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JP2010519181A - 代謝障害を処置するための組成物および方法 - Google Patents

代謝障害を処置するための組成物および方法 Download PDF

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JP2010519181A JP2009548468A JP2009548468A JP2010519181A JP 2010519181 A JP2010519181 A JP 2010519181A JP 2009548468 A JP2009548468 A JP 2009548468A JP 2009548468 A JP2009548468 A JP 2009548468A JP 2010519181 A JP2010519181 A JP 2010519181A
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サリー ジェイ． ワキル，
ラトフィ アブ−エレイガ，
キアン マオ，
伸治 紙透
釘宮　　啓
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Abstract

本発明は、ファトスタチンＡおよび／またはその誘導体および／または類似体を使用した１つまたは複数の代謝障害の治療および／または予防に関する。他の態様では、１つまたは複数の代謝障害の治療および／または予防のための化合物は、Ａ−Ｂ−Ｃ三部構造（（式中、Ａ、Ｂ、およびＣは、同一または異なる構造であり、本明細書中に詳述されている）を使用する。特定の態様では、代謝障害には、例えば、肥満または糖尿病が含まれる。

Description

この出願は、２００７年２月２日に出願された米国仮特許出願第６０／８８７，９９４号、そしてまた２００７年１２月７日に出願された米国仮特許出願第６１／０１２，３１０号（これらの出願の両方は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
本発明は、国立衛生研究所助成金ＧＭ−６３１１５および国防総省助成金番号ＤＡＭＤ１７−０３−１−０２２８からの連邦政府補助金を利用した。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。また、本発明は、Ｉｂｒａｈｉｍ Ｅｌ−Ｈｅｆｎｉ技術研修基金（Ｉｂｒａｈｉｍ Ｅｌ−Ｈｅｆｎｉ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）からの拠出資金を利用した。
発明の分野
本発明は、一般に、例えば、医学、細胞生物学、分子生物学、および生化学の分野に関する。特定の態様では、発明の分野は、肥満などの代謝障害の治療のための特定の組成物に関する。ある態様では、組成物は、例えば、ファトスタチンＡおよびその類似体または誘導体を含む。
発明の背景
代謝症候群は、多数の心血管危険因子（高血圧症、脂質異常症（ｄｙｓｌｉｐｉｄａｅｍｉａ）、肥満、２型糖尿病、膵臓β細胞機能障害、およびアテローム性動脈硬化症が含まれる）を対象とする。脂肪または炭水化物の含有量が様々な食事は、動物（ヒトが含まれる）のエネルギー代謝に寄与する。長鎖脂肪酸は、主なエネルギー供給源であり、細胞膜を含む脂質の重要な成分である。長鎖脂肪酸は、食品に由来し、ｄｅ ｎｏｖｏで複雑な一連の反応を介してアセチル−ＣｏＡから合成される。コレステロールも食品に由来し、同様に複雑な反応を介してアセチル−ＣｏＡから合成される。ｄｅ ｎｏｖｏ脂肪酸およびコレステロール合成を介した炭水化物のアシルグリセリドへの変換は、それぞれ、少なくとも１２および２３の酵素反応を含む。これらの酵素をコードする遺伝子の発現レベルは、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）と呼ばれる３つの転写因子（ＳＲＥＢＰ−１ａ、ＳＲＥＢＰ−１ｃ、およびＳＲＥＢＰ−２）によって調節される（非特許文献１；非特許文献２）。これらの膜結合タンパク質は、ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス・ロイシンジッパー転写因子ファミリークラスのメンバーである（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。他のロイシンジッパー転写因子メンバーと異なり、ＳＲＥＢＰは、小胞体膜結合前駆体として合成され、小胞体膜結合前駆体は核内の標的遺伝子の転写を活性化するためにゴルジ膜に結合する２つのプロテアーゼ（サイト−１およびサイト−２プロテアーゼ）によってタンパク質分解的に放出される必要がある（非特許文献１；非特許文献４）。
ＳＲＥＢＰのタンパク質分解性活性は、ＳＲＥＢＰ切断活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）（ＳＲＥＢＰの小胞体膜結合エスコートタンパク質）との相互作用を介してステロールによって強く調節される（非特許文献５；非特許文献６）。ステロールが小胞体膜中に蓄積される場合、ＳＣＡＰ／ＳＲＥＢＰ複合体はＥＲからゴルジに排出することができず、それにより、ＳＲＥＢＰのタンパク質分解プロセシングは抑制される。ＳＲＥＢＰは、脂肪代謝のホメオスタシスを支配する重要な脂質合成転写因子である。
Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．＆ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ． Ｃｅｌｌ（１９９７）８９，３３１−４０ Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２０００）２７５，３２３７９−８２ Ｔｏｎｔｏｎｏｚ，Ｐ．，Ｋｉｍ，Ｊ．Ｂ．，Ｇｒａｖｅｓ，Ｒ．Ａ．＆ Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｂ．Ｍ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９９３）１３，４７５３−９ Ｓａｋａｉ，Ｊ．，Ｄｕｎｃａｎ，Ｅ．Ａ．，Ｒａｗｓｏｎ，Ｒ．Ｂ．，Ｈｕａ，Ｘ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．＆ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ． Ｃｅｌｌ（１９９６）８５，１０３７−４６ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．，ＤｅＢｏｓｅ−Ｂｏｙｄ，Ｒ．Ａ．＆ Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ． Ｃｅｌｌ（２００６）１２４，３５−４６ Ｈｕａ，Ｘ．，Ｎｏｈｔｕｒｆｆｔ，Ａ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．＆ Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ． Ｃｅｌｌ（１９９６）８７，４１５−２６
発明の概要
本発明は、個体（特に、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、またはヒツジなどの哺乳動物）の１つまたは複数の代謝障害の治療および／または予防に関する。特に、本発明は、治療のための個体への１つまたは複数の組成物の送達に関し、特定の実施形態では、組成物は、ファトスタチンＡおよび／またはその類似体および／または誘導体である。有効量の本発明の化合物を使用して障害由来の少なくとも１つの症状が治療および／または予防される限り、代謝障害は、任意の種類であり得る。
本発明のある態様では、代謝症候群は、多数の心血管危険因子（高血圧症、脂質異常症、肥満、２型糖尿病、膵臓β細胞機能障害、およびアテローム性動脈硬化症が含まれる）を対象とする。本発明の他の態様では、内蔵脂肪（脂肪肝が含まれる）の治療および／または予防を提供する。脂肪酸およびコレステロールは、食品に由来するか、ｄｅ ｎｏｖｏで炭水化物のアシルグリセリドへの変換を含む複雑な一連の反応（すなわち、脂質合成）を介してアセチル−ＣｏＡから合成される。ｄｅ ｎｏｖｏ脂肪酸およびコレステロール合成は、それぞれ、少なくとも１２および２３の酵素反応を含む。これらの酵素をコードする遺伝子の発現レベルは、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）と呼ばれる３つの転写因子（ＳＲＥＢＰ−１ａ、ＳＲＥＢＰ−１ｃ、およびＳＲＥＢＰ−２）によって調節される。これらの膜結合タンパク質は、ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス・ロイシンジッパー転写因子ファミリークラスのメンバーである。他のロイシンジッパー転写因子メンバーと異なり、ＳＲＥＢＰは、小胞体膜結合前駆体として合成され、小胞体膜結合前駆体は核内の標的遺伝子の転写を活性化するためにゴルジ膜に結合する２つのプロテアーゼ（サイト−１およびサイト−２プロテアーゼ）によってタンパク質分解的に放出される必要がある。
ＳＲＥＢＰのタンパク質分解性活性は、ＳＲＥＢＰ切断活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）（ＳＲＥＢＰの小胞体膜結合エスコートタンパク質）との相互作用を介してステロールによって強く調節される。ステロールが小胞体膜中に蓄積される場合、ＳＣＡＰ／ＳＲＥＢＰ複合体はＥＲからゴルジに排出することができず、それにより、ＳＲＥＢＰのタンパク質分解プロセシングは抑制される。合成薬物様チアゾール誘導体により、培養哺乳動物細胞中に以下の２つの異なる表現型が生じる：３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞のインスリン誘導性脂肪生成の阻害およびＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞の血清非依存性成長の抑制。完全合成薬物様チアゾール誘導体（ファトスタチンＡまたは１２５Ｂ１１と呼ばれる）により、培養哺乳動物細胞中に以下の２つの異なる表現型が生じる：ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞の血清非依存性成長の抑制および３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞のインスリン誘導性脂肪生成の阻害。長鎖脂肪酸のｄｅ ｎｏｖｏ合成を触媒する脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）のインスリンによる誘導は、ＦＡＳ遺伝子プロモーター上流のＳＲＥＢＰ結合部位に依存する。
特定の態様では、３Ｔ３−Ｌ１細胞のインスリン誘導性脂肪生成および前立腺癌細胞のＩＧＦ１誘導性細胞成長の両方を遮断する１つまたは複数の小分子を提供する。機構研究により、分子がＳＲＥＢＰのタンパク質分解活性を阻害し、それにより、核へのその局在化を阻害することが示された。ＳＲＥＢＰは、ヒト細胞中で脂肪酸およびステロールの生合成を調節する主な転写因子であり、その機能の小分子介入により、種々の範囲の代謝性疾患（肥満および高脂質血症が含まれる）を治療する医薬品を開発することができる。ＤＮＡマイクロアレイ分析により、分子が多数のＳＲＥＢＰ−標的遺伝子（ＬＤＬ受容体およびＨＭＢ−ＣｏＡレダクターゼが含まれる）の発現を選択的に減少させることが示された。この分子のマウスへの投与により、食物摂取に影響を及ぼすことなく血中トリグリセリドレベルおよび血中コレステロールレベルを減少させる。本発明の特定の態様では、本発明の化合物は、ＳＲＥＢＰ経路を妨害する最初の非天然合成分子を示す。
ここに、ファトスタチンＡおよび例示的類似体がＳＲＥＢＰの活性化を選択的に遮断することを証明する。ＳＲＥＢＰのインヒビターとしてのファトスタチンＡの同定は、脂肪酸およびコレステロール（膜の基礎単位）のｄｅ ｎｏｖｏ合成が必要な癌細胞の血清非依存性成長の抑制を説明する。
実験マウスにおいてファトスタチンＡがＳＲＥＢＰ−１の活性化を遮断することも示されている。マウスへのファトスタチンＡの投与により、体重が減少し、成熟ＳＲＥＢＰが下方制御され、その結果として、脂質合成酵素、アセチル−ＣＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）、およびＦＡＳのレベルおよび活性が減少した。最終的に、ある実施形態では、ファトスタチンは、代謝性疾患の薬理学的に介入に有用であり、脂肪酸合成の調節および役割をさらに洞察するためのツールとして役立つ。
ファトスタチンＡは、有機小分子についての化学ライブラリーの表現型スクリーニングによって以前に発見された。合成薬物様チアゾール誘導体により、培養哺乳動物細胞中に以下の２つの異なる表現型が生じる：３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞のインスリン誘導性脂肪生成の阻害およびＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞の血清非依存性成長の抑制。ここに、ファトスタチンＡがＳＲＥＢＰの活性化を選択的に遮断することを証明する。ＳＲＥＢＰのインヒビターとしてのファトスタチンＡの同定は、その高脂肪生成特性と一致し、脂肪酸およびコレステロール（膜の基礎単位）のｄｅ ｎｏｖｏ合成が必要な癌細胞の血清非依存性成長のその抑制を説明する。
本発明の１つの実施形態では、安息香酸４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル；４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；メチル２−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノキシ）アセテート；２−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノキシ）酢酸；４−（４−クロロフェニル）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）チアゾール；４−（４−（２，４−ジフルオロフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−イソプロピル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）アセトアミド；Ｎ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）メタンスルホンアミド；Ｎ−ベンジル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−（シクロプロピルメチル）−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；４−（４−（３−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（２−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−ブロモフェニル）−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボン酸；メチル４−（４−ブロモフェニル）−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボキシレート ４−（４−（３−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（２−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；３−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；２−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；４−（４−ブロモフェニル）−Ｎ−イソプロピル−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボキシアミド；その薬学的に許容可能な塩；その立体異性体；およびそれらの任意の組み合わせまたは混合物からなる群から選択される化合物が存在する。特定の実施形態では、化合物は、Ｎ−イソプロピル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン、およびＮ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）メタンスルホンアミドからなる群から選択される。さらなる特定の実施形態では、化合物は、薬学的に許容可能な賦形剤中に含まれるとさらに定義される。
本発明の１つの実施形態では、個体の代謝障害を治療する方法であって、治療有効量の少なくとも１つの一般式：Ａ−Ｂ−Ｃ（式中、Ａ、Ｂ、およびＣは同一または異なり、それぞれ、５員環、６員環、または７員環を含み、この環は、複素環もしくは非複素環、置換環、または非置換環であり、Ａ、Ｂ、およびＣの任意の１つ、任意の２つ、または３つ全ては、非置換であるか、１つまたは複数の置換を有し、任意の置換は任意の他の置換と同一であっても異なっていてもよく、置換は、以下：ａ）ヒドロキシ；ｂ）Ｃ１〜１０アルキル；ｃ）Ｃ２〜１０アルケニル；ｄ）Ｃ２〜１０アルキニル；ｅ）Ｃ３〜６シクロアルキル；ｆ）アリール；ｇ）ヘテロアリール；ここで、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、および／またはｇ）中の置換は、以下：１）ヒドロキシ；２）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；３）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；４）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；５）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；６）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）；７）ハロ；８）シアノ；９）カルボキシ；１０）アミノ；１１）一置換アミノ；１２）二置換アミノ；１３）アミド；１４）一置換アミド；１５）二置換アミド；および１６）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基と任意選択的に置換され、ここで、２）、３）、または６）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、ｈ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；ｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；ｊ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；ｋ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；ｌ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、ここで、ｈ）、ｉ）、またはｌ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、ｍ）ハロ；ｎ）シアノ；ｏ）カルボキシ；ｐ）アミノ；ｑ）一置換アミノ；ｒ）二置換アミノ、ｓ）アミド；ｔ）一置換アミド；およびｕ）二置換アミドからなる群から選択され、ここで、該一置換アミノ、二置換アミノ、一置換アミド、および二置換アミドの１つまたは複数は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、スルホキシド、スルホン、スルホナート、アルキルスルホナート、スルホン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される置換を有し、ここで、ｕ）において、該アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールは、以下：ｉ）ヒドロキシ；ｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；ｉｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；ｉｖ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；ｖ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；ｖｉ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、ここで、ｉｉ）、ｉｉｉ）、またはｖｉ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、ｖｉｉ）ハロ；ｖｉｉｉ）シアノ；ｉｘ）カルボキシ；ｘ）アミノ；ｘｉ）一置換アミノ；ｘｉｉ）二置換アミノ；ｘｉｉｉ）アミド；ｘｉｖ）一置換アミド；ｘｖ）二置換アミド；およびｘｖｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基と任意選択的に置換される）を有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を個体に送達する工程を含む、方法が存在する。特定の実施形態では、Ａは置換されており、１〜５原子の側鎖を含む。更なる特定の実施形態では、１〜５原子の側鎖が１〜５個の炭素の側鎖である。
本発明の別の実施形態では、２−プロピル−４−（４−ｐ−トリルチアゾール−２−イル）ピリジン；４−（４−（４−ブロモフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−フェニルチアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（４−クロロフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（４−エチルフェニル）チアゾール−２−イル）ピリジン；４−（４−ｐ−トリルチアゾール−２−イル）ピリジン；４−（４−（４−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）ピリジン；安息香酸４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル；４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；メチル２−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノキシ）アセテート；２−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノキシ）酢酸；４−（４−クロロフェニル）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）チアゾール；４−（４−（３，４−ジクロロフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（４−フルオロフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（２，４−ジフルオロフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−イソプロピル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）アセトアミド；Ｎ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）メタンスルホンアミド；Ｎ−ベンジル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−（シクロプロピルメチル）−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；４−（４−ブロモフェニル）−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボン酸；メチル４−（４−ブロモフェニル）−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボキシレート；４−（４−（４−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（３−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（２−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；２−フェニル−４−ｐ−トリルチアゾール；３−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；２−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；４−（４−ブロモフェニル）−Ｎ−イソプロピル−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボキシアミド；４−（４−（４−クロロフェニル）チアゾール−２−イル）ピリジン；４−（４−（４−クロロフェニル）チアゾール−２−イル）−２−エチルピリジン；４−（４−クロロフェニル）−２−フェニルチアゾール；２−プロピル−４−（４−（チオフェン−２−イル）チアゾール−２−イル）ピリジン；４−（４’−メチル［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−プロピル）ピリジン；２−（２−プロピルピリジン−４−イル）−４−ｐ−トリルチアゾール−５−カルボン酸；２−エチル−４−（４−ｐ−トリルチアゾール−２−イル）ピリジン；４−フェニル−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボン酸；メチル２−（２−プロピルピリジン−４−イル）−４−ｐ−トリルチアゾール−５−カルボキシレート；ｔｅｒｔ−ブチル４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニルカルバメート；Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−Ｎ−トシルベンゼンアミン；Ｎ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）−８−キノリンスルホンアミド；Ｎ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）−２−チオフェンスルホンアミド；およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの化合物が存在する。
さらなる特定の実施形態では、少なくとも１つの化合物は、安息香酸４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル；４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；メチル２−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノキシ）アセテート；２−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノキシ）酢酸；４−（４−クロロフェニル）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）チアゾール；４−（４−（２，４−ジフルオロフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−イソプロピル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）アセトアミド；Ｎ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）メタンスルホンアミド；Ｎ−ベンジル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−（シクロプロピルメチル）−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；４−（４−ブロモフェニル）−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボン酸；メチル４−（４−ブロモフェニル）−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボキシレート；４−（４−（３−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（２−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；３−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；２−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；４−（４−ブロモフェニル）−Ｎ−イソプロピル−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボキシアミド；薬学的に許容可能な塩；その立体異性体；およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
さらなる特定の実施形態では、少なくとも１つの化合物は、２−プロピル−４−（４−ｐ−トリルチアゾール−２−イル）ピリジン；４−（４−（４−ブロモフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン、Ｎ−イソプロピル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン、およびＮ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）メタンスルホンアミド；薬学的に許容可能な塩；その立体異性体；およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
本発明の特定の態様では、代謝障害は肥満である。さらなる態様では、代謝障害は、肥満、高脂質血症、糖尿病、脂肪肝、高血圧症、前立腺癌、および心血管疾患からなる群から選択される。
特定の実施形態では、個体に付加療法を施す。特定の場合、代謝障害は肥満であり、付加療法は、食事療法、理学療法、行動療法、手術、薬物療法、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される療法を含む。他の特定の場合、代謝障害は糖尿病であり、付加療法は、食事療法、理学療法、および薬物療法からなる群から選択される療法を含む。
本発明のさらなる実施形態では、化合物が適切な容器に格納されている、少なくとも１つの本発明の化合物を含むキットが存在する。キットは、特定の実施形態では、代謝障害のための付加療法をさらに含むことができる。
本発明の別の実施形態では、治療有効量の少なくとも１つの本発明の化合物を個体に投与する工程を含む個体のＳＲＥＢＰ経路のメンバーを阻害する方法が存在する。特定の実施形態では、ＳＲＥＢＰ経路のメンバーは、ＳＲＥＢＰ−１、ＳＲＥＢＰ−２、またはその両方である。
上記は、むしろ、以下の発明の詳細な説明をより理解することができるように、本発明の特徴および技術的利点を概説している。本発明のさらなる特徴および利点を、以下に記載しており、これは本発明の主題を形成する。当業者は、開示の概念および特定の実施形態を、本発明の目的を実施するための他の構築物の修正またはデザインに基づいて容易に使用することができると認識すべきである。当業者は、かかる等価な構築物は添付の特許請求の範囲に記載の本発明の精神および範囲に逸脱しないとも理解すべきである。その機構および操作方法の両方に関するその本発明の特徴であると考えられる新規の特徴は、さらなる目的および利点と共に、添付の図面と併せて考慮した場合に、以下の説明からより深く理解されるであろう。しかし、各図面は、本発明の例示および説明のみを目的として提供され、本発明を制限することを意図しないと明らかに理解すべきである。
本発明をより完全に理解するために、添付の図面と併せて示した以下の説明をここに参照した。
図１Ａ〜１Ｃは、ＲＴ−ＰＣＲによるマイクロアレイの結果を確認する。（Ａ）ファトスタチンＡの構造。（Ｂ）ＤＵ１４５細胞を、ＤＭＳＯ（レーン１）および５ｍＭファトスタチンＡ（レーン２）で６時間処理した。次いで、総ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲに供した。（Ｃ）ＲＴ−ＰＣＲおよびマイクロアレイデータのまとめ。ＡＣＬ、ＡＴＰクエン酸リアーゼ；ＨＭＧ ＣｏＡＲ、３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル−ＣｏＡレダクターゼ；ＬＤＬＲ、低密度リポタンパク質受容体、ＭＶＤ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ；ＳＣＤ、ステアリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ ；ＩＮＳＩＧ１、インスリン誘導性遺伝子１；ＧＡＰＤＨ、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ。 図２Ａ〜２Ｃは、ファトスタチンＡが内因性ＳＲＥＢＰのレポーター遺伝子を活性化する能力を抑制することを示す。ＨＥＫ２９３細胞を、ＳＲＥ−１駆動ルシフェラーゼレポーター（ｐＳＲＥ−Ｌｕｃ）（Ａ）およびアクチンプロモーター下で調節されたβ−ｇａｌレポーター（Ｂ）で同時トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、種々の濃度のファトスタチンＡまたはＤＭＳＯのみを含む無脂質血清含有培地によって処理した。２０時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼ活性を測定し、データを、β−ガラクトシダーゼ活性によって正規化した。（Ｃ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｐＣＭＶ−ＳＲＥＢＰ−１ｃ（１−４３６）およびｐＳＲＥ−Ｌｕｃでトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を無脂質血清含有培地において、２０ｍＭファトスタチンＡを使用して、または使用せずに処理した。各値は、３つの独立した実験の平均を示す。 図３Ａ〜３Ｈは、ＳＲＥＢＰ−１およびＳＲＥＢＰ−２に及ぼすファトスタチンＡの影響を示す。ＤＵ１４５細胞を、ＤＭＳＯのみまたはファトスタチンＡ（１μＭおよび５μＭ）で６時間処理した。ＳＲＥＢＰ−１（Ａ）またはＳＲＥＢＰ−２（Ｂ）の前駆体および成熟形態のレベルを、ウェスタンブロットによって試験した。アクチンのウェスタンブロットを、負荷コントロールとして下のパネルに示す。（Ｃ〜Ｈ）ＳＲＥＢＰ−１の局在化を、免疫染色によって試験した。細胞を、ＤＭＳＯのみ（Ｃ〜Ｅ）または５ｍＭのファトスタチンＡ（Ｆ〜Ｈ）で処理し、次いで、ＤＡＰＩ（ＣおよびＦ）または抗ＳＲＥＢＰ−１（ＤおよびＧ）で染色した。 図４Ａ〜４Ｇは、ＳＲＥＢＰ−１のｓｉＲＮＡノックダウンによるインスリン誘導性脂肪生成の阻害を示す。ＳＲＥＢＰ−１発現がノックダウンされた３Ｔ３−Ｌ１細胞の２つの安定にトランスフェクトされたクローンを確立し、脂肪細胞に分化するように誘導した。ノックダウン細胞が分化しなかったのに対して（ＤおよびＦ）、空のベクター（ｎｅｏ）でトランスフェクトした３Ｔ３−Ｌ１細胞のほとんどが脂肪細胞に分化した（Ｂ）。Ａ、Ｃ、およびＥは、インスリン誘導しない細胞を示す。（Ｇ）ＳＲＥＢＰ−１の首尾の良いノックダウンを示すクローンのウェスタンブロット分析。 図５Ａ〜５Ｂは、ＳＲＥＢＰ−１のｓｉＲＮＡノックダウンがＤＵ１４５前立腺癌細胞の血清非依存性成長を遮断することを示す。（Ａ）ＳＲＥＢＰ−１発現がノックダウンされたＤＵ１４５細胞の２つの安定にトランスフェクトされたクローンを確立し、無血清であるか、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２％無脂肪ウシ胎児血清、または１μｇ／ｍＬのＩＧＦ１を含むＭＥＭ培地中で３日間成長させた。成長速度をＷＳＴ−１アッセイによって測定した。ノックダウン細胞は、無血清であるか、２％無脂肪ＦＢＳ、または１μｇ／ｍＬのＩＧＦ１を含むＭＥＭ培地中で成長できなかったが、血清の非存在下のコントロール細胞ほどの成長を示した。実験を三連で行った。（Ｂ）クローン１および２におけるＳＲＥＢＰ−１ノックダウンの程度を示すウェスタンブロット。 図６Ａ〜６Ｇは、絶食／無脂肪食再給餌後のマウスに及ぼすファトスタチンＡの影響を示す。１日前から４８時間の絶食を開始し、その後にさらに４８時間の無脂肪食の摂取を行う全実験について、マウスに３０ｍｇ／ｋｇのファトスタチンＡを腹腔内に毎日注射した。体重の減少（Ａ）および摂食（Ｂ）を、４８時間の給餌終了後時に決定した。（Ｃ）処置マウスおよびコントロールマウスの血清成分。（Ｄ）コントロールマウスおよびファトスタチンＡ処置マウス由来の２つの異なるマウス由来の肝臓抽出物のＳＲＥＢＰ−１の代表的なウェスタンブロット。タンパク質の負荷量を正規化した。（Ｅ）肝臓抽出物のＦＡＳ発現（上のパネル）および負荷コントロールのクーマーシー染色ゲル（下）を示す代表的なウェスタンブロット。（ＦおよびＧ）は、肝臓抽出物中のＦＡＳ活性およびＡＣＣ活性である。データは、平均＋ＳＤ（ｎ＝５）である。＊Ｐ＜０．０５。 図７Ａ〜７Ｅは、マウスに及ぼすファトスタチンＡの２週間の処置の影響を示す。５〜６月齢マウスに、３０ｍｇ／ｋｇファトスタチンＡまたは１０％ＤＭＳＯのいずれかで２週間にわたって毎日注射した。（Ａ）ファトスタチンＡでの処置前および処置後の体重。（Ｂ）処置後の体重減少量。（Ｃ）処置マウスおよびコントロールマウスにおけるグルコース、コレステロール、およびトリグリセリド（ＴＧ）の血清レベル。（Ｄ）肝臓抽出物中のＦＡＳ活性。（Ｅ）コントロール群および処置群それぞれについての３匹のマウスの肝臓の代表的なウェスタンブロット分析。タンパク質の負荷量を正規化した。データは平均＋ＳＤ（ｎ＝５）である。＊Ｐ＜０．０５。 図８Ａ〜８Ｃは、体重および飼料消費に及ぼすファトスタチンＡの影響を示す。２群のｏｂ／ｏｂ雄マウス（ｎ＝５）に、ファトスタチンＡを含むＰＢＳまたは１０％ＤＭＳＯを含むＰＢＳ（コントロール群へ）を４週間にわたって腹腔内注射した。