MXPA04005675A - Polipeptido modificado. - Google Patents
Polipeptido modificado.Info
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Abstract
La invencion se refiere a polipeptidos quimericos, en donde dichos polipeptidos comprende un dominio de union modificado de hormona de crecimiento enlazado a un dominio de union a receptor de receptor de hormona de crecimiento; y tandems/oligomeros de dichos dominios de union a hormona de crecimiento modificados.
Description
POLIPEPTIDO MODIFICADO
MEMORIA DESCRIPTIVA
La presente invención se refiere a polipéptidos quiméricos, en donde dichos polipéptidos comprenden un dominio de unión modificado de hormona de crecimiento enlazado a un dominio de unión a receptor de receptor de hormona de crecimiento; y tándems/oligómeros de dichos dominios de unión a hormona de crecimiento modificados. La GH es un miembro de una gran familia de hormonas que intervienen en la regulación del crecimiento y desarrollo de los mamíferos. La GH humana es un polipéptido de 22 kDa que interviene en muchos procesos biológicos, por ejemplo, crecimiento celular, lactancia, la activación de macrófagos y la regulación del metabolismo energético. La GH interactúa secuencialmente con dos moléculas de GHR unidas a la membrana, mediante dos sitios separados en la GH, referidos como sitio 1 y sitio 2. El sitio 1 es un sitio de unión de alta afinidad, y el sitio 2 es un sitio de baja afinidad. Una molécula de GH individual se une al GHR 1 mediante el sitio 1. Un segundo GHR es reclutado entonces mediante el sitio 2 para formar un complejo de GHR:GH:GHR. El complejo es incorporado entonces, y activa una cascada de transducción de señales que lleva a cambios en la expresión de los genes. El dominio extracelular del GHR existe como dos dominios enlazados, cada uno de aproximadamente 100 aminoácidos (SD-100), el dominio SD-100 C-terminal (b) estando más cerca de la superficie celular, y el dominio SD-100 N-terminal (a) estando más lejos. Es un cambio conformacional en estos dos dominios, que ocurre en la unión a la hormona con la formación del complejo trimérico GHR-GH-GHR. Moléculas de GH modificadas se describen en el documento
U.S. 5,849,535, el cual se incorpora en la presente como referencia. La modificación a la GH es en los sitios de unión 1 y 2. Las modificaciones al sitio 1 producen una molécula de GH que tiene una mayor afinidad por el GHR, en comparación con la GH de tipo silvestre. Estas moléculas de GH modificadas actúan como agonistas. Se describen también modificaciones del sitio 2 que dan como resultado la creación de antagonistas de GH. Otros ejemplos de modificaciones a la GH que alteran la afinidad de unión de la GH por el sitio 1 , se describen en los documentos US 5,854,026; US 6,004,931 ; US 6,022,71 1 ; US 6,057,292; y US 6,136,563, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia. Un resumen de las modificaciones hechas al sitio 1 , se provee en el cuadro 1. Se describen también modificaciones al sitio 2, en particular el residuo de aminoácido G120, que cuando es modificado a arginina, lisina, triptófano, tirosina, fenilalanina o ácido glutámico, crea una molécula de GH con propiedades antagonistas. Además, la GH modificada es recubierta en polietilenglicol (PEG) mediante un procedimiento conocido como "pegilación", el cual tiene varios efectos benéficos. En primer lugar, el recubrimiento con PEG aumenta el peso molecular efectivo de la GH, de 22 kD a aproximadamente 40 kD. El efecto que tiene esto, es disminuir la filtración glomerular de la GH, aumentando de esta manera la vida media de la GH in vivo, lo cual reduce la dosis administrada que produce el efecto deseado. Además, se piensa que la pegilación reduce la inmunogenicidad y la toxicidad de las proteínas que se tratan de esta manera; véase Abuchowski et al J Biol Chem., 252, 3578-3581 (1977). Sin embargo, una consecuencia de la pegilación, es reducir la afinidad de la molécula de GH modificada por el GHR. Esto significa que se requiere una dosis incrementada para contrarrestar la afinidad reducida. Esto es no deseable, puesto que contrarresta el efecto ventajoso de la pegilación con respecto a aumentar la vida media de la GH modificada. Sería deseable proveer una molécula de GH modificada que no requiera pegilación, pero que tenga una vida media incrementada, y tenga también los beneficios agregados de inmunogenicidad reducida y carezca de toxicidad. De conformidad con un primer aspecto de la invención, se provee un polipéptido quimérico que comprende: i) por lo menos un dominio de unión modificado de hormona de crecimiento, en donde dicha modificación es la adición, deleción o sustitución de por lo menos un residuo de aminoácido; y ¡i) un dominio de unión a hormona de crecimiento de un receptor de hormona de crecimiento. En una modalidad preferida de la invención, dicho polipéptido es modificado en el dominio de unión a sitio 1 de hormona de crecimiento.
