JP2010043100A - 修飾ポリペプチド - Google Patents

Abstract

【課題】半減期の増加を有し、かつ減少した免疫原性という付加価値も有し、かつ毒性を欠いている、修飾ＧＨ分子を提供する。
【解決手段】ｉ）成長ホルモンの成長ホルモン受容体結合ドメインの修飾されたアミノ酸配列を有する第一の修飾ドメインであって、該修飾は少なくとも１個のアミノ酸残基の付加、欠失、または置換である第一の修飾ドメイン、およびｉｉ）成長ホルモンの成長ホルモン受容体結合ドメインの修飾されたアミノ酸配列を有する第二の修飾ドメインであって、該修飾は少なくとも１個のアミノ酸残基の付加、欠失、または置換である第二の修飾ドメイン、を含み、前記第一及び第二の修飾ドメインは直列に融合され、前記第一及び第二の修飾ドメインの少なくとも一方における修飾が部位２における修飾であり、当該ポリペプチドはアンタゴニストであることを特徴とするキメラポリペプチド。
【選択図】図１

Description

本発明は、キメラポリペプチド（ここで上記ポリペプチドは成長ホルモン受容体の受容体結合ドメインに結合した成長ホルモンの修飾結合ドメインを含む）、および上記修飾成長ホルモン結合ドメインの直列／オリゴマーに関する。

ＧＨは、哺乳類の成長および発達の調節に関与するホルモンの巨大ファミリーの一員である。ヒトＧＨは、２２ｋＤａのポリペプチドであり、これは多数の生物学的プロセスに関与している。例えば、細胞増殖、乳汁分泌、マクロファージの活性化、およびエネルギー代謝の調節。ＧＨは、部位１および部位２と称される、ＧＨ上の離れた２ヶ所を介してＧＨＲに結合した２枚の膜と経時的に相互作用する。部位１は、高親和性結合部位であり、そして部位２は低親和性部位である。単独のＧＨ分子は、部位１を介して１つのＧＨＲと結合する。次いで、第二のＧＨＲが部位２を介して動員されてＧＨＲ：ＧＨ：ＧＨＲ複合体を形成する。次いで、複合体は内部移行して、シグナル伝達カスケードを活性化し、遺伝子発現の変化を導く。

ＧＨＲの細胞外ドメインは、結合した、それぞれ約１００アミノ酸の２個のドメイン（ＳＤ−１００）、細胞表面に最も近接しているＣ末端ＳＤ−１００ドメイン（ｂ）および最も離れているＮ末端ＳＤ−１００ドメイン（ａ）として存在する。三量体複合体ＧＨＲ−ＧＨ−ＧＨＲの形成を伴うホルモン結合で生じるのは、これらの２個のドメインの立体配座の変化である。

修飾ＧＨは、米国特許第５，８４９，５３５号に開示され、これを参照して本明細書の一部とする。ＧＨに対する修飾は、部位１および部位２両方の結合部位でのものである。部位１に対する修飾は、野生型ＧＨと比較してＧＨＲに対しより高い親和性を有するＧＨ分子を産生する。これらの修飾ＧＨ分子は、アゴニストとして作用する。部位２の修飾もまた開示されており、これはＧＨアンタゴニストの創造をもたらす。部位１についての、ＧＨの結合親和性を変更する、ＧＨに対する修飾のさらなる例は、米国特許第５，８５４，０２６号、米国特許第６，００４，９３１号、米国特許第６，０２２，７１１号、米国特許第６，０５７，２９２号、および米国特許第６１３６５６３号に開示され、これらのそれぞれを参照して本明細書の一部とする。部位１に対してなされた修飾の要約は、表１に提供される。部位２、詳細には、アミノ酸残基Ｇ１２０（アルギニン、リシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、またはグルタミン酸のいずれかに修飾された場合、アンタゴニスト性を持つＧＨ分子を作り出す）に対する修飾もまた開示される。

また、修飾ＧＨは、「ｐｅｇ化」（これは複数の有益な効果を有する）として既知のプロセスによりポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に被覆(coat)される。第一に、ＰＥＧ被覆は、ＧＨの有効分子量を２２ｋＤから約４０ｋＤに増加させる。これが有する効果は、ＧＨの糸球体濾過を減少させ、それによりｉｎ ｖｉｖｏでのＧＨの半減期を増加させることであり、これは所望の効果を生成するために投与される用量を減少させる。さらに、ｐｅｇ化は、この方法で処理されるタンパク質の免疫原性および毒性の両方を減少させると考えられる（非特許文献１を参照）。

Abuchowski et al J Biol Chem., 252,3578-3581, (1977)

しかしながら、ｐｅｇ化の結果は、修飾ＧＨ分子のＧＨＲに対する親和性を減少させることである。このことは、親和性の減少を克服するために用量の増加が要求されることを意味する。これは、修飾ＧＨの半減期の増加に関するｐｅｇ化の有利な効果を相殺するため、望ましくない。ｐｅｇ化を必要とせずに、半減期の増加を有し、かつ減少した免疫原性という付加価値も有し、かつ毒性を欠いている、修飾ＧＨ分子を提供することが望ましい。