マウスに通常の固形飼料を与え、試験初日およびその後毎日マウスの体重および飼料消費量を測定した。（８Ａ）：代表的なコントロールマウスおよびファトスタチンＡ処置マウスの写真。（８Ｂ）：各群内の各マウスの体重を毎日測定した。体重の平均および分散を示す。（８Ｃ）：摂食を毎日測定し、２８日にわたるマウスあたりの累積摂食として示した。 図９Ａ〜９Ｈは、コントロールおよびファトスタチンＡ処置ｏｂ／ｏｂマウスの血清成分を示す。一晩絶食マウスの尾静脈から採血し、細胞からの分離後に血清を回収した。成分を、材料と方法に記載のように決定した。データを、平均±ＳＤとして示す（各群中、ｎ＝５マウス）。 図１０Ａ〜１０Ｄは、ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓および脂肪組織に及ぼすファトスタチンの影響を示す。（１０Ａ）ファトスタチンＡ処置マウス（左）およびコントロール（右）の代表的な肝臓。（１０Ｂ）脂肪滴を検出するためにオイルレッドＯで染色し、マイヤーヘマトキシリンで対比染色したコントロールおよびファトスタチンＡｏｂ／ｏｂマウスの肝臓の凍結切片の組織学的分析。ファトスタチンＡで処置した３匹の異なるマウス（赤色に染色された液滴の劇的な減少を示す（上のパネル））およびコントロールの３匹の異なるマウス（処置マウスと比較して多数の赤色に染色された脂肪滴を示す（下のパネル））の肝臓。（１０Ｃ）ファトスタチンＡ処置ｏｂ／ｏｂマウス（左）およびコントロール（右）から単離した精巣上体脂肪パッド。（１０Ｄ）ｏｂ／ｏｂコントロールおよびファトスタチンＡ処置マウスから単離した肝臓および精巣上体脂肪パッドの平均重量。データを、平均±ＳＤとして示す（各群中、ｎ＝５マウス）（＊Ｐ＜０．０５）。 図１１は、コントロールおよびファトスタチンＡ処置ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓におけるトリグリセリドレベルおよびコレステロールレベルを示す。脂質を肝臓から抽出し、トリグリセリドおよびコレステロールを、本実施例のための例示的な材料および方法に記載のように定量した。データを、平均±ＳＤとして示す（各群中、ｎ＝５マウス）（＊Ｐ＝０．０００４；†Ｐ＝０．０３）。 図１２Ａ〜１２Ｄは、ファトスタチンＡが脂質合成酵素の発現レベルおよび活性を減少させることを示す。ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓抽出物中の（１２Ａ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の活性および（１２Ｂ）脂肪酸シンターゼの活性を、本実施例のための例示的な材料および方法に記載のように定量した。（１２Ｃ）：ウェスタンブロット分析。３匹の各ｏｂ／ｏｂマウス由来の肝臓粗抽出物を４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳゲルによって分離し、異なる抗体で探索し、ＥＣＬで検出した（材料と方法）。（１２Ｄ）：アクチンに対する正規化後のコントロールマウスに対するファトスタチンＡ由来の異なる脂質合成酵素の特異的バンドの強度の比。データを、平均±ＳＤとして示す（各群中、ｎ＝５マウス）（†Ｐ＝０．００５；‡Ｐ＝０．００２； ＊Ｐ＜０．０５）。 図１２Ａ〜１２Ｄは、ファトスタチンＡが脂質合成酵素の発現レベルおよび活性を減少させることを示す。ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓抽出物中の（１２Ａ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の活性および（１２Ｂ）脂肪酸シンターゼの活性を、本実施例のための例示的な材料および方法に記載のように定量した。（１２Ｃ）：ウェスタンブロット分析。３匹の各ｏｂ／ｏｂマウス由来の肝臓粗抽出物を４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳゲルによって分離し、異なる抗体で探索し、ＥＣＬで検出した（材料と方法）。（１２Ｄ）：アクチンに対する正規化後のコントロールマウスに対するファトスタチンＡ由来の異なる脂質合成酵素の特異的バンドの強度の比。データを、平均±ＳＤとして示す（各群中、ｎ＝５マウス）（†Ｐ＝０．００５；‡Ｐ＝０．００２； ＊Ｐ＜０．０５）。 図１３は、ファトスタチンＡ ｏｂ／ｏｂマウスと比較したコントロールにおける肝臓脂質合成酵素の転写レベルを示す。各遺伝子のｍＲＮＡレベルを、アクチンに対して正規化した。ＲＮＡをコントロールおよびファトスタチンＡ処置マウス（ｎ＝５）から単離し、リアルタイム定量ＲＴ-ＰＣＲによって測定した。＊Ｐ＜０．０５対コントロール。 図１４は、本発明の例示的化合物を示す。 図１５は、例示的類似体２〜１８を使用した標準的なルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを示す。 図１６は、例示的類似体１９〜３４を使用した標準的なルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを示す。 図１７は、例示的類似体３５〜４４を使用した標準的なルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを示す。 図１８ａ〜１８ｇは、ファトスタチンがＳＲＥＢＰの活性化を遮断することを示す。（ａ）ファトスタチンの構造。（ｂ）ＲＴ−ＰＣＲによって確認した罹患遺伝子の下方制御。ＤＵ１４５細胞を、ＤＭＳＯ（レーン１）または５ｍＭファトスタチン（レーン２）で６時間処理した。次いで、総ＲＮＡを抽出し、ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬ）、３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡＲ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）、ステアロイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ （ＳＣＤ）、インスリン誘導性遺伝子１（ＩＮＳＩＧ１）、およびグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）についてのＲＴ−ＰＣＲに供した。（ｃ）ファトスタチンでの処理に起因する選択した遺伝子の減少。（ｄ）無脂質血清を含む培地中で内因性ＳＲＥＢＰがルシフェラーゼレポーター遺伝子を活性化する能力のファトスタチンによる抑制。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ＳＲＥ−１駆動ルシフェラーゼレポーター（ｐＳＲＥ−Ｌｕｃ）でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、種々の濃度のファトスタチンを含む無脂質血清含有培地で処理した。（ｅ）ｐＣＭＶ−ＳＲＥＢＰ−１ｃ（１−４３６）およびｐＳＲＥ−Ｌｕｃを含む無脂質血清含有培地で同時トランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞に及ぼすファトスタチンの影響。（ｆ）トランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞中のＰＬＡＰ−ＢＰ２は、ゴルジ中でＳ１Ｐによって切断されて、培養培地中に分泌されない限り、膜結合を維持する（左）。ファトスタチン（２０μＭ）またはステロール（１０μｇ／ｍＬコレステロールおよび１μｇ／ｍＬ２５−ヒドロキシコレステロール）での処理は、ＥｔＯＨコントロールと比較してＰＬＡＰ−ＢＰ２の切断に影響を及ぼす。（ｇ）ファトスタチンで処理したＣＨＯ−Ｋ１細胞のウェスタンブロット分析。ＰおよびＮは、それぞれ、ＳＲＥＢＰ−２の非切断膜前駆体および切断核形態を示す。 図１９ａ〜１９ｃは、ファトスタチンがＥＲからゴルジへのＳＲＥＢＰの転位を遮断することを示す。（ａ）ＥｔＯＨのみ、ステロール（１０μｇ／ｍＬコレステロールおよび１μｇ／ｍＬ ２５−ヒドロキシコレステロール）、または２０μＭファトスタチンで処理したＣＨＯ−Ｋ１細胞のブレフェルジンＡの影響を示すウェスタンブロット分析。（ｂ）ＳＣＡＰは、トリプシンによるタンパク質分解から保護され、抗ＳＣＡＰ ＩｇＧ−９Ｄ５を認識するグリコシル化ルミナールループを含む。ループ中の２つのオリゴサッカリドは、ＥＲ中にＳＣＡＰが存在する場合にエンドグリコシダーゼＨに感受性を示す。ＳＣＡＰがゴルジに輸送されるにつれて、その糖はエンドグリコシダーゼＨによる消化に耐性を示すようになる。（ｃ）２０μＭファトスタチンまたはステロール（１０μｇ／ｍＬコレステロールおよび１μｇ／ｍＬ２５−ヒドロキシコレステロール）の非存在下または存在下で成長した細胞の抗ＳＣＡＰ ＩｇＧ−９Ｄ５を使用したウェスタンブロット分析。右の数字は、プロテアーゼ保護ＳＣＡＰフラグメント上に存在するＮ結合糖鎖の数を示す。 図２０ａ〜２０ｄは、（ａ）ダンシルファトスタチンおよびファトスタチン−ポリプロリンリンカー−ビオチン抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の構造を示す。ファトスタチン分子のより良好な投影のためにポリプロリンリンカーを挿入した（Ｓａｔｏら、２００７）。（ｂ）ＥＲ中のダンシルファトスタチンの局在化を示すダンシルファトスタチンおよびＥＲ−トラッカーレッドで処理したＣＨＯ−Ｋ１細胞。スケールバー＝１０μｍ。（ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１膜抽出物中のビオチン化ファトスタチンで飽和したニュートラアビジン−アガロースビーズに結合したタンパク質の抗ＳＣＡＰ抗体、抗ＳＲＥＢＰ−１抗体、抗ＳＲＥＢＰ−２抗体、および抗ＡＴＦ６抗体を使用したウェスタンブロット分析によって示したファトスタチンのＳＣＡＰとの相互作用。（ｄ）競合アッセイのために、膜抽出物を、ＥｔＯＨのみ、コレステロール、またはファトスタチンとプレインキュベートした。 図２１ａ〜２１ｃは、雄ｏｂ／ｏｂマウスの体重、飼料消費、および血液成分に及ぼすファトスタチンの影響を示す。平均±ＳＤ（ｎ＝５）を示す。（ａ）代表的なコントロールマウスおよびファトスタチン処置マウス。（ｂ）２８日間の処置にわたるマウスあたりの体重および累積摂食。（ｃ）コントロールマウスおよびファトスタチン処置マウスの血液成分。 図２２ａ〜２２ｄは、ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓および脂肪組織に及ぼすファトスタチンの影響を示す。（ａ）ファトスタチン処置マウスおよびコントロールマウスの代表的な肝臓。（ｂ）ファトスタチン処置マウスおよびコントロールマウス由来の肝臓および精巣上体脂肪パッドの重量（平均±ＳＤ、ｎ＝５、＊Ｐ＜０．０５）。（ｃ）赤色に染色された脂肪滴を示すファトスタチン処置マウスおよびコントロールマウスの肝臓切片。（ｄ）ファトスタチン処置マウスおよびコントロールマウスの肝臓におけるトリグリセリドレベルおよびコレステロールレベル（平均±ＳＤ、ｎ＝５、＊ｐ＝０．０００４；†ｐ＝０．０３）。 図２３は、ファトスタチンがＳＲＥＢＰ応答性遺伝子の発現を減少させるマイクロアレイの結果を示す。ＤＵ１４５細胞を、ファトスタチンまたはＤＭＳＯのみで処理し、抽出したｍＲＮＡサンプルを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＤＮＡマイクロアレイによって分析した。３５％を超えて下方制御された６３遺伝子のうち、３４遺伝子は、脂肪合成またはステロール合成に直接関連した。桃色は、ＳＲＥＢＰによって調節されたことが報告された１８遺伝子であり、橙色は脂肪合成またはステロール合成に関連する。 図２４は、ファトスタチンで処理したＣＨＯ−Ｋ１細胞のウェスタンブロット分析を示す。ＰおよびＮは、それぞれ、非切断膜前駆体および切断核形態のＳＲＥＢＰ−１を示す。 図２５は、ファトスタチン、ダンシルファトスタチン、およびファトスタチン−ポリプロリンリンカー−ビオチンの例示的合成スキームを示す。 図２６は、無脂質血清含有培地中で内因性ＳＲＥＢＰがルシフェラーゼレポーター遺伝子を活性化する能力のファトスタチン類似体による抑制を示す。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ｐＳＲＥ−Ｌｕｃでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、無脂質血清含有培地中で種々の濃度のファトスタチン、ダンシルファトスタチン、またはイソプロピルアミン誘導体によって処理した。 図２７は、ＥＲ中のダンシルファトスタチンまたはダンシルアミドの局在化を示す。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、５μＭダンシルファトスタチンまたはダンシルアミドで処理し、共焦点顕微鏡下で観察した。スケールバー＝１０μｍ。 図２８ａ〜２８ｃは、ファトスタチンが脂質合成酵素の発現レベルおよび活性を減少させることを示す。（ａ）ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓抽出物中のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）および脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）の活性を測定した。（ｂ）肝臓粗抽出物のウェスタンブロット分析。（ｃ）アクチンに対する正規化後のコントロールマウスに対するファトスタチン由来の異なる脂質合成酵素の特異的バンドの強度の比。データを、平均±ＳＤとして示す（各群中、ｎ＝５マウス）（†Ｐ＝０．００５；‡Ｐ＝０．００２；＊Ｐ＜０．０５）。
発明の詳細な説明
本明細書中で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を意味し得る。特許請求の範囲で用語「〜を含む」と併せて使用する場合、用語「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。本明細書中で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２以上を意味し得る。特定の実施形態では、本発明の態様は、例えば、１つまたは複数の本発明の配列「から本質的になる」または「からなる」ことができる。本発明のいくつかの実施形態は、本発明の１つまたは複数の要素、方法工程、および／または方法からなるかから本質的になることができる。本明細書中に記載の任意の方法または組成物を本明細書中に記載の任意の他の方法または組成物に関連して実施することができる。
Ｉ．発明の一般的な実施形態
本発明の化合物を使用して、代謝障害を治療および／または予防する。例えば、脂肪酸およびコレステロールの無制御な合成および食物性脂肪の過剰摂取は、多数の医学的合併症（少なくとも肥満、糖尿病、高血圧症、および心血管疾患が含まれる）と相関する。ある態様では、これらの状態を、本発明の化合物を使用して治療および／または予防する。疫学的証拠により、代謝性疾患（肥満が含まれる）が浸潤型前立腺癌の発症も促進することを示している。
脂肪枯渇の際、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）は、膜からタンパク質分解的に放出されて核に転位し、核でこれらがコレステロールおよび脂肪酸の生合成に関与する遺伝子の転写を活性化する。本発明は、ＳＲＥＢＰ活性化の選択的インヒビターとして脂肪生成および癌細胞成長の両方を遮断することが以前に知られている合成小分子を特定し、この分子の類似体および誘導体も提供する。薬物様分子ファトスタチンＡはＳＲＥＢＰのタンパク質分解活性を低下させ、それにより、細胞中でのその応答遺伝子の転写を減少させる。マウスでは、ファトスタチンＡは、肝臓中のＳＲＥＢＰ−１の活性化を遮断し、体重を減少させ、血中のコレステロールおよびグルコースレベルを低下させ、脂質合成酵素を下方制御する。脂肪酸シンターゼおよびアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性およびその発現レベルは、処置マウスの肝臓中で減少した。ファトスタチンＡは、細胞経路を理解するためのツールとしての機能を果たし、ある態様において、代謝性疾患の薬理学的介入の少なくとも出発点としてのコンセンサス分子を提供する。
特定の実施形態では、代謝関連表現型を調整する小分子は、複合体会合を分析するためのツールとしての機能を果たす。ファトスタチンＡは、培養哺乳動物細胞中で以下の２つの異なる表現型を生じる：３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞のインスリン誘導性脂肪生成の完全な阻害およびＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞の血清非依存性インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）依存性成長の選択的抑制。
本発明のある態様では、ファトスタチンＡは、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）（コレステロールおよび脂肪酸の合成に関与する特異的遺伝子を活性化する重要な脂質合成転写因子）の活性化を選択的に遮断する。ＳＲＥＢＰのインヒビターとしてのファトスタチンＡの同定は、その抗脂肪生成性と一致し、前立腺癌のＩＧＦ１依存性成長におけるＳＲＥＢＰの役割を示す。
本発明は、例えば実験マウスで示されるように、少なくともＳＲＥＢＰ−１の活性化を遮断する化合物としてのファトスタチンＡに関する。ファトスタチンＡの肥満ｏｂ／ｏｂマウスへの投与により、体重が減少し、内蔵脂肪が顕著に減少した。
ＩＩ．代謝障害
本発明は、代謝障害の少なくとも１つの症状の治療および／または予防に関する。代謝障害は、その症状が本発明の化合物を使用して改善または予防される限り、任意の種類の代謝障害であり得る。それにもかかわらず、特に、代謝性疾患は、欠損代謝酵素に起因する遺伝形質（例えば、調節タンパク質および輸送機構の変異に関与する１つまたは複数の変異または障害を有するもの）などの１つまたは複数の先天性代謝異常（遺伝障害ということもできる）に由来する。
一般に、代謝障害は、細胞内のエネルギー生産に影響を及ぼす障害と定義することができる。ほとんどの代謝障害が遺伝性であるにもかかわらず、いくつかは、１つまたは複数の要因（食事、毒素、および感染などが含まれる）の結果として獲得され得る。遺伝性代謝障害は、細胞の代謝過程のいくつかの工程に必要な酵素が喪失されるか不適切に構築される遺伝的欠損に起因し得る。代謝障害の最大のカテゴリーには、以下が含まれる：１）糖原貯蔵障害（糖原病またはデキストリン蓄積症ともいう）（炭水化物代謝に影響を及ぼす障害が含まれる）；２）脂肪代謝および脂肪成分の代謝に影響を及ぼす脂肪酸化障害；ならびに３）ミトコンドリアに影響を及ぼすミトコンドリア障害。糖原貯蔵障害（ＧＳＤ）の例には、少なくとも、ＧＳＤ Ｉ型（グルコース−６−ホスファターゼ欠損症；フォンギエルケ病）；ＧＳＤ ＩＩ型（酸性マルターゼ欠損症；ポンぺ病）；ＧＳＤ ＩＩＩ型（グリコーゲン脱分枝欠損症；コリ病またはフォーブス病）；ＧＳＤ ＩＶ型（グリコーゲン分枝酵素欠損症；アンダーセン病）；ＧＳＤＶ型（筋肉グリコーゲンホスホリラーゼ欠損症；マッカードル病）；ＧＳＤ ＶＩ型（肝臓ホスホリラーゼ欠損症、エール病）；ＧＳＤ ＶＩＩ型（筋ホスホフルクトキナーゼ欠損症；垂井病）；ＧＳＤ ＩＸ型（ホスホリラーゼキナーゼ欠損症）；およびＧＳＤ ＸＩ型（グルコース輸送体欠損症；ファンコニー・ビッケル病）が含まれる。
脂肪酸代謝欠損症を、ある実施形態では、脂肪酸化障害または脂質貯蔵障害と説明することができる。脂肪酸代謝欠損症は、例えば、筋肉内、肝臓内、および他の細胞型内のエネルギー生産のために脂肪酸を酸化する身体能力に影響を及ぼす酵素欠損症に起因する１つまたは複数の先天性代謝異常を含み得る。脂肪酸代謝欠損症の例には、少なくとも、補酵素Ａデヒドロゲナーゼ欠損症；他の補酵素Ａ酵素欠損症；カルニチン関連障害；または脂質貯蔵障害が含まれる。補酵素Ａデヒドロゲナーゼ欠損症の例には、少なくとも、超長鎖アシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ欠損症（ＶＬＣＡＤ）；長鎖３−ヒドロキシアシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ欠損症（ＬＣＨＡＤ）；中鎖アシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ欠損症（ＭＣＡＤ）；短鎖アシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ欠損症（ＳＣＡＤ）；および短鎖Ｌ−３−ヒドロキシアシル−ｃｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＳＣＨＡＤ）が含まれる。他の補酵素Ａ酵素欠損症の例には、少なくとも、２，４ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ欠損症；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡリアーゼ欠損症；およびマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ欠損症が含まれる。カルニチン関連欠損症の例には、少なくとも、原発性カルニチン欠損症；カルニチン−アシルカルニチントランスロカーゼトランスロカーゼ欠損症；カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ欠損症（ＣＰＴ）；およびカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩＩ欠損症（ＣＰＴ）が含まれる。脂質蓄積症の例には、酸性リパーゼ疾患；ウォルマン病；コレステリルエステル蓄積症；ゴーシェ病；ニーマン−ピック病；ファブリー病；ファーバー病；ガングリオシドーシス；クラッベ病；および異染性白質ジストロフィが含まれる。他の脂肪酸代謝障害には、少なくとも、ミトコンドリア三機能性タンパク質欠損症；電子伝達フラボタンパク質（ＥＴＦ）デヒドロゲナーゼ欠損症（ＧＡＩＩ ＆ ＭＡＤＤ）；タンジール病；および妊娠性急性脂肪肝が含まれる。ミトコンドリア病の例には、少なくとも、進行性外眼筋麻痺（ＰＥＯ）；真性糖尿病および聴覚消失（ＤＡＤ）；レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様症候群（ＭＥＬＡＳ）；赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）；リー症候群；亜急性硬化性脳症；ニューロパシー、運動失調症、網膜色素変性、および下垂症（ＮＡＲＰ）；カーンズ・セイアー症候群（ＫＳＳ）；筋神経原性胃腸脳症（ＭＮＧＩＥ）が含まれる。
本発明の特定の態様では、代謝障害は、１つまたは複数の以下であるか、その合併症の１つとして１つまたは複数の以下を有する：肥満、高脂質血症、糖尿病、脂肪肝、高血圧症、および心血管疾患。
ＩＩＩ．本発明の例示的組成物
１つの実施形態では、以下の一般式：
Ａ−Ｂ−Ｃ
（式中、
Ａ、Ｂ、およびＣは同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、５員環、６員環、または７員環であり得、環は、複素環もしくは非複素環、置換環、または非置換環である）を有する少なくとも１つの化合物またはその薬学的に許容可能な塩および立体異性体の投与を含む代謝障害の治療方法が存在する。
好ましくは、環Ａは、１つのヘテロ原子を有する６員複素環である。環Ａを置換することができる。好ましい実施形態では、環はピリジン環であり、より好ましくは、ピリジン環の窒素原子は、環Ｂの位置に対して４位にある。もっとも好ましくは、ピリジン環は、窒素ヘテロ原子に対してα位にある炭素上のｎ−プロピル基と置換される。他の好ましい実施形態では、環Ａ上に１〜５原子の側鎖、より好ましくは１〜５個の炭素原子の側鎖が存在する。他の例示的且つ非限定的な実施形態では、環Ａは、例えば、フェニル、ピロール、チオフェン、フラン、ピリミジン、イソキノリン、キノリン、ベンゾフラン、インドール、オキサゾール、またはナフチルであり得る。
好ましくは、環Ｂは、少なくとも２つのヘテロ原子を有する５員環である。環Ｂを置換することができる。好ましい実施形態では、環Ｂはチアゾール環である。他の例示的且つ非限定的な実施形態では、環Ｂは、例えば、オキサゾール、イミダゾール、イソオキサゾール、イミダゾール、チフェン、フラン、ピリミジン、ピラゾール、またはイソチアゾールであり得る。
好ましくは、環Ｃは、６員環、最も好ましくはフェニル環である。環Ｃを置換することができる。好ましい実施形態では、環Ｃはメチル置換される。他の例示的且つ非限定的な実施形態では、環Ｃは、例えば、フェニル、ピリジン、ピロール、チオフェン、フラン、ピリミジン、イソキノリン、キノリン、ベンゾフラン、インドール、オキサゾール、またはナフチルであり得る。
例示的化合物を、図１４に示す。図１４の化合物１を参照して、ｎ−プロピル置換ピリジン環は一般式の環Ａに対応し、２，４−置換チアゾール環は一般式の環Ｂに対応し、メチル置換フェニル環は一般式の環Ｃに対応する。
置換が任意の環Ａ、環Ｂ、および環Ｃ中の任意の位置で許容可能であり、任意の置換が任意の他の置換と同一であっても異なっていてもよいと理解すべきである。置換の非限定的な例には、図１４に示す置換に加えて、以下の基が含まれる：Ｈ（すなわち、非置換）；ヒドロキシ；Ｃ１〜１０アルキル；Ｃ２〜１０アルケニル；Ｃ２〜１０アルキニル；Ｃ３〜６シクロアルキル；アリール；ヘテロアリール（ここで、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、およびヘテロアリール基は、ヒドロキシ、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ、−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０であり、ＲａはＣ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、またはＣ３〜６シクロアルキルである）、アリール、ヘテロアリール、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、シアノ、カルボキシ、アミノ、一置換アミノおよび二置換アミノ、一置換アミドおよび二置換アミド、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基と任意選択的に置換される）；−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ、−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０であり、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、またはＣ３〜６シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード；シアノ；カルボキシ；アミノ；アミド、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、スルホキシド、スルホン、スルホナート、アルキルスルホナート、スルホン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される置換を有する一置換アミノおよび二置換アミノである）；（ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールは、ヒドロキシ、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ、−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０であり、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、またはＣ３〜６シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール；フルオロ；クロロ；ブロモ；ヨード；シアノ；カルボキシ；アミノ；１つまたは複数のＣ１〜１０アルキル基、Ｃ２〜１０アルケニル基、Ｃ２〜１０アルキニル基、およびそれらの任意の組み合わせとの一置換アミノおよび二置換アミノである）からなる群から選択される１〜５個の基と任意選択的に置換される）；ならびにＣ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、スルホキシド、スルホン、スルホナート、アルキルスルホナート、スルホン酸、スルホナート、アルキルスルホナート、スルホン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される置換を有する一置換アミドおよび二置換アミド（ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールは、ヒドロキシル；−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ、−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０であり、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、またはＣ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールである）；フルオロ；クロロ；ブロモ；ヨード；シアノ；カルボキシ；アミノ；１つまたは複数のＣ１〜１０アルキル基、Ｃ２〜１０アルケニル基、Ｃ２〜１０アルキニル基との一置換アミノおよび二置換アミノである）およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基と任意選択的に置換される）。
特定の実施形態では、一般式：
Ａ−Ｂ−Ｃ
（式中、
Ａ、Ｂ、およびＣは同一または異なり、それぞれ、５員環、６員環、または７員環を含み、この環は、複素環もしくは非複素環、置換環、または非置換環であり、
Ａ、Ｂ、およびＣの任意の１つ、任意の２つ、または３つ全ては、非置換であるか、１つまたは複数の置換を有し、任意の置換は任意の他の置換と同一であっても異なっていてもよく、置換は、以下：
ａ）ヒドロキシ；
ｂ）Ｃ１〜１０アルキル；
ｃ）Ｃ２〜１０アルケニル；
ｄ）Ｃ２〜１０アルキニル；
ｅ）Ｃ３〜６シクロアルキル；
ｆ）アリール；
ｇ）ヘテロアリール；
ここで、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、および／またはｇ）中の置換は、以下：
１）ヒドロキシ；
２）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
３）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
４）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
５）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
６）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）；
７）ハロ；
８）シアノ；
９）カルボキシ；
１０）アミノ；
１１）一置換アミノ；
１２）二置換アミノ；
１３）アミド；
１４）一置換アミド；
１５）二置換アミド；および
１６）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換され、
ここで、２）、３）、または６）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
ｈ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
ｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
ｊ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
ｋ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
ｌ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
ここで、ｈ）、ｉ）、またはｌ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
ｍ）ハロ；
ｎ）シアノ；
ｏ）カルボキシ；
ｐ）アミノ；
ｑ）一置換アミノ；
ｒ）二置換アミノ、
ｓ）アミド；
ｔ）一置換アミド；および
ｕ）二置換アミドからなる群から選択され、
ここで、該一置換アミノ、二置換アミノ、一置換アミド、および二置換アミドの１つまたは複数は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、スルホキシド、スルホン、スルホナート、アルキルスルホナート、スルホン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される置換を有し、
ここで、ｕ）において、該アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールは、以下：
ｉ）ヒドロキシ；
ｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
ｉｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
ｉｖ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
ｖ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
ｖｉ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
ここで、ｉｉ）、ｉｉｉ）、またはｖｉ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
ｖｉｉ）ハロ；
ｖｉｉｉ）シアノ；
ｉｘ）カルボキシ；
ｘ）アミノ；
ｘｉ）一置換アミノ；
ｘｉｉ）二置換アミノ；
ｘｉｉｉ）アミド；
ｘｉｖ）一置換アミド；
ｘｖ）二置換アミド；および
ｘｖｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換される）を有する１つの化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体が存在する。
特定の化合物の例には、２−プロピル−４−（４−ｐ−トリルチアゾール−２−イル）ピリジン；４−（４−（４−ブロモフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−フェニルチアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（４−クロロフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（４−エチルフェニル）チアゾール−２−イル）ピリジン；４−（４−ｐ−トリルチアゾール−２−イル）ピリジン；４−（４−（４−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）ピリジン；安息香酸４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル；４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；メチル２−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノキシ）アセテート；２−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノキシ）酢酸；４−（４−クロロフェニル）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）チアゾール；４−（４−（３，４−ジクロロフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（４−フルオロフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（２，４−ジフルオロフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−イソプロピル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）アセトアミド；Ｎ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）メタンスルホンアミド；Ｎ−ベンジル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−（シクロプロピルメチル）−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；４−（４−ブロモフェニル）−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボン酸；メチル４−（４−ブロモフェニル）−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボキシレート；４−（４−（４−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（３−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（２−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；２−フェニル−４−ｐ−トリルチアゾール；３−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；２−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；４−（４−ブロモフェニル）−Ｎ−イソプロピル−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボキシアミド；４−（４−（４−クロロフェニル）チアゾール−２−イル）ピリジン；４−（４−（４−クロロフェニル）チアゾール−２−イル）−２−エチルピリジン；４−（４−クロロフェニル）−２−フェニルチアゾール；２−プロピル−４−（４−（チオフェン−２−イル）チアゾール−２−イル）ピリジン；４−（４’−メチル［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−プロピル）ピリジン；２−（２−プロピルピリジン−４−イル）−４−ｐ−トリルチアゾール−５−カルボン酸；２−エチル−４−（４−ｐ−トリルチアゾール−２−イル）ピリジン；４−フェニル−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボン酸；メチル２−（２−プロピルピリジン−４−イル）−４−ｐ−トリルチアゾール−５−カルボキシレート；ｔｅｒｔ−ブチル４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニルカルバメート；Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−Ｎ−トシルベンゼンアミン；Ｎ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）−８−キノリンスルホンアミド；Ｎ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）−２−チオフェンスルホンアミドが含まれる。