En otra modalidad preferida de la invención, dicho polipéptido es modificado en el dominio de unión a sitio 2 de hormona de crecimiento. En otra modalidad preferida de la invención, dicho polipéptido es modificado en los sitios 1 y 2 de hormona de crecimiento. Como se describió anteriormente, se conocen en la técnica mutaciones del sitio 1 que aumentan la afinidad de la hormona del crecimiento por su dominio de unión sobre el receptor de hormona de crecimiento. Dicha hormona de crecimiento modificada actúa como un agonista. Si una modificación del sitio 1 se combina con una modificación del sitio 2, en donde la última modificación produce un sitio de unión al sitio 2 inactivo o parcialmente activo, entonces dicha molécula es un antagonista. Una modificación sólo al sitio 2 que explote un sitio de unión al sitio 1 de tipo silvestre, crea también un antagonista. En otra modalidad preferida de la invención, se provee un polipéptido que comprende un dominio de unión al sitio 1 que ha sido modificado por sustitución de aminoácidos, en donde dicha modificación se selecciona del grupo que consiste de: histidina 18 con alanina o ácido aspártico; y/o histidina 21 con asparagina; y/o glutamina 22 con alanina; y/o fenilalanina 25 con alanina; y/o ácido aspártico 26 con alanina; y/o glutamina 29 con alanina; y/o ácido glutámico 167 con alanina; y/o ácido aspártico 171 con serina; y/o lisina 172 con serina o alanina; y/o isoleucina 179 con tirosina; de la secuencia representada en la figura 13. De preferencia, dicha modificación que aumenta la afinidad del sitio 1 por su dominio de unión en el GHR, consiste de las sustituciones de aminoácido: histidina 18 ácido aspártico; histidina 21 asparagina; arginina 167 asparagina; ácido aspártico 171 arginina; ácido glutámico 174 serina; e isoleucina 179 treonina; representadas por la secuencia de aminoácidos de la GH en la figura 13. En otra modalidad preferida de la invención, dicha modificación que aumenta la afinidad del sitio 1 por su dominio de unión en el GHR, consiste de las sustituciones de aminoácido: histidina 18 alanina; glutamina 22 alanina; fenilalanina 25 alanina; ácido aspártico 26 alanina; glutamina 29 alanina; ácido glutámico 65 alanina; Usina 168 alanina; y ácido glutámico 174 alanina; representadas por la secuencia de aminoácidos de la GH en la figura 13. En otra modalidad preferida de la invención, dicha modificación al sitio 2, es al residuo de aminoácido 120 de la secuencia representada en la figura 13. De preferencia, dicha modificación al sitio 2 se combina con modificaciones al sitio 1 como se describe en la presente. En forma alternativa, la GH es modificada sólo en el residuo de aminoácido glicina 120. En una modalidad preferida de la invención, dicha modificación al sitio 2 es una sustitución de glicina por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de: arginina; alanina; lisina; triptófano; tirosina; fenilalanina; ácido aspártico; y ácido glutámico. De preferencia, dicha sustitución es glicina 120 por arginina o lisina o alanina. En otra modalidad preferida de la invención, el dominio de unión a hormona de crecimiento del GHR es el dominio extracelular del GHR. Más preferiblemente, el dominio de unión es el dominio SD-100 C-terminal de la GH. En forma alternativa, dicho dominio de unión es el GHR de longitud completa. En otra modalidad preferida de la invención, dicho polipéptido quimérico es una proteína de fusión, en donde la GH modificada es una fusión de traducción en el marco de lectura con el GHR, o parte de la misma. De preferencia, dicho polipéptido de fusión comprende GH modificada y el dominio SD-100 C-terminal del GHR. En otra modalidad preferida alternativa de la invención, el dominio de unión modificado de GH es enlazado por un enlazador al dominio de unión a GH del GHR. El enlazador puede ser flexible. El enlazador podría ser cualquier residuo dentro del dominio extracelular del receptor que permita que la GH modificada se una flexiblemente con el receptor libre en la superficie de la célula. De preferencia, el enlace se hace entre un residuo cerca del extremo carboxilo de la molécula de GH modificada, y un residuo cerca del extremo amino del GHR. Más preferiblemente, el enlace se hace entre un residuo cerca del extremo carboxilo de la molécula de GH modificada y un residuo cerca del N-terminal del N-terminal del SD-100 C-termihal. Más preferiblemente, el enlace se hace en cualquiera de los residuos 126-128 del extremo amino del SD-100 C-terminal del GHR. En una modalidad de la invención, el enlace se hace en el
de ácido nucleico en la figura 13; y ii) una molécula de ácido nucleico que híbrida con la secuencia de ácido nucleico en (i). Las moléculas de ácido nucleico que codifican para una hormona de crecimiento modificada de conformidad ' con la invención, pueden sintetizarse típicamente mediante técnicas moleculares conocidas en la técnica, e incluyen métodos recombinantes, así como la síntesis de moléculas de ácido nucleico usando sintetizadores de oligonucleótidos. En una modalidad preferida de la invención, dicha molécula de ácido nucleico híbrida bajo hibridación severa. El término "condiciones de hibridación severas", como se usa en la presente, se refiere a parámetros con los cuales la técnica es familiar. Los parámetros de hibridación de ácido nucleico pueden encontrarse en referencias que compilan dichos métodos, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds. segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, o Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. New York. Más específicamente, las condiciones severas, como se usan en la presente se refieren, por ejemplo, a hibridación a 65°C en regulador de pH de hibridación (3.5 x SSC, Ficoll a 0.02%, polivinilpirrolidona a 0.02%, albúmina de suero de bovino a 0.02%, NaH2P04 a 2.5 mM (pH 7), SDS a
0.5%, EDTA a 2 mM). SSC es cloruro de sodio a 0.15 M/citrato de sodio a 0.015 M, pH 7; SDS es dodecil sulfato de sodio; y EDTA es ácido etilendiaminotetraacético. Después de la hibridación, la membrana sobre la cual el ADN es transferido, se lava a 2 x SSC a temperatura ambiente, y
entonces a 0.1-0.5 x SSC/0.1 x SOS a temperaturas de hasta 68°C.
De conformidad con otro aspecto de la invención, se provee un
vector que comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la invención.