本発明の第１の態様によると、キメラペプチドであって、
ｉ）成長ホルモンの、少なくとも１ヶ所が修飾された結合ドメインであって、該修飾は少なくとも１個のアミノ酸残基の付加、欠失、または置換である、少なくとも１ヶ所が修飾された結合ドメイン、および
ｉｉ）成長ホルモン受容体のリガンド結合ドメイン、
を含むキメラポリペプチドが提供される。

ｐＨＥＡＴ．ＧＨ．Ｇ１２０Ｒのプラスミドマップ、これは、ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ遺伝子の結合により生成され、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限部位間のＰＣＲにより合成された。プラスミド上の選択マーカーはＡｍｐＲである。 ｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯ．１Ａ７のプラスミドマップ、これは、ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ遺伝子をｐＴｒｃＨｉｓ １Ａ１のＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位間に結合することにより生成された。リンカーは（Ｇ４Ｓ）４であり、そしてプラスミド上の選択マーカーはＡｍｐＲである。 ｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯ．１Ｂ２のプラスミドマップ、これは、ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ遺伝子をｐＴｒｃＨｉｓ １Ｂ１のＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位間に結合することにより生成された。リンカーは（Ｇ４Ｓ）４であり、そしてプラスミド上の選択マーカーはＡｍｐＲである。 ｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯ．１Ｃ３のプラスミドマップ、これは、ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ遺伝子をｐＴｒｃＨｉｓ １Ａ７のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎＤＩＩＩ部位間に結合することにより生成された。リンカーは（Ｇ４Ｓ）４であり、そしてプラスミド上の選択マーカーはＡｍｐＲである。 ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ遺伝子の配列で、開始コドン、６×Ｈｉｓタグ、関連制限部位、終止コドン、およびＧ１２０Ｒ突然変異（ＣＧＣ）を示す。実際のＧＨ．Ｇ１２０Ｒコンポーネントは大文字で示され、そして配列決定された領域は太字で示される。 １Ａ７遺伝子の配列で、開始コドン、６×Ｈｉｓタグ、関連制限部位、終止コドン、およびＧ１２０Ｒ突然変異（ＣＧＣ）を示す。実際のＧＨ．Ｇ１２０Ｒ−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＨＲ（ｂ）コンポーネントは大文字で示され、そして配列決定された領域は太字で示される。 １Ｂ２遺伝子の配列で、開始コドン、６×Ｈｉｓタグ、関連制限部位、終止コドン、およびＧ１２０Ｒ突然変異（ＣＧＣ）を示す。実際のＧＨ．Ｇ１２０Ｒ−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＨＲ（ｆｌｅｃ）コンポーネントは大文字で示され、そして配列決定された領域は太字で示される。 １Ｃ３遺伝子の配列で、開始コドン、６×Ｈｉｓタグ、関連制限部位、終止コドン、およびＧ１２０Ｒ突然変異（ＣＧＣ）を示す。実際のＧＨ．Ｇ１２０Ｒ−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＨ．Ｇ１２０Ｒコンポーネントは大文字で示され、そして配列決定された領域は太字で示される。 ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ、１Ａ７、１Ｂ２、および１Ｃ３の発現研究のため、一次抗体として抗ヒトＧＨを用いた１５％ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロット。発現は、エシェリヒア・コリＸＬ１ Ｂｌｕｅまたはエシェリヒア・コリＳＵＲＥ細胞中、ｐＴｒｃＨｉｓベクターからであり、これらの試料は、１ｍＭ（最終濃度）のＩＰＴＧでの誘導後４時間をおいた。ブロットは、ＧＨ．Ｇ１２０Ｒおよび１Ｃ３が単独のバンドを生成し、一方１Ａ７および１Ｂ２の試料は開裂生成物を含むことを示す。 精製ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ、１Ａ７、および１Ｃ３のクーマシー染色した［Ｃ］１５％ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル。一次抗体として抗ヒトＧＨを用いたこれらの試料のウェスタンブロット［Ｗ］もまた示す。クーマシー染色したゲルは、精製タンパク質試料が９５％より多い純度であることを示すが、しかしウェスタンブロットは、ＧＨ．Ｇ１２０Ｒおよび１Ｃ３のみが単独のバンドを生成し、一方１Ａ７の試料は開裂生成物を含むことを示す。 ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ、１Ａ７、および１Ｃ３についてのＧＨバイオアッセイの結果を示すグラフである。各グラフは、標準曲線、異なる濃度における構築物単独でのアッセイ、および２５ｎｇ／ｍｌのｈＧＨと合わせた異なる濃度における構築物でのアッセイを示す。これらは、タンパク質のいずれも固有のアゴニスト活性を有さないが、全てアンタゴニスト活性を有し、ここでＧＨ．Ｇ１２０Ｒが最も活性であり、１Ａ７が最低であることを示す。 未修飾のＧＨのアミノ酸配列である。 未修飾ＧＨの核酸配列である。

本発明の好適な実施形態において、上記ポリペプチドは、成長ホルモンの部位１結合ドメインで修飾されている。
本発明のさらに好適な実施形態において、上記ポリペプチドは、成長ホルモンの部位２結合ドメインで修飾されている。
本発明のなおさらに好適な実施形態において、上記ポリペプチドは、成長ホルモンの部位１および部位２両方で修飾されている。