好ましい化合物は、２−プロピル−４−（４−ｐ−トリルチアゾール−２−イル）ピリジン；４−（４−（４−ブロモフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン、Ｎ−イソプロピル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン、およびＮ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）メタンスルホンアミドである。
本明細書中で使用する場合、用語「アルキル」は、直鎖または分岐鎖の非環式炭化水素からの１水素原子の概念的除去によって誘導される１価の置換（すなわち、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ（ＣＨ３）３など）をいう。
本明細書中で使用する場合、用語「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む直鎖または分岐鎖の非環式不飽和炭化水素からの１水素原子の概念的除去によって誘導される１価の置換（すなわち、−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、−Ｃ＝Ｃ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２など）をいう。
本明細書中で使用する場合、用語「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む直鎖または分岐鎖の非環式不飽和炭化水素からの１水素原子の概念的除去によって誘導される１価の置換（すなわち、−Ｃ≡ＣＨ、−Ｃ≡ＣＣＨ３、−Ｃ≡ＣＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨなど）をいう。
本明細書中で使用する場合、用語「アリールオキシ」は、架橋酸素原子を有するアリール基（フェノキシ（−ＯＣ６Ｈ５）またはベンゾキシ（−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５）など）をいう。「アリールアミノ」は、架橋アミン官能基を有するアリール基（−ＮＨＣＨ２Ｃ６Ｈ５など）を意味する。「アリールアミド」は、架橋アミド基を有するアリール基（−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨＣＨ２Ｃ６Ｈ５など）を意味する。
本明細書中で使用する場合、用語「アルキリデン」は、同一炭素原子からの２水素原子の概念的除去によって直鎖または分岐鎖の非環式飽和炭化水素から誘導される２価の置換（すなわち、＝ＣＨ２、＝ＣＨＣＨ３、＝Ｃ（ＣＨ３）２など）をいう。
本明細書中で使用する場合、用語「シクロアルキル」は、飽和単環式炭化水素からの１水素原子の概念的除去によって誘導される１価の置換（すなわち、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、またはシクロヘプチル）をいう。
本明細書中で使用する場合、用語「アリール」は、単環式または二環式の芳香族炭化水素からの１水素原子の概念的除去によって誘導される１価の置換をいう。アリール基の例は、フェニル、インデニル、およびナフチルである。
本明細書中で使用する場合、用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択される１、２、３、または４個のヘテロ原子を含む単環式または二環式の芳香環系からの１水素原子の概念的除去によって誘導される１価の置換をいう。ヘテロアリール基の例には、ピロリル、フリル、チエニル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、ベンズイミダゾリル、インドリル、およびプリニルが含まれるが、これらに限定されない。ヘテロアリール置換を、炭素原子に結合させるか、ヘテロ原子を介して結合させることができる。単環式ヘテロアリール基の例には、ピロリル、フリル、チエニル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、およびピリジルが含まれる。二環式ヘテロアリール基の例には、ピリミジニル、ピラジニル、ベンズイミダゾリル、インドリル、およびプリニルが含まれる。各環は、５または６原子を有することができる。したがって、これには、４員の単環式ヘテロアリール基および５員の単環式ヘテロアリール基が含まれる。これには、１つの５員環および１つの６員環を有する二環式ヘテロアリール基および２つの６員環を有する二環式ヘテロアリール基も含まれる。
用語「ハロ」には、ヨード、ブロモ、クロロ、およびフルオロが含まれる。
用語「置換」は、置換による複数の置換度が含まれると考えられるものとする。化学基または化学部分の原子価が水素以外の原子または官能基によって満たされる場合に置換が起こる。複数の置換の場合、置換化合物を、１つまたは複数の開示または特許請求の範囲に記載の置換部分と単独または複数で独立して置換することができる。「独立して置換する」は、（２つ以上の）置換が同一であっても異なっていてもよいことを意味する。
用語「薬学的に許容可能な塩」は、本明細書中で、薬学的に許容可能であり、親化合物の所望の薬理活性を有する塩をいう。かかる塩には、以下が含まれる：（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、およびリン酸などの無機酸を使用して形成された、または酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタン−ジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４−メチルビシクロ［２．２．２］−オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ−ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸（ｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｔｈｏｉｃ ａｃｉｄ）、サリチル酸、ステアリン酸、およびムコン酸などの有機酸を使用して形成された酸付加塩；あるいは（２）親化合物中に存在する酸性プロトンが金属イオン（例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、またはアルミニウムイオン）と置換された場合に形成される塩；またはエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、およびＮ−メチルグルカミンなどの有機塩基との錯体。
用語「立体異性体」は、その原子連結性が１つまたは複数の他の分子と同一であるが、空間におけるその原子配置が異なる異性体分子を意味する。この定義には、鏡像異性体、ジアステレオマー、シス異性体、トランス異性体、配座異性体が含まれる。
用語「非置換」は、化学基または化学部分の原子価が水素によって満たされている全ての物質を意味する。
本発明はまた、本明細書中に開示の化合物の保護誘導体を含む。例えば、本発明の化合物がヒドロキシルまたはカルボニルなどの基を含む場合、これらの基を安定な保護基で保護することができる。適切な保護基の総合リストを、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９８１（その開示全体が本明細書中で参考として援用される）に見出すことができる。本発明の化合物の保護誘導体を、当該分野で周知の方法によって調製することができる。
本発明の化合物は、不斉中心、キラル軸、およびキラル面を有することができ、ラセミ体、ラセミ化合物、および各ジアステレオマーとして生じ、全ての可能なその異性体および混合物（光学異性体が含まれる）が本発明に含まれる。さらに、本明細書中に開示の化合物は、互変異性体として存在することができ、両互変異性体は、一方の互変異性体構造しか示していないが、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
ＩＶ．ＳＲＥＢＰ
本発明の特定の実施形態では、本発明の組成物は、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）経路の１つまたは複数のメンバーを対象とする。経路は、特定の態様で細胞質から核への輸送を容易にする膜結合転写因子（ＳＲＥＢＰ）のタンパク質分解性放出に関する。ここで、ＳＲＥＢＰは、脂質産生に関連する酵素をコードする遺伝子の調節領域に存在するステロール調節エレメント（ＳＲＥ）と呼ばれるエレメントに結合する。ＳＲＥＢＰのＤＮＡへの結合の際、標的遺伝子の転写は調整（例えば、上方制御など）される。
小胞体（ＥＲ）の膜および核膜は、タンパク質の中心にその２つの膜貫通ヘリックスを介してＳＲＥＢＰ前駆体タンパク質を格納している。膜内の前駆体タンパク質のヘアピン方向により、アミノ末端転写因子ドメインおよびＣＯＯＨ末端調節ドメインの両方が細胞質に向かうことが可能である。タンパク質の切断によって転写活性アミノ末端ドメインの作用および放出のためにタンパク質を放出し、前駆体タンパク質の切断は、サイト−１プロテアーゼ（Ｓ１Ｐ）およびサイト−２プロテアーゼ（Ｓ２Ｐ）によって行われる。切断タンパク質は、その各カルボキシ末端ドメイン間の相互作用を介してＳＲＥＢＰと複合体を形成するＳＲＥＢＰ切断活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）によって活性化する。
ＳＲＥＢＰの３つの異なるイソ型（ＳＲＥＢＰ−１ａ、−１ｃ、および−２）は、哺乳動物ゲノム中の２つの異なるＳＲＥＢＰ遺伝子中に存在する。ＳＲＥＢＰ−１ａおよび−１ｃは、ＳＲＥＢＰ−１の異なる転写開始部位の使用によってその第１のエクソンが異なる。ＳＲＥＢＰ−１は、脂肪酸合成遺伝子の調節に関連すると考えられるのに対して、ＳＲＥＢＰ−２はコレステロール代謝遺伝子を調節する。
一般に、ＳＲＥＢＰは、ステロール調節エレメント（ＳＲＥ）を含む標的遺伝子のアクチベーターと考えられている（Ｓｈｉｍａｎｏ ２００１）。これらの遺伝子には、例えば、少なくとも以下が含まれる：１）脂肪酸代謝経路（アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、脂肪酸シンターゼ、ステアロイル（Ｓｔｅａｒｏｌｙ）−ＣｏＡデカルボキシラーゼ−１および２リンゴ酸酵素、ＰＰＡＲγ、アセチル−ＣｏＡシンターゼ、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、アシルＣｏＡ結合タンパク質など）；２）コレステロール合成（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ＬＤＬ受容体、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ファルネシル二リン酸シンターゼ、スクアランシンターゼなど）；３）トリグリセリド合成（グリセロール−３リン酸アシルトランスフェラーゼなど）；および４）血漿リポタンパク質代謝（リポタンパク質リパーゼおよびＨＤＬ受容体など）。ＳＲＥＢＰがこれらの遺伝子に特異的な正のレギュレーターの置換によって他のＳＲＥ含有遺伝子のリプレッサーとして作用することができることも報告されている（Ｓｈｉｍａｎｏ ２００１）。ミクロソーム転移タンパク質およびカベオリンなどのこれらの遺伝子は、例えば、細胞コレステロール含有量の調節に関与する。
Ｖ．薬学的調製物
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能なキャリアに溶解または分散された有効量の１つまたは複数の本発明の組成物（およびさらなる薬剤（必要に応じる））を含む。句「薬学的または薬理学的に許容可能な」は、例えば、必要に応じて、ヒトなどの動物に投与した場合に副作用、アレルギー反応、または他の有害反応を引き起こさない分子的実体および組成物をいう。少なくとも１つのファトスタチンＡ類似体もしくは誘導体またはさらなる有効成分を含む薬学的組成物の調製は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０（本明細書中で参考として援用される）に例示されるように、本開示を考慮して当業者に公知であろう。さらに、動物（例えば、ヒト）投与のために、調製物は、ＦＤＡの生物学的基準に必要とされる無菌性、発熱性、一般的安全性、および純度の基準を満たすべきであると理解されるであろう。
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容可能なキャリア」には、当業者に公知のように、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌薬、抗真菌薬）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、矯味矯臭剤、色素、それらの類似の物質および組み合わせが含まれる（例えば、 Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０、ｐｐ．１２８９−１３２９（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。任意の従来のキャリアが有効成分と不適合である場合を除き、薬学的組成物中でのその使用が意図される。
ファトスタチンＡ類似体または誘導体は、固体、液体、またはエアゾール形態のいずれで投与するか、注射などの投与経路に対して無菌である必要があるかどうかに応じて、異なるキャリア型を含むことができる。本発明は、当業者に公知のように、静脈内、皮内、経皮、髄腔内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、局所、筋肉内、皮下、粘膜、口腔、局所、局部、吸入（例えば、エアゾール吸入）、注射、注入、連続注入、直接的に標的細胞を浸漬する局在化潅流、カテーテル、洗浄液、クリーム、脂質組成物（例えば、リポソーム）、または他の方法または上記の任意の組み合わせによって投与することができる（例えば、 Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
ファトスタチンＡ類似体または誘導体を、遊離塩基形態、中性形態、または塩形態の組成物に処方することができる。薬学的に許容可能な塩には、酸付加塩（例えば、タンパク質組成物の遊離アミノを使用して形成されたか、あるいは、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸、またはマンデル酸などの有機酸を使用して形成された酸付加塩）が含まれる。遊離カルボキシル基を使用して形成された塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、またはプロカインなどの有機塩基に由来し得る。処方の際、溶液を、投薬処方物に適合する様式および治療に有効な量などで投与するであろう。処方物は、種々の投薬形態（注射液などの非経口投与のために処方した投薬形態などまたは肺への送達のためのエアゾール、または薬物放出カプセルなどの摂取投与のために処方した投薬形態）で容易に投与される。
さらに、本発明によれば、投与に適切な本発明の組成物を、不活性希釈剤を含むか、または含まない薬学的に許容可能なキャリア中に準備する。キャリアは吸収可能であるべきであり、液体、半固体（すなわち、ペースト）、または固体のキャリアが含まれる。任意の従来の媒質、薬剤、希釈剤、またはキャリアがレシピエントまたはこれらに含まれる組成物の治療有効性に悪影響をもたらす場合を除き、本発明の方法の実施で用いる投与可能な組成物を使用することが適切である。キャリアまたは希釈剤の例には、脂肪、油、水、生理食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、および充填剤などのまたはそれらの組み合わせが含まれる。組成物はまた、１つまたは複数の成分の酸化を遅延するための種々の抗酸化剤を含むことができる。さらに、種々の抗生物質および抗真菌薬などの防腐剤（パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チロメサール、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない）によって微生物作用を予防することができる。
本発明によれば、組成物を、任意の都合の良く且つ実践的な様式で（すなわち、溶液、懸濁液、乳濁液、混合物、カプセル化、および吸収など）キャリアと組み合わせる。かかる手順は、当業者に日常的である。
本発明の特定の実施形態では、組成物を、半固体または固体のキャリアと組み合わせるか、または完全に混合する。粉砕など任意の都合の良い様式で混合することができる。混合過程で安定剤を添加して、治療活性の喪失（すなわち、胃内での変性）から組成物を保護することもできる。組成物で用いる安定剤の例には、緩衝液、アミノ酸（グリシンおよびリジンなど）、炭水化物（デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトールなど）が含まれる。
さらなる実施形態では、本発明は、ファトスタチンＡ類似体または誘導体、１つまたは複数の脂質、および水性溶媒を含む薬学的脂質ビヒクル組成物の使用に関し得る。本明細書中で使用する場合、用語「脂質」は、水に特徴的に不溶であり、有機溶媒で抽出可能な任意の広範な範囲の物質を含むと定義されるであろう。この広範な化合物クラスは当業者に周知であり、用語「脂質」を本明細書中で使用する場合、任意の特定の構造に制限されない。例には、長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体を含む化合物が含まれる。脂質は、天然に存在する脂質でも合成脂質（すなわち、人為的にデザインまたは産生される）でもよい。しかし、脂質は、通常、生体物質である。生体脂質は当該分野で周知であり、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リソ脂質（ｌｙｓｏｌｉｐｉｄ）、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド（ｓｕｌｐｈａｔｉｄｅ）、エーテルおよびエステル結合脂肪酸を有する脂質および重合性脂質、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。勿論、当業者によって脂質と理解される本明細書中に具体的に記載した化合物以外の化合物も本発明の組成物および方法に含まれる。
当業者は、脂質ビヒクル中に組成物を分散させるために使用することができる技術範囲に精通しているであろう。例えば、ファトスタチンＡ類似体または誘導体を、脂質を含む溶液中に分散するか、脂質と共に溶解するか、脂質と共に乳化するか、脂質と混合するか、脂質と組み合わせるか、脂質と共有結合させるか、脂質中に懸濁液として含むか、ミセルまたはリポソームと共に含むか、または複合体を形成するか、そうでなければ、当業者に公知の任意の手段によって脂質または脂質構造と会合することができる。分散により、リポソームを形成しても形成しなくても良い。
動物患者に投与する本発明の組成物の実際の投薬量を、物理的および生理学的要因（体重、状態の重症度、治療される疾患の型、以前または現在の治療介入、患者の特発性、および投与経路など）によって決定することができる。投薬量および投与経路に応じて、好ましい投薬量および／または有効量の投与数は、被験体の反応に応じて変化し得る。投与を担う実務者は、任意の事象で、各被験体のための組成物中の有効成分の濃度および適切な用量を決定するであろう。
ある実施形態では、薬学的組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含むことができる。他の実施形態では、活性化合物は、構成単位の重量の約２％〜約７５％または約２５％〜約６０％（例えば、この数値内で導かれる任意の範囲）で含むことができる。必然的に、それぞれの治療に有用な組成物中の活性化合物の量を、任意の所与の用量の化合物中に適切な投薬量が得られるような方法で準備することができる。溶解性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、生成物の有効期間、および他の薬理学的検討事項などの要因は、かかる薬学的処方物の調製分野の当業者によって意図され、そのようなものとして、種々の投薬量および治療レジメンが望ましいかもしれない。
他の非限定的な例では、用量は、投与あたり約１μｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重、約１０μｇ／ｋｇ／体重、約５０μｇ／ｋｇ／体重、約１００μｇ／ｋｇ／体重、約２００μｇ／ｋｇ／体重、約３５０μｇ／ｋｇ／体重、約５００μｇ／ｋｇ／体重、約１ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約２００ｍｇ／ｋｇ／体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５００ｍｇ／ｋｇ／体重から約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重までまたはそれを超える用量、およびこれらの数値内から導かれる任意の範囲も含むことができる。本明細書中に列挙した数値から導かれる範囲の非限定的な例では、上記数値に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重の範囲、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ／体重の範囲などを投与することができる。
Ａ．消化管組成物および処方物
本発明の好ましい実施形態では、消化管経路を介して投与されるようにファトスタチンＡ類似体または誘導体を処方する。消化管経路には、組成物が消化管に直接接触する全ての可能な投与経路が含まれる。具体的には、本明細書中に開示の薬学的組成物を、経口、口腔、直腸、または舌下に投与することができる。そのようなものとして、これらの組成物を、不活性希釈剤または吸収可能な食用キャリアを使用して処方することができるか、硬ゼラチンカプセルまたは軟ゼラチンカプセル中に封入することができるか、打錠することができるか、あるいは食物と直接組み込むことができる。
ある実施形態では、活性化合物を、賦形剤と組み込み、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、およびウェハーなどの形態で使用することができる（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、１９９７；Ｈｗａｎｇら、１９９８；米国特許第５，６４１，５１５号；同第５，５８０，５７９号；および同第５，７９２，４５１号（それぞれ、その全体が本明細書中に具体的に援用される））。錠剤、トローチ、丸薬、およびカプセルなどはまた、以下も含むことができる：結合剤（例えば、トラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプン、ゼラチン、またはそれらの組み合わせなど）；賦形剤（例えば、第二リン酸カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、またはそれらの組み合わせなど）；崩壊剤（例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸、またはそれらの組み合わせなど）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムなど）；甘味剤（例えば、スクロース、ラクトース、サッカリン、またはそれらの組み合わせなど）；矯味矯臭剤（例えば、ペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリーフレーバー、オレンジフレーバーなど）。投薬単位形態がカプセルである場合、上記物質型に加えて、液体キャリアを含むことができる。種々の他の材料がコーティングとして、またはそうでなければ投薬単位の物理的形態を改変するために存在することができる。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセルを、シェラック、糖、またはその両方でコーティングすることができる。投薬形態がカプセルである場合、上記材料型に加えて、液体キャリアなどのキャリアを含むことができる。ゼラチンカプセル、錠剤、または丸薬を、腸溶コーティングすることができる。腸溶コーティングは、ｐＨが酸性である胃内または小腸上部中での組成物の変性を防止する。例えば、米国特許第５，６２９，００１号を参照のこと。小腸への到達の際、小腸中の塩基性ｐＨによりコーティングが溶けて、組成物が放出され、特殊化細胞（例えば、上皮腸細胞およびパイエル板Ｍ細胞）によって吸収される。エリキシルのシロップは、活性化合物、甘味剤としてのスクロース、防腐剤としてのメチルパラベンおよびプロピルパラベン、色素、およびフレーバー（チェリーフレーバーまたはオレンジフレーバーなど）を含むことができる。勿論、任意の投薬単位形態の調製で使用される任意の材料は、薬学的に純粋であり、使用量で実質的に非毒性でなければならない。さらに、活性化合物を、徐放性の調製物および処方物に組み込むことができる。
経口投与のために、本発明の組成物を、代替法として、含嗽剤、歯磨剤、口腔錠、口腔噴霧剤、または舌下経口投与処方物の形態で１つまたは複数の賦形剤と組み込むことができる。例えば、適切な溶媒（ホウ酸ナトリウム溶液（Ｄｏｂｅｌｌ’ｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）など）中に必要量の有効成分を組み込んだ含嗽剤を調製することができる。あるいは、有効成分を、経口溶液（ホウ酸ナトリウム、グリセリン、および重炭酸カリウムを含む経口溶液など）に組み込むか、歯磨剤中に分散させるか、水、結合剤、研磨剤、矯味矯臭剤、起泡剤、および保湿剤を含むことができる組成物に治療有効量で添加することができる。あるいは、組成物を、舌下に置くことができるか、あるいは口腔内で溶解することができる錠剤または溶液に構築することができる。
他の消化管投与様式に適切なさらなる処方物には、座剤が含まれる。座剤は、種々の重量および形状の固体投薬形態であり、通常、直腸に挿入するように薬物適用される。挿入後、座剤は、腔液中で軟化、融解、または溶解する。一般に、座剤のために、伝統的なキャリアには、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリド、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。ある実施形態では、座剤を、例えば、約０．５％〜約１０％、好ましくは約１％〜約２％の範囲の有効成分を含む混合物から形成することができる。
Ｂ．非経口組成物および処方物
さらなる実施形態では、ファトスタチンＡ類似体または誘導体を、非経口経路を介して投与することができる。本明細書中で使用する場合、用語「非経口」には、消化管を回避する経路が含まれる。具体的には、本明細書中に開示の薬学的組成物を、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、動脈内、髄腔内、皮下、または腹腔内（これらに限定されない）に投与することができる。米国特許第６，５３７，５１４号、同第６，６１３，３０８号、同第５，４６６，４６８号、同第５，５４３，１５８号、同第５，６４１，５１５号、および同第５，３９９，３６３号（それぞれ、その全体が本明細書中で参考として具体的に援用される）。
遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中に調製することができる。グリセロール、脂質ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物、ならびに油中に分散体を調製することもできる。通常の保存および使用条件下で、これらの調製物は微生物の増殖を防止するための防腐剤を含む。注射に適切な薬学的形態には、滅菌水溶液または滅菌分散体および滅菌注射溶液または滅菌注射分散体の即時調製のための滅菌粉末が含まれる（米国特許第５，４６６，４６８号（その全体が本明細書中で参考として具体的に援用される））。全ての場合において、形態は、無菌でなければならず、容易に注射可能な範囲の流動物でなければならない。製造および保存条件下で安定でなければならず、微生物（細菌および真菌など）の汚染作用から防御されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（すなわち、グリセロール、プロピレングリコール、および脂質ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／または植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散体の場合の必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。種々の抗菌薬および抗真菌薬（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、およびチロメサールなど）によって微生物作用を防止することができる。多くの場合、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含めることが好ましいであろう。組成物中の吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によって注射組成物を持続的に吸収させることができる。
水溶液中での非経口投与のために、例えば、必要に応じて溶液を適切に緩衝化し、液体希釈剤を最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に適切である。これに関連して、使用することができる滅菌水媒体は、本開示を考慮して、当業者に公知であろう。例えば、ある投薬量を、１ｍＬの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解し、１０００ｍＬの皮下注入液に添加するか、適切な注入部位に注射することができる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐａｇｅｓ １０３５−１０３８および１５７０−１５８０を参照のこと）。治療される被験体の状態に応じて、投薬量のいくつかのバリエーションが必然的に生じるであろう。投与を行う者は、任意の事象で、各被験体に適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒト投与のために、調製物は、ＦＤＡの生物学的基準に必要とされる無菌性、発熱性、一般的安全性、および純度の基準を満たすべきである。
滅菌注射液を、上に列挙の種々の他の成分を含む適切な溶媒中の必要量の活性化合物の組み込みおよびその後の必要に応じた濾過滅菌によって調製する。一般に、塩基性分散媒および上に列挙の必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルへの種々の滅菌有効成分の組み込みによって分散体を調製する。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、事前に濾過滅菌したその溶液からの有効成分および任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる真空乾燥技術および凍結乾燥技術である。粉末組成物を、安定剤を含むかまたは含まない液体キャリア（例えば、水または生理食塩水など）と合わせる。
Ｃ．多岐にわたる薬学的組成物および処方物
本発明の他の好ましい実施形態では、活性化合物ファトスタチンＡ類似体または誘導体を、種々の多岐にわたる経路（例えば、局所（すなわち、経皮）投与、粘膜投与（鼻腔内、膣など）および／または吸入）を介した投与のために処方することができる。
局所投与のための薬学的組成物は、軟膏、ペースト、クリーム、または粉末などの医学的適用のために処方された活性化合物を含むことができる。軟膏には、局所適用のための全ての油脂性物質、吸着物質、乳濁液、および水溶性ベースの組成物が含まれる一方で、クリームおよびローションは、乳濁液基剤のみを含む組成物である。局所的に投与される医薬品は、皮膚を介した有効成分の吸着を促進するための浸透促進剤を含むことができる。適切な浸透促進剤には、グリセリン、アルコール、アルキルメチルスルホキシド、ピロリドン、およびラウロカプラム（ｌｕａｒｏｃａｐｒａｍ）が含まれる。局所適用のための組成物に可能な基剤には、ポリエチレングリコール、ラノリン、コールドクリーム、およびペトロラタム、ならびに任意の他の適切な吸収、乳濁液、または水溶性軟膏基剤が含まれる。局所調製物には、必要に応じて、有効成分を保存し、均一な混合物を得るための乳化剤、ゲル化剤、および抗菌防腐剤も含まれ得る。本発明の経皮投与は、「パッチ」の使用も含むことができる。例えば、パッチは、所定の速度および固定期間にわたる連続的様式で１つまたは複数の活性物質を供給することができる。
ある実施形態では、薬学的組成物を、点眼薬、鼻腔内噴霧、吸入、および／または他のエアゾール送達ビヒクルによって送達させることができる。鼻内エアゾール噴霧を介して肺へ組成物を直接送達させる方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および同第５，８０４，２１２号（それぞれ、その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、１９９８）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号（その全体が本明細書中で具体的に援用される））を使用した薬物の送達も薬学分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号（その全体が本明細書中で具体的に援用される）に記載されている。
用語「エアゾール」は、液化または圧縮ガス噴射剤中に分散させた液体粒子の微粉化固体のコロイド系をいう。吸入用の典型的な本発明のエアゾールは、液体噴射剤または液体噴射剤と適切な溶媒との混合物中の有効成分の懸濁液からなるであろう。適切な噴射剤には、炭化水素および炭化水素エーテルが含まれる。適切な容器は、噴射剤の圧縮要件に応じて変化するであろう。エアゾールの投与は、被験体の年齢、体重、ならびに症状の重症度および応答に応じて変化するであろう。
ＶＩ．併用療法
本発明の組成物の有効性を増加させるために、付加療法を代謝障害を有する個体に送達することができる。例えば、肥満個体に、肥満のための別の療法に加えて、本発明の組成物を投与することができる。さらなる肥満療法には、例えば、食事療法、理学療法（運動）、薬物療法、手術、および行動療法が含まれる。例示的薬物療法には、例えば、Ｘｅｎｉｃａｌ Ｏｒｌｉｓｔａｔ（登録商標）、フェンテルミン、およびシブトラミン（Ｍｅｒｉｄｉａ（登録商標））が含まれる。例示的手術には、例えば、脂肪吸引および胃バイパスが含まれる。
糖尿病個体のために、例えば、治療のための例示的なさらなる化合物には、１つまたは複数の以下が含まれる：アクトス（ピオグリチゾン（ｐｉｏｇｌｉｔｉｚｏｎｅ））；ＡＣＴＯＳＰｌｕｓ Ｍｅｔ；アマリール（グリメピリド）；アバンダリル（アバンジア＋グリミペリド）；アバンジア（ロシグリタゾン）；アバンダメット（マレイン酸ロシグリタゾンおよび塩酸メルホルミン）；バイエタップ（Ｂｙｅｔｔａｐ）；デュエタクト（Ｄｕｅｔａｃｔ）（ピオグリタゾンＨＣｌおよびグリメピリド）；ガルブス（Ｇａｌｖｕｓ）（ビルダグリプチン）；グリピジド（スルホニル尿素）；グルコファージ（メルホルミン）；グリメピリド；グルコバンス（グリブリド／メルホルミン）；グルコトロールＸＬ（持続放出グリピジド）；グリブリド；グリセット（ミグリトール）グルコシダーゼインヒビター；ジャニュービア（リン酸シタグリプチン）；メタグリップ（グリピジド＋メルホルミン）；メルホルミン−ビグアニド；プランジン（レパグリニド）；プレコース（アカルボース）；レズリン（トログリタゾン）；スターリックス（ナテグリニド）。他の糖尿病療法には、食事および運動の改善が含まれる。
ＶＩＩ．例示的な代謝障害治療の測定
本発明の特定の態様では、個体に、１つまたは複数の本発明の組成物を投与し、個体を、代謝障害の少なくとも１つの症状の改善について評価する。例えば、代謝障害が肥満である特定の実施形態では、肥満の改善を、１つまたは複数の本発明の組成物の治療中および／または治療後に決定することができる。肥満の改善を、任意の標準的手段によって測定することができるが、特定の態様では、肥満の改善を、例えば、体重測定、体型指数（ＢＭＩ）測定、および／または体部位のサイズの測定（腰囲測定）によって測定する。例示的なＢＭＩ計算方法は、個体の体重（キログラム）をその身長（メートル）の２乗で割ること（体重［ｋｇ］身長［ｍ］２）を含む。ＢＭＩ３０以上を肥満と見なし、ＢＭＩ２５〜２９．９を過体重と見なす。
本発明の他の態様では、糖尿病個体を、本発明の療法の個体への実施後の改善について試験する。１つの特定の実施形態では、糖尿病のモニタリングを血液検査によって行う。例えば、 血液検査は、化学的Ａ１Ｃを測定することができる。血糖値が高いほど、Ａ１Ｃレベルが高いであろう。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎは、糖尿病患者は糖尿病に関連する合併症を軽減するために、７．０％未満のＡ１Ｃを維持することを推奨している（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｓｔｓは、６．５％以下を推奨している）。
いくつかの場合、コレステロール（ＨＤＬおよび／またはＬＤＬコレステロールが含まれる）および／またはトリグリセリドを、当該分野の標準的手段などによって測定する。特定の場合、当該分野の標準的手段などによって空腹時リポタンパク質プロフィールを行う。