En una modalidad preferida de la invención, dicho vector es un vector de expresión adaptado para expresión de genes recombinantes. Típicamente, dicha adaptación incluye, por ejemplo y no a manera de limitación, la provisión de secuencias de control de la transcripción (secuencias de promotor) que median la expresión específica de células/tejidos. Estas secuencias de promotor pueden ser específicas de células/tejidos, inducibles o constitutivas. Promotor es un término reconocido en la técnica y, por razones de claridad, incluye las siguientes características que se proveen sólo a manera de ejemplo, y no a manera de limitación. Los elementos intensificadores son secuencias de ácido nucleico que actúan en la posición c/'s, encontrados con frecuencia 5' hacia el sitio de inicio de la transcripción de un gen (los intensificadores pueden encoritrarse también 3' hacia una secuencia de genes, o localizarse incluso en secuencias intrónicas, y son por i lo tanto independientes de la posición). Los intensificadores funcionan para
aumentar la velocidad de transcripción del gen al cual el intensificador es enlazado. La actividad del intensificador es sensible al factor de transcripción que actúa al nivel de la posición trans, que se ha mostrado se une específicamente a elementos intensificadores. La unión/actividad de los factores de transcripción (favor de ver Eukaryotic Transcription Factors, por David S Latchman, Academic Press Ltd, San Diego), es sensible a muchas señales ambientales que incluyen, a manera de ejemplo y no de limitación, metabolitos intermediarios y/o efectores ambientales. Los elementos promotores incluyen también la denominada caja TATA, y secuencias de selección de inicio de ARN polimerasa (RIS), que funcionan para seleccionar un sitio de inicio de la transcripción. Estas secuencias se unen también a polipéptidos que funcionan, entre otras cosas, para facilitar la selección del inicio de la transcripción por la ARN polimerasa. Las adaptaciones incluyen también la provisión de marcadores seleccionares y secuencias de replicación autónoma que facilitan el mantenimiento de dicho vector en la célula eucariótica o el hospedero procariótico. Los vectores que se mantienen en forma autónoma son referidos como vectores episómicos. Los vectores episómicos son deseables, puesto que estas moléculas pueden incorporar grandes fragmentos de ADN (ADN de 30-50 kb). Vectores episómicos de este tipo se describen en el documento WO98/07876, el cual se incorpora en la presente como referencia. Las adaptaciones que facilitan la expresión de genes codificados por vectores, incluyen la provisión de secuencias de poliadenilación/término de la transcripción. Esto incluye también la provisión de sitios internos de entrada de ribosomas (IRES) que funcionan para aumentar al máximo la expresión de genes codificados por vectores dispuestos en cassettes de expresión bicistrónicos o multicistrónicos. Estas adaptaciones son bien conocidas en la técnica. Existe una cantidad significativa de literatura publicada con respecto a la construcción de vectores de expresión y técnicas de ADN recombinante en general. Favor de ver Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY, y referencias citadas en la misma; Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol. III IRL Press, Oxford, Reino Unido; DNA Cloning: F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994). De conformidad con otro aspecto de la invención, se provee el uso del polipéptido de conformidad con la invención como un agente farmacéutico. En una modalidad preferida de la invención, dicho polipéptido es para su uso en la producción de un medicamento para el tratamiento de una condición seleccionada del grupo que consiste de: gigantismo; acromegalia; cáncer (por ejemplo, tumor de Wilm, sarcoma osteogénico, y cáncer de mama, colon, próstata y tiroides); retinopatía diabética; nefropatía diabética; y otras complicaciones de la diabetes y exceso de GH. Los polipéptidos y composiciones de la invención pueden administrarse mediante cualquier vía convencional, incluyendo inyección, o mediante infusión gradual con el tiempo. La administración puede ser, por ejemplo, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavitaria, infraocular, subcutánea o transdérmica. Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse en forma conveniente en forma de dosificación unitaria, y pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Cuando se administran, las preparaciones farmacéuticas de la invención se aplican en cantidades farmacéuticamente aceptables y en composiciones farmacéuticamente aceptables. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica de los ingredientes activos. Dichas preparaciones pueden contener habitualmente sales, agentes reguladores de pH, conservadores, vehículos compatibles, y opcionalmente otros agentes terapéuticos. Las composiciones pueden combinarse, si se desea, con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa uno o más llenadores líquidos o sólidos compatibles, diluyentes o sustancias de encapsulación que son adecuados para administración en un humano. El término "vehículo" denota un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el cual el ingrediente activo se combina para facilitar la aplicación. Las composiciones farmacéuticas pueden contener agentes reguladores de pH adecuados, incluyendo: ácido acético en una sal; ácido cítrico en una sal; ácido bórico en una sal; y ácido fosfórico en una sal. Las composiciones farmacéuticas pueden contener también, opcionalmente, conservadores adecuados, tales como: cloruro de benzalconio; clorobutanol; parabenos y timerosal.
De conformidad con otro aspecto de la invención, se provee una célula transformada o transfectada con el ácido nucleico o vector de conformidad con la invención. En una modalidad preferida de la invención, dicha célula es una célula eucariótica. De preferencia, dicha célula se selecciona del grupo que consiste de: un moho mucilaginoso (por ejemplo, Dictyostelium spp); una célula de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae; Pichia spp); una célula de mamífero (por ejemplo, ovario de hámster chino); una célula vegetal; o una célula de insecto (por ejemplo, Spodoptera spp). En una modalidad preferida alternativa, dicha célula es una célula procariótica, de preferencia Escheríchia coli o Bacillus spp. De conformidad con otro aspecto de la invención, se provee un método para sintetizar el polipéptido de conformidad con la invención, el cual comprende: i) proveer una célula de conformidad con la invención; ii) incubar dicha célula bajo condiciones que lleven a la producción del polipéptido de conformidad con la invención; y opcionalmente iii) aislar el polipéptido de la célula o el medio de cultivo de células. En un método preferido de la invención, dicho polipéptido se provee con una señal de secreción para facilitar la purificación del polipéptido de dicha célula. Más preferiblemente aún, dicho polipéptido se provee con una marca de afinidad para facilitar la purificación del polipéptido de dicha célula o el medio de cultivo de células. De conformidad con otro aspecto de la invención, se provee un método para el tratamiento de un mamífero, de preferencia un humano, el cual comprende administrar a dicho mamífero el polipéptido de conformidad con la invención. De conformidad con otro aspecto de la invención, se provee un polipéptido quimérico que comprende más de dos dominios de unión a hormona de crecimiento modificados, en donde dicha modificación es la adición, deleción o sustitución de por lo menos un residuo de aminoácido. En una modalidad preferida de la invención, se provee un polipéptido quimérico que comprende una pluralidad de dominios de unión a hormona de crecimiento modificados. En otra modalidad preferida de la invención, se provee un polipéptido quimérico que comprende por lo menos dos dominios de unión a hormona de crecimiento del sitio 2 modificados. En otra modalidad preferida de la invención, se provee un polipéptido quimérico que comprende 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dominios de unión a hormona de crecimiento del sitio 2 modificados. En otra modalidad preferida de la invención, dicho polipéptido quimérico comprende más de dos dominios de unión a hormona de crecimiento modificados enlazados por una molécula enlazadora. De preferencia, dicha molécula enlazadora es como se describió anteriormente en la presente.
