JP2009297038A - プロテアーゼ変異体及び組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】多くのサブチラーゼ遺伝子を突然変異し、かつ適当な宿主において突然変異された遺伝子を発現することにより産生された酵素を提供する。これらの酵素は、いずれかの洗剤中において、それらの野生型親酵素と比べて改善された洗濯性能を示す。
【解決手段】位置252 、255 及び／又は259 （BASBPN番号）に修飾を含んで成る、洗剤中で改善された洗濯性能を有するサブチラーゼ酵素変異体。
【選択図】なし

Description

本発明は、洗剤組成物を配合すること及び洗剤において改善された洗濯性能を発揮させることにおいて有用な新規のプロテアーゼ酵素突然変異体又は酵素突然変異体；該酵素を含有するクリーニング及び洗剤組成物；適当な宿主細胞又は生物に挿入された場合に該酵素を発現するようにコードされた突然変異された遺伝子；並びに、それにより形質転換され、かつ該酵素変異体を発現することが可能な該宿主細胞に関する。

洗剤産業においては、30年以上にわたって酵素が洗濯配合物中で使用されている。このような配合物中で使用される酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、更には他の酵素、又はそれらの混合物を含む。商業的に最も重要な酵素はプロテアーゼである。

数が増している商業的に使用されるプロテアーゼは、天然の野生型プロテアーゼのタンパク質が操作された変異体であり、例えばDURAZYM（登録商標）（ノボ・ノルディスク社(NOVO Nordisk A/S)）、RELASE（登録商標）（ノボ・ノルディスク社）、MAXAPEM （登録商標）（ギスト−ブロケード社(Gist-Brocades N.V.)）、PURAFECT（登録商標）（ジェネンコル・インターナショナル社(Genencor International, Inc.)）がある。

更に多くのプロテアーゼ変異体が、当該技術分野において説明されており、例えば特許文献１（ジェネンテック社(GENENTECH)）（特許文献２（ジェネンコル社））；特許文献３（ヘンケル社(HENKEL)）；特許文献４（アムゲン社(AMGEN)）；特許文献５（ジェネックス社(GENEX)）；特許文献６（ジェネンコル社) ；Thomas、Russell 及びFershtの論文、非特許文献１；Thomas、Russell 及 びFershtの論文、非特許文献２；Russel及びFershtの論文、非特許文献３；特許文献７（ジェネックス社）；特許文献８（アムゲン社)；特許文献９（ソルベイ社(SOLVAY S.A.)）；特許文献１０（プロクター・アンド・ギャンブル社(PROCTER & GANBLE COMPANY)）；特許文献１１（プロクター・アンド・ギャンブル社）；特許文献１２（プロクター・アンド・ ギャンブル社）；特許文献１３（ソルベイ社）；特許文献１４（ジェネンコル社)；特許文献１５（ノボ・ノルディスク社）；特許文献１６（ノボ・ノルディスク社）；特許文献１７（ソルベイ社）；特許文献１８（ギストブロケード社）；及び国際公開公報第96/34946号（ノボ・ノルディスク社）がある。

しかしながら、多くの有用なプロテアーゼ変異体が説明されているにもかかわらず、多くの産業における使用のための新規の改善されたプロテアーゼ変異体が依然必要である。

欧州特許第130756号 米国再発行特許第34,606号 欧州特許第214435号 国際公開公報第87/04461 号 国際公開公報第87/05050 欧州特許第260105号 国際公開公報第88/08028号 国際公開公報第88/08033号 国際公開公報第95/27049号 国際公開公報第95/30011号 国際公開公報第95/30010号 国際公開公報第95/29979号 米国特許第5,543,302 号 欧州特許第251 446 号 国際公開公報第89/06279号 国際公開公報第91/00345号 欧州特許公開第525 610 Al号 国際公開公報第94/02618号 国際公開公報第96/34946号

Nature、318:375-376(1985) J. Mol. Biol.、193:803-813(1987) Nature、328:496-500(1987)

従って本発明の目的は、改善されたタンパク質が操作されたプロテアーゼ変異体、特に洗剤産業において使用するためのものを提供することである。

本発明は、SAVINASE（登録商標）のN252、T255及びS259残基の多くの可能性のある組合せを集中的に研究し、そして増強され改善された洗濯性能を持つ多くの変異体を同定するものである。
更なる詳細については、本願明細書の実施例を参照としている（下記参照）。

従って本発明は、その第一の態様において、洗剤中の改善された洗濯性能を持つサブチラーゼ(subtilase)プロテアーゼ変異体であり、252、255及び／又は259位に修飾を有するものに関する。

好ましくは本発明のサブチラーゼ変異体は、252及び255位の両方に修飾を有し、より好ましくは252、255及び259位の３種全てにおいて修飾を有する。

第二の態様において、本発明は、洗剤において改善された洗濯性能を有するサブチラーゼ酵素変異体であり、下記からなる群より選択される少なくとも１種の修飾を有するものに関する： 252L+255I 252V+255A 252M+255C+259H 252S+255E+259C 252K+255S+259C；又は前述の変異体のいずれかにおいて１種以上の保存的修飾（複数）を含む変異体（例えば、252L（疎水性アミノ酸）＋255I変異体の保存的修飾は、252I（疎水性アミノ酸）＋255I、及び252V（疎水性アミノ酸）＋255Iのような変異体を含む）。

第三の態様において、本発明は、本発明のサブチラーゼ変異体をコードしている単離されたDNA配列に関する。

第四の態様において、本発明は、本発明のサブチラーゼ変異体をコードしている単離されたDNA配列を含む発現ベクターに関する。

第五の態様において、本発明は、第四の態様の発現ベクターで形質転換された微生物宿主細胞に関する。

更なる態様において、本発明は、適当な微生物宿主への第四の態様の発現ベクターの挿入、所望のサブチラーゼ酵素を発現するための宿主の培養、及び酵素産物の回収による、本発明のズブチリシン酵素の産生に関する。

より更に本発明は、本発明のサブチラーゼ変異体を含む組成物に関する。

最後に本発明は、多くの工業的関連用途のための突然変異酵素の使用、特にクリーニング組成物における使用及び突然変異体酵素を含むクリーニング組成物、特に突然変異体ズブチリシン酵素を含む洗剤組成物に関する。

図１−１は、サブチラーゼにおいて18個の高度に保存された残基とアライニングしたいくつかの相同のサブチラーゼのアラインメント。18個の高度に保存された残基は、太字で強調している。示されたサブチラーゼは、JP170以外は全て、これらの保存された残基において100％の同一性を有している。JP170は、保存された残基G146に“G”の代わりに“N”を有する。 図１−２は、サブチラーゼにおいて18個の高度に保存された残基とアライニングしたいくつかの相同のサブチラーゼのアラインメント。18個の高度に保存された残基は、太字で強調している。示されたサブチラーゼは、JP170以外は全て、これらの保存された残基において100％の同一性を有している。JP170は、保存された残基G146に“G”の代わりに“N”を有する。

定義
本発明をより詳細に説明する前に、まず下記の用語を定義する。
アミノ酸の用語
A = Ala = アラニン
V = Val = バリン
L = Leu = ロイシン
I = Ile = イソロイシン
P = Pro ＝プロリン
F = Phe = フェニルアラニン
W = Trp = トリプトファン
M = Met = メチオニン
G = Gly ＝グリシン
S = Ser = セリン
T = Thr = トレオニン
C = Cys=システイン
Y = Tyr = チロシン
N = Asn = アスパラギン
Q = Gln = グルタミン
D = Asp = アスパラギン酸
E = Glu = グルタミン酸
K = Lys = リシン
R = Arg = アルギニン
H = His = ヒスチジン
X = Xaa = いずれかのアミノ酸

核酸用語
A ＝アデニン
G ＝グアニン
C ＝シトシン
T ＝チミン（DNA のみ）
U ＝ウラシル（RNA のみ）

変異体用語
本発明に従って産生されるか、又は、予期された様々な酵素変異体を説明する場合は、参照を容易にするために以下の用語を使用する。

オリジナルのアミノ酸位置置換されたアミノ酸

従って、195 位のグリシンのグルタミン酸による置換は次のように示され：
Gly 195 Glu 又は G195E
同位置でのグリシンの欠失は次のように表され：
Gly 195 * 又は G195*
及び、リシンのような追加のアミノ酸残基の挿入は次のように表される：
Gly 195 GlyLys 又は G195GK。

番号付けのために使用された配列との比較において欠失が示されたならば、そのような位置での挿入は：
* 36 Asp 又は *36D
のように36位でのアスパラギン酸の挿入について示される。
複数の突然変異体はプラス（＋）によって分けられており、すなわち：
Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu 又は Rl70Y+G195E
は、170 位及び195 位でのアルギニン及びグリシンの、それぞれ、チロシン及びグルタミン酸との置換である変異体を示している。

プロテアーゼ
タンパク質基質のアミド結合を切断する酵素は、プロテアーゼ、又は（互換的に）ペプチダーゼと分類される（Walsh 、1979年、「酵素反応メカニズム（Enzymatic Reaction Mechanisms ）」、W.H. Freeman and Company、サンフランシスコ、第３章を参照のこと）。

アミノ酸及び残基の位置の番号付け
特に言及しない限りは本願明細書において使用されたアミノ酸の番号付けは、サブチラーゼBPN'(BASBPN)配列のものに対応している。BPN'配列 の更なる説明については、Siezenらの論文、Protein Engng.、4:719-737(1991) 及び図１を参照のこと。

セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素であり、ここで活性部位には本質的にセリン残基がある（White、Handler及びSmith、1973年、「生化学原論（Principles of Biochemistry）」、第五版、McGraw Hill Book Company、ニューヨーク、271〜272頁）。

細菌性セリンプロテアーゼは、分子量が20,000〜45,000ダルトンの範囲である。これらは、ジイソプロピルフルオロリン酸によって阻害される。これらは、容易に末端エステルを加水分解し、これは同じくセリンプロテアーゼである真核生物のキモトリプシンの活性に類似している。サブグループを包含するより狭い用語であるアルカリプロテアーゼは、pH9.0〜11.0といった、一部のセリンプロテアーゼの高い至適pHを反映している（検討のため、Priestの論文、Bacteriological Rev.、41:711-753(1977)を参照のこと）。

サブチラーゼ
試験的にサブチラーゼと称されるセリンプロテアーゼのサブグループが、Siezenらによって（Protein Engng.、4:719-737(1991)）提唱されている。これらは、それまではズブチリシン様プロテアーゼと称されたセリンプロテアーゼの40種以上のアミノ酸配列の相同性分析によって定義さ れた。ズブチリシンは、これまではグラム陽性菌又は真菌によって産生されるセリンプロテアーゼとして定義され、現時点ではSiezenらに従って、サブチ ラーゼのサブグループとされている。様々なサブチラーゼが同定されており、かつ多数のサブチラーゼのアミノ酸配列が決定されている。このようなサブチラー ゼ及びそれらのアミノ酸配列に関するより詳細な説明は、Siezenらの論文、及び本願明細書の図１を参照とすることができる。

サブチラーゼのひとつのサブグループであるI-S1は、「古典的」ズブチリシンを含み、例えばズブチリシン168、ズブチリシンBPN'、ズブチリシンCarlsberg(ALCALASE（登録商標）、ノボ・ノルディスク社)、及びズブチリシンDYである。

更なるサブチラーゼのサブグループI-S2は、Siezenらによって（上記）認められた。サブグループI-S2プロテアーゼは、高度にアルカリ性のズブチリシンとして説明され、かつ例えばズブチリシンPB92(MAXACAL（登録商標）、ギストブロケード社)、ズブチリシン309(SAVINASE（登録商標）、ノボ・ノルディスク社)、ズブチリシン147(ESPERASE（登録商標）、ノボ・ノルディスク社)、及びアルカリエラスターゼYaBなどの酵素を含んでいる。

“SAVINASE（登録商標）”
SAVINASE（登録商標）は、ノボ・ノルディスク社から市販されている。これはB.レンタス(B. Lentus)由来のズブチリシン309であり、N87Sを有する点のみがBABP92と異なる（本願明細書の図１を参照のこと）。

親サブチラーゼ
用語“親サブチラーゼ”は、Siezenらに従って定義されたサブチラーゼである（Protein Engineering 、4:719-737(1991) ）。更なる詳細は、直前に記した“サブチラーゼ”の項を参照のこと。親サブチラーゼは、天然の供給源から単離されたサブチラーゼであることもでき、この場合、その後にサブチラーゼの特徴を保持しながら修飾が行われている。あるいは用語“親サブチラーゼ”は、“野生型サブチラーゼ”の意味であることもできる。

サブチラーゼ変異体の修飾（複数）
本願明細書においてサブチラーゼ変異体の修飾に関連して使用される用語“修飾”は、化学的修飾、更には遺伝子操作を含むと定義される。修飾は、目的のアミノ酸の中又はその場における置換、欠失及び／又は挿入であることができる。

サブチラーゼ変異体
本発明に関連して、用語「サブチラーゼ変異体」又は「突然変異されたサブチラーゼ」は、当初の又は親の遺伝子を有し、かつ対応する親酵素を産生するような親微生物に由来した突然変異遺伝子を発現している微生物によって産生されたサブチラーゼを意味しており、この親遺伝子は、該突然変異されたサブチラーゼプロテアーゼが適当な宿主において発現された場合に産生されるような突然変異遺伝子を産生するように突然変異されている。

相同なサブチラーゼ配列
SAVINASE（登録商標）サブチラーゼに特異的なアミノ酸残基が、本発明のサブチラーゼ変異体を得るために本願明細書において修飾されるように同定された。

しかし、本発明は、この特定のサブチラーゼの修飾に限定されるものではなく、SAVINASE（登録商標）のものと相同の一次構造を有する他の親（野生型）サブチラーゼに拡大される。

本発明の範囲内である他の相同なサブチラーゼを同定するために、先に並べられたサブチラーゼのグループに対する該サブチラーゼ（複数）の並置を、先の並置の定常部を保ちながら実施した。サブチラーゼにおける18個の高度に保存された残基の比較を行った。これらの18個の高度に保存された残基を表Iに示した（該保存された残基に関する詳細はSiezenらの論文を参照のこと）。

