JP2010539962A - メチオニン収量の増加 - Google Patents
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Abstract
炭素源と硫黄源とを含んでなる適当な培養培地において微生物を培養することによる、メチオニンまたはその誘導体の生産方法。この微生物および／または培養培地は、メチオニン／炭素源収量が増大するように改変されている。発酵培地からのメチオニンまたはその誘導体の単離も記載される。
Description
発明の分野
本発明は、炭素源と硫黄源とを含んでなる適当な培養培地で微生物を培養することによってメチオニンまたはその誘導体を生産するための方法に関する。該微生物および／または培養培地はメチオニン／炭素源収量が増加されるように改変されたものである。また、発酵培地からのメチオニンまたはその誘導体の単離についても請求される。
本発明は、炭素源と硫黄源とを含んでなる適当な培養培地で微生物を培養することによってメチオニンまたはその誘導体を生産するための方法に関する。該微生物および／または培養培地はメチオニン／炭素源収量が増加されるように改変されたものである。また、発酵培地からのメチオニンまたはその誘導体の単離についても請求される。
先行技術
システイン、ホモシステイン、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニンなどの硫黄含有化合物は、細胞代謝にとって重要であり、食品または飼料添加物および医薬品として使用されるべく工業的に製造される。特に、動物が合成することのできない必須アミノ酸であるメチオニンは、多くの身体機能において重要な役割を果たす。タンパク質生合成におけるその役割とは別に、メチオニンは、メチル基転移ならびにセレニウムおよび亜鉛のバイオアベイラビリティに関与している。メチオニンはまた、アレルギーやリウマチ熱のような疾患のための治療薬として直接用いられる。しかしながら、生産されるメチオニンの大部分は動物飼料に添加されている。
システイン、ホモシステイン、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニンなどの硫黄含有化合物は、細胞代謝にとって重要であり、食品または飼料添加物および医薬品として使用されるべく工業的に製造される。特に、動物が合成することのできない必須アミノ酸であるメチオニンは、多くの身体機能において重要な役割を果たす。タンパク質生合成におけるその役割とは別に、メチオニンは、メチル基転移ならびにセレニウムおよび亜鉛のバイオアベイラビリティに関与している。メチオニンはまた、アレルギーやリウマチ熱のような疾患のための治療薬として直接用いられる。しかしながら、生産されるメチオニンの大部分は動物飼料に添加されている。
ＢＳＥおよび鳥インフルエンザの結果としての動物由来タンパク質の使用が減少するに伴い、純粋なメチオニンに対する需要が高まっている。化学的には、Ｄ，Ｌ−メチオニンは、通常、アクロレイン、メチルメルカプタンおよびシアン化水素から製造される。しかしながら、ラセミ混合物は、例えば鶏飼料用添加物において、純粋なＬ−メチオニンほど良好には機能しない(Saunderson, C.L., (1985) British Journal of Nutrition 54, 621-633)。純粋なＬ−メチオニンは、ラセミ型メチオニンから、例えばＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニンのアシラーゼ処理によって製造することができるが、製造コストは大幅に増加する。環境問題に関連して純粋なＬ−メチオニンに対する需要が高まりつつあることから、メチオニンの微生物生産は魅力的である。
微生物は、細胞成分の生合成を微調整する極めて複雑な調節機構を発達させ、これにより最大の増殖率が得られる。結果として、必要量のアミノ酸などの代謝産物しか合成されず、通常、野生型株の培養上清においては検出できない。細菌は、主に酵素のフィードバッグ阻害や遺伝子転写の抑制または活性化によりアミノ酸生合成を制御する。これらの調節経路に対するエフェクターは、ほとんどの場合、関連経路の最終産物である。結果として、微生物においてアミノ酸を過剰生産させる戦略には、これら制御機構の調節を解除することが必要となる。
Ｌ−メチオニン合成経路は、多くの微生物においてよく知られている（図１）。メチオニンは、アミノ酸であるアスパラギン酸に由来するが、その合成には、システイン生合成およびＣ１代謝というさらなる２つの経路の収束が必要である。
アスパラギン酸はオキサロ酢酸から合成される。大腸菌（E.coli）では、クエン酸回路の適切な機能のために安定なオキサロ酢酸プールが必要とされる。よって、オキサロ酢酸からアスパラギン酸への変換には、このプールからのオキサロ酢酸の抜き取りを補う反応が必要である。補充反応と呼ばれるいくつかの経路は大腸菌においてこれらの機能を果たす(Sauer & Eikmanns (2005) FEMS Microbiol Reviews 29 p765-94)。対数増殖条件およびグルコース過剰下で、ＰＥＰカルボキシラーゼはＰＥＰのカルボキシル化を触媒してオキサロ酢酸を生じさせる。カルボキシル化効率はとりわけ細胞内ＰＥＰ濃度に依存する。ＰＥＰは多数の反応を遂行する中枢的代謝産物である。それらの１つである、ＰＥＰからピルビン酸への解糖的変換は大腸菌にとって必須ではなく、これはＰＴＳ系を介したグルコースの取り込みは、グルコースから生じた２つのＰＥＰ分子のうち１つをピルビン酸へ変換するためである。解糖では、酵素ピルビン酸キナーゼ（大腸菌では、遺伝子ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦによりコードされている２つのイソ酵素によりコードされている）はＰＥＰからピルビン酸へ変換を触媒する。
アスパラギン酸は、一連の３つの反応によってホモセリンに変換される。次に、ホモセリンはトレオニン／イソロイシンまたはメチオニン生合成経路へ入り得る。大腸菌では、メチオニン経路へ入るにはホモセリンのスクシニル−ホモセリンへのアシル化が必要である。この活性化段階は、次のシステインとの縮合を可能とし、チオエーテル含有シスタチオニンをもたらし、これが加水分解されてホモシステインとなる。メチオニンに至る最終的なメチル転移はＢｉ２依存的またはＢｉ２依存的メチルトランスフェラーゼのいずれかによって行われる。
大腸菌におけるメチオニン生合成は、ＭｅｔＪおよびＭｅｔＲタンパク質のそれぞれを介してメチオニン生合成遺伝子を抑制および活性化することによって調節される（Figge RM (2006), Wendisch VF編, Microbiol Monogr (5) Amino acid biosynthesis p164-185に総説）。ＭｅｔＪは、そのコリプレッサーであるＳ−アデノシルメチオニンとともに、遺伝子ｍｅｔＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＥおよびｍｅｔＦを調節することが知られている。ｇｌｙＡ、ｍｅｔＥ、ｍｅｔＨおよびｍｅｔＦなどの、メチオニン生産に関与する酵素をコードする他の遺伝子は、そのコアクチベーターであるホモシステインの存在下でＭｅｔＲによって活性化されるが、ホモシステインの不在下ではｍｅｔＡだけが活性化される。これらの酵素は総て、Ｃ１単位の生産およびセリンからメチオニンへのＣ１単位の転移に関与している。セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードするＧｌｙＡは、セリンのグリシンへの変換および補酵素テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）上へのＣ１単位の同時転移を触媒する。次に、グリシンがＣＯ２、ＮＨ３に変換されるとともに、別のＣ１単位がＴＨＦに変換される。この反応は、遺伝子ｇｃｖＴＨＰおよびｌｐｄによりコードされているグリシン切断複合体によって触媒される。
この２つの反応によってメチレン−ＴＨＦ形態で生産されるＣ１単位は次に、メチル−ＴＨＦへと還元されるか、またはホルミル−ＴＨＦへとさらに酸化させるかのどちらかである。メチオニン生合成にはメチル−ＴＨＦへの還元が必要である。よって、この酸化反応はＣ１単位をめぐってメチオニン生合成と競合する。ホルミル−ＴＨＦまたはギ酸は、プリンおよびヒスチジンの生合成に必要である。大腸菌において、ホルミル−ＴＨＦは、ｐｕｒＵ遺伝子によりコードされているホルミル−ＴＨＦデホルミラーゼにより触媒される反応においてＴＨＦおよび遊離ギ酸へと変換され得る(Nagy et al. (1995) J. Bacteriol 177 (5) p. 1292-98)。
メチレン−ＴＨＦのメチル−ＴＨＦへの還元は、ＭｅｔＦタンパク質によって触媒される。ホモシステインへのメチル基の転移は、ビタミンＢ１２を介してＭｅｔＨにより触媒されるか、またはＭｅｔＥによって直接触媒される。ＭｅｔＨ酵素は、ＭｅｔＥ酵素よりも数百倍高い触媒反応速度を有することが知られている。ビタミンＢ１２および従って活性ＭｅｔＨの不存在下では、ＭｅｔＥは、全細胞タンパク質の最大５％を構成し得る。活性ＭｅｔＨの存在は、おそらく、通常はＭｅｔＲを介してｍｅｔＥの転写を活性化するホモシステインの量を低減することによりＭｅｔＥ活性を低下させる。従って、ＭｅｔＨを介したメチオニンの生産は、ＭｅｔＥを大量に発現させないので、細胞にとって重要な資源を節約する。ホモシステインの蓄積は大腸菌にとって有毒であり(Tuite et al., 2005 J. Bacteriol, 187, 13, 4362-4371)、同時に、ＭｅｔＲを介したｍｅｔＡ発現に対する負の調節効果を有する。よって、効果的なメチオニン生産には、酵素ＭｅｔＨおよび／またはＭｅｔＥの強い発現が明らかに必要である。
大腸菌において、還元された硫黄は、システインに組み込まれ、次いでメチオニン前駆体であるＯ−スクシニル−ホモセリン上へ転移されるが、このプロセスは硫黄基転移(transulfuration)と呼ばれる（Neidhardt, F.C. (Ed. in Chief), R. Curtiss III, J.L. Ingraham, E.C.C. Lin, K.B. Low, B. Magasanik, W.S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H.E. Umbarger (編). 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiologyに総説）。システインは、Ｏ−アセチルセリンおよびＨ２Ｓから硫黄基転移により生産される。本プロセスは、生成物であるシステインが、ＣｙｓＥによりコードされているセリントランスアセチラーゼに作用することによって負のフィードバック調節を受ける。Ｏ−アセチル−セリンから同時に生産されるＮ−アセチル−セリンは、転写因子ＣｙｓＢとともに、硫黄化合物の輸送、それらのＨ２Ｓへの還元および有機硫黄化合物であるシステイン（メチオニンと同様に必須アミノ酸である）内へのそれらの組み込みに関与する酵素をコードする遺伝子を活性化させる。
システインの不存在下では、ＭｅｔＢは、メチオニン前駆体Ｏ−スクシニルホモセリンの、アンモニア、α−ケトブチラートおよびスクシネートへの変換を触媒し、この反応はγ脱離と呼ばれる(Aitken & Kirsch, 2005, Arch Biochem Biophys 433, 166-75)。次いで、α−ケトブチラートはイソロイシンへと変換され得る。この副反応は、メチオニンの工業的製造には望ましくなく、これはこれら２つのアミノ酸を分離するのが困難であるからである。よって、低いγ脱離活性またはイソロイシン生産を低く維持する他の手段が、メチオニンの工業的製造にとって重要な態様である。米国仮特許出願ＵＳ６０／６５０，１２４には、酵素ＭｅｔＢを最適化することによってどのようにγ脱離を低減され得るかが記載されている。システイン生合成を最適化することによってもγ脱離を低下させ、従って副産物であるイソロイシンの生産を低減することができ、これは本発明の一実施態様をなす。
発明の一般的開示
発酵プロセスにおいてメチオニン、その誘導体または前駆体を生産するための方法であって、下記工程：
炭素源と硫黄源とを含んでなる適当な培養培地中で改変微生物を培養する工程；および
該培養培地からメチオニンを回収する工程
を含んでなり、
該微生物または方法が、非改変微生物または方法に比べ、以下の改変：
１−微生物におけるホルミル−ＴＨＦの脱ホルミル化の低減；
２−微生物におけるホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の消費の低減；
３−培養培地中の１種または数種の無機基質に対して微生物を制限するまたは飢餓状態にすることによる微生物の増殖の制限
の少なくとも１つおよびその組合せによって、増強されたメチオニン／炭素源収量をもたらすように改変されている方法に関する。
発酵プロセスにおいてメチオニン、その誘導体または前駆体を生産するための方法であって、下記工程：
炭素源と硫黄源とを含んでなる適当な培養培地中で改変微生物を培養する工程；および
該培養培地からメチオニンを回収する工程
を含んでなり、
該微生物または方法が、非改変微生物または方法に比べ、以下の改変：
１−微生物におけるホルミル−ＴＨＦの脱ホルミル化の低減；
２−微生物におけるホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の消費の低減；
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の少なくとも１つおよびその組合せによって、増強されたメチオニン／炭素源収量をもたらすように改変されている方法に関する。
本発明の記載において、遺伝子およびタンパク質は大腸菌における対応する遺伝子の名称を用いて識別される。しかしながら、特に断りのない限り、これらの名称の使用は本発明に従うより一般的な意味を有し、他の生物、より詳しくは微生物における対応する遺伝子およびタンパク質の総てを包含する。他の生物に由来する遺伝子およびタンパク質も、付加的情報として、特にコリネバクテリウム・グルタミクム(Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ)に関して明示することができる。この付加的情報の目的は遺伝子またはタンパク質の一般定義を限定するものではない。
本発明の特定の実施形態では、メチオニン／炭素源収量はホルミル−ＴＨＦの脱ホルミル化の低減によって増加し、これはｐｕｒＵ遺伝子（Ｃ．グルタミクムのＹＰ＿００１１３７３２２）の発現を減衰させることにより達成することができる。ＰｕｒＵ酵素はホルミル−ＴＨＦデホルミラーゼ反応を触媒する。デホルミラーゼ活性の減衰は、ホモシステインのメチル化に必要なメチル−ＴＨＦの生産を増加させる。脱ホルミル化によるＣ１代謝産物の欠如により、メチオニンへ変換できないホモシステインの生産が増加される。そして、ホモシステインは、ホモランチオニンの生産をもたらすＯ−スクシニルホモセリンとホモシステインの間の反応を触媒する酵素シスタチオニンγシンターゼ（ＭｅｔＢ）の基質となる。
本発明の別の特定の実施形態では、メチオニン／炭素源収量はホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の消費の低減によって増加し、これは遺伝子ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦをコードするピルビン酸キナーゼの少なくとも一方または双方の減衰によって達成することができる。ＰＥＰのアベラビリティの増加は、アスパラギン酸の重要な前駆体であるオキサロ酢酸（これは次にメチオニンの前駆体となる）の生産を増加させることができる。Ｃ．グルタミクムは、ＹＰ＿２２６３２６に相当するただ１つのピルビン酸キナーゼ遺伝子を担持する。
本発明の別の実施形態では、メチオニン／炭素源収量は、微生物の増殖を制限するまたは無機基質に対して微生物を飢餓状態にすることにより増加する。これは培養培地中の利用可能なリン酸塩（phosphate）および／またはカリウムの量を制限することにより達成することができる。炭素はバイオマスの生産および／またはバイオマスの維持には用いられないが、メチオニンの生産には用いられるので、このような細胞増殖の制限によってメチオニン／炭素源収量を向上させることができる。特に、培養培地におけるリン酸塩の濃度はＯＤ６００ ２００未満、好適には１５０、より好適には１００までの増殖を可能にする。ＯＤ６００ １００は、大腸菌ではバイオマス３０〜３５ｇ／ｌ、酵母では４０〜５０ｇ／ｌに相当する。他の微生物については、当業者であれば変換倍率が分かるであろう。大腸菌では、バイオマス１ｇを生産するのに必要なリン酸塩の量は１０〜２０ｍｇの間、好適には約１８ｍｇである。バイオマス１ｇを生産するのに必要なカリウムの量は１０〜２０ｍｇの間、好適には約１８ｍｇである。コリネバクテリウム・グルタミクムでは、バイオマス１ｇを生産するのに必要なリン酸塩の量は１４〜２１ｍｇの間、好適には約１７ｍｇである。バイオマス１ｇを生産するのに必要なカリウムの量は２３〜３３ｇの間、好適には約２８ｍｇである。他の微生物については、当業者であれば変換倍率が分かるであろう。