De conformidad con otro aspecto de la invención, dicho polipéptido quimérico comprende más de dos dominios de unión a hormona de crecimiento modificados que comprenden además por lo menos un dominio de unión a hormona de crecimiento de un receptor de hormona de crecimiento. De preferencia, dicho polipéptido quimérico consiste de dos dominios de unión a hormona de crecimiento modificados y un dominio de unión a hormona de crecimiento de un receptor de hormona de crecimiento. De preferencia, dicho polipéptido quimérico consiste de por lo menos dos dominios de unión a hormona de crecimiento del sitio 2 modificados. Los aspectos y modalidades que se refieren a un polipéptido quimérico que comprende un dominio de unión a hormona de crecimiento enlazado a un dominio de unión a receptor, son aplicables a polipéptidos quiméricos que comprenden más de un dominio de unión a hormona de crecimiento, o una pluralidad de los mismos. Por ejemplo, vectores que comprenden ácidos nucleicos que codifican para dichos polipéptidos quiméricos, composiciones farmacéuticas que comprenden dichos polipéptidos, líneas de células que expresan dichos polipéptidos quiméricos, métodos para sintetizar dichos polipéptidos, y métodos de tratamiento que usan dichos polipéptidos, están dentro del alcance de la invención con respecto a esta especie de polipéptido quimérico. Se describirá ahora una modalidad de la invención sólo a manera de ejemplo, y con relación al cuadro y las figuras a continuación: El cuadro 1 representa un resumen de las sustituciones de aminoácidos al sitio 1 y el sitio 2 de la GH humana; La figura 1 es el mapa de plásmido de pHEAT.GH.G120R, que se generó ligando el gen de GH.G120R, sintetizado mediante PCR, entre los sitios de restricción BamH\ y A/orl. El marcador selectivo en el plásmido es
AmpR. La figura 2 es el mapa de plásmido de pTrcHis-TOP0.1A7, que se generó ligando el gen de GH.G120R entre los sitios BamH\ y A/orl en pTrcHis 1 A1 . El enlazador es (G4S)4, y el marcador selectivo en el plásmido es AmpR. La figura 3 es el mapa de plásmido de pTrcHis-TOPO. 1 B2, que se generó ligando el gen de GH.G120R entre los sitios BamH\ y Notí en pTrcHis 1 B1 . El enlazador es (G4S)4, y el marcador selectivo en el plásmido es AmpR. La figura 4 es el mapa de plásmido de pTrcHis-TOPO. 1 C3, que se generó ligando el gen de GH.G120R entre los sitios EcoRI y Hind\\ \ en pTrcHis A7. El enlazador es (G4S) , y el marcador selectivo en el plásmido es AmpR. La figura 5 es la secuencia del gen de GH.G120R, que muestra el codón de inicio, marca 6xHis, sitios de restricción relevantes, codones de detención y la mutación G120R (CGC). El componente de GH.G120R real se muestra en mayúsculas, y las regiones secuenciadas se muestran en negritas. La figura 6 es la secuencia del gen 1A7, que muestra el codón de inicio, marca 6xHis, sitios de restricción relevantes, codones de detención y la mutación G120R (CGC). El componente de GH.G120R-(G4S)4-GHR(b) real se muestra en mayúsculas, y las regiones secuenciadas se muestran en negritas. La figura 7 es la secuencia del gen 1 B2, que muestra el codón de inicio, marca 6xHis, sitios de restricción relevantes, codones de detención y la mutación G120R (CGC). El componente de GH.G120R-(G4S)4-GHR(flec) real se muestra en mayúsculas, y las regiones secuenciadas se muestran en negritas. La figura 8 es la secuencia del gen 1C3, que muestra el codón de inicio, marca 6xHis, sitios de restricción relevantes, codones de detención y la mutación G120R (CGC). El componente de GH.G120R-(G4S)4-GH.G120R real se muestra en mayúsculas, y las regiones secuenciadas se muestran en negritas. La figura 9 se refiere a Western blots que usan GH anti-humana como el anticuerpo primario de geles de SDS PAGE a 15% para estudios de expresión de GH.G120R, 1A7, 1 B2 y C3. La expresión fue a partir del vector pTrcHis en células XL1 Blue de E. coli o células SURE de E. coli, y estas muestras se tomaron cuatro horas después de la inducción con IPTG a 1 mM (concentración final). Las transferencias muestran que GH.G120R y 1C3 producen bandas individuales, mientras que las muestras de 1A7 y 1 B2 contienen productos de desdoblamiento. La figura 10 se refiere a geles de SDS PAGE a 5% teñidos con azul de Coomassie [C] de GH.G120R, 1A7 y 1 C3 purificados. Se muestran también Western blots [W] de estas muestras usando GH anti-humana como el anticuerpo primario. Los geles teñidos con azul de Coomassie muestran que las muestras de proteína purificadas son más de 95% puras; sin embargo, los Western blots muestran que sólo GH.G120R y 1 C3 producen bandas individuales, mientras que la muestra de 1A7 contiene productos de desdoblamiento. Las figuras 1 1A-1 1 C se refieren a gráficas que muestran los resultados del bioensayo de GH para GH.G120R, 1A7 y 1 C3. Cada gráfica muestra una curva normal, la prueba con la construcción sola a diferentes concentraciones, y la prueba con la construcción a diferentes concentraciones con 25 ng/ml de hGH. Estas muestran que ninguna de las proteínas tiene actividad agonística inherente, pero todas tienen actividad antagonística, siendo GH.120R la más activa, y 1A7 la menos activa. La figura 12 es la secuencia de aminoácidos de la GH no modificada. La figura 13 es la secuencia de ácido nucleico de la GH no modificada.
