MXPA99004108A - Variantes y composiciones de subtilasa - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a enzimas producidas mediante la mutación de genes para varias subtilasas en las posiciones 167 y 170 y que expresan los genes que sufrieron mutación en hospederos adecuados. Las enzimas presentan comportamiento en condiciones de lavado mejorado encualquier detergente en comparación con sus enzimas precursoras tipo natural.

Description

VARIANTES Y COMPOSICIONES DE SUBTILASA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a nuevas enzimas proteasas mutantes o variantes enzimáticas útiles para formular composiciones detergentes y mostrar un comportamiento mejorado en condiciones de lavado en los detergentes; composiciones limpiadoras y detergentes que contienen esas enzimas; genes que han sufrido mutación que codifican para la expresión de las enzimas cuando se insertan en una célula u organismo hospedero adecuado; y las células hospederas transformadas con esos y susceptibles de expresar las variantes enzimáticas . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En la industria de detergentes por más de 30 años se han aplicado las enzimas en las formulaciones para lavar. Las enzimas usadas en estas formulaciones comprenden proteasas, lipasas, amilasas, celulasas así como otras enzimas o mezclas de las mismas. Desde el punto de vista comercial las enzimas más importantes son las proteasas. Un número creciente de proteasas de uso comercial son variantes de proteínas de ingeniería (modificadas genéticamente) de proteasas que se presentan en forma natural, por ejemplo DURAZYM® (Novo Nordisk A/S), RELASE® (Novo Nordisk A/S), MAXAPEM® P1269/99MX (Gist Brocades, N.V.), PURAFECT® (Genecor International, Inc.) Además diversas variantes de proteasa se describen en el campo de la técnica, como en EP 130756 (GENETECH) (que corresponde a la Patente de los Estados Unidos Re-publicada No. 34,606 (GENENCOR); EP 214435 (HENKEL); WO 87/04461 (AMGEN); WO 87/05050 (GENEX) ; EP 260105 (GENENCOR); Thomas, Russell and Fersht (1985) Nature 318 375-376; Thomas, Russell and Fersht (1987) J. Mol. Biol. 193 803-813; Rusell and Fersht Nature 328 496-500 (1987); WO 88/08028 (Genex); WO 88/08033 (Amgen); WO 95/27049 (SOLVAY S.A); WO 95/30011 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); WO 95/30010 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); WO 95/29979 (PROCTER & GAMBLE COMPANY) Patente de los Estados Unidos 5.543.302 (SOLVAY S.A) EP 251 446 (GENENCOR); WO 89/06279 (NOVO NORDISK A/S) WO 91/00345 (NOVO NORDISK A/S); EP 525 610 Al (SOLVAY) y WO 94/02618 (GIST BROCADES N.V.). Sin embargo, aunque se han descrito diversas variantes de proteasas útiles, todavía existe la necesidad de nuevas variantes de proteasas mejoradas para diversos usos industriales. Por lo tanto, un objeto de la presente invención, es proporcionar variantes mejoradas de proteasas de proteínas modificadas genéticamente, especialmente para usarse en la industria de detergentes . ni .r a / a t? r SUMARIO DE LA INVENCIÓN Recientemente se ha identificado que la variante subtilasa que tiene comportamiento mejorado en las condiciones del lavado se puede obtener sustituyendo uno o más residuos de aminoácidos ubicados en un dominio hidrofóbico de la subtilasa de origen o en la vecindad del mismo por un residuo de aminoácido más hidrofóbico que el residuo original, el dominio hidrofóbico comprende los residuos que corresponden a los residuos 1165, Y167, Y171 de BLS309 y los residuos en la vecindad del mismo comprenden residuos que corresponden a los residuos E136, G159, S164, R170, A194 y G195 de BLS309 (WO/34946) . Con base en esta información, los inventores de la presente han estudiado de manera intensiva varias de las posibles combinaciones de los residuos Y167 y R170 de SAVINASE® e identificado varias de las variantes con un comportamiento mejorado y aumentado de manera sorprendente en el lavado. Para más detalles se hace referencia a los ejemplos de working (ver más delante). Por consiguiente, la presente invención se refiere en su primer aspecto a una variante de proteasa subtilasa que tiene comportamiento en condiciones de lavado mejorado en los detergentes, que comprende modificaciones tanto en la posición 167 como en la 170. En un segundo aspecto la invención se refiere a una variante de enzima subtilasa que tiene comportamiento en condiciones de lavado mejorado en detergentes, que comprende al menos una modificación seleccionada del grupo que comprende (en la numeración BASBPN) : 167(G,A,S o T}+170(G,A,S o T} 167{G,A,S o T}+170{L, I o V} 167(G, A,S o T}+170(Q o N} 167P 167P+170(L, I o V} 167{L, I, o V}+170(G,A, S o T} 167{L, I o V}+170{Q o N} 167P+170{G,A, S o T} 167{L, I, o V}+170{L, I, o V} 167{F,W o Y}+170(G,A,S o T} 167{F,W o Y}+170{E o D} 167(F,W o Y}+170{R,K o H} 167{ F, W o Y}+170(L, I, o V} 167{L, I, o V} 170H 167{G,A,S o T} La nomenclatura anterior, por ejemplo, la variante "167{G,A,S o T}+170{G,A,S o T}" es una nomenclatura matriz, en donde el término "167(G,A,S o T)+170(G,A,S o T}" comprende las siguientes variantes: 167G+170G, 167G+170A, 167G + 170S, 167G+170T, 167A+170G, 167A+170A, 167A + 170S, 167A+170T, 167S+170G, 167S+170A, 167S + 170S, 167S+170T, 167T+170G, 167T+170A, 167T + 170S o 167T+170T Para más detalles relacionados con la nomenclatura de una variante subtilasa en la presente, ver la sección "Definiciones" en la presente (ver más adelante) . En un tercer aspecto la invención se refiere a una secuencia de ADN aislada que codifica una variante de subtilasa de la invención . En un cuarto aspecto la invención se refiere a un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN aislada que codifica una variante de subtilasa de la invención. En un quinto aspecto la invención se refiere a una célula hospedera microbiana transformada con un vector de expresión según el cuarto aspecto. En otro aspecto la invención se refiere a la producción de enzimas subtilisina de la invención por medio de insertar un vector de expresión según el cuarto aspecto en un hospedero microbiano adecuado, cultivar el hospedero para expresar la enzima subtilasa que se desea y recuperar el producto enzimático. Más aún la invención se refiere a una composición que comprende una variante de subtilasa de la invención. Finalmente la invención se refiere al uso de enzimas mutantes para diversos usos de importancia industrial, en particular para usarse en composiciones de limpieza que comprenden enzimas mutantes, en especial, composiciones de detergente que comprenden las enzimas subtilisinas mutantes.

DEFINICIONES Antes de tratar esta invención con más detalle, se definirán primero los términos siguientes.

Nomenclatura de Aminoácidos A = Ala = Alanina V = Val = Valina L = Leu = Leucina I = lie = Isoleucina P = Pro = Prolina F = Phe = Fenilalanina W = Trp = Triptofano M = Met = Metionina G = Gly = Glicina S = Ser = Serina T = Thr = Treonina C = Cys = Cisteína Y = Tyr = Tirosina N = Asn = Asparagina Q = Gln = Glutamina D = Asp = Ácido Aspártico E = Glu = Acido Glutámico K = Lys = Lisina R = Arg = Arginina H = His = Histidina X = Xaa = Cualquier aminoácido Nomenclatura de ácidos nucleicos A = Adenina G = Guanina C = Citosina T = Timina (sólo en ADN) U = Uracilo (sólo en ARN) Nomenclatura de variantes Para describir las diversas enzimas producidas o contempladas según la invención, se han adaptado las siguientes nomenclaturas para fácil referencia: Aminoácido ( s) original (es) posición(es) aminoácido (s) sustituyente ( s ) Según esto la sustitución de glicina por ácido Glutámico en la posición 195 se designaría como: Glyl95Glu o G195E una supresión de glicina en la misma posición es: Glyl95* o G195* y la inserción de un residuo de aminoácido adicional como la lisina es: Glyl95GlyLys o G195GK En donde está indicada una supresión en comparación con la secuencia usada para la numeración, una inserción en esa posición se indica como: * 36Asp o *36D para la inserción de un ácido aspártico en la posición 36. Las mutaciones múltiples se separan por signos más, por ejemplo: Argl70Tyr + Glyl95Glu o R170Y+G195E que representan mutaciones en las posiciones 170 y 195 que sustituyen a arginina y glicina por tirosina y ácido glutámico, respectivamente. Cuando el aminoácido (s ) original (es) puede comprender cualquier aminoácido, entonces solamente se mencionan posición(es) y aminoácido ( s ) que sustituyente (s) , por ejemplo: 170Ser. Esta nomenclatura es de importancia particular con relación a la(s) modificación (es ) según la invención en subtilasas homologas (ver más adelante). 170Ser comprende entonces, por ejemplo, tanto una modificación Lysl70Ser en BASBPN y una modificación Argl70Ser en BLSSAVI. Ver Figura 1 con relación a los ej emplos . Cuando el (los) aminoácido ( s ) sustituyente ( s) puede (n) comprender cualquier aminoácido, entonces se menciona(n) solamente el (los) aminoácido ( s ) original(es) y la(s) posición(s), por ejemplo: Argl70.

Cuando tanto el (los) aminoácido ( s ) original(es) como el(los) aminoácido ( s ) sustituyente ( s ) pueden comprender cualquier aminoácido, entonces solamente se menciona la(s) posición (es ) , por ejemplo: 170. Cuando el(los) aminoácido (s) y/o el(los) aminoácido (s) sustituyente (s) pueden comprender más de uno y no todos los aminoácidos, entonces los aminoácidos seleccionados se encierran por un "{ }", por ejemplo: Argl70{Gly, Ala, Ser o Thr} que comprende las variantes Argl70Gly, Argl70Ala, Argl70Ser o Argl70Thr; o por ejemplo Tyrl67{Gly, Ala, Ser o Thr} + Argl70{Gly, Ala, Ser o Thr} que comprende las variantes Tyrl67Gly + Argl70Gly, Tyrl67Gly + Argl70Ala, Tyrl67Gly + Argl70Ser Tyrl67Gly + Argl70Thr, Tyrl67Ala + Argl70Gly, Tyrl67Ala + Argl70Ala, Tyrl67Ala + Argl70Ser, Tyrl67Ala + Argl70Thr, Tyrl67Ser + Argl70Gly, Tyrl67Ser + Argl70Ala, Tyrl67Ser + Argl70Ser, Tyrl67Ser + Argl70Thr, Tyrl67Thr + Argl70Gly, Tyrl67Thr + Argl70Ala, Tyrl67Thr + Argl70Ser, o Tyrl67Thr + Argl70Thr. Esta nomenclatura es de importancia particular con relación a una(s) modificación (es ) de un aminoácido conservativo de unas variantes de subtilasa preferidas de la invención.

Por ejemplo, una(s) modificación (es ) , por ejemplo, de una variante preferida Tyrl67Ala + Argl70Ser son Tyrl67{Gly,Ala,Ser o Thr} + Argl70 { Gly, Ala, Ser o Thr}, que sustituyen aquí un aminoácido pequeño por otro aminoácido pequeño. Ver la sección "Descripción detallada de la invención" para más detalles.

Proteasas Las enzimas que desdoblan los enlaces de amida en los substratos proteicos se clasifican como proteasas o (indistintamente) peptidasas (ver Walsh, 1979, En zyma t i c Rea c t i on Mechani sms , W.H.Freeman and Company, San Francisco, Chapter 3).

Numeración de posiciones/residuos de aminoácidos Si no se indica de otro modo la numeración de aminoácidos utilizada en la presente corresponde a la de la secuencia de subtilasa BPN' (BASBPN) . Para mayor descripción de la secuencia BPN1 ver Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 y la Figura 1.

Proteasas de Serina Una proteasa de serina es una enzima que cataliza la hidrólisis de los enlaces peptídicos y en la cual hay un residuo de serina esencial en el sitio activo (White, Handler and Smith, 1973 " Prin cipi es of Bi ochemi s try, " Fífth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, p. 271-272) . Las proteasas de serina bacterianas tienen pesos moleculares en el intervalo entre 20,000 y 40,000 Daltones. Se inhiben con fluorofosfato de diisopropilo. Hidrolizan esteres terminales simples y son semejantes en actividad a la quimotripsina eucariótica, que es también una proteasa de serina. Un término más restringido, proteasa alcalina, que cubre un sub-grupo, refleja el elevado pH óptimo de algunas proteasas de serina, entre pH 9.0 y 11.0 (para revisión, ver Priest (1977) Ba cteri ol ógi ca ! Rev. 41 711-753).

Subtilasas Un sub-grupo de las proteasas de serina designadas en forma tentativa como subtilasas ha sido propuesto por Siezen et al., Pro tein Engn . 4 (1991) 719-737. Se definen por análisis de homología de más de 40 secuencias de aminoácidos de proteasas de serina previamente denominadas proteasas análogas a subtilisina. Una subtilisina anteriormente se definía como una proteasa de serina producida por bacterias Gram positivas o por hongos y según Siezen et al. actualmente es un sub-grupo de las subtilasas. Se ha identificado una amplia variedad de subtilasas y se ha determinado la secuencia de aminoácidos de varias subtilasas. Para una descripción más detallada de estas subtilasas y de sus secuencias de aminoácidos se hace referencia en la presente a Siezen et al. y a la Figura 1. Un subgrupo de subtilasas, I-SI, comprende las subtilisinas "clásicas", como subtilisina 168, subtilisina BPN1, subtilisina Carlsberg (ALCALASE®, NOVO NORDISK A/S) y subtilisina DY . Otro sub-grupo de las subtilasas I-S2, está reconocido por Siezen et al. (arriba). Las proteasas del sub-grupo I-S2 se describen como subtilisinas muy alcalinas y comprenden enzimas como BP92 (MAXACAL®, Gist Brocades NV) , subtilisina 309 (SAVINASE®, NOVO NORDISK a/s), subtilisina 147 (ESPERASE®, NOVO NORDISK A/S) y elastasa alcalina YaB.

"SAVINASE®" La SAVINASE® se comercializa por NOVO NORDISK A/S. Es la subtilisina 309 de B.Lentus y es distinta de BABP92 solamente porque tiene N87S (ver Figura 1 en la presente) .

Subtilasa precursora El término "subtilasa precursora" es una subtilasa definida según Siezen et al. (Protein Engineering 4:719-737 (1991)). Para más detalles ver la descripción de "SUBTILASAS" en lo que antecede. Una subtilasa precursora puede ser también una subtilasa aislada a partir de fuentes naturales, en la que se ha hecho modificación subsecuente mientras que se conserva la característica de una subtilasa. En forma alternativa el término "subtilasa precursora" puede llamarse "subtilasa tipo natural".

Modificación (es ) de una variante de subtilasa El término "modificación (es ) " empleado con relación a la(s) modificación (es ) de una variante de subtilasa según se comenta en la presente se define para incluir la modificación química así como la manipulación genética. La(s) modificación (es ) pueden Ser por sustitución, supresión y/o inserciones en o del aminoácido de interés.

Variante de subtilasa En el contexto de esta invención, el término variante de subtilasa o subtilasa que ha sufrido mutación se aplica a una subtilasa que ha sido producida por un organismo el cual expresa un gen mutante derivado de un microorganismo precursor que posee un gen original o precursor y que produce la enzima precursora correspondiente, el gen precursor que ha sufrido mutación para producir el gen mutante a partir del cual se produce la proteasa subtilasa con mutación se produce cuando se expresa en un hospedero adecuado .

