciones del residuo de aminoácidos de 321 a 347 están basadas en el precursor humano del GDF8 Los números de acceso del banco de genes (incorporada aquí a título de referencia) identifican la secuencia de proteínas completa publicada para cada especie respectiva Los péptidos alineados presentan las mismas SEC ID NOs
Anas platyrhynchos (pato) AAL35275 (SEC ID NO 11) Anser anser (ganso) AAL35276 (SEC ID NO. 12) Anser anser (ganso) AAR 18246 (SEC ID NO. 13) Bos taurus (vaca) AAB86687 (SEC ID NO: 14) Canis famíliaris (perro) AAR14343 (SEC ID NO: 15) Capra hircus (cabra) AAR12161 (SEC ID NO. 16) Columba livía (paloma) AAL35277 (SEC ID NO: 17) Coturnix chínensis (codorniz) AAL35278 (SEC ID NO. 18) Danío rerio (pez cebra) AAB86693 (SEC ID NO: 19) Equus caballus (caballo) BAB16046 (SEC ID NO: 20) Gallus gallus (pollo) AAK18000 (SEC ID NO: 21) Gallus gallus (pollo) AAR18244 (SEC ID NO: 22) Homo sapiens (humano) NP-005250 (SEC ID NO: 8) I. punctatus (pez gato) AAK84666 (SEC ID NO: 23) Lepus capensis (liebre) AAN87890 (SEC ID NO: 24) Macaca fascicularis (mono) AAL17640 (SEC ID NO: 25) Meleagris gallopavo (pavo) AAB86692 (SEC ID NO: 26) Morone chrysops (perca blanca) AAK28707 (SEC ID NO: 27) Mus musculus (ratón doméstico) AAC531 67 (SEC ID NO: 28) O
AAK7X707 (SEC ID NO: 29) O AÁB86689 (SEC ID NO. 30) Papio hamadryas (mandril) AAB86686 (SEC ID NO: 31) Rattus norvegicus (rata) AAB86691 (SEC ID NO: 32) Salmo salar (salmón) CAC1 9541 (SEC ID NO: 33) Sparus aurata (besugo) AAL05943 (SEC ID NO 34) Sus scrofa (cerdo) AAC08035 (SÉC ID NO: 35) Sus scrofa (cerdo) AAR18245 (SEC ID NO: 36)
La figura 3 delínea la organización genómica y la estrategia de
expresión génica de tobamovirus. Los tobamovirus presentan un ARN
genómico de aproximadamente 6.4 kb El ARN genómico es usado como un
ARNm y traducido para producir una proteína de replícacíón. El TMV produce
dos proteínas de replicación, produciéndose la proteina más grande (183 kDa)
mediante una lectura de traducción de un codón de detención ámbar (UAG).
Todos los tobamovirus producen dos ARNs subgenómicos coterminales más
pequeños (ARNsg) La proteina de envoltura es codificada por el ARNsg más próximo a 3' (17 kDa), y la proteína de movimiento (30kDa) por el ARNsg mayor El vipón de ARN y los ARNsg están cortados El ARN del tobamovirus no está poliadenilado, pero contiene una estructura similar a ARNt en el extremo 3' La figura 4 ilustra la estructura genómica de TMV y la construcción y la utilidad de los vectores de expresión GENEWARE® (1 ) muestra una copia de ADNc del genoma TMV y las posiciones de dos promotores subgenómicos (flechas inclinadas) produciendo la expresión de mensajeros subgenómicos de ARNs codificando la proteína de movimiento (MP) y la proteína de envoltura (CP), respectivamente Las proteínas de replicación son traducidas del ARN genómico ARN El vector GENEWARE® (3) fue construido mediante inserción (2) de un promotor de ARN subgenomico adicional y múltiples sitios de clonación para la inserción de genes externos (ilustrados por una secuencia de proteina fluorescente verde (GFP)) La figura 5 ilustra cinco vectores aceptores (pLSB2268, pLSB2269, pLSB2109, pLSB21 10, y pLSB1806) que fueron empleados en la generación del epítope DJ5 de fusiones de proteínas de envoltura Los cinco vectores fueron derivados del mismo vector base (pBTI 2150) La región alrededor de la proteina de envoltura también esta expandida para mostrar mayores detalles Abreviaturas U1 y U5 indican que la proteina de envoltura viral fue derivada de las cepas U1 y U5 de TMV, respectivamente
La figura 6A ilustra el diseño generalizado del par de o gonucleótidos utilizado para clonar el epítope DJ5 en las manchas de proteina de envoltura U1 de TMV y U5 de TMV Nota n1n2n3, etc representa los nucleótidos en el oligonucleótido anterior y n-1n-2n-3 etc en el oligonucleótido inverso, representa el complemento inverso del nucleótido anterior Se describen la cadena anterior y la cadena inversa La figura 6B ilustra la alineación de la secuencia de aminoácido para la proteina de envoltura U1 de TMV (SEC ID NO 56), la proteina de envoltura U5 de TMV (SEC ID NO 57) y los 12 aminoácidos N-terminales del péptido DJ5 derivado de GDF8 (SEC ID NO 44) La figura 6C ilustra un diagrama de alambres de la proteina de envoltura U1 de TMV, con las regiones N y C terminales expuestas en la superficie, junto con los residuos QANP (SEC ID NO 58), resaltados "VIS" indica la superficie interna del virus y "VOS" indica la superficie externa del virus La figura 7 ilustra la secuencia de aminoácidos de GDF8 (residuos 319 a 346 de la SEC ID NO 1 ) en la región DJ5 y están marcados los epitopes DJ5(20), DJ5(12), DJ5(8), SP2 y DJ4 "N term," marca el extremo N-terminal de la secuencia, "C term," marca el extremo C-terminal Las figuras 8A y 8B juntas ilustran la secuencia natural de ADN
(SEC ID NO 2) codificando la prohormona GDF8 (SEC ID NO 1 ) Este ADN es bien conocido en el arte, pero se presenta aquí simplemente por conveniencia
La figura 9 ilustra la secuencia de ADN con codon optimizado ejemplificada mediante el Ejemplo 1 (SEC ID NO 3) obtenida SEC ID NO 1 con traducción inversa usando codones preferidos de levadura
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Por consiguiente, la invención brinda proteínas de fusión GDF8-VCP de virus de plantas Estas proteínas de fusión GDF8-VCP pueden usarse directamente como inmunógenos para lograr respuestas inmunes ant?-GDF8 en animales, por ejemplo, a efecto de subregular el GDF8 y/o promover un aumento en la masa muscular y/o como reactivo para métodos de detección del GDF8 o anticuerpos que se unen con el GDF8 Estas proteínas de fusión GDF8-VCP pueden asimismo ser intervenidas por ingeniería genética a efecto de una escición completa y recuperación de los epítopes GDF8 expresados en una forma que es sustancialmente libre de la porción VCP de la proteína de fusión Los epitopes GDF8 se denominan generalmente aquí como péptidos GDF8 o fragmentos de péptidos La utilidad de estos péptidos del GDF8 incluye el uso como inmunógenos para obtener una respuesta inmune ant?-GDF8 en animales, y para el uso como objetivos altamente específicos de unión de anticuerpos en ensayos relacionados con GDF8 La invención asimismo brinda partículas de virus, es decir, vipones, que incluyen proteínas de fusión GDF8-VCP, y células de plantas que también los incluyen Ello se emplea opcionalmente como una fuente, a partir de la cual se purifica la
proteína de fusión GDF8-VCP o puede emplearse directamente como un inmunógeno Preferentemente, el virus de plantas es una especie del grupo de los tobamovirus Las especie de Tobamovirus incluye, por ejemplo, el virus del mosaico del tabaco (cepa tipo U 1 ), virus del mosaico de moteado verde del pepino (cepa SH), virus del mosaico del frangipaní, virus del mosaico de moteado verde kyup, virus de mancha anillada Odontoglossum, virus de moteado suave de paprika, virus de moteado suave del pimiento (cepa S), virus del mosaico de la gramínea nervada, virus Sammons' Opuntiun, virus del mosaico Sunn-hemp, virus del mosaico verde suave del tabaco (U5), virus del mosaico del tabaco (cepa Vulgare, ssp cepa NC82), virus del mosaico del tomate y virus de moteado suave Ullucus Los tobamovirus ejemplificados en este caso son los virus del mosaico del tabaco U 1 y el virus del mosaico verde suave del tabaco U5, denominado de otro modo como TMV U1 y TMV U5, respectivamente Los epítopes de GDF8 que se enlazan específicamente se identificaron micialmente al contactar antisuero ant?-GDF8 con una batería de péptidos GDF8 superpuestos y determinando el grado de actividad de unión entre los péptidos y los anticuerpos IgG del antisuero El antisuero ant?-GDF8 se obtuvo de una cabra inmunizada con el precursor de proteína GDF8 que presenta una estructura optimizada para la expresión y la antigenicidad A efecto de poder apreciar por completo la presente invención, se brindan las siguientes definiciones El uso por conveniencia de términos
individuales en la descripción no constituye limitación alguna Asi, por ejemplo, la referencia a una composición que comprende "un polipéptido" incluye la referencia a uno o más de tales po péptidos Como se utiliza aqui el término "aproximadamente" es usado de modo intercambiable con el término "alrededor de" y significa que un valor se ubica dentro del veinte porciento del valor indicado, es decir, un péptido que contiene "aproximadamente" 50 residuos de aminoácidos puede contener entre 40 y 60 residuos de aminoácidos Asimismo, se sobreentiende que esta invención no está limitada a las configuraciones particulares, los pasos de proceso y materiales aquí descritos, ya que tales configuraciones, pasos de proceso y materiales pueden variar de algún modo Asimismo se sobreentiende que la terminología aqui empleada es usada sólo a efecto de describir modalidades particulares y no debe ser considerada como limitativa, dado que el alcance de la presente invención sólo será limitado por las reivindicaciones anexas y equivalentes de las mismas Como se utiliza aquí, el término, "pohpéptido" es usado de modo intercambiable con el término "proteína," e indica un polímero que comprende dos o más aminoácidos conectados por uniones de péptidos Preferentemente, salvo indicación contraria, el término pohpéptido se distingue del término, "péptido" como se emplea aqui, en su tamaño y longitud de cadena, donde un "péptido" se refiere a una cadena de polímero de alrededor de cincuenta o menos aminoácidos, y un po péptido o proteina se refiere una
cadena de polímero que incluyen más de alrededor de cincuenta aminoácidos, salvo que se haya especificado lo contrario Opcionalmente, un péptido o un po peptido puede carecer de determinados residuos de aminoácidos que están codificados por un gen o por un ARNm Por ejemplo, un gen o una molécula de ARNm puede codificar una secuencia de residuos de aminoácidos en el extremo N terminal de un polipéptido (es decir, una secuencia señal) que es escindida del mismo, y por lo tanto puede no ser parte de la proteína final Un "péptido de GDF8" incluido un "dominio del péptido de GDF8" de una proteina de fusión, de acuerdo con la invención, es un fragmento relativamente corto derivado de la proteína GDF8, por ejemplo, el DJ5 20 mer aquí identificado Este termino opcionalmente incluye fragmentos incluso mas pequeños que estos péptidos o dominios de péptidos, tales como los dominios 12 mer y 4 mer también aqui identificados, y asimismo se incluyen opcionalmente las sustituciones de aminoácidos que se describieron aqui Aunque no se desea limitar el tamaño máximo de un péptido del GDF8 o dominio de péptido, se prefiere que el tamaño del dominio del péptido varié desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 50 residuos, de mayor preferencia que varíe en tamaño desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 20 residuos, y opcionalmente que el dominio del péptido de GDF8 de acuerdo con la invención varíe en tamaño desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 12 residuos En una modalidad particular, el
tamaño del dominio del péptido es de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 16 residuos de aminoácidos Como se utiliza aqui el termino "fragmento antigénico" en consideración a una proteína y/o péptido particular, es un fragmento de aquella proteína/péptido que es antigénico Por ejemplo, un fragmento antigénico de un dominio del péptido del GDF8 es un fragmento del dominio del péptido del GDF8 que es antigénico Como se utiliza aquí, un fragmento antigénico del dominio del péptido del GDF8 puede ser cualquier fragmento del dominio del péptido del GDF8 faltante, tan pequeño como un solo aminoácido del péptido de longitud total En una modalidad particular, un fragmento antigénico del dominio del péptido del GDF8 contiene alrededor de 3 hasta aproximadamente 20 residuos de aminoácidos En una modalidad particular, el fragmento antigénico del dominio del péptido del GDF8 contiene alrededor de 4 hasta aproximadamente 16 aminoácidos En una modalidad particular, el fragmento antigénico del dominio del péptido del GDF8 contiene alrededor de 8 hasta aproximadamente 12 aminoácidos En otra modalidad particular, el fragmento antigénico del dominio del péptido del GDF8 contiene alrededor de 12 hasta aproximadamente 20 aminoácidos Un fragmento antigénico de un dominio del péptido del GDF8 dado, como el dominio del péptido del GDF8 propiamente dicho, puede obtenerse de una fuente recombmante, de una proteína aislada de fuentes naturales y/o a través de la síntesis química/peptídica Así, un fragmento antigénico puede obtenerse, por ejemplo (i) siguiendo la digestión proteolítica de un GDF8 de existencia
natural o un fragmento de péptido de los mismos, (n) siguiendo la digestión proteolítica de un GDF8 recombinante o un fragmento de péptido de los mismos, (ni) directamente a través de su expresión recombinante, ya sea por sí misma, o como una proteína de fusión, y/o (iv) puede ser generado de novo, por ejemplo, a través de la síntesis de péptido En otra modalidad particular, un péptido de GDF8 comprende un dominio peptídico que presenta un grado de similitud (y preferentemente un grado de identidad) que alcanza desde aproximadamente 50% de similitud (preferentemente de identidad) a un 100% de similitud con el péptido definido por los residuos números 327-346 (SEC ID NO 8) del precursor humano de existencia natural del GDF8 (SEC ID NO 1 ) Los términos "purificado" o "aislado," como se emplean aqui, se refieren a materiales separados en condiciones que reducen o eliminan la presencia de materiales no relacionados, es decir, de contaminantes o impurezas, incluyendo materiales nativos, a partir de los cuales se obtiene el material Por ejemplo, una proteína purificada o aislada preferentemente está libre de otras proteínas o ácidos nucleicos, con el cual puede encontrarse dentro de una célula Un material purificado material puede contener menos de alrededor de 25%, preferentemente menos de alrededor del 50%, de mayor preferencia menos de alrededor del 75%, y de máxima preferencia menos de alrededor del 90%, de los componentes celulares, con los estaba asociado originariamente La pureza puede ser evaluada por cromatografía, electroforesis por gel, inmunoensayos, análisis de composición, ensayo
biológico y otros métodos conocidos en el arte Desde un aspecto particular, un péptido aislado del GDF8 de acuerdo con la invención puede ser uno que esta separado suficientemente de otros materiales, incluyendo el precursor de proteina GDF8 y/o la proteína madura del GDF8, de modo que es posible obtener una respuesta inmune que es específica para el péptido del GDF8 Los métodos de purificación son bien conocidos en el arte Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden ser purificados por precipitación, cromatografía, ultracentpfugación y otros medios Las proteínas y po péptidos, asi como también los péptidos, pueden ser purificados a través de diferentes métodos incluyendo, sin limitación alguna, electroforesis preparativa en gel de disco, isoelectroenfoque, HPLC, HPLC de fase reversa, filtración por gel, intercambio iónico y cromatografía de partición, precipitación y cromatografía de salazón, extracción y distribución en contracorriente Para algunos propósitos, es preferible producir el po péptido en un sistema recombmante, en el cual la proteína contiene una marca de secuencia adicional que facilita la purificación, tal como, pero sin ser ello limitativo, una secuencia de pohhistidma, FLAG®, GST y/o una secuencia que se une específicamente con un anticuerpo El polipéptido puede entonces ser purificado a partir de un hsado en bruto de la célula hospedero mediante cromatografía en una matriz apropiada de fase sólida De modo alternativo, los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos, producidos contra el pohpéptido pueden ser usados como reactivos de purificación
El término "sustancialmente puro" indica el mayor grado de pureza que puede lograrse usando las técnicas de purificación convencionales conocidas en el arte y significa un ácido nucleico, pohpéptido, péptido u otro material que no presenta otras proteínas, ácidos nucleicos u otras sustancias biológicas contaminantes derivadas de un organismo fuente original o un sistema de expresión de ADN recombinante La pureza sustancial puede ser analizada por métodos estándar y típicamente excederán al menos alrededor de 75%, preferentemente al menos alrededor de 90%, de mayor preferencia al menos alrededor de 95% y de máxima preferencia al menos alrededor de 99% de pureza La evaluación de la pureza puede efectuarse sobre la base de masa o molar Un "polinucleótido" o una "molécula de ácido nucleico" es una molécula que incluye nucleótidos incluyendo, pero sin constituir limitación alguna, ARN, ADNc, ADN genómico e incluso de de secuencias de ADN sintéticas Los términos también están contemplados para incluir moléculas de ácidos nucleicos que comprenden cualquiera de las bases conocidas en el arte de análogos de ADN y ARN Un "vector" o "vector de replicación" es un replicón, tal como un plásmido, un fago o un cósmido, al que puede estar unido o incorporado otro segmento de ácido nucleico, a modo lograr la replicación del segmento unido El término comprende asimismo un replicón que incluye los segmentos de interés de ácidos nucleicos incorporados o unidos
Los vectores que pueden usarse en esta invención incluyen plasmidos microbianos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN integrables y otros portadores que pueden facilitar la integración de los ácidos nucleicos en el genoma del hospedero Los plásmidos son la forma de vector más utilizada, pero todas las demás formas de vectores que se utilizan en una función equivalente y los cuales son o se tornan conocidos en el arte, son adecuados para ser utilizados aquí Véase, por ejemplo, Pouwels et al , Cloning Vectors A Laboratory Manual, 1985 y Supplements, Elsevier, N Y , y Rodríguez et al (eds ), Vectors A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, 1988, Buttersworth, Boston, MA La inserción del ADN que codifica el péptido del GDF8 de la invención en un vector, se logra fácilmente cuando los extremos del ADN y del vector comprenden sitios de restricción compatibles Si ello no puede realizarse, puede ser necesario modificar los extremos del ADN y/o del vector mediante la retro-digestión de las salientes de ADN de doble cadena generadas por la restricción de la escisión de endonucleasa para producir los extremos romos, o para lograr el mismo resultado al completar los extremos de cadena simple con una ADN polimerasa apropiada De modo alternativo, pueden producirse los sitios deseados, por ejemplo, mediante el enlace de secuencias de nucleótidos (conectores) con los extremos Tales enlaces pueden comprender secuencias de ohgonucleótidos especificas que definen los sitios de restricción deseados Los sitios de restricción también pueden ser generados a través del uso de la reacción de la cadena de polimerasa (PCR)
Véase, por ejemplo, Saiki et al , 1988, Science 239 487 El vector escindido y los fragmentos de ADN también pueden ser modificados, en caso requerido, a través de la prolongación homopolimépca Los vectores de expresión recombinantes usados en esta invención son construcciones de ARN o ADN que son típicamente autorreplicantes e incluyen ácidos nucleicos que codifican uno de los péptidos del GDF8 de la invención, usualmente enlazados de modo operativa a elementos de control genético adecuados, que son capaces de regular la expresión de los ácidos nucleicos en células hospedero compatibles Los elementos de control genético pueden incluir un sistema de promotor procariótico o un sistema de control de expresión del promotor eucariótico y típicamente incluye un promotor transcppcional, un operador opcional para controlar el comienzo de transcripción, los intensificadores de transcripción para elevar el nivel de la expresión de ARNm, una secuencia que codifica un sitio de unión de ribosomas adecuado y secuencias que determinan la transcripción y la traducción Los vectores de expresión pueden asimismo contener un origen de replicación que permite al vector la rep cación independientemente de la célula hospedero La expresión de ácidos nucleicos que codifican el péptido del GDF8 puede efectuarse mediante métodos convencionales, ya sea en células procarióticas o eucarióticas Una "secuencia codificadora" de ácido nucleico o una "secuencia que codifica" una proteina o péptido particular, es una secuencia de ácido
nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) que es transcrita y/o traducida en un polipéptido in vitro o in vivo cuando es colocada bajo el control de elementos de regulación apropiados Las uniones de la secuencia codificadora son determinadas por un codón de inicio en el extremo 5'-terminal y un codón de detención de traducción en el extremo 3'-terminal Una secuencia codificadora puede incluir, pero sin constituir limitación alguna, secuencias de virus de ARN, secuencias procarióticas, ADNc de ARNm eucaríótica, secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico (por ejemplo, de mamíferos) e incluso secuencias de ADN sintéticas Una secuencia de terminación de transcripción usualmente se ubicará en 3' respecto de la secuencia codificadora Como se utiliza aqui, los términos "proteína de fusión" y "péptido de fusión" se usan de modo indistinto e incluyen "proteínas quiméricas y/o péptidos quiméricos" y " proteínas/péptídos auto-catalíticos" de fusión Una proteína de fusión comprende al menos una porción de un péptido de GDF8 de la presente invención ligado a través de una unión de péptidos a por lo menos una porción de otra proteína. Por ejemplo, las proteínas de fusión pueden comprender una proteína o péptido marcador, o una proteína o péptido que ayuda en el aislamiento y/o purificación y/o antigenicidad de un péptido del GDF8 de la presente invención. Una proteína de fusión del GDF8 puede comprender al menos una porción de una proteina no GDF8 unida a través de una unión de péptido a por lo menos una porción de un polipéptido de GDF8 En modalidades preferidas, una porción del GDF8 es funcional, es decir, retiene su antigenicidad Las secuencias no GDF8 pueden ser amino
y/o carboxi-terminales en las secuencias del GDF8 Ello también esta contemplado para opcionalmente incluir una fusión de bucle, donde el dominio péptido DJ5 es insertado dentro del polipéptido portador Una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una dicha proteína de fusión comprende una secuencia que codifica al menos una porción de una proteína no GDF8 enlazada en el marco en la secuencia codificadora del GDF8 y puede codificar un sitio de escisión para una proteasa específica, por ejemplo, trombina o Factor Xa, preferentemente junto a o cerca de la unión entre la secuencia del GDF8 y la secuencia del no GDF8 En una modalidad especifica, la proteína de fusión es expresada en una célula CHO Tal proteína de fusión puede usarse para aislar los péptidos del GDF8 de la presente invención, mediante el uso de una columna de afinidad que es específica para la proteína y/o marca fusionada al péptido del GDF8 El péptido del GDF8 purificado, por ejemplo, pueden entonces ser liberado de la proteína de fusión mediante el uso de una enzima proteolitica y un sitio de escisión, tal como al que se hizo referencia anteriormente En otra modalidad, puede prepararse un péptido quimérico del GDF8, por ejemplo, una proteína de fusión glutatión-S-transferasa (GST), una proteína de fusión de unión a maltosa (MBP), o una proteína de fusión marcada con poli-histidina, para la expresión en cualquier célula o alternativamente en un sistema libre de células Por ejemplo, la GST enlaza glutation conjugado como una matriz de soporte sólido, la MBP enlaza una matriz de maltosa y los quelatos de poh-histidina a una matriz de soporte de
quelacion de Ni La proteina de fusión puede ser eluída a partir de la matriz específica con reguladores de pH apropiados o mediante el tratamiento con proteasa específica para un sitio de escisión usualmente creado por ingeniería genética entre el péptido del GDF8 y el compañero de fusión (por ejemplo, GST, MBP, FLAG®) como se ejemplifica a continuación, o poli-His como se describe arriba Las proteínas de fusión particulares de la presente invención comprenden aquellas que incluyen la proteina de envoltura de TMV-péptidos de GDF8 que se citan a continuación a modo de ejemplo Una "secuencia de nucleótidos heteróloga" como se usa aquí, es una secuencia de nucleótidos que es agregada a la secuencia de nucleótidos de la presente invención mediante métodos recombinantes para formar un ácido nucleico que no se forma naturalmente Tales ácidos nucleicos pueden codificar proteínas de fusión (por ejemplo, quiméricas) Asi, la secuencia de nucleótidos heteróloga puede codificar péptidos y/o proteínas que contienen propiedades reguladoras y/o estructurales En otra modalidad, la secuencia de nucleótidos heteróloga puede codificar una proteina o un péptido que funciona como un medio de detección de la proteína o péptido codificada por la secuencia de nucleótidos de la presente invención, luego de que sea expresado el ácido nucleico recombinante En otra modalidad más, la secuencia de nucleótidos heteróloga puede funcionar como un medio para detectar una secuencia de nucleótidos de la presente invención Una secuencia de nucleótidos heteróloga puede comprender secuencias no
codificadoras incluyendo sitios de restricción, sitios reguladores, promotores y similares Una "célula hospedero" es una célula que contiene, o es capaz de contener y expresar una molécula de ácido nucleico exógeno ya sea de modo transitorio o permanente El ácido nucleico exógeno (ADN o ARN) puede o no estar integrado (enlazada de modo covalente) en el ADN cromosómico formando el genoma en la célula En procariotas y levaduras, por ejemplo, el ácido nucleico exógeno puede ser mantenido en un elemento episomal, tal como un plásmido Con respecto a las células eucarióticas, una célula transformada de modo estable es una, en la cual el ácido nucleico exógeno fue integrado en el cromosoma, de modo que es heredado por células hija a través de la rephcación del cromosoma Esta estabilidad es demostrada por la habilidad de la célula eucariótica para establecer líneas celulares o clones que comprenden una población de células hijas que contienen el ácido nucleico exógeno Como se ejemplifica aquí, una "célula hospedero" incluye una célula de planta eucariótica que es infectada con tobamovirus recombinante Los vectores de tobamovirus ejemplificados son vectores de TMV, y son conocidos por replicarse sólo en el citoplasma de plantas Nicotiana infectadas, por ejemplo, plantas de tabaco Los vectores de TMV no ingresan en el núcleo y no transforman la célula de planta infectada de modo estable Las procariotas incluyen tanto los organismos gram positivos como los gram negativos, por ejemplo, E coli y B subtilis Las eucapotas