既に記載されたように、部位１突然変異は、当該技術分野で既知であり、これは成長ホルモン受容体上の結合ドメインに対する成長ホルモンの親和性を増加させる。そのような修飾成長ホルモンはアゴニストとして作用する。部位１の修飾が部位２の修飾と組合せられている場合（ここで後者の修飾は、不活性または部分的に活性な部位２結合部位をもたらす）、そのような分子はアンタゴニストとなる。野生型部位１結合部位を活用する部位２のみに対する修飾もまたアンタゴニストを作り出す。

本発明のさらに好適な実施形態において、アミノ酸置換により修飾されている部位１結合ドメインを含むポリペプチドが提供され、ここで該修飾は、以下からなる群より選択される。図１３に表される配列の、１８位ヒスチジンをアラニンまたはアスパラギン酸で、および／または２１位ヒスチジンをアスパラギンで、および／または２２位グルタミンをアラニンで、および／または２５位フェニルアラニンをアラニンで、および／または２６位アスパラギン酸をアラニンで、および／または２９位グルタミンをアラニンで、および／または１６７位グルタミン酸をアラニンで、および／または１７１位アスパラギン酸をセリンで、および／または１７２位リシンをセリンまたはアラニンで、および／または１７９位イソロイシンをチロシンで。

好ましくは、ＧＨＲのその結合ドメインに対する部位１の親和性を増加させるための上記修飾は、図１３のＧＨアミノ酸配列により表されるように、１８位ヒスチジンをアスパラギン酸で、２１位ヒスチジンをアスパラギンで、１６７位アルギニンをアスパラギンで、１７１位アスパラギン酸をアルギニンで、１７４位グルタミン酸をセリンで、および１７９位イソロイシンをスレオニンでの、アミノ酸置換からなる。

本発明のさらに好適な実施形態において、ＧＨＲのその結合ドメインに対する部位１の親和性を増加させるための上記修飾は、図１３のＧＨアミノ酸配列により表されるように、１８位ヒスチジンをアラニンで、２２位グルタミンをアラニンで、２５位フェニルアラニンをアラニンで、２６位アスパラギン酸をアラニンで、２９位グルタミンをアラニンで、６５位グルタミン酸をアラニンで、１６８位リシンをアラニンで、および１７４位グルタミン酸をアラニンでの、アミノ酸置換からなる。

本発明のさらに好適な実施形態において、上記部位２修飾は、図１３に表される配列のアミノ酸残基１２０位に対するものである。好ましくは、上記部位２修飾は、本明細書中開示されるとおり、部位１修飾と組合される。あるいは、ＧＨは、アミノ酸残基１２０位グリシンにおいてのみ修飾される。

本発明の好適な実施形態において、上記部位２修飾は、アルギニン、アラニン、リシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、およびグルタミン酸からなる群より選択されるアミノ酸でのグリシンの置換である。好ましくは、上記置換は、１２０位グリシンのアルギニンまたはリシンまたはアラニンでのものである。

本発明のさらに好適な実施形態において、ＧＨＲの成長ホルモン結合ドメインは、ＧＨＲの細胞外ドメインである。より好ましくは、結合ドメインは、ＧＨのＣ末端ＳＤ−１００ドメインである。

あるいは、上記結合ドメインは全長ＧＨＲである。

本発明の好適な実施形態において、上記キメラポリペプチドは、融合タンパク質であり、ここで修飾ＧＨは、ＧＨＲ、またはその一部とインフレーム翻訳融合(inframe translationalfusion)している。好ましくは、上記融合ポリペプチドは、修飾ＧＨ、およびＧＨＲのＣ末端ＳＤ−１００ドメインを含む。

本発明の代替的なさらに好適な実施形態において、ＧＨの修飾結合ドメインは、ＧＨＲのＧＨ結合ドメインに対するリンカーにより結合している。リンカーは可動性(flexible)であってもよい。

リンカーは、受容体の細胞外ドメイン内の任意の残基のところにあってもよく、これは、修飾ＧＨが自由な受容体と細胞表面で可動的に結合することを可能にする。好ましくは、結合は、修飾ＧＨ分子のＣ末端に近い残基とＧＨＲのＮ末端に近い残基との間で作られる。より好ましくは、結合は、修飾ＧＨ分子のＣ末端に近い残基とＣ末端ＳＤ−１００のＮ末端のＮ末端に近い残基との間で作られる。より好ましくは、結合は、ＧＨＲのＣ末端ＳＤ−１００のＮ末端の残基１２６〜１２８のいずれかで作られる。本発明の１つの実施形態において、結合は、Ｃ末端ＳＤ−１００のＮ末端の残基１２７で作られる。好ましくは、リンカーはペプチドである。

ＧＨＲ：ＧＨ：ＧＨＲ複合体の結晶構造は、ＧＨのＣ末端（１９１残基）とＣ末端ＳＤ−１００のＮ末端（１２６〜１２８残基）との間の距離が１０Ａであることを明らかにする。これは、リンカー設計に関して貴重な情報を提供する。