Secuencias homologas de subtilasa Residuos de aminoácidos específicos de subtilasa SAVINASE® se identifican aquí por modificación para obtener una variante de subtilasa de la invención. Sin embargo, la invención no se limita a las modificaciones de esta subtilasa particular, sino que se extiende a otras subtilasas precursoras (tipo natural), que tienen estructura primaria homologa a la de la SAVINASE®. Para identificar otras subtilasas homologas, dentro del alcance de esta invención, se realizó un alineamiento de esta(s) subtilasa(s) a un grupo de subtilasas previamente alineado. Se realizó una comparación de los 18 residuos más conservados en las subtilasas. Los 18 residuos más conservados se muestran en la tabla I (ver Siezen et al. para más detalles con relación a los residuos conservados).

Tabla I 18 residuos más conservados en subtilasas Posición Residuo conservado 23 G 32 D 34 G 39 H 64 H 65 G 66 T 70 G 83 G 125 S 127 G 146 G 154 G 155 N 219 G 220 T 221 S 225 P Después de alinear permitiendo las inserciones y supresiones necesarias para mantener el alineamiento adecuado, se identifican los residuos homólogos. Los residuos homólogos se pueden modificar entonces según la invención. Mediante el uso de CLUSTALW (versión 1.5, Abril 1995) programa de alineamiento computarizado (Thompson, J.D., Higgins, D.G. y Gibson, T.J. (1994) Nuecleic Acids Research, 22:4673-4680), con penalización abierta GAP de 10.0 y penalización de extensión GAP de 0.1, usando la matriz de peso de proteína BLOSUM30, se logra el alineamiento de una subtilasa dada con un grupo de subtilasas alineadas previamente mediante la opción Profile alignments del programa. Para una subtilasa dada que está dentro del alcance de la invención, de preferencia 100% de los 18 residuos más conservados se deben conservar. Sin embargo, un alineamiento mayor o igual a 17 de los 18 residuos o tan bajo como 16 de esos residuos conservados también es adecuado para identificar los residuos homólogos. En subtilasas, la conservación de la triada catalítica Asp32/His64 /Ser221 , debe mantenerse. El alineamiento previamente definido se muestra en la Figura 1, en donde se muestra también el por ciento de identidad de las subtilasas individuales es este alineamiento con respecto a los 18 residuos más conservados. Además en el proceso para identificar una subtilasa precursora homologa (tipo natural) dentro del alcance de la invención, los 18 residuos conservados de arriba se relacionan con la secuencia primaria precursora (tipo natural) de la subtilasa precursora homologa. En otras palabras, si una subtilasa precursora se ha modificado en cualquiera de los 18 residuos más conservados anteriormente mencionados, esa es la secuencia precursora original tipo natural en los 18 residuos conservados, que determina si tanto la subtilasa precursora original como una posible variante de esa subtilasa precursora, son o no una subtilasa homologa, según el alcance de la presente invención. Con base en esta descripción es de rutina para una persona experta en el campo de la técnica identificar subtilasas homologas adecuadas y los residuos homólogos correspondientes, los cuales se pueden modificar según la invención. Para ilustrar esto, la tabla II abajo muestra una lista limitada de subtilasas homologas y los residuos adecuados correspondientes que se van a modificar según la invención .

Tabla II Subtilasas homologas y residuos homólogos correspondientes, adecuados para modificarse según la invención Es evidente que una tabla similar o más grande que cubra otras subtilasas homologas puede generarse fácilmente por una persona experta en el campo de la técnica .

Comportamiento en las condiciones de lavado La habilidad de una enzima para catalizar la degradación de diversos substratos que se presentan en forma natural en los objetos que se van a limpiar durante el lavado, por ejemplo, es frecuente que se conozca como su habilidad para lavado, habilidad de lavado, detergencia o comportamiento en las condiciones de lavado. A lo largo de esta solicitud el término comportamiento en las condiciones de lavado se usará para abarcar esta propiedad.

Secuencia de ADN aislada El término "aislada", cuando se aplica a una molécula de secuencia de ADN, indica que la secuencia de ADN se ha retirado de su entorno natural y de este modo se ha liberado de otras secuencias de codificación extrañas o indeseables y está en una forma adecuada para emplearse en los sistemas de producción de proteínas obtenidas por ingeniería genética. Estas moléculas aisladas son las que están separadas de su entorno natural e incluyen clones gnenómicos ADNc. Las moléculas de ADN aisladas de la presente invención están libres de otros genes con los cuales están asociadas normalmente, pero pueden incluir regiones sin traducir 5' y 3' que se presentan en forma natural como las promotoras y terminadoras . La identificación de regiones asociadas será evidente para un experto en el campo de la técnica (ver por ejemplo, Dynan and Tijan, Nature 316: 774-78, 1985). El término "una secuencia de ADN aislada" se puede llamar en forma alternativa "una secuencia de ADN clonada".

Proteína aislada Cuando se aplica a una proteína, el término "aislada" indica que la proteína se encuentra en un estado diferente a su entorno nativo. En una forma preferida, la proteína aislada está prácticamente libre de otras proteínas, en particular de otras proteínas homologas (es decir, "impurezas homologas" (ver adelante) ) . Se prefiere proporcionar la proteína en una forma bastante purificada, por ejemplo, con más de 40% de pureza, más de 60% de pureza, más de 80% de pureza, con mayor preferencia más de 95% de pureza y aún con mayor preferencia más de 99% de pureza, según se determina mediante SDS-PAGE. El término "proteína aislada" puede llamarse en forma alternativa "proteína purificada".

Impurezas homologas El término "impurezas homologas" significa cualquier impureza (por ejemplo, otro polipéptido diferente al polipéptido de la invención) que se origina a partir de la célula homologa de donde el polipéptido de la invención se obtiene originalmente.

Obtenido a partir de El término "obtenido a partir de" en el sentido en el que se utiliza en la presente con relación a una fuente microbiana específica, se aplica al polinucleótido y/o al polipéptido producido por la fuente específica o por una célula en la cual se ha insertado un gen de la fuente.

Substrato El término "Substrato" utilizado con relación a un substrato para proteasa se deberá interpretar en su sentido más amplio ya que comprende un compuesto que contiene al menos un enlace peptídico susceptible de ser hidrolizado mediante una proteasa subtilisina.

Producto El término "producto" utilizado con relación al producto derivado de una reacción enzimática de proteasa en el contexto de esta invención deberá interpretarse como un término que incluye los productos de una reacción de hidrólisis que implica una proteasa subtilasa. Un producto puede ser el substrato en una reacción de hidrólisis subsecuente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra un alineamiento de varias subtilasas homologas, que están alineadas con los 18 residuos más conservados en las subtilasas. Los 18 residuos más conservados están resaltados con negritas. Todas las subtilasas que se muestran, excepto JP170, tienen 100% de identidad en los residuos conservados. JP170 tiene una "N" en lugar de una "G" en los residuos conservados G146.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Variantes de subtilasa con comportamiento en condiciones de lavado mejorado: Numerosas variantes de subtilasa de la invención se analizan en la presente y muestran comportamiento mejorado en condiciones de lavado en los detergentes (ver ejemplos de funcionamiento en la presente (ver adelante) ) . Por consiguiente, una modalidad de la invención se refiere a una variante de enzima subtilasa según el segundo aspecto de la invención, en donde la modificación se selecciona del grupo que comprende (en numeración BASBPN) : 167A+170S 167A+170L 167A+170N 167P 167P+170L 167V+170T 167I+170T 167V+170Q 167S+170Q 167T+170N 167A+170A 167T+170L 167T+170A 167P+170S 167I+170L 167F+170T 167F+170E 167F+170H 167F+170T 167F+170L 167L 170H 167S Los inventores de la presente han identificado las variantes con comportamiento en condiciones de lavado mejorado en BLS309 (SAVINASE®) , la cual en su secuencia primaria precursora tipo natural incluye Y167 y R170 como los aminoácidos originales tipo natural (ver Figura 1 ) .

En consecuencia, otra modalidad de la invención se refiere a una variante de enzima subtilasa según el segundo aspecto de la invención, en donde la modificación se selecciona del grupo que comprende (en numeración BASBPN) : Y167{G,A,S o T} + R170{G,A,S o T} Y167{G,A,S o T} + R170{L,I, o V} Y167{G,A,S o T} + R170{Q o N} Y167P Y167P + R170{L, I, o V} Y167{L,I, o V} + R170{G,A,S o T} Y167{L,I, o V} + R170{Q o N} Y167P + R170(G, A, S o T} Y167{L,I, o V} + R170{L,I, o V} Y167{F,W o Y} + R170{G,A,S o T} Y167{ F,W o Y} + R170{E o D} Y167{F,W o Y} + R170(R,K o H} Y167(F,W o Y} + R170(L,I, o V} Y167{L, I, o V} R170H Y167{G,A,S o T}; o con mayor preferencia una variante de enzima subtilasa según la modalidad inmediata anterior, en donde la modificación se selecciona del grupo que comprende (en numeración BASBPN) : Y167A+R170S Y167A+R170L Y167A+R170N Y167P Y167P+R170L Y167V+R170T Y167I+R170T Y167V+R170Q Y167S+R170Q Y167T+R170N Y167A+R170A Y167T Y167T+R170A Y167P+R170S Y167I+R170L Y167F+R170T Y167F+R170E Y167F+R170H Y167F+R170T Y167F+R170L Y167L R170H Y167S Es bien sabido en este campo de la técnica que la sustitución de un aminoácido por un aminoácido conservativo similar solamente produce un cambio menor en las características de la enzima. La Tabla III abajo hace una lista de grupos de aminoácidos conservativos.

Tabla III Sustituciones de aminoácidos conservativos Básicos: R = arginina K = lisina H = histidina Ácidos: E = ácido glutámico D = ácido aspártico Polares: Q = glutamina N = asparagina Hidrofóbicos: L = leucina I = isoleucina V = valina M = metionina Aromáticos: F = fenilalanina W = triptofano Y = tirosina Pequeños: G = glicina A = alanina S = serina T = treonina Por consiguiente, variantes de subtilasa como 167A+170S, 167G+170S, 167S+170S y 167T+170S, tendrán mejoras similares en el comportamiento en condiciones de lavado. Además, las variantes de subtilasa como Y167G+R170S, Y167S+R170S y Y167T+R170S, tendrán un mejoramiento del comportamiento en condiciones de lavado similar a la variante Y167A+R170S. Ver, por ejemplo, los ejemplos de funcionamiento en la presente para una prueba de comportamiento en condiciones de lavado específica de la variante Y167A+R170S. Con base en lo expuesto y en particular en las numerosas variantes de subtilasa ejemplificadas en la presente, es labor de rutina, para un experto en la técnica, identificar otras modificación (es ) conservativa (s ) adecuada(s), en particular de las variantes ejemplificadas, para obtener una variante de subtilasa con comportamiento en condiciones de lavado mejorado, según todos los aspectos y modalidades de una variante de subtilasa de la invención. En modalidades de la invención, las subtilasas de interés son las que pertenecen a los subgrupos I-SI e I-S2. Con relación al subgrupo I-SI la subtilasa precursora que se prefiere se selecciona del grupo que comprende ABSS168, BASBPN, BSSDY y BLSCAR o variantes funcionales de las mismas que han conservado la característica del subgrupo I-SI. Con relación al subgrupo I-S2 la subtilasa precursora que se prefiere se selecciona del grupo que comprende BLS147, BLS309, BAPB92, TVTHER AND BYSYAB o variantes funcionales de las mismas que han conservado la característica del subgrupo I-S2. En particular la subtilasa precursora es BLS309 (SAVINASE® NOVO NORDISK A/S) .

La presente invención también comprende cualquiera de una o más modificaciones en las posiciones anteriormente mencionadas en combinación con cualquier otra modificación a la secuencia de aminoácidos de la enzima precursora. En especial se conciben las combinaciones con otras modificaciones conocidas en el campo de la técnica para impartir propiedades mejoradas a la enzima. En el campo de la técnica se describen diversas variantes de subtilasa con diferentes propiedades mejoradas y varias de ellas se mencionan en la sección "Antecedentes de la invención" de la presente (ver más atrás). Esas referencias se exponen aquí como referencias para identificar una variante de subtilasa de la invención. Tales combinaciones comprenden las posiciones 222 (mejora la estabilidad a la oxidación) , 218 (mejora la estabilidad térmica) sustituciones en los sitios de unión-Ca que estabilizan la enzima, por ejemplo, posición 76 y muchas otras evidentes a partir de la técnica anterior. En otras modalidades una variante de subtilasa de la invención puede con ventaja combinarse con una o más modificaciones en cualquiera de las posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 206, 218, 222, 224, 235 y 274. En forma específica las siguientes variantes BLS309 y BAPB92 se consideran adecuadas para la combinación : K27R, *36D, S57P, N76D, S87N, G97N, S101G, V104A, V104N, V104Y, H120D, N123S, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L y T274A. Además las variantes que comprenden alguna de las variantes S101G+V104N, S87N+S101G+V104N, K27R+V104Y+N123S+T274A o N76D+V104A u otras combinaciones de estas mutaciones (V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A) , en combinación con cualquiera de una o más de las modificaciones mencionadas arriba presentan propiedades mejoradas. Aún otras variantes de subtilasa del principal aspecto (s) de la invención se combinan de preferencia con una o más modificaciones en cualquier de las posiciones 129, 131, 133 y 194, de preferencia como modificaciones 129K, 131H, 133P, 133D y 194P y con mayor preferencia como modificaciones P129K, P131H, A133P, A133D y A194P. Cualquiera de estas modificaciones dan un nivel de expresión mayor a una variante de subtilasa de la invención. Para más detalles se hace referencia a ejemplos de funcionamiento en la presente (ver más adelante) . En consecuencia, aún otra modalidad de la invención se refiere a una variante según la invención, en donde la modificación se selecciona del grupo que comprende : Y167A+R170S+A194P Y167A+R170L+A194P Y167A+R170N+A194P Y167A+R170S+P129K Y167A+R170L+P129K Y167A+R170N+P129K Y167A+R170S+P131H Y167A+R170L+P131H Y167A+R170N+P131H Y167A+R170S+A133P Y167A+R170L+A133P Y167A+R170N+A133P Y167A+R170S+A133D Y167A+R170L+A133D Y167A+R170N+A133D PRODUCCIÓN DE MUTACIONES EN GENES DE SUBTILASA Muchos métodos para clonar una subtilasa de la invención y para introducir mutaciones en los genes (por ejemplo, genes de subtilasa) son bien conocidos en el campo de la técnica. En general los procedimientos estándar para clonar genes e introducir mutaciones (aleatorias y/o dirigidas al sitio) en estos genes pueden emplearse para obtener una variante adecuada de la invención. Para descripción adicional de técnicas adecuadas se hace referencia a ejemplos de funcionamiento en la presente (ver más adelante) y (Sambrook et al.) (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Hardwood, C.R., and Cutting, S.M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990); y WO 96/34946.