superiores incluyen lineas celulares de cultivo de tejido establecidas a partir de células de animales, ambas de origen no mamífero, por ejemplo, células de insectos y aves y de origen mamífero, por ejemplo, humanos, primates y roedores o plantas, como se ejemplifica a continuación Los sistemas de vector de hospedero procariótico incluyen una amplia variedad de vectores para muchas especies diferentes Como se utiliza aquí, Eschenchia coli "E coli," y sus vectores, será usado genéricamente para incluir vectores equivalentes usados en otras procariotas Un vector representativo para amplificar el ADN es pBR322 o muchos de sus derivados Los vectores que pueden ser usados para expresar el GDF8, y/o péptido del GDF8, incluyen, pero sin ser limitativo, aquellos que contienen el promotor lac (serie pUC), el promotor trp (pBR322-trp), el promotor Ipp (las senes pIN), los promotores lambda-pP o pR (pOTS), o los promotores híbridos, tales como ptac (pDR540) Véase Brosius et al , "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, y Ipp-depved Promoters", in Rodríguez y Denhardt (eds ) Vectors A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, 1988, Buttersworth, Boston, pp 205-236 Puede usarse levadura, así como células más elevadas de cultivo de tejido eucariótico como hospedero para la producción recombinante del péptido del GDF8 de la invención, y/o de anticuerpos ant?-GDF8 y/o fragmentos de aquellos anticuerpos Aunque también puede usarse cualquier línea celular de tejido eucariótico mas elevada, incluyendo los sistemas de expresión de baculovirus de insectos, se prefieren las células de mamíferos
La transformación o transfeccion y propagación de tales células se han convertido en un procedimiento de rutina Son ejemplos de tales lineas celulares útiles, las células HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), líneas celulares de de riñon de rata bebé (BRK), lineas celulares de insectos, líneas celulares de aves y líneas celulares de monos (COS) Los vectores de expresión para tales lineas celulares usualmente incluyen, por ejemplo, un origen de replicación, un promotor, un sitio de iniciación de traducción, sitios de empalme de ARN (en caso de usarse ADN genómico), un sitio de pohadenilación y un sitio de terminación de transcripción Estos vectores también contienen usualmente un gen de selección o un gen de amplificación Los vectores de expresión adecuados pueden ser plásmidos, virus o retrovirus que portan promotores derivados, por ejemplo, de fuentes tales como adenovirus, SV40, parvovirus, virus vaccinia o citomegalovirus Los ejemplos representativos de los vectores de expresión adecuados incluyen pCR®3 1 , pCDNAl , pCD [Okayama et al , 1985, Mol Cell Biol 5 1136], pMCI neo Poly-A [Thomas et al , 1987, Cell 5Í 503], pUC19, pREP8, pSVSPORT y derivados de los mismos, y vectores de baculovirus, tales como pAC 373 o pAC 610 Las secuencias procarióticas de control de expresión típicamente usadas incluyen los promotores, incluyendo aquellos derivados de los sistemas de promotores de la ß-lactamasa y lactosa [Chang et al , 1977, Nature, 798 1056], el sistema promotor del tpptofano (trp) [Goeddel et al , 1980, Nucleic Acids Res 8 4057], el sistema promotor lambda PL [Shimatake
et al , 1981 , Nature, 292 128] y el promotor tac [De Boer et al , 1983, Proc Nati Acad Sci USA 292 128], todos incorporados aqui a título de referencia Se conocen en el arte numerosos vectores de expresión que contienen tales secuencias de control, y se pueden obtener comercialmente "Ligado de modo operativo" se refiere a un conjunto de elementos, en los cuales los componentes así descritos están configurados de modo tal para realizar su función usual Así, los elementos de control ligados de modo operativo a una secuencia codificadora, son capaces de efectuar la expresión de la secuencia codificadora Los elementos de control no necesitan ser contiguos con la secuencia codificadora, hasta tanto funcionen para dirigir la expresión de los mismos Así, por ejemplo, secuencias que intervienen no traducidas, pero si transcritas pueden existir entre un promotor y una secuencia codificadora y el promotor pueden continuar considerándose como 'ligado de modo operativo" a la secuencia codificadora
Diseño General del Vector GDF8 La secuencia que codifica al ácido nucleico se diseñó preferentemente para que difiriera tanto cuanto fuera posible de la secuencia del acido nucleico de los mamíferos Por ejemplo, en una modalidad, la secuencia aminoácido del precursor GDF8 se tradujo en forma reversa, usando los codones preferidos de la levadura La secuencia resultante se estudio para determinar los codones que conservaban su homología con la secuencia del acido nucleico humano GDF8 En donde fuera posible, estos
codones se sustituían con los codones próximos mas preferidos de la levadura que codifican al mismo aminoácido El gen optimizado resultante (SEC ID NO 3) se puede expresar en cualquier sistema hospedero adecuado, incluyendo, por ejemplo los sistemas de expresión conocidos por la ciencia de insectos, mamíferos, bacterias, virus y levaduras Por ejemplo, los sistemas de expresión celular de insectos conocidos por la ciencia, tales como los sistemas del baculovirus, son conocidos por la ciencia y descritos, por ejemplo, por Summers y Smith, en el Texas Agpcultural Expepment Station Bulletin No 1555 (1987) Los materiales y métodos para los sistemas de expresión celular de baculovirus/insectos conocidos en la técnica están a la venta en el comercio en forma de equipo por, ínter alia, Invitrogen, San Diego Ca f ("MaxBac" kit) Asimismo, los sistemas celulares de expresión de bacterias y mamíferos son muy conocidos por la ciencia y están descritos, por ejemplo, por Sambrook et al (MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, ADN Cloning, Vols I y II, D N Glover ed ) Los sistemas de expresión de las levaduras también son muy conocidos por la ciencia y están descritos, por ejemplo, por YEAST GENETIC ENGINEERING (Barr et al , eds , 1989) Butter orths, Londres Muchos otros sistemas de expresión conocidos por la ciencia también están a la venta en el comercio en forma de equipo En una modalidad preferida, el gen GDF8 del precursor modificado (SEC ID NO 3) se expresó en un sistema de expresión Flp-ln™
CHO (Invitrogen, Carisbad, California), según se describe en forma más detallada en el Ejemplo 1 , mas abajo Los peptidos del GDF8 se expresan con preferencia, como parte de las proteínas de fusión en los virus adecuados de la planta Los virus de la planta alterados genéticamente proporcionan un medio eficiente de transfección de las plantas con genes que codifican a las proteínas de fusión del péptido portador Por ejemplo, en Turpén et al , 1999, Patente de E U A No 5 977 438 se presenta un debate sobre las fusiones de la proteina de envoltura de TMV Véase también Yusibov V et al , 1997, Proc Nati Acad Sci USA 94 5784-5788, Modelska, A et al , 1998 Proc Nati Acad Sci USA 95 2481-2485, que se han incorporado aquí como referencia Por lo tanto, la invención también proporciona los nuevos virus recombinantes de la planta que en su material genético incluyen las secuencias del nucleótido que codifica a la proteína de envoltura viral de la planta ("VCP") y a un peptido del GDF8, según se trata supra Las proteínas de fusión codificadas se describen aquí como proteínas de fusión del GDF8-VCP Los virus recombinantes de la planta permiten la expresión sistémica de la proteína de fusión en una planta infectada Por lo tanto, empleando estos virus recombinantes de la planta, se pueden producir grandes cantidades de proteínas de fusión de GDF8-VCP En forma opcional, las proteínas de fusión son manipuladas por ingeniería genética de modo tal que los péptidos de GDF8 se segmentan fácilmente, a partir de las proteínas de fusión, y se separan
El sitio o los sitios en el VCP en donde el peptido del GDF8 se une (fusiona) con el VCP aquí se denomina "unión de fusión " Una determinada proteína de fusión puede tener una o dos uniones de fusión La unión de fusión puede estar ubicada en el extremo C terminal del VCP en donde se fusiona con el extremo N terminal del péptido de interés La unión de fusión puede estar ubicada en el extremo N terminal del VCP en donde se fusiona con el extremo C terminal del péptido de GDF8 En otras modalidades de la invención, el péptido del GDF8 se encuentra internamente en el VCP, en este caso, la proteína de fusión tendrá dos uniones de fusión Esto se llama proteína de fusión interna Las proteínas de fusión internas pueden abarcar un VCP completo o un fragmento de la planta que "interrumpe" el péptido de GDF8 Las uniones de fusión pueden estar ubicadas en varios sitios dentro de una proteína de envoltura El péptido completo puede estar en la parte N-terminal o en la parte C-terminal del VCP Los sitios adecuados para la unión de las fusiones se pueden determinar, de acuerdo con la variación sistemática habitual, analizando la proteina interna de fusión resultante para conferirle las propiedades deseadas Los sitios adecuados para la unión de fusiones también se pueden determinar mediante la inspección de la estructura tridimensional de la proteina de envoltura, para determinar los sitios para "inserción" del péptido que no interferirá en forma significativa con las funciones estructurales y biológicas de la parte del VCP de la proteína de fusión Las estructuras tridimensionales detalladas de los VCP de la planta y
de su orientación en el virus se han determinado y están publicamente a disposición de las personas con los conocimientos de práctica en la técnica Por ejemplo, un modelo de resolución de la proteína de envoltura del virus del mosaico moteado verde del pepino (una proteina de envoltura, que tiene grandes similitudes estructurales con otras proteínas tobamovirus de envoltura) y el virus se puede encontrar en Wang y Stubbs, 1994, J Mol Biol 239 371 -384 La información estructural detallada del TMV se puede encontrar, por ejemplo, en Namba et al , 1989, J Mol Biol 208 307-325 y Pattanayok and Stubbs, 1992, J Mol Biol 228 516-528 El conocimiento de la estructura tridimensional de una partícula del virus de la planta y del proceso de montaje de la partícula del virus le permite al experto en la técnica, diseñar varias fusiones del GDF8-VCP de la invención, incluyendo inserciones y sustituciones parciales Por ejemplo, si el péptido del GDF8 es hidrofilico, puede ser apropiado para fusionar el péptido con la región TMV de la proteina de envoltura (TMVCP), que se sabe está orientada como una región de bucle de superficie Del mismo modo, los segmentos helicoidales que mantienen los contactos de la subunidad se pueden sustituir por las regiones apropiadas de las hélices del TMVCP o por los dominios de unión del ácido nucleico expresados en la región del TMVCP orientada hacia el genoma Las secuencias polinucleotídicas que codifican la proteina de fusión GDF8-VCP pueden abarcar un codon de detención "permeable" en la unión de fusión El codón de detención puede estar presente como el codón
inmediatamente adyacente a la unión de fusión o puede estar ubicado cerca (por ejemplo dentro 9 bases) de los codones que codifican a la unión de fusión La finalidad de este codón de detención permeable es mantener la relación de la proteina de fusión deseada con la proteína de envoltura de tipo silvestre Un codón de detención "permeable" no siempre produce una terminación de traducción y se traduce periódicamente La frecuencia de la iniciación y la terminación en un determinado codón de inicio/detención depende del contexto El ribosoma barre desde el 5'-f?nal/term?nal de un ARNm para el primer codón ATG Si el ribosoma estuviera en un contexto de secuencia no óptimo pasará, a determinada frecuencia, al siguiente codón de inicio disponible e iniciará la traducción corriente abajo del primero Asimismo, el primer codón de terminación encontrado durante la traducción no siempre funcionará si está en un contexto de secuencia en particular En consecuencia, muchas proteínas que se forman naturalmente como una población que tiene extensiones terminales N y/o C heterogéneas Incluyendo un codón de detención permeable en la unión de fusión que codifica la región en un vector viral recombinante que codifica a la proteina de fusión GDF8-VCP, el vector se puede usar para producir tanto la proteína de fusión más larga como la segunda proteína más corta, por ejemplo, el propio VCP Se puede usar un codón de detención permeable en/o próximo a las uniones de fusión de las proteínas de fusión en las que la parte de interés del peptido se une a la terminal C de la región de la proteína de envoltura, por medio de la cual un solo vector viral recombinante podría producir las
proteínas de fusión GDF8-VCP y VCPs Por añadidura, se puede usar un codon de inicio permeable en/o cerca de la unión de fusiones para obtener un resultado similar En el caso de TMVCP, las extensiones en las terminales N y C se localizan en la superficie de las partículas virales y se puede contar con que se proyecten lejos del eje helicoidal El ejemplo de una secuencia de detención permeable se registra en la unión de los marcos de lectura de 126/183 kDa de TMV como ya se ha descrito hace algunos años [Pelham, H R B , 1978, Nature 272 469-471 Skuzeski, J M et al , 1991 , J Mol Biol 20 365-373, definido como necesario en los requisitos del contexto 3' de esta región para conferirle permeabilidad de terminación en un gen heterólogo, marcador de la proteína (be/a-glucuronidasa) como CAR-YYA (R=pur?na, Y=p?r?m?d?na)] En otra modalidad de la invención, las uniones de fusión en las proteínas de fusión de GDF8-VCP se diseñaron para ser escindibles al tener una secuencia de aminoácido que es el substrato para una proteasa Esto permite la separación y el aislamiento del péptido del GDF8, usando la enzima proteolitica adecuada La enzima proteolítica puede hacer contacto con la proteína de fusión tanto in vitro como in vivo La expresión de la proteina de fusión de GDF8-VCP se puede impulsar por medio de cualquiera de una variedad de promotores funcionales en el contexto del vector viral de la planta recombinante y de la planta hospedero En la modalidad preferida se usan los promotores subgenómicos
virales de la planta (Véase, por ej patente de E U A No 5,316,931 , incorporada aquí como referencia) Las tecnologías recombinantes han permitido que se alargue artificialmente el ciclo vital de numerosos virus del ARN de la planta mediante una fase del ADN que facilita la manipulación del genoma viral Estas técnicas las pueden aplicar los expertos en la técnica, a fin de hacer y usar los virus recombinantes de la planta de la invención El ADNc completo del genoma TMV se clono y se unió en forma funcional a un promotor bacteriano en un plásmido de E coli (Dawson, W O et al , 1986, Proc Nati Acad Sci USA 83 1832-1836) Los transcriptos infecciosos recombinantes del ARN viral de la planta también se pueden producir usando otras técnicas muy conocidas, por ejemplo, las polimerasas del ARN de T7, T3 y SP6 que están a la venta en el comercio Las replicas exactas del ARN del vipón se pueden producir in vitro con el ARN de la polimerasa y de la capa del dinucleótido, m7GpppG Esto no solo permite la manipulación del genoma viral para la genética reversa, sino también la manipulación del virus en un vector para expresar los genes extraños Se ha descrito un método para la producción de vectores del virus del ARN de la planta, basados en la manipulación de los fragmentos del ARN con la gasa del ARN (Pelcher, L E et al , 1982, EP 67553A2) La información detallada sobre la forma de hacer y usar el ARN recombinante de los virus de la planta se encuentra, entre otros lugares en la patente de E U A No 5,316,931 (Donson et al ), que se ha incorporado aqui como referencia La invención proporciona los ácidos nucleicos que abarcan un vector
recombinante del ARN de la planta para la expresión de las proteínas de fusión del GDF8-VCP La invención también proporciona los ácidos nucleicos que abarcan la parte o las partes de los vectores que codifican las proteínas de fusión del GDF8-VCP Los vectores descritos en la patente norteamericana No 5,316,931 , incorporada aqui como referencia, son los preferidos, en particular, porque expresan a las proteínas de fusión de la invención La parte VCP de la planta se puede derivar, a partir del mismo virus del cual deriva el genoma del vector de la expresión Es decir, la proteina de envoltura es opcionalmente natural con respecto al genoma viral recombinante En forma alternativa, el compañero de la fusión de la proteina de envoltura puede ser heterologo, es decir, no natural, ya que deriva de un virus diferente del virus que contribuye al genoma viral recombinante En una modalidad preferida, la proteína de envoltura) del 17 5 kDa de TMV se usa en conexión con un vector derivado de TMV El péptido/polipéptido de interés en la proteína puede estar compuesto por cualquier dominio péptido de GDF8 como se define aquí, con tal que el dominio péptido de GDF8 no interfiera en forma significativa con una pretendida (i) capacidad de la proteína de fusión de fijarse a la molécula del receptor, incluyendo a los anticuerpos y a los receptores de la célula T, (n) capacidad de inducir una respuesta inmune, y/o (ni) cualquier actividad biológica que se pueda requerir de la proteína de fusión, incluyendo la actividad hormonal, la actividad mmunorreguladora, tales como un substrato
para una enzima o la actividad quelante del metal, sólo por mencionar algunas Se empleo, en particular, el sistema GENEWARE® disponible en Large Scale Biology Corporation ("LSBC") basado en el TMV Véase, por ejemplo Pogue, et al 2002, Ann Rev Phytopathol 40 45-74, incorporada como referencia aquí TMV tiene un genoma de ARN de una sola cadena horizontal en sentido positivo de aproximadamente 6400 nucleótidos Las proteínas virales a cargo de la replicación del ARN se transcriben directamente del ARN genómico, puesto que la expresión de los genes internos se logra, a través de la producción de los ARNs subgenómicos La producción de los ARNs subgenómicos se controla mediante las secuencias en el genoma de TMV que funcionan como promotores subgenómicos El VCP se traduce del ARN subgenómico, que es la proteína más abundante, y del ARN producido en la célula infectada (perspectiva proporcionada por la figura 3) En una planta infectada de TMV, hay vanos miligramos de VCP producido por gramo de tejido infectado Los vectores de expresión
GENEWARE® sacan ventaja de la resistencia y de la duración de la actividad de este promotor para reprogramar las prioridades de traducción de las células hospedero de la planta, de modo tal que las proteínas codificadas del virus se sintetizan a grandes niveles, similares al de TMV VCP Las copias de ADNc de longitud completa del genoma del ARN de TMV bajo control del promotor de la polimerasa del ARN T7 se prepararon en un plasmido compatible de Eschenchia coli Las manipulaciones del ADNc
del virus se realizaron usando los procedimientos del ADN recombinante estándar y del ADN recombinante transcrito in vitro con la pohmerasa del ARN T7 para generar ARN infeccioso (perspectiva proporcionada por la figura 4) Los transcriptos infecciosos se usaron para infectar varias especies relacionadas con el tabaco (género Nicotiana), incluyendo las especies LSBC creadas de tabacum, benthamiana y Nicotiana excelsiana (Fitzmaupce, W P , 2002 Patente de E U A No 6 344 597, incorporada como referencia aqui), a través de lesiones provocadas por un abrasivo TMV se replica en la célula inicial, se mueve hacia las células adyacentes para producir focos de infección circulares y luego entra al sistema vascular de las plantas para transportarla a las hojas aéreas Alli, infecta sistemáticamente a la mayoría de las células en cada hoja infectada El gen extraño se expresa en todas las células que expresan otros productos de la proteína del virus, incluyendo la replicasa, la proteína de movimiento y la proteína de envoltura La proteína extraña se deposita en el sitio impuesto por la secuencia de la proteína Las proteínas citosólicas acumulan citosol en la planta, tal como la proteína fluorescente verde, GFP), las proteínas segregadas se acumulan en el ER de la planta, los compartimientos vacuolares o apoplasto, dependiendo de las secuencias especificas del objetivo de la proteina que están presentes dentro de la proteína extraña o que se agregan por ingeniería genética Este sistema permite no sólo la manipulación del genoma viral para la genética reversa, sino también la manipulación del virus mediante los métodos del ADN recombinante estándar
Los vectores de GENEWARE® permiten la expresión de las proteínas extrañas y de los péptidos por dos métodos distintos 1 ) Expresión del gen independiente agregando un gen extraño para la expresión en lugar del virus de la proteína de envoltura, de manera que se expresará a partir del promotor del virus endógeno de la proteína de envoltura Un segundo promotor de la proteina de envoltura con menor actividad transcppcional y sin identidad en la secuencia se ubica corriente abajo de la región de codificación heteróloga y, luego, se agrega un gen de la proteína de envoltura del virus Esto codifica un tercer ARN subgenómico permitiéndole al vector del virus expresar a todos los genes necesarios para la replicación del virus y el movimiento sistémico además del gen heterólogo destinado para la sobreexpresión 2) Exposición de los péptidos inmunogénicos en la superficie de las partículas del virus El vipón de TMV es un bacilo/bacteria rígido de -18 nm de diámetro y 300 nm de longitud La estructura del vipón y de la proteína de envoltura se ha determinado mediante la difracción de los rayos X, revelando una estructura de aproximadamente 2 130 subunidades de proteina de envoltura dispuestas en una hélice dispuesta en sentido dextrógiro, encapsulando el ARN genómico, con 16 3 subunidades por giro Esta invención también proporciona particulas del virus o vipones, que incluyen las proteínas de fusión del GDF8-VCP Por ejemplo, la cubierta de las partículas del virus de la invención puede estar compuesta completamente de la proteína de fusión de GDF8-VCP En otra modalidad, la partícula del virus está compuesta de una mezcla de proteínas de fusión de
GDF8-VCP y de VCP no fusionada, donde puede variar el coeficiente de las dos proteínas Como las proteínas de envoltura del tobamovirus se pueden autoensamblar en las partículas del virus, las partículas del virus de la invención se pueden ensamblar tanto in vivo como in vitro Las partículas del virus también se pueden desensamblar convenientemente usando las técnicas muy conocidas, a fin de simplificar la purificación de las proteínas de fusión de GDF8-VCP o sus partes La invención también proporciona células la planta recombinantes incluyendo las proteínas de fusión de GDF8-VCP y/o las particulas del virus incluyendo a las proteínas de fusión de GDF8-VCP Estas células de la planta se pueden producir infectando las células de la planta (en un cultivo o en las plantas completas) con las partículas del virus recombinante infeccioso de la invención o con los pohnucleótidos que incluyen los genomas de la partícula del virus infeccioso de la invención Las células de la planta recombinante de la invención tienen muchos usos, el principal entre otros es servir como fuente para las proteínas de fusión de envoltura de la invención En forma opcional, los vectores de la invención están optimizados por el codón, para el uso del codón del organismo hospedero seleccionado, por ejemplo, plantas del género Nicotiana
Anticuerpos Ant?-GDF8 y Ant?-VCP-GDF8 Los métodos de la invención incluyeron un proceso de selección de las proteínas de fusión de GDF8-VCP y/o de los peptidos de GDF8 contra un antisuero policlonal ant?-GDF8 Este proceso se usó para identificar varios epitopes de GDF8 que se fijarán específicamente a los anticuerpos anti-GDF8 En una modalidad, el antisuero ant?-GDF8 se obtuvo inmunizando a un animal con el precursor GDF8 El gen precursor GDF8 se modificó para proporcionar una forma optimizada de la expresión y la inmunogenicidad Por ejemplo, la secuencia del ADN natural de la prohormona GDF8 (SEC ID NO 2) se optimizó para la expresión en los mamíferos y los sistemas de expresión viral conocidos por la ciencia Además, se hicieron los cambios para evitar los efectos negativos los mecanismos del hospedero viral Los mecanismos de interrupción característicos del hospedero viral incluyen el control transcppcional, estabilidad del ARN (escisión), etc Estos cambios vuelven al ácido nucleico menos similar al hospedero y más similar al virus La invención también incluye anticuerpos policlonales y monoclonales (mAb) que se fijan específicamente a las proteínas de fusión de GDF8-VCP y/o al GDF8 y a sus fragmentos péptidos de la invención Según se usa aquí, el término "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobuhna y/o a sus fragmentos La inmunoglobuhna de origen natural consta de, por lo menos, un po peptido codificado fundamentalmente por los genes de la inmunoglobulina Los genes reconocidos de la inmunoglobuhna incluyen tanto a los genes de la región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, como
también a la minada de genes de la región variable de la inmunoglobulina El anticuerpo o los anticuerpos, de acuerdo con la invención también contienen los fragmentos del anticuerpo, es decir, los fragmentos antígeno de la ligadura, por ejemplo, Fv, Fab, y F(ab')2, proteínas de la ligadura de una cadena individual diseñada por ingeniería (por ejemplo, Huston et al , 1988, Proc Nati Acad Sci U S A , 85, 5879-5883, and Bird et al , Science, 1988, 242, 423-426, incorporada aquí como referencia en su totalidad), asi como también los anticuerpos del híbrido bifuncional (por ej Lanzavecchia et al , 1987, Eur J Immunol 17, 105) [Véase, generalmente, Hood et al , 1984, Immunology, Benjamín, N Y , 2a ed , Harlow y Lañe, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) y Hunkapiller y Hood, 1986, Nature, 323, 15-16, todo lo anterior se incorpora aqui como referencia ] Por ejemplo, el suero producido de animales inmunizados por las proteínas de fusión de GDF8-VCP y/o los péptidos GDF8 de la invención, usando los métodos estándar, se puede usar directamente o se puede separar la fracción de IgG del suero usando los métodos estándar, tales como plasmaforesis o cromatografía de adsorción con adsorbentes específicos de la IgG, tales como Proteína A o Proteína G inmovilizadas En forma alternativa, se pueden preparar los anticuerpos monoclonales y, opcionalmente, los fragmentos de la unión del antígeno o las proteínas de la unión recombinante, derivada de estos mAbs Estos mAbs o sus fragmentos se pueden humanizar opcionalmente mediante los métodos conocidos por los expertos en la ciencia
Los hibpdomas que producen los mAbs que se fijan selectivamente a las proteínas de fusión de GDF8-VCP y/o a los péptidos de GDF8 de la invención, se producen mediante las técnicas muy conocidas Por lo general, el proceso que incluye a la fusión de una línea celular, que se perpetúa con un linfocito B que produce el anticuerpo deseado En forma alternativa, se pueden usar las técnicas de no fusión para generar el anticuerpo inmortal que produce líneas celulares por ejemplo, la transformación inducida por vía viral [Casali et al , Science 234 476 (1986)] Por lo general, las líneas celulares inmortalizadas son células de mamíferos transformadas, en particular, células de mieloma originadas en roedores, bovinos y humanos Las líneas celulares de mieloma que se emplean con mayor frecuencia son las de rata y ratón, por una razón de conveniencia y disponibilidad Las técnicas para la obtención de los linfocitos productores del anticuerpo de mamíferos inyectados con antígenos son muy conocidas En general, si se emplean células de origen humano se usan los linfocitos de la sangre periférica (PBLs), pero cuando las fuentes son mamíferos no humanos se usan células de bazo y nodulo linfático Al animal hospedero se le inyectan dosis repetidas de antígeno purificado (las células humanas se sensibilizan in vitro), y se permite que el animal genere las células productoras del anticuerpo deseado, antes de que sean derivadas para su fusión con la linea celular inmortalizante Las técnicas para la fusión también son muy conocidas en la