ＶＩＩＩ．本発明のキット
本明細書中に記載の任意の組成物を、キット中に含めることができる。非限定的な例では、キットは、１つまたは複数の代謝障害の治療および／または予防に適切な組成物を含む。
本発明の他の実施形態では、キットは、個体からサンプルを得るための１つまたは複数の装置を含む。かかる装置は、例えば、１つまたは複数のスワブ（綿スワブなど）、爪楊枝、小刀、スパチュラ、およびシリンジなどであり得る。
別の実施形態では、さらなる化合物（代謝障害の治療および／または予防のためのさらなる化合物など）をキット中に提供する。キット中に提供される任意の組成物を、例えば、水媒体または凍結乾燥形態のいずれかにパッケージングすることができる。キットの容器手段には、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段が含まれるであろう。この容器手段に、成分を配置し、好ましくは、適切に等分することができる。キット中に１つを超える成分が存在する場合、キットはまた、一般に、さらなる成分を個別に配置することができる第２、第３、または他のさらなる容器を含むであろう。
本発明の好ましい実施形態を証明するために以下の実施例を含める。当業者は、以下の実施例に開示の技術は、発明者らによって発見された技術を示し、本発明の実施において十分に機能し、したがって、好ましいその実施様式を構成すると見なすことができると認識すべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、開示の特定の実施形態における多数の変更を行い、本発明の精神および範囲を逸脱することなく同様または類似の結果が依然として得られることを認識すべきである。
（実施例１）
ファトスタチンＡはＳＲＥＢＰ応答性遺伝子の発現を減少させる
薬物処理細胞および非処理細胞の遺伝子発現プロフィールの比較により、ファトスタチンＡによって影響を受ける特異的分子経路を明らかにすることができる。ＤＵ１４５細胞を、ファトスタチンＡまたはＤＭＳＯのみで処理し、抽出ｍＲＮＡサンプルを、３３，０００遺伝子をマッピングするＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ ＤＮＡマイクロアレイによって分析した（表１）。
結果は、ファトスタチンＡによって下方制御された（０．７倍未満）遺伝子の５５％がステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）（ＬＤＬ受容体、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、および脂肪酸シンターゼが含まれる）によって調節されることが公知であるか、または可能性が高い遺伝子であるを示した（Ｈｏｒｔｏｎら、２００３）。代表的なＳＲＥＢＰ応答性遺伝子の下方制御を、ＲＴ−ＰＣＲ実験によって確認した（図１Ｂおよび１Ｃ）。これらの結果は、ファトスタチンＡがＳＲＥＢＰ経路の選択的インヒビターであることを示した。
ファトスタチンＡがＳＲＥＢＰの機能を妨害することを示すために、内因性ＳＲＥＢＰがＳＲＥＢＰ応答性レポーター遺伝子の転写を活性化する能力を、ＨＥＫ２９３細胞においてファトスタチンＡの存在下または非存在下で測定した（図２ＡＢ）。ファトスタチンＡは、濃度依存様式でレポーター遺伝子の活性化を減少させ、ここで、ルシフェラーゼ発現がステロール調節エレメントの３つの反復によって調節される。対照的に、ファトスタチンＡは外因的に発現したＳＲＥＢＰ−１の成熟形態（アミノ酸１〜５００）がレポーター遺伝子活性を活性化する能力を妨害することができなかった（図２Ｃ）。これらの結果は、ファトスタチンＡが細胞中のＳＲＥＢＰの活性化過程を選択的に遮断することを示す。
（実施例２）
ファトスタチンＡはＳＲＥＢＰのタンパク質分解活性を遮断する
ＳＲＥＢＰはタンパク質分解的にプロセシングされて核に転位し、ここで、ＳＲＥＢＰが脂質合成遺伝子の転写を活性化する（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、１９９７）。ファトスタチンＡがＳＲＥＢＰのタンパク質分解活性に影響を及ぼすかどうかを試験するために、ファトスタチンＡで処理したＤＵ１４５細胞の全細胞溶解物を、ＳＲＥＢＰ−１のＮＨ２末端に対する抗体を使用したウェスタンブロットによって分析した（図３Ａ）。ファトスタチンＡの処理により、用量依存様式でＳＲＥＢＰ−１の６８ｋＤａ成熟形態の量が減少した一方で、１２５ＫＤａ前駆体形態の量が増加した。そのＣＯＯＨ末端に対する抗体を使用して、ＳＲＥＢＰ−２について類似の結果が得られた（図３Ｂ）。これらの結果は、ファトスタチンＡが両ＳＲＥＢＰイソ型のタンパク質分解活性を直接または間接的に妨害することを示す。
ＳＲＥＢＰのタンパク質分解活性の阻害は、ＳＲＥＢＰの核転位を妨害するであろう。ＳＲＥＢＰ−１の細胞内局在に及ぼすファトスタチンＡの影響を、ＳＲＥＢＰ−１のＮＨ２末端に対する抗体を使用した免疫蛍光顕微鏡法によって分析した。細胞をＤＭＳＯのみで処理した場合、ＳＲＥＢＰ−１は、無血清（無脂肪）培地中にて核内にほぼ排他的に局在化した（図３Ｃ〜３Ｅ）。対照的に、細胞をファトスタチンＡとインキュベートした場合、核内のＳＲＥＢＰ−１の免疫蛍光が減少し、核の外側で相互に増加した（図３Ｆ〜３Ｈ）。これは、ファトスタチンＡがＳＲＥＢＰ−１の核局在化を阻害することを示す。
（実施例３）
ＳＲＥＢＰ−１のノックダウンによるファトスタチン表現型の検証
ファトスタチンＡにより、培養細胞中に以下の２つの表現型が生じる：（ｉ）３Ｔ３−Ｌ１細胞のインスリン誘導性脂肪生成の阻害および（ｉｉ）ＤＵ１４５前立腺癌細胞の血清非依存性成長の抑制（Ｃｈｏｉら、２００３）。第１の表現型は、脂質合成におけるＳＲＥＢＰ−１の公知の役割のために、ファトスタチンＡがＳＲＥＢＰ−１の遮断薬であるという本発明者らの結論と完全に一致する（Ｔｏｎｔｏｎｏｚら、１９９３；Ｋｉｍ ａｎｄ Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ、１９９６）。細胞培養条件下で３Ｔ３−Ｌ１細胞中のＳＲＥＢＰ−１発現がＳＲＥＢＰ−１に特異的な小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の発現ベクターのトランスフェクションによってサイレンシングされたことを確認するために（図４Ｇ）、インスリン誘導性脂肪生成に及ぼすサイレンシングの影響を試験した。予想通り、ＳＲＥＢＰ−１発現のノックダウンによって３Ｔ３−Ｌ１細胞の油滴形成が完全に遮断されたのに対して（図４Ｄおよび４Ｆ、クローン１および２）、空のベクター（ｎｅｏ）でトランスフェクトしたコントロール細胞は、親３Ｔ３−Ｌ１細胞ほどの脂肪蓄積を示した（図４Ｂ）。これらの結果は、３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるファトスタチンＡ誘導性表現型がＳＲＥＢＰ−１阻害によって媒介されることを示す。
ファトスタチンＡによるＳＲＥＢＰ−１の阻害がＤＵ１４５細胞の血清非依存性成長の抑制を媒介するかどうかを試験するために、ＤＵ１４５細胞中のＳＲＥＢＰ−１発現を、ＳＲＥＢＰ−１特異的ｓｉＲＮＡの発現ベクターのトランスフェクションによって同様にサイレンシングした（図５Ｂ）。空のベクター（ｎｅｏ）でトランスフェクトしたコントロール細胞は、血清またはＩＧＦ１のいずれかの存在下で成長し、親ＤＵ１４５細胞と同様であった。対照的に、ＳＲＥＢＰ−１発現がサイレンシングされたノックダウン細胞（クローン１および２）は、血清非依存性ＩＧＦ１駆動成長を減少させたのに対して、その血清依存性成長はほとんど影響を受けなかった（図５Ａ）。
血清非依存性成長におけるＳＲＥＢＰ−１の要件は、無血清培地中の外部脂肪供給源の欠如に起因し得る。外因性脂肪酸が血清中に存在しない場合、細胞は、細胞成長を維持するために脂肪酸およびコレステロール（膜の基礎単位）を合成する必要がある。細胞成長における脂肪酸の重要性を試験するために、無脂肪血清培地中のＳＲＥＢＰ−１ノックダウン細胞の成長をモニタリングした（図５Ａ）。ＳＲＥＢＰ−１サイレンシングにより、無血清ＩＧＦ１含有培地ほどに無脂肪培地中の細胞成長が妨害された。これらの結果は、ファトスタチンＡがＳＲＥＢＰ−１阻害によって癌細胞の血清非依存性成長を遮断することを示す。
（実施例４）
ファトスタチンＡは、マウスにおいて体重を減少させ、コレステロールレベルおよびグルコースレベルを低下させ、脂質合成酵素を下方制御する
ファトスタチンＡの薬物様化学構造により、本発明者らは、全動物の肝臓中のＳＲＥＢＰ−１を阻害する能力の調査に駆り立てられた。長期絶食（４８時間）およびその後のさらなる４８時間の無脂肪高炭水化物食の摂取による脂質合成条件下での肝臓ＳＲＥＢＰ−１に及ぼすファトスタチンＡの影響を試験した。マウスに、３０ｍｇ／ｋｇ／日のファトスタチンＡを、４８時間の絶食期間の１日前から開始して５日間腹腔内注射した。４８時間の絶食後、処置群はコントロール群よりも多くの体重が減少した（４．９±０．３ｇ／マウスと比較して６．１２±０．６；ｐ＝０．０１）（図６Ａ）。処置中に摂食の減少や明らかな毒性は認められなかった（図６Ｂ）。興味深いことに、無脂肪高炭水化物食の再摂取４８時間後、ファトスタチンＡ処置マウスの血清中のグルコースレベル（１３７±１４ｍｇ／ｄｌと比較して１１０±２３；Ｐ＝０．０６）およびコレステロール（１２０±１９ｍｇ／ｄｌと比較して９３±２０；Ｐ＝０．１２）が低下する傾向があった（図６Ｃ）。ＨＤＬおよびＬＤＬの両方は、処置マウス群で減少した。しかし、ＬＤＬレベルの減少がより有意なようであった（３０±６ｍｇ／ｄｌと比較して１６±５）（図６Ｃ）。
肝臓抽出物中のＳＲＥＢＰ−１の発現レベルを、ウェスタンブロットによって試験した。細胞培養物の結果と一致して、ファトスタチンＡで処置したマウス由来の肝臓抽出物は、ＳＲＥＢＰ−１の６８ＫＤａ成熟形態の量が減少し、１２５ＫＤａ前駆体形態の量が増加した（図６Ｄ）。脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）（代表的なＳＲＥＢＰ−１応答性脂質合成酵素（Ｂｏｉｚａｒｄら、１９９８））の肝臓発現も処置後に決定した。肝臓抽出物のウェスタンブロット分析により、ファトスタチンＡ処置によってＦＡＳ発現レベルが３０％まで減少したことが示された（図６Ｅ）。発現の減少と一致して、抽出物中のその酵素活性も同様に減少した（図６Ｆ）。ＦＡＳについて認められるように、ＳＲＥＢＰ−１によっても調節されるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）活性は、肝臓抽出物中で減少した（図６Ｇ）。これらの結果は、培養細胞で見出されるように、ファトスタチンＡがマウス肝臓中でのＳＲＥＢＰ−１の活性化を遮断することを示す。
普通食を与えた別のマウス群のより長い処置（２週間）によって体重が１０％減少したのに対して、コントロール群は、体重が変化しなかった（図７ＡＢ）。摂食は、両群間で類似していた（処置マウスおよびコントロールマウスについて、それぞれ、３．８および３．５ｇ／マウス／日）。無脂肪食を絶食／再摂取したマウスの結果と一致して、普通食を与えたマウスは、有意に低いグルコースレベルを示し、血中のトリグリセリド（ＴＧ）レベルおよびコレステロールレベルがより低い傾向があった（図７Ｃ）。ＦＡＳ活性およびそのタンパク質レベルも約３０％減少した（図７Ｄおよび７Ｅ）。
（実施例５）
本発明の有意性
生物活性小分子は、代謝経路が含まれる複雑な細胞過程を調査するための有益なツールであることが証明されている。脂質ホメオスタシスおよびインスリン作用の重要なレギュレーターは、ＳＲＥＢＰ転写因子のファミリーである（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、１９９７）。ＳＲＥＢＰ機能を調整する小分子は、代謝性疾患の治療で使用することができ、疾患のさらなる分子的理解のためのツールとしての機能を果たすことができる。本発明者らの細胞ベースのデータおよび動物データにより、ファトスタチンＡが核内の成熟ＳＲＥＢＰ−１形態量の下方制御によって脂質合成遺伝子の発現を妨害することが示唆される。本発明者らの知る限り、ファトスタチンＡは、培養細胞およびマウス肝臓の両方においてＳＲＥＢＰのタンパク質分解活性を阻害する第１の非ステロール様合成分子に相当する。
ＳＲＥＢＰ−１および−２を活性化する小分子は、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのグループによって報告されている（Ｇｒａｎｄ−Ｐｅｒｒｅｔら、２００１）。これらのＬＤＬ低下分子は、ＳＲＥＢＰのタンパク質分解活性の刺激によってＬＤＬ受容体の発現を上方制御する。作用の分子機構は完全に解明されていないが、データにより、ＳＣＡＰが分子の主な標的であることが示唆された。これらの分子と異なり、ファトスタチンＡはＳＲＥＢＰの活性化を阻害し、ＳＲＥＢＰ応答性遺伝子（ＬＤＬ受容体遺伝子が含まれる）の発現を下方制御する（表１）。
ＳＲＥＢＰ−１および−２の活性化はｉｎ ｖｉｖｏで差分的に調整されることが明らかなようである（Ｒａｄｅｒ、２００１；Ｓｈｅｎｇら、１９９５）。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下でＳＲＥＢＰ−１または−２のいずれかを選択的に阻害する小分子を開発することができるかもしれない。不運なことに、免疫染色に適合したヒトＳＲＥＢＰ−２のＮＨ２末端フラグメントに対する抗体がその時は利用できなかったので、ＳＲＥＢＰ−２の核局在化に及ぼすファトスタチンＡの影響についての研究は制限された。ファトスタチンＡは培養細胞およびマウス肝臓中でＳＲＥＢＰ−１の活性化を明確に遮断するにもかかわらず、ＳＲＥＢＰ−２に及ぼす影響を結論づけるにはさらなる調査を待つ必要がある。
ファトスタチンＡの動物データは、細胞培養の結果と一致する。脂質合成の関連する工程を触媒するＡＣＣおよびＦＡＳのｍＲＮＡが絶食後の低脂肪高炭水化物食の再摂取に応答して増加することが報告されている（Ｌｉａｎｇら、２００２）。ＡＣＣおよびＦＡＳの発現の増加が核ＳＲＥＢＰ、特にＳＲＥＢＰ−１に依存するのに対して、個別の遺伝子によってコードされるＳＲＥＢＰ−２は、コレステロール生合成における遺伝子の活性化に関与する。無脂肪食の再摂取下でファトスタチンＡで処置したマウスの肝臓抽出物では、有意に成熟ＳＲＥＢＰ−１形態のレベルが低く、前駆体形態のレベルが高かった（図６）。他方では、予想されるように、コントロール群の肝臓抽出物において、成熟形態のレベルは、前駆体形態より高かった（Ｈｏｒｔｏｎら、１９９８）。興味深いことに、形態の組み合わせの総量の変化はなく、核（成熟）形態とサイトゾル（前駆体）形態との間で分布のみが異なるようである（図６）。これらのデータは、ファトスタチンＡがＳＲＥＢＰ−１の発現レベルを変化させることができず、むしろ、前駆体の切断過程を強化し、それにより、その量が減少し、成熟形態および活性形態が増加することを示す。脂肪合成におけるＳＲＥＢＰ−１切断の重要性は、ＳＣＡＰ欠損マウスを使用した実験によって示されている：マウスの肝臓は、再摂取条件下でのＡＣＣおよびＦＡＳの発現を誘導できなかった（Ｌｉａｎｇら、２００２）。
核ＳＲＥＢＰ−１レベルの減少の生理学的有意性を評価するために、ＡＣＣおよびＦＡＳのレベルおよび活性を決定した。肝臓抽出物中のこれらの活性は、ファトスタチンＡ処置に応答して下方制御された（図６および７）。これらの結果は、脂肪酸合成経路のレギュレーターとしてのＳＲＥＢＰ−１の役割と一致する（Ｓｈｉｍａｎｏ、２０００）。Ｓｈｉｍａｎｏらは、ＳＲＥＢＰ−１−／−マウスに高炭水化物食を与えた場合にＦＡＳレベルおよびＡＣＣレベルが誘導されないことを示し（Ｓｈｉｍａｎｏら、１９９７）、脂質合成酵素発現の調節におけるＳＲＥＢＰ−１の役割が確認された。
ファトスタチンＡ処置マウスにおける興味深い所見は、体重および血糖の減少である（図６および７）。体重減少についての１つの可能性は、ＡＣＣおよびＦＡＳなどの脂質合成酵素の下方制御の結果としての脂質合成率の低下に起因する。さらに、マロニルＣｏＡ（ＡＣＣの生成物およびカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼの強力なインヒビター）の減少により、脂肪酸酸化および脂肪燃焼を増強することができる。Ａｃｃ２−／−変異マウスは痩せており、筋肉内、肝臓内、および脂肪内での脂肪酸酸化率がより高く、血中のグルコースレベルがより低いことが以前に示されている（Ａｂｕ−Ｅｌｈｅｉｇａら、２００１；Ａｂｕ−Ｅｌｈｅｉｇａら、２００３；Ｏｈら、２００５）。本発明の特定の実施形態では、ファトスタチンＡによるＳＲＥＢＰ−１切断の阻害により、脂質合成酵素が下方制御され、脂肪酸酸化が増強され、体重が減少し、インスリン感受性が増加してグルコースが低下する。
（実施例６）
実施例１〜５についての例示的な材料と方法
本実施例では、例示的な材料と方法を示す。
材料。脂質枯渇血清を、記載のように調製した（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、１９８３）。無脂肪ＦＢＳをＦｉｓｈｅｒから入手した。ウサギ抗ＳＲＥＢＰ−１（ｓｃ−８９８４）およびヤギ抗アクチン（ｓｃ−１６１６）ポリクローナル抗体を、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。マウス抗ＳＲＥＢＰ−２ポリクローナル抗体およびマウス抗ＦＡＳ抗体をＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。抗ヤギＩｇＧ ＨＲＰおよび抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰを、Ｐｒｏｍｅｇａから入手した。ＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅ試薬を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。抗ウサギＩｇＧ ＦＩＴＣを、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手した。デキサメタゾン（ＤＥＸ）および１−メチル−３−イソブチルキサンチン（ＭＩＸ）を、Ｓｉｇｍａから入手した。
ファトスタチンＡの調製。２−ブロモ−４’−メチルアセトフェノン（１．２２ｇ、５．７０ｍｍｏｌ）およびプロチオナミド（１．０３ｇ、５．７０ｍｍｏｌ）の混合物を含むエタノール（２０ｍＬ）を、撹拌しながら７０℃で０．５時間加熱し、次いで、０℃に冷却した。形成された黄色沈殿を濾過し、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、黄色針状結晶としてファトスタチンＡのＨＢｒ塩を得た（１．７８ｇ、８３％）：１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６，６００ ＭＨｚ）δＨ ８．８８（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），８．５４（ｓ，１Ｈ），８．４６（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），８．３６（ｄｄ，Ｊ＝１．４，６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），３．０３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），１．８０（ｍ，２Ｈ），０．９６（ｔ，Ｊ＝７．６，３Ｈ）；Ｃ１８Ｈ１８Ｎ２Ｓ＋Ｈについて計算したＨＲＭＳ（ＦＡＢ）の正確な質量はｍ／ｚ ２９５．１２６９が必要である。実測値ｍ／ｚ ２９５．１２６９。
細胞培養。ＤＵ１４５ヒトアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞（ＡＴＣＣ）を、２ｍＭＬ−グルタミン、１．０ｍＭピルビン酸ナトリム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシンと共に含むイーグル最少必須培地中にて３７℃の５％ＣＯ２下で維持した。３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞（ＡＴＣＣ）を、５．５ｍＭグルコース、１０％ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、０．５ｍＭグルタミン、および０．５μｇ／ｍＬファンギゾンを含むダルベッコ改変イーグル培地中にて３７℃で維持した。ヒト胎児由来腎臓２９３細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地中にて３７℃の５％ＣＯ２下で維持した。
オリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析。ＤＵ１４５前立腺癌細胞を、１μｇ／ｍＬのＩＧＦ１の存在下にて無血清培地中で５μＭのファトスタチンＡまたはＤＭＳＯのみで６時間処理し、ＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）中に総ＲＮＡを抽出し、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）によってさらに単離した。精製ｍＲＮＡを、約３３，０００個の十分に実証されたヒト遺伝子由来の３９，０００個を超える転写物を代表するほぼ４５，０００個のプローブ組からなるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．）によってＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙにて分析した。
ルシフェラーゼレポーターアッセイ。０日目に、ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地を含む９６ウェルプレートに５×１０３／ウェルの密度にて三連でプレートした。２日目に、細胞を、リポフェクタミン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の使用によって以下のプラスミドで一過性に同時トランスフェクトした：０．４μｇ／ウェルｐＳＲＥ−Ｌｕｃ（ＳＲＥ−１駆動ルシフェラーゼレポーター構築物；Ｈｕａ、Ｘ．、Ｓａｋａｉ、Ｊ．、Ｈｏ、Ｙ．Ｋ．、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｊ．Ｌ．＆Ｂｒｏｗｎ、Ｍ．Ｓ．１９９５ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０、２９４２２−７）および０．１μｇ／ウェルβ−ｇａｌレポーター（β−ｇａｌ発現が最終体積１５０μＬでアクチンプロモーターによって調節される）。３７℃で５時間のインキュベーション後、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、次いで、ファトスタチンＡの非存在下または存在下で１０％脂質枯渇血清、１００単位／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシンを含む１００μＬのダルベッコ改変イーグル培地中にインキュベートした。２０時間のインキュベーション後、各ウェル中の細胞を２０μＬの１×レポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、アリコートをルシフェラーゼ活性（１０μＬ）およびβ−ガラクトシダーゼ活性（１０μＬ）の測定のために使用した。ルシフェラーゼアッセイのために、光子生成を、Ｗａｌｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯｓｘマルチラベルカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）にてカウント毎秒として検出した。β−ガラクトシダーゼアッセイのために、３７℃で０．５時間のインキュベーション後に、波長４０５ｎｍのマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）によってＯ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼの加水分解を測定した。ルシフェラーゼ活性（カウント毎秒）を、β−ガラクトシダーゼ活性（ＯＤ単位）によって正規化した。ＳＲＥＢＰ−１ｃのＮ末端成熟形態の過剰発現について、ｐＣＭＶ−ＳＲＥＢＰ−１ｃ（１〜４３６）を、ｐＳＲＥ−Ｌｕｃと同時トランスフェクトした。ｐＳＲＥ−ＬｕｃおよびｐＣＭＶ−ＳＲＥＢＰ−１ｃ（１〜４３６）は、Ｊ．Ｌ．ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＭ．Ｓ．Ｂｒｏｗｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒから譲渡された（Ｈｕａ、Ｘ．、Ｓａｋａｉ、Ｊ．、Ｈｏ、Ｙ．Ｋ．、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｊ．Ｌ．ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ、Ｍ．Ｓ．１９９５ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０、２９４２２−７）。
ＲＴ−ＰＣＲ実験。総ＲＮＡを、ＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）中でＤＵ１４５細胞から抽出し、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。ＲＮＡサンプルを、Ａｃｃｅｓｓ ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）の使用によってＲＴ−ＰＣＲに供した。ＲＴ−ＰＣＲ反応物は、総ＲＮＡ、１μＭの各プライマー、０．２ｍＭｄＮＴＰ、１ｍＭＭｇＳＯ４、ＡＭＶ逆転写酵素（２単位）、およびＴｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ（２単位）を最終体積２５μＬで含んでいた。使用したプライマー対は以下である：５’−ＴＣＡ ＧＡＣ ＣＧＧ ＧＡＣ ＴＧＣ ＴＴＧ ＧＡＣ ＧＧＣ ＴＣＡ ＧＴＣ−３’（配列番号１）および５’−ＣＣＡ ＣＴＴ ＡＧＧ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＡＣ ＴＣＧ ＡＡＧ ＧＣＣ Ｇ−３’（配列番号２）（低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）用）；５’−ＧＣＣ ＴＧＣ ＴＴＧ ＡＴＡ ＡＴＡ ＴＡＴ ＡＡＡ Ｃ−３’（配列番号３）および５’−ＣＡＣ ＴＴＧ ＡＡＴ ＴＧＡ ＧＣＴ ＴＴＡ Ｇ−３’（配列番号４）（ステアロイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ （ＳＣＤ）用）；５’ −ＡＡＧ ＡＡＡ ＡＡＧ ＴＧＴ ＣＡＧ ＡＣＡ ＧＣＴ ＧＧ−３’（配列番号５）および５’−ＴＧＧ ＡＣＴ ＧＡＡ ＧＧＧ ＧＴＧ ＴＴＡ ＧＣ−３’（配列番号６）（ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬ）用）；５’−ＧＣＣ ＣＧＡ ＣＡＧ ＴＴＣ ＴＧＡ ＡＣＴ ＧＧＡ ＡＣＡ−３’（配列番号７）および５’−ＧＡＡ ＣＣＴ ＧＡＧ ＡＣＣ ＴＣＴ ＣＴＧ ＡＡＡ ＧＡＧ−３’（配列番号８）（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ ＣｏＡ Ｒ）用）；５’−ＣＴＧ ＣＣＴ ＧＡＣ ＴＧＣ ＣＴＣ ＡＧＣ−３’（配列番号９）および５’−ＡＣＣ ＴＣＴ ＣＣＴ ＧＡＣ ＡＣＣ ＴＧＧ Ｇ−３’（配列番号１０）（メバロン酸キナーゼ（ＭＶＤ）用）；５’−ＡＡＧ ＡＣＴ ＴＣＡ ＧＧＧ ＴＡＡ ＧＴＣ ＡＴＣ Ａ−３’（配列番号１１）および５’−ＣＧＴ ＧＴＡ ＴＡＡ ＴＧＧ ＴＧＴ ＣＴＡ ＴＣＡ Ｇ−３’（配列番号１２）（インスリン誘導遺伝子１（ＩＮＳＩＧ１）用）。増幅条件は以下である：９４℃で４分間を１サイクル、その後に９４℃での４０秒間の変性、５０℃で４０秒間のアニーリング、６８℃で２分間の伸長を、ＳＣＤおよびＨＭＧ ＣｏＡ Ｒについては２２サイクル行い、ＬＤＬＲおよびＩＮＳＩＧ１については２４サイクル行って５８℃でアニーリングし、ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬ）については２４サイクル行って６０℃でアニーリングし、ＭＶＤについては３０サイクル行って５５℃でアニーリングした。増幅ＤＮＡを、アガロースゲルによって分析し、Ｓｃｉｏｎ−ｉｍａｇｅ（バージョン４．０２）ソフトウェアを使用して定量した。
ウェスタンブロッティング。ＤＵ１４５前立腺癌細胞を、２×１０５細胞／ウェルの密度で無血清ＭＥＭを含む６ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、細胞を、ＩＧＦ１（１μｇ／ｍＬ）の存在下にてＤＭＳＯまたはファトスタチンＡ（１または５ｍＭ）で処理した。インキュベーション６時間後、細胞をＰＢＳ中に回収し、ＳＤＳ緩衝液中に溶解した。サンプルを、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ウサギ抗ＳＲＥＢＰ−１抗体および抗ＳＲＥＢＰ−２抗体の使用によってブロッティングした。特異的バンドを、増強蛍光（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）（ＥＣＬ）検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の使用によって視覚化した。
免疫蛍光実験。ＤＵ１４５前立腺癌細胞を、無血清ＭＥＭを含むカバースリップ上に一晩播種し、次いで、ＩＧＦ１（１μｇ／ｍＬ）を含む無血清ＭＥＭ中にて５μＭのファトスタチンＡまたはＤＭＳＯのみで処理した。インキュベーション６時間後、細胞を−２０℃のメタノール中で２０分間固定し、５％ミルクおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中で１時間ブロッキングした。サンプルを、ウサギポリクローナル抗ＳＲＥＢＰ−１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ：ｓｃ−８９８４）とインキュベートし、次いで、フルオレセインイソチオシアナート抱合抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ）とインキュベートした。カバースリップを、蛍光検出に適切なフィルターを用いたＮｉｋｏｎ ＴＥ２００蛍光顕微鏡下で４００倍で視覚化した。
ＳＲＥＢＰのｓｉＲＮＡノックダウン。ＳＲＥＢＰ−１遺伝子配列由来の相補オリゴヌクレオチド（５１２〜５３１）、５’−ＧＡＴ ＣＣＣ ＣＧＣ ＣＡＣ ＡＴＴ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＴＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＣＴ ＣＡＡ ＴＧＴ ＧＧＣ ＴＴＴ ＴＴＧ ＧＡＡＡ−３’（配列番号１３）、および５’−ＡＧＣ ＴＴＴ ＴＣＣ ＡＡＡ ＡＡＧ ＣＣＡ ＣＡＴ ＴＧＡ ＧＣＴ ＣＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＴＴ ＧＡＡ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＣＴ ＣＡＡ ＴＧＴ ＧＧＣ ＧＧＧ−３’（配列番号１４）を、ｐＳＵＰＥＲベクター（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ）に挿入した。得られたプラスミドを、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して３Ｔ３−Ｌ１またはＤＵ１４５細胞にトランスフェクトした。安定にトランスフェクトしたクローンを確立するために、ネオマイシン誘導体Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を濃度５００μｇ／ｍＬで使用し、安定な形質転換体を確立した。ＳＲＥＢＰ−１の発現レベルを、ウェスタンブロットによって評価した。脂肪生成試験のために、３Ｔ３−Ｌ１細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭを含む９６ウェルプレートに播種し、完全なコンフルエンスまでさらに２日間インキュベートした。０日目に、培地を以下の誘導培地と交換した：１０％ウシ胎児血清、５μｇ／ｍＬのインスリン、０．５ｍＭ１−メチル−３−イソブチルキサンチン（ＭＩＸ）、および１μＭデキサメタゾン（ＤＥＸ）を含むＤＭＥＭ。２日目に、誘導培地を除去し、１０％ウシ胎児血清および５μｇ／ｍＬのインスリンを含むＤＭＥＭ培地と交換した。１０日目に、脂肪油滴をオイルレッドＯで染色した。細胞成長実験のために、ＤＵ１４５細胞を、密度２，０００細胞／ウェルで血清を含まない、あるいは１μｇ／ｍＬのＩＧＦ１、２％無脂肪ウシ胎児血清、または２％ウシ胎児血清を含むＭＥＭを含む９６ウェルプレートに播種した。３日後、細胞成長をＷＳＴ−１アッセイによって評価した。実験を三連で行った。
ファトスタチンＡを使用した動物研究。雄マウス（１２９Ｓｖバックグラウンド）を、管理条件下（１２時間の明暗サイクル；２５℃）でＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ａｔ Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅに収容し、標準的な実験動物用飼料（Ｐｕｒｉｎａ Ｍｉｌｌｓ）および水を自由に与えた。動物実験を、米国国立衛生研究所によって公開されたＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．８５−２３、１９９６改訂）にしたがって行った。ファトスタチンＡを、２つの異なるプロトコールを使用して、５〜６月齢の雄マウス（１２９Ｓｖバックグラウンド）に腹腔内投与した（３０ｍｇ／ｋｇ；１５０ｍＬ）。第１のプロトコールは、マウスの４８時間の絶食、その後のさらに４８時間にわたる無脂肪食の再摂取を含む。この処置により、ＳＲＥＢＰに加えて脂質合成酵素（ＡＣＣおよびＦＡＳなど）の活性およびレベルの両方が誘導される。ファトスタチンＡまたは１０％ ＤＭＳＯを含むＰＢＳのコントロール群（ｎ＝５）への投与を、絶食の２４時間前に開始し、これを実験終了まで毎日続ける。
第２のプロトコールでは、２つの雄マウス群（ｎ＝５）を、３０ｍｇ／ｋｇファトスタチンＡまたは１０％ＤＭＳＯを含むＰＢＳのいずれかで２週間毎日処置した。摂食および体重を毎日測定した。実験終了時、マウスを４〜５時間の短期にわたって絶食し、血清成分の決定のために採血した。次いで、マウスを屠殺し、その肝臓を迅速に取り出し、液体窒素中で粉砕した。粉末組織を０．１ｍＭＰＭＳＦ、５ｍＭベンズアミジン、および５ｍｇ／ｍＬプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む１０ｍＬのＰＢＳ中に懸濁し、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（３×３０秒、高速）を使用してホモジナイズし、短時間超音波処理してＤＮＡを破壊した。抽出物を１６，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって清澄化した。次いで、サンプルを、市販のＦＡＳおよびＳＲＥＢＰ−１に対する抗体を使用したウェスタンブロット分析に供した。ＦＡＳおよびＡＣＣ活性を、前に記載のように決定した（Ｍａｏら、２００６）。
（実施例７）
ファトスタチンＡは、肥満ＯＢ／ＯＢマウスにおいて脂肪肝を予防し、高血糖を低下させ、体重減少を誘導する
創薬における遺伝子操作マウスモデルの重要性および役割は十分に報告されている（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ ａｎｄ Ｓａｎｄｓ、２００３）。これらの動物モデルのうち、レプチン欠損マウスＬｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂは、肥満およびその関連する症候群（インスリン抵抗性および脂肪肝疾患など）を研究するための特に有益なモデルと見なされている（Ｋｔｏｒｚａら、１９９７）。ホモ接合体ｏｂ／ｏｂ肥満マウスは、体脂肪の蓄積、高血糖、高インスリン、および生殖障害が増加した（Ｉｎｇａｌｉｓら、１９５０）。肥満の結果の１つである代謝症候群は、多数の心血管危険因子（高血圧症、脂質異常症、２型糖尿病、膵臓β細胞機能障害、およびアテローム性動脈硬化症が含まれる）を伴う（Ｍｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ、２００５）。
摂食およびエネルギーバランスを調節するネットワークを解明する努力にもかかわらず、どのようにして肥満がこれらの疾患を引き起こすのかについては完全に理解されていない。雄ｏｂマウスに及ぼすファトスタチンＡの影響、特に、白色脂肪サイズ、糖尿病状態、および脂肪肝の軽減による体重増加を防止する効果を調査した。前に記載のように、ファトスタチンＡは、ＳＲＥＢＰ−１作用の阻害による主な転写調節のインヒビターである。ファトスタチンＡで処置した正常マウスは体重が減少し、グルコースおよびコレステロールのレベルが低下した。ファトスタチンＡは、コントロールと比較して、処置マウスの肝臓中のＳＲＥＢＰ−１の活性成熟形態を減少させることも示した。
ＳＲＥＢＰ−１および−２は、脂肪酸およびコレステロールの生合成において関連するが異なる役割を果たす。ＳＲＥＢＰ−１は脂肪酸合成に必要な遺伝子を優先的に活性化し、ＳＲＥＢＰ−２はコレステロール生成を促進する。ファトスタチンＡがＳＲＥＢＰ−１およびおそらくＳＲＥＢＰ−２の活性化を遮断するので、本発明の特定の実施形態では、ファトスタチンＡの肥満ｏｂ／ｏｂマウスへの投与により、脂肪酸およびコレステロールの両方の生合成が一過性に調整され、肥満マウスにおける興味深い表現型が明らかとなる。
体重および摂食に及ぼすファトスタチンＡの影響
本研究は、平均体重が約２３ｇ／マウスの４〜５週齢の雄ｏｂ／ｏｂマウスを使用した。ファトスタチンＡ（３０ｍｇ／ｋｇ／日）を毎日腹腔内に送達させ、体重および摂食を測定した。図８Ａおよび８Ｂに示すように、処置したマウスの体重増加は、コントロールよりも有意に低かった。治療の最初の週の終了時に、ＤＭＳＯを注射したｏｂコントロールマウスは平均４．８２ｇ／マウス増加したのに対して（２３．５８±０．６２から２８．４０±１．４５への増加）、ファトスタチン処置群は約３．３７ｇ／マウス増加した（２３．０８±１．５３から２６．４５±１．２ｇ／マウスへの増加）（Ｐ＝０．０３）。処置２８日後、ファトスタチンＡ処置群は、数週、コントロールよりも約１２％軽かった（ファトスタチンについて３６．２±２．２ｇ／マウスと比較して３２．１±１．４）（Ｐ＝０．０２）。累積摂食は両群で類似していた（図８Ｃ）。平均して、処置群では、摂食は、それぞれ、５．９±１．４ｇ／マウス／日と比較してコントロールは５．４±１．５であり、有意に異ならなかった。