VECTORES DE EXPRESIÓN Un vector de expresión recombinante que comprende una construcción de ADN que codifica para la enzima de la invención puede ser cualquier vector que en forma conveniente se pueda someter a procedimientos de ADN recombinante y la selección del vector con frecuencia dependerá de la célula hospedera en la cual se introduce. De este modo, el vector puede ser un vector de réplica autónoma, es decir un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. En forma alternativa, el vector puede se aquel que, cuando se introduce en una célula hospedera, se integra en el genoma de la célula hospedera en parte o en su totalidad y se replica junto con el (los) cromosoma(s) en los cuales se ha integrado. El vector es . de preferencia un vector de expresión en el cual la secuencia de ADN que codifica para la enzima de la invención está enlazada funcionalmente a segmentos adicionales requeridos para la transcripción del ADN. En general, el vector de expresión se deriva de ADN plásmido o viral o puede contener elementos de ambos. El término "enlazado funcionalmente" indica que los segmentos están colocados de tal manera que funcionan de manera armónica para sus fines proyectados, por ejemplo, la transcripción se inicia en un promotor y sigue a través de la secuencia de ADN que codifica para la enzima. El promotor puede se cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula hospedera seleccionada y puede derivarse de genes que codifican para proteínas ya sea homologas o heterólogas a la célula hospedera. Ejemplos de promotores adecuados para usarse en células hospederas bacterianas incluyen el promotor de gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus, gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis, gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens, gen de proteasa alcalina de Bacillus subtilis, gen de xilosidasa de Bacillus pumilus o los promotores Lambda PR o PL de fago o los promotores E.coli lac, trp o tac. La secuencia de ADN que codifica para la enzima de la invención, si es necesario, puede también conectarse de manera funcional a un terminador adecuado .

El vector recombinante de la invención puede además comprender una secuencia de ADN que permita al vector replicarse en la célula hospedera en cuestión. El vector puede comprender también un marcador seleccionable, por ejemplo un gen cuyo producto complemente un defecto en la célula hospedera o un gen que codifique para dar resistencia, por ejemplo, a los antibióticos como kanamicina, cloranfenicol , eritromicina, tetraciclina, espectinomicina o lo semejante o resistencia a los metales pesados o a los herbicidas . Para dirigir una enzima de la presente invención a la ruta secretoria de las células hospederas, se puede proporcionar al vector recombinante una secuencia de señal secretoria (conocida también como secuencia guía, secuencia prepro o secuencia pre) . La secuencia de señal secretoria se une a una secuencia de ADN que codifica para la enzima en el marco de lectura correcto. Las secuencias de señales secretorias en general se colocan en la posición 5' de la secuencia de ADN que codifica para la enzima. La secuencia de señal secretoria puede ser alguna que esté asociada normalmente con la enzima o puede derivarse de un gen que codifica para otra proteína secretada. Los procedimientos utilizados para ligar las secuencias de ADN que codifica para la enzima de la presente, el promotor y opcionalmente la secuencia terminadora y/o de señal secretoria, respectivamente o para ensamblar estas secuencias mediante esquemas convenientes de amplificación PCR y para insertarlos en vectores adecuados que contienen la información necesaria para replicación o integración, son bien conocidos por los expertos en la técnica (cf., por ejemplo, Sambrook et al., op . cit . ) .

CÉLULA HOSPEDERA La secuencia de ADN que codifica para la presente enzima que se introduce en la célula hospedera puede ser homologa o heteróloga a la célula en cuestión. Si es homologa a la célula hospedera, es decir, producida por la célula hospedera en forma natural, típicamente se conectará funcionalmente a otra secuencia promotora o, si es aplicable, a otra secuencia de señal secretoria y/o secuencia terminadora aparte de su entorno natural. El término "homólogo" se utiliza para incluir una secuencia de ADN que codifica una enzima nativa al organismo hospedero en cuestión. El término "heterólogo" se utiliza para incluir una secuencia de ADN no expresada en la naturaleza por la célula hospedera. De este modo, la secuencia de ADN puede derivarse de otro organismo o puede ser una secuencia sintética. La célula hospedera en la cual la construcción de ADN o el vector recombinante de la invención se introduce puede ser cualquier célula que es capaz de producir la presente enzima e incluye bacterias, levaduras, hongos y células eucariontes mayores. Ejemplos de células hospederas bacterianas las cuales, en el cultivo, son capaces de producir la enzima de la invención son bacterias gram-positivas como las cepas de Bacillus , como cepas de B. subtilis , B. lícheniformís , B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus , B. alkalophilus , B. amyloliquefaciens, B. coagulans , B. circulans , B. lautus, B. megatherium o J9. thuringiensis o cepas de Streptomyces, como S. lividans o S. murinus o bacterias gram-negativas como Escherichia coli. La transformación de la bacteria se puede efectuar mediante transformación de protoplasto, electroporación, conjugación o usando células competentes de una manera que se conoce por sí misma (cf. Sambrook et al., (arriba) . Cuando la enzima se expresa en bacterias como E. coli, la enzima puede quedar retenida en el citoplasma, típicamente como granulos insolubles (conocidos como cuerpos de inclusión) o puede dirigirse al espacio periplásmico mediante una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células se usan y los granulos se recuperan y se desnaturalizan después de lo cual la enzima se reconcentra mediante dilución del agente desnaturalizante. En el último caso, la enzima se puede recuperar del espacio periplásmico por ruptura de las células, por ejemplo, por sonicación o choque osmótico para liberar los contenidos del espacio periplásmico y recuperar la enzima . Cuando la enzima se expresa en bacteria gram-positiva como cepas de Bacillus o Streptomyces, la enzima puede quedar retenida en el citoplasma o puede dirigirse al medio extracelular mediante una secuencia de secreción bacteriana. En el último caso, la enzima se puede recuperar a partir del medio de la misma forma que se describió arriba.

MÉTODO PARA PRODUCIR SUBTILASA La presente invención proporciona un método para producir una enzima aislada según la invención, en donde una célula hospedera adecuada, que ha sido transformada con una secuencia de ADN que codifica para la enzima, se cultiva bajo condiciones que permitan la producción de la enzima y la enzima resultante se recupera a partir del cultivo. Cuando un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica para la enzima se transforma dentro de una célula hospedera heteróloga es posible permitir la producción recombinante heteróloga de la enzima de la invención.

Por ello es posible hacer una composición de subtilasa muy purificada, que se caracteriza porque está libre de impurezas homologas. En este contexto impurezas homologas significa cualquier impureza (por ejemplo, otros polipéptidos diferentes a la enzima de la invención) que se originan a partir de la célula homologa de donde originalmente se obtiene la enzima de la invención. El medio utilizado para cultivar las células hospederas transformadas puede ser cualquier medio convencional adecuado para desarrollar las células hospederas en cuestión. La subtilasa expresada puede ser secretada de manera conveniente en el medio de cultivo y puede recuperarse a partir de este por procedimientos muy conocidos entre los que se incluyen separar las células del medio por centrifugación o filtración, precipitar componentes proteináceos del medio utilizando una sal como sulfato de amonio, seguida por procedimientos cromatográficos como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por afinidad o lo semejante.

USO DE UNA VARIANTE DE SUBTILASA DE LA INVENCIÓN Una variante de proteasa subtilasa de la invención se puede usar para varias aplicaciones industriales, en particular la industria de detergentes .

Adicionalmente la invención se refiere a una composición enzimática, que comprende una variante de subtilasa de la invención. Más abajo se describe un sumario de las aplicaciones industriales preferidas y de las correspondientes composiciones enzimáticas preferidas. Este sumario de ninguna manera está planeado para Ser una lista completa de aplicaciones adecuadas de una variante de subtilasa de la invención. Las variantes de subtilasa de la invención se pueden usar en otras aplicaciones industriales conocidas en la técnica que incluyen el uso de una proteasa, en particular una subtilasa.

COMOSICIONES DETERGENTES QUE COMPRENDEN ENZIMAS MUTANTES La presente invención comprende el uso de las enzimas mutantes de la invención en composiciones limpiadoras y detergentes y estas composiciones comprenden las enzimas de subtilisina mutantes. Las composiciones limpiadoras y detergentes están bien descritas el campo y se hace referencia a WO 96/34946; WO 97/07202; WO 95/30011 para mayor descripción de estas composiciones limpiadoras y detergentes adecuadas . Se hace referencia adicional a los ejemplos de funcionamiento en la presente que muestran las mejoras al comportamiento en condiciones de lavado para varias de las variantes de subtilasa de la invención.