ciencia y, en general, implican la mezcla de las células con un agente de fusión, tal como el po etilenglicol Los hibpdomas se seleccionan mediante los procedimientos estándar, tales como la selección de HAT (hipoxantina-aminoptepna-timidina) Se seleccionan los que segregan el anticuerpo deseado, usando mmunoensayos estándar, tales como el Western blotting, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), RÍA (radioinmunoensayo), etc Los anticuerpos se recuperan del medio usando las técnicas estándar de purificación de la proteína [Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoensayos (Elsevier, Amsterdam, 1985)] Se disponen de muchas referencias para proporcionar una guía sobre la aplicación de las técnicas mencionadas arriba [Kohler et al , Hybndoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980), Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoensayos (Elsevier, Amsterdam, 1985), Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984), Hurrell, Monoclonal Hybpdoma Antibodies Techniques and Applications (CRC Press, Boca Ratón, FL, 1982)] También se pueden producir anticuerpos monoclonales usando los sistemas de la biblioteca de fagos muy conocidos Véase, por ejemplo, Huse, et al , 1989, Science 246 1275, Ward, et al , 1989, Nature, 341 544 Se pueden usar tanto los anticuerpos policlonales como los monoclonales producidos de esta manera, por ejemplo, unidos a un soporte
solido e inmovilizados, de acuerdo con los métodos muy conocidos para purificar los péptidos GDF8 por cromatografía de inmunoafmidad También se pueden usar los anticuerpos que se unen a las proteínas de fusión GDF8-VCP y/o a los peptidos GDF8, no marcados o marcados por los métodos estándar, como la base de los inmunoensayos para detectar o cuantificar las proteínas o los péptidos que incluyen a los epítopes GDF8, por ejemplo, proteína natural GDF8, proteínas de fusión GDF8-VCP y/o los péptidos GDF8 El rótulo especial que se use dependerá del tipo de inmunoensayo Los ejemplos de los rótulos que se pueden usar incluyen, pero no están limitados a los radiomarcados, tales como 32P, 125l, 3H y 14C, rótulos fluorescentes, tales como fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil y umbehferona, quimioluminiscentes, tales como lucifepa y 2,3-d?h?droftalaz?nad?onas y enzimas, tales como la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la sozíma y la glucosa-6-fosfato deshidrogenase Los anticuerpos se pueden identificar/etiquetar con esas marcas mediante los métodos conocidos Por ejemplo, se pueden usar los agentes de unión/acoplamiento, tales como aldehidos, carbodnmidas, dimaleimida, imidatos, succinimidas, benzadina bisdiazotizada y similares para identificar/etiquetar los anticuerpos con etiquetas fluorescentes, quimioluminiscentes o enzimáticas Los métodos generales inherentes son conocidos en la técnica y están descritos, por ejemplo, en Immunoassay A Practical Guide, 1987, Chan (Ed ), Academic Press, Inc , Orlando, FL Estos
inmunoensayos se podrían llevar a cabo, por ejemplo, en fracciones obtenidas durante la purificación de los receptores Los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse para identificar clones de ADNc particulares que expresan po péptidos relaciones con GDF8 en sistemas donadores de la expresión La neutralización de anticuerpos específicos para el sitio de unión de ligandos de un receptor también puede usarse como antagonistas (inhibidores) para bloquear o reducir la función de GDF8 Tales anticuerpos neutralizantes pueden identificarse perfectamente a través de la experimentación de rutina, como se ejemplificó mediante los ejemplos indicados a continuación El antagonismo de la actividad de GDF8 in vivo o in vitro puede llevarse a cabo usando moléculas de anticuerpo completas, o el bien conocido antígeno que une los fragmentos tales como los fragmentos Fab, Fe, F(ab)2, y Fv Las definiciones de tales fragmentos puede encontrarse como se describió previamente o por ejemplo, en Klein, Immunology (John Wiley, New York, 1982), Parham, Chapter 14, in Weír, ed Immunochemistry, 4th Ed (Blackwell Scientific Publishers, Oxford, 1986) También se describió el uso y la generación de fragmentos de anticuerpos, por ejemplo los fragmentos Fab [Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)], los fragmentos Fv [Hochman et al , 1973, Biochemistry 72 1 130, Sharon et al , 1976, Biochemistry 75 1591 , Ehrlich et al , Patente Norteamericana No 4,355,023] y medias moléculas de anticuerpos (Auditore-
Hargreaves, Patente Norteamericana No 4,470,925) Se describieron además, métodos para preparar los fragmentos Fv recombmantes basados en secuencias de región variable de cadena liviana y pesada de anticuerpos, por ejemplo, en Moore et al (Patente Norteamericana No 4,642,334) y en Pluckthun, 1991 , BiolTechnology 9 545 Alternativamente, puede efectuarse la síntesis química mediante métodos estándar La presente invención también incluye anticuerpos anti-idiotípicos, ambos pohclonales y monoclonales, que se produjeron usando los anticuerpos que se describieron previamente Estos anticuerpos son útiles porque pueden imitar las estructuras de los gandos
Composiciones de vacuna y administración En una modalidad preferida, los vipones que expresan proteínas de fusión del GDF8-VCP, la proteina de fusión del GDF8-VCP y/o los péptidos del GDF8 derivados de la misma, son incorporados en cualquier composición de vacuna aceptable Tales composiciones de vacuna son bien conocidas en el arte e incluyen, por ejemplo, solución salina y reguladores de pH fisiológicamente compatibles y similares, asi como los adyuvantes, como se describe en mayor detalle a continuación La composición de vacuna brindada se emplea, por ejemplo, para obtener antisuero para analizar e identificar un epitope específico de neutralización para un anticuerpo ant?-GDF8 Como se ejemplifica aquí, el precursor purificado de la proteína del GDF8 expresada por un vector que incluye SEC ID NO 3 fue inyectado a
una cabra en una composición de vacuna que incluía medio mg de precursor de proteina GDF8 emulsionado en adyuvante completo de Freund (CFA) La composición de vacuna, preferentemente se inyectó en forma subcutánea (SC) debajo de la piel de la cabra Se prefieren los posteriores refuerzos de inmunización Éstos pueden administrarse en intervalos adicionales adecuados con la misma dosis o una dosis reducida de la proteína, por ejemplo, en intervalos que son de alrededor de 2-5 semanas luego de la inyección inicial Comenzando desde aproximadamente dos semanas posteriores a la inyección inicial, pero preferentemente comenzando luego de un período mas prolongado, por ejemplo, de tres a quince semanas o más aún, se recolecta el suero, como es requerido, del animal inmunizado El suero recolectado es luego preferentemente purificado y/o fraccionado mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobu na, tales como, por ejemplo, proteina A-sefarosa, proteína G-agarosa, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía por afinidad con un ligando adecuado Como se cita aquí a modo de ejemplo, la fracción IgG del suero, fue luego fraccionada de una columna de proteina G-agarosa La fracción IgG antisérica ant?-GDF8 está luego disponible para ser seleccionada entre una cantidad de péptidos del GDF8 maduro, como se describe en mayor detalle en el ejemplo 3, a continuación En una modalidad preferida, la vacuna comprende un virus de planta intacto que expresa la proteína de fusión GDF8-VCP como un
inmunogeno, por ejemplo, suspendido en una composición fisiológica En otra modalidad preferida, la vacuna comprende la proteina VCP sustancialmente aislada del vipon e incluyendo opcionalmente uno o más adyuvantes conocidos en el arte En otra modalidad preferida, la composición de vacuna comprende uno o más peptidos GDF8, junto con los adyuvantes adecuados En otra modalidad adicional, la composición de vacuna comprende combinaciones de lo anterior La composición de vacuna incluye una cantidad suficiente del inmunógeno deseado, tal como la proteína de fusión GDF8-VCP, para lograr una respuesta inmune La cantidad administrada por dosis puede alcanzar desde aproximadamente 1 microgramo/kg hasta aproximadamente 1 0 g /kg, con respecto a la masa del animal Cuando la inmunización se realiza con el objetivo de obtener anticuerpos po clonales o hnfocitos activados (para la posterior selección e hibridación), se emplea finalmente cualquier animal vertebrado adecuado Preferentemente, el animal es un mamífero, e incluye, pero sin constituir limitación alguna, roedores, tales como ratones, ratas, conejos, caballos, perros, gatos, bovinos, porcinos, por ejemplo, cerdos y puercos, ovinos, por ejemplo, cabras y ovejas, primates, por ejemplo, monos, antropomorfos grandes y humanos, y similares "Adyuvantes" son agentes que aumentan de modo no especifico una respuesta inmune a un antigeno particular, reduciendo asi la cantidad de antígeno necesario en cualquier vacuna administrada y/o la frecuencia de
inyección necesaria para generar una respuesta inmune adecuada para el antígeno de interés Los adyuvantes adecuados para la vacunación de animales incluye, pero sin ser limitativo, el adyuvante 65 (que contiene aceite de mam, monooleato de manida y monostearato de aluminio), los adyuvantes de Freund completo o incompleto, geles minerales, tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y alumbre, agentes tensioactivos, tales como hexadecilamina, octadecilamina, solecitina, bromuro de dimetildioctadecilamonio, N,N-d?octadec?l-N',N'-b?s(2-h?drox?met?l) propandiamina, metoxihexadecilghcerol y polioles plurónicos, po aniones, tales como pirano, sulfato de dextrano, poli IC, ácido poliacrilico y carbopol, péptidos, tales como el muramil dipéptido, dimetilglicma y tuftsina, y emulsiones oleosas La proteína o péptidos también ser administrados siguiendo la incorporación en liposomas u otros microportadores La información concerniente a los adyuvantes y distintos aspectos de inmunoensayos se describe, por ejemplo, en las senes de P Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, 3a Edición, 1987, Elsevier, New York, incorporada aquí a título de referencia Cuando las proteínas de fusión GDF8-VCP de la invención, los fragmentos de los mismos o partículas virales que expresan las proteínas del GDF8-VCP o los fragmentos deben ser administrados in vivo, usualmente son administrados como una composición farmacéutica que incluye un portador o excipiente aceptable para uso farmacéutico El portador puede ser cualquier sustancia compatible no toxica adecuada para brindar los compuestos
deseados al cuerpo El portador puede incluir agua estéril, alcohol, grasas, ceras y sólidos inertes Asimismo pueden incorporarse en la composición farmacéutica agentes reguladores de pH, agentes de dispersión, etc , aceptables para uso farmacéutico Adicionalmente, cuando las proteínas de fusión o los fragmentos son usados para inducir respuestas inmunes (protectoras o de otro tipo), la formulación puede comprender uno o más adyuvantes inmunológicos a los efectos de estimular una respuesta inmune más potente deseada Cualquiera de las vías de administración puede usarse al administrar las composiciones a un animal incluyendo un ser humano Las vías de administración estándar incluyen, por ejemplo, la administración endovenosa, intramuscular, subcutánea, mtradermica, intrapeptoneal y/u oral Para especies de peces, los métodos de administrar una composición de vacuna o una composición inmunogénica incluyen los anteriores, así como sumergir el pez en agua que incluye una concentración antigénica del péptido, rociar el pez con una concentración antigénica del péptido, mientras que el pez es extraído brevemente del agua etc El especialista apreciara que la composición de vacuna, es preferentemente formulada de modo apropiado para cada tipo de receptor animal y vía de administración Las composiciones para la administración parenteral comprenden una solución de la proteina de fusión (o derivado) o una mezcla de las mismas disuelta en un portador aceptable, preferentemente un portador acuoso, por ejemplo, agua, agua regulada de pH, solución salina al 0 4%, glicepna al 0 3% y similares Estas
soluciones son estériles y generalmente no presentan dificultades particulares Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales Estas composiciones pueden contener sustancias auxiliares aceptables para uso farmacéutico como requeridas para las condiciones fisiológicas aproximadas, tales como agentes para ajustar el pH y agentes reguladores de pH, agentes para ajustar la toxicidad y similares, por ejemplo acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio, etc La concentración del péptido del GDF8 y/o proteina de fusión GDF8-VCP (o porciones de la misma) en estas formulaciones puede variar ampliamente dependiendo de la secuencia de aminoácidos específica y la actividad biológica deseada, por ejemplo, de menos de aproximadamente 0 5%, usualmente al menos alrededor de 1 % a tanto como 15 o 20% en peso y será seleccionado basado en principio en volúmenes de líquidos, viscosidades, etc , de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y la condición del receptor Los métodos actuales para preparar composiciones que pueden administrarse en forma parenteral y los ajustes necesarios para la administración a individuos son conocidos u obvios para aquellos especialistas en el arte, y se describen en mayor detalle, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Science, en la edición actual, Mack Publishing Company, Easton, Pa , que es incorporada aquí a titulo de referencia
Identificación de los epitopes de unión de GDF8 Los anticuerpos policlonales o monoclonales ant?-GDF8 adecuados son puestos en contacto con la proteína del GDF8 durante un periodo de tiempo suficiente para el anticuerpo para unirse selectivamente a la proteína Luego se confirmó en los bioensayos con el GDF8 que el anticuerpo neutralizó sustancialmente toda la actividad de la proteína GDF8 De preferencia cualquier bioensayo con GDF8 puede emplearse a tal propósito, como se ejemplifica a continuación mediante el Ejemplo 3, como un ensayo de activación transcppcional in vitro de acuerdo con Thies et al , 2001 , (Growth Factors 18, 251 ) Generalmente, un péptido del GDF8 útil como un antígeno o un epítope de unión de acuerdo con la invención incluye desde aproximadamente el residuo 312 hasta aproximadamente el residuo 361 de GDF8 (SEC ID NO 1 ) En particular, un péptido de acuerdo con la invención incluye desde aproximadamente el residuo 320 hasta aproximadamente el residuo 350 de GDF8 (SEC ID NO 1 ) El péptido preferentemente incluye desde aproximadamente el residuo 321 hasta aproximadamente el residuo 346 de GDF8 (SEC ID NO 1 ) El especialista apreciará que el péptido de GDF8 de la invención puede modificarse finalmente para incluir al menos una sustitución de aminoácidos conservativa en cualquier posición, siempre que el polipéptido se une específicamente con un anticuerpo monoclonal MAB788 de rata, como se indica a continuación a modo de ejemplo Tales sustituciones conservativas
pueden incluir, por ejemplo, variaciones en los residuos 328, 329 y 335, y combinaciones de los mismos, en los cuales el residuo 328 de aminoácido es His, Leu, Asn o Val; el residuo 329 de aminoácido es Lys o Leu, y el residuo 335 de aminoácido es Ser o Pro o Thr El precursor GDF8 de los residuos 328, 329 y 335 puede variar dentro de las especies cruzadas de la secuencia dentro de la proteína GDF8, como se ilustró en la figura 2, pero a pesar de ello el GDF8 maduro permanece funcional. La figura 1 ilustra un mapa de la región activa GDF8 (que forma la proteína madura) en el contexto de su proteína precursora Se encuentran superpuestas al mapa de la región activa GDF8 las ubicaciones de siete péptidos superpuestos. Estos péptidos superpuestos se diseñaron para proveer objetivos para identificar el epítope que se une al anticuerpo o epítopes de GDF8 El péptido rotulado como DJ5 fue identificado por exploración con la fracción de IgG del antisuero ejemplificado de cabra anti-GDF8 como el único epítope de unión significativo de GDF8 para el antisuero ejemplificado Este péptído tiene una secuencia (SEC ID NO 8) correspondiente al residuo 321 hasta el residuo 346 del precursor GDF8 (SEC ID NO 1 )
Animales que se trataran y/o inmunizarán El resultado de la inmunización exitosa que genera el anticuerpo neutralizante de GDF8 sera la subregulacion de la función de GDF8 en el animal inmunizado En una modalidad preferida, el animal es un animal "productor de alimentos", y el resultado de la inmunización activa o pasiva es un aumento en el peso del animal, en particular la masa muscular con relación a los animales no inmunizados La inmunización pasiva puede realizarse, por ejemplo, tratando un animal con un anticuerpo ant?-GDF8 neutralizante y/o su fragmento de anticuerpo En otra modalidad preferida, el animal es un humano u otro animal, por ejemplo, una mascota o animal de compañía, donde la función de GDF8 se subregula por inmunización activa o pasiva En esta modalidad alternativa óptima, la finalidad de la subregulación de GDF8 es proveer tratamiento médico o veterinario, por ejemplo, para contrarrestar una afección de desgaste muscular, y/o para fines de investigación en un animal que no se cria para fines alimenticios En una modalidad preferida alternativa opcional, los animales que se tratarán para fines veterinarios incluyen todos los animales que se beneficiarán a partir de dicho tratamiento, por ejemplo, como se mencionó con anterioridad, aunque sin excluir específicamente a los humanos El animal con preferencia es un vertebrado, y con mayor preferencia un mamífero, ave o pez Debe reconocerse que la definición de un animal productor de alimento variara entre las personas de diferentes culturas
Además, los animales productores de alimentos que no se emplean normalmente para consumo humano, por ejemplo, en los Estados Unidos, pueden emplearse como animales productores de alimentos para alimentar a otros animales, como mascotas, mascotas exóticas, animales de compañía y/o animales de investigación De este modo, la siguiente lista no pretende ser limitativa, sino que se provee simplemente a modo de ejemplo En una modalidad particular, el animal de la invención es un mamífero Otros mamíferos de la invención incluyen primates no humanos (por ejemplo, monos), bovinos (por ejemplo, ganado o vacas lecheras), porcinos (por ejemplo, cerdos o chanchos), ovinos (por ejemplo, cabras u ovejas), equinos (por ejemplo, caballos), caninos (por ejemplo, perros), felinos (por ejemplo, gatos domésticos), camellos, ciervos, antílopes, conejos y roedores (por ejemplo, cobayos, ardillas, ratas, ratones, jerbos y hámsters) Las aves incluyen Anatidae (cisnes, patos y gansos), Columbidae (por ejemplo, palomas y pichones), Phasianidae (por ejemplo, perdices, urogallos y pavos) Thesienidae (por ejemplo, pollos domésticos), Psittacines (por ejemplo, pencos, guacamayos y loros), pájaros de juego, y rátidas (por ejemplo, avestruces) Los pájaros pueden asociarse con la avicultura tanto comercial como no comercial Estos incluyen por ejemplo, Anatidae, tales como gansos y patos, Columbidae, por ejemplo, palomas y pichones, incluyendo pichones domésticos, Phasianidae, por ejemplo, perdices, urogallos y pavos, Thesienidae, por ejemplo, pollos domésticos
Otros animales productores de alimentos incluyen, por ejemplo, marsupiales (tales como canguros), reptiles (tales como tortugas de granja) y otros animales domésticos económicamente importantes para los cuales los métodos de la invención son seguros y efectivos en el aumento de peso y/o la promoción del crecimiento muscular Para los fines de la presente invención, se entenderá que el término "pez" o "peces" incluirá sin limitaciones, el grupo de peses Teleosti, es decir, teleósteos Tanto el orden de los Salmoniformes (que incluye la familia de Salmonidae) y el orden de los Perciformes (que incluye la familia de Centrarchidae) se incluyen dentro del grupo de los Teleosti Ejemplos de potenciales receptores de pescados incluyen la familia de los Salmonidae, la familia de los Serranidae, la familia de los Spandae, la familia de los Cichlidae, la familia de los Centrarchidae, el Roncador de tres líneas (Parapnstipoma tnlineatum), y el Plecostomo de ojos azules (Plecostomus spp)
Familia Salmonidae
NOI^RE ^X NqMJCO__ NOMBRE COMÚN Coreqonus clupeaformis Corégano lacustre Coreqonus hoyi Coregonus Oncorhynchus keta Salmón perro Oncorhynchus qorbuscha Salmón rosado Oncorhynchus kisutch Salmón plateado Oncorhynchus masou Salmón cereza (masou salmón) Oncorhynchus nerka Salmón Sockeye Oncorhynchus tshawytscha (salmón chinook) Prosopium cylindraceum Corégano redondo Oncorhynchus clarki Trucha garganta cortada Oncorhynchus mykiss Trucha arco iris Salmo salar Salmón del Atlántico Salmo trutta Trucha marrón Salmo trutta X S. fontinalis Trucha híbrida tigre Salvelinus alpinus Trucha ártica Salvelinus confluentus Trucha toro Salvelinus fontinalis Trucha de arroyo Salvelinus leucomaenis Trucha de manchas blancas Salvelinus malma trucha Dolly varden (Miyabe charr) Salvelinus namaycush Trucha de lago Thymallus thymallus Tímalo
Algunos Miembros de la Familia Serranidae
NOMBRE TAXONÓMICO NOMBRE COMÚN Centrop?stis ocyurus Lobo marino de Bancos Centroprístis philadelphicus Lobo marino de rocas Centropristis striata Lobo marino negro Diplectrum bivittatum Perca de arena enana Diplectrum formosum Serrano Epinephelus flavolimbatus Mero de laterales amarillos Epinephelus morio Mero rojo Serranus phoebe Sarasa Serranus tortuqarum Guaseta terrosa
Algunos miembros de la familia Spandae
NOMBRE TAXONÓMICO N (3MB RELCOM UN Archosarqus probatocephalus Sargo Archosarqus rhomboidalis Salema Calamus penna Mojarra rayada Laqodon rhomboides Xlavita Pagrus Major Besugo Sparus aurata Dorada Stenotomus chrysops Sargo de América del Norte
Algunos miembros de la familia Cichlidae
NOMBRE TAXONÓMICO NOMBRE COMÚN Aequidens latifrons Acara azul Cichlisoma niqrofasciatum Cíclido cebra albino Crenichichla sp. Cíclido lucio Pterophyllum scalare Pez ángel Tilapia mossambica Tilapia mossambica Oreochromis spp Tilapia Sarotherodon áurea Tilapia dorada
Algunos miembros de la familia Centrarchidae
NOMBRE TAXONÓMICO NOMBRE COMÚN Ambloplites rupestrís Lobo marino de las rocas Centrarchus macropterus Volador Elassoma everpladei Perca enana Elassoma okefenokee Pez sol enano okefenokee Elassoma zonatum Pez sol enano rayado Enneacanthus qloríosus Pez sol de manchas azules Enneacanthus obesus Pez sol con bandas
Lepomis auntus Pez sol de pecho rojo Lepomis cyanellus Pez sol verde Lepomis cyanellus X L ibbosus Pez sol Lepomis qibbosus Perca sol Lepomis qulosus Mojarrón Lepomis humilis Pez sol con manchas naranja Lepomis macrochirus Mojarra azul Lepomis meqalotis Mojarra orejona Micropterus coosae Lobina de ojos rojos Micropterus dolomieui Lobina de boca pequeña Micropterus punctulatus Lobina con manchas Micropterus salmoides Lobina de boca grande Pomoxis annulans Róbalo blanco o robaleta Pomoxis niqromaculatus Róbalo negro
En una modalidad adicional, el animal es un animal de compañía
o un humano, y la vacuna se administra para proveer subregulación de GDF8
a largo plazo para fines médicos o veterinarios en respuesta a dicha
subregulación de GDF8 Para los fines de la presente invención, se entenderá
que el término animal de "compañía" incluye caballos (equinos), gatos
(felinos), perros (caninos), roedores, (incluyendo ratones, ratas, cobayos),
especies de conejos, y aves, tales como palomas, loros y similares
Los pájaros que reciben dicha vacunación o anticuerpos pueden
asociarse con la avicultura no comercial o comercial Estos incluyen por ej ,
Anatidae, tales como cisnes, gansos, y patos, Columbidae, por ej , palomas y
pichones, tales como palomas domésticas, Phasianidae, por ej , perdices,
urogallos y pavos, Thesienidae, por ej , pollos domésticos, Psittacines, por ej ,
pericos, guacamayos y loros, por ej , criados para el mercado de mascotas o
coleccionistas
En otra modalidad preferida, cualquiera de los animales mencionados con anterioridad (con preferencia no humanos) se inmunizan para obtener anticuerpos ant?-GDF8 que se unen específicamente a los péptidos de la invención, y los anticuerpos generados se cultivan para usar en ensayos, y/o en medicina veterinaria o humana, por ej , para proveer subregulación de GDF8 para cualquier fin médico o veterinario en respuesta a dicha subregulación de GDF8 La presente invención puede comprenderse mejor con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos, que se proveen como ejemplificativos de la invención Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar de manera más completa las modalidades de la invención y no deben considerarse como limitantes del amplio alcance de la invención
EJEMPLOS
EJEMPLO 1 Materiales y Métodos
A Expresión y Purificación del precursor de GDF8 (Prohormona de GDF8) La secuencia de ADN natural del precursor o prohormona de GDF8 (SEC ID NO 2) se optimizó para expresión en sistemas de expresión viral y de mamíferos Para evitar los efectos negativos de los mecanismos de
corte viral en un hospedero se diseñó la secuencia de ADN para que sea divergente de la secuencia de ácidos nucleicos de mamíferos según fuera posible Para lograr este objetivo, la secuencia de aminoácidos de la Prohormona de GDF8 se tradujo en forma inversa usando codones preferidos de levadura La secuencia resultante se revisó para los codones, que mantenían su homología con la secuencia de ácido nucleico de GDF8 humana Donde fuera posible, estos codones se sustituyeron con los codones de levadura más preferidos que codifican el mismo aminoácido La molécula de ácido nucleico resultante (SEC ID NO 3) se sintetizó comercialmente para incorporar en los vectores de expresión apropiados Se usó el sistema de expresión de CHO Flp-ln™ (Invitrogen, Carisbad, California) para expresar la Prohormona de GDF8 optimizada En síntesis, se construyó una construcción de Prohormona de GDF8 que contenia una fusión al epítope C-terminal FLAG® (Sigma-Aldrich Corp , St Louis, MO) insertando el gen que codifica la Prohormona de GDF8 modificada en el plásmido pCMVtag4B (Stratagene, San Diego, CA ) La marca de fusión
FLAG® facilita la separación de las proteínas de fusión FLAG® en una columna de gel anti-FLAG® Luego se clonó un fragmento de ADN de PCR que contenía el gen FLAG® de la Prohormona de GDF8 modificada en el vector de expresión de plásmidos pcDNA5/FRT (Invitrogen, Carisbad, California) La generación de la línea celular de CHO Flp-ln™ que expresa la Proteina de fusión FLAG® de la prohormona de GDF8 se logró por cotransfeccion de la linea celular de CHO Flp-ln™ con el vector de expresión
Flp-ln™ qu contiene el gen FLAG® de GDF8 el plasmido de expresión de recombinasa Flp, POG44 La recombmasa Flp media la inserción del cásete de expresión Flp-ln en el genoma en un sitio integrado FRT por recombinación de ADN específica del sitio Una linea celular estable que expresa y secreta la Prohormona de GDF8 que contiene el epítope FLAG® se obtuvo usando selección de higromicma B La línea celular de CHO estable que expresa la Prohormona de
GDF8 que contiene la marca FLAG® se adaptó a cultivo en suspensión en medio sin suero usando técnicas estándar Los medios condicionados que contienen la Prohormona de GDF8 secretada se generaron usando el sistema biorreactor WAVE (WAVE Biotech LLC, Bpdgewater, NJ) La purificación de la
Prohormona de GDF8 con rótulo FLAG® se logró por cromatografía por afinidad usando un gel de afinidad anti-FLAG® M2 (Sigma-Aldrich Corp , St Louis, MO)