血中のグルコースおよび脂質プロフィールに及ぼすファトスタチンＡの影響
ｏｂ／ｏｂマウスにおける最も特徴的な表現型の１つは、インスリン抵抗性状態の結果としての高血糖である。血糖および脂質に及ぼすファトスタチンＡの影響を決定するために、グルコース、トリグリセリド、およびコレステロールの血清レベルを、標準的な飼料を与えたｏｂ／ｏｂマウスで分析した。
図９に示すように、一晩の絶食後の処置動物由来の血清中のグルコースレベルは、コントロールよりも約７０％低かった（それぞれ、１５３．２±３０．５および４２９．４±８７ｍｇ／ｄｌ（Ｐ＝０．００３））。処置動物の血清中のグルコースレベルは、機能的ｏｂ遺伝子を有するｗｔマウスに類似するようになったのに対して、ＤＭＳＯを投与したコントロールマウスは予想通り高血糖であった。興味深いことに、ケトン体（β−ヒドロキシブチラート）は、コントロールと比較して処置動物で約７倍に増加した（それぞれ、３．６２±１．４１および０．５±０．３７ｍｇ／ｄｌ（Ｐ＝０．００４））（図９）。ファトスタチンＡ動物中の高レベルのケトン体は、肝臓中で脂肪酸酸化が有意に増加していることを示し、肝臓中の主な生成物は血中に分泌されるケトン体である。また、処置動物で増加した血液成分は、血清中で測定された非エステル化遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）であった。これは、コントロールより約７０％高かった（１．９３±０．２６および０．７±０．２ｍＥｑ／ｌ（Ｐ＝０．０２８））（図９）。このＮＥＦＡレベルの増加は、脂肪酸酸化の要求の増加に起因する脂肪組織由来の脂肪分解の増加に起因し得る。ＦＦＡは、動物およびヒトにおけるインスリン抵抗性に関連することが公知である（Ｃｈａｌｋｌｅｙら、１９９８；Ｂｏｄｅｎら、１９９４）。しかし、ファトスタチンＡ処置ｏｂ／ｏｂマウスの血清中のＦＦＡレベルの上昇にも関わらず、グルコースレベルはコントロールより有意に低く、これは、おそらくインスリンシグナル伝達の改善に起因するインスリン感受性の改善を示す。さらに、変異アセチルＣｏＡカルボキシラーゼマウス（Ａｃｃ２−／−変異マウス）のマウス組織（肝臓、脂肪、および筋肉）中の脂肪酸酸化の増加の結果として、血中のケトン体がより高くなり、脂肪細胞中の脂肪分解増加の結果としてＮＥＥＡが増加することが最近示されている（Ａｂｕ−Ｅｌｈｅｉｇａら、２００１；Ａｂｕｅ−Ｅｌｈｅｉｇａら、２００３；Ｏｈら、２００５）。血清中のトリグリセリド（ＴＧ）レベルは、コントロールと比較して処置マウスで約３０％増加し（それぞれ、１１５±１１および７９±１２（Ｐ＝０．００６））、これは、ファトスタチンＡが肝臓からのＴＧ分泌および移動を増加させることを示していた。血清総コレステロールレベルは、ファトスタチン処置動物でより低い傾向が認められ、２１９±１８ｍｇ／ｄｌと比較して１８３±１６（Ｐ＝０．０６）であった。しかし、約３５％のＬＤＬが有意に減少し（４８±８と比較して３１±３；Ｐ＝０．０２）、約２２％のＨＤＬがより小幅に減少した（１４４±１１および１８３±１２；Ｐ＝０．０２）。ファトスタチンＡ処置マウスの血清中のＬＤＬレベルはＨＤＬレベルより多く減少したので、これはファトスタチンＡでの処置の望ましい結果を示す。トリグリセリド、リン脂質、およびコレステロールを輸送し、ＴＧレベルに基づいて算出されるＶＬＤＬレベルは、約５０％増加した（１５．８±２．４ｍｇ／ｄｌと比較して２３．１±２．３）。
ファトスタチンＡは精巣上体脂肪サイズを減少させ、脂肪肝を改善する
無制御の摂食のために、ｏｂ／ｏｂマウスは病的に肥満になり、過剰レベルの脂肪が脂肪組織および異なる器官に蓄積する（肝臓に起因する非アルコール性脂肪肝およびインスリン抵抗性など）（Ｈｏｏｋｍａｎ ａｎｄ Ｂａｒｋｉｎ、２００３）。約８〜９週齢のコントロール処置マウスは、ファトスタチンＡで処置したマウスと比較して、淡色から明らかなように、肝臓サイズが拡大し、脂肪が蓄積した（図１０Ａ）。ファトスタチンＡ処置マウスの肝臓の平均重量は、コントロールより約３２％軽かった（２．３４±０．１５と比較して１．５９±０．２；Ｐ＝０．０６）（図１０Ｄ）。オイルレッドで脂肪滴を染色したコントロールマウスの肝臓切片が脂肪滴を豊富に含んでいたのに対して、ファトスタチンＡ処置マウスの肝臓切片は脂肪滴を欠き、これは主にトリグリセリドである（図１０Ｂ）。ＳＲＥＢＰ−１を過剰発現するトランスジェニックマウスが脂肪肝を発症することが示されている（Ｈｏｒｔｏｎら、２００３）。しかし、ＳＲＥＢＰ−１を欠くｏｂ／ｏｂマウス（ｌｅｐｏｂ／ｏｂ Ｘ Ｓｒｅｂｐ １−／−）では、脂肪肝状態は有意に改善され、ＳＲＥＢＰ−１がｏｂ／ｏｂマウスにおける脂肪肝発症の主な原因であることが示唆される（Ｙａｈａｇｉら、２００２）。
前に言及するように、４週間のファトスタチンＡ処置後、処置マウスはコントロールよりも軽かった。主な白色脂肪組織である精巣上体脂肪パッドの試験により、ファトスタチンＡ処置マウスは有意により小さな脂肪パッドを有していることが見出された（図１０Ｃ）。脂肪パッドの平均重量は、コントロールより約２０％軽かった（３．６±０．２と比較して２．７±０．１；Ｐ＝０．０２）（図１０Ｄ）。より小さな脂肪パッドは、脂質保存の減少および／または脂質合成の減少ならびに脂肪中の脂肪酸酸化の増強に起因し得る。Ａｃｃ２−／−変異体マウスを使用した以前の研究により、ＡＣＣ２の非存在によっても肝臓中の脂肪が減少し、精巣上体脂肪パッドがより小さくなり、異なる組織（肝臓が含まれる）中の脂肪酸酸化が増強されることが示されている（Ａｂｕ−Ｅｌｈｅｉｇａら、２００１；Ａｂｕ−Ｅｌｈｅｉｇａら、２００３；Ｏｈら、２００５）。カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼにおけるＡＣＣ２産生マロニルＣｏＡによる阻害の欠如に起因する脂肪酸酸化の増強により、マウスはインスリン感受性が高くなり、食事誘導性の肥満および糖尿病から防御されることがそこに示された。特定の態様では、ファトスタチンＡによるＡＣＣ酵素の下方制御により、異なる組織（例えば、肝臓、脂肪、および筋肉など）において脂肪酸酸化が増加し、脂肪酸合成が阻害される。ｏｂ／ｂコントロールと比較したファトスタチンＡ処置ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓中のＴＧレベルおよびコレステロールレベルを決定した。図１１に示すように、処置マウスの肝臓中のＴＧレベルは約６５％減少した（それぞれ、１４．８±３．７および３８．７±６．０ｍｇ／ｇ肝臓；Ｐ＝０．０００４）。肝臓中のコレステロールレベルもファトスタチンＡによって２０％超減少した（２．８±０．５および３．６±０．１；Ｐ＝０．０３）（図１１）。これらの結果はオイルレッドＯ染色をさらに確認し、肝臓脂質合成の増加に一部起因するｏｂ／ｏｂマウス中の脂肪肝をファトスタチンＡでの処置によって完全に予防することができることを示す。本発明の特定の態様では、処置ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓中のこれらの脂質の減少は、ＴＧおよびコレステロールまたはその前駆体の合成に必要な脂質合成酵素の有意な阻害に起因する。さらに、異なるマウス組織（肝臓が含まれる）による脂肪酸酸化の需要の増加により、肝臓リパーゼ活性が増加し、異なる脂肪酸酸化組織（心臓および筋肉など）による利用のための肝臓から循環へのこれらの脂質の移動も増強される。特定の態様では、これは、ファトスタチンＡ処置ｏｂ／ｏｂマウスの血中のより高いＴＧレベルに関連する。
ファトスタチンＡはｏｂ／ｂマウス肝臓中の脂質合成酵素を下方制御する
脂質合成経路中の酵素は、転写因子（ＰＰＡＲおよびＳＲＥＢＰなど）によって調節される。処置ｏｂ／ｏｂマウスにおける脂質合成酵素のレベルおよび活性に及ぼすファトスタチンＡの影響を試験した。脂肪酸合成の律速段階を行うアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）活性を決定した。ＡＣＣは、アセチル−ＣｏＡのカルボキシル化を触媒してマロニルＣｏＡ（別の多官能酵素（脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ））によって行われる脂肪酸合成の基礎単位）が得られる。脂肪酸合成におけるマロニルＣｏＡの役割に加えて、これは、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１（ＣＰＴ１）の阻害による脂肪酸酸化で重要な役割を果たす。脂質合成酵素はｏｂ／ｏｂマウスで有意に誘導され、これは、これらのマウスの病的な肥満表現型を部分的に説明している。ファトスタチンＡ処置マウスの肝臓抽出物中のＡＣＣ活性は、約４０％減少した（５．５５±０．５７ｎｍｏｌ／ｍｉｎ．ｍｇと比較して３．４４±０．４４）（図１２Ａ）。脂肪酸シンターゼ活性も、ファトスタチンＡ処置ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓抽出物中で有意に下方制御された。ＦＡＳ活性は、処置マウスで７０％超減少した（２２．６±１．３７ｎｍｏｌ／ｍｉｎ．ｍｇと比較して８．６４±１．９１）（図１２Ｂ）。両酵素についてウェスタンブロット分析で示すように、ＡＣＣおよびＦＡＳ活性の両方の減少は、両酵素の発現レベルの減少に起因する（図１２Ｃ）。その生成物である脂肪酸（Ｃ１４：０およびＣ１６：０）は、非処置コントロールマウスの肝臓中よりファトスタチン処置ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓中で有意に低下する（約５０％）（表２を参照のこと）。
ＡＣＣはリン酸化／脱リン酸化機構によって急速に調節され、それにより、それぞれ、酵素を阻害および活性化する。図１２Ｃに示すように、ホスホロ−ＡＣＣレベルはコントロールマウスでより高いが、ＡＣＣの発現レベルも同レベルに高いので、これにより、ファトスタチンＡが特異的リン酸化レベル（Ｐ−ＡＣＣ／ＡＣＣタンパク質）を変化させないことが示唆される。これらの結果は、ＡＣＣ活性の下方制御が酵素レベルの減少のみに起因し、リン酸化状態の減少に起因しないことを示す（図１２Ｃ）。肝臓中に脂肪の合成および酸化をそれぞれ調節する異なる役割を果たす以下の２つのＡＣＣイソ型が存在することが以前に示されていた：ＡＣＣ１（肝臓中の主なイソ型）およびＡＣＣ２（筋肉内の主なイソ型）（Ａｂｕ−Ｅｌｈｅｉｇａら、２００１、Ａｂｕ−Ｅｌｈｅｉｇａら、１９９７；Ａｂｕ−Ｅｌｈｅｉｇａら、２０００；Ａｂｕ−Ｅｌｈｅｉｇａら、１９９５）。ＡＣＣ活性およびＦＡＳ活性の減少は、ファトスタチンＡ処置マウスの肝臓中で脂質合成が減少するのに対して、脂肪燃焼は有意に増強されることを示し、これは、図９に示すように、ｏｂ／ｏｂファトスタチンＡ処置マウスの血中のケトン体の７倍増加と一致する。ＳＲＥＢＰ−１の転写調節下にもある脂肪酸代謝における２つの重要な酵素（ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬ）およびステロイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ １（ＳＣＤ１））のレベルを決定した。サイトゾルクエン酸塩をアセチル−ＣｏＡ（脂肪酸合成のためにマロニルＣｏＡを得るためのＡＣＣの基質である）に変換するＡＣＬのタンパク質レベルは、ファトスタチンＡマウスの肝臓抽出物中で約７０％減少した。このＡＣＬレベルの下方制御は、肝臓などの脂質合成組織での脂質合成過程の減少に及ぼすファトスタチンＡの影響をさらに増幅する。ＳＣＤ１は、脂肪アシルＣｏＡ（パルミトイル−ＣｏＡおよびステアロイル−ＣｏＡなど）のΔ９位のシス二重結合の導入による一飽和脂肪酸の生合成の律速段階を触媒する。生成物であるパルミトレオイル−ＣｏＡ（１６：１）およびオレオイル−ＣｏＡ（１８：１）は、トリグリセリドおよびコレステロールエステルの重要な成分であり、マウス（ｏｂ／ｏｂマウスが含まれる）におけるＳＣＤ１の欠失により、代謝率が増加し、脂肪過多症が減少し、脂肪肝が予防され、食事によって誘導された糖尿病を防御した（Ｃｏｈｅｎら、２００２；Ｎｔａｍｂｉら、２００２；Ｍｉｙａｚａｋｉら、２０００）。図１２Ｃに示すように、ＳＣＤ１のタンパク質レベルは、コントロールと比較して、ファトスタチンＡ処置マウスの肝臓抽出物で約５０％減少した。これを、一不飽和脂肪酸Ｃ１６：１、Ｃ１８：１、およびＣ２０：１が約７０％の減少ならびにその伸長生成物である（Ｃ１８：２）Ｎ−６、（Ｃ１８：３）Ｎ−６、（Ｃ２０：２）Ｎ−６、および（Ｃ２０−３）Ｎ−６の不飽和化の約５０％の減少によって確認した（表２を参照のこと）。本発明の特定の実施形態では、ＳＣＤ１の減少に及ぼすこの影響は、体重減少、肝臓中のＴＧレベルの減少および脂肪肝からの防御における重要な要因である。興味深いことに、ＦＡＤＳ１またはΔ５デヒドロゲナーゼ のタンパク質レベルは、ファトスタチンＡ処置の結果として変化しなかった。このデヒドロゲナーゼ は、高不飽和化脂肪酸の合成で重要であり、高不飽和化脂肪酸は主に細胞膜のリン脂質にエステル化される（Ｍａｒｑｕａｒｄｔら、２０００；Ｈａｓｔｉｎｇｓら、２００１；Ｎａｋａｍｕｒａ ａｎｄ Ｎａｒａ、２００４）。
表２：ＯＢ／ＯＢ処置マウスおよびその非処置コントロールマウスの肝臓中の脂肪酸のガスクロマトグラフィ−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）分析
説明文：肝臓サンプル（１００ｍｇ）をファトスタチンＡ処置ｏｂ／ｏｂマウスおよび非処置コントロールマウスから得て、脂肪酸含有量について分析するまで−８０℃で保存した。脂肪酸を、Ｆｏｌｃｈのプロトコールにしたがって抽出し、ガスクロマトグラフィ−質量分析（ＧＣ−ＳＭ）を使用して定量的に分析した。上記表に示すように、Ｃ１４：０およびＣ１６：０（ｄｅ ｎｏｖｏ脂肪酸合成の生成物）が約５０％減少し、一不飽和脂肪酸Ｃ１６：１、Ｃ１８：１、およびＣ２０：１ならびにその伸長脱飽和生成物（Ｃ１８：２）Ｎ−６、（Ｃ１８：３）Ｎ−６、（Ｃ２０：２）Ｎ−６、（Ｃ２０−３）Ｎ−６、および（Ｃ２０：５）Ｎ−３が約７０％減少する。ミリスタート（Ｃ１４：０）およびパルミタート（Ｃ１６：０）（ＦＡＳの生成物）は、約５０％減少した（Ｐ＜０．０５）。Ｃ１８レベルは変化しなかった。このＣ１８レベルは、ＦＡＳによるｄｅ ｎｏｖｏ脂肪酸合成だけでなく、食物および鎖伸長系にも由来する。興味深いことに、Ｃ２０：０が約１５％低下し（Ｐ＋０．０５９）、Ｃ２４：０が３０％増加する（Ｐ＝０．０５）傾向が強かった。長鎖飽和脂肪酸の有意な減少と並行して、結果は、一不飽和脂肪酸Ｃ１６：１、Ｃ１８：１、およびＣ２０：１のレベルを約７０％有意に減少させたことを示す（Ｐ＜０．００４）。また、多価不飽和長鎖脂肪酸（１８：２）Ｎ−６、（１８：３）Ｎ−６、（２０：２）Ｎ−６、（２０：３）Ｎ−６、および（２０：５）Ｎ−３のレベルが３０〜６０％低下した。これらの減少は、転写および翻訳での脂質合成経路中の重要な酵素（ＦＡＳ、ＡＣＣおよびＳＣＤ、ＡＣＬ）の下方制御の結果である。これらの結果は、肝臓中で作製されたトリグリセリドレベルの減少による脂肪肝状態の改善におけるファトスタチンＡの影響を説明するための一助となる。
脂質合成酵素のｍＲＮＡレベルの下方制御
タンパク質レベルの減少は、転写および翻訳の調節に起因し得る。リアルタイムＰＣＲを使用して、脂質合成転写因子ＰＰＡＲγに加えて、代表的な脂質合成遺伝子であるＡＣＣ１、ＦＡＳ、およびＳＣＤ１のｍＲＮＡレベルを決定した。ＡＣＣ１、ＦＡＳ、およびＳＣＤ１のｍＲＮＡレベルが約８０％減少した（図１３）。これらの結果は、より低い酵素のタンパク質レベルおよび活性レベルと一致し、ＳＲＥＢＰ−１の成熟の阻害によってファトスタチンＡが脂質合成を低下させることを強く示す。脂質合成酵素の下方制御は、特定の実施形態では、その主な転写因子であるＰＰＡＲγの１つを含む。この転写因子のｍＲＮＡレベルは、ファトスタチンＡ処置マウスの抽出物中で約４０％減少した（図１３）。ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓由来のＰＰＡＲγの欠失に関する研究により、脂肪肝も改善された（Ｍａｔｓｕｓｕｅら、２００３）。しかし、ＰＰＡＲγを肝臓のみから欠失させ、これらのマウスにおいて糖尿病表現型が悪化した（Ｍａｔｓｕｓｕｅら、２００３）。他の研究により、肝臓ＰＰＡＲγ−／−マウスの血中グルコースがより低く、機能的レプチン遺伝子を使用した高脂肪食において１５週間後にインスリン抵抗性から防御されたことが示された（Ｋｕｂｏｔａら、１９９９）。ファトスタチンＡで処置したｏｂ／ｏｂマウスの高血糖が減少し、脂肪肝が予防されるので、これは、特定の態様では、肝臓中のＰＰＡＲγがこれらの病的状態に影響を及ぼし得るいくつかの要因のうちの１つであることを示す。さらに、白色脂肪などの他の組織は、抗高血糖効果で役割を果たすことができ、これは肝臓中で脂質合成が阻害される場合の脂質合成の減少によって相殺することができる。
まとめると、ＳＲＥＢＰ−１に対するその作用を介したファトスタチンＡは、処置ｏｂ／ｏｂマウスにおいて肝臓ＴＧ貯蔵の減少によって脂肪肝を改善し、脂肪過多症を軽減し、高血糖を低下させた。これらの研究は、ファトスタチンＡおよびその類似体が、例えば、肥満、脂肪肝、および糖尿病に対する有用な薬剤であることを示す。
例示的な材料と方法
動物研究手順
４〜５週齢のホモ接合体雄肥満（ｏｂ／ｏｂ）マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を、管理条件下（１２時間の明暗サイクル；２５℃）でＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ａｔ Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅに収容した。動物実験を、米国国立衛生研究所によって公開されたＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．８５−２３、１９９６改訂）にしたがって行った。１ケージあたり５匹の動物を収容し、標準的な実験動物用飼料（Ｐｕｒｉｎａ Ｍｉｌｌｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ ＩＮ）および水を到着後１週間自由に与えた。実験第１日目およびその後毎日、マウスの体重および飼料の消費量を測定した。マウスおよび飼料の残量を、ファトスタチンＡ（３０ｍｇ／ｋｇ；１５０ｍＬ）注射前の午後３時〜５時に毎日測定した。
ファトスタチンＡまたは１０％ＤＭＳＯを含むＰＢＳのコントロール群（ｎ＝５）への投与を、研究終了まで、４週間にわたって毎日継続した。
血液成分
ファトスタチンＡマウスへの２８日間にわたる毎日の注射の２８日後に、マウスを一晩絶食させ、採血し、全血糖およびβ−ヒドロキシブチラートを、Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ（Ａｂｂｏｔｔ）を使用して測定した。血清成分の決定のために、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）によってグルコース、トリグリセリド、およびコレステロールの測定を行った。血清非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）を、ＮＥＦＡ Ｃキット（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）の使用によって測定した。
肝臓分析
マウスを屠殺し、肝臓および精巣上体脂肪パッドを秤量した。以前に記載のように、各動物由来の肝臓スライスの凍結切片を、オイルレッドＯで染色して、肝臓スライス中の脂肪滴（ＴＧ）を視覚化した（Ａｂｕ−Ｅｌｈｅｉｇａら、２００１）。残りの肝臓組織を、液体窒素中で凍結し、さらなる分析のために−８０℃に保持した。
組織トリグリセリドおよびコレステロール含有量
肝臓トリグリセリドおよびコレステロール含有量を、参考文献（Ｃｈａｎｄｌｅｒら、２００３）に記載のように、９６ウェルプレート形式での比色分析に適合したコレステロールＥキット（Ｗａｋｏ）およびＩｎｆｉｎｉｔｙトリグリセリドキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して測定した。
酵素活性およびウェスタンブロット分析
凍結肝臓の一部を、液体窒素中で粉砕した。粉末組織を、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、５ｍＭベンズアミジン、および５ｍｇ／ｍＬプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む１０ｍＬのＰＢＳ中に懸濁し、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（３×３０秒、高速）を使用してホモジナイズし、短時間超音波処理してＤＮＡを破壊した。抽出物を１６，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって清澄化した。上清中のタンパク質濃度を決定し、以下の酵素に対する市販の抗体を使用したウェスタンブロット分析に供した：ＦＡＳ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、クエン酸リアーゼＳＣＤ１、ＦＡＤＳ１、ＡＣＣ、およびホスホロ−ＡＣＣ抗体。タンパク質を、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ Ｐｌｕｓ（商標）ウェスタンブロッティング検出試薬を使用して視覚化した。目的のタンパク質の特異的バンドの強度をスキャンし、定量のためにβ−アクチンに対して正規化した。
肝臓抽出物由来のＦＡＳ活性およびＡＣＣ活性を、以前に記載のように決定した（Ｍａｏら、２００６）。
定量的リアルタイムＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、マウス組織から総ＲＮＡを調製した。５匹のマウス由来の等量のＲＮＡをプールし、ＤＮアーゼＩ（Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ−ｆｒｅｅ、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）で処理した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮアーゼＨ−逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したランダムな６マーのプライマーによって、第１のｃＤＮＡ鎖を２μｇのＤＮアーゼＩ処理総ＲＮＡから合成した。リアルタイムＰＣＲは、最終体積２０μＬで、１０ｎｇの逆転写総ＲＮＡ、０．５μＭの順方向プライマーおよび逆方向プライマー、ならびに１０μＬのＤｙＮＡｍｏ ＨＳ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲキット（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）の２×マスターミックスを含んでいた。ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ）を使用して、９６ウェルプレートでＰＣＲを行った。全反応を三連で行い、ｍＲＮＡの相対量を、比較Ｃ（ｔ）法を使用して計算した。サイクル閾値Ｃ（ｔ）を、Ｏｐｔｉｃｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ ２．０２（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して計算した。マウスβ−アクチンのｍＲＮＡを内部コントロールとして使用した。
統計分析
データを、平均±ＳＤとして示す。２群間の相違を、対応のない両側（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）スチューデントｔ検定を使用して評価した。
（実施例８）
ファトスタチンＡおよびその類似体または誘導体の標的分子の同定
本発明のある態様では、ファトスタチンＡまたはその類似体または誘導体の１つまたは複数の標的を同定する。かかる同定のために任意の適切な方法を使用することができるにも関わらず、特定の実施形態では、ファトスタチンＡまたはその類似体または誘導体を標識する。例示的な標識には、例えば、ビオチンが含まれる。
（実施例９）
例示的な化合物およびその修飾
図１４は、本発明の例示的化合物を示し、その与えられた名称を表３に示す。図１５〜１７は、図２Ａと同一の方法による２０μＭのこれらの例示的化合物についての例示的ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを示す。以前に記載のように脂肪生成アッセイを行った（Ｃｈｏｉら、２００３）。細胞中の油滴形成を完全に阻害した類似体を、脂肪生成阻害類似体と記録した。
さらに、当業者は、他の適切な化合物の同定を補助するために例示的な化合物の１つまたは複数の態様を修飾することが適切かもしれないと認識する。例えば、１つまたは複数の代謝障害の治療および／または予防のための特定の化合物の適合性の決定の際、化合物を、同一または異なる代謝障害のために使用される他の関連化合物が同定されるように修飾することができる。特定の実施形態では、本明細書中に記載の例示的な化学基にしたがってかかる変更を行うことができる。
（実施例１０）
ＳＲＥＢＰ活性化の阻害による脂肪合成の遮断
細胞中の脂肪枯渇の際、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）が膜からタンパク質分解的に放出され、核に転位し、ここで、コレステロールおよび脂肪酸の生合成に関与する遺伝子の転写を活性化する。本発明では、脂肪生成を遮断する合成小分子がＳＲＥＢＰ活性化の選択的インヒビターであることを示す。現在はファトスタチンと呼ばれるジアリールチアゾール誘導体はＳＲＥＢＰのタンパク質分解活性を妨害し、それにより、細胞中の脂質合成遺伝子の転写が減少する。ファトスタチンの分子標的は、ＳＲＥＢＰ切断活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）のようである。ファトスタチンは、摂食の制御下でさえも、肥満ｏｂ／ｏｂマウスにおける体重、血糖、および肝臓脂肪蓄積の増加を遮断した。ファトスタチンは、ＳＲＥＢＰ調節についてのさらなる洞察を得るためのツールとしての機能を果たすことができ、代謝性疾患の新規の薬理学的介入のための出発点を得ることができる。
代謝症候群は、しばしば、脂肪または炭水化物が豊富な過剰な食事の長期摂取と説明される。ｄｅ ｎｏｖｏ脂肪酸およびコレステロール合成を介した炭水化物のアシルグリセリドへの変換は、多数の酵素反応を含む。これらの酵素をコードする遺伝子の発現レベルは、以下の３つの転写因子によって調節される：ＳＲＥＢＰ−１ａ、ＳＲＥＢＰ−１ｃ、およびＳＲＥＢＰ−２（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、１９９７；Ｏｓｂｏｒｎｅ、２０００）。ＳＲＥＢＰは、小胞体膜結合前駆体として合成され、これは、ゴルジ膜に結合する２つのプロテアーゼ（サイト−１およびサイト−２プロテアーゼ（Ｓ１ＰおよびＳ２Ｐ））によってタンパク質分解的に放出されて、核内での標的遺伝子の転写を活性化する活性形態を生成する必要がある（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、１９９７；Ｓａｋａｉら、１９９６）。ＳＲＥＢＰのタンパク質分解活性は、ＳＲＥＢＰ切断活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）（ＳＲＥＢＰの小胞体膜結合エスコートタンパク質）との相互作用を介してステロールによって強く調節される（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、２００６；Ｈｕａら、１９９６）。ステロールが小胞体膜に蓄積する場合、ＳＣＡＰ／ＳＲＥＢＰ複合体はＥＲからゴルジに排出できず、ＳＲＥＢＰのタンパク質分解的プロセシングが抑制される。したがって、ＳＲＥＢＰは、脂肪代謝のホメオスタシスを支配する重要な脂質合成転写因子である。
本明細書中で使用する場合、ファトスタチン（図１８ａ）は、３Ｔ３−Ｌ１細胞のインスリン誘導性脂肪生成およびＤＵ１４５細胞の血清非依存性成長を阻害する（Ｃｈｏｉら、２００３）。薬物処理細胞および非処理細胞の遺伝子発現プロフィールを比較して、ファトスタチンによって影響を受ける特異的分子経路についての情報を得た。ＤＵ１４５細胞を、ファトスタチンまたはＤＭＳＯのみで処理し、抽出ｍＲＮＡサンプルを、３３、０００遺伝子をマッピングするＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＤＮＡマイクロアレイによって分析した。これらの遺伝子（これらの遺伝子は全て、ワールドワイドウェブ上のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＧｅｎＢａｎｋデータベースで利用可能であり、その全てが本明細書中で参考として援用される）のうち、６３遺伝子の転写レベルが、ファトスタチン処理に応答して少なくとも３５％減少した（図２３）。影響を受けた遺伝子のうちの３４個は、脂肪合成またはステロール合成に直接関連し（生合成酵素をコードする遺伝子など）、影響を受けた遺伝子のうちの１８個は、ＳＲＥＢＰによって調節されることが報告されている（Ｈｏｒｔｏｎら、２００３）。影響を受けたＳＲＥＢＰ応答性遺伝子の下方制御を、ＲＴ−ＰＣＲ実験によって確認した（図１８ｂおよび１８ｃ）。下方制御された遺伝子のリスト中に公知のＳＲＥＢＰ応答性遺伝子および脂肪／コレステロール生合成遺伝子が多数出現することは、ファトスタチンがＳＲＥＢＰ経路に直接または間接的に作用することを意味する。
ファトスタチンがＳＲＥＢＰ機能を妨害することを確認するために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞中の内因性ＳＲＥＢＰがＳＲＥＢＰ応答性レポーター遺伝子の転写を活性化する能力を、ファトスタチンの存在下または非存在下で測定した（図１８ｄ）。ファトスタチンはレポーター遺伝子の活性化を減少させ、ここでルシフェラーゼ発現がステロール調節エレメントによって調節される。外因的に発現されたＳＲＥＢＰ−１の成熟形態（アミノ酸１〜４３６）がレポーター遺伝子を活性化する能力に及ぼすファトスタチンの影響が制限され（図１８ｅ）、ファトスタチンがＳＲＥＢＰの活性化過程を妨害することが示された。
ファトスタチンがＥＲ−ゴルジ転位およびＳＲＥＢＰのタンパク質分解性プロセシングに影響を及ぼすかどうかを決定するために、本発明者らは、Ｓａｋａｉら（１９９８）によって開発されたレポーターアッセイを使用した。本アッセイでは、ＮＨ２末端ＤＮＡ結合ドメイン（ＰＬＡＰ−ＢＰ２５１３-１１４１）を欠くＳＲＥＢＰ−２フラグメントと融合した分泌アルカリホスファターゼは、蛍光ホスファターゼ基質の蛍光の変化によって転位およびプロセシングをモニタリング可能である（図１８ｆ）。細胞をＰＬＡＰ−ＢＰ２５１３-１１４１およびＳＣＡＰをコードするプラスミドで同時トランスフェクトした場合、ＰＬＡＰホスファターゼが分泌され、蛍光シグナルが生成された。ファトスタチンまたはステロールの添加によって、分泌が同様に減少した（図１８ｆ）。ＳＲＥＢＰ活性化のファトスタチン媒介性阻害を、ＳＲＥＢＰのウェスタンブロット分析によって確認した。ファトスタチンでのＣＨＯ−Ｋ１細胞の処理により、ＳＲＥＢＰ−２の６８ＫＤａ成熟形態の量が減少し、１２５ＫＤａ前駆体形態の量が増加した（図１８ｇ）。ＳＲＥＢＰ−１について類似の結果が得られた（図２４）。これらの結果を、集合的に、ファトスタチンがＳＲＥＢＰの両イソ型の活性化過程を遮断すると示す。
本発明者らは、ファトスタチンがゴルジ装置中でのＳＲＥＢＰのタンパク質分解的切断またはＳＣＡＰ／ＳＲＥＢＰ複合体のＥＲ−ゴルジ間転位のいずれかを妨害すると見なした。ブレフェルジンＡ（ＥＲからゴルジへのタンパク質の順行性移動を遮断する天然生成物）は、ＳＲＥＢＰをステロール非応答性にし、ゴルジからＥＲへのＳ１Ｐの再配置によってＥＲ中にＳＲＥＢＰを構成性にプロセシングさせることが公知である（ＤｅＢｏｓｅ−Ｂｏｙｄら、１９９９）。ブレフェルジンＡの存在下で、ファトスタチンは、ＳＲＥＢＰプロセシングに影響を及ぼさず（図１９ａ）、ファトスタチンがタンパク質分解自体を遮断しないと示唆された。
ファトスタチンがＳＣＡＰ／ＳＲＥＢＰ複合体のＥＲ−ゴルジ間転位を遮断するかどうかを決定するために、本発明者らは、ゴルジ装置中のＳＣＡＰのＮ結合グリコシル化の範囲を分析した。転位したＳＣＡＰはグリコシル化レベルが高く、ＥＲ結合ＳＣＡＰよりもエンドグリコシダーゼＨ耐性が高い。ステロールは、ＥＲ−ゴルジ転位の阻害によってＳＣＡＰがエンドグリコシダーゼＨ耐性を示すようになるのを防ぐ（図１９ｂ）（Ｎｏｈｔｕｒｆｆｔら、１９９８）。細胞をファトスタチンまたはステロールの存在下または非存在下で成長させ、膜機能を、トリプシンおよびエンドグリコシダーゼＨを使用して連続的に処理した。ファトスタチンおよびステロールを使用せずに成長した細胞では、ＳＣＡＰのトリプシンフラグメントはエンドグリコシダーゼＨに対してより高い耐性を示し、１つまたは２つの糖鎖を有していた（図１９ｃ、レーン１）。細胞をファトスタチンまたはステロールの存在下で成長させた場合、ＳＣＡＰフラグメントはエンドグリコシダーゼＨへの耐性がより低く、０または１つの糖鎖を有していた（図１９ｃ、レーン２および３）。したがって、ファトスタチンは、ＥＲからゴルジへのＳＣＡＰの転位を阻害するようである。
ファトスタチンの構造活性相関の研究により、そのトルエン部分を種々のアルキルスルホンアミド基またはアリールスルホンアミド基で修飾した場合に、分子は生物活性を保持するかさらに増加させることが示された。１つの蛍光誘導体であるダンシルファトスタチン（図２０ａ）は、ＳＲＥＢＰ活性化を遮断する能力を保持し（図２６）、顕微プローブとしての役割を果たした。共焦点顕微鏡分析により、ダンシルファトスタチンの局在化がＥＲ−トラッカーレッド（ＥＲの特異的マーカー）の局在化と重複する（図２０ｂ）ことが明らかとなった。対照的に、ファトスタチンを欠くコントロールダンシル分子は、いかなるオルガネラにも局在化できなかった（図２７）。選択的ＥＲ局在化は、ファトスタチンがＥＲ中のタンパク質に結合することを意味する。もっとも可能性の高い候補はＳＣＡＰ（ＳＲＥＢＰ調節のためのコレステロール標的）である（Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎら、２００４）。この仮説を試験するために、ファトスタチン−ポリプロリンリンカー−ビオチン抱合体に結合するタンパク質（図２０ａ）（Ｓａｔｏら、２００７）を細胞溶解物から精製し、ＳＣＡＰ、ＳＲＥＢＰ−１、ＳＲＥＢＰ−２、およびＡＴＦ６（無関係のＥＲ結合転写因子）に対する抗体を使用したウェスタンブロットによって分析した（Ｙｅら、２０００）。結果は、ファトスタチンはＳＣＡＰに結合するが、他のタンパク質には結合しなかったことを示した（図２０ｃ）。過剰なファトスタチンの添加の際に結合が喪失するが、過剰なコレステロールでは喪失せず（図２０ｄ）、ファトスタチンがコレステロールと異なる部位でＳＣＡＰと相互作用するという興味深い可能性が高まる。
脂質合成におけるＳＲＥＢＰの重要な役割が確立されたので、次いで、ｏｂ／ｏｂマウス（無制御の摂食を用いたマウス肥満モデル）に及ぼすファトスタチンの薬理学的影響を試験した。ファトスタチンを毎日腹腔内送達させ、摂食および体重をモニタリングした。処置マウスによる１日摂食量の平均は、コントロールと有意に異ならず（それぞれ、５．４ １．５対５．９ １．４ｇ／マウス／日、ｐ＞０．０５）、処置中に明らかな毒性は認められなかった（図４ａ、ｂ）。ファトスタチンでの２８日間の処置後、処置マウスは非処置コントロールより約１２％軽かった（それぞれ、３２．１＋１．４および３６．２ ２．２ｇ／マウス、Ｐ＝０．０２）。ｏｂ／ｏｂマウスにおける最も特徴的な表現型の１つは、インスリン抵抗性に起因する高血糖である。血液成分（図２１ｃ）の試験により、処置マウスの平均グルコースレベルは非処置マウスよりも約７０％低かった（それぞれ、１５３．２ ３０．５対４２９．４ ８７ｍｇ／ｄｌ、Ｐ＝０．００３）ことが明らかとなった。これは、正常なグルコースレベルの範囲である。これらの結果は、肝臓インスリン抵抗性の病理発生における報告されたＳＲＥＢＰ−１ｃの役割と一致する（Ｉｄｅら、２００４）。
ｏｂ／ｏｂマウスの別の表現型は、器官中の脂肪の過剰な蓄積（非アルコール性脂肪肝が含まれる）である。肥大した肝臓および脂肪肝は非処置ｏｂ／ｏｂマウスの淡色から明らかである一方で、ファトスタチンで処置したマウスの肝臓は正常なようであった（図２２ａ）。処置マウスの肝臓は、平均して約３２％の体重が減少し、脂肪パッドは非処置マウスより小さかった（図２２ｂ）。肝臓切片のオイルレッド染色は、非処置ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓が豊富な脂肪滴を含む一方で、処置マウスの肝臓は脂質蓄積レベルがより低いことを示した（図２２ｃ）。処置マウスの肝臓中のトリグリセリドレベルおよびコレステロールレベルも減少した（図２２ｄ）。ファトスタチンによるｏｂ／ｏｂマウスにおける脂肪肝の予防は、脂肪肝発症におけるＳＲＥＢＰ−１の報告された役割と一致する。ＳＲＥＢＰ−１を過剰発現するトランスジェニックマウスは脂肪肝を発症する一方で（Ｈｏｒｔｏｎら、２００３）、ＳＲＥＢＰ−１を欠くｏｂ／ｏｂマウス（ｌｅｐｏｂ／ｏｂ Ｘ Ｓｒｅｂｐ １−／−）は健康な肝臓を有していた（Ｙａｈａｇｉら、２００２）。
処置マウスにおける肝臓脂肪レベルの減少は、ＳＲＥＢＰ応答性脂質合成酵素の肝臓発現の減少に起因すると考えられた。したがって、代表的なＳＲＥＢＰ応答性脂質合成酵素（脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）、ステアロイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ １（ＳＣＤ１）、およびＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬ）が含まれる）の肝臓タンパク質レベルおよび酵素活性に及ぼすファトスタチンの影響を試験した。生化学分析により、ファトスタチン処置マウスの肝臓抽出物中の脂質合成酵素のタンパク質レベルおよび活性が減少したことを示した（図２８）。したがって、ファトスタチンは、肝臓中のＳＲＥＢＰ−１プロセシングを遮断し、脂質合成酵素を下方制御し、肝臓トリグリセリド貯蔵を減少させる。