EXPQSCION Y EJEMPLOS DE DETERGENTES Sistema surfactante Las composiciones detergentes según la presente invención comprenden un sistema surfactante, en donde el surfactante se puede seleccionar entre los surfactantes no iónicos y/o aniónicos y/o catiónicos y/o anfolíticos y/o zwitteriónicos y/o semi polares. El surfactante típicamente está presente a niveles entre 0.1% y 60% en peso. El surfactante de preferencia se formula para que sea compatible con a los componentes enzimáticos presentes en la composición. En las composiciones líquidas o en gel el surfactante de preferencia se formula de tal manera que promueva o al menos no degrade, la estabilidad de alguna enzima en estas composiciones . Los sistemas preferidos para usarse según la presente invención comprenden como surfactante uno o más de los surfactantes no iónicos y/o aniónicos que se describen en la presente. Polietileno, polipropileno y condensados de óxido de polibutileno y alquilfenoles son adecuados para usarse como surfactantes no iónicos de los sistemas surfactantes de la presente invención y son los condensados cié óxido de poliet leno los que se prefieren. Estos compuestos incluyen los productos de condensación de alquil fenoles que tienen un grupo alquilo que contiene entre aproximadamente 6 y 14 átomos de carbono, de preferencia entre aproximadamente 8 y 14 átomos de carbono, ya sea una configuración de cadena lineal o de cadena ramificada con el óxido de alquileno. En una modalidad preferida, el óxido de etileno está presente en una cantidad entre aproximadamente 2 y aproximadamente 25 moles, con mayor preferencia entre aproximadamente 3 y aproximadamente 15 moles, de óxido de etileno por mol de alquil fenol. Los surfactantes no iónicos disponibles comercialmente de este tipo incluyen Igepal™ CO-630, comercializada por GAF Corporation y Tritón™ X-45, X-114, X-100 y X-102, comercializados todos por Rohm & Haas Company. Estos surfactantes se denominan comúnmente alcoxilatos de alquilfenol (por ejemplo, etoxilatos de alquil fenol) . Los productos de condensación de alcoholes alifáticos primarios y secundarios con aproximadamente entre 1 y 25 moles de óxido de etileno son adecuados para usarse como surfactante no iónico del sistema de surfactantes no iónicos de la presente invención. La cadena alquílica del alcohol alifático puede lineal o ramificada, primaria o secundaria y en general contiene entre aproximadamente 8 y aproximadamente 22 átomos de carbono. Los que se prefieren son productos de condensación de alcoholes que tienen un grupo alquilo que contiene entre aproximadamente 8 y aproximadamente 20 átomos de carbono, con mayor preferencia entre aproximadamente 10 y 18 átomos de carbono, con aproximadamente entre 2 y 10 moles de óxido de etileno por mol de alcohol . Aproximadamente entre 2 y aproximadamente 7 moles de óxido de etileno y con preferencia superlativa entre 2 y 5 moles de óxido de etileño por mol de alcohol están presentes en esos productos de condensación. Ejemplos de surfactantes no iónicos de este tipo disponibles comercialmente incluyen Tergitol™ 15-S-9 (El producto de condensación de un alcohol lineal Cn-C15 con 9 moles de óxido de etileno) , Tergitol™ 24-L-6 NMW (el producto de condensación de una alcohol primario C12-C14 con 6 moles de óxido de etileno con una distribución estrecha de peso molecular) , ambos comercializados por Union Carbide Corporation; Neodol™ 45-9 (producto de condensación de un alcohol lineal C14-C15 con 9 moles de óxido de etileno), Neodol™ 23-3 (producto de condensación de un alcohol lineal C12-C13 con 3.0 moles de óxido de etileno) , Neodol™ 45-7 (producto de condensación de un alcohol lineal CX4-C15 con 7 moles de óxido de etileno) , Neodol™ 45-5 (producto de condensación de un alcohol lineal C14-C15 con 5 moles de óxido de etileno) comercializados por Shell Chemical Company, Kyro™ EOB (producto de condensación de un alcohol C13-C15 con 9 moles de óxido de etileno) , comercializado por Procter & Gamble Company y Genapol LA 050 (producto de condensación de un alcohol C12-C14 con 5 moles de óxido de etileno) comercializado por Hoechst . El intervalo de HBL preferido en estos productos es de 8-11 y con preferencia superlativa de 8-10. También útiles como surfactantes no iónicos de los sistemas surfactantes de la presente invención son los alquilpolisacáridos expuestos en la Patente de los Estados Unidos 4,565,647, que tienen un grupo hidrofóbico que contiene entre aproximadamente 6 y 30 átomos de carbono, de preferencia entre aproximadamente 10 y 16 átomos de carbono y un polisacárido, por ejemplo, un poliglicósido, un grupo hidrofílico que contiene entre aproximadamente 1.3 y 10, de preferencia entre aproximadamente 1.3 y 3, con preferencia superlativa entre aproximadamente 1.3 y aproximadamente 2.7 unidades de sacárido. Se puede usar cualquier sacárido reductor que contiene entre 5 ó 6 átomos de carbono, por ejemplo, glucosa, galactosa y fracciones de galactosilo pueden sustituir a las fracciones de glucosilo (opcionalmente el grupo hidrofóbico está unido en las posiciones 2-, 3-, 4-, etc, quedando, de este modo, una glucosa o galactosa en oposición a un glucósido o galactósido) . Los enlaces intersacárido pueden Ser, por ejemplo, entre una posición de las unidades de sacárido adicionales y las posiciones 2-, 3-, 4- y/o 6- de las unidades de sacárido precedentes. Los alquilpoliglicósidos que se prefieren tienen la fórmula R20 CnH2nO) t (glicosilo) en donde R se selecciona del grupo que consiste de alquilo, alquilfenilo, hidroxialquilo, hidroxialquifenilo y mezclas de los mismos en los cuales los grupos alquilo contienen entre aproximadamente 10 y 18, de preferencia entre aproximadamente 12 y 14, átomos de carbono; n es 2 ó 3, de preferencia 2; t es entre 0 y aproximadamente 10, de preferencia 0; y x es entre aproximadamente 1.3 y 10, de preferencia entre aproximadamente 1.3 y 3, con mayor preferencia entre aproximadamente 1.3 y 2.7. El glicosilo de preferencia es derivado de glucosa. Para preparar estos compuestos, el alcohol o el alquilpolietoxi alcohol se forma primero y después se hace reaccionar con glucosa o una fuente de glucosa, para formar el glucósido (unido en la posición 1) . Las unidades glicosílicas adicionales se pueden unir entonces entre su posición 1 y las posiciones 2-, 3-, 4-, y/o 6 de las unidades glicosílicas precedentes, de preferencia de manera predominante en la posición 2. Los productos de condensación de óxido de etileno con una base hidrofóbica formada por la condensación de óxido de propileno con propilenglicol también son adecuadas para usarse como surfactantes no iónicos adicionales de los sistemas surfactantes no iónicos de la presente invención. La porción hidrofóbica de estos compuestos de preferencia tendrá un peso molecular entre aproximadamente 1500 y 1800 y presentará insolubilidad en agua. La adición de fracciones de polioxietileno a esta porción hidrofóbica tiende a aumentar la solubilidad en agua de la molécula en su totalidad y el carácter líquido del producto se conserva hasta el punto en el que el contenido de polioxietileno es aproximadamente 50% del peso total del producto de condensación, el cual corresponde a la condensación con hasta aproximadamente 40 moles de óxido de etileno. Ejemplos de compuestos de este tipo incluyen algunos de los surfactantes Pluronic™ comercialmente disponibles, comercializados por BASF. También adecuados para usarse como surfactantes no iónicos del sistema surfactante no iónico de la presente invención, son los productos de condensación de óxido de etileno con el producto resultante de la reacción de óxido de propileno y etilendiamina. La fracción hidrofóbica de estos productos está constituida por el producto de reacción de la etilendiamina y un exceso de óxido de propileno y en general tienen un peso molecular entre aproximadamente 2500 y 3000. Esta fracción hidrofóbica se condensa con óxido de etileno hasta un punto en el que el producto de condensación contiene entre aproximadamente 40% y 80% en peso de polioxietileno y tiene un peso molecular entre aproximadamente 5,000 y 11,000. Ejemplos de este tipo de surfactantes no iónicos incluyen algunos de los compuestos Tetronic™ disponibles comercialmente, comercializados por BASF. Preferidos para usarse como surfactantes no iónicos de los sistemas surfactantes de la presente invención son los condensados de óxido de polietileno y alquil fenoles, los productos de condensación de alcoholes alifáticos primarios y secundarios con aproximadamente entre 1 y 25 moles de óxido de etileno, los alquilpolisacáridos y las mezclas de los mismos. Los que más se prefieren son los etoxilatos de alquilo C8-C14 fenol que tienen entre 3 y 15 grupos etoxi y etoxilatos de alcohol C8-C18 (de preferencia en promedio C10 ) que tienen entre 2 y 10 grupos etoxi y mezclas de los mismos. Surfactantes no iónicos bastante preferidos son los surfactantes de amidas de ácidos grasos polihidroxilados de la fórmula R2 - C - N - Z, II II, O R en donde R1 es H o R1 es hidrocarbilo C1-4, 2-hidroxietilo, 2 -hidroxipropilo o una mezcla de los mismos, R es hidrocarbilo C5_31 y Z es un polihidroxihidrocarbilo que tiene una cadena de hidrocarbilo lineal con al menos 3 hidroxilos unidos directamente a la cadena o un derivado alcoxilado de la misma. De preferencia R es metilo, R es alquilo C-^-Cj^ lineal o una cadena alquilo o alquenilo C16-C18 como un alquilo derivado de coco o mezclas de las mismas y Z se deriva de un azúcar reductor como glucosa, fructosa, maltosa o lactosa en una reacción de aminación reductora . Surfactantes aniónicos bastante preferidos incluyen surfactantes de sulfatos alquil alcoxilados. Ejemplos de estos son las sales o ácidos solubles en agua de fórmula RO(A)mS03M en donde R es un alquilo C10-C24- no substituido o un grupo hidroxialquilo que tiene un componente alquílico C10-C24 , de preferencia un alquilo o un hidroxi alquilo C12-C20, con mayor preferencia un alquilo o un hidroxialquilo C12-C18, A es una unidad etoxi o propoxi, m es mayor a cero, típicamente entre aproximadamente 0.5 y 6, con mayor preferencia entre aproximadamente 0.5 y 3 y M es H o un catión que puede ser, por ejemplo, un catión metálico (por ejemplo, sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, etc.), amonio o un catión sustituido con amonio. Los sulfatos alquil etoxilados así como los sulfatos alquil propoxilados se contemplan aquí. Ejemplos específicos de cationes sustituidos con amonio incluyen cationes de metil-, dimetil, tri etilamonio y cationes de amonio cuaternario como tetrametil amonio y cationes de dimetil piperidinio y aquéllos derivados de alquilaminas como etilamina, dietilamina, trietilamina, mezclas de las mismas y lo semejante. Surfactantes para ejemplificar son sulfato de alquilo C12-C18 polietoxilato (1.0) (C12-Clß E(l.O)M), sulfato de alquilo C12-C18 polietoxilato (2.25) (C12-C18 (2.25 ) M) , sulfato de alquilo C12-C18 polietoxilato (3.0) (C12-C18E(3.0)M) y sulfato de alquilo C12-C18 polietoxilato (4.0) (C12-C18E (4.0)M) , en donde M se selecciona convenientemente entre sodio y potasio. Surfactantes aniónicos adecuados para usarse son los surfactantes esteres de alquil sulfonatos que incluyen esteres lineales de ácidos carboxílicos C8-C20 (por ejemplo, ácidos grasos) los cuales se sulfonan con S03 según "The Journal of the American Oil Chemists Society", 52 (1975), pp . 323-329. Materias primas adecuadas podrían incluir sustancias grasas naturales como los derivados de sebo, aceite de palma, etc. Los surfactantes de esteres de alquil sulfonatos especialmente para aplicaciones de lavandería, comprenden surfactantes de esteres de alquil sulfonatos de la fórmula estructural: O R - CH - C - OR S03M en donde R es un hidrocarbilo C8-C20, de preferencia un alquilo o una combinación de los mismos, R4 es un hidrocarbilo C-L-Cg, de preferencia un alquilo o una combinación de los mismos y M es un catión que forma una sal soluble en agua con el éster de alquil sulfonato. Los cationes adecuados para formar la sal incluyen metales como sodio, potasio y litio y cationes de amonio sustituidos o no sustituidos, como monoetanolamina, dietanolamina y trietanola ina . De preferencia, R es alquilo C10-C16 y R4 es metilo, etilo o isopropilo. Se prefieren especialmente los sulfonatos de éster metílico en donde R es alquilo C10-C16. Otros surfactantes aniónicos adecuados incluyen los surfactantes de sulfato de alquilo los cuales son sales o ácidos solubles en agua de fórmula ROS03M en donde R de preferencia es un hidrocarbilo C10-C24, de preferencia un alquilo o hidroxialquilo que tiene un componente alquilo C10-C20, con mayor preferencia un alquilo o hidroxialquilo C12-C18 y M es H o un catión, por ejemplo un catión de metal alcalino (por ejemplo, sodio, potasio, litio) o amonio o amonio substituido (por ejemplo, cationes de metil-, dimetil-y trimetil amonio y cationes de amonio cuaternario como tetrametil amonio y cationes de dimetil piperidinio y cationes de amonio cuaternario derivados de alquilaminas como etilamina, dietilamina, trietilamina y mezclas de las mismas y lo semejante) . Típicamente, se prefieren las cadenas de alquilo C12-C16 para temperaturas bajas de lavado (por ejemplo, abajo de aproximadamente 50°C) y se prefieren cadenas de alquilo ci6~ci8 para temperaturas de lavado más altas (por ejemplo, arriba de aproximadamente 50 °C) . Otros surfactantes aniónicos útiles para fines de detergencia se pueden incluir también en las composiciones de detergentes para lavandería de la presente invención. Estos pueden incluir sales (que incluyen por ejemplo, sodio, potasio, amonio y sales de amonio sustituidas como sales de mono-, di- y trietanolamina) de jabones, alcansulfonatos primarios o secundarios C8-C22, olefinsulfonatos C8-C24, ácidos policarboxílicos sulfonados preparados por sulfonación del producto pirolizado de citratos de metales alcalinos, por ejemplo, los que se describen en la descripción de la patente Británica No. 1,082,179, C8-C24 alquilpoliglicoletersulfatos (que contienen hasta 10 moles de óxido de etileno) ; alquil glicerol sulfonatos, sulfonatos de acilo derivado graso glicerol, sulfatos de oleil derivado graso glicerol, sulfatos de éter de óxido de etileno y alquil fenol, parafin sulfonatos, alquil fosfatos, isetionatos como isetionatos de acilo, N-acil tauratos, alquil succinamatos y sulfosuccinatos, monoésteres de sulfosuccinatos (en especial monoésteres saturados e insaturados C12-C18) y diésteres de sul fosuccinatos (en especial diésteres saturados e insaturados C6-C12), acil sarcosinatos , sulfatos de alquilpolisacáridos como los sulfatos de alquilpoliglucósido (los compuestos no iónicos no sulfatados se describen abajo) , alquil sulfatos primarios ramificados y alquil polietoxi carboxilatos como los de la fórmula RO (CH2CH20) k-CH2-COO-M+ en donde R es un alquilo C8-C22, k es un entero entre 1 y 10 y M es una sal soluble que forma catión. Los ácidos resínicos y los ácidos resínicos hidrogenados también son adecuados, como la colofonia, la colofonia hidrogenada y los ácidos resínicos y ácidos resínicos hidrogenados presentes en el tall oil o derivados del mismo . Los alquilbencen sulfonatos son bastante preferidos. Especialmente preferidos son los alquilbencen sulfonatos lineales (cadena recta) (LAS) en donde el grupo alquilo de preferencia contiene entre 10 y 18 átomos de carbono. Otros ejemplos se describen en "Surface Active Agents and Detergents" (Vol. I y II by Schwartz, Perry and Berch) . Una variedad de surfactantes también se describen en general en la Patente de los Estados Unidos 3,929,678 (Columna 23, de la línea 58 a la Columna 29, línea 23, la cual se considera forma parte de la presente, como referencia) . Cuando se incluyen aquí, las composiciones detergentes para lavandería de la presente invención típicamente comprenden entre aproximadamente 1% y 40%, de preferencia entre aproximadamente 3% y 20% en peso de surfactantes aniónicos. Las composiciones detergentes para lavandería de la presente invención pueden contener también, surfactantes catiónicos, anfolíticos, zwitteriónicos y semipolares, así como surfactantes no iónicos y/o aniónicos diferentes a los que ya se describieron aquí. Surfactantes detergentes catiónicos adecuados para usarse en las composiciones detergentes para lavandería de la presente invención son aquéllos que tienen un grupo hidrocarbilo de cadena larga. Ejemplos de estos surfactantes catiónicos incluyen los surfactantes de amonio como halogenuros de alquiltrimetilamonio y los surfactantes que tienen la fórmula: [R (OR3¡ [R4(OR3)y]2R5N+X- en donde R2 es un grupo alquilo o alquilbencilo que tiene entre 8 y 18 átomos de carbono en la cadena alquílica, cada R3 se selecciona del grupo que consiste de -CH2CH2-, -CH2CH(CH3) -, CH2CH (CH2OH) - , -CH2CH2CH2-, y mezclas de los mismos; cada R se selecciona del grupo que consiste de alquilo C1-C4, hidroxialquilo C -C^ estructuras de anillo bencílico formado al unir los dos grupos R4 , -CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH, en donde R6 es cualquier hexosa o polímero de hexosa que tiene un peso molecular inferior a 1000 e hidrógeno cuando y no es 0; R es igual a R4 o es una cadena alquílica, en donde el número total de átomos de carbono o R mas R no es mayor a aproximadamente 18; cada y es entre 0 y aproximadamente 10 y la suma de los valores de y es entre 0 y aproximadamente 15; y x es cualquier anión compatible . Surfactantes catiónicos bastante preferidos son los compuestos de amonio cuaternario solubles en agua útiles en la presente composición que tienen la fórmula : R1R2R3R4N+X" (i) en donde Rx es alquilo C8-C16, cada una de R2 , R3 , y R4 es independientemente alquilo C^C^ hidroxi alquilo Cx -C4 , bencilo y (C2H40)XH en donde x tiene un valor entre 2 y 5 y X es un anión. No más de uno de R2, R3 o R4 deberá ser bencilo. La longitud que se prefiere en la cadena alquílica para Rj es C12-C1S, particularmente cuando el grupo alquilo es una mezcla de longitudes de cadena derivadas del aceite de coco o del aceite de nuez de palma o se deriva sintéticamente mediante formación de olefinas o síntesis de alcoholes 0X0. Los grupos preferidos para R2, R3 y R4 son grupos metilo e hidroxietilo y el anión X se puede seleccionar entre los iones haluro, metosulfato, acetato y fosfato. Ejemplos de compuestos de amonio cuaternario adecuados de fórmula (i) para usarse aquí son: cloruro o bromuro de alquil (derivado de aceite de coco) trimetil amonio; cloruro o bromuro de alquil (derivado de aceite de coco) metil dihidroxietil amonio; cloruro de decil trietil amonio; cloruro o bromuro de decil dimetil hidroxietil amonio; cloruro o bromuro de C12-C1S dimetil hidroxietil amonio; cloruro o bromuro de alquil (derivado de aceite de coco) dimetil hidroxietil amonio; metil sulfato de miristil trimetil amonio; cloruro o bromuro de lauril dimetil bencil amonio; cloruro o bromuro de lauril dimetil (etenoxi)4 amonio; esteres de colina (compuestos de fórmula (i) en donde R es CH2 - CH2 -0-C - alqui l C12.14 y R R3R4 son met ilo ) 0 di alquil imidazolinas [compuestos de la fórmula (i)] . Otros surfactantes catiónicos útiles aquí se describen también en la Patente de los Estados Unidos 4,228,044 y en EP 000 224. Cuando se incluyen aquí, las composiciones detergentes para lavandería de la presente invención típicamente comprende entre 0.2% y aproximadamente 25%, de preferencia entre aproximadamente 1% y 8% en peso de los surfactantes catiónicos. Los surfactantes anfolíticos también son adecuados para usarse en las composiciones detergentes de la presente invención. Estos surfactantes se pueden describir ampliamente como derivados alifáticos de aminas secundarias o terciarias o derivados alifáticos de aminas heterocíclicas secundarias y terciarias en las cuales el radical alifático puede ser de cadena recta o ramificada. Uno de los substituyentes alifáticos contiene al menos aproximadamente 8 átomos de carbono, típicamente entre aproximadamente 8 y 18 átomos de carbono y al menos uno contiene un grupo aniónico que se solubiliza en agua, por ejemplo carboxi, sulfonato, sulfato. Ver Patente de los Estados Unidos 3,929,678 (columna 19, líneas 18-35) para ejemplos de estos surfactantes anfolíticos. Cuando se incluyen aquí, las composiciones detergentes de la presente invención típicamente comprenden entre 0.2% y aproximadamente 15%, de preferencia entre aproximadamente 1% y 10% en peso de estos surfactantes anfolíticos. Los surfactantes Zwitteriónicos también son adecuados para las composiciones detergentes de la presente invención. Estos surfactantes se pueden describir ampliamente como derivados de aminas secundarias y terciarias, derivados de aminas heterocíclicas secundarias y terciarias o derivados de compuesto de amonio cuaternario, fosfonio cuaternario o sulfonio terciario. Ver Patente de los Estados Unidos 3,929,678 (columna 19, línea 38 a columna 22, línea 48) para ejemplos de surfactantes zwitteriónicos. Cuando se incluyen aquí, las composiciones detergentes de la presente invención típicamente comprenden entre 0.2% y aproximadamente 15%, de preferencia entre aproximadamente 1% y 10% en peso de estos surfactantes zwitteriónicos. Los surfactantes no iónicos semi polares son una categoría especial de surfactantes no iónicos los cuales incluyen óxidos de amina solubles en agua que contienen una fracción alquílica con aproximadamente entre 10 y 18 átomos de carbono y 2 fracciones seleccionadas del grupo que consiste de grupos alquilo e hidroxialquilo que contienen entre aproximadamente 1 y 3 átomos de carbono; los óxidos de fosfina solubles en agua que contienen una fracción alquílica con aproximadamente entre 10 y 18 átomos de carbono y 2 fracciones seleccionadas del grupo que consiste de grupos alquilo e hidroxialquilo que contienen entre 1 y 3 átomos de carbono y sulfóxidos solubles en agua que contienen una fracción alquílica con aproximadamente entre 10 y 18 átomos de carbono y una fracción seleccionada del grupo que consiste de fracciones alqmli au e hi dioxialquí 1 icas con aproximadamente entre 1 y 3 átomos de carbono. Los surfactantes detergentes no iónicos semi polares incluyen los óxidos de amina que tienen la fórmu] a : O t R3 (OR4)xN(R5) 2 en donde R3 es un grupo alquilo, hidroxialquilo o alquil fenilo o mezclas de los mismos que contienen entre aproximadamente 8 y 22 átomos de carbono; R4 es un grupo alquileno o hidroxialquileno que contiene entre aproximadamente 2 y 3 átomos de carbono o mezclas de ellos; x es entre 0 y aproximadamente 3: y cada R es un grupo alquilo o hidroxialquilo que contiene entre aproximadamente 1 y 3 átomos de carbono o un grupo de óxido de polietileno que contiene entre aproximadamente 1 y 3 grupos de óxido de etileno. Los grupos R pueden unirse entre sí, por ejemplo, a través de un átomo de oxígeno o de nitrógeno, para formar una estructura de anillo . Estos surfactantes de óxidos de amina en particular incluyen óxidos de alquilo C10 - C1 B dimetil amina y óxidos de alcoxi C8-C12 etil dihidroxi etil amina . Cuando se incluyen aquí, las composiciones detergentes para lavandería de la presente invención típicamente comprenden entre 0.2% y aproximadamente 15%, de preferencia entre aproximadamente 1% y 10% en peso de estos surfactantes no iónicos semi polares.