B Purificación del Anticuerpo Especifico de DJ5 Se purificaron fracciones de anticuerpo específicas de DJ5 (SEC ID NO 8, Ver Cuadro 2, a continuación) por cromatografía en columna por afinidad Se preparó una columna por afinidad acoplando 10 mg de péptido sintético a 0 8 g de Sefarosa 4B activada con bromuro de cianógeno (Sigma Genosys, Woodlands, TX) La columna se lavó y se equilibró con PBS Aproximadamente 1 1 ml de fracción de IgG de cabra (10 mg/ml) se aplicó a la columna por afinidad y se lavó con 25 ml de PBS Se recolectaron fracciones
de 1 O ml y se monitorearon para determinar la absorbancia a 280 nm El material unido se eluyo con aproximadamente 10 ml de glicina 0 2 M (pH 1 85) Se recolectaron fracciones de 1 0 ml y se neutralizaron con 0 25 ml de fosfato de sodio 0 5 M, NaCI 0 75 M, pH 7 4 Alícuotas de aproximadamente 25 µl de fracciones no unidas 1 -10 y fracciones unidas 25-35 se evaluaron para determinar la reactividad por ELISA al péptido DJ5 Se encontró que las fracciones no unidas fueron negativas para la reactividad por DJ5 Las fracciones unidas exhibieron un fuerte pico de reactividad al péptido Se reunieron las fracciones no unidas 1 -1 1 y las fracciones unidas 26-34 Las muestra reunidas se concentraron y se cambió su solución reguladora con solución salina con solución reguladora de fosfato (PBS) como se indica a continuación Se determinaron las concentraciones de muestra por el método de DO 280 (CURRENT PROTOCOLS IN I MUNOLOGY, 2 7 3, John Wiley & Sons, Inc ) La muestra no unida se ajusto hasta 10 mg/ml y la muestra unida se ajustó hasta 1 mg/ml, para posterior uso
EJEMPLO 2 Suero de IgG Policlonal Anti-GDF8 de Cabra
Se obtuvo la IgG precurosa ant?-GDF8 de cabra de una cabra inmunizada a través de los siguientes métodos
A Inmunización de la Cabra Se inmunizo una cabra de Saanen (lechera) (macho de aproximadamente 2 años) con Prohormona de GDF8 recombinante purificada (obtenida como se describe en el Ejemplo 1 , anterior), de la siguiente manera Medio mg de proteína se emulsionó en adyuvante completo de Freund (CFA) y se inyectó por vía subcutánea (SC) debajo de la piel de la cabra Se administraron inmunizaciones posteriores de refuerzo SC en las semanas tres, seis, y diez contenían 0 3 mg de proteína emulsionada en adyuvante incompleto de Freund (IFA) Se tomaron muestras de sangre de la vena yugular con una jeringa y aguja, y se tomaron con frasco y tubo de vacío Se recolecto la sangre en frascos que contenían anticoagulante y se centrifugó a 2500 RPM durante 20 minutos para retirar los glóbulos rojos El plasma se re-calcifico para producir suero La muestra de suero obtenida 15 semanas después de la inmunización inicial se usó para análisis adicional
B Recolección y Purificación de IqG po clonal de cabra Se cosechó suero de la cabra luego de 15 semanas, y la fracción de IgG se purificó a partir de este suero, de la siguiente manera La fracción de IgG de suero de cabra se purificó en una columna de agarosa con Proteína G de acuerdo con el protocolo del fabricante (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc , Gaithersburg, MD) Las fracciones eluidas se reunieron, se concentraron y se intercambió la solución reguladora con solución salina de fosfato (PBS) utilizando Filtros centrífugos Centpprep (Centpprep YM- 10,
Milhpore Corporation, Billepca, MA) Se determinaron las concentraciones de las muestras por el método DO 280
EJEMPLO 3 Caracterización de Antisuero de cabra
El antisuero de cabra provisto por el Ejemplo 2, anterior, se designa como PGA Se espera que la fracción de IgG del PGA contenga anticuerpos dirigidos contra varios epítopes en la molécula de la Prohormona de GDF8 El antisuero de PGA se caracterizó por un ensayo de activación de la transcripción in vitro, de la siguiente manera El ensayo de activación de la transcripción m vitro usado para medir cuantitativamente la bio-neutralización de GDF8 es esencialmente el de Thies et al (Growth Factors 18, 251 (2001 )) Se sembraron placas de ensayo de noventa y seis receptáculos para cultivo tratadas con luminómetro ViewPlate™ (PerkinElmer Life and Analytical
Sciences, Inc , Boston, MA) con 1 0 x 10^ células/receptáculo de células A204 de Rabdomiosarcoma (ATCC HTB-82) y se incubaron en una cámara humidificada a 37°C, de 5% CO2 El medio de cultivo completo de A204 está formado por medio 5A de McCoy, 10% suero de feto de bovino, 2% L-glutamina, y 1 % Penn/Strep Luego de reaccionar más de un 80% de confluencia, las células se transfectaron de manera transitoria con una mezcla de pDPC4 plásmido-luciferasa y HCMV lE-lacZ usando el protocolo recomendado por el fabricante del reactivo de transfección FUGENE (Roche
Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) y se incubó 16 horas en una cámara humidificada a 37°C, de 5% CO2 El plásmido pDPC4-luc?ferasa contiene cuatro copias del casillero CAGA, derivadas del inhibidor activador de plasminógeno humano (PAI-1 ), que confiere respuestas de GDF8 a la construcción heteróloga del indicador promotor El HCMV lE-lacZ plásmido contiene un gen de beta-galactosidasa bajo el control del promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano constitutivo Este gen se agrega como control para normalizar eficiencias de transfección Luego se trataron las células con 100 ng/receptáculo de proteína GDF8 (R&D Systems Inc , Minneapolis, MN) y se incubaron un adicional de 16 horas en una cámara humid f icada a 37°C de 5% CO2 Se cuantificaron la luciferasa y be/a-galactosidasa en las células tratadas usando el Dual-Light Luciferase Assay (Tropix, Applied Biosystems, Foster City, CA) Cada muestra se corrió por duplicado (2 pocilios) Se calculó la señal para cada pocilio como señal de luciferasa dividido por los tiempos de señal de be/a-galactosidasa 100 La señal de muestra se calculó como el promedio de dos pocilios Para evaluar la actividad de bio-neutralización de una muestra de anticuerpo, se incubaron varias concentraciones de fracciones de IgG purificadas con la proteína GDF8 (aproximadamente 16 horas a 4°C) antes del tratamiento de las células Se calculó la inhibición porcentual como 100 - ( 100 X señal de muestra) / (señal con GDF8 solo - señal sin GDF8 agregado) Los
resultados del ensayo de activación de transcripción m vitro se resumen en el cuadro 1 , a continuación
CUADRO 1 Titulos de neutralización de GDF8 para PGA de Suero de Cabria
Muestra (µq de IgG) % de inhibición de la actividad de GDF8 Cabra - normal (250) 0 Cabra - PGA (250) 95 Cabra - PGA (125) 86 Cabra - PGA (63) 62 Cabra - PGA (31) 22 Cabra - PGA (16) 3
El ensayo de neutralización confirmó que la fracción de IgG del suero de cabra cosechado contiene anticuerpos capaces de neutralizar por lo menos un 95% del GDF8 usado en este ensayo de actividad
EJEMPLO 4 El anticuerpo policlonal de cabra define un epítope de neutralización específico de la proteína GDF8
Para determina la especificidad de la respuesta inmune neutralizante de la fracción de PGA se evaluó una fracción de IgG para determinar su reactividad con un grupo de siete péptidos superpuestos (DJ1-7 ver Cuadro 2 y FIG 1 ) que abren la región codificadora entera de la proteína activa GDF8 La reactividad de la IgG del PGA de cabra para cada péptido
individual se determinó por el ensayo Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) El ELISA del péptido GDF8 se realizo esencialmente como se describe en Protein Detector™ ELISA Kit HRP, ABTS System (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc , Gaithersburg, MD) En el ensayo se usaron las siguientes modificaciones Se sintetizaron en forma específica péptidos sintéticos DJ1-7 (ver Cuadro 2, a continuación) bajo nuestra dirección por ProScí, Inc (Poway, CA) Se recubrieron las placas con peptidos sintéticos a 500 ng por receptáculo y Prohormona de GDF8 purificada a 250 ng por receptáculo Los anticuerpos primarios fueron fracciones de IgG de vanas muestras Los anticuerpos secundarios se usaron a una dilución de 1 2000 Para las muestras de anticuerpos primarios de cabra el anticuerpo secundario fue anticuerpo marcado con peroxidasa de conejo para IgG de cabra Para las muestras de anticuerpo primario e rata el anticuerpo secundario fue anticuerpo marcado con peroxidasa de cabra para IgG de rata El DO 405 nm se leyó durante 15 minutos con un lector de placa de ELISA La reactividad por ELISA se calculó como DO 405 por minuto por 1000
CUADRO 2
Péptidos de Región Activa de GDF8
Los resultados de ELISA se resumen en el Cuadro 3, a
continuación
CUADRO 3
Reactividad por ELISA de PGA IgG (10 mg/ml) para Péptidos de Región
Activa de GDF8 DO 405 / minuto X 1000 Antíqeno 1 20 1 40 1 80 DJ1* 23 10 1 DJ2* 3 0 0 DJ3* 0 10 0 DJ4* 3 0 0 DJ5* 121 37 27 DJ6* 3 0 0 DJ7* 10 1 0 proGDFd** 194 196 199 * péptido, ** prohormona
1 La fracción de IgG de PGA reaccionó específicamente con
ambos, la Prohormona de GDF8 purificada y con el péptido DJ5 Entre los
péptidos de la región activa GDF8 la fracción de IgG reacciona
específicamente y de manera exclusiva con el péptido DJ5 Esta es una fuerte
indicación de que la capacidad neutralizante de este suero se dirige contra un
epitope definido por el peptido DJ5 Para confirmar esta hipótesis se purificó la
fracción específica DJ5 de IgG de PGA Esto se logró por cromatografía por
afinidad como se describe en el Ejemplo 1 , referencia anterior Los
anticuerpos de PGA se separaron en péptido DJ5 unido y fracciones no
unidas Ambas fracciones se evaluaron para determinar la actividad de
neutralización contra la proteína GDF8
Los resultados en el Cuadro 4, a continuación, muestran que la
mayor parte de la capacidad de neutralización de GDF8 reside con el
anticuerpo que se une específicamente al péptido DJ5 Esto demuestra
claramente que el péptido DJ5 define un epítope neutralizante de la proteina
GDF8
CUADRO 4
Actividad de neutralización de GDF8 de anticuerpos específicos de DJ5
Muestra (µq de IqG) % de inhibición de actividad de GDF8 Cabra - normal (250) ** 7 IgG no unido a DJ5 (250) 26 IgG unido a DJ5 (25) 90 ** La IgG de cabra normal fue un control negativo purificado a partir de suero de cabra no inmunizada (obtenida en el mercado) Curiosamente, en un experimento preliminar, los anticuerpos de
GDF8 neutralizantes no se obtuvieron cuando se inyectó a dos conejos el
antígeno DJ5 humano conjugado a hemocianina de lapa cahforniana Como
puede observarse en la Figura 2, las secuencias de aminoácidos
correspondientes a DJ5 para DGF8 de conejo y humano son idénticas, mientras que la secuencia de aminoácidos de DJ5 de cabra es diferente Por lo tanto, en vista de los datos provistos anteriormente para la cabra, los datos preliminares del conejo sugieren que puede ser ventajoso usar un antígeno de DJ5 que comprende una secuencia de aminoácidos diferente de la correspondiente región/porción del CDF8 del animal hospedero De este modo, en este caso, la capacidad de la Prohormona de GDF8 Humana recombinante para inducir anticuerpos bio-neutralizantes en una cabra pueden deberse, por lo menos en parte, al hecho de que el antígeno usado comprendió una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia hospedero por una simple sustitución de aminoácidos en la región/porción de DJ5 de GDF8 [ver, residuo de aminoácidos 333 en la Figura 2] Más particularmente, como lo muestra la Figura 2, el Arg333 en la secuencia humana está reemplazado por un residuo Lys333 en la secuencia de la cabra Esta única sustitución conservadora de aminoácido puede constituir una alteración que es lo suficientemente significativa para tornar la proteína "extraña" para el sistema de vigilancia inmunológica de la cabra
EJEMPLO S
El mAG 788 de rata neutralizante de GDF8 define un epítope
neutralizante especifico de la proteína GDF8
Se informa que el anticuerpo monoclonal de rata MAB788
neutraliza la bioactividad de GDF8 del ratón (R&D Systems Inc , Cat No
MAB788, Minneapohs, MN) Para confirmar este resultado evaluamos el
anticuerpo monoclonal para determinar la actividad de neutralización contra la
proteína GDF8 El anticuerpo se caracterizó como se describe en el Ejemplo
3, anterior Los resultados de este ensayo se resumen en el cuadro 5, de la
siguiente manera
CUADRO 5
Títulos de neutralización de GDF8 para
anticuerpo monoclonal 788
Muestra (µq de IqG) % de inhibición de actividad de GDFd MAB - 788 (12 5) 47 MAB - 788 (6 3) 17 MAB - 788 (3 1 ) 7 MAB - 788 (1 8) 0 MAB - 788 (0 1 ) 0
El Cuadro 5 confirma que este anticuerpo es capaz de
neutralizar la actividad de la proteina GDF8 Para determinar la especificidad
de esta respuesta inmune neutralizante se evaluó el anticuerpo monoclonal de
rata para determinar su reactividad con un conjunto de siete péptidos
superpuestos (DJ1 -7 ver Cuadro 2 y FIG 1 ) que abren la región codificadora
completa de la proteina GDF8 activa La reactividad del anticuerpo
monoclonal para cada peptido individual se determinó por ensayo de ELISA
(ver Ejemplo 4, referencia anterior)
CUADRO 6
Reactividad por ELISA de MAB 788 de Rata (10 mg/ml) para péptidos de
la región activa GDF8
DO 405 / minuto X 1000 Antíqeno 120 140 180 DJ1* 4 0 0 DJ2* 0 0 0 DJ3* 0 0 0 DJ4* 0 0 0 DJ5* 133 118 102 DJ6* 0 0 0 DJ7* 0 0 0 proGDF8** 132 127 132 * péptido, ** proteína
El anticuerpo monoclonal de rata reaccionó específicamente con
ambos la Prohormona de GDF8 purificada y con el péptido DJ5
Normalmente un anticuerpo monoclonal tiene mono especificidad con un solo
epítope Entre los peptidos de la región activa GDF8 este anticuerpo
monoclonal reacciona específicamente y de manera exclusiva con el péptido
DJ5 Este resultado provee evidencia independiente adicional de que el
peptido DJ5 define un epítope neutralizante de la proteína GDF8
EJEMPLO 6 Construcción de Vectores Para insertar Epítopes en la proteína de envoltura A través de templado de oligonucleótidos
La clonación de diferentes epítopes en diferentes ubicaciones de la proteína de envoltura TMV se simplificó creando cinco vectores receptores diferentes (FIG 5) El Cuadro 7 enumera estos vectores junto con sus propiedades Estos vectores contienen los sitios de restricción Ncol (5') y ?/goMIV (3') que se colocaron en la ubicación apropiada del marco abierto de lectura (ORF) de la proteina de envoltura para la TMV cepa U1 o U5 Para TMV cepa U1 , el par de sitios de restricción se colocó en el Bucle N-termmal, entre los amino ácidos 155 y 156 (GPAT) y en el C-término, mientras que para la cepa U5 solo se colocó entre los amino ácidos 155 y 156 (TPAT) Cualquier par de oligonucleótidos que codifican un péptido, que tienen las salientes 5' y 3' de "CATG" y "CCGG", respectivamente, pueden clonarse fácilmente en estos vectores receptores La construcción de tres de estos vectores, pLSB2268, pLSB2269, y pLSB2109 se describió en el texto escrito por Palmer et al (April 2004, publicación de patente mundial no WO 2004/032622 A2) La construcción de los dos vectores restantes, pLSB21 10 y pLSB1806, se describe a continuación
CUADRO 7
Características de Vectores receptores para insertar epítopes DJ5 en la
Proteína de envoltura TMV
Origen de la Secuencia no Nombre del Ubicación de proteina de original SEC ID plasmido inserción recubrimiento agregada pLSB2268 N-terminal U1 — -AG
Antes de los últimos 4 pLSB2109 U1 AM— -A aminoácidos (GPAT) pLSB21 10 C-terminal U1 AM— -AG Antes de los últimos 4 pLSB1806 U5 AM— -AG aminoácidos (TPAT) * Información más detallada sobre este vector se encuentra disponible en Palmer et al (Abril 2004, WO 2004/032622 A2, incorporada aquí como referencia) Las secuencias de ácido nucleico para pLSB21 10 y pLSB1806 son para el marco abierto de lectura la proteína de envoltura " — " Las líneas punteadas indican el dominio del péptido GDF8 de interés, por ej , DJ5, que se inserta en el respectivo vector receptor La secuencia no nativa adicional se debe a los aminoácidos generados en el sitio de inserción
Para generar pLSB21 10, se amplificó un fragmento de ADN de
0 8 kilobases (kb) a partir del plásmido pLSB2108, un derivado de pBTI 2150
(Pogue et al, 2004, Patente de los Estados Unidos no US 6,730,306 B1 )
donde el sitio de restricción Afl\\\ se eliminó, usando los siguientes iniciadores
GCGCACATGTCTTACAGTATCACTAC (SEC ID NO 37),
TGGTCCTGCAACTGCCATGGACAGTGCCGGCTGAGGTAGTC
AAGAT (SEC ID NO 38),
CGGATAACAATTTCACACAGGA (SEC ID NO 39) El iniciador de la SEC ID NO 37 (envoltura 5' de A//III), contiene la secuencia de inicio de la proteína de envoltura U1 y el sitio de reconocimiento de Afl\\\ esta subrayado En el caso del iniciador de la SEC ID NO 38 (Ncol/ NgoMIV en bucle al final), los sitios de reconocimiento de ?/col y ?/goMIV están subrayados El o gonucleótido SEC ID NO 39 (30B 7792R) se templa por disminución al sitio Pst\ El producto resultante de esta reacción de la cadena de polimerasa (PCR) contenía la proteína de envoltura que se modificó en el C-termino para proveer dos sitios de clonación, ?/col y ?/goMIV, y la región 3' no traducida (UTR) del virus Este fragmento de AfIMV Pst\ de 0 8 kb se insertó en el fragmento de 8 4 kb ?/col/ Pst\ del vector pBTI 2150 El plásmido resultante, pLSB21 10, permite la inserción de cualquier secuencia peptídica, que poseen las salientes ?/col y ?/goMIV, en el C-término de la proteína de envoltura U1 Para generar pLSB1806, se empleó PCR por superposición Dos fragmentos de ADN, 0 5 kb y 0 3 kb de tamaño, se amplificaron usando el plásmido BSG1057 como patrón (Fitzmaupce et al , Patente de los Estados Unidos No US 6,656,726 B1 ) El fragmento de 0,5 kb se amplifico usando los o gonucleótidos Afl-U5-F (CCACATGTATACAATCAACTCTCCGAG, SEC ID NO 40) y U5-NN-TPAT-R (CACTGTCCATGGCTGTGGTCC, SEC ID NO 41 ) Este fragmento resultante contenía la mayor parte de la proteina de envoltura U5 (aminoácido no 1 -155), sin embargo, carece del segundo residuo de aminoácidos (prolina) El fragmento de 0 3 kb se amplifico usando los
oligonucleótidos U5-NN-TPAT
(CTTGTCTGGACCACAGCCATGGACAGTGCCGGCACTCCGGCTACTTAG, SEC ID NO 42, ) y JAL302 (AAACATGATTACGCCAAGCTTGCATG, SEC ID NO 43) Este fragmento contiene los cuatro aminoácidos C-terminales de la proteína de envoltura U5 como también el 3' UTR Además, también posee los dos sitios de clonación, ?/col y ?/O?MIV, que se colocaron entre el aminoácido número 155 y 156 Ambos fragmentos de 0 5 y 0 3 kb se purificaron para eliminar todos los ohgonucleótidos restantes Estos fragmentos purificados de ADN se mezclaron y amplificaron por PCR usando los dos oligonucleótidos más externos, Afl\\\ y JAL302 El fragmento resultante de 0 8 kb AflWM Pst\ se clonó posteriormente en el fragmento de 8 4 kb ?/col/ Pst\ del plásmido pBTI 2150 El plásmido resultante pLSB1806 permite la inserción de cualquier secuencia peptídico, que posee las salientes ?/col y ?/goMIV, en la posición 155 de envoltura U5 (antes de los últimos cuatro aminoácidos)
EJEMPLO 7 Construcción de Fusión de proteínas de envoltura gue muestran el péptido DJ5 de 20 aminoácidos
Las cinco construcciones de fusión de proteina de envoltura DJ5 iniciales se resumen en el Cuadro 8 Cuatro de estas construcciones emplearon la cepa U1 de TMV El péptido de 20 aminoácidos DJ5 (VHQANPRGSAGPCCTPTKMS, SEC ID NO 8) se fusionó en la superficie
expuesta al termino N y C término de la proteína de envoltura como también dentro de la superficie expuesta al bucle "60" entre los aminoácidos 64 (Pro) y 67 (Asp), con la supresión concomitante de los aminoácidos 65 (Asp) y 66 (Ser) En la fusión de la cepa final U1 , el epitope se colocó interno a los cuatro aminoácidos C-terminales de la proteína de envoltura (la posición GPAT) Para la única fusión de la proteína de envoltura de cepa U5, el epítope se colocó también en la parte interna de los cuatro aminoácidos C-terminales (la posición TPAT)
CUADRO 8 Vectores de fusión de la proteina de envoltura gue expresan viriones recombinantes gue muestran el péptido de 20 aminoácidos DJ5 en plantas
Denominación Esqueleto de la Descriptor Ubicación de inserción del del Vector proteina de abreviado epitope envoltura pLSB-FV1 DJ5(20)-U1 -GPAT cepa U1 Posición GPAT pLSB-FV2 DJ5(20)-U1-C cepa U1 C-termino pLSB-FV3 DJ5(20)-U1-N cepa U1 N-termino superficie expuesta del bucle pLSB-FV4 DJ5(20)-U1-L cepa U1 "60" pLSB-FV5 DJ5(2Q)-U5-TPAT cepa U5 Posición TPAT
Para introducir el epítope de DJ5 de 20 aminoácidos en estas cinco ubicaciones, es decir en los cinco plásmidos descritos en el Ejemplo 6, un conjunto de o gonucleótidos se diseñó como se ilustra en la FIG 6A Las secuencias de los o gonucleótidos sentido e inverso que se emplearon en la clonación de la fusión de proteínas de envoltura del péptido DJ5 de 20
aminoácidos, para producir los plasmidos pLSB-FV1 , pLSB-FV2, pLSB-FV3, pLSB-FV4 y pLSB-FV5, junto con las SEC ID Nos asociadas, se muestran en el Cuadro 9, a continuación
CUADRO 9 Oligonucleótidos delantero e inverso
Oligonucleótido delantero Oligonucleótido inverso SEC ID Secuencia de acido nucleico ..„ Secuencia de acido nucleico SEC ID NO NO
CATGGTTCATCAAGCTAATCCAGAG CCGGCAGACATCTTAGTTGGAG GATCTGCTGGACCATGTTGTACTCC 45 TACAACATGGTCCAGCAGATCCT 46 AACTAAGATGTCTG CTTGGATTAGCTTGATGAAC
La base de datos de uso de codones Nicotiana tabacum es muy conocida en el arte, por ej , como se encuentra en Internet en http //www kazusa or jp/codon, incorporada aquí como referencia, y como se ilustra en los cuadros A y B, se empleó para diseñar los o gonucleótidos en el cuadro 9 (SEC ID NOs 45 y 46) Esto produjo o gonucleótidos con codones optimizados para el péptido DJ5(20) Cuando se templaron estos oligonucleótidos, generaron un fragmento de ADN de hebra doble, con las salientes apropiadas 5, y 3, de "CATG" y "CCGG," respectivamente (según se indica en el Ejemplo 6) Estos fragmentos se clonaron entonces en los vectores receptores definidos en el Cuadro 7 La inserción de este fragmento de ADN de hebra doble produjo el reemplazo del péptido DJ5(20) en los diversos contextos de proteína de envoltura El cuadro 8A y cuadro 8B juntos ilustran el uso del codón para Nicotiana tabacum Este cuadro de uso de codón fue empleado en la creación
de los ohgonucleotidos optimizados para el codón para la generación de fusiones de la proteína de envoltura del peptido DJ5 de 20 aminoácidos (SEC ID NO 45 y SEC ID NO 46) y el peptido DJ5 de 12 aminoácidos (SEC ID NO 52 y SEC ID NO 53) El codon empleado para cada aminoácido está subrayado
CUADRO A Nicotiana tabacum fabplnl: 1211 CDS's (430056 codones)
AMINOÁCIDO CODON NUMERO /1000 FRACCIÓN Gly GGG 4554 00 10 59 0 15 Gly GGA 10299 00 23 95 0 35 Gly GGT 10001 00 23 26 0 34 Gly GGC 4823 00 1 1 21 0 16 Glu GAG 1 1931 00 27 74 0 44 Glu GAA 15268 00 35 50 0 56 Asp GAT 15520 00 36 09 0 69 Asp GAC 6997 00 16 27 0 31 Val GTG 6830 00 15 88 0 24 Val GTA 5239 00 12 18 0 19 Val GTT 1 1395 00 26 50 0 40 Val GTC 4758 00 11 06 0 17 Ala GCG 2522 00 5 86 0 08 Ala GCA 9680 00 22 51 0 31 Ala GCT 13597 00 31 62 0 44 Ala GCC 5363 00 12 47 0 17 Arg AGG 5116 00 1 1 90 0 24 Arg AGA 6713 00 15 61 0 32 Ser AGT 5786 00 13 45 0 17 Ser AGC 4162 00 9 68 0 13 Lys AAG 13789 00 32 06 0 50 Lys AAA 14014 00 32 59 0 50 Asn AAT 12038 00 27 99 0 61 Asn AAC 7714 00 17 94 0 39 Met ATG 10619 00 24 69 1 00 lie ATA 6431 00 14 95 0 26 lie ATT 12172 00 28 30 0 50 Me ATC 5980 00 13 91 0 24 Thr ACG 1978 00 4 60 0 09 Thr ACÁ 7394 00 17 19 0 33 Tht ACT 8929 00 20 76 0 40 Thr ACC 4277 00 9 95 0 19
CUADRO B AMINOÁCIDO CODON NUMERO /1000 FRACCIÓN Trp TGG 5125 00 11 92 1 00 End TGA 458 00 1 06 0 37 Cys TGT 4156 00 9 66 0 57 Cys TGC 3089 00 7 18 0 43 End TAG 241 00 0 56 0 20 End TAA 531 00 1 23 0 43 Tyr TAT 8029 00 18 67 0 59 Tyr TAC 5618 00 13 06 0 41 Leu TTG 9324 00 21 68 0 24 Leu TTA 6052 00 14 07 0 15 Phe TTT 10821 00 25 16 0 58 Phe TTC 7723 00 17 96 0 42 Ser TCG 2344 00 5 45 0 07 Ser TCA 7513 00 17 47 0 23 Ser TCT 8706 00 20 24 0 26 Ser TCC 4656 00 10 83 0 14 Arg CGG 1634 00 3 80 0 08 Arg CGA 2534 00 5 89 0 12 Arg CGT 3404 00 7 92 0 16 Arg CGC 1721 00 4 00 0 08 Gln CAG 6425 00 14 94 0 41 Gln CAÁ 9324 00 21 68 0 59
Leu CTG 4370 00 10 16 0 11 Leu CTA 4160 00 9 67 0 1 1 Leu CTT 10181 00 23 67 0 26 Leu CTC 51 12 00 1 1 89 0 13 Pro CCG 2105 00 4 89 0 10 Pro CCA 8389 00 19 51 0 39 Pro CCT 8045 00 18 71 0 38 Pro CCC 2913 00 6 77 0 14
Para templar los oligonucleótidos sentido e inverso, se combinó 100 pmoles de cada oligonucleótido en 10X solución reguladora para PCR (Promega) y se ajustó hasta un volumen final de 20 pl con agua. La mezcla de oligonucleótidos se calentó hasta 95°C durante 3 minutos y posteriormente se enfrió gradualmente hasta 30°C a una velocidad de 0 1°C por segundo. La reacción se mantuvo a 30°C y se agregó 80 pl de agua a cada tubo. Para
cada reducción de ligación, se empleó 1 pl de la mezcla de oligonucleotidos templada (que contiene 1 pmole de cada ohgonucleótido) y se combinó con 40 ng del plásmido o vector de interés (cortado con enzimas de restricción ?/col y ?/gomlV (ambos de New England Biolabs)), junto con 5 µl de 2X solución reguladora de ligación Quick (New England Biolabs) y 0 5 µl de Quick Ligase (New England biolabs) El volumen de la reacción de ligación se ajustó hasta 10 µl y luego de una incubación durante 5 minutos a temperatura ambiente, 2 µl de la reacción se transfirió a un tubo micrófugo de 1 5 ml y se congeló sobre hielo A este tubo de microcentrífuga, se agregaron 40 µl de células competentes DH5a (MAX Efficiency® de Invitrogen Corp , Carisbad, California) y la mezcla de células/reacción de ligación se incubó sobre hielo durante 30 minutos Las células se calentaron luego a 37°C durante 2 minutos y el tubo de microcentrífuga inmediatamente se volvió al hielo Se agregó 950 µl de medio SOC (Invitrogen Corp ) al tubo de microcentrifuga, que se tapó y se agitó hopzontalmente a 200 rpm y 37°C durante 1 hora Las células se colocaron en placas sobre placas de agar con caldo de cultivo Luna (LB) (50 o 100 µl por placa), que contiene 100 mg/l de ampicilma, y se incubó hasta la mañana siguiente a 37°C Se seleccionaron colonias simples y se cultivaron cultivos durante la noche de 2 ml en medio de LB que contiene 100 mg/l de ampicilma El plásmido se purificó a partir de las células DH5a y se secuenció para confirmar la presencia del epítope de DJ5 de secuencia de 20 aminoácidos La correspondencia entre los vectores de inicio y los vectores finales que contienen el epítope de DJ5 de 20 aminoácidos en los diferentes
sitios de inserción se resume en el Cuadro 10 El Cuadro 1 1 da las secuencias
de aminoácidos finales de la fusión de proteínas de envoltura traducidas que
muestran el péptido de 20 aminoácidos DJ5 y sus SEC ID NO asociados
CUADRO 10
Correspondencia entre el vector de clonación inicial y el vector final que
contiene la secuencia del péptido de DJ5 de 20 aminoácidos
DenominaVector DJ5 ción del vector de Denominación Descriptor abreviado clonación pLSB2109 pLSB-FV1 DJ5(20)-U1-GPAT pLSB21 10 pLSB-FV2 DJ5(20)-U1 -C pLSB2268 pLSB-FV3 DJ5(20)-U1 -N pLSB2269 pLSB-FV4 DJ5(20)-U1 -L pLSB1806 pLSB-FV5 DJ5(20)-U5-TPAT
EJEMPLO 8
Construcción de fusión de proteínas de envoltura
gue muestran la región N-terminal de 12 aminoácidos del péptido DJ5
Dos construcciones adicionales de fusión de proteina de
envoltura derivada de DJ5 se resumen en el Cuadro 12, a continuación,
ambas emplearon la cepa U1 de TMV Las fusiones visualizaron la región N- terminal de 12 aminoácidos del péptido DJ5 (VHQANPRGSAGP, SEC ID NO
44) fusionadas al extremo N-terminal expuesto a la superficie de la proteína
de envoltura o colocada en forma interna a los cuatro aminoácidos C-
terminales de la proteina de envoltura (la posición GPAT) El Cuadro 12 provee los vectores de fusión de la proteina de envoltura usados para expresar vipones recombinantes que muestran la región N-terminal de 12 aminoácidos del péptido DJ5 en plantas
CUADRO 11 Secuencia de aminoácidos completa del péptido de 20 aminoácidos DJS, fusión de la proteína de envoltura, junto con sus SEC ID NOs asociados.