微生物は富化または最少培地で、好適には最少培地で増殖させる。好適な最少培地は以下に記載されている。
メチオニン／炭素源収量を調整するためのこれら３つの手段は単独で使用することもできるし、あるいは１つまたは２つの他の手段と組み合わせて使用することもできる。
よって、ｐｕｒＵ遺伝子の発現を減衰することによるホルミル−ＴＨＦの脱ホルミル化の低減は、遺伝子ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦまたは双方の発現の減衰、ならびに培養培地におけるリン酸塩および／またはカリウムの制限または飢餓と行うことができる。
同様に、ｐｕｒＵ遺伝子の発現の減衰によるホルミル−ＴＨＦの脱ホルミル化の低減は、遺伝子ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦまたは双方の発現の減衰によるＰＥＰ消費の低減と行うことができる。
同様に、ｐｕｒＵ遺伝子の発現の減衰によるホルミル−ＴＨＦの脱ホルミル化の低減は、培養培地におけるリン酸塩および／またはカリウムの制限または飢餓と行うことができる。
同様に、ｐｕｒＵ遺伝子の発現の減衰によるホルミル−ＴＨＦの脱ホルミル化の低減は、培養培地におけるリン酸塩および／またはカリウムの制限または飢餓と行うことができる。
同様に、遺伝子ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦまたは双方の発現の減衰によるＰＥＰ消費の低減は、培養培地におけるリン酸塩および／またはカリウムの制限または飢餓と行うことができる。
本明細書において、特許請求の範囲および明細書の解釈のために以下の用語を用いることができる。
本発明によれば、「培養」、「発酵」または「発酵プロセス」とは、単純炭素源を含有する適当な増殖培地での細菌の増殖を表すために互換的に用いられる。
総メチオニン／炭素源収量は、発酵実施中に消費されたグルコース（ｇ）当たりのメチオニン＋ＮＡＭの量（ＮＡＭ量はメチオニン当量）（ｇ）％として定義される。
メチオニンの誘導体はメチオニン変換および／または分解経路から生じる。特に、これらの生成物はＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）チオ−メチル−リボースおよびＮ−アセチルメチオニン（ＮＡＭ）である。特にＮＡＭは、単離および脱アシル化によるメチオニンへの変換が可能な、容易に回収できるメチオニン誘導体である。「培養培地からメチオニンを回収する」とは、メチオニン、ＳＡＭおよびＮＡＭならびに有用であり得る他のあらゆる誘導体を回収する行為を表す。
メチオニンの前駆体は、メチオニン特異的代謝経路の一部であるか、またはこれらの代謝産物に由来し得る代謝産物として定義される。特に、前駆体はＯ−スクシニル−ホモセリン（ＯＳＨ）、γ−シスタチオニン、ホモシステインおよびホモランチオニンである。このメチオニン特異的経路は、酵素ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＡ）によるホモセリンのスクシニルホモセリンへの変換で始まる。
「微生物」とは、細菌、酵母または真菌を表す。好適には、微生物は腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、バチルス科(Bacillaceae)、ストレプトミセス科(Streptomycetaceae)およびコリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)の中から選択される。より好適には、微生物は、エシェリキア属(Escherichia)、クレブシェラ属(Klebsiella)、パンテア属(Pantoea)、サルモネラ菌属(Salmonella)またはコリネバクテリウム属(Corynebacterium)の種である。いっそうより好適には、微生物は、大腸菌（Escherichia coli)またはコリネバクテリウム・グルタミクム種のいずれかである。
「改変微生物」とは、メチオニン／炭素源収量を増大させる目的で遺伝的に改変された微生物を表す。当業者ならば、どのようにして特定の遺伝子の発現を調整すればよいか分かる。通常の改変としては、遺伝子置換、プロモーターの改変および異種遺伝子の発現のためのベクターの導入を含む、遺伝エレメントで微生物を形質転換することを含む。
「メチオニン／炭素源収量」とは、発酵中に得られたメチオニンの量を消費された炭素源の量で割ったものを表す。それはメチオニンｇ／炭素源ｇ％またはメチオニンｍｏｌ／炭素源ｍｏｌ％で表すことができる。これに関して「増強された」とは、特定の非改変の微生物および／または非改変の培養培地と比べた場合の測定可能な増加を示す。好ましい実施形態において、増加は少なくとも２％ｇ／ｇ、好ましくは少なくとも４％ｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも７％ｇ／ｇである。総メチオニン／炭素源収量は好適には少なくとも７％ｇ／ｇ、好適には少なくとも１２％ｇ／ｇ、好適には少なくとも１５％ｇ／ｇ、最も好適には少なくとも１９％ｇ／ｇである。
この増加を評価するためには、消費されたグルコースおよび生産されたメチオニンの量を測定しなければならない。消費された炭素源の量は、屈折率測定検出を用いるか、または流加溶液に関してはＢｒｉｘの方法に従い、ＨＰＬＣにより増殖培地のグルコース濃度を測定することにより計算される。バッチ培養では、消費されたグルコースは、実験開始時の残留グルコース量から実験終了時の残留グルコース量を差し引いたものに相当する。流加発酵では（詳細な説明の例を参照）、消費されたグルコースの量は、バッチ培養におけるグルコースと植菌物中の添加グルコースと流加段階に注入したグルコースの量の合計から実験終了時の残留グルコース量を差し引いたものに相当する。
「得られたメチオニン」には、Ｌ−メチオニンと容易に回収できるメチオニン誘導体ＮＡＭが含まれる。培地における得られたメチオニンの量は、標品としてＬ−メチオニン（Ｆｌｕｋａ、Ｒｅｆ６４３１９）を用いた蛍光測定検出による、ＯＰＡ／Ｆｍｏｃ誘導体化後のＨＰＬＣによって測定される。ＮＡＭの量は、標品としてＮＡＭ（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ０１３１０）を用いた屈折率測定ＨＰＬＣを用いて決定される。
本発明による「炭素源」とは、微生物の正常な増殖を支持するために当業者が使用可能ないずれの炭素源も表し、ヘキソース（グルコース、ガラクトースまたはラクトースなど）、五炭糖、単糖類、二糖類、オリゴ糖（スクロース、セロビオースまたはマルトースなど）、糖蜜、デンプンまたはその誘導体、ヘミセルロース、グリセロールおよびそれらの組合せであり得る。特に好ましい単純炭素源はグルコースである。別の好ましい単純炭素源はスクロースである。
本発明による「遺伝子の発現の減衰」とは、遺伝子の発現の部分的または完全な抑制（この場合、減衰されると言われる）を表す。この発現の制は遺伝子発現の阻害、遺伝子発現に必要なプロモーター領域の全部または一部の欠損、遺伝子のコード領域の欠損、または野生型プロモーターのより弱い天然もしくは合成プロモーターとの交換のいずれかであり得る。好適には、遺伝子の減衰は本質的にその遺伝子の完全な欠損であり、これは本発明による株の同定、単離および精製を助ける選択マーカー遺伝子により置換することができる。遺伝子は好適には相同組換えの技術によって不活性化される(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645)。
本願明細書において「増強される」または「過剰発現される」とは、例えば、より強いプロモーターを使用するか、または活性が増強された対立遺伝子を使用し、また、おそらくはこれらの手段を組み合わせて、遺伝子のコピー数を増やすことにより、対応するＤＮＡによってコードされる酵素活性の細胞内活性を高めることを表す。
「増加された発現」、「増強された発現」または「過剰発現」は本明細書において互換的に用いられ、同様の意味を有する。
遺伝子の発現を増大させるため、染色体内にコードされていても、あるいは染色体外にコードされていてもよい。染色体内では、当業者に公知の組換え方法により導入可能な１種類または数種類のコピーがゲノム上に存在し得る。染色体外では、遺伝子は、それらの複製起点、よって細胞内でのそれらのコピー数が異なる、様々なタイプのプラスミドにより担持されてもよい。それらは１〜５コピー、約２０または最大５００として存在してもよく、これらは厳密な複製を有する低コピー数のプラスミド（ｐＳＣ１０１、ＲＫ２）、低コピー数のプラスミド（ｐＡＣＹＣ、ｐＲＳＦ１０１０）または高コピー数のプラスミド（ｐＳＫ ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ）に相当する。
本発明の好ましい実施形態では、この遺伝子は誘導可能な、強度の異なるプロモーターを用いて発現させることができる。これらのプロモーターは同種であっても異種であってもよい。当業者ならば、どのプロモーターが最も便宜か分かり、例えば、プロモーターＰｔｒｃ、Ｐｔａｃ、ＰｌａｃまたはλプロモーターｃＩが広く用いられる。
酵素の発現は対応するメッセンジャーＲＮＡ(Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64)またはタンパク質（例えば、ＧＳＴタグ、Amersham Biosciences）を安定化または脱安定化するエレメントにより促進または低減することができる。
本発明はまた、本発明に従って増強される遺伝子の１つまたはいくつかの対立遺伝子を含む微生物に関する。
本発明の記載において、遺伝子およびタンパク質は大腸菌における対応する遺伝子の名称を用いて識別される。しかしながら、特に断りのない限り、これらの名称の使用は本発明に従うより一般的な意味を有し、他の生物、より詳しくは微生物における対応する遺伝子およびタンパク質の総てを包含する。
ＰＦＡＭ（アラインメントのタンパク質ファミリーデータベースおよび隠れマルコフモデル；http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）は、タンパク質配列アラインメントを多数集めたものである。各ＰＦＡＭにより、多重アラインメントを視覚化し、タンパク質ドメインを調べ、生物間の分布を評価し、他のデータベースへのアクセスを確保し、既知のタンパク質構造を視覚化することができる。
３０個の主要な系統発生系を示す６６個の完全に配列決定されたゲノムからのタンパク質配列を比較することにより、ＣＯＧ（タンパク質のオーソロガス群のクラスター；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）が得られる。各ＣＯＧは、少なくとも３つの系から定義されるので、前に保存されたドメインを同定することができる。
相同配列およびそれらの相同性％を同定する手段は当業者によく知られており、特にＢＬＡＳＴプログラムが挙げられ、このプログラムは、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から、このウェブサイト上に示されているデフォルトパラメーターとともに利用することができる。次いで、例えばプログラムＣＬＵＳＴＡＬＷ(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)またはＭＵＬＴＡＬＩＮ(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)を、これらのウェブサイト上に示されているデフォルトパラメーターとともに用いて、得られた配列を活用する（例えば、整列させる）ことができる。
当業者ならば、ＧｅｎＢａｎｋ上で得られる既知の遺伝子に関する参考番号を用いて他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳類、植物などにおける同等の遺伝子を決定することができる。この常法は、有利には、他の微生物由来の遺伝子との配列アラインメントを行い、縮重プローブを設計して、他の生物における対応する遺伝子をクローニングすることにより決定することができるコンセンサス配列を使用して行われる。これらの分子生物学の常法は当業者によく知られており、例えば、Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York)に記載されている。
「生物が無機基質の制限を受ける」とは、その微生物の増殖が、なお弱い増殖を許容しつつ、供給された非有機化学物質の量により支配される条件を定義する。これらの物質の例は、リン酸塩、カリウム、マグネシウムまたはこれらの組合せである。
ある無機基質に対して微生物を飢餓状態にするとは、その無機基質が存在しないために微生物の増殖が完全に停止する条件を定義する。これらの基質の例は、リン酸塩、カリウム、マグネシウムまたはこれらの組合せである。
本発明において、本発明者らは、生産株の代謝操作によってメチオニン／炭素源収量を増加させることを目的とした。本発明の特定の実施形態では、メチオニン／グルコースおよび／またはメチオニン／スクロース収量（ｇ／ｇ）は少なくとも１０％ｇ／ｇ、好適には少なくとも１５％ｇ／ｇ、より好適には１９％ｇ／ｇである。
本発明の特定の実施形態では、硫黄の同化、セリンの生産、そのグリシンへの変換またはグリシンの切断に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現が増加される。メチオニンは硫黄を含有するアミノ酸（Ｃ５Ｈ１１ＮＯ２Ｓ）であるので、微生物の硫黄同化を増加させることが有利である。さらに、アミノ酸セリンおよびグリシンの生産ならびにグリシンの切断（すなわち、異化）を増加させることも有利である。グリシンの切断とセリンのグリシンへの変換はメチレン−ＴＨＦを生産する２つの主要な反応であり、このメチレン−ＴＨＦはメチル−ＴＨＦへと還元されることができ、これはその後のホモシステインからメチオニンへのメチル化に必要である。セリンの生産は酵素３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホセリンホスファターゼおよびホスホセリンアミノトランスフェラーゼによって触媒される。グリシンの切断はグリシン切断複合体によって触媒される。
大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミクムでは、それらの活性を増加させることができ、かつ、従前に記載されている活性に関与する酵素は以下の遺伝子によってコードされている（受託番号および対応するポリペプチドの機能が続く）：
本発明の特定の実施形態では、硫酸／チオ硫酸インポーターとチオ硫酸塩特異的システインシンターゼをコードするオペロンｃｙｓＰＵＷＡＭ、および／または亜硫酸レダクターゼとＰＡＰＳレダクターゼをコードするオペロンｃｙｓＪＩＨの発現が増加される。コリネバクテリウムでは、ｃｙｓＡ、ｃｙｓＴ、ｃｙＩおよびｃｙｓＪの発現が増加されるのが好ましい。
本発明の別の特定の実施形態では、オペロンｇｃｖＴＨＰの発現および／またはグリシン切断複合体をコードする遺伝子ｌｐｄが増加される。グリシン切断複合体は、おそらくは合成遺伝子としてのコリネバクテリウム・ジェケイウム(Corynebacterium jekeium)由来の遺伝子ｇｃｖＴＨＰを導入することにより、コリネバクテリウム・グルタミクムに導入し、過剰発現させることができる。
本発明の別の特定の実施形態では、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣまたはｇｌｙＡなど、グリシンの生産に関与する少なくとも１つの遺伝子が過剰発現される。
本発明の別の実施形態では、メチオニン生産を促進するために、メチオニン生合成の代謝経路に関与する酵素を過剰発現させるか、またはそれらの活性を増加させることができる。特に、このような酵素をコードする以下の遺伝子の少なくとも１つを過剰発現させることができる。
・ｍｅｔＦ １７９０３７７ Ｃｇｌ２１７１ ５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ
・ＷＯ２００５／１０８５６に記載されているようにＳ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減されているホモセリンスクシニルトランスフェラーゼをコードするｍｅｔ Ａ（１７９０４４３）対立遺伝子、またはコリネバクテリウム・グルタミクムの場合には遺伝子ｍｅｔＸ Ｃｇｌ０６５２
・トレオニンに対するフィードバック阻害が低減されたアスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするｔｈｒＡまたはｔｈｒＡ（１７８６１８３）対立遺伝子
・コリネバクテリウム・グルタミクムの場合には、ＷＯ２００７／０１２０７８に記載のように潜在的にフィードバック耐性であるａｓｐおよびｈｏｍが過剰発現され得る
・ｍｅｔＨ １７９０４５０ Ｃｇｌ１５０７ Ｂ１２依存性ホモシステイン−Ｎ５−メチルテトラヒドロ葉酸トランスメチラーゼ
・ＣｙｓＥ １７９００３５ Ｃｇｌ２５６３ セリンアセチルトランスフェラーゼ
・ｍｅｔＦ １７９０３７７ Ｃｇｌ２１７１ ５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ
・ＷＯ２００５／１０８５６に記載されているようにＳ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減されているホモセリンスクシニルトランスフェラーゼをコードするｍｅｔ Ａ（１７９０４４３）対立遺伝子、またはコリネバクテリウム・グルタミクムの場合には遺伝子ｍｅｔＸ Ｃｇｌ０６５２
・トレオニンに対するフィードバック阻害が低減されたアスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするｔｈｒＡまたはｔｈｒＡ（１７８６１８３）対立遺伝子
・コリネバクテリウム・グルタミクムの場合には、ＷＯ２００７／０１２０７８に記載のように潜在的にフィードバック耐性であるａｓｐおよびｈｏｍが過剰発現され得る
・ｍｅｔＨ １７９０４５０ Ｃｇｌ１５０７ Ｂ１２依存性ホモシステイン−Ｎ５−メチルテトラヒドロ葉酸トランスメチラーゼ
・ＣｙｓＥ １７９００３５ Ｃｇｌ２５６３ セリンアセチルトランスフェラーゼ
Ｃ．グルタミクムにおけるｍｅｔＹ（Ｃｇｌ０６５３）の過剰発現は、遺伝子ａｅｃＤ／ｍｅｔＢ（Ｃｇｌ２３０９／Ｃｇｌ２４４６）とともに、または伴わずに意図することができる。
ｍｅｔＦおよびｍｅｔＨの過剰発現は、引用することにより本願の一部とされるＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００７／０１２０７８に示唆されている。この文献において発明者らは、ｍｅｔＦのメッセンジャーＲＮＡを安定化するエレメントを用いたｍｅｔＦのいっそうさらなる過剰発現がメチオニン生産をさらに増加させたことを証明している。これらの安定化エレメントは通常、ＲＮＡ分解ヌクレアーゼによる作用を軽減するループ構造である(Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64)。
ｍｅｔＦおよびｍｅｔＨの過剰発現は、引用することにより本願の一部とされるＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００７／０１２０７８に示唆されている。この文献において発明者らは、ｍｅｔＦのメッセンジャーＲＮＡを安定化するエレメントを用いたｍｅｔＦのいっそうさらなる過剰発現がメチオニン生産をさらに増加させたことを証明している。これらの安定化エレメントは通常、ＲＮＡ分解ヌクレアーゼによる作用を軽減するループ構造である(Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64)。
その阻害剤ＳＡＭおよびメチオニンに対するフィードバック感受性が低減されているホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ対立遺伝子の過剰発現は、引用することにより本願の一部とされる特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２に記載されている。
ｃｙｓＥの過剰発現は、引用することにより本願の一部とされるＷＯ２００７／０７７０４１に示唆されている。
メチオニンの生産は、引用することにより本願の一部とされる特許出願ＷＯ２００４／０７６６５９に記載されているように、優先的にまたは排他的にＨ２Ｓを用い、従って、Ｏ−スクシニル−ホモセリンからホモシステインを生産する変更されたｍｅｔＢ対立遺伝子を使用することによってさらに増加させることができる。
大腸菌におけるＬ−メチオニン、その前駆体またはそれに由来する化合物の生産のさらなる増加は、特許出願ＪＰ２０００／１５７２６７に示唆されているようにメチオニンレギュロンのダウンレギュレーションを担うリプレッサータンパク質ＭｅｔＪ（ＧｅｎＢａｎｋ １７９０３７３）の遺伝子を減衰または欠失させることによって達成される。コリネバクテリウムでは、ＷＯ２００７／０１２０７８に示されているように、マスター硫黄レギュレーターＭｃｂＲ（ＡＡＰ４５０１０）を欠失させるべきである。
本発明の別の特定の実施形態では、副産物であるイソロイシンの生産が低減される。イソロイシンは、純粋なメチオニンの生産コストを大幅に増大させる大きな問題を伴って初めて分離可能なアミノ酸である。さらに、イソロイシンの生産では、メチオニンの生産に使用できた炭素を消費する。従って、イソロイシンの生産をできる限り低く維持するのが望ましい。
イソロイシンは、トレオニン生合成経路を介するか、またはシステインの不在下でのＯ−スクシニルホモセリンのγ−脱離活性の反応を介して生産される。γ−脱離活性を低減する手段は、引用することにより本願の一部とされる特許出願ＷＯ２００６／０８２２５４およびＷＯ２００７／０７７０４１に記載されている。
大腸菌などの非改変微生物では、イソロイシンの生産は検出レベル（ＨＰＬＣ）に満たない。改変微生物では、その生産量は２％イソロイシンｇ／グルコースに達し得る。培地において回収されるイソロイシンの量は４０ｍＭを超え得る。
本発明者らは、セリン生合成に関与する以下の遺伝子のうち少なくとも１つの過剰発現がまたイソロイシンの生産も低減することを示した。
本発明のさらに特定の実施形態では、本発明者らは、増強されたｓｅｒＡ、ｓｅｒＢおよび／またはｓｅｒＣの発現が副産物イソロイシンの生産を低減することを証明した。
本発明の別の特定の実施形態では、副産物ホモランチオニンの生産が低減される。ホモランチオニンは、活性化されたホモセリンとホモシステインから生産されるアミノ酸である(Kromer et al (2006) J Bacteriol 188, 609-18;およびＢＡＳＦによる特許出願ＷＯ２００７／０５１７２５）。ホモランチオニンは、純粋なメチオニンの生産コストを大幅に増大させる大きな問題を伴って初めて分離可能なアミノ酸である。さらにホモランチオニンは２つのアスパラギン酸に由来するホモセリン分子と還元型硫黄分子を含んでなり、これらは総て、メチオニンへ変換されれば、メチオニン／炭素源収量を増大させることができる。よって、ホモランチオニンの生産はできる限り低く維持され、使用される前駆体がメチオニンへ変換されることが望ましい。ＰＣＴ出願ＷＯ２００７／０５１７２５は、ホモランチオニンの生産を低減するためのいくつかの手段を提案している。発明者らは、ホモランチオニンの生産を低減すると同時に、基質であるホモシステインをメチオニンへ変換することができる他の手段を見出した。ホモシステインをメチオニンへ特異的に変換する手段としては、ｐｕｒＵ遺伝子によりコードされているホルミル−ＴＨＦデホルミラーゼ活性の減衰、ｍｅｔＦ遺伝子によりコードされているメチレン−ＴＨＦレダクターゼ活性の過剰発現、ｐｙｋＡおよび／またはｐｙｋＦ遺伝子の発現の減衰、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢもしくはｓｅｒＣの過剰発現、またはｌｐｄ遺伝子の過剰発現である。
Ｌ−メチオニン、その前駆体またはそれに由来する化合物の発酵生産に用いる硫黄源は下記のいずれであってもよい：硫酸塩、チオ硫酸塩、硫化水素、ジチオン酸塩、亜ジチオン酸塩、亜硫酸塩またはそれらの組合せ。本発明の好ましい実施形態では、硫黄源は硫酸塩および／またはチオ硫酸塩である。
好ましい炭素源として、本発明者らはグルコースまたはスクロースを推奨する。
本発明はまた、Ｌ−メチオニン、その前駆体またはそれに由来する化合物を生産するための方法であって、上記のメチオニン生産微生物の発酵、メチオニン、その前駆体または誘導体の濃縮、および発酵液の目的生成物の単離を含む方法に関する。
当業者ならば、本発明による微生物のための培養条件を定義することができる。特に、細菌は、Ｃ．グルタミクムでは２０℃〜５５℃の間、好適には２５℃〜４０℃の間、より具体的には約３０℃、大腸菌では約３７℃の温度で発酵される。
発酵は一般に、用いる細菌に適合された既知の定義組成の無機培養培地（少なくとも１種類の単純炭素源と、所望により代謝産物の生産に必要な補助基質を含有）を用いた発酵槽で行う。
特に、大腸菌用の無機培養培地はＭ９培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)、Ｍ６３培地(Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New YorkまたはSchaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96)により定義されているような培地と同一または類似の組成であり得る。
同様に、Ｃ．グルタミクム用の無機培養培地はＢＭＣＧ培地(Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210)またはRiedel et al. (2001, J. MoI. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583)により記載されているような培地と同一または類似の組成であり得る。培地には突然変異によって導入された栄養要求性を補償するための添加を行うことができる。
発酵後、Ｌ−メチオニン、その前駆体またはそれに由来する化合物を回収し、必要であれば精製する。培養培地におけるメチオニンおよびＮ−アセチル−メチオニンなどの生産された化合物の回収および精製のための方法は当業者によく知られている。
所望により、発酵産物の精製の際には、０〜１００％、好適には少なくとも９０％、より好適には９５％、いっそうより好適には少なくとも９９％のバイオマスが保持され得る。所望により、メチオニン誘導体であるＮ−アセチル−メチオニンは、メチオニンを回収する前に脱アシル化によりメチオニンへ変換する。
本発明はまた、メチオニンの発酵生産のために至適化され（すなわち、非改変微生物に比べて改良されたメチオニン／炭素源収量を有する）、かつ、上記の遺伝的改変を含む微生物に関する。
発明の詳細な説明
ｍｅｔＪ遺伝子によりコードされているメチオニンリプレッサーがクロラムフェニコールカセット（ΔｍｅｔＪ：：Ｃｍ）で置換され、かつ、メチオニンおよびＳＡＭに対するフィードバック感受性が低減されているｍｅｔＡ対立遺伝子（ｍｅｔＡ＊１１）を担持する大腸菌株は、２００４年５月１２日に出願されたＰＣＴ ＷＯ２００５１０８５６１に記載されている。染色体中の構造遺伝子の上流に組み込まれた人工プロモーターからの遺伝子ｍｅｔＦおよびｍｅｔＨ（Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ、Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ）の過剰発現が特許出願ＷＯ２００７／０７７０４１に記載されている。この文献にはまた、トレオニンに対するフィードバック阻害が低減されているアスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｔｈｒＡ＊）の過剰発現ならびにプラスミドｐＭＥ１０１からのセリンアセチル−トランスフェラーゼ（ｃｙｓＥ）およびｍｅｔＡ＊１１の過剰発現も記載されている。上記の特許出願に記載されている総ての改変を有する株（本願では株１と呼ぶ）は、遺伝子型ΔｍｅｔＪ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１）を有する。下記の後続構築物は総て、これらの構築物に基づくものである。
ｍｅｔＪ遺伝子によりコードされているメチオニンリプレッサーがクロラムフェニコールカセット（ΔｍｅｔＪ：：Ｃｍ）で置換され、かつ、メチオニンおよびＳＡＭに対するフィードバック感受性が低減されているｍｅｔＡ対立遺伝子（ｍｅｔＡ＊１１）を担持する大腸菌株は、２００４年５月１２日に出願されたＰＣＴ ＷＯ２００５１０８５６１に記載されている。染色体中の構造遺伝子の上流に組み込まれた人工プロモーターからの遺伝子ｍｅｔＦおよびｍｅｔＨ（Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ、Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ）の過剰発現が特許出願ＷＯ２００７／０７７０４１に記載されている。この文献にはまた、トレオニンに対するフィードバック阻害が低減されているアスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｔｈｒＡ＊）の過剰発現ならびにプラスミドｐＭＥ１０１からのセリンアセチル−トランスフェラーゼ（ｃｙｓＥ）およびｍｅｔＡ＊１１の過剰発現も記載されている。上記の特許出願に記載されている総ての改変を有する株（本願では株１と呼ぶ）は、遺伝子型ΔｍｅｔＪ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１）を有する。下記の後続構築物は総て、これらの構築物に基づくものである。
オペロンｃｙｓＰＵＷＡＭ、ｃｙｓＪＩＨ、ｇｃｖＴＨＰと遺伝子ｍｅｔＦ、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＣ、ｓｅｒＢ、ｇｌｙＡおよびｌｐｄを過剰発現する株ならびに遺伝子ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦおよびｐｕｒＵの欠失を有する株の構築
ｍｅｔＦを除く総ての構築物は、まず大腸菌株ＭＧ１６５５にて作製した後、形質導入により最終的な株に導入した。
ｍｅｔＦを除く総ての構築物は、まず大腸菌株ＭＧ１６５５にて作製した後、形質導入により最終的な株に導入した。
ＭＧ１６５５ Ｐｔｒｃ−ｃｙｓＰＵＷＡＭの構築
オペロンｃｙｓＰＵＷＡＭを異種Ｐｔｒｃプロモーターの制御下に置くために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略により、着目する遺伝子の上流にクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを異種プロモーターとともに挿入することができる。この目的で、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
Ｐｔｒｃ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ Ｆ（配列番号１）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・遺伝子ｃｙｓＰの配列（２５４１５１２〜２５４１５７８）に相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
・−３５〜−１０のボックス（下線）を有するｔｒｃプロモーター配列の領域（斜体の大文字）
Ｐｔｒｃ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ Ｒ（配列番号２）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・遺伝子ｃｙｓＰの上流領域の配列（２５４１６４４〜２５４１５７８）に相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
・バクテリオファージＴ７ターミネーター配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｖ０１１４６）の領域（斜体下線の大文字）
オペロンｃｙｓＰＵＷＡＭを異種Ｐｔｒｃプロモーターの制御下に置くために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略により、着目する遺伝子の上流にクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを異種プロモーターとともに挿入することができる。この目的で、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