Sistema Fortificador Las composiciones según la presente invención pueden comprender además un sistema fortificador. Cualquier sistema fortificador convencional es adecuado para usarse aquí se incluyen materiales de aluminosilicato , silicatos, policarboxilatos y ácidos grasos, materiales como tetraacetato de etilendiamina, secuestrantes de iones metálicos como los aminopolifosfonatos , en particular ácido etilendiamino tetrametilen fosfónico y ácido dietilen triamino pemtametilenfosfónico . Aunque con menor preferencia por razones ambientales obvias, también se pueden usar aquí fortificadores de fosfato. Fortificadores adecuados puede ser también un material inorgánico de intercambio iónico, usualmente un material inorgánico de aluminosilicatos hidratado, en particular una zeolita sintética hidratada como la zeolita hidratada A, X, B, HS o MAP . Otro material fortificador inorgánico es el silicato en capas, por ejemplo SKS-6 (Hoechst). El SKS-6 es un silicato cristalino en láminas que consiste en silicato de sodio (Na2Si205) . Policarboxilatos adecuados que contienen un grupo carboxi que incluye ácido láctico, ácido glicólico derivados eterificados de los mismos se exponen en las Patentes de Bélgica Nos. 831, 368, 821, 369 y 821,370. Policarboxilatos que contienen dos grupos carboxi incluyen las sales solubles en agua del ácido succínico, ácido malónico, ácido (etilendioxi) acético, ácido maléico, ácido diglicólico, ácido tartárico, ácido tartrónico y ácido fumárico así como los carboxilatos de éteres descritos en Germán Offenle-enschrift 2,446,686 y 2,446,487, Patente de los Estados Unidos No.3, 935,257 y los sulfinil carboxilatos descritos en la Patente de Bélgica No.840, 623. Policarboxilatos que contienen tres grupos carboxi incluyen, en particular, citratos solubles en agua, aconitratos y citraconatos así como derivados de succinatos como los carboximetiloxisuccinatos descritos en la Patente Británica No. 1,379,241, lactoxisuccinatos descritos en la Solicitud Holandesa 7205873 y los materiales de oxipolicarboxilato como 2-oxa- 1 , 1 , 3 -propantricarboxilatos descritos en la Patente Británica No. 1,387,447. Los policarboxilatos que contienen cuatro grupos carboxi incluyen oxidisuccinatos expuestos en la Patente Británica No. 1,261,829, 1,1,2,2-etan tetracarboxilatos, 1 , 1 , 3 , 3 -propan tetracarboxilatos que contienen substituyentes sulfo incluyen los derivados de sulfosuccinatos expuestos en las Patentes Británicas Nos. 1,398,421 y 1,398,422 y en la Patente de los Estados Unidos No. 3,936,448 y los citratos pirolizados sulfonados descritos en la Patente Británica No. 1,082,179, mientras que los policarboxilatos que contienen sustituyentes de fosfonio se exponen en la Patente Británica No. 1,439,000. Los policarboxilatos alicíclicos y heterocíclicos incluyen ciclopentan-cis , cis , cis-tetracarboxilatos , ciclopentadienido pentacarboxilatos, 2,3,4, 5- tetrahidrofuran-cis , cis , cis- tetracarboxilatos , 2 , 5 -tetrahidrofuran-cis, dicarboxilatos , 2,2,5,5-tetrahidrofuran tetracarboxilatos, 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6-hexan-hexacarboxilatos y derivados carboximetílicos de alcoholes polihídricos como sorbitol, manitol y xilitol. Los policarboxilatos aromáticos incluyen ácido piromelítico y derivados del ácido ftálico expuestos en la Patente Británica No. 1,425,343. De los anteriores los policarboxilatos que se prefieren son los hidroxi carboxilatos que contienen hasta tres grupos carboxi por molécula, en particular, los citratos. Los sistemas fortificadores que se prefieren para usarse en las presentes composiciones incluyen una mezcla de fortificador de alumino silicato insoluble en agua como zeolita A o un silicato en capas (SKS-6) y un agente quelante de carboxilato soluble en agua como el ácido cítrico. Un quelante adecuado para incluirse en las composiciones detergentes según la invención es el ácido etilendiamino-N, ' -disuccínico (EDDS) o las sales de metales alcalinos, alcalinotérreos, amonio sustituido o mezclas de las mismas. Los compuestos EDDS que se prefieren son la forma acida y as sales de sodio o magnesio del mismo. Ejemplos de las sales de sodio de EDDS que se prefieren incluyen Na2EDDS y Na4EDDS. Ejemplos de las sales de magnesio de EDDS que se prefieren incluyen MgEDDS y Mg2EDDS . Las sales de magnesio son las que más se prefieren para incluirse en las composiciones según la invención. Los sistemas fortificadores que se prefieren incluyen una mezcla de un fortificador de aluminosilicato insoluble en agua como zeolita A y un agente quelante de carboxilato soluble como el ácido cítrico. Otros materiales fortificadores que pueden formar parte del sistema fortificador para usarse en composiciones granulares incluyen materiales inorgánicos como carbonatos, bicarbonatos, silicatos de metales alcalinos y materiales orgánicos como los fosfonatos orgánicos, amino polialquilen fosfonatos y amino policarboxilatos. Otras sales orgánicas solubles en agua que son adecuadas son los ácidos homo- o copoliméricos o sus sales, en los cuales el ácido policarboxí lico comprende al menos dos radicales carboxilos separados entre sí por no más de dos átomos de carbono. Los polímeros de este tipo se exponen en GB-A-1,596,756. Ejemplos de estas sales son los poliacrilatos de PM 2000-5000 y sus copolímeros con anhídrido maléico, estos copolímeros tienen un peso molecular entre 20,000 y 70,000, en especial aproximadamente 40,000. Sales fortificadoras para detergencia se incluyen normalmente en cantidades entre 5% y 80% en peso de la composición. De preferencia los niveles de fortificador para los detergentes líquidos están entre 5% y 30%.

Enzimas Las composiciones detergentes que se prefieren, además de la preparación enzimática de la invención, comprenden otra(s) enzima (s) que imparten cualidades de limpieza y/o beneficios en el cuidado de la tela. Estas enzimas incluyen otras proteasas, lipasas, cutinasas, amilasas, celulasas, peroxidasas, oxidasas (por ejemplo, laccasas) .

Proteasas : Se puede usar cualquier otra proteasa adecuada para usarse en soluciones alcalinas. Las proteasas adecuadas incluyen las de origen vegetal o microbiano. Se prefieren las de origen microbiano. Se incluyen las mutantes modificadas química o genéticamente. La proteasa puede ser una proteasa de serina, de preferencia una proteasa microbiana alcalina o una proteasa análoga a tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son las subtilisinas, especialmente las que se derivan de Bacillus , por ejemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en WO 89/06279). Ejemplos de proteasas análogas a tripsina son tripsina (por ejemplo, de origen porcino o bovino) y la proteasa Fusarium descrita en WO 89/06270. Las enzimas proteasa comercialmente disponibles que se prefieren incluyen aquéllas que se comercializan con los nombres comerciales Alcalasa, Savinase, Primase, Durazym y Esperase de Novo Nordisk A/S (Dinamarca) , las que se comercializan con los nombres comerciales Maxatase, Maxacal, Maxapem, Properase, Purafect y Purafect OXP de Genecor International y las que se comercializan con los nombres comerciales Opticlean y Optimase de Solvay Enzymes. Las enzimas proteasas se pueden incorporar en las composiciones según la invención a un nivel entre 0.00001% y 2% de proteína enzimática por peso de composición, de preferencia a un nivel entre 0.0001% y 1% de proteína enzimática por peso de la composición, con mayor preferencia a un nivel entre 0.001% y 0.5% de proteína enzimática por peso de la composición y aún con mayor preferencia a un nivel entre 0.01% y 0.2% de proteína enzimática por peso de la composición.

Lipasas : Se puede utilizar cualquier lipasa adecuada para usarse en soluciones alcalinas. Las lipasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fungal . Se incluyen las mutantes modificadas química o genéticamente . Ejemplos de lipasas útiles incluyen una lipasa Humicola lanuginosa, por ejemplo, como la que se describe en EP 258 068 y EP 305 216, una lipasa Rhizomucor miehei, por ejemplo, como la que se describe en EP 238 023, una lipasa Candida , como una lipasa C . antárctica , por ejemplo la lipasa C. antárctica A o B que se describe en EP 214 761, una lipasa Pseudomonas como la lipasa P. alcaligenes y P. pseudoalcaligenes , por ejemplo, igual a al que se describe en EP 218 272, una lipasa P. cepacia, por ejemplo, como la que se describe en EP 331 376, una lipasa P. stutzeri, por ejemplo, según se expone en GB 1,372,034, una lipasa P . fluorescens , una lipasa Bacillus, por ejemplo, una lipasa B. subtilis (Dartois et al., (1993), Biochemica et Biophysica acta 1131, 253-260), una lipasa B. stearothermophilus (JP 64/744992) y una lipasa B. pumilus (WO/91/16422) . Además, varias lipasas clonadas pueden ser útiles, entre las que se incluyen la lipasa Penicillium camembertii descrita por Yamaguchi et al., (1991), Gene 103, 61-67), la lipasa Geotricum candidum (Schimada, Y, et al., (1989), J. Biochem. , 106 , 383-388) y varias lipasas Rhizopus como la lipasa R. dele ar (Hass, M.J. et al., (1991), Gene 109, 117-113), una lipasa ^ niveus (Kugimiya et al., (1992), Biosci. Biotech.

Biochem. 56, 716-719) y una lipasa R. oryzae. Otros tipos de enzimas lipolíticas como las cutinasas también pueden ser útiles, por ejemplo, una cutinasa derivada de Pseudomonas mendocina según se describe en WO 88/09367 o una cutinasa derivada de Fusarium solani pisi (por ejemplo, la que se describe en WO 90/09446) . Las lipasas especialmente adecuadas son lipasas como MI Lipasa™, Luma Fast™ y Lipomax™ (Genencor) , Lipolase™ y Lipolase Ultra™ (Novo Nordisk A/S) y Lipase P "Amano" (Amano Pharmaceutical Co .

Ltd. ) .

Las lipasas normalmente se incorporan en la composición detergente a un nivel entre 0.00001% y 2% de la proteína enzimática por peso de la composición, de preferencia a un nivel entre 0.0001% y 1% de proteína enzimática por peso de la composición, con mayor preferencia e un nivel entre 0.001% y 0.5% de proteína enzimática por peso de la composición, aún con mayor preferencia a un nivel entre 0.01% y 0.2% de proteína enzimática por peso de la composición.

Amilasas : Se puede utilizar cualquier amilasa (a y/o ß) adecuada para usarse en soluciones alcalinas. Las amilasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fungal . Se incluyen las mutantes modificadas química o genéticamente. Las amilasas incluyen por ejemplo, a-amilasas obtenidas a partir de una cepa especial de B . licheniformis , descrita con más detalle en GB 1,296,839. Amilasas comercialmente disponibles son Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™ y BAN™ (disponibles de Novo Nordisk A/S) y Rapidase™ y Maxamyl P™ (disponibles de Genencor) . Las amilasas normalmente se incorporan en la composición detergente a un nivel entre 0.00001% y 2% de la proteína enzimática por peso de la composición, de preferencia a un nivel entre 0.0001% y 1% de la proteína enzimática por peso de la composición, con mayor preferencia a un nivel entre 0.001% y 0.5% de la proteína enzimática por peso de la composición y aún con mayor preferencia a un nivel entre 0.01% y 0.2% de la proteína enzimática por peso de la composición.

Celulasas : Se puede utilizar cualquier celulasa adecuada para usarse en soluciones alcalinas. Las celulasas alcalinas incluyen las de origen bacteriano o fungal . Se incluyen las mutantes modificadas química o genéticamente. Las celulasas adecuadas se exponen en la Patente de los Estados Unidos 4,435,307, que describe celulasas fúngales producidas a partir de Humicola insolens . Celulasas especialmente adecuadas son las celulasas que tienen beneficios para el cuidado del color. Ejemplos de estas celulasas son las que se describen en la solicitud de Patente Europea No. 0 495 257. Las celulasas comercialmente disponibles incluyen Celluzyme™ producida por una cepa de Humicola insolens (Novo Nordisk A/S) y KAC-500(B)™ (Kao Corporation) . Las celulasas normalmente se incorporan en la composición detergente a un nivel entre 0.00001% y 2% de la proteína enzimática por peso de la composición, de preferencia a un nivel entre 0.0001% y 1% de la proteína enzimática por peso de la composición, con mayor preferencia a un nivel entre 0.001% y 0.5% de la proteína enzimática por peso de la composición y aún con mayor preferencia a un nivel entre 0.01% y 0.2% de la proteína enzimática por peso de la composición.

Peroxidasas/Oxidasas : Las enzimas peroxidasas se usan en combinación con peróxido de hidrógeno o una fuente del mismo (por ejemplo, un percarbonato, perborato o persulfato) . Las enzimas oxidasas se usan en combinación con oxígeno. Ambos tipos de enzimas se utilizan para "blanqueado de solución", es decir, para evitar la transferencia de un colorante textil a partir de una tela teñida a otra tela cuando estas telas se lavan juntas en el mismo licor de lavado, de preferencia junto con un agente reforzante como el que se describe por ejemplo, en WO 94/12621 y WO 95/01426. Peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen las de origen vegetal, bacteriano y fungal . Se incluyen las mutantes modificadas química o genéticamente. Las enzimas peroxidasas/oxidasas normalmente se incorporan en la composición detergente a un nivel entre 0.00001% y 2% de la proteína enzimática por peso de la composición, de preferencia e un nivel entre 0.0001% y 1% de la proteína enzimática por peso de la composición, con mayor preferencia a un nivel entre 0.001% y 0.5% de la proteína enzimática por peso de la composición y aún con mayor preferencia a un nivel entre 0.01% y 0.2% de la proteína enzimática por peso de la composición.

Se incluyen aquí las mezclas de las enzimas mencionadas arriba, en particular una mezcla de una proteasa, una amilasa, una lipasa y/o una celulasa. La enzima de la invención o cualquier otra enzima incorporada en la composición detergente, normalmente se incorpora en la composición detergente a un nivel entre 0.00001% y 2% de la proteína enzimática por peso de la composición, de preferencia a un nivel entre 0.0001% y 1% de la proteína enzimática por peso de la composición, con mayor preferencia a un nivel entre 0.001% y 0.5% de la proteína enzimática por peso de la composición y aún con mayor preferencia a un nivel entre 0.01% y 0.2% de la proteína enzimática por peso de la composición.