Secuencia de aminoácidos de proteina de envoltura (los aminoácidos insertados están subrayados) MSYSITTPSQFVFLSSAWADPIELINLCTNALGNQFQTQQARTWQRQFSE
VWKPSPQVTVRFPDSDFKVYRYNAVLDPLVTALLGAFDTRNRIIEVENQAN
PTTAETLDATRRVDDATVAIRSAINNLIVELIRGTGSYNRSSFESSSGLVWT
SAMVHQANPRGSAGPCCTPTKMSAGPAT
MSYSITTPSQFVFLSSAWADPIELINLCTNALGNQFQTQQARTVVQRQFSE WVKPSPQVTVRFPDSDFKVYRYNAVLDPLVTALLGAFDTRNRIIEVENQAN PTTAETLDATRRVDDATVAIRSAINNLIVELIRGTGSYNRSSFESSSGLVWT SGPATAMVHQANPRGSAGPCCTPTKMSAG
MVHQANPRGSAGPCCTPTKMSAGSYSITTPSQFVFLSSAWADPIELINLCT NALGNQFQTQQARTWQRQFSEVWKPSPQVTVRFPDSDFKVYRYNAVLD PLVTALLGAFDTRNRIIEVENQANPTTAETLDATRRVDDATVAIRSAINNLIVE LIRGTGSYNRSSFESSSGLVWTSGPAT
MSYSITTPSQFVFLSSAWADPIELINLCTNALGNQFQTQQARTWQRQFSE VWKPSPQVTVRFPGSPMVHQANPRGSAGPCCTPTKMSAGPSGDFKVYR YNAVLDPLVTALLGAFDTRNRIIEVENQANPTTAETLDATRRVDDATVAIRS AINNLIVELIRGTGSYNRSSFESSSGLVWTSGPAT
MYTINSPSQFVYLSSAYADPVQLINLCTNALGNQFQTQQARTTVQQQFADA WKPVPSMTVRFPASDFYVYRYNSTLDPLITALLNSFDTRNRIIEVDNOPAPN TTEIVNATQRVDDATVAIRASINNLANELVRGTGMFNQASFETASGLVWTT
AMVHQANPRGSAGPCCTPTKMSAGTPAT
CUADRO 12 Vectores de fusión de la proteina de envoltura
Para introducir el epítope de 12 aminoácidos (12 mer) en estas dos 2 ubicaciones, se diseñó un conjunto de dos oligonucleótidos, las secuencias se muestran en el cuadro 13, a continuación, junto con sus SEC ID NO asociados Para templar los o gonucleótidos sentido e inverso, se siguió el procedimiento definido en el Ejemplo 7 Para cada reacción de ligación se empleo 1 µl de la mezcla de oligonucleótidos templados, que contienen 1 pmol de cada o gonucleótido Esto se combinó con el plásmido de interés (cortado con las enzimas de restricción ?/col y ?/gomlV) y el protocolo de reacción de ligación junto con su transformación en células DH5a químicamente competentes fue como se detalla en el Ejemplo 7, referencia anterior El cuadro 13, a continuación, provee los iniciadores sentido e inverso empleados en la clonación de las fusiones de la proteina de envoltura formadas por de la región N-terminal de 12 aminoácidos del péptido DJ5, para producir los plásmidos pLSB-FV6 y pLSB-FV7
CUADRO 13 Iniciadores delantero e inverso
Las células se plaquearon sobre placas de agar con LB (50 o 100 µl por placa), que contienen 100 mg/l de ampicihna, y se incubó hasta la mañana siguiente a 37°C Se seleccionaron colonias simples y se cultivaron 2 ml de cultivos durante la noche en medio de LB que contiene 100 mg/l de ampicilma El plasmido se purifico a partir de las células DH5a y se secuenció para confirmar la presencia de la secuencia de epítopes depvado de DJ5 de 12 aminoácidos La correspondencia entre los vectores de inicio y los vectores finales que contienen el epítope de 12 aminoácidos derivado de DJ5 en dos sitios de inserción elegidos se resume en el cuadro 14, a continuación El cuadro 15, a continuación, provee las secuencias de aminoácidos finales de la fusión de proteínas de envoltura traducidas que muestran la región N-terminal de 12 aminoácidos del péptido DJ5 y sus SEC ID NO asociados
CUADRO 14
Correspondencia entre el vector de clonación inicial V el vector final gue
contiene la secuencia de péptidos de 12 aminoácidos derivada de DJ5
Denominación del Vector DJ5 vprtpr rip Descriptor abreviado clonación Denominación pLSB2268 pLSB-FV6 DJ5(12)-U1-GPAT pLSB2109 pLSB-FV7 DJ5(12)-U1-C
CUADRO 15
Secuencia de aminoácidos completa de las fusiones de la proteína
de envoltura gue muestran la región N-terminal de 12 aminoácidos
del péptido DJ5, junto con sus SEC ID NOs asociados
Denominación SEC Secuencia de aminoácidos Descriptor ID NOs (los aminoácidos insertados están subrayados) abreviado MVHQANPRGSAGPAGSYSITTPSQFVFLSSAWADPIELI
NLCTNALGNQFQTQQARTWQRQFSEVWKPSPQVTV pLSB-FV6 FPDSDFKVYRYNAVLDPLVTALLGAFDTRNRIIEVENQAN 54 DJ5(12)-U1 -N PTTAETLDATRRVDDATVAIRSAINNLIVELIRGTGSYNRS SFESSSGLVWTSGPAT
MSYSITTPSQFVFLSSAWADPIELINLCTNALGNQFQTQQ pLSB-FV7 ARTWQRQFSEVWKPSPQVTVRFPDSDFKVYRYNAVLD
DJ5(12)-U1- 55 PLVTALLGAFDTRNRIIEVENQANPTTAETLDATRRVDDA
GPAT TVAIRSAINNLIVELIRGTGSYNRSSFESSSGLVWTSAMV
HQANPRGSAGPAGPAT
EJEMPLO 9 Producción de TMV-FV1 , TMV-FV2, TMV-FV3, TMV-FV4 y TMV-FV5
El virus TMV-FV1 se produjo por transcripción del plásmido pLSB-FV1 Se sintetizaron transcripciones infecciosas a partir de reacciones de transcripción con T7 ARN polimerasa (Ambion) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes Luego de la verificación de la integridad de transcripción por electroforesis con gel de agarosa, la transcripción de ARN se combinó con una solución abrasiva (una mezcla de benton?ta/ce\\\e suspendida en un solución reguladora de glicina/fosfato que contiene pirofosfato de sodio) y se usó para inocular hojas de Nicotiana benthamiana de plantas de 23 a 28 días de edad Aproximadamente 5 a 13 días después de la inoculación, dependiendo de la severidad de la infección, el movimiento sistémico del virus recombinante fue visible en el tejido de las plantas, en virtud de un fenotipo mosaico en las hojas que contienen el virus El tejido sistémicamente infectado se cosecho para extracción y purificación del virus Debe observarse que pueden emplearse plantas hospederos alternativas, distintas de Nicotiana benthamiana en la producción de TMV-FV1 Por ejemplo, Nicotiana excelsiana o Nicotiana tabacum representan dos plantas hospederos alternativas posibles Para los dos últimos hospederos, el tejido se cosecha 2,5-5 semanas luego de la inoculación, luego de la diseminación sistemica del virus
Para producir el virus TMV-FV2, se generó la transcripción del plásmido pLSB-FV2, se inoculó en las plantas y se cosechó el tejido sistemicamente infectado en un modo similar al que se describe para la producción del virus TMV-FV1 Para producir el virus TMV-FV3, se generó la transcripción del plásmido pLSB-FV3, se inoculó en las plantas y se cosechó el tejido sistémicamente infectado en un modo similar al que se describe para la producción del virus TMV-FV1 Para producir el virus TMV-FV4, se generó la transcripción del plásmido pLSB-FV4, se inoculo en las plantas y se cosechó el tejido sistémicamente infectado en un modo similar al que se describe para la producción del virus TMV-FV1 Para producir el virus TMV-FV5, se generó la transcripción del plásmido pLSB-FV5, se inoculó en las plantas y se cosechó el tejido sistémicamente infectado en un modo similar al que se describe para la producción del virus TMV-FV1
EJEMPLO 10 Extracción y purificación de TMV-FV1 , TMV-FV2, TMV-FV3, TMV-FV4 y TMV-FV5
El virus recombinante TMV puede extraerse del tejido de planta infectado inmediatamente después de la cosecha Alternativamente, el tejido puede almacenarse durante 2 horas hasta 14 días a 4°C, o a -20°C a -80°C (durante días a meses) antes de realizar la extracción El tejido también puede congelarse inmediatamente antes de la extracción, para ayudar en la desintegración del tejido Se han documentado varios procedimientos para la purificación de virus de TMV recombmante de tejido de planta infectado Por ejemplo, Garger et al (Patentes de los Estados Unidos 6,033,895, 6,037,456 y 6,303,779) y Pogue et al (Patentes de los Estados Unidos Nos 6,740,740 y 6,730,306, incorporada aqui como referencia) describen métodos basados en el ajuste del pH y tratamiento por calor del homogenado "jugo verde" obtenido luego de la extracción del tejido infectado Pogue et al también describen un procedimiento basado en el uso de pohetilenimina ("PEÍ") para ayudar en la separación de las proteínas de la célula hospedero y el TMV recombinante Estos procedimientos y sus modificaciones, diseñados para mejorar la estabilidad del epítope (es decir minimizar la degradación por proteólisis) durante la extracción y procesamiento, y la solubilidad del vipón recombinante, se usaron en la purificación de virus TMV-FV1 , la purificación de TMV-FV2, la
purificación de TMV-FV3, la purificación de TMV-FV4 y la purificación de TMV-FV5
A Purificación de fusión de TMV-FV1 VCP de tejido de plantas Se purificó TMV-FV1 a partir de tejido de plantas de la siguiente manera Se cosechó tejido de planta infectado sistémicamente (hoja y tallos) y se combinó con solución reguladora EB de extracción congelado (Tris 100 mM, pH 8, cloruro de sodio 0 86 M, 0 2% v/v Tritón® X-100), al cual se había agregado 0 04% p/v metabisulfito de sodio, a una relación de volumen de solución reguladora (ml) a masa de tejido (g) de 2 1 El tejido de planta y solución reguladora de extracción se homogeneizaron durante 1 minuto en un mezclador de 1 L Wapng®, transferido a un matraz de Erlenmeyer se homogeniza adicionalmente durante 1 minuto usando un Polytron® (Bpnkmann Instruments) Este homogenado se pasó a través de cuatro capas de tela de queso, para eliminar la fibra, para producir un extracto vegetal, que se denominará en adelante "jugo verde " El jugo verde se transfirió a un frasco de centrifugo, centrifugado a 10,000 x G durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante La mayor parte de la fusión de TMV-FV1 VCP, que era insoluble, se encontró presente en la pella La pella se resuspendió al volumen de jugo verde original en la solución reguladora de extracción EB, con la ayuda del Polytron® (1 minuto de homogenización) Luego del tratamiento con Polytron®, la pella resuspendida se transfirió a un frasco de
centrifuga, se centrifugó a 10,000 x G durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante Este paso resuspensión de la pella en solución reguladora de extracción EB, homogemzación con Polytron®, centrifugado a 10,000 x G durante 10 minutos, se repitió dos veces adicionales La finalidad de estos pasos repetidos fue efectuar la separación de las proteínas derivadas de las plantas y pigmentos de la fusión de proteína de envoltura TMV DJ5 insoluble, que se facilitó por la presencia de una concentración relativamente elevada de cloruro de sodio y detergente en la solución reguladora EB El número de repeticiones requirió eliminar todos los pigmentos derivados de las plantas, para producir una pella blanca a tostado claro, puede depender de la edad del tejido cosechado y la fusión de la proteína de envoltura TMV se expresa Si el pigmento derivado del hospedero verde permanece asociado con la pella, pueden realizarse lavados adicionales a la pella que contiene la fusión de la proteina de envoltura TMV empleando un solución reguladora con pH elevado, por ejemplo, tpetilamina 50 mM que contiene 0 2% v/v Tritón® X-100 y 0 04% p/v metabisulfito de sodio (solución reguladora B1) Para TMV-FV1 , se realizaron estos lavados de pellas adicionales Específicamente la pella obtenida luego de los tres lavados con solución reguladora EB se resuspendió al volumen de jugo verde original en solución reguladora B1 con la ayuda del Polytron® (1 minuto de homogenización) y luego se transfirió a un frasco de centrífugo, centrifugado a 10,000 x G durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante Esta pella se sometió a un
lavado adicional con solución reguladora B1 , y la pella resultante se resuspendió, con la ayuda del Polytron®, en aproximadamente el volumen original de jugo verde de 1 x solución salina con solución reguladora de fosfato ("PBS"), pH 7 4, centrifugado a 10,000 x G durante 10 minutos, y se descartó el sobrenadante El lavado con PBS de la pella se repitió y la pella final se resuspendió en aproximadamente una décima parte del volumen original de jugo verde de 1 x PBS La finalidad de los dos lavados con PBS fue eliminar el detergente residual de la pella que contenía la fusión de proteína de envoltura DJ5 de TMV y asegurar que la preparación final de fusión de proteína de envoltura de TMV tuviera un pH cercano al neutro Se sometieron alícuotas del jugo verde, los sobrenadantes descartados y la preparación de la pella final, resuspendidos en 1 x PBS, a análisis por PAGE El análisis por PAGE mostró que los sobrenadantes contenían cantidades mínimas de la fusión de la proteina de envoltura DJ5 de TMV-FV1 , mientras que esta era la especie de proteína principal presente en la preparación de pella final Por el contrario, las proteínas hospederos derivadas de las plantas se encontraron presentes en los sobrenadantes descartados, y se detectó un mínimo de proteína hospedero en la pella final. Se empleó el mismo procedimiento en la purificación de TMV-FV2, la purificación de TMV-FV4 y la purificación de TMV-FV5, con resultados similares
B Purificación de VCP de fusión de TMV-FV3 de teµdo de planta TMV-FV3 se purifico a partir de tejido de planta de la siguiente manera Se maceró tejido de tallo y hoja infectados sistémicamente en un mezclador Wapng® durante 1 minuto a la configuración alta con solución reguladora EB1 congelado (cloruro de sodio 0 86 M, que contiene 0 04% p/v metabisulfito de sodio) a una relación de solución reguladora (ml) a tejido (g) de 2 1 El material macerado se separó a través de cuatro capas de tela de queso para retirar el material fibroso El jugo verde resultante se ajustó hasta un pH de 5,0 con acido fosfórico El jugo verde con pH ajustado se calentó hasta 47°C y se mantuvo a esta temperatura durante 5 minutos y luego se enfrió hasta 15°C El jugo verde tratado con calor se centrifugó a 6,000 x G durante 3 minutos produciendo dos fracciones, sobrenadante S1 y pella P1 La fracción de la pella P1 se resuspendió en agua destilada usando un volumen de agua equivalente a 1/2 del volumen de jugo verde inicial La pella P1 resuspendida se ajustó hasta un pH de 7 5 con hidróxido de sodio y se centrifugó a 6,000 x G durante 3 minutos produciendo dos fracciones, sobrenadante S2 y pella P2 Se precipitó el virus de ambas fracciones de sobrenadante S1 y S2 a través del agregado de 4% p/v polietilenglicol (PEG) 6,000 y 4% p/v cloruro de sodio Luego de incubar a 4°C (1 hora), el virus precipitado se recuperó por centrifugado a 10,000 x G durante 10 minutos La pella del virus se resuspendio en 1x PBS, pH 7 4 y se aclaró por centrifugado a 10,000 x G durante 3 minutos para producir una preparación final clarificada de TMV-FV3
Alícuotas del jugo verde, los sobrenadantes S1 y S2 y la preparación final del virus antes y después del centrifugado de clarificación se sometieron a análisis por PAGE El análisis por PAGE mostró la mayor parte de la cadena principal de la proteina de envoltura presente en el jugo verde repartida en el sobrenadante S1 con bajos niveles presentes en el sobrenadante S2 Con la precipitación del sobrenadante S1 con PEG y el sobrenadante S2 y el centrifugado de clarificación final, el virus se purifico adicionalmente de las proteínas del hospedero vegetal para producir dos preparaciones virales de TMV-FV3 sustancialmente puras La mayor parte del virus TMV-FV3 recuperado se encontró presente en la pella obtenida luego de la precipitación con PEG del sobrenadante S1 Una porción menor del TMV-FV3 se retiro por el centrifugado de clarificación final, junto con las proteínas residuales del hospedero vegetal
C Purificación de VCP de fusión TMV-FV1 , TMV-FV2, TMV-FV4 y TMV-FV5 de teµdo de planta El procedimiento definido para TMV-FV3, referencia anterior, se aplicó al la otra fusión de las proteínas de envoltura TMV del epitope DJ5, es decir TMV-FV1 , TMV-FV2, TMV-FV4 y TMV-FV5 Para TMV-FV1 , TMB-FV2 y TMV-FV4, el análisis por PAGE indicó que la cadena de la proteína de envoltura estaba presente en el jugo verde inicial, sin embargo la cadena estaba ausente en ambos, el sobrenadante S1 y el sobrenadante S2 y no se recupero fusión de la proteína de envoltura de TMV por el procedimiento
definido para TMV-FV3 Un análisis adicional demostró que TMV-FV1 , TMV-FV2 y TMV-FV4 fueron insolubles y estaban presentes en la pella P2, junto con pigmentos y proteínas vegetales Para purificar las proteínas de fusión insolubles TMV-FV1 , TMV-FV2 y TMV-FV4 de las proteínas y pigmentos derivados de las plantas, se empleó el procedimiento definido con anterioridad para TMV-FV1 En el caso de TMV-FV5, el procedimiento definido para TMV-FV3 imcialmente no tuvo éxito Cuando se realizaron extracciones de tejido infectado recién cosechado, empleando un mezclador Wapng® para homogenización, se recuperó una mínima cantida de TMV-FV5 de longitud completa, debido a la degradación que ocurrió durante el procesamiento Modificando el procedimiento, y comenzando con tejido congelado que se procesó con un mortero, seguido de homogenización con Polytron®, aproximadamente 30-40% de TMV-FV5 longitud completa estaba presente en el sobrenadante S1 Este se concentró en forma adicional por precipitación con PEG, y 15-17% de este TMV-FV5 permaneció soluble luego del centrifugado de clarificación final, con el resto presente en la pella de clarificación Tanto la pella de clarificación como la preparación con virus clarificada contenían cantidades significativas de proteínas del hospedero vegetal, produciendo un producto final con baja pureza Estos resultados sugirieron que el estado del tejido de partida (fresco versus congelado) y/o el(los) paso(s) de desintegración de tejidos
empleados desempeñaron una función importante en la estabilidad del epítope
D Purificación para optimización de la VCP de Fusión de TMV-FV5 de tendo de planta Dado que TMV-FV5 exhibió una solubilidad parcial con los métodos de purificación de la Parte C, referencia anterior, se realizo optimización adicional sobre el procedimiento de TMV-FV3, para determinar si la recuperación y la pureza de la preparación final del virus TMV-FV5 podía mejorarse Se combino tejido de hojas y tallo congelados, sistémicamente infectados con 2 volúmenes de solución reguladora EB1 y se macero en un mortero, seguido de homogenización usando un Polytron® Este extracto se separó a través de cuatro capas de tela de queso y el jugo verde resultante se ajustó hasta un pH de 5 0 con ácido fosfórico El jugo verde con pH ajustado se centrifugó a 6,000 x G durante 3 minutos produciendo dos fracciones, sobrenadante S1 y pella P1 , el último de los cuales no se procesó en forma adicional El sobrenadante S1 se ajustó hasta un pH 6 a través del agregado de hidróxido de sodio y se contactó con 5% p/v polvo de carbón activado {por ej Nuchar grade SA-20 o Nopt grade KB-FF) durante 1 hora a 4°C El carbón activado que contiene el sobrenadante S1 se ajustó luego hasta un pH 8 con hidróxido de sodio y centrifugado a 3000 x G durante 15 minutos para eliminar el carbón activado El sobrenadante de este se tomó hacia delante y el TMV-
FV5 se precipitó a través del agregado de 4% p/v pohetilenglicol (PEG) 6,000 y 4% p/v cloruro de sodio Luego de incubar a 4°C (1 hora), el virus precipitado se recuperó por centrifugado a 10,000 x G durante 10 minutos La pella del virus se resuspendió en 1 x PBS, pH 7 4 y no se realizó ninguna centrifugación de clarificación Se sometieron alícuotas del jugo verde, el sobrenadante S1 en las varias etapas de procesamiento, la pella resuspendida P1 y la preparación final de TMV-FV5 se sometieron a análisis por PAGE Como se observó con anterioridad, aproximadamente 40% del jugo verde proteina de envoltura estaba presente en el sobrenadante S1 junto con niveles sustanciales de proteínas del hospedero vegetal, mientras que visualmente la mayor parte del pigmento verde se separó en la pella P1 Luego del tratamiento con carbón activado a un pH 6 hubo una reducción sustancial en el nivel de la proteina hospedero en el sobrenadante con recuperación del 70-80% de TMV-FV5 Con ajuste del pH 8 y centrifugado para eliminar el carbón activado las pérdidas de TMV-FV5 fueron mínimas La precipitación con PEG, como se describió con anterioridad, del sobrenadante con pH 8 se realizó para concentrar en forma adicional el TMV-FV5, produciendo una preparación viral final con pureza satisfactoria y una mejoría notable sobre el virus obtenido del mismo procedimiento en el cual no se emplearon los pasos de pH o carbón activado La electroforesis con gel de poliacplamida (PAGE) y análisis Western blot (cuadro 16) se realizaron sobre los virus recombinantes
purificados para evaluar la pureza y la mm?norreactividad del epitope Para el análisis Western blot se empleó un anticuerpo de cabra generado contra la pro-forma de GDF8 Este anticuerpo policlonal, denominado #661 de cabra, se determinó como neutralizante en un ensayo de neutralización in vitro de GDF8 Además se realizaron transferencias Western con un anticuerpo de conejo generado contra TMV de tipo salvaje, indicado como PVAS 135D (obtenido de la ATCC Collection) El cuadro 16, a continuación, resume la solubilidad, pureza, el perfil de electroforesis con gel de poliacplamida (PAGE) y reactividad, de la fusión de proteínas de envoltura DJ5 del péptido de 20 aminoácidos, con el anticuerpo GDF8 neutralizante #661 de cabra, y con el anticuerpo anti-TMV (PVAS-135D), por transferencia Western
CUADRO 16
Propiedades físicas de la fusión de proteínas de envoltura del péptido DJ5 de 20 aminoácidos
Todas las fusiones de TMV recombinantes enumeradas en el cuadro 16 se purificaron con éxito hasta mas de un 90% de pureza En el caso de TMV-FV1 , TMV-FV2 y TMV-FV4, el TMV purificado fue no soluble Cuando se analizó por PAGE, un patrón característico de escalera se observo para las tres fusiones de la cepa U1 Sobre 10-20% geles de Tris-glicina, la cadena más baja (monómero) migró a aproximadamente 22 kDa, como se esperó para el péptido de la fusión de proteina de envoltura DJ5 de 20 aminoácidos La cadena de proteínas por enciama de este monómero migró a 45 kDa y la cadena de proteínas por enzima de ésta a 65 - 70 kDa Por transferencia Western la mayor parte de estas cadenas se detectaron mediante el anticuerpo #661 de cabra como también el anticuerpo anti-TMV PVAS-135D (cadenas de peso molecular muy alto, > 200 kDa, no siempre se detectaron debido a la escasa transferencia del gel a la membrana) Junto con los pesos moleculares observados, estos resultados indican que las cadenas adicionales representan dímeros, trímeros y multímeros superiores del péptido de fusión de la proteína de envoltura DJ5 de 20 aminoácidos Cuando el análisis por PAGE de TMV-FV1 , TMV-FV2 y TMV-FV4 se realizó en ausencia de agente reductor, la proporción del monómero disminuyó, con un aumento observable en la proporción de oligómeros de orden superior Esto sugiere que ocurría la formación de puentes de disulfuro entre el péptido de la fusión de proteínas de envoltura DJ5 de 20 aminoácidos El péptido de 20 aminoácidos DJ5 contiene dos residuos de cisteína, que probablemente estén involucrados en la formación de los oligómeros observados de orden superior
Para TMV-FV5, la preparación final del virus fue parcialmente soluble y exhibió el mismo patrón de cadenas ohgomépcas dependientes del agente reductor que TMV-FV1 , TMV-FV2 y TMV-FV4 tanto por PAGE y por análisis Western blot La solubilidad levemente mejorada de TMV U5 puede deberse al uso de esta proteina de envoltura cepa U5 en lugar de la proteína de envoltura de cepa U1 La única fusión de TMV soluble de la serie enumerada en el cuadro 15 fue TMV-FV3, donde el péptido de 20 aminoácidos DJ5 se mostró como una fusión N-terminal a la proteína de envoltura de cepa U1 Para TMV-FV3, la proteína de envoltura migró con una masa de aproximadamente 18 kDa en un gel de PAGE, similar a la proteína de envoltura U1 de tipo salvaje Esto sugirió el truncamiento del epitope No se observó escalera oligomépca y por transferencia Western la fusión de TMV se detectó a través del anticuerpo 135D PVAS anti-TMV aunque no por el anticuerpo neutralizante de GDF8 #661 de cabra Esta falta de reactividad con el anticuerpo #661 de cabra soporta el truncamiento de parte o la totalidad del péptido de fusión DJ5 de 20 aminoácidos en el caso de TMV-FV3
EJEMPLO 11 Caracterización de TMV-FV1 , TMV-FV2, TMV-FV3, TMV-FV4 y TMV-FV5 por MALDI
Además de PAGE y análisis Western blot, las preparaciones virales se caracterizaron usando Matrix Assisted Láser Desorption lonization -Time of Flight (MALDI-TOF) (Cuadro 17) Las preparaciones virales resuspendidas, precipitadas con PEG, se diluyeron en una solución de ácido sinapínico (Aldrich, Milwaukee, Wl), con la dilución en el rango de 1 1 a 1 20 dependiendo del la concentración del virus, para obtener una concentración final de 1 a 1 5 mg/ml El ácido sinapínico se preparó a una concentración de 10 mg/ml en 0 1 % acido tpfluoroacético acuoso/acetonitplo (70/30 en volumen) La muestra tratada con ácido sinapínico (1 0 µl) se aplicó a una superficie de placa de MALDI de acero inoxidable y se dejó secar al aire a temperatura ambiente Los espectros de masa MALDI-TOF se obtuvieron con un PerSeptive Biosystems DE-PRO (Houston, TX) operado en modo lineal Un láser pulsado operativo a 337 nm se usó en el modo de extracción demorada para ionización Se usó un voltaje de aceleración de 25 kV con un 90% de voltaje de parrilla y un voltaje de cable guia del 0 1 % Aproximadamente se adquirieron 100 barridos y se promediaron sobre el rango de masa 2,000-156,000 Da con una puerta de masa baja de 2,000 Las presiones espejo y de origen iónico fueron de aproximadamente 1 2 x 10 7 y 1 6 x 10 7 Torr, respectivamente Todos los espectros se calibraron en masa con un
adaptador de dos puntos usando apomioglobina de caballo (16,952 Da) e
insulina (5734 Da) como estándares El cuadro 17, a continuación, provee un
resumen de los pesos moleculares esperados y observados, por MALDI , para
el péptido de fusión DJ5 de 20 aminoácidos
CUADRO 17
Pesos moleculares esperados y observados, fusiones del péptido DJ5 de
20 aminoácidos, por MALDI
análisis MALDI Denominación Descriptor Equivaabreviado PM esperado PM observado lencia
TMV-FV1 19,833 Da (-Met / 19,829 Da Si DJ5(20)-U1 -GPAT Acetilo) TMV-FV2 19,890 Da (-Met / 19,890 Da Sí DJ5(20)-U1 -C Acetilo) TMV-FV3 19,685 (- Met / Acetilo) 17,745 Da No DJ5(20)-U1-N TMV-FV4 20, 100 Da (-Met / 20,097 Da Sí DJ5(20)-U1 -L Acetilo) TMV-FV5 19,878 Da (-Met / 19,876 Da Sí DJ5(20)-U5-TPAT Acetilo)
Para TMV-FV1 , TMV-FV2, TMV-FV4 y TMV-FV5 los pesos
moleculares observados fueron equivalentes a los pesos moleculares
esperados, para el caso donde el residuo Met N-terminal de la fusión de la
proteína de envoltura se eliminó y se acetiló el aminoácido adyacente La
presencia del epitope DJ5 intacto de 20 aminoácidos sobre TMV-FV1 , TMV- FV2, TMV-FV4 y TMV-FV5, junto con la transferencia Western ant?-GDF8
positiva mencionada en el cuadro 16, confirmó que la totalidad de estas cuatro fusiones de TMV eran potenciales candidatos para las vacunas Para la fusión N-terminal, TMV-FV3, se obtuvo una masa de 17,745 Da, lo que representa múltiples posibilidades de truncación Realizando cromatografía líquida en una digestión tríptica de TMV-FV3 y analizando los fragmentos de péptidos resueltos por espectrometría de masa en tándem se determinó luego que el extremo C-terminal de TMV-FV3 estaba intacto y que el epítope DJ5 se escindió, para dejar solo la sepna final C-terminal que se acetiló Dado que esta fusión no fue capaz de mantener el epitope de DJ5 de 20 aminoácidos y no se detecto en transferencias Western por el anticuerpo ant?-GDF8 #661 de cabra, no se buscó en forma adicional como candidato para la vacuna La confirmación por espectrometría de masa de que TMV-FV3 carecía del epítope DJ5 y su migración como cadena única por análisis por PAGE (Cuadro 16), indica que el residuo de aminoácidos dentro del epítope DJ5 fue responsable del entrecruzamiento y la formación de ohgómeros de orden superior Como se indicó con anterioridad, las dos cisteínas dentro del epítope DJ5 se consideraron los aminoácidos que con mayor probabilidad estarían involucrados en este entrecruzamiento