小分子によるＳＲＥＢＰ経路の調整は新しくない。ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅの研究者らは、ＬＤＬ受容体の発現を介してＳＲＥＢＰを活性化し血中コレステロールレベルを低下させる小分子を発見した（Ｇｒａｎｄ−Ｐｅｒｒｅｔら、２００１）。それにもかかわらず、ファトスタチンは、ＳＲＥＢＰの活性化を阻害する第１の非ステロール様合成分子に相当する。ファトスタチンおよびＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅの分子の両方は、ＳＣＡＰをターゲティングしてその機能を調整するようであり、それにより、実験動物の脂肪酸および／またはコレステロール代謝に明らかに影響を及ぼす。どのようにしてこれらの動物がＳＣＡＰに結合してその機能を調整するのかが不明なままであるにもかかわらず、これらの分子はＳＣＡＰに結合してその機能を調整する。ＳＣＡＰは、単純な合成分子を有するポジティブコントロールおよびネガティブコントロールの両方に適合する重要な受容体であり得る。ファトスタチンおよびＳＣＡＰリガンドは、ＳＲＥＢＰ経路のＳＣＡＰ媒介性調節をさらに洞察するためのツールとしての機能を果たすことができ、最終的に、代謝症候群の薬理学的介入のためのシード分子としての機能をはたすことができる。
例示的な材料と方法
ルシフェラーゼレポーターアッセイ。０日目に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、培地Ａ（５％ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシンを含むＨａｍのＦ−１２培地とダルベッコ改変イーグル培地との１：１混合物）を含む９６ウェルプレートにプレートした。２日目に、細胞を、リポフェクタミン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｐＳＲＥ−Ｌｕｃ（ＳＲＥ−１駆動ルシフェラーゼレポーター構築物）（Ｈｕａら、１９９５）およびｐＡｃ−β−ｇａｌ（β−ｇａｌ発現がアクチンプロモーターによって調節されるβ−ｇａｌレポーター）で同時トランスフェクトした。５時間のインキュベーション後、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次いで、ファトスタチンの非存在下または存在下にて、培地Ｂ（５％脂質枯渇血清、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、５０μＭコンパクチン、および５０μＭメバロン酸ナトリウムを含むＨａｍのＦ−１２培地とダルベッコ改変イーグル培地との１：１混合物）中でインキュベートした。２０時間のインキュベーション後、各ウェル中の細胞を溶解し、アリコートを使用してルシフェラーゼ活性およびβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性を、β−ガラクトシダーゼ活性によって正規化した。ＳＲＥＢＰ−１ｃのＮ末端成熟形態の過剰発現について、ｐＣＭＶ−ＳＲＥＢＰ−１ｃ（１〜４３６）を、ｐＳＲＥ−ＬｕｃおよびｐＡｃ−β−ｇａｌで同時トランスフェクトした。
ＳＲＥＢＰプロセシングのウェスタンブロット分析。０日目に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、培地Ａを含む１００ｍｍ皿にプレートした。２日目に、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、ファトスタチンの非存在下または存在下にて培地Ｂ中でインキュベートした。３日目に、細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄し、次いで、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、およびプロテアーゼインヒビター混合物（１μｇ／ｍＬペプスタチンＡ、１０μｇ／ｍＬロイペプチン、２００μＭフェニルメチルスルホニルフルオリド）を含む緩衝液で処理した。各総タンパク質抽出物のタンパク質濃度を測定し（ＢＣＡキット；Ｐｉｅｒｃｅ）、その後に、２２〜３３μｇアリコートの細胞抽出物を０．２５倍体積の緩衝液（２５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％ＳＤＳ、２５％グリセロール、０．２％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー、および５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール）と混合し、９５℃で７分間加熱した。サンプルを、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ＳＲＥＢＰ−２に対するマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ−７Ｄ４）を使用してブロッティングした（Ｙａｎｇら、１９９５）。特異的バンドを、増強蛍光（ＥＣＬ）検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して視覚化した。
ＳＣＡＰオリゴサッカリドの修飾。細胞膜画分を、本明細書中の他の場所に記載のように調製した。膜ペレットを、１０ｍＭＨｅｐｅｓ・ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭＥＤＴＡナトリウム、および１００ｍＭＮａＣｌを含む０．１ｍＬの緩衝液中に再懸濁した。次いで、タンパク質のアリコートを、総体積５８μＬで、１μｇのトリプシンの非存在下または存在下にて３０℃で３０分間インキュベートした。２μＬ（４００単位）のダイズトリプシンインヒビターの添加によって反応を停止させた。エンドグリコシダーゼＨでのその後の処理のために、各サンプルに、３．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＳＤＳおよび７％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）２−メルカプトエタノールを含む１０μＬの溶液を添加した。１００℃で１０分間の加熱後、各サンプルに、９μＬの０．５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、１７□プロテアーゼインヒビター（濃度１倍、１０μｇ／ｍＬロイペプチン、５μｇ／ｍＬペプスタチンＡ、および２μｇ／ｍＬアプロチニンに相当）を含む５μＬ溶液、その後に１μＬ（５単位）のエンドグリコシダーゼＨを連続的に添加した。３７℃で一晩反応させ、０．２５ＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロール、０．０５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ブロモフェノールブルー、および４％２−メルカプトエタノールを含む２０μＬの緩衝液の添加によって反応を停止させた。次いで、混合物を１００℃で５分間加熱し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ（１２％ゲル）に供した。
共焦点顕微鏡分析。ガラス底９６ウェルプレート（Ｇｒａｉｎｅｒ）上の密集度が約７０％のＣＨＯ−Ｋ１細胞を、０．２μＭＥＲ−トラッカーレッド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および５μＭダンシルファトスタチンと１時間インキュベートした。蛍光画像を取り込み、ＣＳＵ１０スピニングディスク共焦点スキャナ（Ｙｏｋｏｇａｗａ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＯＲＣＡ−ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を備えたＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０共焦点顕微鏡を使用して分析した。画像をＩＰＬａｂソフトウェア（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析した。
結合アッセイ。細胞膜画分を、補足方法（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ）に記載のように調製した。膜画分を、０．１％ＦＯＳ−Ｃｈｏｌｉｎｅ１０（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を含むＰＢＳで抽出した。抽出物を、ビオチン化ファトスタチンで飽和したニュートラアビジン−アガロースビーズ（１０μＬ）と混合し、１時間インキュベートした。結合したタンパク質を、０．１％ＦＯＳ−Ｃｈｏｌｉｎｅ１０を含むＰＢＳで４回洗浄し、２５μＬのＳＤＳサンプル緩衝液中で煮沸し、ウェスタンブロッティングに供した。競合アッセイのために、飽和量のコレステロールまたはファトスタチンを膜抽出物に添加し、その後にビーズとインキュベートした。
動物研究手順。４〜５週齢のホモ接合体雄肥満（ｏｂ／ｏｂ）マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を、管理条件下（１２時間の明暗サイクル；２５℃）でＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ａｔ Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅに収容した。動物実験を、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．８５−２３、ｒｅｖｉｓｅｄ １９９６）にしたがって行った。１ケージあたり５匹の動物を収容し、標準的な実験動物用飼料（Ｐｕｒｉｎａ Ｍｉｌｌｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ ＩＮ）および水を到着後１週間自由に与えた。実験第１日目およびその後毎日、各マウスの体重および摂食量を、午後３時と午後５時の間に測定した。体重測定後、処置マウスにファトスタチン（３０ｍｇ／ｋｇ；１５０ｍＬ）を腹腔内注射し、コントロールマウスに１０％ ＤＭＳＯを含むＰＢＳを投与した。研究終了まで、注射を４週間にわたって毎日継続した。
血液成分。ファトスタチンマウスの２８日間にわたる毎日の注射の２８日後に、マウスを５〜６時間絶食させ、全血糖およびβ−ヒドロキシブチラートを、Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ（Ａｂｂｏｔｔ）を使用して測定した。血清成分の決定のために、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）によってグルコース、トリグリセリド、およびコレステロールの測定を行った。血清非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）を、ＮＥＦＡ Ｃキット（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）を使用して測定した。
肝臓分析。マウスを屠殺し、肝臓および精巣上体脂肪パッドを秤量した。以前に記載のように、各動物由来の肝臓スライスの凍結切片を、オイルレッドＯで染色して、肝臓スライス中の脂肪滴（トリグリセリド）を視覚化した（Ａｂｕ−Ｅｌｈｅｉｇａら、２００１）。残りの肝臓組織を、液体窒素中で凍結し、さらなる分析のために−８０℃に保持した。
組織トリグリセリドおよびコレステロール含有量。肝臓トリグリセリドおよびコレステロール含有量を、Ｃｈａｎｄｌｅｒら（２００３）に記載のように、コレステロールＥキット（Ｗａｋｏ）およびＩｎｆｉｎｉｔｙ トリグリセリドキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して測定した。
ファトスタチン（１）、ダンシルファトスタチン（２）、およびファトスタチン−ポリプロリンリンカー−ビオチン抱合体（３）の合成。ファトスタチンの合成（１）：２−プロピル−４−（４−ｐ−トリルチアゾール−２−イル）ピリジン。プロチオナミド（５）（１．０３ｇ、５．７０ｍｍｏｌ）と２−ブロモ−４’−メチルアセトフェノン（６）（１．２２ｇ、５．７０ｍｍｏｌ）との混合物を含むエタノール（２０ｍＬ）を、撹拌しながら７０℃で０．５時間加熱し、次いで、０℃に冷却した。形成された黄色沈殿を濾過し、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、黄色針状結晶としてファトスタチン（１）ＨＢｒ塩を得た（１．７８ｇ、８３％）。ｍｐ：１９０〜１９３℃；１Ｈ ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．８８（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），８．５４（ｓ，１Ｈ），８．４６（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），８．３６（ｄｄ，Ｊ＝１．４，６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），３．０３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），１．８０（ｍ，２Ｈ），０．９６（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １６１．３，１５８．５，１５６．９，１４６．２，１４３．２，１３８．４，１３０．４，１２９．５，１２６．３，１２２．３，１２０．３，１１９．５，３５．０，２２．４，２０．９，１３．４；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１８Ｈ１９Ｎ２Ｓの計算値２９５．１２６９；実測値２９５．１２６９。
４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン（９）の合成。圧力管に７（１．０８ｇ、３．０ｍｍｏｌ）、ベンゾフェノンイミン（０．５７ｇ、３．３ｍｍｏｌ）、Ｐｄ２ｄｂａ３（８６ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、ＢＩＮＡＰ（２８０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１．４４ｇ、９．０ｍｍｏｌ）、および乾燥トルエン（３０ｍＬ）を充填し、アルゴンガスをパージした。圧力管をシールし、１００℃の浴中で２０時間加熱した。室温への冷却後、反応混合物をクロマトグラフ分析して（ＳｉＯ２、４：１ ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）、黄色オイルとして１．３５ｇの８（９８％）を得た。次いで、８（１．３５ｇ、２．９ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に、２ＮＨＣｌ水溶液（１５ｍＬ）を添加した。室温で２時間の撹拌後、反応混合物を、減圧濃縮し、次いで、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、飽和Ｎａ２ＣＯ３（５０ｍＬ）溶液で洗浄した。水性洗浄物を、ＥｔＯＡｃ（３×４０ｍＬ）で抽出し、合わせたＥｔＯＡｃ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をクロマトグラフ分析して（ＳｉＯ２、４：１ ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）、白色結晶として０．７３ｇの９（８２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．６１（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．７５（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｄｄ，Ｊ＝１．４，４．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３６（ｓ，１Ｈ），６．７５（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），３．８２（ｂｒｓ，１Ｈ），２．８５（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．８３（ｍ，２Ｈ），１．０１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１６４．９，１６３．４，１５７．３，１５０．０，１４６．８，１４０．８，１２７．７，１２４．８，１１９．２，１１７．８，１１５．１，１１１．３，４０．４，２３．１，１３．９；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１７Ｈ１８Ｎ３Ｓの計算値２９６．１２２１；実測値２９６．１２２８。
ダンシルファトスタチン（２）の合成。９（５０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）およびピリジン（２７ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を含むＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）の磁気的に撹拌した溶液に、ダンシルクロリド（５０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を添加した。１７時間の撹拌後、反応混合物を減圧濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）と飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（２０ｍＬ）との間で分配した。水相をＥｔＯＡｃ（２×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物を、クロマトグラフ分析して（ＳｉＯ２、２：１ ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）、黄色結晶として２（６５ｍｇ、７３％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．６０（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），８．５０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．３６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．２１（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６２（ｄｄ，Ｊ＝１．５，４．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｔ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ）７．４４（ｓ，１Ｈ），７．４３（ｄｄ，Ｊ＝７．５，８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．９７（ｂｒｓ，１Ｈ），２．８７（ｓ，６Ｈ），２．８４（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．８１（ｍ，２Ｈ），１．００（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １６５．５，１６３．５，１５６．１，１５２．２，１５０．０，１４０．５，１３６．７，１３４．０，１３１．１，１３１．０，１３０．５，１２９．８，１２９．７，１２８．７，１２７．３，１２３．１，１２１．６，１１９．２，１１８．３，１１７．８，１１５．３，１１３．８，４５．４，４０．４，２３．１，１３．９；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ２９Ｈ２９Ｎ４Ｏ２Ｓ２の計算値５２９．１７３２；実測値５２９．１７３３。
ｔｅｒｔ−ブチル４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニルカルバメート（１０）の合成。９（０．５７ｇ、１．９２ｍｍｏｌ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（５ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（２０ｍＬ）の磁気的に撹拌した溶液に、ジカルボン酸ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）（０．４９ｇ、２．２１ｍｍｏｌ）を添加した。１７時間の撹拌後、反応混合物を減圧濃縮し、残渣を、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）と飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（３０ｍＬ）との間で分配した。水相をＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物を、クロマトグラフ分析して（ＳｉＯ２、２：１ ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）、黄色泡として１０（０．３３ｇ、４３％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．６８（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７９（ｓ，１Ｈ），７．７２（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｓ，１Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），６．５８（ｓ，１Ｈ），２．９０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，），１．８７（ｍ，２Ｈ），１．５５（ｓ，９Ｈ），１．０３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１６３．１，１５６．５，１５２．３，１４９．６，１４０．６，１３８．５，１２８．７，１２８．１，１２７．０，１１８．３，１１７．７，１１４．３，１１２．９，８０．６，４１．０，２８．４，２４．１，１３．７；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ２２Ｈ２６Ｎ３Ｏ２Ｓの計算値 ３９６．１７４６；実測値３９６．１７３８。
中間体１２の合成。Ｎ２雰囲気下で、１０（２００ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）を、ＮａＨ（６０％鉱物油分散体、２４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（５ｍＬ）の懸濁液に添加し、混合物を室温で２時間撹拌した。次いで、ＮａＩ（９１ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）および４−ブロモ酪酸エチル（０．１２ｇ、０．６ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（２ｍＬ）を添加した。１８時間の撹拌後、反応混合物を水（２０ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をクロマトグラフ分析して（ＳｉＯ２、２：１ ヘキサン：ＡｃＯＥｔ）、黄色オイルとして１１（３５ｍｇ、１３％）を得た。次いで、１１（３０ｍｇ、２．９ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（１ｍＬ）およびＭｅＯＨ（０．５ｍＬ）の溶液に、２ＮＮａＯＨ水溶液（０．２ｍＬ）を添加した。室温で１８時間の撹拌後、反応混合物を減圧濃縮し、次いで、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（５ｍＬ）で洗浄した。水性洗浄物を、 ＥｔＯＡｃ（２×１０ｍＬ）で抽出し、合わせたＥｔＯＡｃ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をクロマトグラフ分析して（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ）、白色泡として１４ｍｇの１２（５０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．６９（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．８０（ｓ，１Ｈ），７．７３（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｓ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），６．５８（ｓ，１Ｈ），２．９２（ｍ，４Ｈ），２．３３（ｍ，２Ｈ），１．９０（ｍ，４Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），１．０２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １７４．２，１６２．９，１５６．３，１５２．９，１４９．６，１４０．６，１３８．５，１２９．３，１２８．９，１２７．２，１１９．０，１１７．９，１１４．８，１１３．３，８０．８，４１．０，４０．３，３２．１，２８．４，２４．１，２１．１，１３．７；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ２６Ｈ３２Ｎ３Ｏ４Ｓの計算値４８２．２１１４；実測値４８２．２１２０。
４−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニルアミノ）−Ｎ−イソプロピルブタンアミド（１４）の合成。１２（１７ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１７μＬ、０．１４ｍｍｏｌ）、およびイソプロピルアミン（４μＬ、０．０４６ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液に、ＨＡＴＵ（１６ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）を添加した。１８時間の撹拌後、反応混合物を減圧濃縮し、残渣を、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）と飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（１０ｍＬ）との間で分配した。水相を、ＥｔＯＡｃ（２×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をクロマトグラフィ分析して（ＳｉＯ２、２：１ ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）、黄色オイルとして１３（１４ｍｇ、７７％）を得た。次いで、１３（１２ｍｇ、２．９ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（１ｍＬ）溶液に、ＴＦＡ（０．２ｍＬ）を添加した。室温で１８時間の撹拌後、反応混合物を減圧濃縮し、次いで、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（１０ｍＬ）で洗浄した。水性洗浄物をＥｔＯＡｃ（２×５ｍＬ）で抽出し、合わせたＥｔＯＡｃ層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をクロマトグラフィ分析して（ＳｉＯ２、２：１ ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）、黄色泡として６．２ｍｇの１４（６３％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．６９（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），８．０４（１Ｈ，ｓ），７．９６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．９６（ｓ，１Ｈ），７．７２（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｓ，１Ｈ），６．６５（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），３．９５（ｍ，１Ｈ），３．０３（ｍ，４Ｈ，），２．３５（ｍ，２Ｈ），１．９２（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，６Ｈ），１．０３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １７１．６，１６２．９，１５６．３，１５２．９，１４０．６，１３８．５，１２９．３，１２８．９，１２７．２，１１９．０，１１７．９，１１４．８，１１３．３，４２．２，４１．０，４０．３，３２．１，２４．１，２３．２，２１．１，１３．７；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ２４Ｈ３１Ｎ４ＯＳの計算値４２３．２２１９；実測値４２３．２２１６。
ファトスタチン−ポリプロリンリンカー−ビオチン抱合体（３）の合成：ファトスタチン−ＫＰＧＱＦＬＹＥＬＫＫＰＰＰＰＰＰＰＰＰＫＫ（配列番号１５）−アミノカプロン酸−ビオチン。抱合体３および４を、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｎ−ε−Ｆｍｏｃ−ε−アミノカプロン酸、１２、ビオチン（以前に記載のように逆相ＨＰＬＣによって精製（Ｓａｔｏら、２００７））のカップリングによってＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂にて合成した。抱合体３：Ｃ１５５Ｈ２３８Ｎ３５Ｏ２９Ｓ２ ＋ の計算値３１１９．９。実測値（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）３１１９．７［Ｍ＋Ｈ］＋。
プラスミド。ｐＳＲＥ−Ｌｕｃ、ｐＣＭＶ−ＳＲＥＢＰ−１ｃ（１−４３６）、ｐＣＭＶ−ＰＬＡＰ−ＢＰ２（５１３-１１４１）、およびｐＣＭＶ−ＳＣＡＰは、Ｊ．Ｌ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍ．Ｓ．Ｂｒｏｗｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）から譲り受けた（Ｓａｋａｉら、１９９８；Ｈｕａら、１９９５）。
抗体。モノクローナル抗ＳＲＥＢＰ−１ ＩｇＧ（２Ａ４）、抗ＳＣＡＰ ＩｇＧ（９Ｄ５）、および抗ＡＴＦ６ ＩｇＧ（Ｈ−２８０）を、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。モノクローナル抗ＳＲＥＢＰ−２ ＩｇＧ−７Ｄ４は、Ｊ．Ｌ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍ．Ｓ．Ｂｒｏｗｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）から譲り受けた。ポリクローナル抗ＦＡＳ、抗ＡＣＣ、抗ＳＣＤ１、および抗ＡＣＬ ＩｇＧは、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。
細胞培養。チャイニーズハムスター卵巣細胞Ｋ１（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞を、５％ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地／ＨａｍのＦ１２培地［１：１］中にて３７℃の５％ＣＯ２下で維持した。ヒトアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞（ＤＵ１４５）を、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１．０ｍＭピルビン酸ナトリム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシンと共に含むイーグル最少必須培地中にて３７℃の５％ＣＯ２下で維持した。
膜画分の調製。細胞を回収し、次いで、緩衝液（１０ｍＭＨｅｐｅｓ・ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ２、および１ｍＭＥＤＴＡナトリウム）に再懸濁し、２２ゲージニードルを通過させ、１，０００×ｇで５分間遠心分離した。ポスト核（ｐｏｓｔｎｕｃｌｅａｒ）上清を、１５，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。
オリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析。ＤＵ１４５前立腺癌細胞を、１μｇ／ｍＬのＩＧＦ１の存在下にて無血清培地中で５μＭのファトスタチンまたはＤＭＳＯのみで６時間処理し、ＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）中に総ＲＮＡを抽出し、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）によってさらに単離した。精製ｍＲＮＡを、約３３，０００個の十分に実証されたヒト遺伝子由来の３９，０００個を超える転写物を代表するほぼ４５，０００個のプローブ組からなるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．）によってＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙにて分析した。
ＲＴ−ＰＣＲ実験。総ＲＮＡを、ＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）中でＤＵ１４５細胞から抽出し、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）で単離した。ＲＮＡサンプルを、Ａｃｃｅｓｓ ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）の使用によってＲＴ−ＰＣＴに供した。ＲＴ−ＰＣＲ反応物は、総ＲＮＡ、１μＭの各プライマー、０．２ｍＭｄＮＴＰ、１ｍＭＭｇＳＯ４、ＡＭＶ逆転写酵素（２単位）、およびＴｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ（２単位）を最終体積２５μＬで含んでいた。使用したプライマー対は以下である：５’−ＴＣＡ ＧＡＣ ＣＧＧ ＧＡＣ ＴＧＣ ＴＴＧ ＧＡＣ ＧＧＣ ＴＣＡ ＧＴＣ−３’（配列番号１６）および５’−ＣＣＡ ＣＴＴ ＡＧＧ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＡＣ ＴＣＧ ＡＡＧ ＧＣＣ Ｇ−３’（配列番号１７）（低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）用）；５’−ＧＣＣ ＴＧＣ ＴＴＧ ＡＴＡ ＡＴＡ ＴＡＴ ＡＡＡ Ｃ−３’（配列番号１８）および５’−ＣＡＣ ＴＴＧ ＡＡＴ ＴＧＡ ＧＣＴ ＴＴＡ Ｇ−３’（配列番号１９）（ステアロイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ （ＳＣＤ）用）；５’ −ＡＡＧ ＡＡＡ ＡＡＧ ＴＧＴ ＣＡＧ ＡＣＡ ＧＣＴ ＧＧ−３’（配列番号２０）および５’−ＴＧＧ ＡＣＴ ＧＡＡ ＧＧＧ ＧＴＧ ＴＴＡ ＧＣ−３’（配列番号２１）（ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬ）用）；５’−ＧＣＣ ＣＧＡ ＣＡＧ ＴＴＣ ＴＧＡ ＡＣＴ ＧＧＡ ＡＣＡ−３’（配列番号２２）および５’−ＧＡＡ ＣＣＴ ＧＡＧ ＡＣＣ ＴＣＴ ＣＴＧ ＡＡＡ ＧＡＧ−３’（配列番号２３）（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル− ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡＲ）用）；５’−ＣＴＧ ＣＣＴ ＧＡＣ ＴＧＣ ＣＴＣ ＡＧＣ−３’（配列番号２４）および５’−ＡＣＣ ＴＣＴ ＣＣＴ ＧＡＣ ＡＣＣ ＴＧＧ Ｇ−３’（配列番号２５）（メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）用）；５’−ＡＡＧ ＡＣＴ ＴＣＡ ＧＧＧ ＴＡＡ ＧＴＣ ＡＴＣ Ａ−３’（配列番号２６）および５’−ＣＧＴ ＧＴＡ ＴＡＡ ＴＧＧ ＴＧＴ ＣＴＡ ＴＣＡ Ｇ−３’（配列番号２７）（インスリン誘導遺伝子１（ＩＮＳＩＧ１）用）。増幅条件は以下である：９４℃で４分間を１サイクル、その後に９４℃での４０秒間の変性、５０℃で４０秒間のアニーリング、６８℃で２分間の伸長を、ＳＣＤおよびＨＭＧ ＣｏＡ Ｒについては２２サイクル行い、ＬＤＬＲおよびＩＮＳＩＧ１については２４サイクル行って５８℃でアニーリングし、ＡＣＬについては２４サイクル行って６０℃でアニーリングし、ＭＶＤについては３０サイクル行って５５℃でアニーリングした。増幅ＤＮＡを、アガロースゲルによって分析し、Ｓｃｉｏｎ−ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して定量した。
ＰＬＡＰ−ＢＰ２切断。０日目に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、培地Ａを含む９６ウェルプレートにプレートした。２日目に、細胞を、リポフェクタミン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｐＣＭＶ−ＰＬＡＰ−ＢＰ２（５１３-１１４１）、ｐＣＭＶ−ＳＣＡＰ、およびｐＡｃ−β−ｇａｌで一過性に同時トランスフェクトした。５時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、ファトスタチン（２０μＭ）またはステロール（１０μｇ／ｍＬコレステロールおよび１μｇ／ｍＬ２５−ヒドロキシコレステロール）の非存在下または存在下にて培地Ｂ中でインキュベートした。２０時間のインキュベーション後、培地のアリコートを、分泌アルカリホスファターゼ活性についてアッセイした。各ウェル中の細胞を溶解し、β−ガラクトシダーゼ活性の測定のために使用した。アルカリホスファターゼ活性を、β−ガラクトシダーゼ活性によって正規化した。