表Ｉ
サブチラーゼにおける18個の高度に保存された残基
位置：保存された残基
23 G
32 D
34 G
39 H
64 H
65 G
66 T
70 G
83 G
125 S
127 G
146 G
154 G
155 N
219 G
220 T
221 S
225 P

アラインメントを維持するために必要な挿入及び欠失ができるようにアライニング後、適当な相同な残基を同定した。次に該相同な残基を本発明に従って修飾した。
CLUSTALW（バージョン1.5 、1995年４月）コンピュータ用アラインメントプログラム（Thompson, J.D.、Higgins, D.G. 及びGibson, T.J.、Nucleic Acids Research、22:4673-4680(1994)）を用い、GAPオープンペナルティーを10.0及びGAPエクステンションペナルティーを0.1とし、BLOSUM30タンパク質重量マトリックスを用いて、先に並べたサブチラーゼの群に対して所定のサブチラーゼのアラインメントを、このプログラムのプロフィールアラインメンツ(Profile alignments)オプションを用いて実施した。本発明の範囲内の所定のサブチラーゼについては、18個の高度に保存された残基の100％が保存されることが好ましい。しかし、これら18残基中の17個又はそれ以上の、もしくは該保存残基の少なくとも16個の並びも、相同な残基を同定するために適している。サブチラーゼにおいては、触媒性の３つ組Asp32/His64/Ser221の保存が維持されなければならない。

これまでに同定されたアラインメントを図１に示しているが、ここには18の高度に保存された残基に対するこの並びの個々のサブチラーゼの同一性の割合（％）も示した。

この説明を基に、本発明に従って修飾され得る適当な相同サブチラーゼ及び対応する相同な残基を同定することは、当業者には通常のことである。これを説明するために、下記表IIは、本発明に従って修飾され得る相同なサブチラーゼ及び対応する適当な残基の限定的一覧を示している。

表II
本発明に従って修飾するのに適した相同なサブチラーゼ及び対応する残基

他の相同なサブチラーゼを包含するより小さい又はより大きい表が当業者によって容易に作成され得ることは明らかであろう。

洗濯性能
例えば洗濯の間に、クリーニングされるべき対象物上に存在する様々な天然の基質の分解を触媒する酵素の能力は、その洗濯能、ウォッシャビリティ、洗浄力、又は洗濯性能と称される事が多い。本出願を通じて、用語「洗濯性能」は、この特性を包含するように使用されるものである。

単離されたDNA配列
用語「単離された」とは、DNA配列分子に適用される場合は、DNA配列がその天然の遺伝的環境(milieu)から取り出されて、その結果他の外来性の又は所望でないコード配列を含まず、かつ遺伝子操作されたタンパク質産生システムにおける使用に適した形であることを意味する。このような単離された分子は、それらの天然の環境から分離され、かつcDNA及びゲノムクローンを含んでいる。本発明の単離されたDNA分子は、それが本来結合している他の遺伝子を含まないが、天然の5'及び3'の非翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターは含み得る。結合した領域の同定は、当業者には明白であろう（例えばDynan及びTijanの論文、Nature、316:774-78(1985)を参照のこと）。あるいは、用語「単離されたDNA配列」は、「クローニングされたDNA配列」と称され得る。

単離されたタンパク質
用語「単離された」がタンパク質に適用される場合には、これは、タンパク質がその天然の環境以外の状態で認められることを示す。好ましい形において、単離されたタンパク質は、実質的に他のタンパク質、特に他の相同なタンパク質（すなわち「相同な不純物」（下記参照））を含まない。好ましくはSDS-PAGEで調べた場合に、タンパク質を高純度の形、すなわち40％以上の純度、60％以上の純度、80％以上の純度で、より好ましくは95％以上の純度で、更により好ましくは99％以上の純度で提供される。
用語「単離されたタンパク質」は、他に「精製されたタンパク質」を意味することもある。

相同な不純物
用語「相同な不純物」は、本発明のポリペプチドが本来得られるような相同な細胞を起源とする何らかの不純物（例えば本発明のポリペプチド以外のその他のポリペプチド）を意味する。

得られる
本願明細書において特定の微生物源に関連して使用される用語「得られる」とは、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドが特定の供給源によって、又はその中に該供給源の遺伝子が挿入されている細胞によって産生されることを意味する。

基質
プロテアーゼの基質に関連して使用される用語「基質」は、ズブチリシンプロテアーゼによる加水分解を受けやすい少なくとも１個のペプチド結合を有する化合物を含むような最も広範な形で理解されなければならない。

生成物
プロテアーゼ酵素反応に由来する生成物に関連して使用される用語「生成物」は、本発明の文脈において、サブチラーゼプロテアーゼに関連している加水分解反応の生成物を含むと理解されなければならない。生成物は次の加水分解反応の基質となり得る。

発明の詳細な説明
改善された洗濯性能を有するサブチラーゼ変異体：
本発明者らは、改善された洗濯性能を持つ変異体をBLS309（SAVINASE（登録商標））において確定した。従って、本発明の実施態様は、下記の群 より修飾が選択されるサブチラーゼ酵素変異体に関する： N252L+T255I N252V+T255A N252M+T255C+S259H N252S+T255E+S259C N252K+T255S+S259C ；又は 前述の変異体のいずれかにおいて１個以上の保存的修飾を含む変異体（例えば、N252L （疎水性アミノ酸）+T255I変異体の保存的修飾は、N252I（疎水性アミノ酸）+T255I、及びN252V （疎水性アミノ酸）+T255Iの変異体を含む。）。

本発明の多くのサブチラーゼ変異体をここで試験し、かつ洗剤において改善された洗濯性能を示すことを示した（本願明細書の実施例を参照のこと（下記参照））。

同様の保存的アミノ酸に対するひとつのアミノ酸の置換は、酵素の特性において小さい変化をもたらすのみであることは当該技術分野において周知である。

下記表IIIは、保存的アミノ酸のグループを一覧としている。
表III
保存的アミノ酸の置換
塩基性：アルギニン、リシン、ヒスチジン
酸性：グルタミン酸、アスパラギン酸
極性：グルタミン、アスパラギン
疎水性：ロイシン、イソロイシン、バリン
芳香族：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン
小さい：グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン

従って、サブチラーゼ変異体、例えば252L+255I、252I+255I、及び252V+255Iなどは、同様の洗濯性能の改善性を有する。更にN252L+T255I、N252I+T255I、及びN252V+T255Iのようなサブチラーゼ変異体も、同様の洗濯性能の改善を有するであろう。

本願明細書に開示されたサブチラーゼ変異体を基に、更に改善された洗濯性能を有するサブチラーゼ変異体を得るために適した保存的置換を確定することは、当業者には通常の作業である。

本発明の実施態様において、興味深いサブチラーゼは、サブグループI-S1及びI-S2に属するものである。

サブグループI-S1に関連して、好ましい親サブチラーゼは、ABSS168、BASBPN、BSSDY、及びBLSCAR、又はそれらの機能的変異体でサブグループI-S1の特徴を保持するものを含む群から選択される。

サブグループI-S2に関連して、好ましい親サブチラーゼは、BLS147、BLS309、BAPB92、TVTHER、及びBYSYAB、又はそれらの機能的変異体でサブグループI-S2の特徴を保持するものを含む群から選択される。

本発明は更に、親酵素のアミノ酸配列に対する何らかの他の修飾と組み合わせた前述の位置でのいずれか１種以上の修飾も含む。特に当該技術分野において酵素に改善された特性を提供することが公知の他の修飾との組合せが考察されている。当該技術分野は、様々な改善された特性を有する多くのサブチラーゼ変異体を説明し、かつそれらの多くは本願明細書の「発明の背景」の項において言及されている（前記参照）。これらの参照は、サブチラーゼ変異体を同定するための参照としてここに明らかにされていて、有利なことに本発明サブチラーゼ変異体と組合せることができる。

このような組合せは、次の位置を含む：222 （酸化安定性の改善）、218 （温度安定性の改善）、酵素を安定化するCa- 結合部位の置換、例えば76位、及び先行技術により明らかな多くの他の位置。

更なる実施態様において、本発明のサブチラーゼ変異体は、有利なことに下記の位置のいずれかにおける１個以上修飾と組合せることができる：27、36、57、76、97、101、104、120、123、167、170、206、218、222、224、235及び274。

特に下記のBLS309及びBAPB92変異体は、組合せに適していると考えられる：K27R、*36D、S57P、N76D、G97N、S101G、V104A、V104N、V104Y、H120D、N123S、Y167A、Y167I、R170S、R170L、R170N、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、K235L及びT274A。

更に、前述の修飾の１種以上のいずれかとの組合せにおいて、変異体V104N+S101G、K27R+V104Y+N123S+T274A、もしくはN76D+V104A、又はこれらの突然変異体の他の組合せ（V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104A）のいずれかを含む変異体は、改善された特性を示す。

本発明の主要な態様の更なるサブチラーゼ変異体さえもが、好ましくは、129、131、133及び194のいずれかの位置で１種以上の修飾と組合せられていて、好ましくは129K、131H、133P、133D及び194Pの修飾であり、最も好ましくはP129K、P131H、A133P、A133D及びA194Pの修飾である。これらの修飾（複数）のいずれかは、本発明のサブチラーゼ変異体のより高い発現レベルをもたらし得る。

サブチラーゼ遺伝子における突然変異誘発
本発明のサブチラーゼのクローニング法及び遺伝子（例えばサブチラーゼ遺伝子）への突然変異の多くの導入法が、当該技術分野において周知である。

一般に、本発明のサブチラーゼ変異体を得るためには、遺伝子クローニング及び該遺伝子への突然変異導入（ランダム及び／又は部位特異的）の標準的手順を使 用することができる。適当な技法の更なる説明のために、本願明細書の実施例（下記参照）、並びにSambrookらの「分子クローニング：実験マニュアル （Molecular Cloning : A laboratory manual）」、1989年、コールドスプリングハーバーラボ社、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）、Ausubel, F. M.らの編集「分子生物学の最新プロトコール（Current protocols in Molecular Biology）」、John Wiley and Sons 社、1995年；Harwood, C. R.及びCutting, S. M.の編集、「バシラスの分子生物学的方法(Molecular Biological Methods for Bacillus)」、John Wiley and Sons 社、1990年；及び国際公開公報第96/34946号を参照とする。

発現ベクター
本発明の酵素をコードしているDNA構築物を含む組換え発現ベクターは、組換えDNA手順に常用されているいずれかのベクターであることができ、ベクターの選択はそれが導入されるべき宿主細胞によって決まる事が多い。従ってベクターは、自律複製ベクター、すなわち染色体外遺伝因子(extrachromosomal entity)として、染色体複製とは無関係の複製を示すベクター、例えばプラスミドであることができる。あるいはこのベクターは、宿主細胞へ導入される場合に、一部又はその全体が該宿主細胞ゲノムに組込まれ、かつそれが組入れられた染色体と一緒に複製されるものであることができる。

ベクターは、本発明の酵素をコードしているDNA配列が、DNAの転写に必要な追加のセグメントに機能的に結合した発現ベクターであることが好ましい。一般に、発現ベクターは、プラスミドもしくはウイルスDNAに由来するか、もしくは両方のエレメントを含むことができる。用語「機能的に結合した」とは、セグメントが、例えば転写がプロモーターで始まり、酵素をコードしているDNA配列を通じての進行するような、それらの意図された目的のために協力して機能するように配列されることを意味する。

プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示すいずれかのDNA配列であることができ、かつ宿主細胞と同種又は異種のいずれかのタンパク質をコードしている遺伝子に由来することができる。

細菌宿主細胞における使用に適したプロモーターの例は、バシラス・ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus) のマルトース型(maltogenic)アミラーゼ遺伝子、バシラス・リシェニフォルミス(Bacillus licheniformis)α−アミラーゼ遺伝子、バシラス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)α−アミラーゼ遺伝子、バシラス・サブチリス(Bacillus subtilis)アルカリプロテアーゼ遺伝子、もしくはバシラス・プミラス(Bacillus pumilus)キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、又はファージλPRもしくはPLプロモーター、又は大腸菌のlac、trpもしくはtacプロモーターを含む。

本発明の酵素をコードしているDNA配列は、必要であるならば、適当なターミネーターに機能的に結合することもできる。

本発明の組換ベクターは更に、問題の宿主細胞においてベクターを複製することが可能なDNA配列を含むことができる。

このベクターは、更に選択可能なマーカー、例えばその産物が宿主細胞における欠損の相補産物である遺伝子、又は例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシンなどの抗生物質に対する耐性、又は重金属もしくは除草剤に対する抵抗性をコードしている遺伝子などを含むこともできる。

本発明の酵素を宿主細胞の分泌経路に向けるためには、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても公知）が、該組換ベクターに提供され得る。分泌シグナル配列は、正確なリーディングフレーム内で本発明の酵素をコードしているDNA配列に連結されている。分泌シグナル配列は、通常、酵素をコードしているDNA配列の5'側に位置する。分泌シグナル配列は、通常は該酵素と結合しているか、もしくは、他の分泌されたタンパク質をコードしている遺伝子に由来することができる。

本発明の酵素をコードしているDNA配列、プロモーター及び任意にターミネーター及び／又は分泌シグナル配列を各々連結するために、又はこれらの配列を適当なPCR増幅法により組み立てるため、及びこれらを複製又は組入れに必要な情報を有する適当なベクターに挿入するために使用される手順は、当業者には周知である（例えば前掲のSambrookらの論文を参照のこと）。

宿主細胞
宿主細胞に導入される本発明の酵素をコードしているDNA配列は、問題の宿主細胞に対して同種又は異種のいずれかであることができる。宿主細胞と同種である、すなわち自然に宿主細胞によって産生される場合は、これは典型的には他のプロモーター配列、又は適当ならば他の分泌シグナル配列及び／又はターミネーター配列に、その天然の環境にある時よりもより機能的に結合されるであろう。用語「同種」は、問題の宿主生物に本来備わる酵素をコードしているDNA配列を含むことが意図されている。用語「異種」は、自然には宿主細胞によって発現されないDNA配列を含むことが意図されている。従って、このDNA配列は他の生物に由来することができ、又は、合成配列であることができる。