Ｐｔｒｃ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ Ｆ（配列番号１）
・遺伝子ｃｙｓＰの配列（２５４１５１２〜２５４１５７８）に相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
・−３５〜−１０のボックス（下線）を有するｔｒｃプロモーター配列の領域（斜体の大文字）
Ｐｔｒｃ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ Ｒ（配列番号２）
・遺伝子ｃｙｓＰの上流領域の配列（２５４１６４４〜２５４１５７８）に相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
・バクテリオファージＴ７ターミネーター配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｖ０１１４６）の領域（斜体下線の大文字）
オリゴヌクレオチドＰｔｒｃ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ ＦおよびＰｔｒｃ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ Ｒを用いて、プラスミドｐＫＤ３からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅した。次に、得られたＰＣＲ産物を、エレクトロポレーションによって株ＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）に導入した。この株では、Ｒｅｄレコンビナーゼ酵素を発現させ、相同組換えを可能とした。次に、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、以下に示されるオリゴヌクレオチドＰｔｒｃ−ｃｙｓＰＵＷＡＭＲｖおよびＰｔｒｃ−ｃｙｓＰＵＷＡＭＦｖを用いたＰＣＲ分析によって、耐性カセットの挿入を確認した。得られた株をＭＧ１６５５ Ｐｔｒｃ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ：Ｃｍと呼称した。
Ｐｔｒｃ−ｃｙｓＰＵＷＡＭＲｖ（配列番号３）：GCAGGATTTGTACGTCGGTCACC（２５４１２６０〜２５４１２８２の配列と相同）
Ｐｔｒｃ−ｃｙｓＰＵＷＡＭＦｖ（配列番号４）：cgtcttgaactaagttcaccaggc（２５４１８１２〜２５４１７８９の配列と相同）
Ｐｔｒｃ−ｃｙｓＰＵＷＡＭＲｖ（配列番号３）：GCAGGATTTGTACGTCGGTCACC（２５４１２６０〜２５４１２８２の配列と相同）
Ｐｔｒｃ−ｃｙｓＰＵＷＡＭＦｖ（配列番号４）：cgtcttgaactaagttcaccaggc（２５４１８１２〜２５４１７８９の配列と相同）
ＭＧ１６５５ Ｐｔｒｃ−ｃｙｓＪＩＨの構築
オペロンｃｙｓＪＩＨを異種Ｐｔｒｃプロモーターの制御下に置くために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略により、着目する遺伝子の上流にクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを異種プロモーターとともに挿入することができる。この目的で、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ Ｒ（配列番号５）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・遺伝子ｃｙｓＪの配列（２８８９９３５〜２８８９９８７）に相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
・−３５〜−１０のボックス（下線）を有するｔｒｃプロモーター配列の領域（斜体の大文字）
ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ Ｆ（配列番号６）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・遺伝子ｃｙｓＪの上流領域の配列（２８９００４７〜２８８９９８８）に相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
・バクテリオファージＴ７ターミネーター配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｖ０１１４６）の領域（斜体下線の大文字）
オペロンｃｙｓＪＩＨを異種Ｐｔｒｃプロモーターの制御下に置くために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略により、着目する遺伝子の上流にクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを異種プロモーターとともに挿入することができる。この目的で、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ Ｒ（配列番号５）
・遺伝子ｃｙｓＪの配列（２８８９９３５〜２８８９９８７）に相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
・−３５〜−１０のボックス（下線）を有するｔｒｃプロモーター配列の領域（斜体の大文字）
ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ Ｆ（配列番号６）
・遺伝子ｃｙｓＪの上流領域の配列（２８９００４７〜２８８９９８８）に相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
・バクテリオファージＴ７ターミネーター配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｖ０１１４６）の領域（斜体下線の大文字）
オリゴヌクレオチドＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ ＦおよびＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ Ｒを用いて、プラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅した。次に、得られたＰＣＲ産物を、エレクトロポレーションによって株ＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）に導入した。この株では、Ｒｅｄレコンビナーゼ酵素を発現させ、相同組換えを可能とした。次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、以下に示されるオリゴヌクレオチドＰｔｒｃ−ｃｙｓＪＩＨＦｖおよびＰｔｒｃ−ｃｙｓＪＩＨＲｖを用いたＰＣＲ分析によって、耐性カセットの挿入を確認した。得られた株をＭＧ１６５５ Ｐｔｒｃ−ｃｙｓＪＩＨ：Ｋｍと呼称した。
Ｐｔｒｃ−ｃｙｓＪＩＨＦｖ（配列番号７）：GCAGTTCGACAAGTTCTTTCACC（２８８９０４２〜２８８９０６４の配列と相同）
Ｐｔｒｃ−ｃｙｓＪＩＨＲｖ（配列番号８）：CCAGAACACAACACCCTAACATAGCG（２８９０６６３〜２８９０６３８の配列と相同）
Ｐｔｒｃ−ｃｙｓＪＩＨＦｖ（配列番号７）：GCAGTTCGACAAGTTCTTTCACC（２８８９０４２〜２８８９０６４の配列と相同）
Ｐｔｒｃ−ｃｙｓＪＩＨＲｖ（配列番号８）：CCAGAACACAACACCCTAACATAGCG（２８９０６６３〜２８９０６３８の配列と相同）
ＭＧ１６５５ Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰの構築
オペロンｇｃｖＴＨＰを異種Ｐｔｒｃプロモーターの制御下に置くために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略により、着目する遺伝子の上流にクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを異種プロモーターとともに挿入することができる。この目的で、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
Ｐｔｒｃ−ｇｃｖＴＨＰ Ｆ（配列番号９）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・遺伝子ｇｃｖＴの配列（３０４８６３０〜３０４８６８７）に相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
・−３５〜−１０のボックス（下線）を有するｔｒｃプロモーター配列の領域（斜体の大文字）
Ｐｔｒｃ−ｇｃｖＴＨＰ Ｒ（配列番号１０）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・遺伝子ｇｃｖＴの上流領域の配列（３０４８８８７〜３０４８８３０）に相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
オペロンｇｃｖＴＨＰを異種Ｐｔｒｃプロモーターの制御下に置くために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略により、着目する遺伝子の上流にクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを異種プロモーターとともに挿入することができる。この目的で、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
Ｐｔｒｃ−ｇｃｖＴＨＰ Ｆ（配列番号９）
・遺伝子ｇｃｖＴの配列（３０４８６３０〜３０４８６８７）に相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
・−３５〜−１０のボックス（下線）を有するｔｒｃプロモーター配列の領域（斜体の大文字）
Ｐｔｒｃ−ｇｃｖＴＨＰ Ｒ（配列番号１０）
・遺伝子ｇｃｖＴの上流領域の配列（３０４８８８７〜３０４８８３０）に相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
オリゴヌクレオチドＰｔｒｃ−ｇｃｖＴＨＰ ＦおよびＰｔｒｃ−ｇｃｖＴＨＰ Ｒを用いて、プラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅した。次に、得られたＰＣＲ産物を、エレクトロポレーションによって株ＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）に導入した。この株では、Ｒｅｄレコンビナーゼ酵素を発現させ、相同組換えを可能とした。次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、以下に示されるオリゴヌクレオチドＰｔｒｃ−ｇｃｖＴＨＰ Ｆ２およびＰｔｒｃ−ｇｃｖＴＨＰ Ｒ２を用いたＰＣＲ分析によって、耐性カセットの挿入を確認した。得られた株をＭＧ１６５５ Ｐｔｒｃ−ｇｃｖＴＨＰ：Ｋｍと呼称した。
Ｐｔｒｃ−ｇｃｖＴＨＰ Ｆ２（配列番号１１）：CTATCACACCGCCAGAGGCATTC（３０４８３９９〜３０４８４２１の配列と相同）
Ｐｔｒｃ−ｇｃｖＴＨＰ Ｒ２（配列番号１２）：CCCATCACACTTTCATCTCCCG（３０４９１０６〜３０４９０８５の配列と相同）
Ｐｔｒｃ−ｇｃｖＴＨＰ Ｆ２（配列番号１１）：CTATCACACCGCCAGAGGCATTC（３０４８３９９〜３０４８４２１の配列と相同）
Ｐｔｒｃ−ｇｃｖＴＨＰ Ｒ２（配列番号１２）：CCCATCACACTTTCATCTCCCG（３０４９１０６〜３０４９０８５の配列と相同）
ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＡの構築
ｐｙｋＡ遺伝子を欠失させるため、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略により、着目する遺伝子へクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することができる。この目的で、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ＤｐｙｋＡ Ｆ（配列番号１３）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・ｐｙｋＡ領域の配列（１９３５７５６〜１９３５８３８）に相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
ＤｐｙｋＡ Ｒ（配列番号１４）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・ｐｙｋＡ領域の配列（１９３７１３５〜１９３７０５５）に相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
ｐｙｋＡ遺伝子を欠失させるため、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略により、着目する遺伝子へクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することができる。この目的で、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ＤｐｙｋＡ Ｆ（配列番号１３）
・ｐｙｋＡ領域の配列（１９３５７５６〜１９３５８３８）に相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
ＤｐｙｋＡ Ｒ（配列番号１４）
・ｐｙｋＡ領域の配列（１９３７１３５〜１９３７０５５）に相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
オリゴヌクレオチドＤｐｙｋＡ ＦおよびＤｐｙｋＡ Ｒを用いて、プラスミドｐＫＤ３からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅した。次に、得られたＰＣＲ産物を、エレクトロポレーションによって株ＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）に導入した。この株では、Ｒｅｄレコンビナーゼ酵素を発現させ、相同組換えを可能とした。次に、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、以下に示されるオリゴヌクレオチドｐｙｋＡ ＦおよびｐｙｋＡ Ｒを用いたＰＣＲ分析によって、耐性カセットの挿入を確認した。得られた株をＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＡ：：Ｃｍと呼称した。
ＰｙｋＡ Ｆ（配列番号１５）：ggcaattaccctcgacgtaccgg（１９３５３３８〜１９３５３６０の配列と相同）
ＰｙＫＡ Ｒ（配列番号１６）：ccgcctctaacagatcatccatcgg（１９３５４０１〜１９３７４２５の配列と相同）
ＰｙｋＡ Ｆ（配列番号１５）：ggcaattaccctcgacgtaccgg（１９３５３３８〜１９３５３６０の配列と相同）
ＰｙＫＡ Ｒ（配列番号１６）：ccgcctctaacagatcatccatcgg（１９３５４０１〜１９３７４２５の配列と相同）
ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦの構築
ｐｙｋＦ遺伝子を欠失させるため、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略により、着目する遺伝子へクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することができる。この目的で、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ＤｐｙｋＦ Ｆ（配列番号１７）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・ｐｙｋＦ領域の配列（１７５３６８９〜１７５３７６７）に相同な領域（小文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
ＤｐｙｋＦ Ｒ（配列番号１８）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・ｐｙｋＦ領域の配列（１７５５１２９〜１７５５０５１）に相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