好ましくは、リンカーは、５個〜３０個のアミノ酸残基を含むポリペプチドである。より好ましくは、リンカーは、１０個〜２０個のアミノ酸残基を含む。さらにより好ましくは、リンカーはペプチドの少なくとも１つのコピーを含む：
ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（本明細書中以下、「Ｇｌｙ４Ｓｅｒ」として示す）。

本発明の１つの実施形態において、リンカーは、長さが１０個のアミノ酸であり、かつＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーのコピーを２つ含む。本発明の代替的な実施形態において、リンカーは長さが１５個のアミノ酸であり、かつＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーのコピーを３つ含む。なお代替的な実施形態において、リンカーは、長さが２０個のアミノ酸であり、かつＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーのコピーを４つ含む。

本発明の好適な実施形態において、上記ポリペプチドは、ヒトＧＨおよびヒトＧＨＲに由来する。

本発明のさらなる態様によると、核酸分子であって、
ｉ）図１３の核酸配列に表されるとおりの核酸分子と、
ｉｉ）（ｉ）の該核酸配列とハイブリダイズする核酸分子と、
からなる群から選択される、本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。

本発明による修飾成長ホルモンをコードする核酸分子は、通常、当該技術分野で既知の、および組換え技法ならびにオリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いる核酸分子合成を含む分子技法により合成され得る。

本発明の好適な実施形態において、上記核酸分子は、厳密な(stringent)ハイブリダイゼーションの下、ハイブリダイズする。

用語「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、本明細書中使用されるとおり、当該技術分野で一般的なパラメーターを示す。核酸ハイブリダイゼーションパラメーターは、そのような方法をまとめた参照文献、例えば、「分子クローニング：実験室手引書（Molecular Cloning : A Laboratory Manual）」（J. Sambrook, et al. eds, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989）、または「分子生物学における最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」（F. M. Ausubel, et al. eds, John Wiley & Sons, INC., New York）に見られ得る。より詳細には、厳密な条件は、本明細書中使用されるとおり、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％のフィコール、０．０２％のポリビニルピロリドン、０．０２％のウシ血清アルブミン、２．５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％のＳＤＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ）中６５℃でのハイブリダイゼーションを示す。ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）であり、ＳＤＳは、ドデシル硫酸ナトリウムであり、そしてＥＤＴＡは、エチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーション後、その上にＤＮＡが移された膜を、室温で２×ＳＳＣで、次いで上限６８℃で０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳで洗浄する。

本発明のさらなる態様によれば、本発明による核酸分子を含むベクターが提供される。

本発明の好適な実施形態において、上記ベクターは、組換え遺伝子発現に順応した発現ベクターである。

通常、上記順応には、制限としてではなく例として、細胞／組織特異的発現を媒介する転写調節配列（プロモーター配列）の提供が挙げられる。これらのプロモーター配列は、細胞／組織特異的、誘導性、または構成型(constitutive)であってもよい。

プロモーターは、当該技術分野で認識された用語であり、そして明瞭にするために、以下の特徴を含むが、これは例としてのみ提供されるものであり、制限としてではない。エンハンサーエレメントは、遺伝子の転写開始部位に対して５'でしばしば見いだされるシス作用核酸配列である（エンハンサーは、遺伝子配列に対して３'で見いだされてもよく、またはさらにイントロン配列に位置してもよく、それゆえ位置独立性である）。エンハンサーは、エンハンサーが結合している遺伝子の転写速度を増加させるように機能する。エンハンサー活性は、特にエンハンサーエレメントに結合することが示されているトランス作用転写因子に応答する。転写因子の結合／活性（「真核生物転写因子（Eukaryotic Transcription Facters）」（David S Latchman, Academic Press Ltd, San Diego）を参照してほしい）は、いくつかの環境的合図に応答し、これには、制限としてではなく例として、中間代謝産物および／または環境的作動体が挙げられる。

プロモーターエレメントはまた、転写開始部位を選択するように機能するいわゆるＴＡＴＡボックスおよびＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列も含む。

これらの配列も、とりわけＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を促進するように機能するポリペプチドに結合する。

順応はまた、選択可能なマーカーおよび自己複製配列の提供を含み、これらは両方とも真核生物細胞または原核生物宿主のいずれかにおける上記ベクターの維持を促進する。自律的に維持されるベクターは、エピソームベクターと称される。エピソームベクターは、これらの分子が巨大ＤＮＡフラグメント（３０〜５０ｋｂのＤＮＡ）を取り込み得るので、望ましい。この型のエピソームベクターは、ＷＯ９８／０７８７６に記載されており、これを参照して本明細書の一部とする。

ベクターコード遺伝子の発現を促進する順応として、転写終結／ポリアデニル化配列の提供が挙げられる。これはまた、ビシストロンまたはマルチシストロン発現カセットに配列されたベクターコード遺伝子の発現を最大限にするように機能する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の提供を含む。