Agentes blanqueadores : Ingredientes opcionales adicionales para detergentes que pueden incluirse en las composiciones detergentes de la presente invención incluyen agentes blanqueadores como PB1, PB4 y percarbonato con un tamaño de partícula de 400-800 mieras. Estos componentes de agentes blanqueadores pueden incluir uno o más agentes blanqueadores oxigenados y dependiendo del agente blanqueador seleccionado, uno o más activadores de blanqueado. Cuando está presente el oxígeno los compuestos blanqueadores típicamente estarán presentes en niveles entre aproximadamente 1% y 25%. En general, los compuestos blanqueadores son componentes añadidos opcionales en las formulaciones no líquidas, por ejemplo, detergentes granulares. El componente del agente blanqueador que se usa aquí puede ser cualquiera de los agentes blanqueadores útiles para composiciones detergentes que incluyen blanqueadores oxigenados así como otros conocidos en el campo de la técnica. El agente blanqueador adecuado para la presente invención puede ser un agente blanqueador activado o no activado. Una categoría de agentes de blanqueo oxigenados que puede usarse abarca agentes blanqueadores de ácido percarboxílico y sales del mismo. Ejemplos apropiados de esta clase de agentes incluyen monoperoxiftalato de magnesio hexahidratado, sal de magnesio del ácido meta-cloro perbenzoico, ácido 4 -nonilamino-4 -oxoperoxibutírico y ácido diperoxidodecandioico . Estos agentes blanqueadores se exponen en la Patente de los Estados Unidos 4,483,781, Patente de los Estados Unidos 740,446, EP 0 133 354 y Patente de los Estados Unidos 4,412,934. Agentes blanqueadores bastante preferidos incluyen también el ácido 6-nonilamino-6-oxoperoxicaproico según se describe en la Patente de los Estados Unidos 4,634,551. Otra categoría de agentes blanqueadores que puede usarse incluye los agentes blanqueadores halogenados. Ejemplos de agentes blanqueadores hipohalita, por ejemplo, incluyen ácido tricloro isocianúrico y los dicloroisocianuratos de sodio y potasio y N-cloro y N-bromo sulfonamidas. Estos materiales normalmente se añaden en proporción de 0.5%-10% en peso del producto terminado, de preferencia en proporción de 1-5% en peso. Los agentes que liberan peróxido de hidrógeno se pueden usar en combinación con activadores de blanqueo como tetra-acetiletilendiamina (TAED) , nonanoiloxibencensulfonato (NOBS, descrito en la Patente de los Estados Unidos 4,412,934), 3 , 5 -trimetil -hexanoloxibencensulfonato (ISONOBS, descrito en EP 120,591) o pentaacetilglucosa (PAG), los cuales se perhidrolizan para formar un perecido como la especie blanqueadora activa, que conduce a mejorar el efecto blanqueador. Además, muy adecuados son los activadores de blanqueo C8 (6 -octanamido caproil) oxibencen sulfonato, C9 (6 -nonanamido caproil) oxibencensulfonato y CÍO (6-decanamido caproil) oxibencensulfonato o mezclas de los mismos. Activadores adecuados son también los esteres citratos acilados como los que se describen en la Solicitud de -Patente Europea No. 91870207.7. Agentes blanqueadores útiles, que incluyen peroxiácidos y sistemas blanqueadores que comprenden activadores de blanqueo y compuestos blanqueadores peroxigenados para usarse en composiciones limpiadoras según la invención se describen en la solicitud USSN 08/136, 626. También puede estar presente el peróxido de hidrógeno añadiendo un sistema enzimático (es decir, una enzima y un substrato para la misma) que sea capaz de generar peróxido de hidrógeno al inicio o durante el proceso de lavado y/o de enjuague. Estos sistemas enzimáticos se exponen en la Solicitud de Patente Europea EP 0 537 381. También se conocen en el campo de la técnica agentes blanqueadores diferentes a los agentes blanqueadores oxigenados y se pueden utilizar en la presente. Un tipo de agentes blanqueadores no oxigenados de interés particular incluye agentes blanqueadores fotoactivados como las ftalocianinas sulfonadas de cinc y/o aluminio. Estos materiales se pueden depositar en el substrato durante el proceso de lavado. Bajo irradiación luminosa, en presencia de oxígeno, tal como cuando se seca la ropa en el exterior y a la luz de día, la ftalocianina sulfonada de cinc se activa y en consecuencia, el substrato se blanquea. La ftalocianina sulfonada de cinc preferida y un proceso de blanqueo fotoactivado se describen en la Patente de los Estados Unidos 4,033,718. Típicamente, la composición detergente contendrá entre aproximadamente 0.025% y 1.25% en peso de la ftalocianina sulfonada de cinc . Los agentes de blanqueo pueden comprender también un catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso, puede ser por ejemplo, uno de los compuestos que se describen en "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature 369, 1994, pp . 637-639.

Supresores de espuma: Otro ingrediente adicional es el supresor de espuma, que se ejemplifica con las siliconas, y las mezclas de sílice-silicona. Las siliconas están representadas en general por los materiales de polisiloxano alquilados, mientras que la sílice normalmente se usa en las formas finamente divididas ejemplificadas por aerogeles y xelogeles de sílice y las sílices hidrofóbicas de diversos tipos. Estos materiales se pueden incorporar como particulados, en los cuales el supresor de espuma se incorpora libremente con ventaja en un vehículo para detergente que sea impermeable, soluble en agua o dispersable en agua, prácticamente no surfactante. En forma alternativa el supresor de espuma puede disolverse o dispersarse en un vehículo líquido y aplicarse por aspersión sobre uno o más de los otros componentes. Un agente de silicona controlador de espuma que se prefiere se expone en la Patente de los Estados Unidos 3,933,672. Otros supresores de espuma particularmente útiles son los supresores de espuma a base de siliconas auto-emulsificables , que se describen en la Solicitud de Patente Alemana DTOS 2,646,126. Un ejemplo de estos compuestos es DC-544, disponible comercialmente de Dow Corning, el cual es un copolímero de siloxano-glicol . Agentes controladores de espuma preferidos especialmente son los sistemas supresores de espuma que comprenden una mezcla de aceites de silicona y 2 -alquil-alcanoles . Los 2 -alquil -alcandés adecuados son 2 -butil -octanol que están disponibles comercialmente bajo el nombre comercial Isofol 12 R. Estos sistemas supresores de espuma se describen en la Solicitud de Patente Europea EP 0 593 841. Agentes controladores de espuma a base de silicona que se prefieren en especial se describen en la Solicitud de Patente Europea No. 92201649.8. Estas composiciones pueden contener una mezcla de silicona/sí lice en combinación con sílice no porosa calcinada como Aerosil . Los supresores de espuma descritos arriba normalmente se emplean a niveles entre 0.001% y 2% en peso de la composición, de preferencia entre 0.01% y 1% en peso.

Otros componentes: Se pueden emplear otros componentes utilizados en composiciones detergentes como agentes de suspensión de suciedad, agentes liberadores de suciedad, abrillantadores ópticos, abrasivos, bactericidas, inhibidores de empañado, agentes colorantes y/o perfumes encapsulados o no encapsulados. Los materiales encapsulantes especialmente adecuados son cápsulas solubles en agua que constan de una matriz de polisacárido y compuestos polihidroxilados según se describe en GB 1,464,616. Otros materiales encapsulantes solubles en agua adecuados comprenden dextrinas derivadas de esteres de ácidos de almidón sin gelatinizar de ácidos dicarboxílicos sustituidos según se describen en la Patente de los Estados Unidos 3,455,838. Estas dextrinas ácido-éster, de preferencia, se preparan a partir de almidones como los de maíz ceroso, sorgo ceroso, sagú, tapioca y papa. Ejemplos adecuados de estos materiales de encapsulación incluyen N-Lok fabricado por National Starch. El material encapsulante N-Lok está constituido por un almidón de maíz modificado y glucosa. El almidón está modificado por adición de grupos sustituyentes monofuncionales como el anhídrido del ácido octenil succínico. Los agentes anti re-depósito y de suspensión de suciedad adecuados aquí incluyen derivados de celulosa como metilcelulosa, carboximetilcelulosa e hidroxietilcelulosa y ácidos policarboxílieos homo- o copoliméricos o sus sales. Polímeros de este tipo incluyen los poliacrilatos y los copolímeros de anhídrido maléico-ácido acrílico que previamente se mencionaron como fortificadores , así como copolímeros de anhídrido maléico con etileno, éter metilvinílico o ácido metacrílico, el anhídrido maléico constituye al menos 20 moles por ciento del copolímero. Estos materiales normalmente se usan en niveles entre 0.5% y 10% en peso, con mayor preferencia entre 0.75% y 8% en peso, con preferencia superlativa entre 1% y 6% en peso de la composición. Los abrillantadores ópticos que se prefieren son de carácter iónico, ejemplos de estos son 4,4'-bis-(2-dietanolamino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino) estilben-2 : 2 ' disulfonato disódico, 4,4'-bis-(2-morfolino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino-estilben-2 : 2 ' -disulfonato disódico, 4 , 4 ' -bis- (2 , 4 -dianilino-s-triazin-6-ilamino) estilben-2 : 2 ' -disulfonato disódico, 4 ' ,4" -bis- (2,4 -dianilino-s- triazin-6- ilamino) -estilben-2-sulfonato monosódico, 4 , 4 ' -bis (2 -anilino-4 - (N-metil-N-2 -hidroxietilamino) -s-triazin-6-ilamino) estilben-2 , 2 ' -disulfonato disódico, 4 , 4 ' -bis- ( -fenil-2 , 1 , 3 -triazol-2-il) -estilben-2,2 ' disulfonato disódico, 4,4 'bis (2-anilino-4- ( 1 -etil -2 -hidroxietilamino) -s-triazin-6-ilamino) estilben-2 , 2 ' -disulfonato disódico, 2 (estilbil-4" - (nafto-1 ,,2,:4,5)-l,2, 3 - triazol -2 " -sulfonato de sodio y 4, 4' -bis (2 -sulfoestiril ) bifenilo . Otros materiales poliméricos útiles son los polietilenglicoles , en particular los de peso molecular de 1000-10000, más particularmente entre 2000 y 8000 y con preferencia superlativa de aproximadamente 4000. Estos se usan en niveles entre 0.20% y 5% con mayor preferencia entre 0.25% y 2.5% en peso. Estos polímeros y las sales de policarboxilatos homo- o copoliméricos previamente mencionadas son valiosas para mejorar la conservación de blancura, el depósito de ceniza sobre la tela y las cualidades de limpieza de arcillas, suciedad de origen proteico y oxidable en presencia de impurezas de metales de transición. Los agentes de liberación de suciedad útiles en las composiciones de la presente invención son convencionalmente copolímeros o terpolímeros de ácido tereftálico con unidades de etilen glicol y/o propilen glicol de diferentes estructuras. Ejemplos de estos polímeros se exponen en las Patentes de los Estados Unidos 4,116,885 y 4,711,730 y EP 0 272 033. Un polímero que se prefiere en particular según EP 0 272 033 tiene la fórmula: (CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25( (PEG)43CH3)0.75 en donde PEG es -(OC2H4)0-, PO es (OC3H60) y T es (pOOC6H4CO) . También muy útiles son los poliésteres modificados como los copolímeros aleatorios de tereftalato de dimetilo, sulfoisoftalato de dimetilo, etilenglicol y 1 , 2-propandiol , los grupos terminales están constituidos en primer lugar de sulfobenzoato y en segundo lugar de mono esteres de etilenglicol y/o 1 , 2 -propandiol . El objetivo es obtener un polímero bloqueado en los dos extremos por los grupos sulfobenzoato, "en primer lugar", en el presente contexto la mayoría de estos copolímeros estarán bloqueados en los extremos por grupos sulfobenzoato . Sin embargo, algunos copolímeros no estarán totalmente bloqueados y por lo tanto, sus grupos terminales pueden estar constituidos por etilen glicol y/o 1,2-propandiol , en esto consiste el "segundo lugar" de estas especies. Los poliésteres seleccionados aquí contienen aproximadamente 46% en peso de ácido dimetil tereftálico, aproximadamente 16% en peso de 1,2-propandiol, aproximadamente 10% en peso de etilen glicol, aproximadamente 13% en peso de ácido dimetil sulfobenzoico y aproximadamente 15% en peso de ácido sulfoisoftálico y tienen un peso molecular de aproximadamente 3.000. Los poliésteres y sus métodos de preparación se describen con detalle en EP 311 342.

Agentes suavizantes: Agentes suavizantes para telas también se pueden incorporar en las composiciones detergentes para lavandería de la presente invención. Estos agentes pueden ser de tipo orgánico o inorgánico. Los agentes suavizantes inorgánicos se ejemplifican con las arcillas esmectitas expuestas en la GB-A-1 400898 y en la Patente de los Estados Unidos 5,019,292. Los agentes suavizantes para telas orgánicos incluyen las aminas terciarias insolubles en agua según se exponen en GB-A-1 514 276 y EP 0 011 340 y sus combinaciones con sales de amonio cuaternario mono C12-C14 se exponen en EP-B-0 026 528 y las amidas con dos cadenas largas se exponen en EP 0 242 919. Otros ingredientes orgánicos útiles de los sistemas suavizantes para telas incluyen materiales de óxido de polietileno de alto peso molecular como los que se describen en EP 0 299 575 y 0 313 146. Los niveles de arcilla esmectita están normalmente en el intervalo entre 5% y 15%, con mayor preferencia entre 8% y 12% en peso y el material se añade como un componente mezclado en seco al resto de la formulación. Los agentes suavizantes para telas orgánicos como los materiales de aminas terciarias insolubles en agua o de amidas de dos cadenas largas se incorporan en niveles entre 0.5% y 5% en peso, normalmente entre 1% y 3% en peso, mientras que los materiales de óxido de polietileno de alto peso molecular y los materiales catiónicos solubles en agua se añaden en niveles entre 0.1% y 2%, normalmente entre 0.15% y 1.5% en peso. Estos materiales se añaden normalmente a la porción de secado por atomización de la composición, aunque en algunos casos es más conveniente añadirlos como un particulado mezclado en seco o atomizarlos como líquido fundido sobre otros componentes sólidos de la composición.

Agentes poliméricos inhibidores de transferencia de colorantes : Las composiciones detergentes según la presente invención pueden comprender también entre 0.001% y 10%, de preferencia entre 0.01% y 2%, con mayor preferencia entre 0.05% y 1% en peso de agentes poliméricos inhibidores de transferencia de colorantes. Estos agentes poliméricos inhibidores de transferencia de colorantes normalmente se incorporan en las composiciones detergentes para inhibir la transferencia de los colorantes de las telas teñidas a las telas que se lavan con ellas. Estos polímeros tienen la capacidad de acomplejar o absorber los colorantes fugitivos que se salen de las telas teñidas con el lavado antes de que los colorantes tengan la oportunidad de anclarse a otros artículos en el lavado. Agentes poliméricos inhibidores de transferencia de colorantes especialmente adecuados son los polímeros de N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinil pirrolidona y N-vinilimidazol , polímeros de polivinilpirrolidona, poliviniloxazolidonas y pol ivinilimidazoles o mezclas de los mismos. La adición de estos polímeros refuerza también el comportamiento de las enzimas según la invención. La composición detergente según la invención puede estar en las formas líquida, pastas, geles, barras o granular. Se pueden producir granulados no pulverizados, por ejemplo, como los que se exponen en la Patente de los Estados Unidos 4,106,991 y 4,661,452 (ambas de Novo Industri A/S) y opcionalmente pueden recubrirse por los métodos conocidos en el campo de la técnica. Ejemplos de materiales cerosos para recubrir son los productos de poli (óxido de etileno) (polietilenglicol, PEG) con pesos moleculares medios entre 1000 y 20000; nonilfenoles etoxilados que tienen entre 16 y 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los que el alcohol contiene entre 12 y 20 átomos de carbono y en los cuales hay entre 15 y 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono-, di- y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales para recubrir que forman película adecuados para aplicarse por técnicas en lecho fluidizado se dan en GB 1483591. Las composiciones granulares según la presente invención también pueden estar en "forma compacta", es decir, pueden tener una densidad relativamente mayor que la de los detergentes granulares convencionales, por ejemplo, entre 550 y 950 g/1; en este caso, las composiciones detergentes granulares según la presente invención contendrán una cantidad menor de "Sal de carga inorgánica" en comparación con los detergentes granulares convencionales; las sales de carga típicas son sales de metales alcalinotérreos de sulfatos y cloruros, típicamente sulfato de sodio; el detergente "compacto" típicamente contiene no más de 10% de sal de carga. Las composiciones líquidas según la presente invención también pueden estar en "forma concentrada", en tal caso, las composiciones detergentes líquidas según la presente invención contendrán una cantidad menor de agua, en comparación con los detergentes líquidos convencionales. Típicamente, el contenido de agua del detergente concentrado líquido es menor a 30%, con mayor preferencia menor a 20%, con preferencia superlativa menor a 10% en peso de las composiciones detergentes . Las composiciones de la invención, por ejemplo, pueden estar formuladas como composiciones detergentes para lavandería manual y en máquina y composiciones adecuadas para usarse en pretratamiento de telas manchadas, composiciones suavizantes para tela que se añaden en el enjuague y composiciones para usarse en general en operaciones domésticas de limpieza de superficies compactas y operaciones de lavado de vaj illas .