本発明のDNA構築物又は組換ベクターがその中に導入される宿主細胞は、本発明の酵素を産生することが可能ないずれかの細胞であることができ、かつ細菌、酵母、真菌、及びより高等な真核生物を含む。

培養時に本発明の酵素を産生することが可能な細菌宿主細胞の例は、グラム陽性菌、例えばバシラス株、例としてB.サブチリス(B. subtilis)、B.リシェニフォルミス(B. licheniformis)、B.レンタス(B. lentus)、B.ブレビス(B. brevis)、B.ステアロテルモフィルス(B.stearothermophilus)、B.アルカロフィラス(B. alkalophilus)、B.アミロリクエファシエンス(B.amyloriquefaciens)、B.コアギュランス(B. coagulans)、B.サーキュランス(B. circulans)、B.ランタス(B. lautus) 、B.メガセリウム(B. megatherium)もしくはB.スリンギエンシス(B. thuringiensis)、又はストレプトミセス株、例えばS.リビダンス(S. lividans)もしくはS.ムリナス(S. murinus)、又はグラム陰性菌、例えば大腸菌(Echerichia coli)である。細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換、電気穿孔、接合によるか、又はそれ自身公知の方法においてコンピテント細胞を用いるかによって作用することができる（前掲のSambrookらの論文を参照のこと）。

大腸菌のような細菌において酵素を発現する場合、酵素は、典型的には不溶性顆粒（封入体として公知）として細胞質に保持されるか、もしくは、細菌の分泌配列により細胞周辺腔に向けられるかすることができる。前者の場合、細胞は溶解され、かつ顆粒が回収され変性され、その後変性剤を希釈することによって酵素は再度折りたたまれる。後者の場合、酵素は、細胞周辺腔の内容物を放出するために、例えば音波処理又は浸透圧ショックなどにより細胞を破壊し、かつ酵素を回収することによって、細胞周辺腔から回収される。

バシラス又はストレプトミセス株のようなグラム陽性菌において酵素を発現する場合、酵素は細胞質に保持されるか、もしくは、細菌の分泌配列により細胞外培地に放出される。後者の場合、酵素は下記のように培地から回収される。

サブチラーゼ産生法
本発明は、酵素をコードしているDNA配列によって形質転換された適当な宿主細胞を、酵素の産生が可能な条件下で培養し、得られた酵素を培養物から回収するという、本発明に従って単離された酵素を産生する方法を提供する。

酵素をコードしているDNA配列を含む発現ベクターを、異種宿主細胞に形質転換する場合、本発明の酵素の異種組換え産生ができるようになることが可能である。

これにより、相同の不純物を含まないことを特徴とする、高度に精製されたサブチラーゼ組成物を製造することが可能になる。

尚、相同な不純物とは、本発明の酵素が本来そこから得られる相同の細胞に起源するいずれかの不純物（例えば本発明の酵素以外のポリペプチド）を意味する。

形質転換された宿主細胞の培養に用いる培地は、問題の宿主細胞の増殖に適した通常の培地のいずれかであることができる。発現されたサブチラーゼは、通常培養培地に分泌され、かつ遠心分離又はろ過による培地からの細胞の分離、硫酸アンモニウムのような塩による培地の蛋白質成分の沈殿、その後のクロマトグラフィー法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを含む、周知の手順を用いて、培地から回収される。

本発明のサブチラーゼ変異体の使用
本発明の適当なサブチラーゼプロテアーゼ変異体を、多くの産業上の用途、特に洗剤産業において用いることができる。

更に本発明は、本発明のサブチラーゼ変異体を含有する酵素組成物に関する。

好ましい産業上の用途の及び相当する好ましい酵素組成物の概要を下記に示す。

この概要は、決して本発明のサブチラーゼ変異体の適当な用途の完全なリストを意図するものではない。本発明のサブチラーゼ変異体は、プロテアーゼ、特にサブチラーゼの使用を含む、当該技術分野において公知の他の産業上の用途においても使用することができる。

突然変異体酵素を含有する洗剤組成物
本発明は、クリーニング及び洗剤組成物並びに突然変異体ズブチリシン酵素を含有するそのような組成物における本発明の突然変異体酵素の使用を含む。このようなクリーニング及び洗剤組成物は当該技術分野において公知であり、適当なクリーニング及び洗剤組成物についての説明は、更に国際公開公報第96/34946号；国際公開公報第97/07202号；国際公開公報第95/30011号を参照とすることができる。

更に、多くの本発明のサブチラーゼ変異体の洗濯性能の向上を示している、本願明細書の実施例を参照とすることができる。

洗剤の開示及び実施例
界面活性剤システム
本発明の洗剤組成物は、界面活性剤システムを含有し、ここで界面活性剤は、非イオン及び／又は陰イオン及び／又は陽イオン及び／又は両性イオン及び／又は双性イオン及び／又は半極性界面活性剤から選択することができる。

界面活性剤は、典型的には0.1重量％〜60重量％のレベルで存在する。

界面活性剤は、該組成物中に存在する酵素成分と相溶性があるように配合されることが好ましい。液体又はゲル状組成物において、界面活性剤は、これらの組成物中のあらゆる酵素の安定性を促進するような、もしくは少なくともそれを破壊することがないような方法で配合されることが最も好ましい。

本発明における使用に好ましいシステムは、界面活性剤として、本願明細書に記された１種以上の非イオン及び／又は陰イオン界面活性剤を含む。

アルキルフェノールのポリエチレン、ポリプロピレン、及びポリブチレンオキシド縮合物が、本発明の界面活性剤システムの非イオン界面活性剤として使用するのに適していて、ポリエチレンオキシド縮合物が好ましい。これらの化合物は、約6〜約14個の炭素原子、好ましくは約8〜約14個の炭素原子を有し直鎖又は分枝鎖のいずれかの構造のアルキル基を有するアルキルフェノールの、アルキレンオキシドとの縮合生成物を含む。好ましい実施態様において、エチレンオキシドは、アルキルフェノール1モルにつき、エキレンオキシド約2〜約25モル、より好ましくは約3〜約15モルと等しい量で存在する。この種の市販の非イオン界面活性剤には、GAF社から市販されているIgepal（登録商標）CO-630；ローム・アンド・ハス社(Rohm & Haas Company)から市販されているトリトン（登録商標）X-45、X-114 、X-100 及びX-102 がある。通常これらの界面活性剤は、アルキルフェノールアルコキシレート（例えばアルキルフェノールエトキシレート）と称される。

１級及び２級脂肪族アルコールの約1〜約25モルのエチレンオキシドとの縮合生成物が、本発明の非イオン界面活性剤システムの非イオン界面活性剤として使用するのに適している。脂肪族アルコールのアルキル鎖は、直鎖又は分枝鎖、１級又は２級のいずれかであることができ、一般に約8〜約22個の炭素原子を含むことができる。好ましくは、約8〜約20個の炭素原子を、より好ましくは約10〜約18個の炭素原子を含むアルキル基を有するアルコールの、アルコール１モルにつき約2〜約10モルのエチレンオキシドとの縮合生成物である。この縮合生成物には、アルコール1モルにつき約2〜約7モルのエチレンオキシドが、最も好ましくは2〜5モルのエチレンオキシドが存在する。この種の市販の非イオン界面活性剤の例は、Tergitol（登録商標）15-S-9（C₁₁-C₁₅の直鎖アルコールと9モルのエチレンオキシドの縮合生成物）、Tergitol（登録商標）24-L-6NMW（分子量分布が狭いC₁₂-C₁₄の１級アルコールと6モルのエチレンオキシドの縮合生成物）、両方ともユニオンカーバイド社(Union Carbide Corporation)から販売されている；Neodol（登録商標）45-9（C₁₄-C₁₅ 直鎖アルコールと9 モルのエチレンオキシドの縮合生成物）、Neodol（登録商標）23-3（C₁₂-C₁₃ 直鎖アルコールと3.0 モルのエチレンオキシドの縮合生成物）、Neodol（登録商標）45-7（C₁₄-C₁₅ 直鎖アルコールと7 モルのエチレンオキシドの縮合生成物）、Neodol（登録商標）45-5（C₁₄-C₁₅ 直鎖アルコールと5 モルのエチレンオキシドの縮合生成物）、シェル化学社(Shell Chemical Company)から市販されている；Kyro（登録商標）EOB （C₁₃-C₁₅ アルコールと9 モルのエチレンオキシドの縮合生成物）、プロクター・アンド・ギャンブル社から市販されている；及びGenapol LA 050（C₁₂-C₁₄ アルコールと5 モルのエチレンオキシドの縮合生成物）、ヘキスト社(Hoechst)から市販されている。これらの生成物の好ましいHLBの範囲は、8〜11であり、最も好ましくは8〜10である。

本発明の界面活性剤システムの非イオン界面活性剤として、米国特許第4,565,647号に開示された、約6〜約30個の炭素原子、好ましくは約10〜約16個の炭素原子を含む疎水基、及び約1.3〜約10、好ましくは約1.3〜約3、最も好ましくは約1.3〜約2.7のサッカリドユニットを含むポリグリコシドのようなポリサッカリド親水基を有するアルキルポリサッカリドである。5又は6個の炭素原子を有するいずれかの還元されたサッカリド、例えばグルコース、ガラクトース及びガラクトシル部分がグルコシル部分により置換されるもの（任意に疎水基が2-、3-、4-などの位置に結合し、その結果グルコシド又はガラクトシドに対応してグルコース又はガラクトースを提供する。）を使用することができる。サッカリド間の結合は、例えば追加のサッカリドユニットのある位置及び先行するサッカリドユニットの2-、3-、4及び／又は6-位との間であることができる。

好ましいアルキルポリグリコシドは、下記式を有する： R²O (C_n H_2n O) _t(グリコシル)_x （式中、R²は、アルキル基が約10〜約18個の、好ましくは約12〜約14個の炭素原子を有するようなアルキル、アルキルフェニル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアル キルフェニル、及びそれらの混合物からなる群より選択され；nは、2又は3、好ましくは2であり；tは0〜約10、好ましくは0であり；並びにxは約1.3〜約10、好ましくは約1.3〜約3、最も好ましくは約1.3〜約2.7である。）。グリコシルは、グルコースに由来するのが好ましい。これらの化合物を調製するために、まずアルコール又はアルキルポリエトキシアルコールを生成し、次にグルコース、又はグルコース源と反応させ、グルコシド（1-位で結合）を形成する。次に追加のグリコシルユニットは、それらの1-位と先行するグリコシルユニットの2-、3-、4-及び／又は6-位、好ましくは優先的に2-位に結合することができる。

プロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合により生成された疎水性塩基の、エチレンオキシドとの縮合生成物も、本発明の別の非イオン界面活性剤システムとして使用するのに適している。これらの化合物の疎水性部分は、好ましくは分子量約1500〜約1800を有し、かつ水への不溶性を示すであろう。この疎水性部分へのポリオキシエチレン部分の付加は、全体としてのこの分子の水への溶解度を増す傾向があり、その生成物の液体特性は、エチレンオキシド最高約40モルとの縮合に相当する、ポリオキシエチレン含量が縮合生成物の全重量の約50％になる点まで保持される。この種の化合物の例は、BASF社から市販されているPluronic（登録商標）界面活性剤がある。

更に本発明の非イオン界面活性剤システムの非イオン界面活性剤として使用するのに適しているのは、エチレンオキシドと、プロピレンオキシド及びエチレンジアミンの反応から生じる生成物との縮合生成物である。これらの生成物の疎水性部分は、エチレンジアミンと過剰なプロピレンオキシドの反応生成物からなり、一般には分子量約2500〜約3000を有する。この縮合生成物が約40重量％〜約80重量％のポリオキシエチレンを含有しかつ分子量約5,000〜約11,000を有する程度まで、該疎水性部分はエチレンオキシドと縮合される。この種の非イオン界面活性剤の例には、BASF社から市販されているTetronic（登録商標）化合物がある。

本発明の界面活性剤システムの非イオン界面活性剤として使用するのに好ましいものは、アルキルフェノールのポリエチレンオキシド縮合物、1級又は2級脂肪族アルコールと約1〜約25モルのエチレンオキシドの縮合生成物、アルキルポリサッカリド、及びそれらの混合物である。最も好ましいものは、3〜15個のエトキシ基を有するC₈-C₁₄アルキルフェノールエトキシレート、及び2〜10個のエトキシ基を有するC₈-C₁₈のアルコールエトキシレート（好ましくは平均C₁₀）、並びにそれらの混合物である。非常に好ましい非イオン界面活性剤は、下記式を有するポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活性剤である：

（式中、R¹はHであるか、又はR¹はC_1-4ヒドロカルビル、2-ヒドロキシエチル、2-ヒドロキシプロピルもしくはそれらの混合物であり、R²はC_5-31ヒドロカルビルであり、及びZは、鎖に直接結合した少なくとも3個のヒドロキシル基を有する直鎖のヒドロカルビル鎖を有するポリヒドロキシヒドロカルビル、又はそれらのアルコキシ化された誘導体である。）。好ましくは、R¹はメチルであり、R²は直鎖のC_11-15アルキル又はC_16-18アルキル又はココナッツアルキル(coconut alkyl)のようなアルケニル鎖、又はそれらの混合物であり、かつZ は、還元性アミン化反応において、グルコース、フルクトース、マルトース又はラクトースのような還元糖に由来している。