EJEMPLO 12 Extracción y purificación de TMV-FV6 y TMV-FV7
De estas cinco fusiones del péptido DJ5 de 20 aminoácidos purificadas (ver Ejemplo 10), y caracterizadas por espectrometría de masa (Ejemplo 1 1 ), cuatro se identificaron como posibles candidatos para la vacuna, es decir, TMV-FV1 , TMV-FV2, TMV-FV4 y TMV-FV5 Estas cuatro fusiones de TMV, sin embargo, no fueron solubles Dado que la insolubilidad de la fusión de TMV tuvo relación con la presencia del péptido de 20 aminoácidos DJ5, que produjo el entrecruzamiento de la proteina de envoltura, se arribó a la hipótesis de que la formación de oligómeros se relacionó con la insolubilidad de la fusión de TMV Además, las dos cisteinas presentes en el péptido DJ5 resultaron responsables de este entrecruzamiento, y asi se propusieron dos nuevas construcciones en las cuales estos dos residuos se eliminaron Las dos nuevas construcciones, pLSB-FV6 y pLSB-FV7, se diseñaron para visualizar los 12 aminoácidos N-terminales del péptido DJ5, como fusiones N-termmal y GPAT respectivamente, para la proteína de envoltura U1 Los mismos puntos que surgieron en el Ejemplo 10, respecto del cultivo de tejidos y almacenamiento antes de la extracción también se aplican a TMV-FV6 y TMV-FV7 Como se observa en el Ejemplo 10, referencia anterior, se han documentado varios procedimientos para la purificación de virus de TMV recombinante de tejido de planta infectado Estos procedimientos y sus modificaciones, diseñados para mejorar la estabilidad
del epitope (es decir minimizar la degradación y proteólisis) durante la extracción y el procesamiento, y mejoran la solubilidad de los vipones, se usaron en la purificación de virus TMV-FV6 y la purificación de TMV-FV7 Para TMV-FV7, se empleó el procedimiento definido para TMV-FV3 en el Ejemplo 10 comenzando con tejido de planta recién cosechado infectado sistemicamente El análisis por PAGE de las muestras en proceso y la preparación viral clarificada final mostró que aproximadamente el 80% del TMV-FV7 presente en el jugo verde se repartió en el sobrenadante S1 , con el resto presente en el sobrenadante S2 Solo el sobrenadante S1 se llevó a la siguiente etapa para precipitación con PEG y siguiendo el centrifugado final de clarificación, que precipitó algunas proteínas huéspedes residuales, la mayor parte del TMV-FV7 purificado permaneció soluble Cuando el procedimiento definido para TMV-FV3 en el Ejemplo 10 se empleo para la purificación de TMV-FV6, comenzando con tejido recién cosechado, solo se encontraron presentes bajos niveles de producto en el sobrenadante S1 , con la mayor parte del TMV-FV6 asociado con la pella P2 El protocolo se modificó entonces tal que el tejido sistémicamente infectado se congeló antes de la extracción y la maceración del tejido se realizó con la ayuda de un mortero y maja Con estas alteraciones el análisis por PAGE indicó que aproximadamente el 30% del TMV-FV6 se repartió en el sobrenadante S1 , con el resto detectado en el sobrenadante S2 y pella P2 El sobrenadante S1 se precipitó por PEG como se describe en Ejemplo 10, referencia anterior, y el virus concentrado se sometió a centrifugación para
aclaramiento El TMV-FV6 se repartió en la pella de centrifugación de aclaramiento, y el análisis por PAGE mostró contaminación mínima producida por las proteínas del hospedero vegetal El análisis por electroforesis con gel de poliacplamida (PAGE), y análisis Western blot (Cuadro 18) se realizo sobre los virus recombinantes purificados para evaluar pureza Para el análisis Western blot se empleó un anticuerpo de cabra generado contra la pro-forma de GDF8 Este anticuerpo, indicado como #661 de cabra, se determino como neutralizante en un ensayo de neutralización de GDF8 m vitro También se realizaron transferencias Western con un anticuerpo de conejo generado contra TMV de tipo salvaje, indicado como PVAS 135D [obtenido de la ATCC Collection (ATCC No PVAS 135D] El cuadro 18, a continuación, provee datos para la solubilidad, pureza, perfil de electroforesis con gel de poliacplamida (PAGE) y reactividad con el anticuerpo #661 de cabra neutralizante de GDF8 y el anticuerpo anti-TMV (PVAS-135D) por transferencia Western, para las fusiones acortadas de proteínas de envoltura del péptido DJ5 de 12 aminoácidos
CUADRO 18
Propiedades físicas de la fusión de proteínas de envoltura del péptido
DJ5 de 12 aminoácidos
Detección por
Denominación Perfil por Solubilidad Pureza transferencia Western Descriptor abreviado PAGE Ant?-GDF8 Anti-TMV Parcial¬
TMV-FV6 Cadena mente >90% Si Si DJ5(12)-U1-N única soluble TMV-FV7 Cadena Soluble >90% Si S I DJ5(12)-U1-N única
Ambas fusiones recombinantes de TMV enumeradas en el
cuadro 18 se purificaron con éxito hasta más de un 90% de pureza En el caso
de TMV-FV6, el virus purificado final fue parcialmente soluble, mientras que
TMV-FV7 resultó totalmente soluble Cuando se analizó por PAGE, ambas
fusiones de TMV migraron como cadena única y estas fusiones de proteínas
de envoltura se detectaron mediante tanto con el anticuerpo anti-TMV PVAS- 135 y el anticuerpo ant?-GDF8 #661 de cabra Se detectó un mínimo o
ninguna especie de peso molecular más elevado mediante PAGE o
transferencia Western, respaldando la función hipotética desempeñada por las
dos cisteínas del epítope DJ5 en el entrecruzamiento de la proteina de
envoltura La mejorada solubilidad también indica que la o gomerización fue
responsable de la asociación macromolecular de los vipones de TMV
recombinantes
EJEMPLO 13 Caracterización de TMV-FV6 y TMV-FV7 por MALDI
Además de PAGE y análisis Western blot, las preparaciones virales de TMV-FV6 y TMV-FV7 se caracterizaron usando Matrix Assisted Láser Desorption lonization - Time de Fhght (MALDI-TOF) (cuadro 19) La preparación y el manchado del virus precipitado por PEG y resuspendido en ácido sinapínico fue como se definió en el Ejemplo 1 1 La adquisición de espectros de MALDI-TOF en un PerSeptive Biosystems DE-PRO (Houston, TX) también se realizó como se describe en el Ejemplo 1 1 , usando apomioglobina de caballo e insulina como estándares de masa El cuadro 19, a continuación, provee un resumen de los pesos moleculares esperados y observados, por MALDI, para las fusiones del péptido DJ5 de 12 aminoácidos acortadas
CUADRO 19
Pesos moleculares esperados y observados, fusiones del péptido DJ5 de
12 aminoácidos, por MALDI
Análisis por MALDI Denominación Descriptor abreviado PM esperado PM observado Equivalencia
TMV-FV6 18,794 Da (-Met / Acetilo) 18,792 Da Sí DJ5(12)-U1-N TMV-FV7 18,981 Da (-Met / Acetilo) 18,977 Da Sí DJ5(12)-U1-GPAT
Tanto para TMV-FV6 como TMV-FV7, los pesos moleculares
observados fueron equivalentes a los pesos moleculares esperados, para el
caso donde el residuo Met N-terminal de la fusión de la proteína de envoltura
se eliminó y se acetiló el aminoácido adyacente La presencia del epítope DJ5
de 12 aminoácidos intacto sobre TMV-FV6 y TMV-FV7, junto con los datos
positivos ant?-GDF8 por transferencia Western mencionados en el cuadro 18,
confirmaron que ambas de estas fusiones de TMV resultaron potenciales
candidatos para vacuna
EJEMPLO 14
Caracterización de TMV-FV5, TMV-FV6 y TMV-FV7 por ELISA
Además de inmunoanálisís por transferencia Western, también
se realizaron ensayos inmunoabsorbentes ligados por enzimas (ELISA) con
las fusiones del péptído DJ5 solubles y parcialmente solubles, es decir, TMV-
FV5, TMV-FV6 y TMV-FV7 Dado que la fusión de TMV no se desnaturaliza antes del contacto con el anticuerpo, los ELISA permiten la evaluación del reconocimiento del epítope y la accesibilidad en el contexto del vipón recombinante organizado Los ELISA se realizaron en dos formatos, por envoltura de la fusión de TMV sobre la placa de ELISA y mostrando la fusión de TMV recombinante en un formato sandwich usando el anticuerpo anti-TMV PVAS-135D Para la detección de la fusión de TMV recombinante se emplearon tres anticuerpos - #661 de cabra Este anticuerpo po clonal de cabra se generó contra Prohormona de GDF8 recombinante purificada (ver Ejemplo 2) y se determinó como neutralizante en un ensayo de neutralización de GDF8 in vitro (ver Ejemplo 3) - #1286 de conejo Este anticuerpo policlonal de conejo se generó contra un conjugado de hemocianina de lapa Califomiana (KLH) del peptido de 20 aminoácidos DJ5 (SEC ID NO 8) y aunque fue capaz de reconocer este péptido en formato ELISA, no fue capaz de neutralización in vitro de GDF8 - MAB788 de rata (R&D Systems, Inc , Minneapolis, MN) Este anticuerpo monoclonal anti-ratón GDF8 se purificó a partir de un hibpdoma resultante de la fusión de un mieloma de ratón con B células obtenido de una rata inmunizada con GDF8 de ratón purificado, recombinante, derivado de NSO El anticuerpo monoclonal fue capaz de neutralización de la bioactividad de GDF8 de ratón
Para el ELISA indirecto la fusión recombinante de TMV, TMV-FV5, TMV-FV6 o TMV-FV7, se diluyó en solución reguladora de carbonato/bicarbonato (pH 9 6) y se usó para recubrir una placa de microtitulaaón de 96 pocilios (MaxSorb, Nunc) hasta la mañana siguiente a 4°C (50 pl por receptáculo) Se recubrió un máximo de 200 ng de antígeno objetivo con la modalidad de una dilución serial a la mitad Como control se empleó Prohormona de GDF8 (ver Ejemplo 1 ), con un máximo de 100 ng por receptáculo También se realizó una dilución serial a la mitad con Prohormona de GDF8 La solución de envoltura se eliminó y se bloquearon las placas con 5% p/v de leche descremada en polvo en 1 x solución reguladora de TBST (solución salina con solución reguladora de Tris con TWEEN™ 20) durante 1 a 2 horas a temperatura ambiente (200 pl de solución de bloqueo por receptáculo) Los pocilios se lavaron dos veces con 1 x TBST y 50 µl del anticuerpo (#661 de cabra, MAB788 de rata o #1286 de conejo), diluido en 1 x TBST con 0 5% p/v de leche descremada en polvo, se agregó por receptáculo Todos los anticuerpos se emplearon a una dilución de 1 1000, con excepción de #1286 de conejo, que se empleó a 1 100 Luego de una incubación de 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo primario, la placa se lavó 5 veces con 1 x TBST y 50 µl del anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante apropiada (HRP) a una dilución de 1 10 000 en 1 X TBST que contiene 0 5% p/v de leche descremada en polvo La placa se incubó con el anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavó cinco veces con 1 x TBST y se agregó 50 µl de
sustrato de solución de 3,3',5,5 -tetramet?l bencidina por receptáculo La reacción catalizada por HRP permitió proceder durante 5 a 20 minutos y se interrumpió a través del agregado de 50 µl de ácido sulfúrico 1 N La absorbancia de la placa (DO) se leyó a 450 nm en un espectrofotómetro de placa de 96 pocilios (Molecular Devices) Para el ELISA en sandwich de anticuerpo doble (DAS), 50 µl de anticuerpo policlonal anti-TMV PVAS-135D, diluido a 1 500 en solución reguladora de carbonato/bicarbonato (pH 9 6) se usó para recubrir placas de microtitulación de 96 pocilios (MaxSorb, Nunc) hasta la mañana siguiente a 4°C La solución de envoltura se eliminó y los pocilios se bloquearon con 200 pl de 1X solución reguladora de TBST que contiene 5% p/v de leche descremada en polvo durante 1 a 2 horas a temperatura ambiente Luego del paso de bloqueo, los pocilios se lavaron 5 veces y se agregó 50 µl de una solución vipónica de TMV recombinante, que contiene TMV-FV5, TMV-FV6 o TMV-FV7, por receptáculo (1X TBST con 0 2% p/v de leche descremada en polvo empleada como solución reguladora) Se empleó un máximo de 1 1 pmoles de proteína de envoltura por receptáculo, con una dilución serial a la mitad del vipón recombinante presente en cada placa Para permitir la captura del vipón de TMV por el anticuerpo recubierto PVAS-135D, la placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente El exceso de vipón de TMV se eliminó lavando la placa 5 veces con 1 X TBST y el anticuerpo primario (ya sea #661 de cabra o Rat MAS788, diluido a 1 1000 en 1X TBST con 0 5% p/v de leche descremada en polvo) se agregó durante una incubación de 1 hora a
temperatura ambiente La placa se lavo luego 5 veces con 1x TBST y se agregaron 50 µl del anticuerpo secundario apropiado conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) a una dilución de 1 10,000 en 1X TBST que contiene 0 5% p/v leche descremada La placa se incubó con el anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavó veces con 1 x TBST y se agrego 50 µl de solución sustrato de 3,3',5,5'-tetramet?l bencidina por receptáculo Se dejo proceder la reacción catalizada por HRP durante 5 a 20 minutos y se detuvo a través del agregado de 50 µl de acido sulfúrico 1 N La absorbancia de la placa se leyó a 450 nm en un espectrofotómetro de placa de 96 pocilios (Molecular Devices) También se realizaron ELISA sandwich donde se empleo el anticuerpo MAB788 de rata (diluido a 1 1000) como anticuerpo de captura Para estos ELISA el anticuerpo primario empleado fue el anticuerpo #661 de cabra Estos ELISA sandwich también incluyeron un control positivo de Prohormona de GDF8, presente a una concentración más alta de 1 1 pmoles por receptáculo, con una dilución serial a la mitad Los datos de ELISA para los ELISA indirecto y DAS se resumen en el cuadro 20, a continuación, que provee un resumen de datos de ELISA indirecto y sandwich con anticuerpo doble La respuesta de ELISA indirecto por pmol se informa con relación al control positivo de la Prohormona de GDFd en CHO
CUADRO 20
Resumen de datos de ELISA indirecto y sandwich con anticuerpo doble
ELISA directo ELISA sandwich Denominación ^ , „ MAb „ „,.,-. „ „.,-. ^ r Des^cr.i^ptor a ^b,r0e„v„iaHd.o C ,,a„b_ra C „o,n„ejo _ Ra,ta ^ 13 ,5D C _n 1 -_35D C n „ Ra . ta C « ? #661 #1286 Cabra 1o Rata 1° Cabra 1°
TMV-FV5 + ++++ - - - + DJ5(20)-U5-TPAT TMV-FV6 ++ ++++ ++ + + + DJ5(12)-U1 -N TMV-FV7 ++ ++++ ++ ++++ ++++ +++ + DJ5( 12)-U1 -GPAT
Para el cuadro 20 ++++ indica una respuesta comparable con el
control de la Prohormona de GDF8 Se enumeran los anticuerpos primarios
empleados Para el ELISA sandwich, la respuesta más alta obtenida fue con
la construcción FV7, que se calificó ++++ Los datos para las otras fusiones se
mencionan con relación a éste C, anticuerpo de captura, 135D, PVAS-135D
anti-TMV PAb, 1o, anticuerpo primario
Para TMV-FV5 evaluado en formato de ELISA, la fusión se tituló
en un modo similar al control de la Prohormona de GDF8 cuando se empleó el
anticuerpo #1286 de conejo para detección En comparación, solo se obtuvo
una respuesta mínima cuando se emplearon los anticuerpos #661 de cabra o
MAB788 de rata como los anticuerpos primarios En el formato de ELISA
sandwich las respuestas fueron débiles comparadas con TMV-FV7 Sin
embargo debe observarse que el anticuerpo PVAS-135D empleado para la
captura generado contra la cepa U 1 de TMV y TMV-FV5 se basa en la cepa U5 Ambas fusiones de péptido derivado de DJ5 de 12 aminoácidos (TMV-FV6 y TMV-FV7) se detectaron mediante los tres anticuerpos anti-GDF8/DJ5 en el formato de ELISA directo y los perfiles de respuesta para ambas fusiones fueron similares, con la respuesta DO por mol levemente superior para TMV-FV7 Sin embargo, esto puede reflejar simplemente la solubilidad mejorada para esta fusión Con la detección con #1286 de conejo, la respuesta tanto a TMV-FV6 y -FV7 fue comparable al control de la Prohormona de GDF8 En el caso de #661 de cabra y Rat MAb, la respuesta al control de la Prohormona de GDF8 fue 2-3 veces más alta Para los ELISA sandwich con doble anticuerpo, la fusión N-termmal mostró una respuesta deficiente en todos los casos, posiblemente debido a la escasa captura resultante de este estado agregado Para la fusión C-terminal (GPAT), se obtuvo una respuesta tanto con #661 de cabra como MAB788 de rata como los anticuerpos primarios, habiendo capturado con el policlonal PVAS-135D Con captura y detección de ant?-GDF8 (captura de MAB788 de rata y detección con #661 de cabra), TMV-FV7 mostró una respuesta de DO por pmol mayor que el control de la Prohormona de GDF8 Esto puede reflejar el hecho de que cada varilla capturada mostró más de 2000 copias del epitope reactivo, produciendo amplificación de señal Junto con los datos Western blot discutidos en el Ejemplo 12, los datos de ELISA indican que la porción N-terminal de 12 aminoácidos del epítope de DJ5 de 20 aminoácidos se
reconoció neutralizando anticuerpos a la proteina GDF8 proteina y por lo tanto resulta un candidato viable para vacuna
EJEMPLO 15 Elección de la fusión de la proteína de envoltura de TMV para evaluación en animales y fabricación de la vacuna
Se evaluó un total de siete fusiones TMV DJ5 candidato recombinantes, detalladas en los cuadros 8 y 12, para determinar su expresión en N benthamiana y su inmunorreactividad a una serie de anticuerpos dirigidos tanto contra el peptido de 20 aminoácidos DJ5 o la Prohormona de GDF8 completa En base a los datos acumulativos las construcciones enumeradas en el cuadro 21 , a continuación, se tomaron para fabricación, para generar suficientes cantidades de vipon recombinante calificado, esterilizado e inactivado, a evaluar en ensayos en animales
CUADRO 21
Cuatro fusiones de TMV DJ5 recombinantes seleccionadas pra Ba
fabricación de vacunas de investigación para evaluación en animales
Denominación _ . Esqueleto de . ., , , . . . , Descriptor , , , Ubicación de inserción del del Vector , X la proteina de ? abreviado .. epitope J envoltura pLSB-FV1 DJ5(20)-U1-GPAT cepa U1 Posición GPAT pLSB-FV5 DJ5(20)-U5-TPAT cepa U5 Posición TPAT pLSB-FV6 DJ5(12)-U1-N cepa U1 N-termmo pLSB-FV7 DJ5(12)-U1-GPAT cepa U1 Posición GPAT El razonamiento detras de esta selección fue el siguiente Las
fusiones que muestran la región N-termmal de 12 aminoácidos del péptido
0 DJ5, es decir, TMV-FV6 y TMV-FV7, poseían las características más
deseables en cuanto a la acumulación, extracción y purificación en plantas
Dado que el análisis de inmunorreactividad por transferencia Western y ELISA
demostró que estas fusiones de péptido DJ5 modificadas de TMV se
reconocieron mediante los anticuerpos #661 de cabra y MAB788 de rata, que
5 son neutralizantes de GDF8, ambos se usaron para la fabricación de vacunas
Para complementar estas dos vacunas, las fusiones de DJ5 de 20
aminoácidos consideradas fueron aquellas que transportaban el epítope ya
sea en el N-término (TMV-FV3) o en la posición GPAT/ TPAT (TMV-FV1 y
TMV-FV5) Debido a el truncamiento del epítope en el caso de TMV-FV3 (ver
0 Ejemplo 10 y 1 1 ), se eligieron TMV-FV1 y TMV-FV5 Esta selección también
permite vacunas de diferentes formas físicas para comparación, desde
solubles (TMV-FV7), hasta parcialmente solubles (TMV-FV6 y TMV-FV5)
hasta no solubles (TMV-FV1 )
Para la fabricación de las cuatro fusiones de TMV DJ5 para uso en animales, los procedimientos empleados fueron como se definió en el Ejemplo 10 y Ejemplo 12, con las siguientes modificaciones En todas las etapas en el proceso, se empleo agua para inyección (API) y todos los reactivos fueron de soluciones madre exclusivas Donde fue posible los utensilios de laboratorio para procesar las preparaciones virales se hornearon a 225°C durante un mímino de 6 horas En los casos en los que esto no fue posible los utensilios de laboratorio se enjuagaron en una solución al 10% de hipoclopto de sodio durante 20 minutos, se enjuagaron extensivamente en API y se sometieron a autoclave a 121 °C durante 20 minutos El virus final recombinante se resuspendió en solución salina estéril con solución reguladora de fosfato Esta preparación se esterilizo y el ARN genomico de TMV se inactivo tratando con etilenimina binaria ("BEI") En síntesis, se agregó una solución madre de BEI 0 1 M hasta una concentración final de de BEI 5 mM Las muestras se incubaron durante 48 horas a 37°C con mezclado constante Luego de 48 horas, la BEI se neutralizó a través del agregado de un exceso 3 molar de tiosulfato de sodio El contenido de proteínas de las preparaciones de fusión de DJ5 de TMV inactivadas con BEI se determinó por análisis de aminoácidos (AAA), el pH se ajustó hasta aproximadamente 7 4, a través del agregado de 10% v/v de una solución de fosfato de potasio monobásico 50 mM y la preparación se diluyo hasta 1 mg/ml con solución salina con solución reguladora de fosfato antes de separar
en alícuotas en frascos de vidrio estéril de 2 ml El producto envasado final se evaluó para liberación como se define en el Ejemplo 16, a continuación
EJEMPLO 16 Caracterización de vacunas de fusión de la proteína de envoltura TMV para evaluación en animales
Las vacunas en frascos de TMV-FV1 , TMV-FV5, TMV-FV6 y TMV-FV7 se sometieron a una serie de pruebas para confirmar identidad, pureza, esterilidad, inactivación de ARN genómico de TMV y la ausencia de endotoxina Los ensayos y los criterios de liberación empleados se definen en síntesis a continuación El peso molecular de cada vacuna se determinó por espectrometría de masa MALDI-TOF y para liberación debe ser equivalente al PM esperado dentro de ± 0 05% Todas las vacunas se analizaron por SDS-PAGE con 16% Tris-glicina Luego de la electroforesis, se mancharon los geles con Azul Brillante Coomassie y se analizaron por densitometria La cadena o las cadenas de fusión de proteína de envoltura DJ5 de TMV deben constituir el 90% o más de la proteina total detectable La identidad de cada vacuna se determinó por espectrometría de masa de digestión tríptica por MALDI-TOF Las masas moleculares para por lo menos cuatro fragmentos de peptidos trípticos únicos, no modificados debe equivaler a la masa molecular de los correspondientes fragmentos de peptidos trípticos no modificados
teóricos ± 0 5 y los fragmentos de péptido tríptico deben confirmar la integridad de la fusión del péptido DJ5 La concentración final de proteínas de la vacuna se determinó usando análisis de aminoácidos, que también brindó la composición de aminoácidos de las fusiones DJ5 de TMV El aspecto de las vacunas en solución se determinó por inspección visual y el pH del producto envasado en frascos se determinó por métodos estándares usando un metro de pH calibrado (rango aceptable, pH 7 4 +/- 0 4) La infectividad de TMV se determinó usando una planta hospedero con lesión local, N tabacum var xanthi, "Glurk" Se realizaron análisis de la lesión local en plantas Glurk 4-6 semanas luego de sembrar Se inocularon cien µl de la muestra que se someterá a evaluación por hoja con carburo de silicio empleado como abrasivo Las muestras se corrieron por triplicado y las lesiones locales se calificaron 4-6 días después de la inoculación Se requirió una detección de menos de una lesión local para liberación Para determinación de la carga biológica, muestras de 10 µl y 100 µl se colocaron en placas sobre agar con nutriente de LB, usando la técnica aséptica bajo una capucha de flujo laminar Se invirtieron las placas y se incubaron a temperatura ambiente durante cuatro días La cantidad de colonias se registró luego de los 4 días y se calificó una segunda vez Para la liberación, no deben detectarse unidades formadoras de colonias Finalmente, el contenido de endotoxina de las fusiones DJ5 de TMV envasadas en frascos se determinó usando el ensayo Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Para cumplir con las especificaciones, cada dosis de vacuna no debe administrar
más de 10 UE de endotoxina Los resultados de la evaluación de liberación
para las cuatro vacunas se resumen en los cuadros 22A y 22B, a
continuación
CUADRO 22A
Resultados de evaluación de liberación para proteínas de vacuna de
fusión de DJ5 tratadas con BEI
SDS- DenominaMALDI-T de Come, de PAGE pH Aspecto proteínas ción PM por EM (pureza) (mg/ml) 19833 Opaco TMV-FV1 > 90% 7 4 0.95 Aprueba Ppt blanco Pico menor 19875 Opaco tinta TMV-FV5 > 90% 7 2 0.98 Picos mayores tostado/ Truncamientos verde múltiples Opaco 18799 Tinta TMV-FV6 95 % 7 1 0.83 Aprueba tostado/ verde 18981 Opaco TMV-FV7 98 9% 7 1 1 05 Aprueba Blancuzco
CUADRO 22B
Resultados de evaluación para liberación para proteínas de vacuna
de fusión de DJ5 tratadas con BEI (Datos adicionales)
Conc. de LAL MA DI
DenominaEnsayo de Carga proteína (endotoxina) ción Lesión local biológica TOF tríptico (mg/ml) EU/mL (identidad)
TMV-FV1 0 95 Aprueba Aprueba 0 845 Aprueba 7 70 TMV-FV5 0 98 Aprueba Aprueba Aprueba
TMV-FV6 0 83 Aprueba Aprueba 3 32 Aprueba
TMV-FV7 1 05 Aprueba Aprueba 1 21 Aprueba
Los resultados para los lotes de vacuna producidos para
evaluación en animales fueron de la siguiente manera Para TMV-FV1 , se
prepararon un total de 24 frascos (1 ml/frasco), con concentración de proteína
objetivo de 1 mg/ml Por análisis por PAGE en condiciones de reducción,
resultó ser una reducción en un nivel de monómero presente en la vacuna
purificada siguiendo el tratamiento con BEI Esto puede deberse a una mayor
formación de enlaces de disulfuro causada por las condiciones de alto pH
empleadas en la inactivación con BEI Para determinar si el tratamiento con
BEI afectó la antigenicidad de la fusión, se realizaron transferencias Western
sobre muestras pre- y post-tratadas con BEI usando los siguientes
anticuerpos, PVAS 135D (anti-TMV), #661 de cabra, #1286 de conejo y
MAB788 de rata Los perfiles observados con los cuatro anticuerpos fueron
esencialmente idénticos, donde ambas muestras pre-y post-BEl contienen la
escalera o gomepca esperada No se realizó ELISA debido a la naturaleza
particular de la fusión purificada El análisis de calidad para el TMV-FV1
envasado en frascos se completo y los datos de liberación se resumen en los cuadros 22A y 22B La fusión aprobó todos estos criterios En el caso de la pureza, esta se estimaba en más del 90%, en base a la correspondencia entre los perfiles con gel en PAGE y oligomépcos por Western Blot Sin embargo, no se informo un porcentaje exacto de la pureza ya que no se realizó confirmación de digestión tríptica de cada banda individual Para TMV-FV5, se preparó un total de 9 frascos (1 4 ml/frasco), con una concentración de proteina objetivo de 1 mg/ml Para determinar si había algún efecto perjudicial del tratamiento con BEI sobre la fusión, se realizaron transferencias Western usando el MAB788 de rata neutralizante de GDF8 para la detección Para la muestra de tratamiento pre-BEl, se observó una banda única Sin embargo, luego del tratamiento con BEI se observó una escalera oligomépca, posiblemente debido a un entrecruzamiento creciente de disulfuro, que puede ser el resultado de las condiciones de pH alcalino durante el tratamiento con BEI Además, para la especie monomérica post-BEI resultó evidente un duplete por Western Blot Los datos de Western Blot se correlacionaron con los datos de MALDI de longitud completa, que mostró un producto con múltiples truncamientos Ambas bandas del duplete son reactivas al anticuerpo, lo que sugiere que el producto truncado mantuvo algo de antigenicidad Los ELISA directos se realizaron sobre las muestras con los tres anticuerpos ant?-DJ5/GDF8 (#661 de cabra, #1286 de conejo y MAB788 de rata) y un anticuerpo anti-TMV (PVAS 135D) Las muestras pre-BEl fueron sustancialmente más reactivas que el producto final tratado con BEI Una