Los siguientes ejemplos están destinados a ejemplificar las composiciones de la presente invención, pero no significa necesariamente que limiten o de otro modo definan el alcance de la invención. En las composiciones detergentes, las identificaciones abreviadas del componente tienen los siguientes significados: LAS: Alquil C12 bencen sulfonato sódico lineal TAS: Alquil (derivado de sebo) sulfato de sodio XYAS : Alquil Clx-Clv sulfato de sodio SS: Jabón surfactante secundario de fórmula ácido 2-butil octanoico 25EY: Un alcohol primario C12-C15 predominantemente lineal condensado con un promedio de Y moles de óxido de etileno 45EY: Un alcohol primario C14-C15 predominantemente lineal condensado con un promedio de Y moles de óxido de etileno XYEZS : Alquilo Clx-Cly sulfato sódico condensado con un promedio de Z moles de óxido de etileno por mol No iónico: Mezcla de alcoholes grasos C13-C1S etoxilados/propoxilados con un grado de etoxilación promedio de 3.8 y un grado de propoxilación promedio de 4.5 comercializados con el nombre comercial Plurafax LF404 por BASF Gmbh CFAA: Alquilo C12 -C14 N-metil glucamida TFAA: Alqui lo C16 -C18 N-meti l glucamida Silicato : Silicato de sodio amorfo (relación Si02:Na20 = 2.0) NaSKS-6: Sil icato cristal ino en láminas de fórmula d-Na2Si205 Carbonato Carbonato de sodio anhidro Fosfato : Tripolifosfato de sodio MA/AA: Copolímero de ácido acrílico/maléico 1:4, con peso molecular promedio de aproximadamente 80,000. Poli- Homopolímero de poliaacrilato con un peso acrilato molecular promedio de 8,000 comercializados con el nombre comercial PA30 por BASF Gmbh Zeolita A: Aluminosilicato de sodio hidratado de fórmula Na12 (A102SÍ02 ) 12 . 27H20 que tiene un tamaño de partícula primario en el intervalo entre 1 y 10 micrómetros Citrato : Citrato trisódico dihidratado Cítrico : Acido cítrico Perborato Monohidrato de perborato de sodio anhidro blanqueador , fórmula empírica NaB02. H202 PB4 Tetrahidrato de perborato de sodio anhidro Percarbonato Percarbonato de sodio anhidro blanqueador de fórmula empírica 2Na2C03 . 3H202 TAED: Tetraacetil etilen diamina CMC: Carboximetil celulosa sódica DETPMP: Acido dietilen triamino penta (metilen fosfónico) , comercializado por Monsanto con el nombre comercial Dequest 2060 PVP: Polímero de polivinilpirrolidona EDDS: Acido etitilendiamino-N, N' -disuccínico, isómero [s,s] en la forma de sal sódica Supresor de 25% de cera de parafina, p.f.50°C, 17% de espumas : sílice hidrofóbica, 58% de aceite de parafina Supresor de 12% de silicona/sílice, 18% de alcohol espumas estearílico, 70% de almidón en forma granulado : granular Sulfato : Sulfato de sodio anhidro HMWPEO: Oxido de polietileno de alto peso molecular TAE 25 : Etoxilato de alcohol de sebo (25) Detergente Ejemplo I Una composición granulada para limpieza de telas según la invención se puede preparar de la manera siguiente : Alquil C12 bencen sulfonato 6.5 de sodio lineal Sulfato de sodio 15.0 Zeolita A 26.0 Nitrilotriacetato de sodio 5.0 Enzima de la invención 0.1 PVP 0.5 TAED 3.0 Acido bórico 4.0 Perborato 18.0 Fenol sulfonato 0.1 Minoritarios Hasta 100 Detergente Ejemplo II Una composición para la limpieza de telas granulada compacta (densidad 800 g/1) según la invención se puede preparar de la forma siguiente: 45AS 8.0 25E3S 2.0 25E5 3.0 25E3 3.0 TFAA 2.5 Zeolita A 17.0 NaSKS-6 12.0 Acido cítrico 3.0 Carbonato .0 MA/AA 5.0 CMC O .4 Enzima de la invención 0.1 TAED 6. O Percarbonato 22.0 EDDS 0.3 Supresor de espumas 3.5 granulado agua/minoritarios Hasta 100% Detergente Ejemplo III Composiciones granuladas para limpieza de telas según la invención que es especialmente útil en el lavado de telas de color se prepararon de la manera siguiente : TAS 2.4 TFAA - 4.0 45AS 3.1 10.0 45E7 4.0 25E3S - 3.0 68E11 1.8 25E5 - 8.0 Citrato 15.0 7.0 Carbonato - 10 Acido cítrico 2.5 3.0 Zeolita A 32.1 25.0 Na-SKS-6 - 9.0 MA/AA 5.0 5.0 DETPMP 0.2 0.8 Enzima de la invención 0.10 0.05 Silicato 2.5 Sulfato 5.2 3.0 PVP 0.5 Poli (4 -vinilpiridina) -N- - 0.2 Oxido/copolímero de vinil imidazol y vinil pirrolidona Perborato 1.0 Fenol sulfonato 0.2 Agua/Minoritarios Hasta 100% Detergente Ejemplo IV Composiciones granuladas para la limpieza de telas según la invención que imparten capacidad "Suavizante en el lavado" se pueden preparar de la manera siguiente : 45AS - 10.0 LAS 7.6 68AS 1.3 45E7 4.0 25E3 - 5.0 Cloruro de coco-alquil- 1.4 1.0 dimetil hidroxietil amonio Citrato 5.0 3.0 Na-SKS-6 - 11 Zeolita A 15.0 15.0 MA/AA 4.0 4.0 DETPMP 0.4 0.4 Perborato 15.0 Percarbonato 15.0 TAED 5.0 5.0 Arcilla "Esmectita 10.0 10.0 HMWPEO 0.1 Enzima de la invención 0.10 0.05 Silicato 3.0 5.0 Carbonato 10.0 10.0 Supresor de espumas 1.0 4.0 granulado CMC 0.2 0.1 Agua/Miñoritarios Hasta 100% Detergente Ejemplo V Composiciones líquidas de uso rudo para limpieza de telas según la invención se pueden preparar de la manera siguiente: II LAS forma acida 25 Acido cítrico 5.0 2.0 25AS forma acida 8.0 25AE2S 3.0 25AE7 8.0 CFAA 5 DETPMP 1.0 1.0 Acido graso 8 Acido oleico - 1.0 Etanol 4.0 6.0 Propanodiol 2.0 6.0 Enzima de la invención 0.10 0.05 Cloruro de coco alquil - 3.0 dimetil hidroxietil amonio Arcilla esmectita - 5.0 PVP 2.0 Agua/Minoritarios Hasta 100% APLICACIONES EN LA INDUSTRIA PELETERA Una subtilasa de la invención puede utilizarse en la industria peletera, en particular para usarse en la depilación de pieles. En esta aplicación una variante de subtilasa de la invención de preferencia se usa en una composición enzimática que comprende además otra proteasa . Para descripción más detallada de otras proteasas adecuadas ver la sección que se relaciona con las enzimas adecuadas que se usan en una composición detergente (ver más arriba) .

APLICACIONES EN LA INDUSTRIA DE LA LANA Una subtilasa de la invención se puede utilizar en la industria de la lana, en particular para usarse en la limpieza de ropa que comprenda lana. En esta aplicación una variante de subtilasa de la invención se usa de preferencia en una composición enzimática que además contiene otra proteasa . Para una descripción más detallada de otras proteasas adecuadas ver la sección relacionada con las enzimas adecuadas que se usan en una composición detergente (ver más arriba) . La invención se describe con más detalle en los ejemplos siguientes los cuales de ninguna manera están destinados a limitar el alcance de la invención tal como se solicita.

MATERIALES Y MÉTODOS Cepas B . subtili s DN1885 (Diderichsen et al., 1990) B . l en tus 309 y 147 son cepas específicas de Baci llus len tus, depositadas en la NCIB y a las que se otorgaron los número de acceso NCIB 10309 y 10147 y descritas en la Patente de los Estados Unidos No. 3,723,250 la cual se considera forma parte de la presente, como referencia. E . col i MC 1000 (M.J. Casabadan and S.N. Cohén (1980); J. Mol . Bi ol . 138 179-207), se hizo r" , m+ mediante métodos convencionales y también se describe en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Número de Serie 039,298.

Plásmidos pJS3 : E . col i - B . subti l i s vector de lanzadera que contiene un gen sintético que codifica para subtilasa 309. (Descrito por Jacob Schiodt et al. en Protein and Peptide letters 3:39-44 (1996)) . pSX222: B . subti l i s vector de expresión (Descrito en WO 96/34946) .

Métodos generales de biología molecular: A menos que se indique de otro modo las manipulaciones y transformaciones de ADN se realizaron utilizando métodos estándar de biología molecular (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990) . Las enzimas para manipulaciones de ADN se usaron según las especificaciones de los proveedores.

Enzimas para manipulaciones de ADN A menos que se indique de otro modo todas las enzimas para las manipulaciones de ADN, por ejemplo, como las endonucleasas de restricción, ligasas etc., se obtuvieron de New England Biolabs, Inc.

Actividad Proteolítica En el contexto de esta invención la actividad proteolítica se expresa en Unidades de Proteasa Kilo NOVO (KNPU) . La actividad se determina con relación a una enzima estándar (SAVINASE®) y la determinación se basa en la digestión de una solución de dimetil caseína (DMC) con la enzima proteolítica en condiciones estándar, es decir, 50°C, pH 8.3, tiempo de reacción 9 min, tiempo de determinación 3 min. El folleto AF 220/1 esta disponible al solicitarlo a Novo Nordisk A/S, Dinamarca, este folleto se considera que forma parte de la presente, como referencia. Una GU es una Unidad de Glicina, definida como la actividad enzimática proteolítica, la cual en condiciones estándar, durante 15 minutos de incubación a 40 grados C, con N-acetil caseína como substrato, produce una cantidad de grupos NH2 equivalente a 1 mmol de glicina. La actividad enzimática también se puede determinar utilizando el ensayo de PNA, según la reacción con el substrato soluble succinil-alanina-alanina-prolina-fenil -alanina-para-nitrofenol , que se describe en Journal of American Oil Chemists Society, Rothgeb, T.M., Goodlander, B.D., Garrison, P.H. and Smith, L.A. , (1988) .

Fermentación: Las fermentaciones de las enzimas subtilasa se llevaron a cabo a 30aC en una mesa vibratoria rotatoria (300 r.p.m.) en un matraz Erlen eyer con desviación de 500 mi que contenía 100 mi de medio BPX durante 5 días. En consecuencia para hacer un caldo de 2 litros, por ejemplo, se fermentaron 20 matraces Erlenmeyer en forma simultánea.

Medio : BPX: Composición (por litro) Almidón de papa lOOg Cebada triturada 50g Harina de soya 20g Na2HP04 X 12 H20 9g Pluronic 0. lg Caseinato de sodio lOg El almidón en el medio se hidroliza con a-amilasa y el medio se esteriliza por calentamiento a 120°C por 45 min. Después de la esterilización el pH del medio se ajusta a 9 mediante la adición de NaHC03 0. ÍM.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Construcción y Expresión de Variantes de Enzimas Mu tagénesi s dirigida al si ti o : Variantes de subtilasa 309 dirigidas al sitio se hicieron mediante la técnica "Unique site elimination (USE) " ("Eliminación de sitio único") o "Uracil-USE" descritas respectivamente por Deng et al. (Anal. Biochem. 200:81-88 (1992)) y Markvardsen et al. (BioTechniques 18 (3 ): 371-372 (1995)). El plásmido patrón fue pJS3 o un análogo de este que contenía una variante de Subtilasa 309, por ejemplo, la mutagénesis USE de llevó a cabo en el análogo de pJS3 que contenía un gen que codificaba para la variante Y167A con un oligonucleótido dirigido a la construcción variante R170L que dio por resultado una variante de Subtilasa 309 final Y167A+R170L. Las variantes de Subtilasa 309 construidas en pJS3 se subclonaron entonces en el plásmido de expresión B . subti l i s pSX222, utilizando las enzimas de restricción Kpnl y Mlul .

Mu tagénesi s Al ea toria Localizada La estrategia general utilizada para llevar a cabo la mutagénesis aleatoria localizada fue: se sintetizó un cebador mutagénico (oligonucleótido) el cual correspondía a la parte de la ez o / o secuencia de ADN que se iba a mutagenizar excepto el (los) nucleótido (s) corespondiente (s) a un codón de aminoácido que se iba a mutagenizar. Subsecuentemente, el cebador mutagénico resultante se usó en la reacción PCR con un cebador contrario adecuado. El fragmento PCR resultante se purificó y se llevó a digestión y se clonó en un vector lanzadera E. coli -B. subtilis . Alternativamente, si es necesario, el fragmento PCR resultante se usa en una segunda reacción PCR como un cebador con un segundo cebador contrario adecuado para permitir la digestión y clonación de la región mutagenizada en el vector lanzadera. Las reacciones PCR se llevan a cabo en condiciones normales. Siguiendo esta estrategia se construyó una biblioteca aleatoria localizada en la SAVINASE en donde tanto la posición Y167 como la R170 estaba completamente aleatorizada . Un oligonucleótido se sintetizó con 25% de cada una de las cuatro bases (N) en la primera y segunda base en los codones de aminoácidos que se querían mutagenizar. El tercer nucleótido (la base vacilante) en codones se sintetizaron con 50%G/50%C (S) para evitar dos (TAA,TGA) de los tres codones sin sentido . Los cebadores mutagénicos (5' - GTT TGG ATC AGT AGC TCC GAC TGC CAT TGC GTT CGC ATA SNN CGC CGG SNN GCT GAT TGA GCC - 3 ' (anti sentido) ) se usaron en una reacción PCR con un cebador contrario adecuado (por ejemplo, 5' GAA CTC GAT CCA GCG ATT TC 3' (de sentido)) y el plásmido pJS3 como patrón. Este producto PCR que resultó se clonó en el vector lanzadera pJS3 utilizando las enzimas de restricción Asp 718 y Bel I. La biblioteca aleatoria localizada construida en pJS3 se subclonó entonces en el plásmido de expresión B . subti l i s pSX222, utilizando las enzimas de restricción Kpnl y Mlul . La biblioteca preparada contenía aproximadamente 100,000 clones individuales / biblioteca . Diez colonias seleccionadas aleatoriamente se secuenciaron para confirmar las mutaciones diseñadas. Para purificar una variante de subtilasa de la invención el plásmido de expresión B . subti l i s pSX222 que comprendía una variante de la invención se transformó en una cepa apta de B . subti lis y se fermentó de la forma que se describió arriba en un medio que contenía 10 µg/ml de Cloranfenicol (CAM) .