これらの順応は当該技術分野で既知である。一般に、発現ベクター構築および組換えＤＮＡ技法に関しては、非常に多くの文献が出版されている。Sambrook et al (1989) 「分子クローニング：実験室手引書（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」（Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY）およびその中の参照文献、 Marston, F (1987) 「ＤＮＡクローニング技法：実践的アプローチ第三巻（DNA Cloning Techniques : A Practical Approach Vol III）」（IRL Press, Oxford UK）、「ＤＮＡクローニング（DNA Cloning）」（F M Ausubel et al）、「分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」（John Wiley & Sons, Inc. (1994)）を参照してほしい。

本発明のさらなる態様によれば、本発明によるポリペプチドの医薬品としての使用が提供される。本発明の好適な実施形態において、上記ポリペプチドは、巨人症、末端肥大症、癌（例えば、ウィルムス腫瘍、骨原性肉腫、乳癌、大腸癌、前立腺癌、甲状腺癌）、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎障害、ならびに糖尿病およびＧＨ過剰の他の合併症からなる群より選択される状態を治療するための薬物の製造に使用するためのものである。

本発明のポリペプチドおよび組成物は、注射を含む、任意の従来経路または経時でのゆるやかな輸液により投与され得る。投与は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内（intracavity）、眼内、皮下、または経皮であってもよい。医薬組成物は、便宜上単位剤形で提供されてもよく、そして薬学の分野で既知の任意の方法により調製されてもよい。

投与される場合、本発明の医薬調製物は、医薬上許容可能な量で、かつ医薬上許容可能な組成物に適用される。用語「医薬上許容可能な」は、活性成分の生物活性の有効性に影響を及ぼさない無毒性物質を意味する。そのような調製物は、日常業務上、塩、緩衝化剤、保存料、適合性(compatible)キャリア、および随意に他の治療剤を含み得る。

組成物は、所望であれば、医薬上許容可能なキャリアと組み合わせてもよい。用語「医薬上許容可能なキャリア」は、ヒトへの投与に適した、１種またはそれ以上の適合性の固体もしくは液体の、充填剤、希釈剤、またはカプセル化物質を意味する。用語「キャリア」は、適用を促進するためにそれと活性成分が組合わされる、天然または合成の、有機または無機成分、を表す。医薬組成物は、適した緩衝化剤を含んでもよく、これには塩での酢酸、塩でのクエン酸、塩でのホウ酸、および塩でのリン酸が挙げられる。医薬組成物はまた、随意に、適切な保存料（塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、およびチメロサールなど）を含んでもよい。

本発明のなおさらなる態様によれば、本発明による核酸またはベクターで形質転換または形質移入された細胞が提供される。

本発明の好適な実施形態において、上記細胞は、真核生物細胞である。好ましくは、上記細胞は、粘菌（例えば、タマホコリカビ種）、酵母菌細胞（例えば、サッカロミセス・セレビジエ、ピヒア種）、哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、スポドプテラ種）からなる群より選択される。

代替的な好適な実施形態において、上記細胞は、原核細胞、好ましくはエシェリヒア・コリ（Echerichia coli）またはバチルス種（Bacillus spp）である。

本発明のさらなる態様によると、本発明のポリペプチドの製造法であって、
ｉ）本発明による細胞を提供すること、
ｉｉ）該細胞を、上記ポリペプチドの産生を導く条件下、培養すること、および随意に
ｉｉｉ）該ポリペプチドを該細胞または細胞培地から単離すること、
を含む、本発明に記載のポリペプチドの製造法が提供される。

本発明の好適な方法において、上記ポリペプチドには、上記細胞からのポリペプチドの精製を促進するために、分泌シグナルが提供される。さらにより好ましくは、上記ポリペプチドには、上記細胞または細胞培地からのポリペプチドの精製を促進するために、アフィニティータグ(an affinity tag)が提供される。

本発明のなおさらなる態様によると、上記哺乳類に本発明によるポリペプチドを投与することを含む、哺乳類、好ましくはヒトの治療法が提供される。

本発明のさらなる態様によると、２より多い修飾成長ホルモン結合ドメインを含むキメラポリペプチドが提供され、ここで上記修飾は、少なくとも１個のアミノ酸残基の付加、欠失、または置換である。

本発明の好適な実施形態において、複数の修飾成長ホルモン結合ドメインを含むキメラポリペプチドが提供される。

本発明のさらに好適な実施形態において、少なくとも２個の修飾部位２成長ホルモン結合ドメインを含むキメラポリペプチドが提供される。

本発明のさらに好適な実施形態において、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個の修飾部位２成長ホルモン結合ドメインを含むキメラポリペプチドが提供される。

本発明のなおさらに好適な実施形態において、上記キメラポリペプチドは、リンカー分子により互いに結合した、２より多い修飾成長ホルモン結合ドメインを含む。好ましくは、上記リンカー分子は、本明細書中上記に開示されるとおりである。

本発明のなおさらなる態様に従って、２より多い修飾成長ホルモン結合ドメインを含む上記キメラポリペプチドはさらに、成長ホルモン受容体の少なくとも１個の成長ホルモン結合ドメインを含む。