非常に好ましい陰イオン界面活性剤は、アルコキシレート化された硫酸アルキル塩の界面活性剤である。例として、式 RO(A)_m SO₃Mの水溶性塩又は酸がある（式中、R は、非置換のC₁₀-C₂₄ のアルキル、又はC₁₀-C₂₄ のアルキル部分を有するヒドロキシアルキル基であり、好ましくはC₁₂-C₂₀ のアルキル又はヒドロキシアルキル、より好ましくはC₁₂-C₁₈ の アルキル又はヒドロキシアルキルであり、A は、エトキシ又はプロポキシユニットであり、m は0 以上、典型的には約0.5 〜約6 の間、より好ましくは約0.5 〜約3 の間であり、かつM は、H 又は陽イオン、例えば金属陽イオン（例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウムなど）、アンモニウム又は置換されたアンモニウム陽 イオンである。）。エトキシル化硫酸アルキル塩、更にはプロポキシル化硫酸アルキル塩も本願明細書において意図されている。置換されたアンモニウム陽イオンの具体的な例は、メチル−、ジメチル−、トリメチル−アンモニウム陽イオン、並びにテトラメチル-アンモニウムのような4級アンモニウム陽イオン、及びジメチルピペリジニウム陽イオン、及びエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミンのようなアルキルアミン誘導体、並びにそれらの混合物などである。界面活性剤の例は、C₁₂-C₁₈硫酸アルキルポリエトキシレート(1.0) 塩(C₁₂-C₁₈E(1.0)M)、C₁₂-C₁₈ 硫酸アルキルポリエトキシレート(2.25)塩(C₁₂-C₁₈(2.25)M)、及びC₁₂-C₁₈ 硫酸アルキルポリエトキシレート(3.0)塩(C₁₂-C₁₈E(3.0)M)、及びC₁₂-C₁₈ 硫酸アルキルポリエトキシレート(4.0) 塩(C₁₂-C₁₈(4.0)M)である（式中、Mは便宜上ナトリウム又はカリウムから選択される。）。

使用に適した陰イオン界面活性剤は、“The Journal of the American Oil Chemists Society”、52 (1975)、323-329頁に従って気体SO₃ によりスルホン化された、C₈-C₂₀カルボン酸（すなわち脂肪酸）の直鎖のエステルを含むアルキルスルホン酸エステル塩界面活性剤である。適当な出発材料は、獣脂、パーム油などに由来する天然の脂質物質を含む。

特に洗濯の用途に好ましいアルキルスルホン酸エステル塩界面活性剤は、下記構造式のアルキルスルホン酸エステル塩界面活性剤を含む：

（式中、R³はC₈-C₂₀ヒドロカルビル、好ましくはアルキル、又はそれらの組合せであり、R⁴はC₁-C₆ ヒドロカルビル、好ましくはアルキル、又はそれらの組合せであり、かつMはアルキルスルホン酸エステルと水溶性塩を生成する陽イオンである。）。適当な塩を生成する陽イオンは、ナトリウム、カリウム及びリチウムを含む金属、並びに置換又は非置換のアンモニウム陽イオン、例えばモノエタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンを含む。好ましくはR³は、C₁₀-C₁₆ アルキルであり、及びR⁴はメチル、エチル又はイソプロピルである。特に好ましいのは、R³がC₁₀-C₁₆ アルキルであるメチルスルホン酸エステル塩である。

他の適当な陰イオン界面活性剤は、式ROSO₃M（式中、R は好ましくはC₁₀-C₂₄ ヒドロカルビル、好ましくはアルキル又はC₁₀-C₂₀ アルキル部分を有するヒドロキシアルキル、より好ましくはC₁₂-C₁₈ のアルキル又はヒドロキシアルキルであり、かつMはH又は陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン（例えばナトリウム、カリウム、リチウムである）、又はアンモニウム又は置換されたアンモニウム（例えばメチル−、ジメチル−、及びトリメチル−アンモニウム陽イオン、並びにテトラメチルアンモニウムのような4級アンモニウム陽イオン、及びジメチルピペリジニウム陽イオン、並びにエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、及びそれらの混合物のようなアルキルアミンに由来する4級アンモニウム陽イオンなどである。）である。）を有する、水溶性の塩又は酸である硫酸アルキル塩界面活性剤を含む。典型的には、低い洗濯温度（例えば50℃以下）のためには、C₁₂-C₁₆のアルキル鎖が好ましく、高い洗濯温度（例えば50℃以上）のためにはC₁₆-C₁₈アルキル鎖が好ましい。

洗浄性(detersive)の目的のために有用な他の陰イオン界面活性剤を、本発明の洗濯洗剤組成物に含むことができる。これらは、石鹸の塩（例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、並びにモノ−、ジ−及びトリ−エタノールアミン塩のような置換されたアンモニウム塩を含む）、C₈-C₂₂の1級又は2級アルカンスルホン酸塩、C₈-C₂₄オレフィンスルホン酸塩、アルカリ土類金属のクエン酸塩の熱分解された生成物のスルホン化によって調製されたスルホン化されたポリカルボン酸、例えば英国特許第1,082,179号に開示されたC₈-C₂₄アルキルポリグリコールエーテル硫酸塩（最大10モルのエチレンオキシドを含む）；アルキルグリセロールスルホン酸塩、脂肪族アシルグリセロールスルホン酸塩、脂肪族オレイルグリセロール硫酸塩、エチレンオキシドエーテル硫酸アルキルフェノール塩、パラフィンスルホン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アシルイセチオン酸塩のようなイセチオン酸塩、N-アシルタウレート、アルキルスクシナメート及びスルホスクシネート、スルホスクシネートのモノエステル（特に飽和又は不飽和のC₁₂-C₁₈モノエステル）及びスルホスクシネートのジエステル（特に飽和又は不飽和のC₆-C₁₂ジエステル）、アシルサルコシネート、アルキルポリサッカリドの硫酸塩、例えばアルキルポリグリコシドの硫酸塩（下記に記された非イオン性の硫酸化されない化合物）、分枝した1級アルキル硫酸塩、並びに下記式のようなアルキルポリエトキシカルボン酸塩：RO(CH₂CH₂O)_k-CH₂COO-M+（式中、RはC₈-C₂₂アルキルであり、kは1〜10の整数であり、Mは可溶性の塩を形成する陽イオンである。）である。樹脂酸及び水素化された樹脂酸も適していて、例としては、ロジン、水素化されたロジン、及びタール油の中に存在する又はそれに由来する樹脂酸及び水素化された樹脂酸である。

アルキルベンゼンスルホン酸塩が非常に好ましい。特に好ましいのは、アルキル基が10〜18個の炭素原子を含むことが好ましい、鎖状（直鎖）アルキルベンゼンスルホン酸塩(LAS)である。

更なる例は、「界面活性剤及び洗剤(Surface Active Agents and Detergents)」（I及びII巻、Schwartz、Perrry and Berch）に記されている。このような界面活性剤の多様性は、一般に米国特許第3,929,678号(23段58行から29段23行、これは参照として本願明細書に組入れられている)に開示されている。

ここに含まれるように、本発明の洗濯洗剤組成物は、典型的にはこのような陰イオン界面活性剤を、約1重量％〜約40重量％、好ましくは約3重量％〜約20重量％含む。

本発明の洗濯洗剤組成物は、同じく陽イオン、両性、双性及び半極性界面活性剤を含み、更には非イオン及び／又は既にここに記した以外の陰イオン界面活性剤も含む。

本発明の洗濯洗剤組成物において使用するために適している洗浄性の陽イオン界面活性剤は、1個の長鎖のヒドロカルビル基を有するものである。このような陽イオン界面活性剤の例は、ハロゲン化アルキルトリメチルアンモニウムのようなアンモニウム界面活性剤を含み、かつこれらの界面活性剤は下記の式を有する：[R²(OR³)_y][R⁴(OR³)_y]₂R⁵N+X-（式中、R²はアルキル又はアルキル鎖に約8〜約18個の炭素原子を有するアルキベンジル基であり、各R³は、-CH₂CH₂-、-CH₂CH(CH₃)-、-CH₂CH(CH₂OH)-、-CH₂CH₂CH₂-、及びそれらの混合物からなる群より選択され；各R⁴は、C₁-C₄アルキル、C₁-C₄ヒドロキシアルキル、2個のR⁴基が一緒になって形成されるベンジル環構造、-CH₂CHOHCHOHCOR⁶CHOHCH₂OH-、（式中R⁶は、いずれかの分子量約1000未満であるヘキソース又はヘキソースポリマーである。）、並びにyが0でない場合は水素である；R⁵は、R⁴と同じであるか、もしくはアルキル鎖であり、ここで、R²＋R⁵の合計の炭素原子数は、約18より大きく；各yは、0〜約10であり、かつy値の合計は、0〜約15であり；かつXは、いずれか共存できる陰イオンである。）。
非常に好ましい陽イオン界面活性剤は、下記式を有する本組成物において有用な水に可溶性の4級アンモニウム化合物である：R₁R₂R₃R₄N+X-(i)（式中、R₁は、C₈-C₁₆アルキルであり、各R₂、R₃及びR₄は、各々独立して、C₁-C₄アルキル、C₁-C₄ヒドロキシアルキル、ベンジル、及び-(C₂H₄0)xH（式中、xは、2〜5の値である。）、並びにXは陰イオンである。）。１を超えないR₂、R₃及びR₄が、ベンジルでなければならない。

好ましいR₁のアルキル鎖の長さは、C₁₂-C₁₅であり、特にここではアルキル基は、ココナッツ又はパームの仁の脂肪に由来する鎖長の混合物であるか、オレフィン製造もしくはオキソアルコール合成により合成されたものである。

好ましいR₂、R₃及びR₄基は、メチル及びヒドロキシエチル基であり、陰イオンXは、ハロゲン化物、メト硫酸イオン、酢酸イオン、及びリン酸イオンから選択することができる。

ここで使用するのに適した式(i)を有する4級アンモニウム化合物の例は、以下である：ココナッツトリメチル塩化又は臭化アンモニウム；
ココナッツメチルジヒドロキシエチル塩化又は臭化アンモニウム；
デシルトリエチル塩化アンモニウム；
デシルジメチルヒドロキシエチル塩化又は臭化アンモニウム；
C_12-15ジメチルヒドロキシエチル塩化又は臭化アンモニウム；
ココナッツジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はブロミド；
ミリスチルトリメチルメチル硫酸アンモニウム；
ラウリルジメチルベンジル塩化又は臭化アンモニウム；
ラウリルジメチル（エテノキシ）₄塩化又は臭化アンモニウム；
塩素エステル（式(i)の化合物であって、R₁が：

であり、並びにR₂、R₃及びR₄がメチルであるもの。）、ジ−アルキルイミダゾリン[式(i)の化合物]である。

ここで有用な他の陽イオン界面活性剤も、米国特許第4,228,044号及び欧州特許第000224号に開示されている。

ここに含まれる場合は、本発明の洗濯洗剤組成物は、典型的にはこのような陽イオン界面活性剤を、0.2重量％〜約25重量％、好ましくは約1重量％〜約8重量％含有する。

両性界面活性剤も、本発明の洗濯洗剤組成物における使用に適している。これらの界面活性剤は、2級もしくは3級アミンの脂肪族誘導体、又は脂肪族残基が直鎖もしくは分枝鎖であるようなヘテロ環式の2級もしくは3級アミンの脂肪族誘導体として広範に記されている。脂肪族置換基のひとつは、少なくとも約8個の炭素原子を、典型的には約8〜約18個の炭素原子を含み、かつ少なくとも1個は陰イオン性の水溶性基、例えばカルボキシル基、スルホン酸基、硫酸基を含む。両性界面活性剤の例については、米国特許第3,929,678号（19段18-35行）を参照のこと。

ここに含まれる場合は、本発明の洗濯洗剤組成物は、このような両性界面活性剤を、典型的には0.2重量％〜約15重量％、好ましくは約1重量％〜約10重量％含有する。

双性イオン界面活性剤も、洗濯洗剤組成物における使用に適している。これらの界面活性剤は、2級もしくは3級アミンの誘導体、ヘテロ環式の2級もしくは3級アミンの誘導体、又は4級アンモニウム誘導体、4級ホスホニウム又は3級スルホニウム化合物として広範に記されている。双性イオン界面活性剤については、米国特許第3,929,678号（19段38行から22段48行）を参照のこと。

ここに含まれる場合は、本発明の洗濯洗剤組成物は、このような双性イオン界面活性剤を、典型的には0.2重量％〜約15重量％、好ましくは約1重量％〜約10重量％含む。

半極性非イオン界面活性剤は、非イオン界面活性剤の特殊な範疇であり、これは約10〜約18個の炭素原子のアルキル部分を1個、並びに約1〜約3個の炭素原子を有するアルキル基及びヒドロキシアルキル基からなる群から選択される2個の部分を有する、水溶性アミンオキシド；約10〜約18個の炭素原子のアルキル部分を1個、並びに約1〜約3個の炭素原子を有するアルキル基及びヒドロキシアルキル基からなる群から選択される2個の部分を有する、水溶性ホスフィンオキシド；及び、約10〜約18個の炭素原子のアルキル部分を1個、並びに約1〜約3個の炭素原子を有するアルキル基及びヒドロキシアルキル基からなる群から選択される2個の部分を有する、水溶性スルホキシドを含んでいる。
半極性非イオン洗剤用界面活性剤は下記式を有するアミンオキシド界面活性剤を含む：

（式中、R³は、約8個〜約22個の炭素原子を有するアルキル、ヒドロキシアルキル、もしくはアルキルフェニル基、又はそれらの混合物であり；R⁴は、約2〜約3個の炭素原子を有するアルキレンもしくはヒドロキシアルキレン基、又はそれらの混合物であり；xはO〜約3であり；かつ各R⁵は、約1〜約3個の炭素原子を有するアルキルもしくはヒドロキシアルキル基、又は約1〜約3個のエチレンオキシド基を有するポリエチレンオキシド基である。）。このR⁵基は、例えば酸素又は窒素原子を介して、互いに結合し、環構造を形成することができる。

これらのアミンオキシド界面活性剤は、特にC₁₀-C₁₈アルキルジメチルアミンオキシド及びC₈-C₁₂アルコキシエチルジヒドロキシエチルアミンオキシドを含む。

ここに含まれる場合は、本発明の洗濯洗剤組成物は、半極性非イオン界面活性剤を、典型的には0.2重量％〜約15重量％、好ましくは約1重量％〜約10重量％含んでいる。

ビルダーシステム
本発明の組成物は、更にビルダーシステムを含む。アルミノケイ酸塩物質、ケイ酸塩、ポリカルボキシレートおよび脂肪酸、エチレンジアミン四酢酸のような物質、アミノポリホスホン酸のような金属イオン封鎖剤を含むいずれかの従来のビルダーシステムが、ここで使用するために適していて、特にエチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸及びジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸が適している。リン酸塩ビルダーは、明らかに環境に関する理由により減らすことが好ましいが、ここでは同様に使用することができる。