Materiales y métodos Los métodos para generar GH modificada en el sitio 1 y/o el sitio 2, se describen en los documentos US 5,849,535; US 5,854,026; US 6,004,931 ; US 6,022,71 1 ; US 6,057,292; y US 6,136,563, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia.
Construcciones de ADN
Generación de antagonistas de GH (GHa) mutados en el sitio 2 El ADNc para la GH humana (figura 1 ) ha sido amplificado mediante PCR a partir de tejido de pituitaria humana, y clonado en el vector pTrcHis-Topo (pTrcHis-TOPO-GHstop). Se amplificó el dominio extracelular del GHR a partir de ADNc de hígado humano usando PCR.
Construcciones de antagonistas de la hormona de crecimiento
(G120R)
Mutación G120R de la hormona de crecimiento El gen de la hormona de crecimiento (GH) fue mutado usando el método de mutación de ssADN de fagémidos. El gen de la GH fue subclonado primero a partir de pTrcHisGH en pT7T318 entre los sitios SamHI y HindWl, para producir pT7T318-GH. Este plásmido fue transformado entonces en células CJ236 de E. coli, y se produjo ADN de cadena sencilla (ssADN).
El pT7T318-GH de ssADN fue mutado entonces cambiando el codón por Gly120 de GGC a CGC, y se usó el iniciador GH.(G120R)For (cuadro 1 ). El pT7T318-GH.G120R de ADN de doble cadena (dsADN) producido después del procedimiento de mutación, se usó entonces para subclonar el GH.G120R en un vector pHEAT, y esto dio pHEAT.GH.G120R (figura 1 ).
Generación de construcciones de GH.G120R
?1?7 fGH.GH120R-(G4S)4-GHR(bn=GHa enlazado al dominio b del GHR Se separó el gen de GH.G120R de pHEAT.GH.G120R (figura 1 ), usando los sitios de restricción SamHI y ?/ofl. El gen fue ligado entonces en lugar del gen de GH en ??????e???? [GH-(G4S)4-GHR (b)] (figura 2). El plásmido resultante fue transformado en células XL1 Blue de Escherichia coli, y depositado sobre placas de agar de LB (glucosa a 0.3%, 50 µg/ml de ampicilina y 12.5 g/ml de tetraciclina).
y1 B2 fGH.GH120R-(G4S) -GHRflec1=GHa enlazado al dominio extracelular de longitud completa del GHR Se repitió la estrategia usada para generar el gen de ?1?7; sin embargo, el vector receptor fue pTrcHisx1 B1 [GH-(G4S)4-GHRflec] (figura 3).
El plásmido resultante fue transformado en células XL1 Blue de E. coli, y depositado sobre placas de agar de LB (glucosa a 0.3%, 50 µg/m\ de ampicilina y 2.5 µg/ml de tetraciclina).
Y 1 C3 rGH.GH120R-(G4S)4-GH.G120R1=GHa en tándem Se llevó a cabo una reacción de PCR en pTrcHisGH usando los iniciadores DiGHEcoFI y DiGHHinRI (cuadro 1 ). El producto de PCR fue digerido entonces con EcoRI y Hind\\\ , y fue ligado entonces en lugar del dominio de GHR(b) en pTrcHisX1 A1 [GH-(G4S)4-GHR (b)] (figura 4). El plásmido resultante fue transformado en las células SURE de E. coli deficientes recombinantes, y depositado sobre placas de agar de LB (glucosa a 0.3%, 50 ng/ml de ampicilina, 12.5 µg/ml de tetraciclina y 50 µg/ml de kanamicina).
Resultados de la secuenciación Se secuenciaron plásmidos que contenían a los genes de construcción. Las secuencias de los genes y las regiones secuenciadas para GH.G120R, ?1?7, ?1 ?2 y ?103, se muestran en las figuras 5 a 8, respectivamente.
Estudios de expresión Se usaron colonias individuales para inocular 3 mi de caldo de LB (glucosa a 0.3%, 50 µg/ml de ampicilina y 12.5 µg/ml de tetraciclina) para células XL1 Blue de E. coli, y caldo de LB (glucosa a 0.3%, 50 µg/ml de ampicilina, 12.5 ng/ml de tetraciclina y 50 µ?/??? de kanamicina) para células SURE de E. coli. Estas se desarrollaron, con agitación, durante la noche a 37°C. Se inocularon entonces 4 mi de medio 4YT que contenía los antibióticos adecuados, con 200 µ? del cultivo de LB de la noche anterior. Estos se desarrollaron durante 3 horas, y se tomaron entonces muestras de 1 mi (muestras de T0). Los cultivos de 4YT fueron inducidos entonces con IPTG hasta una concentración final de 1 m , e incubados entonces durante otras 4 horas (muestras de T4). Las muestras de T0 y T4 se procesaron de inmediato después de que fueron tomadas. Se centrifugaron primero para transformar las células a pellas, se desechó entonces el sobrenadante, y las pellas procesadas se hicieron correr sobre un gel de SDS. Se visualizó la proteína sobre estos geles de PAGE mediante tinción con azul de Coomassie, o mediante Western blot, usando un anticuerpo primario anti-GH para sondear la construcción. En todos los casos, los geles de PAGE teñidos con azul de Coomassie no muestran sobreexpresión de la construcción. Sin embargo, las construcciones se observan en los Western blots (figura 9). Estos muestran que en todos los casos, se expresa la proteína del tamaño correcto.