好ましくは、上記キメラポリペプチドは、２個の修飾成長ホルモン結合ドメインおよび成長ホルモン受容体の１個の成長ホルモン結合ドメインからなる。

好ましくは、上記キメラポリペプチドは、少なくとも２個の修飾部位２成長ホルモン結合ドメインからなる。

受容体結合ドメインに結合した成長ホルモン（growth a hormone）結合ドメインを含むキメラポリペプチドに関連する態様および実施形態は、より多くまたは複数の成長ホルモン結合ドメインを含むキメラポリペプチドに応用可能である。例えば、上記キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、上記ポリペプチドを含む医薬組成物、上記キメラポリペプチドを発現する細胞株、上記ポリペプチドの製造法、および上記ポリペプチドを用いる治療法は、この種のキメラポリペプチドに関して、全て本発明の範囲内にある。

本発明の実施形態は、ここで例としてのみ、そして以下の表および図を参照して記載される。

表１は、ヒトＧＨの部位１および部位２に対するアミノ酸置換の要約を表す。

［材料および方法］
部位１および／または部位２で修飾されたＧＨを生成する方法は、米国特許第５，８４９，５３５号、米国特許第５，８５４，０２６号、米国特許第６，００４，９３１号、米国特許第６，０２２，７１１号、米国特許第６，０５７，２９２号、および米国特許第６１３６５６３号に開示され、これらのそれぞれを参照して本明細書の一部とする。

［ＤＮＡ構築］
部位２が突然変異したＧＨアンタゴニスト（ＧＨａ）の生成
ヒトＧＨのｃＤＮＡ（図１）を、ヒト下垂体組織からＰＣＲ増幅し、そしてベクターｐＴｒｃＨｉｓ−Ｔｏｐｏ（ｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯ−ＧＨｓｔｏｐ）中にクローニングした。ＧＨＲ細胞外ドメインを、ＰＣＲを用いてヒト肝臓ｃＤＮＡから増幅した。

成長ホルモンアンタゴニスト（Ｇ１２０Ｒ）構築
成長ホルモンのＧ１２０Ｒ突然変異
ファージミドｓｓＤＮＡ突然変異法を用いて、成長ホルモン（ＧＨ）遺伝子を、突然変異させた。最初に、ＧＨ遺伝子を、ｐＴｒｃＨｉｓＧＨから、ｐＴ７Ｔ３１８中、ＢａｍＨＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間にサブクローニングして、ｐＴ７Ｔ３１８−ＧＨを産生した。次いで、このプラスミドをエシェリヒア・コリＣＪ２３６中に形質転換し、そして一本鎖ｓｓＤＮＡを産生した。

次いで、ｓｓＤＮＡであるｐＴ７Ｔ３１８−ＧＨを、Ｇｌｙ１２０についてのコドンをＧＧＣからＣＧＣへ変更することにより突然変異させ、プライマーＧＨ．（Ｇ１２０Ｒ）Ｆｏｒを使用した（表１）。

次いで、突然変異プロセス後、産生したｄｓＤＮＡであるｐＴ７Ｔ３１８−ＧＨ．Ｇ１２０Ｒを用いて、ＧＨ．Ｇ１２０ＲをｐＨＥＡＴベクター中にサブクローニングした、これによりｐＨＥＡＴ．ＧＨ．Ｇ１２０Ｒを得た（図１）。

［ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ構築物の生成］
χ１Ａ７［ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＨＲ（ｂ）］＝ＧＨＲのｂドメインに結合したＧＨａ。
制限部位ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを用いて、ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ遺伝子をｐＨＥＡＴ．ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ（図１）から切除した。次いで、遺伝子をｐＴｒｃＨｉｓχ１Ａ１［ＧＨ−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＨＲ（ｂ）］のＧＨ遺伝子の場所に結合した（図２）。得られるプラスミドをエシェリヒア・コリＸＬ１ Ｂｌｕｅ中に形質転換し、そしてＬＢ（０．３％のグルコース、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン）寒天板上に蒔いた。

χ１Ｂ２［ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＨＲｆｌｅｃ］＝ＧＨＲの全長細胞外ドメインに結合したＧＨａ。
χ１Ａ７遺伝子を生成するために使用した戦略を繰り返したが、しかしレシピエントベクターはｐＴｒｃＨｉｓχ１Ｂ１［ＧＨ−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＨＲｆｌｅｃ］（図３）であった。得られるプラスミドをエシェリヒア・コリＸＬ１ Ｂｌｕｅ中に形質転換し、そしてＬＢ（０．３％のグルコース、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン）寒天板上に蒔いた。

χ１Ｃ３［ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ］＝ＧＨａ直列。
プライマーＤｉＧＨＥｃｏＦ１およびＤｉＧＨＨｉｎＲ１を用いて、ｐＴｒｃＨｉｓＧＨでＰＣＲ反応を行った（表１）。次いで、ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いでこれをｐＴｒｃＨｉｓχ１Ａ１［ＧＨ−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＨＲ（ｂ）］のＧＨＲ（ｂ）ドメインの場所に結合させた（図４）。得られるプラスミドを組換え欠損エシェリヒア・コリＳＵＲＥ中に形質転換し、そしてＬＢ（０．３％のグルコース、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン）寒天板上に蒔いた。