適当なビルダーは、無機イオン交換物質であり、通常無機の水和されたアルミノケイ酸塩物質であり、より好ましくは水和された合成ゼオライト、例えば水和されたゼオライトA、X、B、HS又はMAPであることができる。

別の適当な無機ビルダー物質は、層状のケイ酸塩、例えばSKS-6（ヘキスト社）であることができる。SKS-6は、ケイ酸ナトリウム(Na₂Si₂O₅)からなる結晶質の層状ケイ酸塩である。

1個のカルボキシル基を含む適当な、ポリカルボン酸塩は、ベルギー国特許第831,368号、第821,369号及び第821,370号に開示されているような、乳酸、グリコール酸及びそれらのエーテル誘導体である。2個のカルボキシル基を含むポリカルボン酸塩は、コハク酸、マロン酸、（エチレンジオキシ）二酢酸、マレイン酸、ジグリコール酸、酒石酸、タルトロン酸、フマル酸の水溶性の塩、更には独国特許（German Offenle-enschrift）第2,446,686号及び第2,446,487号、米国特許第3,935,257号に開示されたエーテルカルボン酸塩、並びにベルギー国特許第840,623号に開示されたスルフィニルカルボン酸塩を含む。3個のカルボキシル基を含むポリカルボン酸塩は、特に水溶性クエン酸、アコニット酸、及びシトラコン酸、更にはコハク酸誘導体を含み、例えば英国特許第1,379,241号に開示されたカルボキシメチルオキシコハク酸塩、オランダ国特許出願第7205873号に開示されたラクトキシコハク酸塩、並びに英国特許第1,387,447号に開示された2-オキサ-1,1,3-プロパントリカルボン酸塩のようなオキシポリカルボン酸塩物質である。

4個のカルボキシル基を含むポリカルボン酸塩には、英国特許1,261,829号に開示されたオキシジコハク酸塩が挙げられ、スルホ置換基を含む1,1,2,2,-エタンテトラカルボン酸塩、1,1,3,3-プロパンテトラカルボン酸塩には英国特許第l,398,421号及び第1,398,422号並びに米国特許第3,936,448号に開示されたスルホンコハク酸誘導体が挙げられ、そしてスルホン化された熱分解されたクエン酸は英国特許第1,082,179号に開示され、同時にホスホン置換基を含むポリカルボン酸塩は英国特許第1,439,000号に開示されている。

脂環式及びヘテロ環式ポリカルボン酸塩は、シクロペンタン-シス,シス,シス-テトラカルボン酸塩、シクロペンタジエニドペンタカルボン酸塩、2,3,4,5-テトラヒドロフラン-シス,シス,シス-テトラカルボン酸塩、2,5-テトラヒドロ-フラン-シス-ジカルボン酸塩、2,2,5,5,-テトラヒドロフラン-テトラカルボン酸塩、1,2,3,4,5,6-ヘキサン-ヘキサカルボン酸塩、並びにソルビトール、マンニトール及びキシリトールのような多価アルコールのカルボキシメチル誘導体である。芳香族ポリカルボン酸塩は、英国特許第1,425,343号に開示されているようなメリト酸、ピロメリト酸、及びフタル酸誘導体である。

前述のように、好ましいポリカルボン酸塩は、1分子につき最高3個のカルボキシル基を含むヒドロキシ−カルボン酸塩、より好ましくはクエン酸塩である。

本発明の組成物において使用するための好ましいビルダーシステムは、ゼオライトAのような水に不溶性のアルミノケイ酸塩ビルダー及び層状ケイ酸塩(SKS-6)、並びに例えばクエン酸のような水溶性カルボン酸塩キレート剤の混合物を含む。

本発明の洗剤組成物に含まれるのに適したキレート剤は、エチレンジアミン-N,N'-ジコハク酸(EDDS)、又はそれらのアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、もしくは置換したアンモニウムの塩、又はそれらの混合物である。好ましいEDDS化合物は、遊離の酸の形、及びそれらのナトリウム又はマグネシウムの塩である。このような好ましいEDDSのナトリウム塩の例は、Na₂EDDS及びNa₄EDDSを含む。このような好ましいEDDSのマグネシウム塩の例は、MgEDDS及びMg₂EDDSを含む。マグネシウム塩が本発明の組成物に含むには最も好ましい。

好ましいビルダーシステムは、ゼオライトAのような水に不溶性のアルミノケイ酸塩ビルダー、及びクエン酸のような水溶性のカルボン酸塩キレート剤の混合物を含む。

顆粒状の組成物において使用するためのビルダーシステムの一部を形成することができる他のビルダー物質は、例えばアルカリ金属の炭酸塩、二炭酸塩、ケイ酸塩のような無機物質、及び有機ホスホン酸塩、アミノポリアルキレンホスホン酸塩及びアミノポリカルボン酸塩のような有機物質を含む。

他の適当な水溶性有機塩は、ホモ−又はコ−ポリマー酸又はそれらの塩であり、ここでポリカルボン酸は、互いに2個を超えない炭素原子で隔てられた形の少なくとも2個のカルボキシルラジカルを含む。

この種のポリマーは、英国特許第GB-A-1,596,756号に開示されている。このような塩の例は、分子量が2000〜5000のポリアクリレート、及びそれらの無水マレイン酸とのコポリマーであり、このようなコポリマーは、分子量20,000〜70,OOO、特に約40,000を有する。

洗浄力のあるビルダー塩は、通常該組成物の5重量％〜80重量％の量で含まれる。液体洗剤のための好ましいビルダーのレベルは、5％〜30％である。

酵素
好ましい洗剤組成物は、本発明の酵素調製物に加え、クリーニング性能及び／又は繊維の保護の利点を提供する他の酵素（複数）を含む。

このような酵素は、他のプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ(cutinase)、アミラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ（例えばラッカーゼ）を含む。

プロテアーゼ：
アルカリ溶液中で使用するのに適したいずれか他のプロテアーゼを使用することができる。適当なプロテアーゼは、動物、植物又は微生物に由来するものを含む。微生物に由来するものが好ましい。化学的又は遺伝学的に修飾された突然変異体も含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、好ましくは微生物由来のアルカリ性プロテアーゼ又はトリプシン-様プロテアーゼであることができる。アルカリ性プロテアーゼの例は、ズブチリシンであり、特にバシラスに由来するもの、例えばズブチリシンNovo、ズブチリシンCarlsberg、ズブチリシン309、ズブチリシン147及びズブチリシン168（国際公開公報第89/06279号に開示されている）である。トリプシン-様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えばブタ又はウシに由来するもの）及び国際公開公報第89/06270号に開示されたフサリウムのプロテアーゼである。
好ましい市販されているプロテアーゼ酵素は、ノボ・ノルディスク社（デンマーク）から商標Alcalase、Savinase、Primase、Durazym、及びEsperaseで販売されているもの、ジェネンコル社から商標Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase、Purafect及びPurafect OXPで販売されているもの、並びにソルベイエンザイム社から商標Opticlean及びOptimaseで販売されているものである。プロテアーゼ酵素は、本発明に従って該組成物に混合することができ、該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.00001％〜2％のレベルで、好ましくは該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.0001％〜1％のレベルで、より好ましくは該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.001％〜0.5％のレベルで、更により好ましくは該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.01％〜0.2％のレベルで混合される。

リパーゼ：
アルカリ溶液中で使用するのに適したいずれかのリパーゼを使用することができる。適当なリパーゼは、細菌又は真菌に由来するものを含む。化学的又は遺伝学的に修飾された突然変異体も含まれる。

有用なリパーゼの例は、例えば欧州特許第258068号及び第305216号に開示されたフミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa) リパーゼ、例えば欧州特許第238 023 号に開示されたリゾムコル・ミエヘイ(Rhizomucor miehei) リパーゼ、C.アンタルクチカ(C.antarctica)リパーゼのようなカンジダリパーゼ、例えば欧州特許第214 761 号に開示されたC.アントラクチカ(C.antarctica)リパーゼA又はB、例えば欧州特許第218 272号に開示されたP.アルカリゲネス(P.alcaligenes)及びP.シュードアラカリゲネス(P.seudoalcaligenes)リパーゼのようなシュードモナスリパーゼ、例えば欧州特許第331 376 号に開示されたP.セパシア(P. cepacia)リパーゼ、英国特許第1,372,034 号に開示されたP.スタッテリ(P. stutzeri)リパーゼ、P.フルオレセンス(P. fluorescens)リパーゼ、バシラスリパーゼ、例としてB.サブチリス(B. subtilis)リパーゼ（Dartois ら、Biochemica et Biophysica acta 、1131:253-260(1993)）、B.ステアロセルモフィラス(B. stearothermophilus)リパーゼ（特開昭JP64/744992 号）、並びにB.プミラス(B.pumilus)リパーゼ（国際公開公報第91/16422号）である。

更に多くのクローン化されたリパーゼも有用であり、これはYamaguchi らの論文の（Gene、103:61-67(1991) ）ペニシリウム・カメンベルチ(Penicillium camembertii) リパーゼ、ゲオトリカム・カンジダム(Geotricum candidum)リパーゼ（Schimada,Y. ら、J. Biochem. 、106:383-388(1989) ）、及び様々なリゾーパス(Rhizopus)リパーゼ、例えばR.デレマー(R. delemar)リパーゼ(Hass, M.Jら、Gene、109:117-113(1991))、R.ニベウス(R. niveus) リパーゼ（Kugimiyaら、Biosci. Biotech. Biochem.、56:716-719(1992)）、並びにR.オリザエ(R.oryzae)リパーゼである。

クチナーゼのような他の種類の脂質分解酵素も有用であり、例えば国際公開公報第88/09367号に開示されたシュードモナス・メンドシナ (Pseudomonas mendocina) 由来のクチナーゼ、又はフサリウム・ソラニ・ピシ(Fusarium solani pisi)由来のクチナーゼ（例えば国際公開公報第90/09446号に開示されている）が有用である。

特に適当なリパーゼは、M1リパーゼ（登録商標）、Lumaファスト（登録商標）及びLipomax （登録商標）（ジェネンコル社) 、Lipolase（登録商標）及びLipolase Ultra（登録商標）（ノボ・ノルディスク社) 、並びにLipase P"Amano" （アマノ・ファーマソーティカル社(Amano Pharmaceutical Co. Ltd.) ）のようなリパーゼがある。

これらのリパーゼは通常、該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.00001％〜2％のレベルで、好ましくは該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.0001％〜1％のレベルで、より好ましくは該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.001％〜0.5％のレベルで、更により好ましくは該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.01％〜0.2％のレベルで洗剤組成物に混合される。

アミラーゼ：
アルカリ溶液中で使用するのに適したいずれかのアミラーゼ（α及び／又はβ）を使用することができる。適当なアミラーゼは、細菌又は真菌に由来するものを含む。化学的又は遺伝学的に修飾された突然変異体も含まれる。アミラーゼは、例えば、英国特許第1,296,839号に詳細に記されている、特定の菌株B.リシェニフォルミス(B. licheniformis)由来のα−アミラーゼを含む。市販アミラーゼは、Duramyl （登録商標）、Termamyl（登録商標）、Fungamyl（登録商標）及びBAN （登録商標）（ノボ・ノルディスク社から入手）、並びにRapidase（登録商標）及びMaxamyl P （登録商標）（ジェネンコル社から入手）がある。

これらのアミラーゼは通常、該組成物の重量に対し酵素タンパク質がO.OOOOl ％〜2 ％のレベルで、好ましくは該組成物の重量に対し酵素タンパク質がO.OOOl％〜1 ％のレベルで、より好ましくは該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.001 ％〜0.5 ％のレベルで、更により好ましくは該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.01％〜0.2 ％のレベルで、洗剤組成物に混合される。

セルラーゼ：
アルカリ溶液中で使用するのに適したいずれかのセルラーゼを使用することができる。適当なセルラーゼは、細菌又は真菌に由来するものを含む。化学的又は遺伝学的に修飾された突然変異体も含まれる。適当なセルラーゼは、米国特許第4,435,307 号に開示されており、これはフミコラ・インソレンス(Humicola insolens)が産生する真菌セルラーゼを明らかにしている。特に適したセルラーゼは、色を保護する長所を持つセルラーゼである。このようなセルラーゼの例は、欧州特許出願第O 495 257 号に記されている。

市販のセルラーゼは、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens) が産生するCelluzyme （登録商標）（ノボ・ノルディスク社) 、及びKAC-500(B)（登録商標）（花王社）がある。

セルラーゼは通常、該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.00001 ％〜2 ％のレベルで、好ましくは該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.0001％〜1 ％のレベルで、より好ましくは該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.001 ％〜0.5 ％のレベルで、更により好ましくは該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.01％〜0.2 ％のレベルで、洗剤組成物に混合される。

ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：
ペルオキシダーゼ酵素は、過酸化水素又はその供給源（例えば過炭酸塩、過ホウ酸塩、又は過硫酸塩）と共に使用される。オキシダーゼ酵素は、通常酸素と一緒に使用される。両方の型の酵素は、「液体漂白」のために使用され、すなわち染色された布地と他の布地を洗液の中で一緒に洗濯する場合の、染色された布地か ら他の布地への繊維の色移りを防止するために、好ましくは国際公開公報第94/12621号及び第95/01426号に開示されたような増強剤と共に、使用される。適当なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌又は真菌に由来するものである。化学的又は遺伝学的に修飾された突然変異体も含まれる。

ペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼ酵素は通常、該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.00001 ％〜2 ％のレベルで、好ましくは該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.0001％〜1 ％のレベルで、より好ましくは該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.001 ％〜0.5 ％のレベルで、更により好ましくは該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.01％〜0.2 ％のレベルで、洗剤組成物中に混合される。