ｐｙｋＦ遺伝子を欠失させるため、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略により、着目する遺伝子へクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することができる。この目的で、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ＤｐｙｋＦ Ｆ（配列番号１７）
・ｐｙｋＦ領域の配列（１７５３６８９〜１７５３７６７）に相同な領域（小文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
ＤｐｙｋＦ Ｒ（配列番号１８）
・ｐｙｋＦ領域の配列（１７５５１２９〜１７５５０５１）に相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
オリゴヌクレオチドＤｐｙｋＦ ＦおよびＤｐｙｋＦ Ｒを用いて、プラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅した。次に、得られたＰＣＲ産物を、エレクトロポレーションによって株ＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）に導入した。この株では、Ｒｅｄレコンビナーゼ酵素を発現させ、相同組換えを可能とした。次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、以下に示されるオリゴヌクレオチドｐｙｋＦ ＦおよびｐｙｋＦ Ｒを用いたＰＣＲ分析によって、耐性カセットの挿入を確認した。得られた株をＭＧ１６５５ ＤｐｙｋＦ：：ｋｍと呼称した。
ＰｙｋＦ Ｆ（配列番号１９）：gcgtaaccttttccctggaacg（１７５３３７１〜１７５３３９２の配列と相同）
ＰｙｋＦ Ｒ（配列番号２０）：gcgttgctggagcaacctgccagc（１７５５５１８〜１７５５４９５の配列と相同）
ＰｙｋＦ Ｆ（配列番号１９）：gcgtaaccttttccctggaacg（１７５３３７１〜１７５３３９２の配列と相同）
ＰｙｋＦ Ｒ（配列番号２０）：gcgttgctggagcaacctgccagc（１７５５５１８〜１７５５４９５の配列と相同）
ＭＧ１６５５ ΔｐｕｒＵの構築
ｐｕｒＵ遺伝子を欠失させるため、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略により、着目する遺伝子へクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することができる。この目的で、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ＤｐｕｒＵ Ｆ（配列番号２１）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・ｐｕｒＵ領域の配列（１２８７９２９〜１２８７８４９）に相同な領域（小文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
ＤｐｕｒＵ Ｒ（配列番号２２）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・ｐｕｒＵ領域の配列（１２８６９４８〜１２８７０２８）に相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
ｐｕｒＵ遺伝子を欠失させるため、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略により、着目する遺伝子へクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することができる。この目的で、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ＤｐｕｒＵ Ｆ（配列番号２１）
・ｐｕｒＵ領域の配列（１２８７９２９〜１２８７８４９）に相同な領域（小文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
ＤｐｕｒＵ Ｒ（配列番号２２）
・ｐｕｒＵ領域の配列（１２８６９４８〜１２８７０２８）に相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
オリゴヌクレオチドＤｐｕｒＵ ＦおよびＤｐｕｒＵ Ｒを用いて、プラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅した。次に、得られたＰＣＲ産物を、エレクトロポレーションによって株ＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）に導入した。この株では、Ｒｅｄレコンビナーゼ酵素を発現させ、相同組換えを可能とした。次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、以下に示されるオリゴヌクレオチドｐｕｒＵ ＦおよびｐｕｒＵ Ｒを用いたＰＣＲ分析によって、耐性カセットの挿入を確認した。得られた株をＭＧ１６５５ ＤｐｕｒＵ：：Ｋｍと呼称した。
ＰｕｒＵ Ｆ（配列番号２３）：ggaatgcaatcgtagccacatcgc（１２８８４２４〜１２８８４４７の配列と相同）
ＰｕｒＵ Ｒ（配列番号２４）：gcggattcgttgggaagttcaggg（１２８６１２９〜１２８６４５２の配列と相同）
ＰｕｒＵ Ｆ（配列番号２３）：ggaatgcaatcgtagccacatcgc（１２８８４２４〜１２８８４４７の配列と相同）
ＰｕｒＵ Ｒ（配列番号２４）：gcggattcgttgggaagttcaggg（１２８６１２９〜１２８６４５２の配列と相同）
ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣの構築
ｓｅｒＡおよびｓｅｒＣ遺伝子の発現を増大させるために、それらの適切なプロモーターを用い、コピー制御ベクターｐＣＣ１ＢＡＣ(Epicentre)から酵素を発現させることにより、メチオニン生産細胞においてこれら２つの遺伝子の遺伝子量を増大させた。この目的で、まず、オリゴヌクレオチド−ｓｅｒＣ Ｆ（ＸｂａＩ）およびｓｅｒＣ Ｒ（ＨｉｎｄＩＩＩ）を用い、大腸菌ゲノムからｓｅｒＣ遺伝子を増幅した。このＰＣＲ産物を、酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて制限処理し、同じ制限酵素で制限処理したベクターｐＵＣ１８(Stratagene)にクローニングした。得られたベクターをｐＵＣ１８−ｓｅｒＣと呼称した。
ｓｅｒＣ Ｆ（ＸｂａＩ）（配列番号２５）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・遺伝子ｓｅｒＣの配列（９５６６１９〜９５６６４４）と相同な領域（小文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・ＸｂａＩ部位を担持する領域（太字の大文字）
ｓｅｒＣ Ｒ（ＨｉｎｄＩＩＩ）（配列番号２６）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・遺伝子ｓｅｒＣの配列（９５８０２８〜９５８００４）と相同な領域（大文字）
・ＨｉｎｄＩＩＩ部位を担持する領域（太字の大文字）
ｓｅｒＡおよびｓｅｒＣ遺伝子の発現を増大させるために、それらの適切なプロモーターを用い、コピー制御ベクターｐＣＣ１ＢＡＣ(Epicentre)から酵素を発現させることにより、メチオニン生産細胞においてこれら２つの遺伝子の遺伝子量を増大させた。この目的で、まず、オリゴヌクレオチド−ｓｅｒＣ Ｆ（ＸｂａＩ）およびｓｅｒＣ Ｒ（ＨｉｎｄＩＩＩ）を用い、大腸菌ゲノムからｓｅｒＣ遺伝子を増幅した。このＰＣＲ産物を、酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて制限処理し、同じ制限酵素で制限処理したベクターｐＵＣ１８(Stratagene)にクローニングした。得られたベクターをｐＵＣ１８−ｓｅｒＣと呼称した。
ｓｅｒＣ Ｆ（ＸｂａＩ）（配列番号２５）
・遺伝子ｓｅｒＣの配列（９５６６１９〜９５６６４４）と相同な領域（小文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・ＸｂａＩ部位を担持する領域（太字の大文字）
ｓｅｒＣ Ｒ（ＨｉｎｄＩＩＩ）（配列番号２６）
・遺伝子ｓｅｒＣの配列（９５８０２８〜９５８００４）と相同な領域（大文字）
・ＨｉｎｄＩＩＩ部位を担持する領域（太字の大文字）
次に、オリゴヌクレオチドｓｅｒＡ Ｆ（ＸｂａＩ）およびｓｅｒＡ Ｒ（ＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）を用い、ｓｅｒＡ遺伝子を大腸菌ゲノムから増幅した。このＰＣＲ産物を、酵素ＸｂａＩおよびＳｍａＩを用いて制限処理し、同じ制限酵素で制限処理したベクターｐＵＣ１８−ｓｅｒＣにクローニングした。得られたベクターを配列決定により確認し、ｐＵＣ１８−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣと呼称した。
ｓｅｒＡ Ｆ（ＸｂａＩ）（配列番号２７）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・遺伝子ｓｅｒＡの配列（３０５５１９８〜３０５５２１８）と相同な領域（小文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・ＸｂａＩ部位を担持する領域（大文字）
ｓｅｒＡ Ｒ（ＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）（配列番号２８）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・遺伝子ｓｅｒＡの配列（３０５６８７８〜３０５６８５９）と相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・ＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を担持する領域（太字）
ｓｅｒＡ Ｆ（ＸｂａＩ）（配列番号２７）
・遺伝子ｓｅｒＡの配列（３０５５１９８〜３０５５２１８）と相同な領域（小文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・ＸｂａＩ部位を担持する領域（大文字）
ｓｅｒＡ Ｒ（ＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）（配列番号２８）
・遺伝子ｓｅｒＡの配列（３０５６８７８〜３０５６８５９）と相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・ＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を担持する領域（太字）
遺伝子ｓｅｒＡおよびｓｅｒＣをコピー制御ベクターｐＣＣ１ＢＡＣに導入するために、ベクターｐＵＣ１８−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣを酵素ＨｉｎｄＩＩＩで制限処理し、ＨｉｎｄＩＩＩクローニングレディｐＣＣ１ＢＡＣ(Epicentre)にクローニングした。得られた構築物を確認し、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣと呼称した。
ベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＢ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣの構築
ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢおよびｓｅｒＣ遺伝子の発現を増大させるために、それらの適切なプロモーターを用い、コピー制御ベクターｐＣＣ１ＢＡＣ(Epicentre)から酵素を発現させることにより、メチオニン生産細胞においてこれら３つの遺伝子の遺伝子量を増大させた。この目的で、オリゴヌクレオチドｓｅｒＢ（ＳｐｈＩ）およびｓｅｒＢ（ＳｍａＩ）を用い、大腸菌ゲノムからｓｅｒＢ遺伝子を増幅した。このＰＣＲ産物を、酵素ＳｐｈＩおよびＳｍａＩを用いて制限処理し、同じ制限酵素で制限処理したベクターｐＵＣ１８−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣにクローニングした。得られたベクターをｐＵＣ１８−ｓｅｒＢ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣと呼称した。
ｓｅｒＢ（ＳｐｈＩ））（配列番号２９）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・遺伝子ｓｅｒＢの配列（４６２２３６２〜４６２２３８３）と相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・ＳｐｈＩ部位を担持する領域（下線の大文字）
ｓｅｒＢ（ＳｍａＩ）（配列番号３０）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・遺伝子ｓｅｒＢの配列（４６２３４３３〜４６２３４１２）と相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・ＳｍａＩ部位を担持する領域（下線の大文字）
・バクテリオファージＴ７ターミネーター配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｖ０１１４６）の領域（斜体の大文字）
ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢおよびｓｅｒＣ遺伝子の発現を増大させるために、それらの適切なプロモーターを用い、コピー制御ベクターｐＣＣ１ＢＡＣ(Epicentre)から酵素を発現させることにより、メチオニン生産細胞においてこれら３つの遺伝子の遺伝子量を増大させた。この目的で、オリゴヌクレオチドｓｅｒＢ（ＳｐｈＩ）およびｓｅｒＢ（ＳｍａＩ）を用い、大腸菌ゲノムからｓｅｒＢ遺伝子を増幅した。このＰＣＲ産物を、酵素ＳｐｈＩおよびＳｍａＩを用いて制限処理し、同じ制限酵素で制限処理したベクターｐＵＣ１８−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣにクローニングした。得られたベクターをｐＵＣ１８−ｓｅｒＢ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣと呼称した。
ｓｅｒＢ（ＳｐｈＩ））（配列番号２９）
・遺伝子ｓｅｒＢの配列（４６２２３６２〜４６２２３８３）と相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・ＳｐｈＩ部位を担持する領域（下線の大文字）
ｓｅｒＢ（ＳｍａＩ）（配列番号３０）
・遺伝子ｓｅｒＢの配列（４６２３４３３〜４６２３４１２）と相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・ＳｍａＩ部位を担持する領域（下線の大文字）
・バクテリオファージＴ７ターミネーター配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｖ０１１４６）の領域（斜体の大文字）
遺伝子ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢおよびｓｅｒＣをコピー制御ベクターｐＣＣ１ＢＡＣに導入するために、ベクターｐＵＣ１８−ｓｅｒＢ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣを酵素ＨｉｎｄＩＩＩで制限処理し、ＨｉｎｄＩＩＩクローニングレディｐＣＣ１ＢＡＣ(Epicentre)にクローニングした。得られた構築物を確認し、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＢ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣと呼称した。
ベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＢ−ｇｌｙＡ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣの構築
ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣおよびｇｌｙＡ遺伝子の発現を増大させるために、それらの適切なプロモーターを用い、コピー制御ベクターｐＣＣ１ＢＡＣ(Epicentre)から酵素を発現させることにより、メチオニン生産細胞においてこれら３つの遺伝子の遺伝子量を増大させた。この目的で、オリゴヌクレオチドＰｇｌｙＡ Ｆ（ＨｉｎｄＩＩＩ）およびｇｌｙＡ Ｒ（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）を用い、大腸菌ゲノムからｇｌｙＡ遺伝子を増幅した。このＰＣＲ産物を、酵素ＨｉｎｄＩＩＩを用いて制限処理し、クレノウ断片で平滑末端化し、制限酵素ＳｍａＩで制限処理したベクターｐＵＣ１８−ｓｅｒＢ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣにクローニングした。得られたベクターをｐＵＣ１８−ｓｅｒＢ−ｇｌｙＡ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣと呼称した。
ＰｇｌｙＡ Ｆ（ＨｉｎｄＩＩＩ）（配列番号３１）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・ｇｌｙＡ領域の配列（２６８３７６０〜２６８３７４２）と相同な領域（太字の大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・ＨｉｎｄＩＩＩ部位を担持する領域（下線の大文字）
ｇｌｙＡ Ｒ（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）（配列番号３２）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・ｇｌｙＡ領域の配列（２６８２０８４〜２６８２０６１）と相同な領域（斜体の大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位を担持する領域（下線の大文字）
ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣおよびｇｌｙＡ遺伝子の発現を増大させるために、それらの適切なプロモーターを用い、コピー制御ベクターｐＣＣ１ＢＡＣ(Epicentre)から酵素を発現させることにより、メチオニン生産細胞においてこれら３つの遺伝子の遺伝子量を増大させた。この目的で、オリゴヌクレオチドＰｇｌｙＡ Ｆ（ＨｉｎｄＩＩＩ）およびｇｌｙＡ Ｒ（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）を用い、大腸菌ゲノムからｇｌｙＡ遺伝子を増幅した。このＰＣＲ産物を、酵素ＨｉｎｄＩＩＩを用いて制限処理し、クレノウ断片で平滑末端化し、制限酵素ＳｍａＩで制限処理したベクターｐＵＣ１８−ｓｅｒＢ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣにクローニングした。得られたベクターをｐＵＣ１８−ｓｅｒＢ−ｇｌｙＡ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣと呼称した。
ＰｇｌｙＡ Ｆ（ＨｉｎｄＩＩＩ）（配列番号３１）
・ｇｌｙＡ領域の配列（２６８３７６０〜２６８３７４２）と相同な領域（太字の大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・ＨｉｎｄＩＩＩ部位を担持する領域（下線の大文字）
ｇｌｙＡ Ｒ（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）（配列番号３２）
・ｇｌｙＡ領域の配列（２６８２０８４〜２６８２０６１）と相同な領域（斜体の大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位を担持する領域（下線の大文字）
遺伝子ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣおよびｇｌｙＡをコピー制御ベクターｐＣＣ１ＢＡＣに導入するために、ベクターｐＵＣ１８−ｓｅｒＢ−ｇｌｙＡ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣを酵素ＨｉｎｄＩＩＩで制限処理し、ＨｉｎｄＩＩＩクローニングレディｐＣＣ１ＢＡＣ(Epicentre)にクローニングした。得られた構築物を確認し、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＢ−ｇｌｙＡ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣと呼称した。
ベクターｐＪＢ１３７−ｌｐｄの構築
ｌｐｄ遺伝子を、オリゴヌクレオチドｌｐｄ Ｆ（ＨｉｎｄＩＩＩ）およびｌｐｄ Ｒ（ＥｃｏＲＩ）を用い、大腸菌ゲノムから増幅した。このＰＣＲ産物を、酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて制限処理し、同じ制限酵素により制限処理したベクターｐＪＢ１３７にクローニングした。得られたベクターをｐＪＢ１３７−ｌｐｄと呼称した。
ｌｐｄ Ｆ（ＨｉｎｄＩＩＩ）（配列番号３３）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・遺伝子ｌｐｄの配列（１２７６４４〜１２７６６８）と相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・ＨｉｎｄＩＩＩ部位を担持する領域（太字の大文字）
ｌｐｄ Ｒ（ＥｃｏＲＩ）（配列番号３４）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・遺伝子ｌｐｄの配列（１２９４０４〜１２９３８０）と相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・ＥｃｏＲＩ部位を担持する領域（太字の大文字）
ｌｐｄ遺伝子を、オリゴヌクレオチドｌｐｄ Ｆ（ＨｉｎｄＩＩＩ）およびｌｐｄ Ｒ（ＥｃｏＲＩ）を用い、大腸菌ゲノムから増幅した。このＰＣＲ産物を、酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて制限処理し、同じ制限酵素により制限処理したベクターｐＪＢ１３７にクローニングした。得られたベクターをｐＪＢ１３７−ｌｐｄと呼称した。
ｌｐｄ Ｆ（ＨｉｎｄＩＩＩ）（配列番号３３）
・遺伝子ｌｐｄの配列（１２７６４４〜１２７６６８）と相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・ＨｉｎｄＩＩＩ部位を担持する領域（太字の大文字）
ｌｐｄ Ｒ（ＥｃｏＲＩ）（配列番号３４）
・遺伝子ｌｐｄの配列（１２９４０４〜１２９３８０）と相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/の参照配列）
・ＥｃｏＲＩ部位を担持する領域（太字の大文字）
得られた構築物を確認し、ｐＪＢ１３７−ｌｐｄと呼称した。
個々の突然変異の株１への組込み
次に、Ｐ１ファージの形質導入および必要であれば耐性カセットの除去によりΔｍｅｔＪ ｍｅｔ Ａ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ株から以下の株を誘導した。構築された株は次の通りである。
Ｐ１の形質導入および抗生物質耐性カセットの除去を介した導入は、ΔｍｅｔＪ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ：：Ｃｍ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ．：Ｋｍ株により例示される。Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ（下記参照）を含有する株を除く他の総ての構築物も同様にして構築した。
次に、Ｐ１ファージの形質導入および必要であれば耐性カセットの除去によりΔｍｅｔＪ ｍｅｔ Ａ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ株から以下の株を誘導した。構築された株は次の通りである。
プロモーター構築物ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ：：ＣｍをＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＪ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ株に導入するために、ファージＰ１形質導入法を用いた。以下に示されるプロトコールを、ＭＧ１６５５ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ：：Ｃｍ株のファージ溶解液の調製とその後のＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＪ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦへの形質導入を含む二段階で行った。
ファージ溶解液Ｐ１の調整：
・１０ｍｌのＬＢ＋Ｋｍ５０μｇ／ｍｌ＋グルコース０．２％＋ＣａＣｌ２ ５ｍＭのＭＧ１６５５ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ：：Ｃｍの一晩培養物１００μｌを植菌する。
・振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートする。
・ＭＧ１６５５株で調製されたファージ溶解液Ｐ１ １００μｌを添加する（約１．１０９ファージ／ｍｌ）
・総ての細胞が溶解するまで３７℃で３時間振盪する。
・２００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
・４５００ｇで１０分間遠心分離して細胞残渣を除去する。
・上清を滅菌試験管に移し、２００μｌのクロロホルムを加える。
・溶解液を４℃で保存する。
・１０ｍｌのＬＢ＋Ｋｍ５０μｇ／ｍｌ＋グルコース０．２％＋ＣａＣｌ２ ５ｍＭのＭＧ１６５５ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ：：Ｃｍの一晩培養物１００μｌを植菌する。
・振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートする。
・ＭＧ１６５５株で調製されたファージ溶解液Ｐ１ １００μｌを添加する（約１．１０９ファージ／ｍｌ）
・総ての細胞が溶解するまで３７℃で３時間振盪する。
・２００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
・４５００ｇで１０分間遠心分離して細胞残渣を除去する。
・上清を滅菌試験管に移し、２００μｌのクロロホルムを加える。
・溶解液を４℃で保存する。
形質導入
・ＬＢ培地中のＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＪ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦの一晩培養物５ｍｌを１５００ｇで１０分間遠心分離する。
・２．５ｍｌの１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５ｍＭ ＣａＣｌ２に細胞ペレットを懸濁させる。
・対照試験管：１００μｌの細胞
１００μｌのファージＰ１ ＭＧ１６５５ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ：：Ｃｍ
・供試試験管：１００μｌの細胞＋１００μｌのファージＰ１ ＭＧ１６５５ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ：：Ｃｍ
・振盪せずに３０℃で３０分間インキュベートする。
・各試験管に１００μｌの１Ｍクエン酸ナトリウムを加え、ボルテックスにかける。
・１ｍｌのＬＢを加える。
・振盪しながら３７℃で１時間インキュベートする。
・試験管を７０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、ＬＢ＋Ｃｍ ５０μｇ／ｍｌのディッシュに拡げる。
・３７℃で一晩インキュベートする。
・ＬＢ培地中のＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＪ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦの一晩培養物５ｍｌを１５００ｇで１０分間遠心分離する。
・２．５ｍｌの１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５ｍＭ ＣａＣｌ２に細胞ペレットを懸濁させる。
・対照試験管：１００μｌの細胞
１００μｌのファージＰ１ ＭＧ１６５５ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ：：Ｃｍ
・供試試験管：１００μｌの細胞＋１００μｌのファージＰ１ ＭＧ１６５５ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ：：Ｃｍ
・振盪せずに３０℃で３０分間インキュベートする。
・各試験管に１００μｌの１Ｍクエン酸ナトリウムを加え、ボルテックスにかける。
・１ｍｌのＬＢを加える。
・振盪しながら３７℃で１時間インキュベートする。
・試験管を７０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、ＬＢ＋Ｃｍ ５０μｇ／ｍｌのディッシュに拡げる。
・３７℃で一晩インキュベートする。
株の確認
クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、プロモーター構築物ＭＧ１６５５ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ：：Ｃｍの存在を、ＭＧ１６５５ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ：：Ｃｍ株の確認に関して上記されているオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により確認した。得られた株をΔｍｅｔＪ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ：：Ｃｍと呼称した。次に、ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ対立遺伝子を、上記のようなＰ１形質導入手順を用いて導入した。得られた株をΔｍｅｔＪ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ：：Ｃｍ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ：：Ｋｍと呼称した。
クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、プロモーター構築物ＭＧ１６５５ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ：：Ｃｍの存在を、ＭＧ１６５５ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ：：Ｃｍ株の確認に関して上記されているオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により確認した。得られた株をΔｍｅｔＪ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ：：Ｃｍと呼称した。次に、ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ対立遺伝子を、上記のようなＰ１形質導入手順を用いて導入した。得られた株をΔｍｅｔＪ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ：：Ｃｍ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ：：Ｋｍと呼称した。
ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦの欠失を導入するため、ＤｍｅｔＪ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ：：Ｃｍ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ：：Ｋｍ株から耐性カセットを除去した。