［配列決定の結果］
構築遺伝子を含むプラスミドを配列決定した。ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ、χ１Ａ７、χ１Ｂ２、およびχ１Ｃ３について配列決定された、遺伝子および領域の配列を、それぞれ図５〜図８に示す。

［発現研究］
単独のコロニーを使用して、エシェリヒア・コリＸＬ１ Ｂｌｕｅ細胞については３ｍＬのＬＢ（０．３％のグルコース、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン）ブロスで、そしてエシェリヒア・コリＳＵＲＥ細胞については３ｍｌのＬＢ（０．３％のグルコース、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン）ブロスで接種した。これらを３７℃で一晩、増殖、振盪させた。

次いで、適切な抗生物質を含む４ｍｌの４ＹＴ培地に、２００μｌの一晩ＬＢ培養物（the overnight LB culture）を接種した。これらを３時間増殖させ、次いで１ｍｌの試料を取った（Ｔ０試料）。

次いで４ＹＴ培養物に、ＩＰＴＧで１ｍＭの最終濃度まで誘導し、次いでさらに４時間、さらにインキュベートした（Ｔ４試料）。

Ｔ０およびＴ４試料を、それらを採取した直後に処理した。最初にそれらを遠心分離して、細胞をペレットにし、次いで、上清を廃棄してペレットをＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で処理した。タンパク質を、クーマシー染色によるか、または構築物を調査するために抗ＧＨ一次抗体を使用するウェスタンブロットによるかのいずれかで、これらのＰＡＧＥゲル上で可視化した。

全ての場合において、クーマシー染色したＰＡＧＥゲルは、構築物の過剰発現を示さなかった。しかしながら、構築物はウェスタンブロットで観測された（図９）。これらは、全ての場合において、適正な大きさのタンパク質が発現されることを示す。

［精製］
概して、４ＹＴ（適切な抗生物質を含む）で増殖し、ＩＰＴＧで１ｍＭの最終濃度まで４〜５時間誘導した４×２５０ｍｌ培養物から、タンパク質を精製した。細胞を遠心分離で集め、そしてリゾチームおよびデオキシコール酸ナトリウムで処理し続いて超音波処理により溶解させた。

溶解した細胞を遠心分離して細胞片を除去し、そして上清を、最初にインビトロゲンＰｒｏＢｏｎｄ Ｒｅｓｉｎ（Ｎｉ−カラム）を使用して精製した。タンパク質は、５ｍｌの０．５Ｍイミダゾールで溶出した。

Ｎｉ−カラムからの溶出物を適切な緩衝液で１０倍に希釈し、次いでＭｏｎｏＱイオン交換カラムに通すことにより、タンパク質試料をさらに精製した。タンパク質は、０．５ｍｌ／分の速度で、２０ｍｌにわたり０〜１ＭのＮａＣＩの塩勾配で溶出した；０．５ｍｌずつフラクションを回収した。次いで、フラクションを構築物の存在について分析し、そして構築物を含むフラクションをプールした。

精製したタンパク質を、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（クーマシー染色およびウェスタンブロット）で分析し（図１０）、そしてその濃度を測定するためにアッセイした。次いで、タンパク質をバイオアッセイにかけた。

χ１Ａ７およびχ１Ｂ２の場合、ウェスタンブロットにより開裂した生成物が示されたが、構築物をｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写のため迅速翻訳システム（ＲＴＳ）にかけた。以前の、χ１Ａ１およびχ１Ｂ１での研究は、プロテアーゼインヒビターおよび発現用シャペロンと合わせてＲＴＳシステムを使用して、開裂が大いに減少したことを示している。

［バイオアッセイ］
精製した構築物を、Ａｓｔｅｒｉｏｎ標準ＧＨバイオアッセイにかけた。調製した２９３Ｈｉ（これは成長ホルモン受容体を安定して発現する）を、ある用量範囲で構築物で刺激した。第二複製板も調製したが、ただし２５ｎｇ／ｍｌ ＧＨを、構築物の添加３０分後に添加して、構築物のアンタゴニスト能力を観測した。

全てのＧＨ．Ｇ１２０Ｒ構築物は、アンタゴニスト活性を有した（図１１）。

［アンタゴニスト活性のスクリーニング］
アンタゴニスト活性をスクリーニングするために、確立されたバイオアッセイを使用する（９）。全長ＧＨＲを発現する永久細胞株を、活性化Ｓｔａｔ５に結合するルシフェラーゼレポーターで一過的に形質移入する（９）。２４時間後、アンタゴニストとともに、またはアンタゴニストなしで、細胞をＧＨで６時間刺激する。次いで、細胞を溶解させてルシフェラーゼ活性を測定する（９）。

［ｉｎ ｖｉｖｏでの代謝クリアランス速度の検査］
スプロージ・ドーリー（Sprague-Dawley）種のラット（ＳＤラット）に麻酔をかけ、そして大腿および頚静脈にカニューレを埋め込む。２日後、ＧＨキメラまたは直列を静脈内または皮下注射で投与する。大腿カニューレを介して血液試料を回収し、そしてキメラおよび直列またはオリゴマータンパク質のレベルを放射免疫アッセイで測定する。利用可能なコンピュータープログラムを使用して、時間に対してホルモン濃度をフィッティングすることで薬物動態パラメーターを見積もる。