posible explicación para esto es que el entrecruzamiento de la fusión de TMV redujo la accesibilidad del epítope y/o redujo la solubilidad de los vipones, produciendo un nivel reducido de envoltura sobre la placa de microtitulacion El análisis de calidad para el TMV-FV5 envasado en frascos se completó y los datos de liberación se resumen en los cuadros 22A y 22B En el caso de la pureza, esta se estimó en más del 90%, en base a una correspondencia de uno a uno entre el gel de PAGE y los perfiles oligomepcos por Western Blots Sin embargo, no se informó un porcentaje exacto de pureza, ya que la confirmación de digestión tríptica de cada banda individual no se realizo Como se observó con anterioridad, la especie de truncamiento en el producto final tratado con BEI fue inmunorreactivo por Western Blot Además, el mapeo con gel y masa tiptica líquida indicó que la especie truncada mantenía la totalidad del epítope DJ5 excepto los dos aminoácidos C-terminales (EN) Por lo tanto, esta vacuna candidata se llevó a la siguiente etapa para evaluación en animales Para TMV-FV6, se preparó un total de 9 frascos (1 4 ml/frasco), con una concentración de proteína objetivo de 1 mg/ml Para determinar si había efectos perjudiciales del tratamiento con BEI sobre la fusión, se realizaron transferencias Western, en muestras pre- y post-BEl, usando el Rat MAb neutralizante de GDF8 para detección Se observó una banda única para ambas muestras Los ELISA directos también se realizaron con los tres anticuerpos ant?-DJ5/GDF8 y un anticuerpo anti-TMV Perfiles similares se observaron para las muestras pre- y post-BEl Junto con los datos de Western
Blot, estos resultados indican que no hay modificaciones perjudiciales para el epitope luego del tratamiento con BEI Los cuadros 22A y 22B resumen los datos de liberación obtenidos del análisis de calidad del TMV-FV6 envasado en frascos El producto para la vacuna aprobó todos los criterios de liberación y se llevo a la siguiente etapa para evaluación en animales Para TMV-FV7, se preparo un total de 32 frascos (1 ml/frasco), con una concentración de proteina objetivo de 1 mg/ml Para determinar si el tratamiento con BEI tenia algún efecto perjudicial sobre la fusión de DJ5, se realizaron transferencias Western, usando los siguientes anticuerpos, PVAS 135D (anti-TMV), #661 de cabra, #1286 de conejo y MAB788 de rata Tanto las muestras pre- y post-BEl se detectaron mediante los cuatro anticuerpos y la fusión migró como una banda única Además, dado que esta fusión fue soluble, se realizaron tanto ELISA de captura directa como ELISA emparedado de doble anticuerpo (DAS), para determinar si podían detectarse alteraciones al epítope, resultantes del tratamiento con BEI, en el contexto de la proteína de envoltura desnaturalizada y el vipón montado Se empleó Prohormona de GDF8 derivada de CHO (Ejemplo 1 ) como control positivo Para los ELISA DAS, se obtuvieron perfiles casi idénticos para las muestras pre- y post- tratamiento con BEI, indicando que el tratamiento con BEI tenía un impacto mínimo sobre la antigenicidad del producto De manera similar, para los ELISA de captura directa, el producto tratado con BEI fue comparable con la fusión no tratada, y para tres de los cuatro anticuerpos la muestra post-tratamiento con BEI do una lectura de DO levemente superior El análisis de
calidad para el producto envasado en frascos se completo y TMV-FV7 aprobó todos los criterios de liberación (Cuadros 22A y 22B) y por lo tanto pudo llevarse a la siguiente etapa para evaluación en animales
EJEMPL0 17 Estudio de estabilidad para TMV-FV1 , TMV-FV5, TMV-FV6 y TMV-FV7 con almacenamiento a 4°C durante 6 meses
Las cuatro fusiones DJ5 de TMV tratadas con BEI y envasadas en frascos se sometieron a un estudio de estabilidad de 6 meses de duración, para evaluar la integridad de las vacunas candidatas con almacenamiento a
4°C El periodo de tiempo de 6 meses cubrió el marco de tiempo durante el cual se evaluaron las vacunas en los estudios en animales Se tomó un total de seis momentos, a intervalos de aproximadamente un mes y las vacunas en frascos se analizaron por gel para PAGE, Western Blot y espectrometría de masa MALDI-Tof Para el análisis de Western Blot, se empleó el anticuerpo ant?-GDF8 #661 de cabra Los datos del análisis por PAGE y Western Blot para el momento de los 6 meses se resumen en el cuadro 23 y la información de espectrometría de masa por MALDI-Tof para todos los momentos se resumen en el cuadro 24 Específicamente, el cuadro 23, a continuación, provee un resumen de análisis por PAGE y análisis de Western Blot la fusión de
proteínas de envoltura del peptido DJ5 almacenada a 4°C Los datos son para el momento final del estudio de seis meses
CUADRO 23 Resumen de análisis PAGE y de Western Blot
Denominación Detección por Western Blot Descriptor Perfil por PAGE Anti-GDF 8 abreviado TMV-FV1 Escalera oligomepca Si DJ5(20)-U1 -GPAT (7 a 9 bandas) (5 a 6 bandas) TMV-FV5 Escalera oligomepca Si DJ5(20)-U5-GPAT (5 a 6 bandas) (2 bandas) TMV-FV6 Banda mayor a -21 kDa Banda Si DJ5( 12)-U1 -N menor de 40 kDa Banda única -21 kDa TMV-FV7 Si Banda mayor a -23 kDa DJ5( 12)-U1 -GPAT Banda única -23 kDa
Para TMV-FV6, TMV-FV7 y TMV-FV1 , el Perfil por PAGE se mantuvo en el transcurso del estudio de estabilidad de seis meses De manera similar para el perfil de Western Blot, no se observaron desviaciones con relación a las muestras de liberación La diferencia en el número de bandas detectadas por Western Blot, relativa al perfil por PAGE, corresponde a las bandas de peso molecular más alto (más de 200 kDa), que se transfirieron escasamente a la membrana En el caso de TMV-FV5, las especies monoméricas fue un duplete en la muestra liberada como se observa en el Ejemplo 16 En el transcurso del estudio de estabilidad se observó una desviación gradual a las especies de peso molecular mas bajo en el duplete monomepco por análisis por PAGE Sin embargo, ambas especies monoméricas mantuvieron la immunoreactividad por Western Blot durante una
ventana de análisis de seis meses La especie oligomepca de peso molecular más alto de TMV-FV5 también fue evidente por Western Blot Sin embargo, para el momento de los seis meses solo fue visible un dimero putativo de TMV-FV5 por Western Blot, posiblemente debido a la escasa transferencia 4 a 6 bandas se detectaron normalmente El cuadro 24, a continuación, provee Análisis por MALDI del PM para la muestra liberada (R) y para las seis muestras tomadas durante el transcurso del estudio de estabilidad para las vacunas tratadas con BEI y envasadas en frascos Para la muestra liberada, solo se informa el pico mayor
CUADRO 24
Análisis del PM por MALDI
Deno PM PM observado (Da) (Momento #) mina esperad Modifica-ciones cíones R 1 2 3 4 5 6 o(Da) TMV Met escindido 19833 19833 19842 19993 20023 20006 20037 19997 FV1 Ser acetilado TMV 19066 19032 19142 19243 19157 19227
19878 Ninguno 19875 FV5 17723 17719 17830 17717 17718 17719 Met escindido TMV 18797 18795 18792 94 18795
18794 18795 187 Val no 18799 FV6 18841 18838 18836 18838 18837 18838 acetilado TMV Met escindido 18986 18984 18984 18985 18985 18985
18981 18981 FV7 Ser acetilado 19024 19027 19029 19027 19029 19028
El análisis por espectrometría de masa (Cuadro 24, anterior) indico que la especie de longitud completa, con las modificaciones observadas, estaba presente tanto para TMV-FV6 como TMV-FV7 y un pico
mayor adicional, correspondiente a el agregado de un BEI a la proteína de envoltura, también se detectó Estas dos especies se mantuvieron en todo el transcurso del estudio de estabilidad Para TMV-FV1 , el pico principal en la mayor parte de los espectros (momentos 3 a 6) fue aproximadamente 170 Da mayor de lo esperado Esto corresponde al agregado de 4 ó 5 porciones BEI por proteina de envoltura Sin embargo, debe observarse que la calidad de los espectros para las muestras de TMV-FV1 fue escasa En el caso de pLSB-FV5, se detectaron mínimas especies de longitud completa luego del momento uno Las dos especies principales observadas tenían pesos moleculares aproximados de 19130 +/- 100 Da y 17719 Da La muestra liberada para TMV-FV5 contenía una especie de 19038 Da que se identificó positivamente y mostró que poseía la mayor parte del epítope de DJ5 de 20 aminoácidos (Ejemplo 16) La especie de 17719 Da representa una especie solo de 2 a 3 aminoácidos más extensa que TMV U5 (17 489 Da, Met escindido) y por lo tanto no corresponde con una banda menor en el duplete monomérico, lo que sugiere que esta es una especie de 19 130 +/- 100 Da Por Western Blot esta especie de 19 1 kDa mantuvo immunorreactividad En general, los datos indican que TMV-FV1 , TMV-FV6 y TMV-FV7 fueron estables durante por lo menos 6 meses con almacenamiento a 4°C En el caso de TMV-FV5, ocurrió degradación con el almacenamiento a 4°C, para producir una especie principal con un peso molecular apropiado de 19 1 kDa Este producto de truncamiento resultó estable con el
almacenamiento y a partir de los datos de Western Blot fue inmunorreactivo con el anticuerpo #661 de cabra neutralizante de GDF8
EJEMPLO 18 Refinamiento en la región del péptido DJ5 capaz de unirse a un anticuerpo neutralizante de GDF8
Durante el transcurso del análisis de Western Blot, se determinó que el anticuerpo monoclonal de rata neutralizante de GDF8 (MAB788) reacciona fuertemente con proteína de envoltura U1 La respuesta observada resultó comparable con TMV-FV7, cuando esta fusión se analizó en paralelo En contraste, el suero policlonal de #661 de cabra, que también es neutralizante de GDF8, reaccionó solo en forma débil con el control U1 Cuando la proteina de envoltura de cepa U5 se incluyó en el análisis de Western Blot, no se detectó reactividad cruzada con el anticuerpo MAB788 de rata Este resultado impulsó una comparación la reactividad del anticuerpo monoclonal de rata con las U5 proteínas de envoltura U1 y por ELISA indirecto (Cuadro 25) Para este ELISA, el MAB788 de rata se diluyó inicialmente a 1 20, no se detectó reactividad cruzada contra la proteína de envoltura U5, avalando los datos de Western Blot, mientras que se detectó proteína de envoltura U1 con una dilución en el momento final de 1 1620 La respuesta contra el control positivo de la fusión del péptido DJ5 de TMV (TMV-FV7) fue 3 veces superior En el ELISA indirecto, el vipón se adsorbió a la
superficie de la placa de ELISA, se espera que un paso genere cierta interrupción de la estructura del virus Dado que se observó una clara diferencia en la reactividad de MAB788 de rata entre TMV U1 y el TMV-FV7 en formato ELISA, mientras que la reactividad por Western Blot fue comparable, se arribó a la hipótesis que el epitope U1 de TMV putativo detectado por el anticuerpo monoclonal de rata fue interno a la estructura del virus Para evaluar esta hipótesis, se realizó un ELISA emparedado de doble anticuerpo (Cuadro 25), donde tanto TMV U1 o TMV-FV7 se mostraron como vipón intacto, a través de la captura realizada por un anticuerpo policlonal anti-TMV En contraste con el ELISA contra el U1 de TMV adsorbido, hubo reactividad cruzada mínima con el virus del tipo salvaje U1 cuando se presentó como vipón intacto, indicando que la reactividad contra el vipón de TMV-FV7 fue específica para el epítope mostrado derivado de DJ5 Este resultado respaldó al hipótesis de que el epítope U1 putativo no se expuso en la superficie en el vipón intacto El cuadro 25, a continuación, provee resultados de la dilución en el momento final para ELISA indirecta y DAS, para comparar la reactividad de los anticuerpos monoclonales de rata ant?-GDF8 (MAB788) y policlonal #661 de cabra con la proteína de envoltura U1 y la proteina de envoltura U5 de TMV, de la siguiente manera
CUADRO 25 Resultados de dilución del momento final para ELISA indirecto y DAS
ELISA indirecto ELISA DAS (anticuerpo de captura PVAS-135D)
. , . Anticuerpo primario . , Anticuerpo primario Antigeno de Vipon UL recubri miento „__ . . , . . .. , , capturado Cabra pre- #661 de .... . #661 de cabra MAb de rata , v . . MAb de rata desangrada cabra TMV U1 60 1 ,620 TM U1 180 540 180
TMV-FV7 4 860 4 860 TMV FV7 180 14 580 14 580
TMV U5 60 < 20
Para el cuadro 25, TMV-FV7 se incluyó como control positivo Para el ELISA DAS, el virión de TMV U1 o TMV-FV7 se capturó usando el anticuerpo policlonal anti-TMV PVAS 135D Como control negativo, se empleó suero de cabra previo al desangramiento Para todos los ELISA, el antígeno se empleo a 5 pg/ml Los anticuerpos de rata y cabra se diluyeron inicialmente a 1 20 y se realizo una dilución serial en tres veces para cada uno, por duplicado La dilución del momento final se tomó como la dilución más alta a la cual la lectura de DO fue dos veces la del fondo Debido a la diferencia absoluta en la ractividad de MAB788 de rata contra las proteina de envolturas U1 y U5 de TMV, se realizó una alineación de las dos secuencias de la proteina de envoltura con el péptido DJ5 N-terminal de 12 aminoácidos (FIG 6B) Esta alineación mostró que el peptido DJ5 y la protema de envoltura U 1 comparten una secuencia común de cuatro aminoácidos, QANP (SEC ID NO 58), que se interrumpe en el caso de la proteina de envoltura U5 por la presencia de una prolina A partir de la
estructura de difracción del virus por rayos X, QANP (residuo 329 hasta el residuo 332 del precursor de GDF8 humano natural), se ubica en la superficie interior del vipón (FIG 6C), en concordancia con los datos discutidos de la Western Blot y ELISA En general, estos datos proveen una explicación para la reactividad cruzada observada de MAB788 de rata con la proteina de envoltura U 1 , y ayuda en el delineamiento de la secuencia de aminoácidos esencial y necesaria dentro del peptido DJ5, para el cual pueden generarse anticuerpos neutralizantes Es interesante notar que los anticuerpos policlonales #661 de cabra muestran una mínima reactividad hacia la proteína de envoltura U1 tanto en formato de Western Blot como ELISA indirecto Similar al monoclonal de rata, este anticuerpo es capaz de neutralizar GDF8 en un ensayo de activación de transcripción in vitro (Ejemplo 3) Dado que el suero de #661 de cabra reacciona fuertemente con TMV-FV7, esto puede indicar que hay otras regiones dentro del péptido DJ5 N-terminal de 12 aminoácidos que son capaces de generar anticuerpos neutralizantes de GDF8
EJEMPLO 19 Superioridad de la visualización del péptido DJ5 en el contexto de una fusión molecular a TMV comparado con la fusión química para la hemocianina de lapa californiana (KLH)
Durante los estudios de investigación iniciales, que identificaron el péptido DJ5, los anticuerpos monoclonales de rata neutralizantes de GDF8 (MAB788, R&D Systems) y #661 de cabra se compararon con dos sueros híper inmunos derivados de conejo (Cuadro 26) Los anticuerpos de conejo se generaron contra los conjugados de KLH tanto del péptido SP2 o péptido DJ5 La FIG 7 indica que el peptido SP2 contiene los residuos QANP (SEC ID NO 58) en este C-término La reactividad cruzada de MAB788 de rata la proteína de envoltura U1 (Ejemplo 18) brindó fuerte evidencia de la importancia de los residuos QANP (SEC ID NO 58) en la generación de una respuesta neutralizante Sin embargo, ninguno de los sueros de conejo fueron capaces de neutralizar GDF8, aunque no reconocieron sus inmunógenos peptídicos respectivos en formato ELISA También es de interés la respuesta relativa del #661 de cabra y MAB788 de rata hacia los péptidos en formato ELISA Ningún anticuerpo detectó el péptido DJ4, en el cual el residuo de prolina de QANP (SEC ID NO 58) estaba ausente (FIG 7), mientras que resultaban débilmente reactivos hacia SP2 y reactivos hacia el epítope DJ5 En contraste, el suero de #92 de conejo (antígeno del péptido SP2), fue reactivo a DJ4 y no reactivo a DJ5 Esto sugiere que el contexto en el cual esta región de GDF8 se
visualiza puede ser importante para la generación de una respuesta neutralizante El cuadro 26, a continuación, provee un resumen de la reactividad relativa por ELISA y neutralización de GDF8 para una selección de anticuerpos comerciales y generados en laboratorio
CUADRO 26 Resumen de la reactividad relativa por ELISA y neutralización de GDF8
Anticuerpo Antigeno* reactividad por ELISA Neutrali ización de GDF8 DJ5 SP2 DJ4 #661 de cabra CHO-proGDF8 (++) (+) (-) (+) MAB788 de rata NOS-proGDF8 (++) (+) (-) (+) #92 de conejo Péptido SP2** (-) (+ +) ( + + ) (-) #1286 de conejo Péptido DJ5** (++) ND ( + ) (-) *reg?ón madura de GDF8 = secuencia de aminoácidos humano/cerdo/pollo/rata proGDF8 = secuencia de aminoácidos de la Prohormona de GDF8 humana "péptidos acoplados a KLH
Para investigar en forma adicional las diferencias en los anticuerpos #661 de cabra, MAB788 de rata y #1286 de conejo, una sene de ELISA se realizaron contra los siguientes objetivos. > El péptido DJ5 (20) conjugado a BSA (BSA-DJ5 (20), ver FIG. 7). > El péptido DJ5 (12) péptido conjugado a BSA (BSA-DJ5 (12), ver FIG. 7). > El péptido DJ5 (8) péptido conjugado a BSA (BSA-DJ5(8), ver FIG 7).
> BSA solo.
> TMV-FV7, que muestra DJ5(12) como fusión de GPAT a la proteina de
envoltura U1 Los vipones se presentaron como varillas intactas en un formato
emparedado de doble anticuerpo, empleando el pohclonal U1 de conejo anti- TMV PVAS 135D
proGDF8FLAG, una célula de mamífero producida y GDF8 purificada
por afinidad
El cuadro 27, a continuación, provee un resumen de las
envolturas de ELISA y los pmoles estimados de péptido DJ5 presente por
receptáculo
CUADRO 27
Resumen de los envolturas de ELISA
Concentra-cion . . . PM del PM (Da) del , . . .
_. „ . . , Volumen n . . , _, \ ' pmoles peptido
Envoltura de placa de protema . ., Peptido Portador o r n ?£ c (µg/ml) m (Da) Fusión o GDF8 DJ5 (20) BSA 50 2040 67,000 131 DJ5 (12) BSA : 50 1 190 67,000 131 DJ5 (8) BSA 50 850 67,000 131 BSA 50 67,000 PVAS 135D -FV7 50 18,981 13 50,000 (80%) proGDF8FLAG 50 8 (20 e) 12,500 (20%)
sólo 30-35 de estos normalmente están disponibles para derivatización). Para
las reacciones de conjugación de glutaraldehido, el péptido estaba presente
en un exceso molar del doble y se supuso que se cargaron todas las usinas
libres, es decir 35 péptidos visualizados por molécula de BSA
(b) Para el proGDFdFLAG derivado de CHO (Prohormona de GDF8 con etiqueta FLAG), el material purificado fue una mezcla homogénea del po peptido de 50 kDa y el GDF8 totalmente procesado de 12 5 kDa en una relación de 60 20 (c) Al calcular los pmoles del antigeno objetivo adsorbido por receptáculo, se supuso que toda la protema presente en la solución de envoltura se unió a la placa Para todos los antígenos, 250 ng estaban presentes en la solución de envoltura y las placas Nunc MaxiSorp empleadas tienen una capacidad de adsorción de 500-600 ng IgG/cm2, y 0 6 cm2 de área superficial en contacto con la solución de envoltura (d) Supone que todo el TMV-FV7 agregado al receptáculo se capturó por el anticuerpo de envoltura PVAS 135D (e) Los pmoles máximos teóricos de GDF8 recubierfo por receptáculo, fueron el 100% de la Prohormona de GDF8 procesada para la especie de 12 5 kDa El cuadro 28, a continuación, provee una comparación de la dilución en el momento final de ELISA de los anticuerpos #661 de cabra, #1286 de conejo y MAB788 de rata, en lo que respecta a su reactividad hacia una serie de conjugados peptido-BSA derivados de DJ5, la Prohormona de GDFd (proGDFdFLAG) y TMV-FV7 (visualizados en un formato emparedado de doble anticuerpo)
CUADRO 28 Comparaciones de dilución del momento final por ELISA
Debe observarse que no se encontró presencia de emparedado de doble anticuerpo fr TMV U1 / PVAS 135D como control negativo, sin embargo, el cuadro 25, referencia anterior, muestra que cuando se presenta como vipón, hay una mínima reactividad contra la proteína de envoltura U1 tanto por los anticuerpos MAB788 de rata o #661 de cabra Para los datos del cuadro 28, Los anticuerpos #661 de cabra y monoclonal de rata MAB788 se diluyeron micialmente a 1 10 y se realizo una dilución seria a la tercera parte para cada uno por duplicado Para el monoclonal de rata purificada, una dilución a 1 10 correspondía a una concentración de anticuerpo de 50 µg/ml En el caso del anticuerpo #1286 de conejo, la dilución inicial fue de 1 1000 La dilución final se tomó como la dilución máxima a la cual la lectura de DO fue dos veces la del fondo ND, not determinado como po clonal de conejo, se empleó para la captura de vipones
Para el anticuerpo monoclonal de rata, se observo una débil reactividad hacia el conjugado completo del péptido DJ5 a BSA, DJ5(20), sin embargo, ninguno de los peptidos mas cortos derivados de DJ5 se detectaron En contraste, para la Prohormona de GDFd, que mostró aproximadamente niveles 10 veces menores de peptido DJ5 por receptáculo (relativo a DJ5(20) BSA), la dilución final fue 2 log-?0 más alta Además, hubo una fuerte reactividad hacia TMV-FV7, con una dilución final solo 3 veces mas baja que para la la Prohormona de GDFd Para TMV-FV7, se determinó que 13 pmoles era un contenido máximo de DJ5 por receptáculo, aproximadamente dos veces el valor de GDFd, sin embargo, esto supone el 100% de captura del vipón por el anticuerpo de envoltura La diferencia absoluta en la reactividad del MAB7dd de rata reactividad hacia TMV-FV7 versus el conjugado DJ5(12) BSA es de particular interés, porque el mismo péptido se visualizó en ambos casos Para DJ5(12), la conjugación de glutaraldehido a BSA es a través del grupo amino primario del N-término del péptido Esto puede perjudicar estépcamente la accesibilidad a los residuos QANP (SEC ID NO 58) del péptido (FIG 7) Esto se respalda con el hecho de que el péptido DJ5(20) se detecta, aunque débilmente Para DJ5(20), una sina (K) está presente en la región C-terminal del péptido y es un sitio de conjugación alternativa que podría producir una visua zación mejorada de la región N-terminal del péptido Una explicación alternativa es que la presentación de los residuos QANP (SEC ID NO 58) en el contexto de una fusión molecular a la proteína de envoltura TMV permite
que el epitope se adapte a una conformación más "nativa" La ultima hipótesis se respalda por la neutralización de los datos de GDF8 presentados en el cuadro 26, referencia anterior El cuadro 26 indica que los péptidos SP2 y DJ5, conjugado a KLH, no genero anticuerpos neutralizantes de GDFd, aunque para ambos las regiones de QANP (SEC ID NO 5d) debieran haberse visualizado adecuadamente, debido a su ubicación relativao al N-término del péptido y/o a las lismas reactivas (FIG 7) Sin embargo, cuando el péptido DJ5 se visualizo en el contexto de TMV se observo una fuerte respuesta inmune tanto en cabra como en cerdos (ver Ejemplos 20 y 21 ) y el suero fue neutralizante de GDFd, basado en un ensayo de transcripción in vitro Para el anticuerpo #661 de cabra, el perfil de respuesta general contra los diferentes antígenos objetivo fue cualitativamente similar al monoclonal MAB7dd de rata Sin embargo, la diferencia en respuesta entre el conjugado DJ5(20)-BSA y la Prohormona de GDFd fue 1 log10 más bajo que para el monoclonal de rata, debido a la dilución final 10 veces superior contra DJ5(20)-BSA Ademas, los anticuerpos #661 de cabra fueron débilmente reactivos con los conjugados de BSA de los péptidos DJ5(12) y DJ5(8), aunque la dilución final contra TMV-FV7 aún era 2 logio más alta que para DJ5(12)-BSA Para el pliclonal #1286 de conejo, generado contra un conjugado DJ5(20)-KLH, la dilución final fue la más grande para el conjugado DJ5(20)-BSA, mientras que la respuesta a la Prohormona de GDFd, DJ5( 12)-BSA y DJ5(d)-BSA fueron similares En el caso de #12d6 de conejo, no hay
datos de la dilución final disponibles para TMV 2264 como objetivo, ya que el anticuerpo de captura empleado en el emparedado era derivado de conejo Los resultados con el anticuerpo #661 de cabra neutralizante de GDFd avalan además la hipótesis de que la visua zación de los péptidos de la región DJ5 en el contexto de una fusión molecular permite que el péptido adopte una conformación apropiada para la generación de anticuerpos neutralizantes A partir de los datos de #12d6 de conejo, resulta claro que el conjugado del péptido KLH era un potente inmunógeno, sin embargo, la incapacidad de este policlonal de neutralizar GDFd sugiere que el péptido no adoptó la conformación apropiada cuando estaba presente en el contexto de un conjugado de glutaraldehído
EJEMPLO 20 Análisis serológico de sangrado de cabras luego de la inmunización con TMV 2665, TMV-FV5, TMV-FV6. TMV-FV7 o la proteína pro GDF8
Para medir la mmunogenicídad de los vectores de fusión de TMV antes mencionados, se realizaron dos estudios adicionales con cabras Cada estudio fue idéntico excepto por la ubicación uno se realizó bajo nuestra dirección por ProScí, Inc (Estudio en cabras #1 ) y el otro se realizó en el laboratorio y fue ciego (Estudio en cabras #2) Se usaron lecheras adultas para cada estudio Cada estudio se realizó de la siguiente manera
Se vacunaron cabras con 2 ml de vacuna como se muestra en el cuadro 29, a continuación La primera vacuna (día 0), contenía Adyuvante Completo de Freund, mientras que las dosis de vacuna posteriores contenían Adyuvante Incompleto de Freund La primera vacunación se administro por vía subcutánea (SQ) en el lado derecho del cuello Las vacunaciones posteriores se alternaron entre los lados derecho e izquierdo del cuello Se recolectaron muestras de sangre de los animales por venipuncion de las venas yugulares usando tubos de recolección de sangre evacuados de SST los días 0 2d, 49, 63, 77 y 91 Se dejó coagular la sangre durante un mínimo de dos horas a temperatura ambiente, se centrifugó y se recolectó el suero Se etiquetaron las muestras de suero con el número de animal, el tipo de espécimen, la fecha de recolección y el número de estudio Se almacenó el suero a -10(C, o menos, hasta que se evaluó
CUADRO 29 Configuración experimental para el estudio en cabras #1 y estudio en cabras #2
Grupo No. de Identificación Dosi Adyuvan- Vía de Ubicación Dias de Animadel Producto s te Admide Da tratamienles Experimental (µg) nistrainyección to ción proGDFß P2 250 Freund SQ Cuello 0, 21 , 42, Cterm (alternando) TMV-FV1 250 Freund SQ Cuello 0, 21 , 42, (alternando) 70
3 2 TMV-FV5 250 Freund SQ Cuello 0, 21 , 42, (alternando) 70
4 2 TMV-FV6 250 Freund SQ Cuello 0, 21 , 42, (alternando) 70
5 2 TMV-FV7 250 Freund SQ Cuello 0, 21 , 42, (alternando) 70
Las vacunas evaluadas, junto con sus formas físicas fueron: > GDFd P2-Cterm (P2) - proteína globular soluble > TMV-FV1 - sin precipitado soluble > TMV-FV5 - mezcla de viriones solubles y precipitados TMV-FV6 - bastones de viríones agregados > TMV-FV7 - bastones de viriones solubles Para el Estudio en cabras #1 , se desangraron los animales antes de la primera vacunación ("pre-desangrado") y los sueros obtenidos una semana después de la tercera vacunación ("desangrado 1 "), y dos semanas después de la tercera vacunación ("desangrado 2") se analizaron por ELISA.
Para los ELISA, se emplearon los siguientes objetivos.