この目的で、耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するＦＬＰリコンビナーゼを有するプラスミドｐＣＰ２０をエレクトロポレーションによって組換え株に導入した。４２℃で一連の培養を行った後、これら２つのカセットの欠損をＰＣＲ分析により確認した。得られた株をΔｍｅｔＪ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨと呼称した。次いで、ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦ対立遺伝子の欠失をＰ１形質導入により導入することができる。同様に、ｐｕｒＵ遺伝子およびグリシン切断複合体過剰発現構築物Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰの欠失も、対応するカセットの除去の後に導入した。
近接しているため、構築物Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦはＰ１形質導入によって導入することができず、ＰＣＲによる導入によって構築した。
この目的で、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略により、着目する遺伝子の近傍にクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを導入することができる。この目的で以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ−ｍｅｔＦ（配列番号３５）
太字の大文字：リボソーム結合部位および−１０領域
小文字：ＲＮＡ安定化配列
斜体の大文字：Ｐｔｒｃプロモーターの部分
Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ Ｆ（配列番号３６）
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する。
・遺伝子ｍｅｔＦ領域の配列（４１３０１１４〜４１３０１９５）と相同な領域（小文字）（ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/の参照配列）
・バクテリオファージＴ７末端の配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｖ０１１４６）と相同な領域（斜体の小文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
ＰＣＲについては、特許出願ＷＯ２００７０７７０４１に記載されているＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ＤｍｅｔＪ：：Ｃｍ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ：：Ｋｍから単離されたＤＮＡを基質として用いた。
Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ−ｍｅｔＦ（配列番号３５）
小文字：ＲＮＡ安定化配列
斜体の大文字：Ｐｔｒｃプロモーターの部分
Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ Ｆ（配列番号３６）
・遺伝子ｍｅｔＦ領域の配列（４１３０１１４〜４１３０１９５）と相同な領域（小文字）（ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/の参照配列）
・バクテリオファージＴ７末端の配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｖ０１１４６）と相同な領域（斜体の小文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）
ＰＣＲについては、特許出願ＷＯ２００７０７７０４１に記載されているＭＧ１６５５ ｍｅｔＡ＊１１ ＤｍｅｔＪ：：Ｃｍ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ：：Ｋｍから単離されたＤＮＡを基質として用いた。
オリゴヌクレオチドＰｔｒｃ−ｍｅｔＦ ＦおよびＰｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ−ｍｅｔＦを用いてプラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅した。次に、得られたＰＣＲ産物をエレクトロポレーションによって、ΔｍｅｔＪ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ ΔｐｕｒＵ（ｐＫＤ４６）株に導入した（ここで、発現されるＲｅｄレコンビナーゼ酵素により相同組換えが可能である）。カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、以下に定義されるオリゴヌクレオチドＰｔｒｃ−ｍｅｔＦｖ ＦおよびＰｔｒｃ−ｍｅｔＦｖ Ｒを用いたＰＣＲ分析により確認した。
Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦｖ Ｆ（配列番号３７）：GCCCGGTACTCATGTTTTCGGGTTTATGG（４１２９８６６〜４１２９８９４の配列と相同）
Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦｖ Ｒ（配列番号３８）：CCGTTATTCCAGTAGTCGCGTGCAATGG（４１３０５２４〜４１３０４９７の配列と相同）
Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦｖ Ｆ（配列番号３７）：GCCCGGTACTCATGTTTTCGGGTTTATGG（４１２９８６６〜４１２９８９４の配列と相同）
Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦｖ Ｒ（配列番号３８）：CCGTTATTCCAGTAGTCGCGTGCAATGG（４１３０５２４〜４１３０４９７の配列と相同）
得られた株をΔｍｅｔＪ ｍｅｔＡ＊１１ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ ΔｐｕｒＵ Ｐｔｒｃ３６−ＡＫＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ：Ｋｍと呼称した。
次いで、プラスミド（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１）を上記の株に導入し、次の株を得た。
特定の株にプラスミドｐＪＢ１３７−ｌｐｄ、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＢ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣまたはｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＢ−ｇｌｙＡ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣを導入し、次のものを得た。
メチオニン生産株の評価
生産株をまず、小エルレンマイヤーフラスコで評価した。５．５ｍＬの前培養物を混合培地（２．５ｇ／Ｌグルコースおよび９０％最少培地ＰＣ２１を含む１０％ＬＢ培地（Ｓｉｇｍａ ２５％））中で増殖させ、これを用いて、培地ＰＣ１においてＯＤ６００が０．２となるように５０ｍＬ培養物で植菌を行った。必要に応じて、カナマイシンおよびスペクチノマイシンを５０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコールを３０ｍｇ／Ｌの濃度で加えた。培養物のＯＤ６００が６〜７に達した際に、細胞外アミノ酸を、ＯＰＡ／Ｆｍｏｃ誘導体化後のＨＰＬＣにより定量し、他の関連の代謝産物は、屈折率測定検出を用いたＨＰＬＣ（有機酸およびグルコース）およびシリル化後のＧＣ−ＭＳを用いて分析した。
生産株をまず、小エルレンマイヤーフラスコで評価した。５．５ｍＬの前培養物を混合培地（２．５ｇ／Ｌグルコースおよび９０％最少培地ＰＣ２１を含む１０％ＬＢ培地（Ｓｉｇｍａ ２５％））中で増殖させ、これを用いて、培地ＰＣ１においてＯＤ６００が０．２となるように５０ｍＬ培養物で植菌を行った。必要に応じて、カナマイシンおよびスペクチノマイシンを５０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコールを３０ｍｇ／Ｌの濃度で加えた。培養物のＯＤ６００が６〜７に達した際に、細胞外アミノ酸を、ＯＰＡ／Ｆｍｏｃ誘導体化後のＨＰＬＣにより定量し、他の関連の代謝産物は、屈折率測定検出を用いたＨＰＬＣ（有機酸およびグルコース）およびシリル化後のＧＣ−ＭＳを用いて分析した。
表１：最少培地の組成（ＰＣ１）
表２で分かるように、メチオニン／グルコース収量（Ｙｍｅｔ）はｃｙｓＪＩＨおよびｃｙｓＰＵＷＡＭの過剰発現時に増加する。対立遺伝子ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦをコードするピルビン酸キナーゼの欠失はメチオニン／グルコース収量をさらに増加させることができる。ｐｕｒＵ遺伝子によりコードされているホルミル−ＴＨＦデホルミラーゼの欠失はメチオニン／グルコース収量をさらに促進する。構築物Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦによるｍｅｔＦ遺伝子の付加的なさらなる発現は、より高いメチオニン／グルコース収量を与える。ｓｅｒＡ、ｓｅｒＣおよびｓｅｒＢの過剰発現はメチオニン／グルコース収量をいっそうさらに増加させ、ｇｌｙＡの付加的発現もメチオニン／グルコース収量をさらに増加させる。
表２．上記の株によりバッチ培養で生産されたメチオニン収量（Ｙｍｅｔ）（メチオニンｇ／グルコースｇの％）、ｎ．ｄ．は、測定されず。メチオニン／グルコース収量の厳密な定義については下記参照。ＳＤはＹｍｅｔの標準偏差を示す。＊最終培養物中５ｇ／ｌグルコースで行った試験。
ＣｙｓＭ、ｃｙｓＪＩ、ＰｙｋＡ／Ｆ、ＧｃｖＴＨＰおよびＬｐｄ、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣおよびｇｌｙＡの酵素活性の変化の測定
ＣｙｓＭ、ＣｙｓＪＩ、ＰｙｋＡ／Ｆ、ＧｃｖＴＨＰ、ＳｅｒＡ、ＳｅｒＢ、ＳｅｒＣ、ＧｌｙＡおよびＬｐｄの発現の変化を評価するために、組成物抽出液において対応する酵素の活性を測定した。
ＣｙｓＭ、ＣｙｓＪＩ、ＰｙｋＡ／Ｆ、ＧｃｖＴＨＰ、ＳｅｒＡ、ＳｅｒＢ、ＳｅｒＣ、ＧｌｙＡおよびＬｐｄの発現の変化を評価するために、組成物抽出液において対応する酵素の活性を測定した。
in vitroにおいて酵素活性を決定するため、大腸菌株を上記のような最少培地で培養し、対数増殖中期で採取した。細胞を冷リン酸カリウムバッファーに懸濁し、氷上で音波処理を施した(Branson sonifier、７０Ｗ)。２つの場合（表３のグレーで示されている場合）では、precellys extraction system (Bertin technologies, France)を用いてタンパク質を抽出した。細胞を冷リン酸カリウムバッファーに懸濁し、０．１ｍｍのガラスビーズと混合し、３０秒１回の抽出を行った。遠心分離後、上清中に含まれるタンパク質を定量した(Bradford, 1976)。
スルホシステインシンターゼ活性（ＣｙｓＭ）は、生産されたスルホシステインのＬＣ−ＭＳ定量により評価した。試験のため、２５μｇ／ｍＬのタンパク質を、２５ｍＭのＯ−アセチルセリンと２５ｍＭのチオ硫酸を含有するリン酸カリウムバッファー（０．５Ｍ、ｐＨ６．５）中に置いた。反応は３０℃で１０分間行い、ＬＣ−ＭＳ定量のためにさらなる処理を行った。
亜硫酸レダクターゼ活性（ＣｙｓＪＩ）は、ＮＡＤＰＨの消失によってアッセイした。反応混合物はＴｒｉｓ−ＨＣｌ（０．５Ｍ、ｐＨ７．５）中、１０ｍＭ亜硫酸水素ナトリウムおよび１０ｍＭ ＮＡＤＰＨからなった。３０μＬのタンパク質抽出物を加えることで反応を開始し、温度制御付き分光光度計において３０℃で３４０ｎｍにて３０分間追跡した。ピルビン酸キナーゼ活性（ＰｙｋＡ／Ｆ）の測定のため、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）結合アッセイを行った。１０μＬのタンパク質抽出液を、１０ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＰＥＰ、５０ｍＭ ＡＭＰ、１０ｍＭフルクトース１，６ビスホスフェート、１０ｍＭ ＮＡＤＨおよび１０単位のＬＤＨを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（０．５Ｍ、ｐＨ７．５）に加えた。この反応を温度制御付き分光光度計において３０℃で３４０ｎｍにて３０分間追跡した。
グリシン切断複合体の成分であるＧｃｖＴＨＰの活性は、グリシン脱炭酸反応の際に起こるＣＯ２の生成を測定することによって評価した。反応は、０．５Ｍリン酸カリウムバッファーｐＨ７、２ｍＭリン酸ピリドキサール、２００ｍＭリポアミドおよび１−１４Ｃ−グリシン １Ｍ（５０μＣｉ／ｍＬ）の入った枝付きＷａｒｂｕｒｇフラスコで行った。フラスコの中央のウェルに４００μＬのハイアミンを入れ、反応系全体を３７℃で５分間プレインキュベートした。酵素反応は、２ｍｇのタンパク質を加えることで開始させ、３７℃で行った。この反応を、枝のセプタムから５００μＬの６Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えることにより停止させ、３７℃でさらに１時間インキュベートすることでハイアミンにより１４Ｃ−ＣＯ２を捕捉した。その後、この中央のウェルの液体を除去し、３ｍＬのシンチレーション液に加えた後、シンチレーションカウンターにてＣＰＭを測定した。
メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性（ＭＴＨＦＲ、ＭｅｔＦ）を、放射性脱メチル化メチル担体の誘導体化によって測定した。反応混合物はリン酸カリウム（５０ｍＭ、ｐＨ６．７）、０．０２％ＢＳＡ（３０ｍＭ ＥＤＴＡ中、２％ＢＳＡの溶液）、３７．５μＭ ＦＡＤ、１４０μＭメタジオンおよび３００μＭ ５−１４Ｃ−メチル−ＴＨＦ（９２５ｄｐｍ／ｎｍｏｌ）を含んだ。３７℃で５分間プレインキュベートした後、１００μＬのタンパク質抽出液（タンパク質１μｇ／μＬ）を加えた。反応を３７℃で１５分間行い、酢酸ナトリウム（１Ｍ、ｐＨ４．７）中３ｍｇ／ｍＬのジメドン溶液３００μＬを加えることにより停止させた。次に、この反応溶液を１００℃で２分間インキュベートし、氷上で５分間冷却した。その後、３ｍＬのトルエンを加え、反応溶液を室温にて１５００ｇで５分間遠心分離した。１．５ｍＬの水相を取り、３ｍＬのシンチレーション液に加えた。ＣＰＭをシンチレーションカウンターで測定し、活性を計算した。
Ｌｐｄのリポアミドデヒドロゲナーゼ活性は、電子供与体としてＮＡＤＨを用いるリポアミドの還元に基づいて測定した。ＥＤＴＡ １０ｍＭ、ＮＡＤＨ １ｍＭおよびＮＡＤ＋ ２５ｍＭおよび１μｇのタンパク質抽出物をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（０．５Ｍ、ｐＨ８．０）緩衝溶液に加えた。反応を２００ｍＭのリポアミドを加えることにより開始させ、ＮＡＤＨの消失を温度制御付き分光光度計において３０℃で３４０ｎｍにて３０分間追跡した。
ＳｅｒＡのホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性を、ＮＡＤＨの消失を追跡することによりモニタリングした。３０μＬのタンパク質抽出液を、３６０μＭ ３−Ｐ−ヒドロキシピルビン酸を含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ８．８）溶液に入れた。２００μＭのＮＡＤＨを加えて反応を開始させ、ＮＡＤＨの消失を温度制御付き分光光度計において３０℃で３４０ｎｍにて３０分間追跡した。
ＳｅｒＢタンパク質が持っているホスホセリンホスファターゼ活性を、生成したセリンをＧＣ−ＭＳにより測定することで決定した。反応混合物は、ＴＥＡ−ＨＣＬ（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＭｇＣ１２、１ｍＭ Ｏ−ホスホ−Ｌ−セリンおよび１５μｇのタンパク質を含んだ。この反応物を３７℃でインキュベートし、１０分および３０分の時点で、アセトンを加えることにより停止させ、ＧＣ−ＭＳ定量のためのさらなる処理を行った。