前述の酵素の混合物、特にプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ及び／又はセルラーゼの混合物も本願明細書に包含される。

本発明の酵素、又は洗剤組成物に混合された他の酵素は、通常、該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.00001 ％〜2 ％のレベルで、好ましくは該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.0001％〜1 ％のレベルで、より好ましくは該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.001 ％〜0.5 ％のレベルで、更により好ましくは該組成物の重量に対し酵素タンパク質が0.01％〜0.2 ％のレベルで、洗剤組成物中に混合される。

漂白剤：
本発明の洗剤組成物中に含むことができる追加の任意の洗剤成分は、漂白剤、例えばPB1、PB4及び粒度が400-800μmの過炭酸塩を含む。これらの漂白剤成分は、1種以上の酸素系漂白剤及び、選択された漂白剤に応じて1種以上の漂白活性化剤を含むことができる。酸素系漂白剤化合物が存在する場合は、典型的には約1％〜約25％のレベルで存在する。一般に漂白剤化合物は、例えば顆粒状洗剤のような、液体以外の配合物中の任意に添加された成分である。

ここで使用するための漂白剤成分は、酸素系漂白剤、更には当該技術分野において公知の他のものを含む洗剤組成物に有用ないずれかの漂白剤である。

本発明に適した漂白剤は活性化された又は活性化されない漂白剤であることができる。

使用することができる酸素系漂白剤のある範疇は、ペルカルボン酸漂白剤及びそれらの塩を包含している。この種の物質の適当な例は、モノペルオキシフタル酸 マグネシウム・6 水和物、メタ−クロロペル安息香酸、4-ノニルアミノ-4- オキソペルオキシ酪酸及びジペルオキシドデカンジオン酸(dioic acid)のマグネシウム塩を含む。このような漂白剤は、米国特許第4,483,781 号、第740,446 号、欧州特許第O 133 354 号及び米国特許第4,412,934 号に開示されている。更に非常に好ましい漂白剤は、米国特許第4,634,551 号に開示された、6-ノニルアミノ-6- オキソペルオキシカプロン酸を含む。

別の使用することができる漂白剤の範疇は、ハロゲン系漂白剤を包含している。ハロゲンオキソ酸(hypohalite)漂白剤の例は、トリクロロイソシア ヌル酸、及びジクロロイソシアヌル酸のナトリウム又はカリウム塩、及びN-クロロ及びN-ブロモアルカンスルホンアミドを含む。このような物質は、通常、 最終生成物の0.5 〜10重量％で、好ましくは1 〜5 重量％で添加される。

過酸化水素を放出する物質を、漂白活性化剤と一緒に使用することができ、例としてテトラ−アセチルエチレンジアミン(TAED)、ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩(NOBS、米国特許第4,412,934号に開示されている)、3,5-トリメチル- ヘキサノールオキシベンゼンスルホン酸塩(ISONOBS、欧州特許第120 591 号に開示されている)、又はペンタアセチルグルコース(PAG)があり、これらは過加水分解され(perhydrolyzed)、活性漂白種としての過酸を生成し、改善された漂白効果をもたらす。更に非常に適しているのは、漂白活性化剤C₈(6-オクタンアミド−カプロイル）オキシベンゼン−スルホン酸塩、C₉（6-ノナンアミド−カプロイル）オキシベンゼンスルホン酸塩、及びC₁₀ （6-デカンアミド−カプロイル）オキシベンゼンスルホン酸塩又はそれらの混合物である。いずれか適当な活性化剤は、欧州特許出願第91870207.7号に開示されているようなアシル化されたクエン酸エステルである。

本発明のクリーニング組成物において使用するためのペルオキシ酸並びに漂白活性化剤及び過酸素漂白化合物を含有する漂白システムを含む有用な漂白剤は、米国特許出願逐次番号第USSN 08/136,626 号に開示されている。

更に過酸化水素は、洗浄及び／又はすすぎの工程の始め又はその期間中に過酸化水素を発生することが可能であるような酵素システム（すなわち酵素及びその基質）に添加することによって存在することもできる。このような酵素システムは、欧州特許出願第O537381号に開示されている。

酸素系漂白剤以外の漂白剤も、当該技術分野において公知であり、かつここで使用することができる。特に興味深い非酸素系漂白剤のひとつの型は、例えばスルホン化されたフタロシアニン亜鉛及び／又はフタロシアニンアルミニウムのような、光により活性化される漂白剤である。これらの物質は、洗浄工程の間に基質に付着することができる。乾かすために衣類を日光の下に干すというような、酸素が存在する状態で光が照射される際には、スルホン化されたフタロシアニン亜鉛が活性化され、その結果該基質が漂白される。好ましいフタロシアニン亜鉛及び光で活性化される漂白工程は、米国特許第4,033,718号に開示されている。典型的には、洗剤組成物は、スルホン化されたフタロシアニン亜鉛を約0.025重量％〜約1.25重量％含有する。

更に漂白剤は、マンガン触媒を含むことができる。マンガン触媒は、例えば「低温漂白のための効果的なマンガン触媒」（Nature、369、1994年、637-639頁）に記された化合物の1種であることができる。

泡抑制剤：
他の任意の成分は、泡抑制剤であり、例としてシリコン、及びシリカ−シリコン混合物が挙げられる。シリコンは一般に、アルキル化されたポリシロキサン物質で代表されるのに対して、シリカは、通常シリカエーロゲル及びキセロゲル及び様々な形の疎水性シリカで代表とされる細かく粉砕された形状で使用される。こ れらの物質は、粒子として混合することができ、その中で泡抑制剤が、有利なことに、水溶性又は水分散性、実質的には表面が不活性の(non surface-active)洗剤の不吸収(impermeable)担体中に放出されるように混合される。あるいは、この泡抑制剤は、液体担体中に溶解又は分散することができ、かつ1種以上の他の成分の表面に噴霧することによって適用することができる。
好ましいシリコン泡制御剤は、米国特許第3,933,672 号に開示されている。他の特に有用な泡抑制剤は、独国特許出願第DTOS 2,646,126号に開示された自己乳化するシリコン泡抑制剤である。このような化合物の例は、ダウコーニング社(Dow Corning)から市販されているDC-544であり、これはシロキサン−グリコールコポリマーである。特に好ましい泡制御剤は、シリコン油及び2-アルキル- アルカノールの混合物を含有する泡抑制システムである。適当な2-アルキル- アルカノールは、商標Isofol 12 Rで販売されている2-ブチル- オクタノールである。

このような泡抑制剤システムは、欧州特許出願第O 593 841 号に開示されている。

特に好ましいシリコン泡制御剤は、欧州特許出願第92201649.8号に開示されている。この組成物は、Aerosil（登録商標）のような多孔質でないヒュームドシリカと組合せたシリコン／シリカ混合物を含むことができる。

前述の泡抑制剤は通常、組成物の0.001重量％〜2重量％のレベルで、好ましくは0.01重量％〜1重量％で使用される。

他の成分：
洗剤組成物中で使用される他の成分は、汚れ−懸濁剤(soil-suspending agent) 、汚れ−剥離剤(soil-releasing agent)、光学的増白剤、研磨剤、殺菌剤、曇り(tarnish) 防止剤、着色剤、及び／又はカプセル封入された又は封入されていない香料である。

特に適したカプセル封入物質は、例えば英国特許第1,464,616 号に開示されているような、多糖類及びポリヒドロキシ化合物のマトリックスからなる水溶性カプセルがある。

他の適当な水溶性のカプセル封入物質は、米国特許第3,455,838号に開示されているような、置換されたジカルボン酸のゼラチン化されていないスターチ酸エステルに由来するデキストリンを含む。この酸−エステルデキストリンは、ロウ質トウモロコシ、ロウ質モロコシ、サゴ、タピオカ及びジャガイモのようなデンプンから調製されるのが好ましい。該カプセル封入物質の適当な例は、ナショナル・スターチ社(National Starch)が製造したN-Lokを含む。N-Lokカプセル封入物質は、修飾されたトウモロコシデンプン及びグルコースからなる。デンプンは、オクテニル無水コハク酸のような一官能性置換基を付加することによって修飾される。

ここで適した再沈着防止剤及びよごれ懸濁剤は、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロースのようなセルロース誘導体、並びにホモ−又はコ−ポリマー性ポリカルボン酸又はそれらの塩を含む。この種のポリマーは、先にビルダーとして言及したポリアクリレート及び無水マレイン酸−アクリル酸コポリマー、更には無水マレイン酸のエチレン、メチルビニルエーテル又はメタクリル酸とのコポリマーであり、この無水マレイン酸は該コポリマーの少なくとも20モル％を構成している。これらの物質は通常、該組成物のO.5重量％〜10重量％、より好ましくは0.75重量％〜8重量％、最も好ましくは1重量％〜6重量％のレベルで使用される。

好ましい光学的増白剤は、陰イオンの特徴があり、例えば、4,4-ビス-(2-ジエタノールアミノ-4-アニリノ-s-トリアジン-6-イルアミノ)スチルベン-2:2'-ジスルホン酸二ナトリウム、4,-4'-ビス-(2-モルホリノ-4-アニリノ-s-トリアジン-6-イルアミノ-スチルベン-2:2'-ジスルホン酸二ナトリウム、4,4'-ビス-(2,4-ジアニリノ-s-トリアジン-6-イルアミノ)スチルベン-2:2'-ジスルホン酸二ナトリウム、4',4"-ビス-(2,4-ジアニリノ-s-トリアジン-6-イルアミノ)スチルベン-2-スルホン酸ナトリウム、4,4'-ビス-(2-アニリノ-4-(N-メチル-N-2-ヒドロキシエチルアミノ)-s-トリアジン-6-イルアミノ)スチルベン-2,2-ジスルホン酸二ナトリウム、4,4'-ビス-(4-フェニル-2,1,3-トリアゾール-2-イル)-スチルベン-2,2'-ジスルホン酸二ナトリウム、4,4'-ビス(2-アニリノ-4-(1-メチル-2-ヒドロキシエチルアミノ)-s-トリアジン-6-イルアミノ)スチルベン-2,2'-ジスルホン酸二ナトリウム、2(スチルビル-4"-（ナフト-1',2':4,5)-1,2,3-トリアゾール-2"-スルホン酸ナトリウム、及び4,4'-ビス(2-スルホスチリル)ビフェニルがある。他の有用なポリマー物質は、ポリエチレングリコール、特に分子量が1000〜10000、より特には2000〜8000、及び最も好ましくは約4000のものである。これらは、0.20重量％〜5重量％で、より好ましくは0.25重量％〜2.5重量％のレベルで使用される。これらのポリマー及び前述のホモ−又はコ−ポリマー性のポリカルボン酸塩は、遷移金属不純物が存在する場合の、白さの維持、繊維への灰分付着(fabric ash deposition) 、並びにクレー、タンパク質及び酸化できるよごれにおけるクリーニング性能を改善するために価値がある。

本発明の組成物において有用なよごれ剥離剤は、テレフタル酸のエチレングリコール及び／又はプロピレングリコールユニットとの様々な配置での常用のコポリ マー又はターポリマーである。このようなポリマーの例は、米国特許第4,116,885 号及び第4,711,730 号、並びに欧州特許第0 272 033 号に開示されている。特に好ましいポリマーは、欧州特許第0 272 033 号に開示された、下記式を有するものである：

（式中、PEG は-(OC₂H₄)O-であり、POは(OC₃H₆O)であり、T は(pOOC₆H₄CO) である。）。

更に非常に有用なものは、ジメチルテレフタレート、ジメチルスルホイソフタレート、エチレングリコール及び1,2-プロパンジオールのランダムコポリマー としての修飾されたポリエステルであり、その末端基は、第一にスルホベンゾエート及び第二にエチレングリコール及び／又は1,2-プロパンジオールのモノ エステルを含む。この目的は、両端がスルホベンゾエート基でキャップされたポリマーを得ることであり、該コポリマーほとんどに関して「第一に」は、スルホ ベンゾエート基でキャップされている。しかし、一部のコポリマーは、完全にキャップされるのではなく、従ってそれらの末端基は、エチレングリコール及び／ 又は1,2-プロパンジオールのモノエステルからなり、これらはこのような「第二」の種を構成している。

ここで選択されたポリエステルは、ジメチルテレフタル酸を約46重量％、1,2-プロパンジオールを約16重量％、エチレングリコールを約10重量％、ジ メチルスルホ安息香酸を約13重量％、及びスルホイソフタル酸を約15重量％含み、かつ分子量が約3000である。このポリエステル及びそれらの生成法は、欧州特許第311342号に詳細に開示されている。

柔軟剤：
繊維柔軟剤も、本発明の洗濯洗剤組成物に 混合することができる。これらの物質は、無機又は有機の形であることができる。無機柔軟剤は、例えば英国特許公開第A1 400898 号及び米国特許第5,019,292 号に開示されている、スメクチッククレーである。有機の繊維柔軟剤は、英国特許公開第A1 514 276号及び欧州特許第0 011 340号に開示されている水に不溶性の3級アミン、及び欧州特許第B-O 026 528号に開示されているそれらのモノC₁₂-C₁₄ の4級アンモニウム塩との組合せ、並びに欧州特許0 242 919号に開示されている長鎖ジアミド(dilong chain amide)がある。他の有用な繊維柔軟剤システムの有機成分は、英国特許第0 299 575号及び第O 313 146号に開示されている高分子量のポリエチレンオキシド物質である。

スメクチッククレーのレベルは通常、5重量％〜15重量％、より好ましくは8重量％〜12重量％であり、この物質は、配合物の残りに対し乾燥した混合成分として添加される。水に不溶性の3級アミン又は長鎖のジアミド物質のような有機の繊維柔軟剤は、0.5重量％〜5重量％、通常は1重量％〜3重量％で混合されるのに対して、高分子量のポリエチレンオキシド物質及び水溶性陽イオン物質は、0.1重量％〜2重量％、通常は0.15重量％〜1.5重量％のレベルで添加される。これらの物質は、通常該組成物の噴霧乾燥された部分に添加されるが、一部の場合では、より簡便に、乾燥混合された粒子としてそれに添加されるか、もしくは、該組成物の他の固形成分上に溶融した液体として噴霧される。