Purificación En general, se purificó la proteína a partir de cultivos de 4 x 250 mi desarrollados en 4YT que contenía los antibióticos adecuados, y se indujo durante 4 a 5 horas con IPTG hasta una concentración final de 1 mM. Las células se cosecharon mediante centrifugación, y fueron lisadas mediante tratamiento con lisozima y desoxicolato de sodio, seguido de sonicación. Las células lisadas se centrifugaron para remover los restos de células, y el sobrenadante se purificó inicialmente usando resina ProBond de Invitrogen (columna de Ni). La proteína se eluyó usando 5 mi de imidazol a 0.5 M. La muestra de proteína se purificó adicionalmente diluyendo 10 veces el eluyente a partir de la columna de Ni, en un regulador de pH adecuado, y haciéndola pasar entonces a través de una columna de intercambio iónico MonoQ. La proteína se eluyó usando un gradiente de sales de NaCI a 0-1 M sobre 20 mi a una velocidad de 0.5 ml/min; se recogieron fracciones de 0.5 mi. Las fracciones se analizaron entonces para la presencia de la construcción, y se agruparon las fracciones que contenían la construcción. La proteína purificada se analizó mediante SDS PAGE (tinción con azul de Coomassie y Western blot) (figura 10), y se puso a prueba para medir su concentración. Se expuso entonces la proteína para el bioensayo. En los casos de ?1?7 y ?1 ?2, que mostraron productos desdoblados mediante Western blot, las construcciones se sometieron al sistema de traducción rápida (RTS) para transcripción in vitro. Estudios previos en ?1 ?1 y ?1 ?1 , han mostrado que el desdoblamiento fue reducido ampliamente usando el sistema de RTS en conjunto con inhibidores de proteasa y chaperones para expresión.
Bioensayo Se sometieron las construcciones purificadas al bioensayo de GH patrón de Asterion. Se estimuló a células 293 Hi preparadas, que expresan establemente al receptor de la hormona del crecimiento, con la construcción usando una gama de dosis. Se preparó también una segunda placa duplicada, pero se añadieron 25 ng/ml de GH 30 minutos después de añadir la construcción para observar la capacidad antagonística de la construcción. Todas las construcciones de GH.G120R mostraron actividades antagonísticas (figura 1 1 ).
Selección de la actividad antagonista Se usa un bioensayo establecido para seleccionar la actividad antagonista (9). Una línea de células permanentes que expresas el GHR de longitud completa, es transfectada transitoriamente con un reportero de luciferasa que se une a Stat5 activado (9). Veinticuatro horas después, las células se estimulan con GH durante 6 horas, con o sin antagonista. Las células son lisadas entonces, y se mide la actividad de luciferasa (9).
Prueba de velocidad de depuración metabólica in vivo
Se anestesia a ratas Sprague-Dawley, y se implantan cánulas en
las venas femoral y yugular. Dos días después, se administra tándem o
quimera de GH mediante inyección intravenosa o subcutánea. Se toman muestras de sangre mediante la cánula femoral, y se miden los niveles de
proteínas de quimera y tándem u oligómero mediante radioinmunoensayo. Se
calculan los parámetros farmacocinéticos usando programas de cómputo disponibles, ajustando la concentración de la hormona contra el tiempo. El cuadro 1 da un resumen de las sustituciones de aminoácidos hechas al sitio 1 de la GH. Las modificaciones al sitio 2 incluyen la sustitución
de G120 por cualquiera de arginina; alanina; lisina; triptófano; tirosina; fenilalanina; o ácido glutámico.
CUADRO 1
H18 H21 Q22 F25 D26 Q29 E65 R167 K168 D171 D172 E174 1179
D N N A S R S T
A A A A A A A A
A A A A A A A
D A A A A A A S
A A A A A A A S
D A A A A A A A
A A A A A A A A
D N N A S R S T
A A A A A A A A LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Asterion Limited <120> Polipéptido Modificado <130> P101432WO <140> PCT/GB02/05523 <141> 2002-12-06 <150> 0130052.4 <151> 2001-10-14 <160> 6 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 693 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 atggggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcatgactgg tggacagcaa 60 atgggtcggg atctgtacga cgatgacgat aaggatccaa cccttttccc aaccattccc 120 ttatccaggc tttttgacaa cgctagtctc cgcgcccatc gtctgcacca gctggccttt 180 gacacctacc aggagtttga agaagcctat atcccaaagg aacagaagta ttcattcctg 240 cagaaccccc agacctccct ctgtttctca gagtctattc cgacaccctc caacagggag 300 gaaacacaac agaaatccaa cctagagctg ctccgcatct ccctgctgct catccagtcg 360 tggctggagc ccgtgcagtt cctcaggagt gtcttcgcca acagcctggt gtacggcgcc 420 tctgacagca acgtctatga cctcctaaag gacctagagg aacgcatcca aacgctgatg 480 gggaggctgg aagatggcag cccccggact gggcagatct tcaagcagac ctacagcaag 540 ttcgacacaa actcacacaa cgatgacgca ctactcaaga actacgggct gctctactgc 600 ttcaggaagg acatggacaa ggtcgagaca ttcctgcgca tcgtgcagtg ccgctctgtg 660 gagggcagct gtggcttcgg cggccgctga taa 693
<210 2 <211> 1125 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2 atggggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcatgactgg tggacagcaa 60 atgggtcggg atctgtacga cgatgacgat aaggatccaa cccttttccc aaccattccc 120 ttatccaggc tttttgacaa cgctagtctc cgcgcccatc gtctgcacca gctggccttt 180 gacacctacc aggagtttga agaagcctat atcccaaagg aacagaagta ttcattcctg 240 cagaaccccc agacctccct ctgtttctca gagtctattc cgacaccctc caacagggag 300 gaaacacaac agaaatccaa cctagagctg ctccgcatct ccctgctgct catccagtcg 360 tggctggagc ccgtgcagtt cctcaggagt gtcttcgcca acagcctggt gtacggcgcc 420 tctgacagca acgtctatga cctcctaaag gacctagagg aacgcatcca aacgctgatg 480 gggaggctgg aagatggcag cccccggact gggcagatct tcaagcagac ctacagcaag 540 ttcgacacaa actcacacaa cgatgacgca ctactcaaga actacgggct gctctactgc 600 ttcaggaagg acatggacaa ggtcgagaca ttcctgcgca tcgtgcagtg ccgctctgtg 660 gagggcagct gtggcttcgg cggccgcggt ggcggaggta gtggtggcgg aggtagcggt 720 ggcggaggtt ctggtggcgg aggttccgaa ttcgaaatag tgcaaccaga tccacccatt 780 gccctcaact ggactttact gaacgtcagt ttaactggga ttcatgcaga tatccaagtg 840 agatgggaag caccacgcaa tgcagatatt cagaaaggat ggatggttct ggagtatgaa 900 cttcaataca aagaagtaaa tgaaactaaa tggaaaatga tggaccctat attgacaaca 960 tcagttccag tgtactcatt gaaagtggat aaggaatatg aagtgcgtgt gagatccaaa 1020 caacgaaact ctggaaatta tggcgagttc agtgaggtgc tctatgtaac acttcctcag 1080 atgagccaat ttacatgtga agaagatttc tactgataaa agctt 1125