酵素活性およびウェスタンブロット分析。凍結肝臓の一部を、液体窒素中で粉砕した。粉末組織を０．１ｍＭＰＭＳＦ、５ｍＭベンズアミジン、および５ｍｇ／ｍＬプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む１０ｍＬのＰＢＳ中に懸濁し、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（３×３０秒、高速）を使用してホモジナイズし、短時間超音波処理してＤＮＡを破壊した。抽出物を１６，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって清澄化した。上清中のタンパク質濃度を決定し、ＦＡＳ、ＡＣＣ、ＳＣＤ１、およびＡＣＬに対する抗体を使用したウェスタンブロット分析に供した。目的のタンパク質の特異的バンドの強度をスキャンし、定量のためにβ−アクチンに対して正規化した。肝臓抽出物由来のＦＡＳ活性およびＡＣＣ活性を、以前に記載のように決定した（Ｍａｏら、２００６）。
参考文献
本明細書中で言及した全ての特許および刊行物は、本発明に属する当業者のレベルを示す。全ての特許および刊行物は、それぞれの刊行物が具体的且つ個別に参考として援用されると示されているのと同程度にその全体が本明細書中で参考として援用される。
本発明およびその利点を詳述しているが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の変化、置換、および変更を行うことができると理解すべきである。さらに、本出願の範囲は、本明細書中に記載の過程、機械、製造、組成物、手段、方法、および工程の特定の実施形態に制限されることを意図しない。当業者は、本発明の開示から、本明細書中に記載の対応する実施形態と実質的に同一の機能を発揮するか、実質的に同一の結果を達成する、既存またはその後に開発される過程、機械、製造、組成物、手段、方法、または工程を本発明にしたがって使用することができると容易に認識するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、かかる過程、機械、製造、組成物、手段、方法、または工程がその範囲内に含まれることを意図する。

Claims (28)

  1. 安息香酸４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル；４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；メチル２−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノキシ）アセテート；２−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノキシ）酢酸；４−（４−クロロフェニル）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）チアゾール；４−（４−（２，４−ジフルオロフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−イソプロピル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）アセトアミド；Ｎ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）メタンスルホンアミド；Ｎ−ベンジル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−（シクロプロピルメチル）−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；４−（４−（３−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（２−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−ブロモフェニル）−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボン酸；メチル４−（４−ブロモフェニル）−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボキシレート ４−（４−（３−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（２−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；３−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；２−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；４−（４−ブロモフェニル）−Ｎ−イソプロピル−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボキシアミド；その薬学的に許容可能な塩；その立体異性体；およびそれらの任意の組み合わせまたは混合物からなる群から選択される化合物。
  2. 前記化合物が、Ｎ−イソプロピル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン、およびＮ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）メタンスルホンアミドからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
  3. 薬学的に許容可能な賦形剤中に含まれるとさらに定義される、請求項１に記載の化合物。
  4. 個体の代謝障害を治療する方法であって、治療有効量の少なくとも１つの一般式：
    Ａ−Ｂ−Ｃ
    （式中、
    Ａ、Ｂ、およびＣは同一または異なり、それぞれ、５員環、６員環、または７員環を含み、この環は、複素環もしくは非複素環、置換環、または非置換環であり、
    Ａ、Ｂ、およびＣの任意の１つ、任意の２つ、または３つ全ては、非置換であるか、１つまたは複数の置換を有し、任意の置換は任意の他の置換と同一であっても異なっていてもよく、該置換は、以下：
    ａ）ヒドロキシ；
    ｂ）Ｃ１〜１０アルキル；
    ｃ）Ｃ２〜１０アルケニル；
    ｄ）Ｃ２〜１０アルキニル；
    ｅ）Ｃ３〜６シクロアルキル；
    ｆ）アリール；
    ｇ）ヘテロアリール；
    ここで、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、および／またはｇ）中の置換は、以下：
    １）ヒドロキシ；
    ２）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ３）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ４）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ５）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ６）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）；
    ７）ハロ；
    ８）シアノ；
    ９）カルボキシ；
    １０）アミノ；
    １１）一置換アミノ；
    １２）二置換アミノ；
    １３）アミド；
    １４）一置換アミド；
    １５）二置換アミド；および
    １６）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換され、
    ここで、２）、３）、または６）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｈ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｊ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｋ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｌ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｈ）、ｉ）、またはｌ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｍ）ハロ；
    ｎ）シアノ；
    ｏ）カルボキシ；
    ｐ）アミノ；
    ｑ）一置換アミノ；
    ｒ）二置換アミノ、
    ｓ）アミド；
    ｔ）一置換アミド；および
    ｕ）二置換アミドからなる群から選択され、
    ここで、該一置換アミノ、二置換アミノ、一置換アミド、および二置換アミドの１つまたは複数は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、スルホキシド、スルホン、スルホナート、アルキルスルホナート、スルホン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される置換を有し、
    ここで、ｕ）において、該アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールは、以下：
    ｉ）ヒドロキシ；
    ｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｉｖ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｖ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｖｉ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｉｉ）、ｉｉｉ）、またはｖｉ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｖｉｉ）ハロ；
    ｖｉｉｉ）シアノ；
    ｉｘ）カルボキシ；
    ｘ）アミノ；
    ｘｉ）一置換アミノ；
    ｘｉｉ）二置換アミノ；
    ｘｉｉｉ）アミド；
    ｘｉｖ）一置換アミド；
    ｘｖ）二置換アミド；および
    ｘｖｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換される）を有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を該個体に送達する工程を含む、方法。
  5. Ａは置換されており、１〜５原子の側鎖を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記１〜５原子の側鎖が１〜５個の炭素の側鎖である、請求項４に記載の方法。
  7. 前記少なくとも１つの化合物が、２−プロピル−４−（４−ｐ−トリルチアゾール−２−イル）ピリジン；４−（４−（４−ブロモフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−フェニルチアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（４−クロロフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（４−エチルフェニル）チアゾール−２−イル）ピリジン；４−（４−ｐ−トリルチアゾール−２−イル）ピリジン；４−（４−（４−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）ピリジン；安息香酸４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル；４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；メチル２−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノキシ）アセテート；２−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノキシ）酢酸；４−（４−クロロフェニル）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）チアゾール；４−（４−（３，４−ジクロロフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（４−フルオロフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（２，４−ジフルオロフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−イソプロピル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）アセトアミド；Ｎ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）メタンスルホンアミド；Ｎ−ベンジル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−（シクロプロピルメチル）−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；４−（４−ブロモフェニル）−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボン酸；メチル４−（４−ブロモフェニル）−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボキシレート；４−（４−（４−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（３−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（２−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；２−フェニル−４−ｐ−トリルチアゾール；３−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；２−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；４−（４−ブロモフェニル）−Ｎ−イソプロピル−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボキシアミド；４−（４−（４−クロロフェニル）チアゾール−２−イル）ピリジン；４−（４−（４−クロロフェニル）チアゾール−２−イル）−２−エチルピリジン；４−（４−クロロフェニル）−２−フェニルチアゾール；２−プロピル−４−（４−（チオフェン−２−イル）チアゾール−２−イル）ピリジン；４−（４’−メチル［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−プロピル）ピリジン；２−（２−プロピルピリジン−４−イル）−４−ｐ−トリルチアゾール−５−カルボン酸；２−エチル−４−（４−ｐ−トリルチアゾール−２−イル）ピリジン；４−フェニル−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボン酸；メチル２−（２−プロピルピリジン−４−イル）−４−ｐ−トリルチアゾール−５−カルボキシレート；ｔｅｒｔ−ブチル４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニルカルバメート；Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−Ｎ−トシルベンゼンアミン；Ｎ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）−８−キノリンスルホンアミド；Ｎ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）−２−チオフェンスルホンアミド；およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
  8. 前記少なくとも１つの化合物が、安息香酸４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル；４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；メチル２−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノキシ）アセテート；２−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノキシ）酢酸；４−（４−クロロフェニル）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）チアゾール；４−（４−（２，４−ジフルオロフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−イソプロピル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）アセトアミド；Ｎ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）メタンスルホンアミド；Ｎ−ベンジル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；Ｎ−（シクロプロピルメチル）−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン；４−（４−ブロモフェニル）−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボン酸；メチル４−（４−ブロモフェニル）−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボキシレート；４−（４−（３−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；４−（４−（２−メトキシフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン；３−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；２−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェノール；４−（４−ブロモフェニル）−Ｎ−イソプロピル−２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−５−カルボキシアミド；薬学的に許容可能な塩；その立体異性体；およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記少なくとも１つの化合物が、２−プロピル−４−（４−ｐ−トリルチアゾール−２−イル）ピリジン；４−（４−（４−ブロモフェニル）チアゾール−２−イル）−２−プロピルピリジン、Ｎ−イソプロピル−４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）ベンゼンアミン、およびＮ−（４−（２−（２−プロピルピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）メタンスルホンアミド；薬学的に許容可能な塩；その立体異性体；およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
  10. 前記代謝障害が肥満である、請求項４に記載の方法。
  11. 前記代謝障害が、肥満、高脂質血症、糖尿病、脂肪肝、高血圧症、前立腺癌、および心血管疾患からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
  12. 前記個体に付加療法を施す、請求項４に記載の方法。
  13. 前記代謝障害が肥満であり、前記付加療法が、食事療法、理学療法、行動療法、手術、薬物療法、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される療法を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記代謝障害が糖尿病であり、前記付加療法が、食事療法、理学療法、および薬物療法からなる群から選択される療法を含む、請求項１２に記載の方法。
  15. 化合物が適切な容器に格納されている、請求項１に記載の化合物を含むキット。
  16. 代謝障害のための付加療法をさらに含む、請求項１５に記載のキット。
  17. 個体のＳＲＥＢＰ経路のメンバーを阻害する方法であって、治療有効量の少なくとも１つの一般式：
    Ａ−Ｂ−Ｃ
    （式中、
    Ａ、Ｂ、およびＣは同一または異なり、それぞれ、５員環、６員環、または７員環を含み、この環は、複素環もしくは非複素環、置換環、または非置換環であり、
    Ａ、Ｂ、およびＣの任意の１つ、任意の２つ、または３つ全ては、非置換であるか、１つまたは複数の置換を有し、任意の置換は任意の他の置換と同一であっても異なっていてもよく、該置換は、以下：
    ａ）ヒドロキシ；
    ｂ）Ｃ１〜１０アルキル；
    ｃ）Ｃ２〜１０アルケニル；
    ｄ）Ｃ２〜１０アルキニル；
    ｅ）Ｃ３〜６シクロアルキル；
    ｆ）アリール；
    ｇ）ヘテロアリール；
    ここで、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、および／またはｇ）中の置換は、以下：
    １）ヒドロキシ；
    ２）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ３）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ４）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ５）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ６）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）；
    ７）ハロ；
    ８）シアノ；
    ９）カルボキシ；
    １０）アミノ；
    １１）一置換アミノ；
    １２）二置換アミノ；
    １３）アミド；
    １４）一置換アミド；
    １５）二置換アミド；および
    １６）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換され、
    ここで、２）、３）、または６）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｈ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｊ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｋ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｌ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｈ）、ｉ）、またはｌ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｍ）ハロ；
    ｎ）シアノ；
    ｏ）カルボキシ；
    ｐ）アミノ；
    ｑ）一置換アミノ；
    ｒ）二置換アミノ、
    ｓ）アミド；
    ｔ）一置換アミド；および
    ｕ）二置換アミドからなる群から選択され、
    ここで、該一置換アミノ、二置換アミノ、一置換アミド、および二置換アミドの１つまたは複数は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、スルホキシド、スルホン、スルホナート、アルキルスルホナート、スルホン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される置換を有し、
    ここで、ｕ）において、該アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールは、以下：
    ｉ）ヒドロキシ；
    ｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｉｖ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｖ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｖｉ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｉｉ）、ｉｉｉ）、またはｖｉ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｖｉｉ）ハロ；
    ｖｉｉｉ）シアノ；
    ｉｘ）カルボキシ；
    ｘ）アミノ；
    ｘｉ）一置換アミノ；
    ｘｉｉ）二置換アミノ；
    ｘｉｉｉ）アミド；
    ｘｉｖ）一置換アミド；
    ｘｖ）二置換アミド；および
    ｘｖｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換される）を有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を該個体に提供する工程を含む、方法。
  18. 前記ＳＲＥＢＰ経路のメンバーが、ＳＲＥＢＰ−１、ＳＲＥＢＰ−２、またはその両方である、請求項１７に記載の方法。
  19. 一般式：
    （式中、
    Ｒ１は、水素、メチル、エチル、またはプロピルであり、
    Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は同一または異なり、以下：
    ａ）ヒドロキシ；
    ｂ）置換または非置換Ｃ１〜１０アルキル；
    ｃ）置換または非置換Ｃ２〜１０アルケニル；
    ｄ）置換または非置換Ｃ２〜１０アルキニル；
    ｅ）置換または非置換Ｃ３〜６シクロアルキル；
    ｆ）置換または非置換アリール；
    ｇ）置換または非置換ヘテロアリール；
    ここで、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、および／またはｇ）中の置換は、以下：
    １）ヒドロキシ；
    ２）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ３）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ４）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ５）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ６）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）；
    ７）ハロ；
    ８）シアノ；
    ９）カルボキシ；
    １０）アミノ；
    １１）一置換アミノ；
    １２）二置換アミノ；
    １３）アミド；
    １４）一置換アミド；
    １５）二置換アミド；および
    １６）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換され、
    ここで、２）、３）、または６）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｈ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｊ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｋ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｌ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｈ）、ｉ）、またはｌ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｍ）ハロ；
    ｎ）シアノ；
    ｏ）カルボキシ；
    ｐ）アミノ；
    ｑ）一置換アミノ；
    ｒ）二置換アミノ、
    ｓ）アミド；
    ｔ）一置換アミド；および
    ｕ）二置換アミドからなる群から選択され、
    ここで、該一置換アミノ、二置換アミノ、一置換アミド、および二置換アミドの１つまたは複数は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、スルホキシド、スルホン、スルホナート、アルキルスルホナート、スルホン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される置換を有し、
    ここで、ｕ）において、該アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールは、以下：
    ｉ）ヒドロキシ；
    ｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｉｖ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｖ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｖｉ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｉｉ）、ｉｉｉ）、またはｖｉ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｖｉｉ）ハロ；
    ｖｉｉｉ）シアノ；
    ｉｘ）カルボキシ；
    ｘ）アミノ；
    ｘｉ）一置換アミノ；
    ｘｉｉ）二置換アミノ；
    ｘｉｉｉ）アミド；
    ｘｉｖ）一置換アミド；
    ｘｖ）二置換アミド；および
    ｘｖｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換され、
    Ｒ５は、置換されたアルキル、アリール、ヘテロアリール、または−ＳＯ２Ｒであり、Ｒは置換されたアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    Ｙ１は窒素であり、Ｙ２およびＹ３は同一または異なり、硫黄またはメチレンである）を有する化合物。
  20. 一般式：
    （式中、
    Ｒ１は、置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は同一または異なり、以下：
    ａ）ヒドロキシ；
    ｂ）置換または非置換Ｃ１〜１０アルキル；
    ｃ）置換または非置換Ｃ２〜１０アルケニル；
    ｄ）置換または非置換Ｃ２〜１０アルキニル；
    ｅ）置換または非置換Ｃ３〜６シクロアルキル；
    ｆ）置換または非置換アリール；
    ｇ）置換または非置換ヘテロアリール；
    ここで、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、および／またはｇ）中の置換は、以下：
    １）ヒドロキシ；
    ２）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ３）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ４）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ５）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ６）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）；
    ７）ハロ；
    ８）シアノ；
    ９）カルボキシ；
    １０）アミノ；
    １１）一置換アミノ；
    １２）二置換アミノ；
    １３）アミド；
    １４）一置換アミド；
    １５）二置換アミド；および
    １６）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換され、
    ここで、２）、３）、または６）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｈ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｊ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｋ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｌ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｈ）、ｉ）、またはｌ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｍ）ハロ；
    ｎ）シアノ；
    ｏ）カルボキシ；
    ｐ）アミノ；
    ｑ）一置換アミノ；
    ｒ）二置換アミノ、
    ｓ）アミド；
    ｔ）一置換アミド；および
    ｕ）二置換アミドからなる群から選択され、
    ここで、該一置換アミノ、二置換アミノ、一置換アミド、および二置換アミドの１つまたは複数は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、スルホキシド、スルホン、スルホナート、アルキルスルホナート、スルホン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される置換を有し、
    ここで、ｕ）において、該アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールは、以下：
    ｉ）ヒドロキシ；
    ｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｉｖ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｖ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｖｉ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｉｉ）、ｉｉｉ）、またはｖｉ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｖｉｉ）ハロ；
    ｖｉｉｉ）シアノ；
    ｉｘ）カルボキシ；
    ｘ）アミノ；
    ｘｉ）一置換アミノ；
    ｘｉｉ）二置換アミノ；
    ｘｉｉｉ）アミド；
    ｘｉｖ）一置換アミド；
    ｘｖ）二置換アミド；および
    ｘｖｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換され、
    Ｒ５は、置換されたアルキル、アリール、ヘテロアリール、または−ＳＯ２Ｒであり、Ｒは置換されたアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    Ｘは、−ＣＨ２−、酸素、硫黄、置換アミノ、−（Ｃ＝Ｏ）−、または−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−であり、
    Ｙ１は窒素であり、Ｙ２およびＹ３は同一または異なり、硫黄またはメチレンである）を有する化合物。
  21. 一般式：
    （式中、
    Ｒ１は、水素、メチル、エチル、またはプロピルであり、
    Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は同一または異なり、以下：
    ａ）ヒドロキシ；
    ｂ）置換または非置換Ｃ１〜１０アルキル；
    ｃ）置換または非置換Ｃ２〜１０アルケニル；
    ｄ）置換または非置換Ｃ２〜１０アルキニル；
    ｅ）置換または非置換Ｃ３〜６シクロアルキル；
    ｆ）置換または非置換アリール；
    ｇ）置換または非置換ヘテロアリール；
    ここで、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、および／またはｇ）中の置換は、以下：
    １）ヒドロキシ；
    ２）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ３）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ４）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ５）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ６）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）；
    ７）ハロ；
    ８）シアノ；
    ９）カルボキシ；
    １０）アミノ；
    １１）一置換アミノ；
    １２）二置換アミノ；
    １３）アミド；
    １４）一置換アミド；
    １５）二置換アミド；および
    １６）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換され、
    ここで、２）、３）、または６）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｈ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｊ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｋ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｌ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｈ）、ｉ）、またはｌ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｍ）ハロ；