ポリマー性色移り防止剤：
本発明の洗剤組成物は、更にポリマー性色移り防止剤(dye-transferinhibitingagent)を、0.001重量％〜10重量％、好ましくは0.01重量％〜2重量％、より好ましくは0.05重量％〜1重量％含むことができる。該ポリマー性色移り防止剤は、通常染色された繊維からそれと一緒に洗濯する繊維への染料の移りを防止するために洗剤組成物に混合される。これらのポリマーは、染料が洗濯物の中の他の商品を攻撃し始めるようになる前に、染色された繊維から洗濯によって放出される不堅牢(fugitive)染料を錯化又は吸着する能力を有する。

ポリマー性色移り防止剤として特に適しているのは、ポリアミンN-オキシドポリマー、N-ビニル- ピロリドン及びN-ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール、又はそれらの混合物である。

このようなポリマーの添加は、更に本発明の酵素の性能を増強する。

本発明の洗剤組成物は、液体、ペースト、ゲル、棒状又は顆粒状であることができる。

非−粉体(non-dusting)顆粒は、例えば米国特許第4,106,991号及び第4,661,452号（両方ともノボ・インダストリー社）に開示されたように製造することができ、かつ任意に当該技術分野において公知の方法で被覆することができる。ワックス状コーティング物質の例は、平均分子量が1000〜20000であるポリ（エチレンオキシド)生成物（ポリエチレン−グリコール、PEG）；16〜50個のエチレンオキシドユニットを有するエトキシル化されたノニルフェノール；アルコールが12〜20個の炭素原子を有し、かつ15〜80個のエチレンオキシドユニットが存在するエトキシル化された脂肪族アルコール；脂肪族アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ-及びジ-及びトリ-グリセリドである。流動床法によって塗布するのに適した被膜形成コーティング物質の例は、英国特許1483591号に開示されている。

本発明の顆粒組成物は、更に「圧密型」、すなわち、従来の顆粒洗剤よりも比較的高い密度、つまり550〜950g/Lであることができ；このような場合は、本発明の顆粒状洗剤組成物は、従来の顆粒状洗剤と比べて少ない量の「無機充填剤塩(inorganic filler salt) 」を含有し；典型的な充填剤塩は、アルカリ土類金属の硫酸塩又は塩化物であり、典型的には硫酸ナトリウムであり；「圧密型」洗剤は典型的には10％以下の充填剤塩を含有する。本発明の液体組成物も「濃縮型」であることができ、この場合、本発明の液体洗剤組成物は、従来の液体洗剤よりも少ない量の水を含有するであろう。典型的には、濃縮された液体洗剤の含水量は、洗剤組成物の30重量％未満、より好ましくは20重量％未満、最も好ましくは10重量％未満である。

本発明の組成物は、例えば、洗濯用の添加剤組成物及びしみのついた繊維の予備処理で使用するのに適した組成物を含有する手洗い用及び洗濯機用の洗剤組成物、すすぎ時に添加される繊維柔軟剤、及び一般的な家庭用の硬質表面のクリーニング操作及び皿洗い操作に使用するための組成物として配合することができる。

下記の実施例は、本発明の組成物を例示することを意図するが、本発明の範囲を制限さもなければ定義することを必ずしも意図するものではない。

洗剤組成物において、略記された成分の定義は以下のようなものである：
LAS：直鎖状C₁₂アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム
TAS：獣脂アルキル硫酸ナトリウム
XYAS：C_1X-C_1Yアルキル硫酸ナトリウム
SS：2-ブチルオクタン酸が配合された2級(secondary)セッケン界面活性剤
25EY：平均Yモルのエチレンオキシドで縮合されたC₁₂-C₁₅の主に直鎖状1級アルコール
45EY：平均Yモルのエチレンオキシドで縮合されたC₁₄-C₁₅の主に直鎖状1級アルコール
XYEZS：1モル当たり平均Zモルのエチレンオキシドで縮合されたC_1X-C_1Yアルキル硫酸ナトリウム
非イオン性：C₁₃-C₁₅混合エトキシ化／プロポキシ化された脂肪族アルコールで、平均のエトキシ化の程度が3.8でありかつ平均のプロポキシ化の程度が4.5である、商標Plurafax LF404でBASF社より販売されているもの
CFAA：C₁₂-C₁₄ アルキルN-メチルグルカミド
TFAA：C₁₆-C₁₈ アルキルN-メチルグルカミド
ケイ酸塩：非晶質ケイ酸ナトリウム（SiO₂:Na₂O比＝2.O）
NaSKS-6：式δ-Na₂Si₂O₅ の 晶質層状ケイ酸塩
炭酸塩：無水炭酸ナトリウム
リン酸塩：トリポリリン酸ナトリウム
MA/AA：1:4のマレイン酸／アクリル酸コポリマー、平均分子量約80000
ポリアクリレート：ポリアクリレートホモポリマー、平均分子量8000、商標PA30でBASF社より販売
ゼオライトA：水和されたアルミノケイ酸ナトリウム、式Na₁₂(AlO₂SiO₂)12・27H₂O、主な粒度は1 〜10μm
クエン酸塩：クエン酸三ナトリウム二水和物
クエン酸：クエン酸
過ホウ酸塩：無水過ホウ酸ナトリウム・一水和物の漂白剤、実験式NaBO₂・H₂O₂
PB₄：無水過ホウ酸ナトリウム・四水和物
過炭酸塩：無水過炭酸ナトリウム漂白剤、実験式2Na₂CO₃・3H₂O₂
TAED：テトラアセチルエチレンジアミン
CMC：カルボキシメチルセルロースナトリウム
DETPMP：ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸)、商標Dequest2060でモンサント社(Monsanto)から市販されている
PVP ：ポリビニルピロリドンポリマー
EDDS：エチレンジアミン-N,N'-ジコハク酸、ナトリウム塩の形の[S,S]異性体
抑泡剤：25％パラフィンワックス、融点50℃、17％疎水性シリカ、58％サプレッサーパラフィン油
顆粒状抑泡剤：12％シリコン／シリカ、18％ステアリルアルコール、70％サプレッサー：顆粒状デンプン
硫酸塩：無水硫酸ナトリウム
HMWPEO：高分子量のポリエチレンオキシド
TAE25：獣脂アルコールエトキシレート(25)

洗剤実施例Ｉ
本発明の繊維のクリーニング用の顆粒状組成物を下記のように調製した：
直鎖状C₁₂ アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム 6.5
硫酸ナトリウム 15.0
ゼオライトA 26.0
ニトリロ三酢酸ナトリウム 5.0
本発明の酵素 0.1
PVP 0.5
TAED 3.0
ホウ酸 4.0
過ホウ酸 18.0
フェノールスルホン酸塩 0.1
微量成分 100とする

洗剤実施例II
本発明の繊維クリーニング用の圧密型顆粒状組成物（密度800g/L）を下記のように調製した：
45AS 8.5
25E3S 2.0
25E5 3.0
25E3 3.0
TFAA 2.5
ゼオライトA 17.0
NaSKS-6 12.0
クエン酸 3.0
炭酸塩 7.0
MA/AA 5.0
CMC 0.4
本発明の酵素 0.1
TAED 6.0
過炭酸塩 22.0
EDDS 0.3
顆粒状泡抑制剤 3.5
水／微量成分 100 とする

洗剤実施例III
染色された繊維の洗濯において特に有用な、本発明の繊維クリーニング用の顆粒状組成物を下記のように調製した：
LAS 10.7 −
TAS 2.4 −
TFAA − 4.0
45AS 3.1 10.0
45E7 4.0 −
25E3S − 3.0
68E11 1.8 −
25E5 − 8.0
クエン酸塩 15.0 7.0
炭酸塩 − 10
クエン酸 2.5 3.0
ゼオライトA 32.1 25.0
Na-SKS-6 − 9.0
MA/AA 5.0 5.0
DETPMP 0.2 0.8
本発明の酵素 0.10 0.05
ケイ酸塩 2.5 −
硫酸塩 5.2 3.0
PVP 0.5 −
ポリ(4- ビニルピリジン)-N-オキシド／ビニルイミダゾール及びビニルピロリドンのコポリマー − 0.2
過ホウ酸塩 1.0 −
フェノールスルホン酸塩 0.2 −
水／微量成分 100％とする

洗剤実施例IV
「洗濯を通じて柔軟にする」能力を有する本発明の繊維クリーニング用の顆粒状組成物を下記のように調製した：
45AS − 10.0
LAS 7.6 −
68AS 1.3 −
45E7 4.0 −
25E3 − 5.0
ココ-アルキル-ジメチルヒドロキシ-エチル塩化アンモニウム 1.4 5.0
クエン酸塩 5.0 3.0
Na-SKS-6 − 11.0
ゼオライトA 15.0 15.0
MA/AA 4.0 4.0
DETPMP 0.4 0.4
過ホウ酸塩 15.0 −
過炭酸塩 − 15.0
TAED 5.0 5.0
スメチッククレー 10.0 10.0
HMWPEO − 0.1
本発明の酵素 0.10 0.05
ケイ酸塩 3.0 5.0
炭酸塩 10.0 10.0
顆粒状泡抑制剤 1.0 4.0
CMC 0.2 0.1
水／微量成分 100％とする

洗剤実施例Ｖ
本発明のヘビーデューティー繊維クリーニング用の液体組成物を下記のように調製した：
Ｉ II
LAS酸形態 − 25.0
クエン酸 5.0 2.0
25AS酸形態 8.0 −
25AE2S酸形態 3.0 −
25AE7 8.0 −
CFAA 5 −
DETPMP 1.0 1.0
脂肪酸 8 −
オレイン酸 − 1.0
エタノール 4.0 6.0
プロパンジオール 2.0 6.0
本発明の酵素 0.10 0.05
ココ-アルキルジメチルヒドロキシエチル塩化アンモニウム − 3.0
スメクチッククレー − 5.0
PVP 2.0 −
水／微量成分 100％とする

レザー産業への適用
本発明のサブチラーゼを、レザー産業において、特に皮の除毛において使用した。

この用途において、本発明のサブチラーゼ変異体は、更に他のプロテアーゼを含有する酵素組成物において使用するのが好ましい。

適当な他のプロテアーゼのより詳細な説明は、洗剤組成物において使用するのに適した酵素に関連するセクションを参照のこと（上記参照）。

ウール産業への適用
本発明のサブチラーゼは、ウール産業において、特にウールが入った衣類のクリーニングにおいて使用することができる。

この用途において、本発明のサブチラーゼ変異体は、更に他のプロテアーゼを含有する酵素組成物において使用するのが好ましい。

適当な他のプロテアーゼのより詳細説明は、洗剤組成物において使用するのに適した酵素に関連するセクションを参照のこと（上記参照）。

本発明は、請求される本発明の範囲を限定することはいかなる意味でも意図しない下記実施例において更に詳細に説明される。

材料及び方法
株：
B.サブチリス(B.subtilis)DN1885 (Diderichsen ら、1990) 。
B.レンタス(B.lentus)309 及び147は、バシラス・レンタスに特異的な菌株であり、NCIBに、寄託番号NCIB 10309及び10147として寄託されており、本願明細書に組入れられている米国特許第3,723,250 号に開示されている。

大腸菌MC 1000 （M.J. Casadaban及びS.N. Cohen、J. Mol. Biol.、138:179-207(1980) ）は、常法によりr^- 、 m⁺ として作出され、更に米国特許出願第039,298号に開示されている。

プラスミド：
pJS3：サブチラーゼ 309をコードしている合成遺伝子を含む大腸菌−B.サブチリスのシャトルベクター（Jacob Schiodt らの論文に記載、Protein and Peptide letters 、3:39-44(1996) ）。
pSX222：B.サブチリス発現ベクター（国際公開公報第96/34946号に開示）。

一般的な分子生物学的方法：
特に記さない限りは、DNA操作及び形質転換は、分子生物学の標準的方法を用いて行った（Sambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル」、コールドスプリングハーバーラ ボ、1989年、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク；Ausubel, F. M.らの編集、「分子生物学の最新のプロトコール」、John Wiley and Sons 、1995年； Harwood. C. R. 、Cutting, S. M.編集、「バシラスの分子生物学的方法」、John Wiley and Sons 、1990年）。

DNA操作のための酵素は、提供者の指示に従い使用した。

DNA操作のための酵素：
特に記さない限りは、例えば制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼはどのDNA 操作のための酵素は、ニュー・イングランド・バイオラボ社(New England Biolabs, Inc.) から入手した。

タンパク質分解活性：
本発明に関して、タンパク質分解活性は、キロNOVOプロテアーゼユニット(KNPU)として表現した。活性は、酵素標準(SAVINASE)と比較して測定し、かつ測定値は、標準的条件、すなわち、50℃、pH8.3、反応時間9分、測定時間3分で、の％タンパク質分解酵素による、ジメチルカゼイン(DMC) 溶液の消化を基にした。フォルダー(folder)AF 220/1は、ノボ・ノルディスク社（デンマーク）の求めに応じて利用され、このフォルダーは参照として本願明細書に含まれている。

GUは、基質としてN-アセチンカゼインを用い、標準条件下、15分間40℃でインキュベーションした場合に、グリシン1mmoleと等量のNH2-基の量を産生するタンパク質分解酵素活性として定義された、グリシンユニットである。

酵素活性は更に、Journal of American Oil Chemists Society（Rothgeb, T.M. 、Goodlander, B.D.、Garrison, P.H.及びSmith, L.A. 、1988年）に記載されている、可溶性基質スクシニル-アラニン-アラニン-プロリン-フェニル-アラニン-p-ニトロフェノールとの反応による、PNA アッセイを用いて測定した。発酵： サブチラーゼ酵素の発酵は、100ml BPX培地が入った容量500mlのエーレンマイヤーフラスコ中で回転振盪台(300r.p.m.)上で、30℃、5日間行った。その結果、例えば2Lのブロスを作成するためには、20個のエーレンマイヤーフラスコで同時に発酵した。