ＳｅｒＣのホスホホセリン(Phosphophoserine)−アミノ−トランスフェラーゼ活性は、このアッセイをグルタミン酸デヒドロゲナーゼと組み合わせることにより測定した。反応混合物はＴｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ８．２）で緩衝させ、３２ｍＭ酢酸アンモニウム、２ｍＭグルタミン酸、２単位のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、２００μＭ ＮＡＤＨを含んだ。反応を３０μＬのタンパク質抽出液を加えることで開始させ、ＮＡＤＨの消失を温度制御付き分光光度計において３０℃で３４０ｎｍにて３０分間追跡した。
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性は、生成したグリシンをＧＣ−ＭＳによりモニタリングすることにより測定した。３０μｇのタンパク質を、リン酸カリウム（５０ｍＭ、ｐＨ７．３）、４００μＭのグルタミン酸テトラヒドプテロイル(tetrahydopteroyl glutamate)、１０ｍＭ Ｌ−セリンおよび５００μＭ ＤＴＴを含有する溶液に加えた。反応を３７℃で１０分間行い、１０分後にアセトンを加えることにより停止させ、ＧＣ−ＭＳ定量のためのさらなる処理を行った。
表３ メチオニン生産株におけるシステインシンターゼＢ（ＣｙｓＭ）、亜硫酸レダクターゼ（ＣｙｓＪＩ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰｙｋＡ／Ｆ）、メチレン−テトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭｅｔＦ）、リポアミドデヒドロゲナーゼ（Ｌｐｄ）、３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡ）、ホスホセリンホスファターゼ(phosphoserine phosphatise)（ＳｅｒＢ）、ホスホセリン−アミノ−トランスフェラーゼ（ＳｅｒＣ）、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＧｌｙＡ）の活性（ｍＵＩ／タンパク質ｍｇ）を示す。ＧｃｖＴＨＰのグリシンデカルボキシラーゼ活性はμＵ／タンパク質ｍｇである。灰色で印された活性はプリセリーズ系で抽出された培養物から得られた。
ＬＱＱ：定量限界；ＮＤ：不決定
ＬＱＱ：定量限界；ＮＤ：不決定
表３から分かるように、構築物ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ、ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰおよびＰｔｒｃ３９−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ、ｐＪＢ１３７−ｌｐｄ、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＢ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣおよびｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＢ−ｇｌｙＡ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣは総て、対応する対立遺伝子に関して改変されていない株に比べて、対応する酵素の活性を増加させる。ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦの欠失はピルビン酸キナーゼ活性の完全な欠損をもたらす。
発酵条件下でのメチオニン生産の確認
実質量の目的代謝産物を生産した株を、次いで、リン酸飢餓を伴う流加戦略を用い、２．５Ｌ発酵槽(Pierre Guerin)での生産条件下で試験した。
実質量の目的代謝産物を生産した株を、次いで、リン酸飢餓を伴う流加戦略を用い、２．５Ｌ発酵槽(Pierre Guerin)での生産条件下で試験した。
前培養培地Ｂ１は、バッチ培地に植菌物とともにリン酸を追加しなくてもいいように５０ｍＭのリン酸のみを含んだ。細胞濃度３０ｇ／Ｌで増殖を停止させるため、無機培地Ｂ２にリン酸を２８．７ｍＭまで加えた。流加培地（Ｆ１およびＦ２）はリン酸不含とした。
要するに、２．５ｇ／Ｌのグルコースを含む１０ｍＬ ＬＢ培地で８時間増殖させた培養物を用いて、最少培地（チオ硫酸アンモニウムを含まず、ＭＯＰＳ ５ｇ／Ｌを含むＢ１）中１２時間前培養物に植菌した。これらのインキュベーションは、３７℃、ロータリーシェーカー（２００ＲＰＭ）にて、５０ｍＬの最少培地（Ｂ１）の入った５００ｍＬのバッフル付きフラスコ内で行った。
３回目の前培養工程は、バイオマス濃度が０．０５ｇ／Ｌになるように１．５ｍＬの濃縮前培養物（５ｇ／Ｌ）を植菌した２００ｍＬの最少培地（Ｂ１）を充填したバイオリアクター(Sixfors)にて行った。前培養温度は３７℃で一定に維持し、ｐＨは、１０％ＮＨ４ＯＨ溶液を用い、６．８の値に自動的に維持した。溶存酸素濃度は、空気供給および／または攪拌により、空気分圧飽和の３０％に絶えず調整した。バッチ培地からグルコースが消費された後、流加を初期流速０．７ｍＬ／ｈで開始し、約２４ｇ／Ｌの最終細胞濃度を得るために、０．１８／ｈの増加率で２４時間、指数関数的に増加させた。
表４ 前培養バッチ無機培地組成（Ｂ１）
表５ 前培養流加無機培地組成（Ｆ１）
表６ 培養バッチ無機培地組成（Ｂ２およびＢ３）
表７ 培養流加培地組成（Ｆ２）
次に、２．５Ｌの発酵槽(Pierre Guerin)に６００ｍＬの最少培地（Ｂ２）を充填し、４５〜６０ｍＬの範囲の前培養容量でバイオマス濃度が２．１ｇ／Ｌとなるように植菌した。
培養温度を３７℃で一定に維持し、ｐＨは、ＮＨ４ＯＨ溶液（ＮＨ４ＯＨは１０％で１０時間、培養終了まで２４％）の自動添加により実施値（６．８）に維持した。バッチ段階での最初の攪拌速度は２００ｒｐｍに設定し、流加段階で最大１０００ｒｐｍに引き上げた。バッチ段階での最初の通気速度は４０ＮＬ／ｈに設定し、流加段階の初めに１００ＮＬ／ｈに引き上げた。溶存酸素濃度は攪拌を高めることで２０〜４０％飽和の間の値、好適には３０％飽和に維持した。
細胞塊が５ｇ／Ｌ付近の濃度に達した際に、流加を初期流速５ｍＬ／ｈで開始した。供給溶液は流速を増しながら（２１時間後には２１ｍＬ／ｈに達した）Ｓ字状に注入した。厳密な供給条件は式：
［式中、Ｑ（ｔ）はバッチ容量６００ｍＬに対する供給流速（ｍＬ／ｈ）であり、ｐ１＝１．１５、ｐ２＝１８．３２、ｐ３＝０．２７０、ｐ４＝５である］
により計算した。
により計算した。
流加２１時間後、細胞濃度は３０ｇ／Ｌに達し、リン酸は培地から枯渇し、細胞はリン酸飢餓状態に入った。この時点で、供給溶液の注入を４時間、３７ｍＬ／ｈの一定値まで高めた。その後、一定流速を１０ｍＬ／ｈに引き下げ、この流速値を流加の終了時まで維持した（５０時間）。
表８ 上記株の流加発酵で得られた最大メチオニン／グルコース収量（ＮＡＭはメチオニン（％ｇ／ｇ）として計上、下記参照）。メチオニン／グルコース収量の厳密な定義については下記参照。
表８から分かるように、ｐｕｒＵ遺伝子の欠失はメチオニン／グルコース収量を有意に増加させる。イソロイシン生産は、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣからｓｅｒＡ ｓｅｒＣを過剰発現させることにより有意に低減される。さらにｓｅｒＢ遺伝子を付加的に発現させると、イソロイシン生産はさらに低下し、メチオニン／グルコース収量が増加する。
メチオニン／グルコース収量（Ｙｍｅｔ）の決定
細胞外のメチオニン濃度はＯＰＡ／ＦＭＯＣ誘導体化後にＨＰＬＣにより定量した。ＮＡＭ濃度および残留グルコース濃度は、屈折率測定検出とともにＨＰＬＣを用いて分析した。メチオニン収量は次のように表した。
細胞外のメチオニン濃度はＯＰＡ／ＦＭＯＣ誘導体化後にＨＰＬＣにより定量した。ＮＡＭ濃度および残留グルコース濃度は、屈折率測定検出とともにＨＰＬＣを用いて分析した。メチオニン収量は次のように表した。
バッチ培養：
初期培養容量と最終培養容量を測定するために、エルレンマイヤーフラスコを、空で、また培地を含んだ状態で、また培養の終了時で秤量した。メチオニン収量は次のように表した。
初期培養容量と最終培養容量を測定するために、エルレンマイヤーフラスコを、空で、また培地を含んだ状態で、また培養の終了時で秤量した。メチオニン収量は次のように表した。
メチオニン０およびメチオニンｆはそれぞれ初期および最終メチオニン濃度であり、グルコース０およびグルコースｆはそれぞれ初期および最終グルコース濃度であり、Ｖ０およびＶｆは初期および最終容量である。
流加培養：
発酵槽容量は、初期容量にｐＨを調節するため、また、培養物に供給するために加えた溶液の量を加え、サンプリングに用い容量および蒸発による損失を差し引くことによって算出した。
発酵槽容量は、初期容量にｐＨを調節するため、また、培養物に供給するために加えた溶液の量を加え、サンプリングに用い容量および蒸発による損失を差し引くことによって算出した。
流加容量は供給ストックを秤量することにより絶えず追跡した。次に、注入されたグルコースの量を注入重量と溶液密度とＢｒｉｘ（［グルコース］）の方法によって測定されたグルコース濃度に基づいて計算した。メチオニン収量は次のように表した。
メチオニン０およびメチオニンｔはそれぞれ初期および最終メチオニン濃度であり、Ｖ０およびＶｔは初期および最終ｔ容量である。
消費グルコースは次のように計算した。
注入グルコースｔ＝流加容量ｔ＊［グルコース］
消費グルコースｔ＝［グルコース］０＊Ｖ０＋注入グルコース−［グルコース］残留＊Ｖｔ
［グルコース］０、［グルコース］、［グルコース］残留はそれぞれ初期、流加および残留グルコース濃度である。
消費グルコースは次のように計算した。
消費グルコースｔ＝［グルコース］０＊Ｖ０＋注入グルコース−［グルコース］残留＊Ｖｔ
［グルコース］０、［グルコース］、［グルコース］残留はそれぞれ初期、流加および残留グルコース濃度である。
リン酸制限または飢餓はメチオニン／グルコース収量を増大させる
リン酸制限およびまたリン酸飢餓がメチオニン／グルコース収量を増加させることを証明するため、上記のように流加発酵を行った。リン酸塩飢餓または制限無しの培養には無機培地Ｂ３を用い、流加培地はＮａ２ＳＯ４（８．９５／Ｌ）および（ＮＨ４）２ＳＯ４（８．３２ｇ／Ｌ）で補完したＦ２であった。リン酸制限下で増殖させた培養物については、次の改変を行った。使用バッチ無機培地はＢ２とし、流加培地は６０ｍＭのリン酸で補完したＦ２とした。リン酸制限はＯＤ６００ｎｍ １００で起こった。
リン酸制限およびまたリン酸飢餓がメチオニン／グルコース収量を増加させることを証明するため、上記のように流加発酵を行った。リン酸塩飢餓または制限無しの培養には無機培地Ｂ３を用い、流加培地はＮａ２ＳＯ４（８．９５／Ｌ）および（ＮＨ４）２ＳＯ４（８．３２ｇ／Ｌ）で補完したＦ２であった。リン酸制限下で増殖させた培養物については、次の改変を行った。使用バッチ無機培地はＢ２とし、流加培地は６０ｍＭのリン酸で補完したＦ２とした。リン酸制限はＯＤ６００ｎｍ １００で起こった。
図２から分かるように、リン酸過剰下で、培養中にＯＤ６００ｎｍは一貫して高まり、実験の終了時には１６０ＵＤＯに達した。リン酸制限および飢餓の場合、細胞増殖速度はＯＤ６００ｎｍ １００（２０時間）から始まって低下し、最終ＯＤ６００ｎｍは１２０付近であった。残留リン酸濃度は、イオン交換クロマトグラフィーにより確認したところ０付近であった。リン酸飢餓および制限の結果として、メチオニン収量が増加し、リン酸過剰下の０．１２４ｇ／ｇに比べて、それぞれ最大値０．１４７および０．１３９ｇ／ｇに達した。
Claims (20)
- 発酵プロセスにおいてメチオニン、その誘導体または前駆体を生産するための方法であって、下記工程：
炭素源と硫黄源とを含んでなる適当な培養培地中で改変微生物を培養する工程；および
該培養培地からメチオニンを回収する工程
を含んでなり、
該微生物および／または方法が、非改変微生物および／または方法と比較して、以下の改変：
微生物におけるホルミル−ＴＨＦの脱ホルミル化を低減すること、
微生物におけるＰＥＰの消費を低減すること、
培養培地中の１種または数種の無機基質に対して微生物を制限するまたは飢餓状態にすることにより改変微生物の増殖およびバイオマス生産を制限すること
の少なくとも１つおよびその組合せによって、増強されたメチオニン／炭素源収量をもたらすように改変されている、方法。 - ホルミル−ＴＨＦの脱ホルミル化が、遺伝子ｐｕｒＵの発現の減衰により低減される、請求項１に記載の方法。
- ＰＥＰの消費が、以下の遺伝子：
・ｐｙｋＡ
・ｐｙｋＦ
の少なくとも１つの発現の減衰により低減される、請求項１に記載の方法。 - 微生物が、リン酸塩および／またはカリウムに対して制限されるまたは飢餓状態にされる、請求項１に記載の方法。
- ホルミル−ＴＨＦの脱ホルミル化が遺伝子ｐｕｒＵの発現の減衰により低減され、ＰＥＰの消費がｐｙｋＡもしくはｐｙｋＦ遺伝子または双方の発現の減衰により低減され、かつ、微生物がリン酸塩および／またはカリウムに対して制限されるまたは飢餓状態にされる、請求項１に記載の方法。
- ホルミル−ＴＨＦの脱ホルミル化が遺伝子ｐｕｒＵの発現の減衰により低減され、かつ、ＰＥＰの消費がｐｙｋＡもしくはｐｙｋＦ遺伝子または双方の発現の減衰により低減される、請求項１に記載の方法。
- ホルミル−ＴＨＦの脱ホルミル化が遺伝子ｐｕｒＵの発現の減衰により低減され、かつ、微生物がリン酸塩および／またはカリウムに対して制限されるまたは飢餓状態にされる、請求項１に記載の方法。
- ＰＥＰの消費がｐｙｋＡもしくはｐｙｋＦ遺伝子または双方の発現の減衰により低減され、かつ、微生物がリン酸塩および／またはカリウムに対して制限されるまたは飢餓状態にされる、請求項１に記載の方法。
- 微生物において以下の遺伝子：ｃｙｓＰ、ｃｙｓＵ、ｃｙｓＷ、ｃｙｓＡ、ｃｙｓＭ、ｃｙｓＪ、ｃｙｓＩ、ｃｙｓＨ、ｃｙｓＥ、ｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｇｃｖＰ、ｌｐｄ、ｓｅｒａ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣ、ｇｌｙＡの少なくとも１つの発現が増加される、請求項１〜８に記載の方法。
- 微生物においてオペロンｃｙｓＰＵＷＡＭおよび／またはｃｙｓＪＩＨの発現が増加される、請求項９に記載の方法。
- 微生物において遺伝子ｇｃｖＴＨＰおよび／またはｌｐｄによりコードされるグリシン切断複合体の発現が増加される、請求項９に記載の方法。
- ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣまたはｇｌｙＡなどのグリシン生合成経路に関与する少なくとも１つの遺伝子が過剰発現される、請求項９に記載の方法。
- 微生物において以下の遺伝子：ｍｅｔＦ、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減されている酵素をコードするｍｅｔＡ対立遺伝子、トレオニンに対するフィードバック阻害が低減されているｔｈｒＡまたはｔｈｒＡ対立遺伝子、ｃｙｓＥ、ｍｅｔＨの少なくとも１つが過剰発現される、請求項１〜１２に記載の方法。
- 微生物においてｍｅｔＪ遺伝子によりコードされているメチオニンリプレッサーの発現が減衰される、請求項１〜１３に記載の方法。
- 培養培地の硫黄源が、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫化水素、ジチオン酸塩、亜ジチオン酸塩、亜硫酸塩またはこれらの異なる供給源の組合せである、請求項１〜１４に記載の方法。
- 培養培地の硫黄源が、硫酸塩もしくはチオ硫酸塩、またはこの２つの混合物である、請求項１５に記載の方法。
- 炭素源が、グルコースまたはスクロースである、請求項１〜１６に記載の方法。
- 所望により最終産物の一部または全量（０〜１００％）に留まっている発酵液および／またはバイオマスの目的アミノ酸／成分を単離する工程を含んでなる、請求項１〜１７に記載の方法。
- メチオニンが回収される前にメチオニン誘導体であるＮ−アセチル−メチオニンが脱アシル化によりメチオニンへ変換される、請求項１８に記載の方法。
- 請求項１〜３および５〜１４に記載の改変を含んでなる微生物。
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