    ｎ）シアノ；
    ｏ）カルボキシ；
    ｐ）アミノ；
    ｑ）一置換アミノ；
    ｒ）二置換アミノ、
    ｓ）アミド；
    ｔ）一置換アミド；および
    ｕ）二置換アミドからなる群から選択され、
    ここで、該一置換アミノ、二置換アミノ、一置換アミド、および二置換アミドの１つまたは複数は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、スルホキシド、スルホン、スルホナート、アルキルスルホナート、スルホン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される置換を有し、
    ここで、ｕ）において、該アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールは、以下：
    ｉ）ヒドロキシ；
    ｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｉｖ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｖ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｖｉ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｉｉ）、ｉｉｉ）、またはｖｉ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｖｉｉ）ハロ；
    ｖｉｉｉ）シアノ；
    ｉｘ）カルボキシ；
    ｘ）アミノ；
    ｘｉ）一置換アミノ；
    ｘｉｉ）二置換アミノ；
    ｘｉｉｉ）アミド；
    ｘｉｖ）一置換アミド；
    ｘｖ）二置換アミド；および
    ｘｖｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換され、
    Ｙ１は窒素であり、Ｙ２およびＹ３は同一または異なり、硫黄またはメチレンである）を有する化合物。
  22. 一般式：
    （式中、
    Ｒ１は、置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は同一または異なり、以下：
    ａ）ヒドロキシ；
    ｂ）置換または非置換Ｃ１〜１０アルキル；
    ｃ）置換または非置換Ｃ２〜１０アルケニル；
    ｄ）置換または非置換Ｃ２〜１０アルキニル；
    ｅ）置換または非置換Ｃ３〜６シクロアルキル；
    ｆ）置換または非置換アリール；
    ｇ）置換または非置換ヘテロアリール；
    ここで、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、および／またはｇ）中の置換は、以下：
    １）ヒドロキシ；
    ２）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ３）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ４）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ５）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ６）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）；
    ７）ハロ；
    ８）シアノ；
    ９）カルボキシ；
    １０）アミノ；
    １１）一置換アミノ；
    １２）二置換アミノ；
    １３）アミド；
    １４）一置換アミド；
    １５）二置換アミド；および
    １６）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換され、
    ここで、２）、３）、または６）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｈ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｊ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｋ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｌ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｈ）、ｉ）、またはｌ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｍ）ハロ；
    ｎ）シアノ；
    ｏ）カルボキシ；
    ｐ）アミノ；
    ｑ）一置換アミノ；
    ｒ）二置換アミノ、
    ｓ）アミド；
    ｔ）一置換アミド；および
    ｕ）二置換アミドからなる群から選択され、
    ここで、該一置換アミノ、二置換アミノ、一置換アミド、および二置換アミドの１つまたは複数は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、スルホキシド、スルホン、スルホナート、アルキルスルホナート、スルホン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される置換を有し、
    ここで、ｕ）において、該アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールは、以下：
    ｉ）ヒドロキシ；
    ｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｉｖ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｖ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｖｉ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｉｉ）、ｉｉｉ）、またはｖｉ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｖｉｉ）ハロ；
    ｖｉｉｉ）シアノ；
    ｉｘ）カルボキシ；
    ｘ）アミノ；
    ｘｉ）一置換アミノ；
    ｘｉｉ）二置換アミノ；
    ｘｉｉｉ）アミド；
    ｘｉｖ）一置換アミド；
    ｘｖ）二置換アミド；および
    ｘｖｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基と任意選択的に置換され、
    Ｙ１は窒素であり、Ｙ２は硫黄であり、Ｙ３は−ＣＨ−であるか、Ｙ１は窒素であり、Ｙ２は−ＣＨ−であり、Ｙ３は硫黄であるか、Ｙ１は−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｙ２は−ＣＨ−であり、Ｙ３は−ＣＨ−である）を有する化合物。
  23. 一般式：
    （式中、
    Ｒ１は、水素、メチル、エチル、またはプロピルであり、
    Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は同一または異なり、以下：
    ａ）ヒドロキシ；
    ｂ）置換または非置換Ｃ１〜１０アルキル；
    ｃ）置換または非置換Ｃ２〜１０アルケニル；
    ｄ）置換または非置換Ｃ２〜１０アルキニル；
    ｅ）置換または非置換Ｃ３〜６シクロアルキル；
    ｆ）置換または非置換アリール；
    ｇ）置換または非置換ヘテロアリール；
    ここで、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、および／またはｇ）中の置換は、以下：
    １）ヒドロキシ；
    ２）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ３）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ４）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ５）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ６）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）；
    ７）ハロ；
    ８）シアノ；
    ９）カルボキシ；
    １０）アミノ；
    １１）一置換アミノ；
    １２）二置換アミノ；
    １３）アミド；
    １４）一置換アミド；
    １５）二置換アミド；および
    １６）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換され、
    ここで、２）、３）、または６）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｈ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｊ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｋ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｌ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｈ）、ｉ）、またはｌ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｍ）ハロ；
    ｎ）シアノ；
    ｏ）カルボキシ；
    ｐ）アミノ；
    ｑ）一置換アミノ；
    ｒ）二置換アミノ、
    ｓ）アミド；
    ｔ）一置換アミド；および
    ｕ）二置換アミドからなる群から選択され、
    ここで、該一置換アミノ、二置換アミノ、一置換アミド、および二置換アミドの１つまたは複数は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、スルホキシド、スルホン、スルホナート、アルキルスルホナート、スルホン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される置換を有し、
    ここで、ｕ）において、該アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールは、以下：
    ｉ）ヒドロキシ；
    ｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｉｖ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｖ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｖｉ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｉｉ）、ｉｉｉ）、またはｖｉ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｖｉｉ）ハロ；
    ｖｉｉｉ）シアノ；
    ｉｘ）カルボキシ；
    ｘ）アミノ；
    ｘｉ）一置換アミノ；
    ｘｉｉ）二置換アミノ；
    ｘｉｉｉ）アミド；
    ｘｉｖ）一置換アミド；
    ｘｖ）二置換アミド；および
    ｘｖｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換され、
    Ｚは、−ＣＨ＝ＣＨ−、硫黄、酸素、またはアルキル置換アミノである）を有する化合物。
  24. 一般式：
    （式中、
    Ｒ１は、水素、メチル、エチル、またはプロピルであり、
    Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は同一または異なり、以下：
    ａ）ヒドロキシ；
    ｂ）置換または非置換Ｃ１〜１０アルキル；
    ｃ）置換または非置換Ｃ２〜１０アルケニル；
    ｄ）置換または非置換Ｃ２〜１０アルキニル；
    ｅ）置換または非置換Ｃ３〜６シクロアルキル；
    ｆ）置換または非置換アリール；
    ｇ）置換または非置換ヘテロアリール；
    ここで、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、および／またはｇ）中の置換は、以下：
    １）ヒドロキシ；
    ２）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ３）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ４）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ５）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ６）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）；
    ７）ハロ；
    ８）シアノ；
    ９）カルボキシ；
    １０）アミノ；
    １１）一置換アミノ；
    １２）二置換アミノ；
    １３）アミド；
    １４）一置換アミド；
    １５）二置換アミド；および
    １６）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基と任意選択的に置換され、
    ここで、２）、３）、または６）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｈ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｊ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｋ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｌ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｈ）、ｉ）、またはｌ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｍ）ハロ；
    ｎ）シアノ；
    ｏ）カルボキシ；
    ｐ）アミノ；
    ｑ）一置換アミノ；
    ｒ）二置換アミノ、
    ｓ）アミド；
    ｔ）一置換アミド；および
    ｕ）二置換アミドからなる群から選択され、
    ここで、該一置換アミノ、二置換アミノ、一置換アミド、および二置換アミドの１つまたは複数は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、スルホキシド、スルホン、スルホナート、アルキルスルホナート、スルホン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される置換を有し、
    ここで、ｕ）において、該アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールは、以下：
    ｉ）ヒドロキシ；
    ｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｉｖ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｖ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｖｉ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｉｉ）、ｉｉｉ）、またはｖｉ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｖｉｉ）ハロ；
    ｖｉｉｉ）シアノ；
    ｉｘ）カルボキシ；
    ｘ）アミノ；
    ｘｉ）一置換アミノ；
    ｘｉｉ）二置換アミノ；
    ｘｉｉｉ）アミド；
    ｘｉｖ）一置換アミド；
    ｘｖ）二置換アミド；および
    ｘｖｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換され、
    Ｙ１は窒素であり、Ｙ２はアルキル置換炭素であり、Ｙ３は硫黄であるか、Ｙ１は窒素であり、Ｙ２は酸素であり、Ｙ３はアルキル置換炭素であるか、Ｙ１は窒素であり、Ｙ２はアルキル置換炭素であり、Ｙ３は酸素であるか、Ｙ１はアルキル置換炭素であり、ｙ２は硫黄であり、Ｙ３は窒素であり、Ｙ１はアルキル置換炭素であり、Ｙ２は窒素であり、Ｙ３は硫黄であるか、Ｙ１はアルキル置換炭素であり、Ｙ２はアルキル置換炭素窒素であり、Ｙ３は酸素であるか、Ｙ１はアルキル置換炭素であり、Ｙ２は酸素であり、Ｙ３は窒素であるか、Ｙ１はアルキル置換炭素であり、Ｙ２は窒素であり、Ｙ３は硫黄であるか、Ｙ１は窒素であり、Ｙ２は窒素であり、Ｙ３は酸素であるか、Ｙ１は窒素であり、Ｙ２は酸素であり、Ｙ３は窒素であるか、Ｙ１は窒素であり、Ｙ２は窒素であり、Ｙ３は硫黄であるか、Ｙ１は窒素であり、Ｙ２は硫黄であり、Ｙ３は窒素であるか、Ｙ１は窒素であり、Ｙ２は−ＣＨ−であり、Ｙ３はアルキル置換アミノであるか、Ｙ１は窒素であり、Ｙ２はアルキル置換アミノであり、Ｙ３は−ＣＨ−であるか、Ｙ１は−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｙ２は窒素であり、Ｙ３は−ＣＨ−であるか、Ｙ１は−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｙ２＿ＣＨ＿、Ｙ３は窒素であるか、Ｙ１は−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｙ２は窒素であり、Ｙ３は窒素であるか、Ｙ１は−ＣＨ＝Ｎ−であり、Ｙ２は−ＣＨ−であり、Ｙ３は窒素であるか、Ｙ１は−ＣＨ＝Ｎ−であり；Ｙ２は窒素であり、Ｙ３は−ＣＨ−である）を有する化合物。
  25. 一般式：
    （式中、
    Ｒ１は、置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    Ｘは、−ＣＨ２−、酸素、硫黄、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−であり、
    Ｒ２、Ｒ３は同一または異なり、以下：
    ａ）ヒドロキシ；
    ｂ）置換または非置換Ｃ１〜１０アルキル；
    ｃ）置換または非置換Ｃ２〜１０アルケニル；
    ｄ）置換または非置換Ｃ２〜１０アルキニル；
    ｅ）置換または非置換Ｃ３〜６シクロアルキル；
    ｆ）置換または非置換アリール；
    ｇ）置換または非置換ヘテロアリール；
    ここで、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、および／またはｇ）中の置換は、以下：
    １）ヒドロキシ；
    ２）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ３）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ４）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ５）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ６）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）；
    ７）ハロ；
    ８）シアノ；
    ９）カルボキシ；
    １０）アミノ；
    １１）一置換アミノ；
    １２）二置換アミノ；
    １３）アミド；
    １４）一置換アミド；
    １５）二置換アミド；および
    １６）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換され、
    ここで、２）、３）、または６）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｈ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｊ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｋ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｌ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｈ）、ｉ）、またはｌ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｍ）ハロ；
    ｎ）シアノ；
    ｏ）カルボキシ；
    ｐ）アミノ；
    ｑ）一置換アミノ；
    ｒ）二置換アミノ、
    ｓ）アミド；
    ｔ）一置換アミド；および
    ｕ）二置換アミドからなる群から選択され、
    ここで、該一置換アミノ、二置換アミノ、一置換アミド、および二置換アミドの１つまたは複数は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、スルホキシド、スルホン、スルホナート、アルキルスルホナート、スルホン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される置換を有し、
    ここで、ｕ）において、該アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールは、以下：
    ｉ）ヒドロキシ；
    ｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｉｖ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｖ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｖｉ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｉｉ）、ｉｉｉ）、またはｖｉ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｖｉｉ）ハロ；
    ｖｉｉｉ）シアノ；
    ｉｘ）カルボキシ；
    ｘ）アミノ；
    ｘｉ）一置換アミノ；
    ｘｉｉ）二置換アミノ；
    ｘｉｉｉ）アミド；
    ｘｉｖ）一置換アミド；
    ｘｖ）二置換アミド；および
    ｘｖｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換され、
    Ｙ１は窒素であり、Ｙ２は硫黄であり、Ｙ３は−ＣＨ−であるか、Ｙ１は窒素であり、Ｙ２は−ＣＨ−であり、Ｙ３は硫黄であるか、Ｙ１は−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｙ２は−ＣＨ−であり、Ｙ３は−ＣＨ−であり、
    Ｚは、−ＣＨ＝ＣＨ−、硫黄、酸素、またはアルキル置換アミノである）を有する化合物。
  26. 一般式：
    （式中、
    Ｒ１は、水素、メチル、エチル、またはプロピルであり、
    Ｒ２およびＲ３は同一または異なり、以下：
    ａ）ヒドロキシ；
    ｂ）置換または非置換Ｃ１〜１０アルキル；
    ｃ）置換または非置換Ｃ２〜１０アルケニル；
    ｄ）置換または非置換Ｃ２〜１０アルキニル；
    ｅ）置換または非置換Ｃ３〜６シクロアルキル；
    ｆ）置換または非置換アリール；
    ｇ）置換または非置換ヘテロアリール；
    ここで、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、および／またはｇ）中の置換は、以下：
    １）ヒドロキシ；
    ２）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ３）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ４）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ５）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ６）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）；
    ７）ハロ；
    ８）シアノ；
    ９）カルボキシ；
    １０）アミノ；
    １１）一置換アミノ；
    １２）二置換アミノ；
    １３）アミド；
    １４）一置換アミド；
    １５）二置換アミド；および
    １６）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換され、
    ここで、２）、３）、または６）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｈ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｊ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｋ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｌ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｈ）、ｉ）、またはｌ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｍ）ハロ；
    ｎ）シアノ；
    ｏ）カルボキシ；
    ｐ）アミノ；
    ｑ）一置換アミノ；
    ｒ）二置換アミノ、
    ｓ）アミド；
    ｔ）一置換アミド；および
    ｕ）二置換アミドからなる群から選択され、
    ここで、該一置換アミノ、二置換アミノ、一置換アミド、および二置換アミドの１つまたは複数は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、スルホキシド、スルホン、スルホナート、アルキルスルホナート、スルホン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される置換を有し、
    ここで、ｕ）において、該アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールは、以下：
    ｉ）ヒドロキシ；
    ｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｉｖ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｖ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｖｉ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｉｉ）、ｉｉｉ）、またはｖｉ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｖｉｉ）ハロ；
    ｖｉｉｉ）シアノ；
    ｉｘ）カルボキシ；
    ｘ）アミノ；
    ｘｉ）一置換アミノ；
    ｘｉｉ）二置換アミノ；
    ｘｉｉｉ）アミド；
    ｘｉｖ）一置換アミド；
    ｘｖ）二置換アミド；および
    ｘｖｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換され、
    Ｘ１は窒素であり、Ｘ２は−ＣＨ−であり、Ｘ３は−ＣＨ−であるか、Ｘ１は−ＣＨ−であり、Ｘ２は窒素であり、Ｘ３は−ＣＨ−であるか、Ｘ１は−ＣＨ−であり、Ｘ２は−ＣＨ−であり、Ｘ３は窒素である）を有する化合物。
  27. 一般式：
    （式中、
    Ｒ１は、水素、メチル、エチル、またはプロピルであり、
    Ｒ２およびＲ３は同一または異なり、以下：
    ａ）ヒドロキシ；
    ｂ）置換または非置換Ｃ１〜１０アルキル；
    ｃ）置換または非置換Ｃ２〜１０アルケニル；
    ｄ）置換または非置換Ｃ２〜１０アルキニル；
    ｅ）置換または非置換Ｃ３〜６シクロアルキル；
    ｆ）置換または非置換アリール；
    ｇ）置換または非置換ヘテロアリール；
    ここで、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、および／またはｇ）中の置換は、以下：
    １）ヒドロキシ；
    ２）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ３）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ４）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ５）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ６）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）；
    ７）ハロ；
    ８）シアノ；
    ９）カルボキシ；
    １０）アミノ；
    １１）一置換アミノ；
    １２）二置換アミノ；
    １３）アミド；
    １４）一置換アミド；
    １５）二置換アミド；および
    １６）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換され、
    ここで、２）、３）、または６）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｈ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｊ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｋ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｌ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｈ）、ｉ）、またはｌ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｍ）ハロ；
    ｎ）シアノ；
    ｏ）カルボキシ；
    ｐ）アミノ；
    ｑ）一置換アミノ；
    ｒ）二置換アミノ、
    ｓ）アミド；
    ｔ）一置換アミド；および
    ｕ）二置換アミドからなる群から選択され、
    ここで、該一置換アミノ、二置換アミノ、一置換アミド、および二置換アミドの１つまたは複数は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、スルホキシド、スルホン、スルホナート、アルキルスルホナート、スルホン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される置換を有し、
    ここで、ｕ）において、該アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールは、以下：
    ｉ）ヒドロキシ；
    ｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｉｖ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｖ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｖｉ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｉｉ）、ｉｉｉ）、またはｖｉ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｖｉｉ）ハロ；
    ｖｉｉｉ）シアノ；
    ｉｘ）カルボキシ；
    ｘ）アミノ；
    ｘｉ）一置換アミノ；
    ｘｉｉ）二置換アミノ；
    ｘｉｉｉ）アミド；
    ｘｉｖ）一置換アミド；
    ｘｖ）二置換アミド；および
    ｘｖｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換され、
    Ｙ１は窒素であり、Ｙ２は硫黄であり、Ｙ３は−ＣＨ−であるか、Ｙ１は−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｙ２は−ＣＨ−であり、Ｙ３は−ＣＨ−であるか、Ｙ１は窒素であり、Ｙ２は−ＣＨ−であり、Ｙ３は硫黄であり、
    Ｚは、−ＣＨ＝ＣＨ−、硫黄、酸素、またはアルキル置換アミノである
    ）を有する化合物。
  28. 一般式：
    （式中、
    Ｒ１は、置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    Ｘは、−ＣＨ−、酸素、硫黄、アルキル置換アミノ、−（Ｃ＝Ｏ）−、または−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−であり、
    Ｙ１は窒素であり、Ｙ２は硫黄であり、Ｙ３は−ＣＨ−であるか、Ｙ１は−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｙ２は−ＣＨ−であり、Ｙ３は−ＣＨ−であるか、Ｙ１は窒素であり、Ｙ２は−ＣＨ−であり、Ｙ３は硫黄であり、
    Ｚは、−ＣＨ＝ＣＨ−、硫黄、酸素、またはアルキル置換アミノであり、
    Ｒ２およびＲ３は同一または異なり、以下：
    ａ）ヒドロキシ；
    ｂ）置換または非置換Ｃ１〜１０アルキル；
    ｃ）置換または非置換Ｃ２〜１０アルケニル；
    ｄ）置換または非置換Ｃ２〜１０アルキニル；
    ｅ）置換または非置換Ｃ３〜６シクロアルキル；
    ｆ）置換または非置換アリール；
    ｇ）置換または非置換ヘテロアリール；
    ここで、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、および／またはｇ）中の置換は、以下：
    １）ヒドロキシ；
    ２）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ３）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ４）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ５）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ６）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）；
    ７）ハロ；
    ８）シアノ；
    ９）カルボキシ；
    １０）アミノ；
    １１）一置換アミノ；
    １２）二置換アミノ；
    １３）アミド；
    １４）一置換アミド；
    １５）二置換アミド；および
    １６）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基と任意選択的に置換され、
    ここで、２）、３）、または６）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｈ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｊ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｋ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｌ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｈ）、ｉ）、またはｌ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｍ）ハロ；
    ｎ）シアノ；
    ｏ）カルボキシ；
    ｐ）アミノ；
    ｑ）一置換アミノ；
    ｒ）二置換アミノ、
    ｓ）アミド；
    ｔ）一置換アミド；および
    ｕ）二置換アミドからなる群から選択され、
    ここで、該一置換アミノ、二置換アミノ、一置換アミド、および二置換アミドの１つまたは複数は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、スルホキシド、スルホン、スルホナート、アルキルスルホナート、スルホン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される置換を有し、
    ここで、ｕ）において、該アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールは、以下：
    ｉ）ヒドロキシ；
    ｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒａ；
    ｉｉｉ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲａ；
    ｉｖ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ；
    ｖ）−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ；
    ｖｉ）−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲａ（式中、ｎ＝１〜１０）、
    ここで、ｉｉ）、ｉｉｉ）、またはｖｉ）において、Ｒａは、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｖｉｉ）ハロ；
    ｖｉｉｉ）シアノ；
    ｉｘ）カルボキシ；
    ｘ）アミノ；
    ｘｉ）一置換アミノ；
    ｘｉｉ）二置換アミノ；
    ｘｉｉｉ）アミド；
    ｘｉｖ）一置換アミド；
    ｘｖ）二置換アミド；および
    ｘｖｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１〜５個の基で任意選択的にさらに置換される）を有する化合物。
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