<210> 3 <211> 1503 <212> A N <213> Homo sapiens <400> 3 atggggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcatgactgg tggacagcaa 60 atgggtcggg atctgtacga cgatgacgat aaggatccaa cccttttccc aaccattccc 120 ttatccaggc tttttgacaa cgctagtctc cgcgcccatc gtctgcacca gctggccttt 180 gacacctacc aggagtttga agaagcctat atcccaaagg aacagaagta ttcattcctg 240 cagaaccccc agacctccct ctgtttctca gagtctattc cgacaccctc caacagggag 300 gaaacacaac agaaatccaa cctagagctg ctccgcatct ccctgctgct catccagtcg 360 tggctggagc ccgtgcagtt cctcaggagt gtcttcgcca acagcctggt gtacggcgcc 420 tctgacagca acgtctatga cctcctaaag gacctagagg aacgcatcca aacgctgatg 480 gggaggctgg aagatggcag cccccggact gggcagatct tcaagcagac ctacagcaag 540 ttcgacacaa actcacacaa cgatgacgca ctactcaaga actacgggct gctctactgc 600 ttcaggaagg acatggacaa ggtcgagaca ttcctgcgca tcgtgcagtg ccgctctgtg 660 gagggcagct gtggcttcgg cggccgcggt ggcggaggta gtggtggcgg aggtagcggt 720 ggcggaggtt ctggtggcgg aggttccgaa ttcttttctg gaagtgaggc cacagcagct 780 atccttagca gagcaccctg gagtctgcaa agtgttaatc caggcctaaa gacaaattct 840 tctaaggagc ctaaattcac caagtgccgt tcacctgagc gagagacttt ttcatgccac 900 tggacagatg aggttcatca tggtacaaag aacctaggac ccatacagct gttctatacc 960 agaaggaaca ctcaagaatg gactcaagaa tggaaagaat gccctgatta tgtttctgct 1020 ggggaaaaca gctgttactt taattcatcg tttacctcca tctggatacc ttattgtatc 1080 aagctaacta gcaatggtgg tacagtggat gaaaagtgtt tctctgttga tgaaatagtg 1140 caaccagatc cacccattgc cctcaactgg actttactga acgtcagttt aactgggatt 1200 catgcagata tccaagtgag atgggaagca ccacgcaatg cagatattca gaaaggatgg 1260 atggttctgg agtatgaact tcaatacaaa gaagtaaatg aaactaaatg gaaaatgatg 1320 gaccctatat tgacaacatc agttccagtg tactcattga aagtggataa ggaatatgaa 1380 gtgcgtgtga gatccaaaca acgaaactct ggaaattatg gcgagttcag tgaggtgctc 1440 tatgtaacac ttcctcagat gagccaattt acatgtgaag aagatttcta ctgataaaag 1500 ctt 1503
<210> 4 <211> 1379 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 4 atggggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcatgactgg tggacagcaa 60 atgggtcggg atctgtacga cgatgacgat aaggatccaa cccttttccc aaccattccc 120 ttatccaggc tttttgacaa cgctagtctc cgcgcccatc gtctgcacca gctggccttt 180 gacacctacc aggagtttga agaagcctat atcccaaagg aacagaagta ttcattcctg 240 cagaaccccc agacctccct ctgtttctca gagtctattc cgacaccctc caacagggag 300 gaaacacaac agaaatccaa cctagagctg ctccgcatct ccctgctgct catccagtcg 360 tggctggagc ccgtgcagtt cctcaggagt gtcttcgcca acagcctggt gtacggcgcc 420 tctgacagca acgtctatga cctcctaaag gacctagagg aacgcatcca aacgctgatg 480 gggaggctgg aagatggcag cccccggact gggcagatct tcaagcagac ctacagcaag 540 ttcgacacaa actcacacaa cgatgacgca ctactcaaga actacgggct gctctactgc 600 ttcaggaagg acatggacaa ggtcgagaca ttcctgcgca tcgtgcagtg ccgctctgtg 660 gagggcagct gtggcttcgg cggccgcggt ggcggaggta gtggtggcgg aggtagcggt 720 ggcggaggtt ctggtggcgg aggttccgaa ttctttcccg aagtgaggcc acagcagcta 780 tccttagcag agcaccctga accattccct tatccaggct ttttgacaac gctagtctcc 840 gcgcccatcg tctgcaccag ctggcctttg acacctacca ggagtttgaa gaagcctata 900 tcccaaagga acagaagtat tcattcctgc agaaccccca gacctccctc tgtttctcag 960 agtctattcc gacaccctcc aacagggagg aaacacaaca gaaatccaac ctagagctgc 1020 tccgcatctc cctgctgctc atccagtcgt ggctggagcc cgtgcagttc ctcaggagtg 1080 tcttcgccaa cagcctggtg tacggcgcct ctgacagcaa cgtctatgac ctcctaaagg 1140 acctagagga acgcatccaa acgctgatgg ggaggctgga agatggcagc ccccggactg 1200 ggcagatctt caagcagacc tacagcaagt tcgacacaaa ctcacacaac gatgacgcac 1260 tactcaagaa ctacgggctg ctctactgct tcaggaagga catggacaag gtcgagacat 1320 tcctgcgcat cgtgcagtgc cgctctgtgg agggcagctg tggcttctga taaaagctt 1379
<210> 5 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Phe Pro Thr lie Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Ser Leu Arg 1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30
Glu Ala Tyr lie Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser lie Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg lie Ser Leu 65 70 75 80
Leu Leu lie Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly lie Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln lie Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175
Leu Arg lie Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190
<210> 6 <211> 573 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 6 ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaacgcta gtctccgcgc ccatcgtctg 60 caccagctgg cctttgacac ctaccaggag tttgaagaag cctatatccc aaaggaacag 120 aagtattcat tcctgcagaa cccccagacc tccctctgtt tctcagagtc tattccgaca 180 ccctccaaca gggaggaaac acaacagaaa tccaacctag agctgctccg catctccctg 240 ctgctcatcc agtcgtggct ggagcccgtg cagttcctca ggagtgtctt cgccaacagc 300 ctggtgtacg gcgcctctga cagcaacgtc tatgacctcc taaaggacct agaggaaggc 360 atccaaacgc tgatggggag gctggaagat ggcagccccc ggactgggca gatcttcaag 420 cagacctaca gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg acgcactact caagaactac 480 gggctgctct actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg agacattcct gcgcatcgtg 540 cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttc 573
Claims (33)
1.- Un polipéptido quimérico que comprende: i) por lo menos un dominio de unión modificado de hormona de crecimiento, en donde dicha modificación es la adición, deleción o sustitución de por lo menos un residuo de aminoácido; y ii) un dominio de unión a ligando de receptor de hormona de crecimiento.