表１は、ＧＨの部位１になされたアミノ酸置換の要約を示す。部位２に対する修飾は、Ｇ１２０の、アルギニン、アラニン、リシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、またはグルタミン酸のいずれかでの置換を含む。

Claims (21)

1. キメラポリペプチドであって、
   ｉ）成長ホルモンの成長ホルモン受容体結合ドメインの修飾されたアミノ酸配列を有する第一の修飾ドメインであって、該修飾は少なくとも１個のアミノ酸残基の付加、欠失、または置換である第一の修飾ドメイン、および
   ｉｉ）成長ホルモンの成長ホルモン受容体結合ドメインの修飾されたアミノ酸配列を有する第二の修飾ドメインであって、該修飾は少なくとも１個のアミノ酸残基の付加、欠失、または置換である第二の修飾ドメイン、
   を含み、前記第一及び第二の修飾ドメインは直列に融合され、前記第一及び第二の修飾ドメインの少なくとも一方における修飾が部位２における修飾であり、当該ポリペプチドはアンタゴニストであることを特徴とするキメラポリペプチド。
2. 前記第一及び第二の修飾ドメインが、成長ホルモンの部位１においても修飾されている、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 前記第一及び第二の修飾ドメインの両方が、成長ホルモンの部位２において修飾されている、請求項１に記載のポリペプチド。
4. 前記修飾が、成長ホルモンの部位１および部位２両方に対するものである、請求項１に記載のポリペプチド。
5. 前記修飾が、配列番号：５の成長ホルモンアミノ酸配列に示される、１８位のヒスチジンのアラニンまたはアスパラギン酸での置換、および／または２１位のヒスチジンのアスパラギンでの置換、および／または２２位のグルタミンのアラニンでの置換、および／または２５位のフェニルアラニンのアラニンでの置換、および／または２６位のアスパラギン酸のアラニンでの置換、および／または２９位のグルタミンのアラニンでの置換、および／または１６７位のグルタミン酸のアラニンでの置換、および／または１７１位のアスパラギン酸のセリンでの置換、および／または１７２位のリシンのセリンまたはアラニンでの置換、および／または１７９位のイソロイシンのをチロシンでの置換、からなる群より選択される、請求項２または３に記載のポリペプチド。
6. 前記修飾が、配列番号：５の成長ホルモンアミノ酸配列に示される、１８位のヒスチジンのアスパラギン酸での置換、２１位のヒスチジンのアスパラギンでの置換、１６７位のアルギニンのアスパラギンでの置換、１７１位アスパラギン酸のアルギニンでの置換、１７４位のグルタミン酸のセリンでの置換、および１７９位のイソロイシンのスレオニンでの置換からなる、請求項５に記載のポリペプチド。
7. 前記修飾が、配列番号：５の成長ホルモンアミノ酸配列に示される、１８位のヒスチジンのアラニンでの置換、２２位グルタミンのアラニンでの置換、２５位のフェニルアラニンのアラニンでの置換、２６位のアスパラギン酸のアラニンでの置換、２９位のグルタミンのアラニンでの置換、６５位のグルタミン酸のアラニンでの置換、１６８位のリシンのアラニンでの置換、および１７４位のグルタミン酸のアラニンでの置換からなる、請求項５に記載のポリペプチド。
8. 前記部位２における修飾が、図１２に示されるアミノ酸配列における１２０位のグリシンに対する修飾である、請求項１に記載のポリペプチド。
9. 前記部位２における修飾が、グリシンの、アルギニン、アラニン、リシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、およびグルタミン酸からなる群より選択されるアミノ酸での置換である、請求項８に記載のポリペプチド。
10. 前記部位２における修飾が、１２０位のグリシンの、アルギニンまたはリシンまたはアラニンでの置換である、請求項９に記載のポリペプチド。
11. 前記第一の修飾ドメインが、リンカーにより前記第二の修飾ドメインに結合する、請求項１に記載のポリペプチド。
12. 前記リンカーが、５個〜３０個のアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項１１に記載のポリペプチド。
13. 前記リンカーが、１０個〜２０個のアミノ酸残基を含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
14. 前記リンカーが、ペプチドＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒのコピーを少なくとも１つ含む、請求項１２または１３に記載のポリペプチド。
15. 請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
16. 請求項１５に記載の核酸分子を含むベクター。
17. 医薬品としての、請求項１に記載のポリペプチドの使用。
18. 巨人症、末端肥大症、癌（例えば、ウィルムス腫瘍、骨原性肉腫、乳癌、大腸癌、前立腺癌、甲状腺癌）、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎障害、糖尿病性合併症からなる群より選択される状態を治療するための薬物の製造のための、請求項１に記載のポリペプチドの使用。
19. 前記状態が末端肥大症の治療である、請求項１８に記載の使用。
20. 請求項１に記載のポリペプチドを含む、医薬組成物。
21. 請求項１５に記載の核酸分子又は請求項１６に記載のベクターで形質転換された単離細菌細胞。