培地：
BPX：組成（1L当たり）
ジャガイモデンプン 100g
粉砕したオオムギ 50g
ダイズ粉 20g
Na₂HPO₄ X 12H₂0 9g
プルロニック 0.1g
ナトリウムカゼイネート 10g
培地中のデンプンは、α−アミラーゼと共に溶解し、かつこの培地は、120 ℃で45分間加熱滅菌した。滅菌後の培地のpHを、NaHCO₃を0.1M添加して9 とした。

実施例
実施例１
酵素変異体の構築及び発現：
部位特異的突然変異誘発： サブチラーゼ309の部位特異的変異体を、各々Dengらの論文(Anal. Biochem.、200:81-88(1992))及びMarkvardsen らの論文(BioTechniques、18(3):371-372 (1995))に記された、「ユニーク部位の除去(Unique site elimination)(USE)」又は「ウラシル-USE」法により行った。

鋳型プラスミドは、サブチラーゼ309 変異体を含むpJS3、又はその類似体であり、例えばUSE突然変異誘発は、T255I変異体の構築を指示したオリゴヌクレオチドと共にN252L変異体をコードしている遺伝子を含むpJS3類似体上で行い、その結果最終的なN252L+T255I サブチラーゼ309 変異体を得た。
その後、pJS3において構築されたサブチラーゼ309 変異体を、制限酵素KpnI及びMluIを用いて、B.サブチリスpSX222発現プラスミドにサブクローニングした。

局在化したランダム突然変異誘発：
局在化したランダム突然変異を誘発するために使用される全般的戦略は、以下のようなものである：突然変異されるべきアミノ酸コドン（複数）に対応するヌクレオチド（複数）以外の突然変異されるべきDNA配列の一部に相当する突然変異誘発プライマー（オリゴヌクレオチド）を合成した。

引き続き、得られた突然変異誘発プライマーを、適当な対向プライマーと共に、PCR 反応において使用した。得られたPCR 断片を精製し、消化し、かつ大腸菌−B.サブチリスシャトルベクターにクローニングした。

あるいは必要であるならば、得られたPCR 断片をプライマーとして、第二の適当な対向プライマーと共に用いて、第二のPCR 反応を行い、消化し、突然変異させた領域を該シャトルベクターにクローニングした。このPCR 反応は、通常の条件で行った。

この戦略の後、局在化したランダムダイブラリーを、N252、T255及びS259の位置で完全にランダム化されているSAVINASEにおいて構築した。

あるオリゴヌクレオチドを、各25％の4 種の塩基(N)で合成し、アミノ酸コドンの第一及び第二の塩基を突然変異した。コドン中の第三のヌクレオチド（揺れのある塩基）は、50％G ／50％C(S)で合成し、3 種の停止コドンのうちの2 種(TAA、TGA)を避けた。

PCR反応において、突然変異誘発プライマー（5'-C TTC TGC GTT AAC AAG TCC GCT TCC ATA CAA GTT CGT SNN TCC TAA ACT SNN TGC CGT SNN CTT TAG ATG ATT-3' （アンチセンス) ）を、適当な対向プライマー（例えば、5'-GAA CTC GAT CCA GCG ATT TC -3' （センス））及び鋳型としてプラスミドpJS3と共に行った。得られたPCR 産物を、制限酵素XhoI及びHpaIを用いて、pJS3シャトルベクターにクローニングした。

次にpJS3において構築された局在化されたランダムライブラリーを、制限酵素KpnI及びMluIを用いて、B.サブチリスpSX222発現プラスミドにサブクローニングした。

作成したライブラリーは、約100,000 の個別のクローン／ライブラリーを有していた。

ランダムに選択されたコロニーを配列決定し、デザインされた突然変異が行われたことを確認した。

本発明のサブチラーゼ変異体を精製するために、本発明の変異体を含むB.サブチリスpSX222発現プラスミドをコンピテントB.サブチリス株に形質転換し、かつクロラムフェニコール(CAM)10 μg/mlを含有する培地において前述のように発酵した。

実施例２
酵素変異体の精製：
この方法は、ズブチリシン147 酵素、ズブチリシン309 酵素又はその突然変異体の2L発酵スケールの精製に関する。

およそ1.6Lの発酵ブロスを、1Lのビーカーにおいて5000rpm で35分間遠心分離した。上清は、10％酢酸を用いてpH6.5 に調節し、Seitz Supra S100フィルタープレートを用いてろ過した。

ろ液を、アミコン社のS1Y10 UFカートリッジを装着したCH2A UF ユニットを用いて、ほぼ400ml に濃縮した。UF濃縮液を遠心分離し、ろ過し、その後室温でBacitracinアフィニティーカラムにpH7 で吸着させた。このプロテアーゼを、0.01M ジメチルグルタル酸、0.1Mホウ酸及び0.002M塩化カルシウムを含むpH7 に調節した緩衝液中において25％2-プロパノール及び1M塩化ナトリウムを用いて、室温でBacitracinカラムから溶離した。

Bacitracin精製工程から得たプロテアーゼ活性のある分画を一緒にし750ml のSephadex G25カラム（直径5cm ）に載せ、0.01M ジメチルグルタル酸、0.2Mホウ酸及び0.002M塩化カルシウムを含むpH6.5 に調節した緩衝液で平衡とした。

Sephadex G25カラムから得たタンパク質分解活性のある画分を一緒にし、150mlのCM Sepharose CL6B陽イオン交換カラム（直径5cm）に載せ、0.01Mジメチルグルタル酸、0.2Mホウ酸及び0.002M塩化カルシウムを含有するpH6.5に調製した緩衝液中で平衡とした。

プロテアーゼを、1Lの0 〜0.1M塩化ナトリウム勾配、及び2Lの同じ緩衝液を用いて溶離した（ズブチリシン147 の場合は0 〜0.2M塩化ナトリウム）。

最終の精製工程において、CM Sepharoseカラムから得たプロテアーゼ含有分画を一緒にし、GR81PPメンブレン（デニッシュシュガーファクトリー社（Danish Sugar Factories Inc. ）から入手）を装着したアミコン限外ろ過セルにおいて濃縮した。

構築のための実施例１の技法及び前述の単離の技法を用いて、下記のズブチリシン309 変異体を産生し、単離した：
N252L+T255I
N252V+T255A
N252M+T255C+S259H
N252S+T255E+S259C；及び
N252K+T255S+S259C。

実施例３
酵素変異体を含有する洗剤組成物の洗濯性能 下記実施例は、下記条件下で行った多くの洗濯試験から得た結果を示した。
実験条件

使用した洗剤は、単純なモデルの配合物であった。粉末洗剤のpHの通常の範囲であるpH10.5に調節した。モデル洗剤95の組成は下記のようであった：
25％ STP(Na₅P₃O₁₀)
25％ Na₂SO₄
10％ Na₂CO₃
20％ LAS (Nansa 80S)
5.0 ％ 非イオン性テンシド(tenside)(Dobanol 25-7)
5.O ％ Na₂Si₂O₅
0.5 ％ カルボキシメチルセルロース(CMC)
9.5 ％ 水

水の硬度は、脱イオンした水にCaCl₂ 及びMgCl₂ (Ca₂ ⁺ ： Mg₂ ⁺ ＝2 :1)を添加することによって調節した（「消費製品中の界面活性剤−理論、技術及び用途(Surfactants in Consumer Products - Theory, Technology and Application) 、Springer Verlag 、1986年」も参照のこと）。洗剤液のpHは、HClを添加してpH10.5に調節した。

試験物質上の反射率(R) の測定を、Macbeth ColorEye 7000 光度計(Macbeth、Division of Kollmorgen Instruments Corporation 、独国)を用いて460nmで測定した。測定は、製造業者の指示に従って行った。ズブチリシン309変異体の洗濯性能を、性能因子を計算して算出した：
Ｐ＝（R 変異体−R ブランク）／（R サビナーゼ−R ブランク）
P：性能因子
R変異体：変異体で洗浄した試験物質の反射率
Rサビナーゼ：サビナーゼ（登録商標）で洗浄した試験物質の反射率
Rブランク：酵素を使用せずに洗浄した試験物質の反射率

請求の範囲記載のズブチリシン309 変異体は全て、サビナーゼ（登録商標）と比べて改善された洗濯性能を有した−すなわちP＞1。

これらの変異体は、大文字で記された改善されたクラスに分けられた：
クラスA：1＜P＜1.5
クラスB：1.5＜P＜2
クラスC：P＞2
表Ｖ：ズブチリシン309変異体及び改善されたクラス

Claims (24)

1. 位置252 、255 及び／又は259 （BASBPN番号）に修飾を含んで成る、洗剤中で改善された洗濯性能を有するサブチラーゼ酵素変異体。
2. 下記を含んで成る群から選択された修飾（BASBPN番号）を少なくとも１個含む、洗剤中で改善された洗濯性能を有するサブチラーゼ酵素変異体： 252L+255I 252V+255A 252M+255C+259H 252S+255E+259C 252K+255S+259C；又は 前述の変異体のいずれかにおいて1 個以上の保存的修飾を含む変異体（例えば、252L（疎水性アミノ酸)+255I変異体の保存的修飾には、252I（疎水性アミノ酸)+255I、及び 252V（疎水性アミノ酸)+255Iのような変異体が含まれる。）。
3. 前記修飾（BASBPN番号）が下記の群から選択される、請求項２記載のサブチラーゼ酵素変異体： N252L+T255I N252V+T255A N252M+T255C+S259H N252S+T255E+S259C N252K+T255S+S259C ；又は 前述の変異体のいずれかにおいて1 個以上の保存的修飾を含む変異体（例えば、N252L(疎水性アミノ酸)+T255I 変異体の保存的修飾は、N252I(疎水性アミノ酸)+T255I 、及びN252V(疎水性アミノ酸)+T255I のような変異体を含む。）。
4. 前記親サブチラーゼがサブグループI-S1から選択される、請求項１〜３のいずれか1 項記載の変異体。
5. 前記親サブチラーゼが、ABSS168 、BASBPN、BSSDY 、及びBLSCAR、又はサブグループI-S1の特徴を保持しているそれらの機能的変異体からなる群から選択される、請求項４記載の変異体。
6. 前記親サブチラーゼがサブグループI-S2から選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の変異体。
7. 前記親サブチラーゼが、BLS147、BLS309、BAPB92、TVTHER及びBYSYAB、又はサブグループI-S2の特徴を保持しているそれらの機能的変異体からなる群から選択される、請求項６記載の変異体。
8. 前述の修飾がいずれか他の位置において１個以上の修飾と組合せられる、請求項１〜７のいずれか１項記載の変異体。
9. 前述の修飾が、位置27、36、57、76、97、101 、104 、120 、123 、167 、170 、206 、218 、222 、224 、235 及び274 の１個以上における修飾と組合せられる、請求項８記載の変異体。
10. 前記サブチラーゼがI-S2サブグループに属し、かつ前述の更なる変化が、K27R、*36D、S57P、N76D、G97N、S101G 、V104A 、V104N 、V104Y 、H120D 、N123S 、Y167A 、Y167I 、R170S 、R170L 、R170N 、Q206E 、N218S 、M222S 、M222A 、T224S 、K235L 、及びT274A からなる群から選択される、請求項９記載の変異体。
11. 変異体V104N+S101G 、K27R+Vl04Y+N123S+T274A、もしくはN76D+V104A、又は他のこれらの突然変異の組合せ（V104N 、S101G 、K27R、V104Y 、N123S 、T274A 、N76D、V104A ）を、請求項１〜10のいずれか1 項記載の１個以上の置換、欠失及び／又は挿入のいずれかと組合せて含む、請求項10記載の変異体。
12. 前記修飾が、位置129 、131 、133 及び194 のいずれか１個以上の修飾と組合せられる、請求項１〜11のいずれか1 項記載のサブチラーゼ変異体。
13. 前記サブチラーゼがI-S2サブグループに属し、かつ更なる変化がP129K 、P131H 、A133P 、A133D 及びA194P からなる群から選択される、請求項12記載の変異体。
14. 請求項１〜13のいずれか１項記載のサブチラーゼ変異体をコードしている、単離されたDNA 配列。
15. 請求項14記載の単離されたDNA 配列を含む発現ベクター。
16. 請求項15記載の発現ベクターで形質転換された、微生物宿主細胞。
17. 細菌である、好ましくはバシラス(Bacillus)、特にB.レンタス(B. lentus) である、請求項16記載の微生物宿主。
18. 真菌又は酵母である、好ましくは糸状菌、特にアスペルギルス(Aspergillus) である、請求項16記載の微生物宿主。
19. 請求項16〜18のいずれか１項記載の宿主を、該変異体の発現及び分泌を行う条件下で培養し、かつ該変異体を回収する、請求項１〜13のいずれか1 項記載の変異体を産生する方法。
20. 請求項１〜13のいずれか１項記載のサブチラーゼ変異体を含んで成る組成物。
21. 更に、セルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、他のプロテアーゼ又はアミラーゼを含んで成る、請求項20記載の組成物。
22. 前記組成物が洗剤組成物である、請求項20又は21記載の組成物。
23. 洗濯及び／又は皿洗い用洗剤中における、請求項１〜13のいずれか１項記載のサブチラーゼ変異体、又は請求項20〜22のいずれか１項記載の酵素組成物の使用。
24. 洗剤中において改善された洗濯性能を発揮するプロテアーゼ変異体の同定の方法であって；
    下記のアミノ酸に対応する１個以上の位置（BASBPN番号）でサブチラーゼ酵素又はそのプレ- もしくはプレプロ- 酵素をコードしているDNA において突然変異を生じる工程： N252L+T255I N252V+T255A N252M+T255C+S259H N252S+T255E+S259C N252K+T255S+S259C ；又は 前述のいずれかの変異体における１個以上の保存的修飾を有する変異体；前記突然変異したDNA でバシラス(Bacillus)株を形質転換する工程；
    このようなプロテアーゼ変異体を産生する株を選択する工程；
    このような株を発酵／増殖する工程；
    前述のプロテアーゼ変異体を回収する工程；及び 洗剤中における改善された洗濯性能を試験する工程を含む、方法。

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