2.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho dominio de unión es modificado en el sitio 1 de hormona de crecimiento.
3. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho dominio de unión es modificado en el sitio 2 de hormona de crecimiento.
4. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha modificación es en los sitios 1 y 2 de hormona de crecimiento.
5. - El polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2 ó 4, caracterizado además porque dicha modificación se selecciona del grupo que consiste de: histidina 18 con alanina o ácido aspártico; y/o histidina 21 con asparagina; y/o glutamina 22 con alanina; y/o fenilalanina 25 con alanina; y/o ácido aspártico 26 con alanina; y/o glutamina 29 con alanina; y/o ácido glutámico 167 con alanina; y/o ácido aspártico 171 con serina; y/o lisina 172 con serina o alanina; y/o isoleucina 179 con tirosina; como se representa en la figura 13.
6. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicha modificación consiste de las sustituciones de aminoácido: histidina 18 ácido aspártico; histidina 21 asparagina; arginina 167 asparagina; ácido aspártico 171 arginina; ácido glutámico 174 serina; e isoleucina 79 treonina.
7. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicha modificación consiste de las sustituciones de aminoácido: histidina 18 alanina; glutamina 22 alanina; fenilalanina 25 alanina; ácido aspártico 26 alanina; glutamina 29 alanina; ácido glutámico 65 alanina; lisina 168 alanina; y ácido glutámico 174 alanina.
8. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicha modificación del sitio 2 es al residuo de aminoácido glicina 120 de la secuencia representada en la figura 13.
9. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dicha modificación del sitio 2 es una sustitución de glicina por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de: arginina; alanina; lisina; triptófano; tirosina; fenilalanina; y ácido glutámico.
10. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque dicha sustitución del sitio 2 es glicina 120 por arginina o lisina o alanina.
1 1. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado además porque el dominio de unión a hormona de crecimiento del GHR, es el dominio extracelular del GHR. 12. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque el dominio extracelular del GHR es el dominio
SD-100 C-terminal del GHR.
13. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado además porque dicho polipéptido es una proteína de fusión.
14.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho polipéptido de fusión comprende GH modificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y el dominio SD-100 C-terminal del GHR.
15. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado además porque el dominio de unión modificado de la GH es enlazado por un enlazador al dominio de unión de GH del GHR.
16. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 15, caractenzado además porque el enlazador es un polipéptido que comprende 5 a 30 residuos de aminoácido.
17. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el enlazador comprende 10 a 20 residuos de aminoácido.
18. - El polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 16 ó 17, caracterizado además porque el enlazador comprende por lo menos una copia del péptido Gly Gly Gly Gly Ser.
19. - Una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, seleccionado del grupo que comprende: i) una molécula de ácido nucleico representada por la secuencia de ácido nucleico en la figura 13; y ¡i) una molécula de ácido nucleico que híbrida con la secuencia de ácido nucleico en (0-
20. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque híbrida bajo condiciones de hibridación severa con la secuencia de ácido nucleico en la figura 13.
21 . - La molécula de ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 19 ó 20, caracterizada además porque consiste del ADN en la figura 13.
22. - Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21.
23. - El vector de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque dicho vector es un vector de expresión adaptado para expresión recombinante.
24. - El uso del polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, como un agente farmacéutico.
25. - El uso del polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una condición seleccionada del grupo que consiste de: gigantismo; acromegalia; cáncer (por ejemplo, tumor de Wilm, sarcoma osteogénico, y cáncer de mama, colon, próstata y tiroides); retinopatía diabética; nefropatía diabética; y cualquier enfermedad causada por el exceso de GH.
26. - El uso del polipéptido como se reclama en la reivindicación 25, para el tratamiento de acromegalia.
27. - Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.
28. - Una célula transformada o transfectada con el ácido nucleico o vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23.
29. - La célula de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque dicha célula es una célula eucariótica seleccionada del grupo que consiste de: un moho mucilaginoso (por ejemplo, Dictyostelium spp); una célula de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae; Pichia spp); una célula de mamífero (por ejemplo, ovario de hámster chino); una célula vegetal; o una célula de insecto (por ejemplo, Spodoptera spp).
30. - La célula de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque dicha célula es una célula procariótica.
31. - Un método para sintetizar un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 que comprende: i) proveer una célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30; ii) incubar dicha célula bajo condiciones que lleven a la producción de dicho polipéptido; y opcionalmente iii) aislar el polipéptido de la célula o el medio de cultivo de células.
32. - El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque dicho polipéptido se provee con una señal de secreción que facilita la purificación del polipéptido a partir de dicha célula.
33. - El método de conformidad con las reivindicaciones 31 ó 32, caracterizado además porque dicho polipéptido se provee con una marca de afinidad para facilitar la purificación del polipéptido a partir de dicha célula o el medio de cultivo de células.
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