> Virus mosaico del tabaco (tipo U1 o U5, correspondientes un armazón proteínico de la vacuna de TMV) recubierto directamente > Virus mosaico del tabaco (tipo U1 o U5, correspondientes un armazón proteínico de la vacuna de TMV) visualizado como varillas intactas en un formato emparedado de doble anticuerpo (DAS), empleando U 1 anti-TMV de conejo pohclonal PVAS 135D > El péptido DJ5(20) conjugado a BSA (ver FIG 7) > El péptido DJ5(12) conjugado a BSA (ver FIG 7) > El péptido DJ5(d) conjugado a BSA (ver FIG 7) > CHO que expresa y purifica Prohormona de GDFd con etiqueta FLAG Para los ELISA indirectos de TMV, 50 pl de TMV U1 o TMV U5, diluidos hasta 5 pg/ml en regulador de pH de carbonato/bicarbonato (pH 9 6) se usó para recubrir placas de microtitulación de 96 pocilios (MaxiSorp, Nunc) hasta la mañana siguiente o durante el fin de semana a 4oC La solución de envoltura se eliminó y las placas se bloquearon con Tris 100 mM (pH 7 5), que contiene 0 5% v/v TWEENTM 20, y 2% p/v BSA durante 2 horas a temperatura ambiente (200 µl solución de bloqueo por receptáculo) Los pocilios se lavaron dos veces con 1X regulador de pH de TBST (Solución salina con regulador de pH de Tris con TWEENTM 20) y 50 µl de suero de cabra, diluido en en 1X PBS con 2% p/v BSA se agregó por receptáculo Se empleó una dilución serial al tercio para cada suero comenzando a una dilución inicial de 1 50 El suero GDFd P2-Cterm se empleó como control negativo en todas las placas
Luego de una hora de incubación a temperatura ambiente con los sueros las placas se lavaron con 0 9% p/v cloruro de sodio, 2% v/v Tritón® X-100, usando un lavador de placas de microtitulación (Skatron Instruments) Se agregó 50 µl de anticuerpo secundario conjugado de conejo anti-cabra HRP (Pierce) a una dilución de 1 10 000 en 1 X PBS que contiene 2% p/v de BSA Las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente, se lavaron con el lavador de placas, y se agregó 50 µl de la solución sustrato de 3,3', 5,5'-tetramet?l bencidina por receptáculo Se dejó proceder la reacción catalizada por HRP durante 5 a 20 minutos y se detuvo a través del agregado de 50 µl de ácido sulfúrico 1 N La absorbancia de la placa (DO) se leyó a 450 nm en un espectrofotómetro de placa de 96 pocilios (Molecular Devices) Para el ELISA emparedado de doble anticuerpo (DAS), 50 µl de anticuerpo policlonal anti-TMV PVAS-135D, diluido a 1 4000 en regulador de pH de carbonato/bicarbonato (pH 9 6) se usó para recubrir placas de microtitulacion de 96 pocilios (MaxiSorp, Nunc) hasta la mañana siguiente o durante el fin de semana a 4oC La solución de envoltura se eliminó y los pocilios se bloquearon con 200 µl de Tris 100 mM (pH 7 5), que contiene 0 5% v/v de TWEENTM 20, 2% p/v de BSA durante hora a temperatura ambiente Luego del paso de bloqueo, los pocilios se lavaron dos veces con 1X regulador de pH de TBST y se agregó 50 µl de cualquiera de TMV U1 o TMV U5, diluidos a 5 µg/ml en 1X PBS que contiene 2% p/v BSA, por receptáculo Las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente, luego se
lavaron con 0 9% p/v de cloruro de sodio, 2% v/v de Tritón® X- 100 usando un lavador de placas de microtitulación (Skatron Instruments) El agregado y la dilución del suero de cabra, el agregado del anticuerpo secundario y el desarrollo de la placa de ELISA se realizaron de acuerdo con el protocolo definido para los ELISA indirectos de TMV Para determinar la reactividad del Estudio en cabras #1 del suero a Prohormona de GDFd derivada de CHO, se realizó un ELISA por envoltura directo de las placas con la Prohormona de GDFd El GDFd se diluyó hasta 5 µg/ml en regulador de pH de carbonato/bicarbonato (pH 9 6) y se empleó 50 µl por receptáculo para recubrir placas de microtitulación de 96 pocilios (MaxiSorp, Nunc) hasta la mañana siguiente a 4oC Todos los pasos posteriores en el protocolo de ELISA fueron como se los definió para los ELISA indirectos de TMV Para los ELISA contra los péptidos DJ5 (FIG 7), los tres péptidos, DJ5(20), DJ5(12) y DJ5(d) se conjugaron al BSA portador En síntesis, los péptidos se resuspendieron en 50% DMSO a 1 mg/ml y se combinaron con BSA y glutaraldehído para dar concentraciones finales de 1 mg/ml de BSA y 1 % glutaraldehído para todas las reacciones de conjugación Las concentraciones finales de los péptidos en las diferentes reacciones fueron DJ5(8), 1 mg/ml, DJ5(12), 1 4 mg/ml, y DJ5(20), 2 6 mg/ml Las reacciones se rotaron a 4oC hasta la mañana siguiente y posteriormente se diahzaron contra 1X PBS para eliminar cualquier péptido sin reaccionar La conjugación se confirmó por análisis por PAGE en un gel de 10-20% Tris-
Glicina gel Las placas de microtitulación (96 receptáculos) se recubrieron hasta la mañana siguiente a 4oC con cada uno de los tres conjugados con péptido DJ5-BSA, diluidos hasta 5 µg/ml en regulador de pH de carbonato/bicarbonato (pH 9 6) Luego del envoltura de la placa de microtitulación, los ELISA se realizaron siguiendo los procedimientos definidos para los ELISA indirectos de TMV Los datos de la respuesta anti-TMV para el Estudio en cabras #1 se resumen en formato de tabla en el cuadro 30 Como se espera no se observó respuesta a TMV se observó en el animal vacunado P2 Para las vacunas de fusión de péptido TMV, se observó un aumento de 2 a 3 Iog10 en la dilución final del suero anti-TMV para la mayor parte de las vacunas tanto en formato de ELISA indirecto y ELISA DAS En el caso del animal vacunado con TMV-FV5, la respuesta DAS fue notablemente más baja Esto refleja simplemente una captura deficiente del virus TMV U5 por el anticuerpo PVAS 135D, un anticuerpo policlonal generado contra TMV U1 Luego de la tercera vacunación, la respuesta anti-TMV resultó la más elevada en el animal vacunado con TMV-FV6 con la respuesta más baja en el animal vacunado con TMV-FV1 Esta diferencia puede atribuirse a las diferentes formas de vacuna TMV-FV6 existe como vipón intacto parcialmente soluble que se agrega en solución, mientras que TMV-FV1 es un precipitado no soluble en el cual la estructura con aspecto de varilla de TMV probablemente esté comprometida El cuadro 30, a continuación, provee un resumen de los datos de la dilución
final para los ELISA indirectos y emparedado de doble anticuerpo (DAS) anti- TMV, evaluando el suero del estudio en cabras #1
CUADRO 30
Datos de dilución final del Estudio en cabras #1 ELISA Emparedadlo de
doble anticuerpo (DAS) e indirecto Anti-TMV
ELISA indirecto ELISA DAS Pre- Pre- Antígeno Desan- Desan, Desan- Desan- Vacuna desangra desangra , . . _ ( de captura grado 1 grado 2 . 3 grado 1 grado 2 do U1 control TMV U1 150 50 50 450 150 150
U5 control TMV U5 50 (-) 150 450 150 150 P2 TMV U1 50 50 50 150 1350 150
TMV-FV1 TMV U1 50 12,150 4,050 150 12,150 36,450
TMV-FV5 TMV U5 (-) 36,450 12,150 450 4,050 4,050
TMV-FV6 TMV U1 50 109,350 36,450 150 109,350 109,350
TMV-FV7 TMV U1 50 36,450 36,450 150 36,450 36,450
Para los datos presentados por el cuadro 30, Desangrado 1 y
Desangrado 2 se tomaron 7 y 14 dias luego de la tercera vacunación
respectivamente Los sueros se diluyeron inicialmente a 1 50 y se realizó una
dilución serial al tercio para cada desangrado por duplicado La dilución final
se tomo como la dilución más alta a la cual la lectura de DO fue dos veces
superior a la del fondo (-), indica que la lectura de DO fue menor a dos veces
el fondo El U1 control y U5 control representan pocilios que contienen TMV
U1 o TMV U5 respectivamente, que se sondearon con suero P2
predesangrado y estuvieron presentes en todas las placas para justificar cualquier variabilidad entre placas en el fondo Los resultados para los ELISA específicos del péptido para los sueros del Estudio en cabras #1 , empleando el epitope de DJ5 de 20 aminoácidos, junto con peptidos de los aminoácidos 12 N-terminales y 8 C-termmales, se resumen en el cuadro 31 Para el ELISA del péptido DJ5 de 20 aminoácidos, la respuesta inmune generada por las vacunas de la fusión de péptidos de TMV se compararon muy estrechamente con la respuesta observada a anti-TMV U1 , donde la vacuna de TMV-FV6 produjo un aumento 2 5 logio en la dilución sérica final comparado con el aumento 1 log10 con la vacuna de TMV-FV1 La respuesta generada por inmunización con la proteína GDF8 fue comparable con la de la vacuna de TMV-FV1 Cuando la región N-terminal de 12 aminoácidos de DJ5 se empleó como antígeno de captura, el perfil de respuesta en este suero fue comparable al obtenido con el péptido DJ5 completo (DJ5(20)), aunque las diluciones finales fueron aproximadamente 1 log10 más bajas En contraste, la respuesta a la región de 8 aminoácidos C-terminal de DJ5 fue mínima para todas las vacunas Estos datos respaldan la hipótesis de que el epítope neutralizante putativo de DJ5 está ubicado en la región N-terminal del péptido La diferencia 1 log10 en las diluciones finales contra los conjugados DJ5(20) versus DJ5(12)-BSA pueden atribuirse a la accesibilidad del epítope, como se discute en el Ejemplo 19 El cuadro 31 , a continuación provee un resumen de los datos de la dilución final
para los ELISA indirectos ant?-DJ5, que evalúan el suero del Estudio en cabras #1
CUADRO 31 Datos de dilución final de los ELISA Anti-GDF8 del estudio en cabras #1
Pre- Desangrado 1 Desangrado 2 desangrado P2 150 36,450 36,450 TMV-FV1 150 4,050 1 ,350 TMV-FV5 150 12,150 1 ,350 TMV-FV6 150 36,450 36,450 TMV-FV7 150 12,150 4,050
Para los datos presentados por el Cuadro 31 , las secuencias de aminoácidos para los péptidos conjugados a BSA (DJ5(20), DJ5(12) y DJ5(8)) se ilustran en la figura 7 Las condiciones de envoltura de receptáculos para los tres conjugados de péptidos BSA fueron como se describe en el Cuadro 27, referencia anterior Desangrado 1 y Desangrado 2 se tomaron 7 y 14 días después de la tercera vacunación, respectivamente Los sueros se diluyeron inicialmente a 1 50 y se realizó una dilución serial al tercio para cada desangrado por duplicado La dilución final se tomó como la dilución más alta a la cual la lectura de DO fue dos veces la del fondo El P2 control pre-desangrado estuvo presente en todas las placas para justificar cualquier variabilidad entre las placas en el fondo Los ELISA que emplean Prohormona de GDFd como antígeno de captura también se realizaron para evaluar la capacidad de las vacunas de
fusión del péptido DJ5 de TMV de generar anticuerpos capaces de reconocer la región DJ5 en su contexto nativo El Cuadro 32 resume los resultados Todas las vacunas de fusión del peptido DJ5 de TMV generaron anticuerpos que reconocieron GDFd, con un aumento de 1 5 a 2 log10 en la dilución final observada una semana después de la tercera vacuna (desangrado 1 ), relativo al predesangrado Los títulos observados cayeron para todas las vacunas de TMV por el desangrado 2, con excepción de TMV-FV6, donde los títulos se mantuvieron La vacuna FV6 también generó el título de dilución final más alto, enfrentado a los ELISA anti-TMV y anti-péptido, y produciendo una respuesta comparable al observado en el animal vacunado con P2 Una gran proporción de Prohormona de proteína GDFd con marca FLAG empleada para recubrir las placas de ELISA poseen la región del pohpéptido GDF8, que normalmente se escinde por una actividad de proteasa fupna in vivo Aunque el GDFd es una especie pan altamente conservada la región del polipéptido muestra más heterogeneidad de aminoácidos Por lo tanto una extensa porción del C-término GDFd P2 (secuencia humana), empleada como antígeno de control positivo en estos estudios, se verá probablemente como no individual por el sistema inmune de las cabras inmunizadas La extensión hasta la cual esto influirá en las diluciones finales séricas observadas por ELISA se desconoce, pero este hecho debe considerarse en la evaluación y comparación de las respuestas entre los diferentes grupos de vacunas El Cuadro 32, a continuación, provee un resumen de los datos de la dilución final para los ELISA anti-GDFd, que evalúan los sueros del estudio en cabras #1
CUADRO 32 Datos de dilución final Del estudio en cabras #2 ELISA Anti-TMV y Anti-DJ5
TMV-FV5 #10506 36,450 36,450 1 ,350 TMV-FV6 #10506 36,450 109,350 1 ,350 TMV-FV7 #10507 109,350 109,350 109,350
Para el Cuadro 32, las condiciones de envoltura de pocilios para el GDFd fueron como se describe en el Cuadro 27, referencia anterior Desangrado 1 y Desangrado 2 se tomaron 7 y 14 dias después de la tercera vacunación respectivamente Los sueros se diluyeron inícialmente a 1.50 y se realizó una dilución serial al tercio para cada desangrado por duplicado. La dilución final se tomó como la dilución más alta a la cual la lectura de DO fue dos veces la del fondo Para el Estudio en cabras #2, los desangrados 7 dias después de la tercera vacunación se evaluaron en formato ELISA contra los siguientes objetivos Virus mosaico del tabaco (tipo U1 solamente) recubierto directamente > El péptido DJ5(20) conjugado a BSA (ver figura 7) > El péptido DJ5(12) conjugado a BSA (ver figura 7)
El péptido DJ5(d) se omitió, en base a la escasa respuesta a esta región observada para el Estudio en cabras #1 Para este estudio, no se encuentran disponibles muestras pre-desangrado, por lo tanto, el P2-predesangrado del estudio en cabras #1 se empleó como control negativo en cada placa Los resultados se resumen en el Cuadro 33 Para el peptido DJ5 completo (DJ5(20)) conjugado a BSA, se obtuvieron las diluciones finales más altas con las vacunas solubles TMV-FV6 y TMV-FV7, mientras que la respuesta a la vacuna no soluble TMV-FV1 fue 1 logio más baja Junto con el primer estudio estos datos sugieren que las formas de vacuna más solubles son capaces de generar una respuesta más potente específica de DJ5 Para el primer estudio hubo una buena correlación entre las diluciones finales obtenidas cuando tanto TMV U1 o el péptido DJ5 era el antigeno objetivo de ELISA Sin embargo, en el presente estudio la vacuna de TMV-FV1 generó una de las respuestas anti-TMV mas altas, comparables con la vacuna TMV-FV7, mientras que las diluciones finales para las otras dos vacunas, TMV-FV6 y TMV-FV5, fueron solo tres veces más bajas Esto indica que la relación entre forma de vacuna, es decir, soluble vs precipitada, y la respuesta inmune observada no puede ser tan clara en el caso del armazón proteínico de TMV Como en el primer estudio, la respuesta al conjugado DJ5(12) BSA fue 1 a 2 log10 más baja que para el péptido de 20 aminoácidos DJ5, con la excepción de -FV7 donde la dilución final obtenida fue comparable El Cuadro 33, a continuación, provee un resumen de los resultados revelados para el estudio en cabras #2, comarando las diluciones finales del suero por ELISA anti-TMV
U1 y en ELISA contra conjugados BSA en el peptido DJ5 de longitud completa
(20 aminoácidos, DJ5(20)) y el N-terminal de 12 aminoácidos (DJ5( 12))
CUADRO 33
Datos de dilución final del estudio en cabras #2
ELISA Anti-TMV y Anti-DJS
P2 #10509 50 450 (-) TMV-FV1 #10505 109 530 12 150 150 TMV-FV5 #10506 36 450 36 450 1 350 TMV-FV6 #1050d 36 450 109 350 1 350 TMV-FV7 #10507 109 350 109 350 109 350
Para el Cuadro 33, las condiciones de envoltura de pocilios para
los vanos objetivos fueron como se describe en el Cuadro 27, referencia
anterior Se tomaron muestras de suero 7 días después de la tercera
vacunación Los sueros se diluyeron micialmente a 1/50 y se realizó una
dilución serial al tercio para cada desangrado por duplicado La dilución final
se tomó como la dilución más alta a la cual la lectura de DO fue dos veces la
del fondo (-), indica que la lectura de DO fue menor a dos veces el fondo
Empleando los sueros obtenidos del Estudio en cabras #1 y
Estudio en cabras #2, se realizaron Western blots como se describe en
Harlow y Lañe, Anticuerpos A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory (19dd) Se realizo PAGE reductor y no reductor del mismo modo excepto que se uso el regulador de pH la muestra de reducción que contiene 5% beta-mercaptoetanol Un resumen de los datos de Western blot se provee en el Cuadro 34 Los diferentes antisueros de cabra del estudio en cabras #1 y
Estudio en cabras #2 también se caracterizaron por un ensayo de activación de la transcripción in vitro, de la siguiente manera El ensayo de activación de transcripción in vitro usado para medir cuantitativamente la bio-neutralización de GDFd es esencialmente el de Thies et al (Growth Factors 18, 251 (2001 )) Se sembraron placas para ensayo de luminómetro tratadas con cultivo de tejidos de noventa y seis pocilios ViewPlate™ (PerkinElmer Life and Analytical
Sciences, Inc , Boston, MA) con 1 0 x 10^ células/receptáculo de células A204 de Rhabdomyosarcoma (ATCC HTB-d2) y se incubaron en una cámara humidificada a 37°C de 5% CO2 El medio de cultivo completo A204 esta formado por medio de McCoy 5A, 10% suero de feto de bovino, 2% L-glutamina, y 1 % Penn/Strep Luego de alcanzar más del 80% de confluencia, las células se transfirieron transitoriamente con una mezcla del plásmido pDPC4-luc?ferasa y HCMV lE-lacZ usando el protocolo recomendado por el fabricante del reactivo de transfeccion FUGENE (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) y se incubaron 16 horas en una cámara humidificada a 37°C de 5% CO2 La pDPC4-luc?ferasa del plásmido contiene cuatro copias del casillero CAGA, derivadas del inhibidor de activador de
plasminógeno humano (PAI-1 ), que confiere sensibilidad de GDFd a la construcción indicadora del promotor heterólogo El plásmido HCMV lE-lacZ contiene un gen de beta-galactosidasa bajo el control del promotor de inicio inmediato de citomegalovirus humano Este gen se agrega como control para normalizar eficiencias de transfeccion Luego se trataron las células con 100 ng/receptáculo de proteína GDFd (R&D Systems Inc , Minneapolis, MN) y se incubaron durante un adicional de 16 horas en una cámara humidificada a 37°C de 5% CO2 Se cuantificaron la luciferasa y be a-galactosidasa en las células tratadas usando el ensayo Dual-Light Luciferase Assay (Tropix, Applied Biosystems, Foster City, CA) Cada muestra se corrió por duplicado (2 pocilios) Se calculó la señal para cada pocilio como la señal de luciferasa dividido por la señal de oe/a-glactosidasa por 100 La muestra señal se calculó como el promedio de los dos pocilios Para evaluar la bioactividad de neutralización de muesetras de suero de cabra, la IgG de 200 µl de suero se incubó con la proteína GDF8
(aproximadamente 16 horas a 4°C) antes del tratamiento de las células El porcentaje de inhibición como 100 - (100 X muestra señal) / (señal con GDFd alone - señal sin agregado de GDFd Los resultados del ensayo de activación de la transcripción in vitro se resumen en el Cuadro 34, a continuación Los datos para cada denominación de vacunasor es un acumulativo para los resultados obtenidos
para el Estudio en cabras #1 y Estudio en cabras #2 Los datos de GDF-d
maduro se refieren a las Western blots donde el GDF-d maduro de 12 5 kDa
se empleó como el antígeno objetivo
CUADRO 34
Datos de Western blot y neutralización in vitro de GDF8 para sueros del
estudio en cabras #1 y estudio en cabras #2
DenominaAntigeno/AntiGDFß GDFd Ensayo de ción de la cuerpo Maduro, Maduro, no neutral?zación Vacuna reducido reducido ProGDF8P2 GDF8 P2-Cterm + - - TMV-FV1 DJ5(20)-TMV U1 - + - -/+ GPAT
TMV-FV5 DJ5(20)-TMV U5- +++ ++ + TPAT
TMV-FV6 DJ5(12)-TMV U1-N +++ - + term TMV-FV7 DJ5(12)-TMV U1- +++ - + GPAT Pro-CHO- #661 de cabra +++ +++ +++ GDFdflag Wyeth A16 +++ +++ +++ R&D MAB788 de rata +++ +++ +++ Systems
Consistente con los datos de ELISA, todos los antigenos
generaron respuestas inmunes específicas de GDFd in las cabras tratadas
cuando se evaluaban por métodos estándar de Western blot Cuando se
evaluaban para bio-netra zación, se encontró que parte de los sueros de
cabras inmunizadas se neutralizaba (TMV-FV5.-FV6 y -FV7) pero que los
antígenos TMV-FV1 y ProGDF8P2 no generaban anticuerpos neutralizantes según lo detectado en el ensayo En un examen adicional de especificidad del anticuerpo, se determinó que el antigeno TMV-FV5 (DJ5(20)-TMVU5-TPAT) era capaz de generar un anticuerpo capaz de reconocer GDFd no desnaturalizado en un formato de Western blot no desnatura zador Con fines comparativos, todos confirmaron anticuerpos neutralizantes - uno con actividad biológica informada in-vivo (A16), también reacciona con la forma no desnaturalizada de GDFd La forma no desnaturalizada del antígeno GDFd en este ensayo se reconoce por la comunidad científica como lo más parecido al GDFd
"nativo" y de este modo la inferencia es que el anticuerpo que reacciona en este formato probablemente sea más propenso a ser biológicamente relevante Esta es la primera demostración de un péptido GDFd recombinante capaz de generar un anticuerpo que es reactivo en la forma nativa de GDFd y neutralizante en el bioensayo
EJEMPLO 21 Análisis serológicos de desangrados de cerdos luego de la inmunización con TMV-FV1 , TMV-FV5, TMV-FV6, TMV-FV7 o la proteina pro GDF8
Para el estudio en cerdos (Estudio en Cerdos #1 ), se evaluó un total de 6 vacunas, junto con un control U1 de TMV de tipo salvaje Cada vacuna o control se administró a una dosis de 250 µg en uno de dos adyuvantes, para dar un total de 14 combinaciones Los adyuvantes considerados fueron tanto Emunade (una emulsión de aceite en agua) administrada en todas las inmunizaciones, o Adyuvante Completo de Freund (CFA) administrado con la primera dosis de vacuna y Adyuvante Incompleto de Freund (IFA) para las vacunaciones posteriores Para este estudio ciego, hubo un animal por combinación vacuna/adyuvante y un control no inmunizado para un total de 15 animales Las vacunas evaluadas fueron > GDFd P2-Cterm (P2) > Prohormona de GDFd TMV de tipo salvaje U1 > TMV-FV1 > TMV-FV5 > TMV-FV6 > TMV-FV7 Los sueros, obtenidos 7 días después de la tercera vacunación, se evaluaron en formato ELISA contra los mismos objetivos empleados para
los sueros del estudio en cabras #2, es decir, virus mosaico del tabaco (tipo U 1 solamente), el conjugado de péptido DJ5(20) BSA y el conjugado de peptido DJ5( 12) BSA (ver figura 7) Se recubrieron las placas de microtitulacion con el antigeno objetivo, a 5 µg/ml en regulador de pH de carbonato/bicarbonato (pH 9 6), hasta la mañana siguiente a 4°C El protocolo de ELISA empleado fue el que se definió para los ELISA indirectos de TMV (Ejemplo 20), con la siguiente modificación Se usó IgG anti-cerdo de conejo (Sigma) como anticuerpo secundario en lugar de I secundario anti-cabra de conejo Los resultados se resumen en formato de tabla en el Cuadro 35 Como se espera la respuesta anti-TMV fue específica para las animales vacunados con TMV, con títulos de dilución final por lo menos 2 logio más altos que el animal de control para la mayor parte de las combinaciones vacuna/adyuvante Para la combinación TMV-FV5/Adyuvante de Freund, el animal solo habia recibido dos dosis debido a consideraciones en su salud y asi el suero evaluado fue cuatro semanas después de la segunda vacunación, lo que explica la baja respuesta observada En general la respuesta inmune anti-TMV fue mayor para las vacunas administradas con el adyuvante de Freund más potente, siendo la excepción TMV-FV6, el caso fue el contrario Para los ELISA del conjugado DJ5(20)-BSA, los animales vacunados con GDFd y P2 los sueros tenían títulos de dilución final al valor o por debajo de los controles vacunados y no vacunados con U1 TMV Para los animales que recibieron las vacunas con péptido DJ5 de TMV, las respuestas más altas fueron 1 logio mas altas que los controles y generalmente más altas para las
las vacunas administradas en conjunción con adyuvante de Freund Solo para la vacuna-FV6 la respuesta con ambos adyuvantes fue similar Como se observa con los dos estudios en cabras, las diluciones finales del suero en las placas de ELISA del conjugado DJ5(12)-BSA fueron más bajas para todos los animales que respondieron, con relación al ELISA de DJ5(20) Los ELISA para el Estudio en cabras #2 y Estudio en Cerdos #1 se procesaron en paralelo Debe observarse que las diluciones finales del suero fueron sustancialmente más altas para los sueros derivados de las cabras, los ELISA con el estudio en cabras solo se permitieron desarrollar durante 5 minutos, comparado con los 20 minutos para los ELISA del estudio en Cerdos Esto sugiere que tanto las respuesta inmunes anti-portador y específicas del peptido obtenidas en cabras fueron mayores que las observadas en los cerdos La secuencia de la proteína GDFd de cabra madura difiere de la de otras especies de mamíferos, incluyendo cerdos, ganado, y humanos, por un aminoácido, la arginina que es C-terminal a los residuos QANP (SEQ ID NO 5d) en la región DJ5 está sustituida por una lisina Por lo tanto el GDFd humano, empleado en el presente estudio junto con el péptido DJ5 mostrado en la superficie de TMV no fueron autoantígenos reales en cabras Dado que las dosis de vacuna empleadas tanto en los estudios en cabras como en cerdos fueron idénticas, puede ser posible explicar una respuesta más robusta observada en las cabras Sin embargo, el hecho de que la respuesta inmune se observó en cerdos es alentador El Cuadro 35, a continuación, provee un resumen de los resultados no ciegos
para el estudio en Cerdos #1 , que compara las diluciones finales de los
sueros por ELISA anti-TMV U1 y en ELISA contra conjugados BSA del
péptido de longitud completa DJ5 (20 aminoácidos, DJ5(20)) y N-terminal de
12 aminoácidos (DJ5(12))
CUADRO 35
Datos de dilución final del Estudio en Cerdos #1
ELISA Anti-TMV y Anti-DJ5
Antígeno objetivo Vacuna administrada Cerdo # (adyuvante) TMV U1 BSA-DJ5 (12) BSA-DJ5 (20)
Control #10491 150 (-) 50 ProGDFd (E) #10465 150 50 50 ProGDFd (F) #10467 150 50 (-) P2 (E) #10495 50 (-) (-) P2 (F) #10501 50 (-) (-) TMV-FV1 (E) #10498 12,150 150 150 TMV-FV1 (F) #10484 3,6450 150 4,050 TMV-FV5 (E) #10483 4,050 450 1 ,350 TMV-FV5 (F) #10497 150 (-) 450 TMV-FV6 (E) #10490 36,450 50 1 ,350 TMV-FV6 (F) #10499 12,150 150 1 ,350 TMV-FV7 (E) #10496 12,150 450 150 TMV-FV7 (F) #10500 36,450 450 4,050 TMV U 1 (E) #10488 36,450 (-) (-) TMV U1 (F) #10502 109,350 50 50
Para el Cuadro 35, las condiciones de envoltura de pocilios para
los diferentes objetivos fueron como se describe en el Cuadro 27, referencia
anterior Las muestras de suero se tomaron 7 días después de la tercera
vacunación Los sueros se diluyeron inicialmente a 1 50 y se realizó una
dilución serial al tercio para cada desangrado por duplicado La dilución final se tomó como la dilución mas alta a la cual la lectura de DO fue dos veces la del fondo (-), indica que la lectura de DO fue por debajo de dos veces el fondo (E), adyuvante de Emunade, (F), adyuvante de Freund
EJEMPLO 22 Construcción del vector GENEWARE® para la expresión de la prohormona de GDF8 en plantas
Para generar pLSB2661 , un fragmento que contiene GDFd con marca FLAG (human myostatm prohormone gene) se amplifico a partir del plásmido 1202-37 39 por PCR Las secuencias reales de los dos o gonucleótidos empleados, junto con sus SEQ ID asociados, se muestran en el Cuadro 36, a continuación El plásmido 1202-37 39 se generó insertando la secuencia de nucleótidos para un proGDFd humano con marca FLAG en el plásmido pcDNA3 1/hygro (Invitrogen Corp , Carisbad, California)
CUADRO 36
Oligonucleótidos delantero e inverso
para amplificación por PCR de la inserción ProgdFd FLAG del plásmido
1202-37.39
Ohgonucleótido delantero O gonucleótido inverso Secuencia de acido c t= „ , . , . r_ _ ? r. . SEQ Secuencia de acido nucleico SEQ ID GDnFcdQn-ScC?1-P Dac?en *te I D N0 GDFd-A1 -Sal NO
CC TTAATTA ATG GAT CTT GTCGAC CTA CTT
CTA CAG AAG TTG CAG ATC GTC GTC ATC CTT G
Este fragmento amplificado por PCR contiene el ORF entero de
la Prohormona de GDFd que se siguió por un epitope FLAG Esta inserción se
digirió con Pací y Sa/I, y posteriormente se ligó a un fragmento 9 5 kb Pac\l
Xho\ del vector DN15, un derivado de BSG1037 (vector de TMV que expresa
una proteína de fluorescencia verde, Fitzmaupce et al, Patente de los Estados
Unidos no US 6 656 726 B1 ) que contiene un cambio "D" a "N" en el
aminoácido #1 177 (D1 177N) en la proteína replicasa y un "P" a "R" en el
aminoácido #30 (P30R) en la proteína de movimiento Esto produjo la
generación del plásmido pLSB2661 y la región de ORF de la Prohormona de
GDFd con marca FLAG en pLSB2661 se confirmo por secuencia (SEQ ID NO
61 ) El Cuadro 37, a continuación da la secuencia de aminoácidos final de la
Prohormona de GDFd con marca FLAG (proGDFd FLAG) expresada a partir
de pLSB2661 , basada en la secuencia obtenida
CUADRO 37 Secuencia de aminoácidos completa de Pro FDG-8 FLAG Junto con sus SEQ ID NOs. Asociadas
EJEMPLO 23 Producción y caracterización de la Prohormona de GDF8 expresada en plantas
La prohormona de GDFd con marca FLAG se produjo por transcripción del plásmido pLSB 2661 La síntesis de transcripción, verificación e inoculación en plantas se realizo como se describe en el Ejemplo 9 Como se observa en el Ejemplo 9, pueden emplearse plantas hospederos alternativas, distintas de N benthamiana en la producción de la prohormona de GDFd con marca FLAG Por ejemplo, N excelsiana o N tabacum representan dos plantas alternativas posibles de plantas hospederos
Para evaluar el nivel de expresión de la Prohormona de GDFd como función de los dias post inoculación (DPI), se tomaron trozos de hojas de tejido infectado sistémicamente a 5 DPI hasta 8 DPI Las muestras de trozos de hoja se almacenaron a -20°C hasta el procesamiento Además de las muestras de trozos de hojas tomadas para las plantas inoculadas con pLSB2661 , plantas no inoculadas y plantas inoculadas con un vector GENEWARE® que expresa GFP se mantuvieron como muestras de control Las muestras de trozos de hoja se homogeneizaron en colorante de carga de PAGE y se analizaron en gel para PAGE y análisis de Western blot Las Western blots se sondearon con el policlonal anti-GDF8 #661 de cabra o un monoclonal anti-FLAG (Sigma). De los geles para PAGE , las únicas bandas correspondientes al GENEWARE® derivadas de proteina de envoltura U5 (~ 20 kDa) y el GFP expresado (-30 kDa) fueron detectables a 6 y d DPI (los dos puntos analizados) para el control de GFP Ambas bandas estaban ausentes en el caso del control no infectado Para las plantas infectadas con pLSB2661 , una banda de proteína de envoltura U5 solo fue detectable a d DPI, aunque las plantas fueron sintomáticas a 5 DPI Ninguna otra banda fue evidente por gel para PAGE con el transcurso del tiempo Para la Western blot que emplea el anticuerpo #661 de cabra, una única banda que migraba a -50 kDa se encontró presente a 7 y 8 DPI, para las plantas inoculadas con pLSB2661 Esta banda muy probablemente corresponde a la Prohormona de GDF8 no procesada, que tiene un peso molecular de 50 kDa El anticuerpo #661 de cabra también reacciona en forma cruzada con la
especie de alto peso molecular que se detectaron en el mismo rango de DPI La reactividad no especifica en las lineas de control no infectadas y GFP fue mínima Cuando se sondeo una Western blot paralela con el monoclonal anti-FLAG, la reactividad cruzada con proteínas del hospedero vegetal fue mayor Sin embargo, para las líneas que contienen extractos de tejido infectado con pLSB 2661 , se observaron las mismas especies de PM alto observadas con el anticuerpo #661 de cabra, en todos los DPI observados, sin bandas con reacción cruzada de peso molecular similar presentes en ninguno de los controles Una especie de 50 kDa también se detectó a 7 y 8 DPI, aunque una banda de reacción cruzada débil co-migró en todas las muestras Tomados juntos estos datos indican que la expresión de la Prohormona de GDFd se obtuvo usando expresión basada en GENEWARE® en plantas y que la prohormona no procesada se acumulo como especie principal Además, una especie de alto peso molécula reactiva a anti-FLAG y ant?-GDF8 se encontró presente, lo que puede representar una forma entrecruzada de la Prohormona de GDFd Sin embargo, el nivel de acumulación de proGDFd FLAG obtenido con el vector pLSB2661 fue insuficiente para permitir la purificación económica de la proteína en escala Debe observarse que serían posibles iteraciones similares de la optimización del vector, para mejorar la acumulación de proGDFd Por ejemplo, la secuencia de señal nativa proGDFd podría reemplazarse por una secuencia de señal derivada de plantas por ej las secuencias de señal de extensina o alfa amilasa, la proteína podría mantenerse en el retículo endoplasmático (ER) a través del agregado de una
señal de retención de ER en el C-termino de la proteína, por ej la secuencia KDEL y el uso del codon del ORF de proGDFd podría optimizarse de modo tal que se emplea el uso del codón preferido de N tabacum o TMV Ademas estas estrategias diferentes pueden combinarse para mejorar la acumulación en forma adicional
CUADRO 38 Secuencias adicionales
Pueden realizarse muchas modificaciones y variaciones de esta invención sin alejarse de su espíritu y alcance, como resultará obvio para los expertos en el arte Las modalidades específicas descritas aquí se ofrecen a modo de ejemplo solamente, y la invención sólo debe limitarse por los términos de las reivindicaciones anexas junto con el alcance completo de equivalentes a los cuales habilitan dichas reivindicaciones Numerosas referencias se citan en la memoria descriptiva, incluyendo Números de Acceso al Genebank de secuencias publicadas y/o publicadas en Internet de ácidos nucleicos y polipéptidos/proteínas, cuyas descripciones se incorporan como referencia en su totalidad