EJEMPLO 2 Purificación de Variantes de Enzimas: Este procedimiento se refiere a la purificación de una fermentación a escala de 2 litros de la enzima Subtilisina 147, la enzima Subtilisina 309 o mutantes de las mismas. Aproximadamente 1.6 litros de caldo de fermentación se centrifugaron a 5000 rpm por 35 minutos en vasos de 1 litro. Los sobrenadantes se ajustaron a un pH de 6.5 usando ácido acético 10% y se filtraron en placas filtrantes Seitz Supra S100. Los filtrados se concentraron a aproximadamente 400 mi utilizando una unidad Amicon CH2A UF equipada con un cartucho Amicon S1Y10 UF . El concentrado UF se centrifugó y se filtró antes de absorberse a temperatura ambiente en una columna de afinidad de Bacitracina a pH 7. Las proteasas se eluyeron de la columna de Bacitracina a temperatura ambiente utilizando 2-propanol 25% y cloruro de sodio ÍM en una solución amortiguadora con ácido dimetil glutárico 0.01, ácido bórico 0.1 M y cloruro de calcio 0.002 M ajustada a un pH de 7. Las fracciones con actividad de proteasa provenientes del paso de purificación con Bacitracina se combinaron y se aplicaron a una columna de Sephadex G25 de 750 mi (5 cm de diámetro) equilibrada con un amortiguador que contenía ácido dimetilglutárico 0.01, ácido bórico 0.2 M y cloruro de calcio 0.002 m ajustado a pH 6.5. Las fracciones con actividad proteolítica provenientes de la columna de Sephadex G25 se tp TÍÜ / a QMV combinaron y se aplicaron a una columna de intercambio catiónico CM Sepharose CL 6B de 150 mi (5 cm de diámetro) equilibrada con un amortiguador que contenía ácido dimetilglutárico 0.01 M, ácido bórico 0.2 M y cloruro de calcio 0.002 M ajustado a pH 6.5. La proteasa se eluyó utilizando un gradiente lineal de cloruro de sodio 0-0.1 M en 2 litros del mismo amortiguador (cloruro de sodio 0-0.2 M en el caso de la Subtilisina 147) . En un paso de purificación final las fracciones que contenían proteasa provenientes de la columna CM Sepharose se combinaron y se concentraron en una celda de ultrafiltración Amicon equipada con membrana GR81PP (de Danish Sugar Factories Inc.). Usando las técnicas del Ejemplo 1 para la construcción y el procedimiento de aislamiento de arriba se produjeron y se aislaron las variantes se subtilisi^»a 309 siguientes: Y167A+R170S Y167A+R170L Y167A+R170N Y167P Y167P+R170L Y167V+R170T Y167I+R170T Y167V+R170Q Y167S+R170Q Y167T+R170N Y167A+R170A Y167T Y167T-1R170A Y167P+R170S Y167I+R170L Y167F+R170T Y167F+R170E Y167F+R170H Y167F+R170T Y167F+R170L Y167L R170H Y167S EJEMPLO 3 Comportamiento en condiciones de lavado de las Composiciones Detergentes que Comprenden Variantes de Enzima Los siguientes ejemplos proporcionan resultados de varias pruebas de lavado que se realizaron en las condiciones que se indican Condiciones experimentales Tabla IV: Condiciones experimentales para evaluación de variantes de Subtilisina 309.

Después del lavado las ropas se enjuagaron con agua de la tubería y se secaron con aire. El detergente modelo de arriba es una formulación detergente simple. Las particularidades más características son que como fortificador se usa STP y el contenido de surfactante aniónico (LAS) es bastante alto. Además el pH está ajustado a 10.4, el cual está dentro del intervalo normal de un detergente en polvo.

Tabla V La composición del detergente modelo es la siguiente % STP (Na5P3O10 ) 10% Zeolita (Wessalith P) 10% Na2S04 10% Na2C03 25% LAS (Nansa 80S) 5% NI (Dobanol 25-7) 5% Na2Si205 0.5% Carboximetilcelulosa (CMC) 9.5% agua La dureza del agua se ajusta adicionando CaCl2 y MgCl2 a agua deionizada. El pH de la solución de detergente se modifica al valor deseado mediante la adición de ácido. La medición de la remisión (R) en el material de prueba se ha realizado a 460 nm utilizando un fotómetro Elrepho 2000 (sin UV) . Abertura: 10 mM. El comportamiento en condiciones de lavado en XnM se calcula como: Rx - Ro Px Rx,ref - Ro Rx: es el efecto de lavado de la enzima en X nM (en unidades de remisión) R0 : es el efecto de lavado de la enzima en 0 nM (valor blanco) Tabla VI: Variantes y factores de mejoramiento para SAVINASE® Como puede observarse en la Tabla VI las variantes de SAVINASE® de la invención presentan mejoramiento en el comportamiento en condiciones de lavado . En una prueba de lavado similar posterior las variantes de SAVINASE® mostraron un valor de comportamiento en condiciones de lavado en el intervalo entre la variante Y167I+R170L y Y167A+R170S: Y167P Y167P+R170L Y167V+R170T Y167I+R170T Y167V+R170Q Y167S+R170Q Y167T+R170N Y167A+R170A Y167T+R170L Y167T+R170A Y167P+R170S EJEMPLO 4 Comportamiento en condiciones de lavado de Composiciones Detergentes que Comprenden Variantes de Enzimas Los ejemplos siguientes proporcionan resultados de varias pruebas de lavado que se llevaron a cabo en las condiciones que se indican CONDICIONES EXPERIMENTALES Tabla VII: Condiciones experimentales para evaluación de variantes de Subtilisina 309.

El detergente utilizado es una formulación modelo simple. El pH se ajusta a 10.5 el cual está dentro del intervalo normal para un detergente en polvo. La composición del detergente modelo 95 es la siguiente: % STP (Na5P3O10) 25% Na2S04 10% Na2C03 20% LAS (Nansa 80S) 5.0% Surfactante no iónico (Dobanol 25-7) 5.0% Na2Si205 0.5% Carboximetilcelulosa (CMC) 9.5% agua La dureza del agua se ajustó adicionando CaCl2 y MgCl2 (Ca + : Mg + = 2:1) a agua deionizada (ver también Surfactants in Consumer Products - Theory, Technology and Application, Springer Verlag 1986). El pH de la solución detergente se ajustó a 10.5 mediante la adición de HCl. La medición de la reflectancia (R) en el material de prueba se hizo a 460 nm utilizando un fotómetro Macbeth ColorEye 7000 (Macbeth, División of Kollmorgen Instruments Corporation, Alemania) . Las mediciones se hicieron según el protocolo de los fabricantes . El comportamiento en condiciones de lavado de las variantes de Subtilisina 309 se evaluaron calculando un factor de funcionamiento: *, ' na n t — R Blanco R Savtnase R Blanco P : Factor de funcionamiento R V„a„r i, a3n„tt„e : ' Ref lectancia del materia l de prueba lavado con la variante Savinase ' Reflectante del material de prueba lavado con Savinase® R Blanco Reflectancia del material de prueba lavado sin enzima Las variantes de Subtilisina 309 reclamadas tienen comportamiento en condiciones de lavado mejorado en comparación con la SAVINASE® - es decir, P > 1. Las variantes están divididas en clases de mejoramiento designadas con letras mayúsculas: Clase A 1 < P < 1.5 Clase B 1.5 < P < 2 Clase C P > 2 Tabla VIII: Variantes de Subtilisina 309 y clases de mejoramiento .

EJEMPLO 5 Experimento de fermentación comparativo con variante (s) del principal aspecto de la invención combinadas con otra(s) modificación (es) en la(las) posición(es) 129, 131, 133 y/o 194 La variante de Savinase® Y167I+R170L+A194P se comparó en un experimento de fermentación con una variante Y167I+R170L que no tenía la sustitución A194P. Las dos variantes se clonaron en un vector de expresión pSX222 base y se fermentaron de la forma que se describe arriba en 100 mi de medio BPX que contenía 10 µg/ml de CAM. Después de 5 días de fermentación 1.5 mi del medio de fermentación BPX se centrifugaron y el sobrenadante se usó para medir la actividad Proteolítica (KPNU) de la forma que se describió arriba . El medio de fermentación que contenía la variante Y167I+R170L+A19 P tuvo un nivel de actividad proteolítica significativamente mayor en comparación con el medio de fermentación que contenía la variante Y167I+R170L. Las dos variantes tienen la misma actividad específica. Resultados semejantes se obtuvieron con las variantes Y167A+R170S+A194P, Y167A+R170L+A194P Y Y167A+R170N+A194 P comparadas con sus variantes correspondientes sin la mutación A194P. Además, se obtuvieron resultados semejantes con las variantes A133P+Y167A+R170S, A133D+Y167A+R170S, P129K+Y167A+R170S y P131H+Y167A+R170S comparadas con sus correspondientes variantes sin las mutaciones A133P, A133D, P129K y P131H.

Claims (19)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Un método para producir una variante de enzima subtilasa que tiene comportamiento en condiciones de lavado mejorado en detergentes, en comparación al comportamiento en condiciones de lavado de la subtilisina 309 de B. lentus y que comprende modificaciones tanto en la posición 167 como en la 170 (en numeración BASBPN) y en donde el método comprende: (i) construir un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN aislada que codifica para la variante de subtilasa; (ii) transformar una célula hospedera microbiana con el vector de expresión del paso i) ; (iii) cultivar la célula hospedera del paso ii); en condiciones conducentes a la expresión y secreción de la variante; y (iv) recuperar la variante; con excepción de las variantes de subtilasa Y167L+R170L; Y167L+R170I; Y167I+R170L; Y167I+R170I; Y167F+R170L; Y167F+R170I; Y167V+R170L y Y167V+R170I de la subtilasa subgrupo I-S2.
2. 2. El método según la reivindicación 1, en donde la modificación se selecciona del grupo que comprende (en numeración BASBPN) : 167(G,A,S o T}+170(G,A,S o T} 167{G,A,S o T}+170{L,I o V} 167(G,A,S o T}+170{Q o N} 167P+170{L, I o V} 167{L,I, o V}+170{G,A,S o T} 167{L, I o V}+170{Q o N} 167P+170(G, A, S o T} 167{L, I, o V}+170(L, I, o V} 167{F,W o Y}+170{G,A,S o T} 167{F,W o Y}+170{E o D} 167{F,W o Y}+170{R,K o H} 167(F,W o Y}+170(L, I, o V}
3. 3. El método según la reivindicación 2, en donde la modificación se selecciona del grupo que comprende (en numeración BASBPN) : 167A+170S, 167A+170L, 167A+170N 167P+170L 167V+170T 167I+170T 167V+170Q 167S+170Q 167T+170N 167A+170A 167T+170L 167T+170A 167P+170S 167F+170T 167F+170E 167F+170H 167F+170T.
4. 4. El método según la reivindicación 2, en donde la modificación se selecciona del grupo que comprende (en numeración BASBPN) : Y167{G,A,S o T } +R170 { G, A, S o T} Y167(G,A,S o T}+R170(L,I o V} Y167(G,A,S o T}+R170(Q o N} Y167P+R170{L, I o V} Y167{L,I, o V}+R170{G,A,S o T} Y167{L,I o V}+R170{Q o N} Y167P+R170(G,A,S o T} Y167{L,I, o V}+R170(L,I, o V} Y167{F,W o Y}+R170{G,A,S o T} Y167{F,W o Y}+R170{E o D} Y167{F,W o Y}+R170{R,K o H} Y167{F,W o Y}+R170{L,I, o V} en donde las variantes de subtilasa Y167L+R170L; Y167L+R170I; Y167I+R170L; Y167I+R170I; Y167F+R170L; Y167F+R170I; Y167V+R170L y Y167V+R170I se rechazan.
5. 5. El método según la reivindicación 4, en donde la modificación se selecciona del grupo que comprende (en numeración BASBPN) : Y167A+R170S Y167A+R170L Y167A+R170N Y167P+R170L Y167V+R170T Y167I+R170T Y167V+R170Q Y167S+R170Q Y167T+R170N Y167A+R170A Y167T+R170A Y167P+R170S Y167F+R170T Y167F+R170E Y167F+R170H Y167F+R170T.
6. 6. El método según alguna de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la variante es una variante de una subtilasa precursora que se selecciona del subgrupo I-SI.
7. 7. El método según la reivindicación 6, en donde la subtilasa precursora se selecciona del grupo que comprende ABSS168, BASBPN, BSSDY y BLSCAR o variantes funcionales de las mismas que han conservado la característica del subgrupo I-SI.
8. 8. El método según alguna de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la variante es una variante de una subtilasa precursora que se selecciona del subgrupo I-S2.
9. 9. El método de la reivindicación 8, en donde la subtilasa precursora se selecciona del grupo que comprende BLS147, BLS309, BAPB92, TVTHER y BYSYAB o variantes funcionales de las mismas que han conservado la característica del subgrupo I-S2.
10. 10. El método según alguna de las reivindicaciones de arriba, en donde la (las) modificación (es ) se combina (n) con una o más modificaciones en alguna otra posición (es) .
11. 11. El método según la reivindicación 10, en donde la(s) modificación (es ) se combina(n) con modificación (es) en una o más de las posiciones 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 206, 218, 222, 224, 235 y 274.
12. 12. El método según la reivindicación 11, en donde la subtilasa pertenece al subgrupo I-S2 y el otro cambio se selecciona del grupo que comprende K27R, *36D, S57P, N76D, S87N, G97N, S101G, V104A, V104N, V104Y, H120D, N123S, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L y T274A.
13. 13. El método según la reivindicación 11, que comprende alguna de las variantes S101G+V104N, S87N+S101G+V104N, K27R+V104Y+N123S+T274A o N76D+V104A u otras combinaciones de estas mutaciones (V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A), en combinación con una o más de las sustituciones, eliminaciones y/o inserciones mencionadas en alguna de las reivindicaciones 1 a 12.
14. 14. El método según alguna de las reivindicaciones precedentes, en donde la(s) modificación (es ) se combinan con modificación (es ) en una o más de las posiciones 129, 131, 133 y 194.
15. 15. El método según la reivindicación 14, en donde la subtilasa pertenece al subgrupo I-S2 y la otra modificación se selecciona del grupo que comprende P129K, P131H, A133P, A133D y A194P.
16. 16. El método según la reivindicación 15, en donde la modificación se selecciona del grupo que comprende : Y167A+R170S+A194P Y167A+R170L+A194P Y167A+R170N+A194P Y167A+R170S+P129K Y167A+R170L+P129K Y167A+R170N+P129K Y167A+R170S+P131H Y167A+R170L+P131H Y167A+R170N+P131H Y167A+R170S+A133P Y167A+R170L+A133P Y167A+R170N+A133P Y167A+R170S+A133D Y167A+R170L+A133D Y167A+R170N+A133D
17. 17. El método según alguna de las reivindicaciones 1 a 16, en donde la célula hospedera microbiana es una bacteria, de preferencia una Bacillus, en especial B . len tus .
18. 18. El método según alguna e las reivindicaciones 1 a 16, en donde la célula hospedera microbiana es un hongo o una levadura, de preferencia un hongo filamentoso, en especial un Aspergillus.
19. 19. El uso de una variante se subtilasa producida según alguna de las reivindicaciones 1 a 18 en un detergente para lavandería y/o para lavado de vaj illas .