JP2009035550A - プロアントシアニジンの豊富な抽出物、及び関連する調製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】プロアントシアニジンの含有量の高い破砕した果実、植物、又は、事前に精製済みの抽出物から出発する、プロアントシアニジンの豊富な抽出物を得る工業スケールでも実現可能な方法の提供。
【解決手段】プロアントシアニジンの豊富な破砕した果実若しくは植物又は既に前もって精製された抽出物の水性エタノールによる処理、濾過、真空下での濃縮、脱塩水で任意に希釈された濃縮物の任意保存、濾過、溶液の巨大網状脂肪族架橋ポリマー樹脂への負荷、前記樹脂の水洗浄、水性エタノールによる溶出、溶出溶液の真空下での濃縮、濃縮生成物の真空下での乾燥、又は噴霧乾燥の各ステップ有することを特徴とする方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、高い含量でプロアントシアニジンを含有する抽出物、及び出発反応物として破砕した果実若しくは植物、又はプロアントシアニジンの豊富な前もって調製した抽出物を使用することを含む関連する調製方法に関する。

プロアントシアニジン、いわゆる縮合タンニン類は、遍在しており、最も豊富な天然のフェノール誘導体である。プロアントシアニジンは、Ｃ４〜Ｃ８又はＣ４〜Ｃ６結合を介して結合したフラバン−３−オールの繰り返し単位からなるオリゴマー又はポリマーの混合物である。このフラバン−３−オール単位は、Ｃ２−Ｏ７（Ａタイプ）間の追加の二重結合により、二重結合されてもよい。プロアントシアニジンの大きさは、重合度（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｇｒｅｅ；ＤＰ）で定義される。

プロアントシアニジンに含まれる最も一般的なフラバン−３−オールは、アフザレチン（Ａｆｚａｌｅｃｈｉｎ）、エピアフザレチン（Ｅｐｉａｆｚａｌｅｃｈｉｎ）、カテキン（Ｃａｔｅｃｈｉｎ）、エピカテキン（Ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ）、ガロカテキン（Ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）、エピガロカテキン（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）である。排他的にカテキン及びエピカテキンからなるプロアントシアニジンは、プロシアニジンと称され、アフザレチン及びエピアフザレチン、又はガロカテキン及びエピガロカテキンを含有するものは、プロペラルゴニジン及びプロデルフィニジンである。プロシアニジンは、天然で最も豊富である。

文献に報告されているプロアントシアニジンの生物学的活性には、抗腫瘍、抗炎症、老化防止、抗酸化、抗アレルギー、特に尿路の抗菌、毛髪の成長促進等が挙げられる（非特許文献１及び２）。

ツルコケモモ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｍａｃｒｏｃａｒｐｏｎ）、ぶどうの種、茶葉（ｔｅａ ｌｅａｖｅ）、ピーナッツ、松樹皮などの種々の起源の植物及び果実からプロアントシアニジンが豊富な抽出物を調製する多くの方法が知られている。

これらの方法のいくつかは、例えば特許文献１に記載のような鉱酸の存在下で水性アルコール性溶媒を用いて行う抽出ステップを包含し、或いは特許文献２に開示のようなＣＯ_２などの超臨界溶媒を使用することを包含し、或いは、特許文献３に開示の方法におけるように、超濾過膜（ｕｌｔｒａ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を使用することを必要とする逆浸透濾過を含むものである。

その他の方法は、複数の種類の有機溶媒を単独又は互いに組み合わせたものを用いる多段の抽出ステップの組合せを必要とし、少なくとも一つのステップは、特許文献４及び５に開示のように、抽出物を含有する溶液を、巨大網状（ｍａｃｒｏｒｅｔｉｃｕｌａｒ）ポリマー樹脂上に吸着し、吸着された液体を、続いて溶出し、濃縮し、且つ霧化することに関連する。

他の方法によると、非常に高い含量のプロアントシアニジンを含有する抽出物を得ることが可能である。例えば、特許文献６に開示の工程によって、２３〜４５％の量のオリゴマープロアントシアニジン（ＯＰＣ）を有する８０〜９０％の範囲の全プロアントシアニジン含量の抽出物を得ることが可能であり、この方法は、松樹皮などの植物又はその抽出物若しくは分泌液を、いわゆる材料の種類、細孔半径、特定の表面積及び分子量分布範囲の特徴の少なくとも１つが異なる少なくとも２つの種類の吸着樹脂で処理することを含む。又は、特許文献７に開示の方法により、６７〜８５％の全プロアントシアニジン含量及び１２．５〜５１％のＯＰＣ含量を有する抽出物を得ることが可能であって、この方法は、植物の抽出物又は圧搾した分泌液について、塩又はアルカロイドと処理し、且つ合成吸着樹脂を用いた処理の両方を組み合わせた処理を行うことを含む。

多数の先行技術が、高いプロアントシアニジンの力価を有する抽出物を得ることを可能にするにもかかわらず、市販の抽出物は、７％未満のプロアントシアニジンの力価を有する。

従って、このことが意味するのは、高いプロアントシアニジンの力価を有する抽出物を調製する先行技術の方法が、有害な抽出溶媒を使用すること、長時間（約２４時間）にわたる非常に高い抽出温度（約１００℃）、超臨界溶媒の場合などで圧力装置を使用すること、又は超浸透膜を使用することなどのいくつかの理由により、工業スケールで容易に実現可能ではないことである。
中華民国特許第１４５４８９６号明細書 中華民国特許第１７４９２３号明細書 特開昭６３−２６７７７４号公報 米国特許第６，６０８，１０２号明細書 米国特許第６，４４０，４７１号明細書 カナダ国特許第２５３９７２４号明細書 欧州特許第１，６０２，６５３号明細書 Ｂａｒｔ Ｓｃｈｗｉｔｔｅｒｓ及びＪａｃｋ Ｍａｓｑｕｅｌｉｅｒ著、"２１ｔｈ ｃｅｎｔｕｒｙ Ｂｉｏｐｈｙｌａｘｉｓ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ＯＰＣ"、Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９７年、ｐ．５０〜１３５ Ｔｏｍｏｙａ Ｔａｋａｊａｓｈｉら著、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、１９９９年、ｐ．１１２（３１０．３１６） Ｇｕ Ｌ．Ｋｅｌｍら著、"Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｆｒｏｍ ｌｏｗ ｂｕｓｈ ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ ｉｎ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｏｏｄｓ ｗｉｔｈ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｎｏｒｍａｌ ｐｈａｓｅ ＨＰＬＣ．ＭＳ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ"、Ｊ．Ａｇｒ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．、２００２年、５０巻、ｐ．４８５２〜４８６０

従って、先行技術の方法の欠点に影響されない高いプロアントシアニジンの力価を有する抽出物の調製方法を得ること、従って、工業スケールで実現可能な方法が望まれている。

本願出願人は、高いプロアントシアニジンの力価を有する抽出物を工業スケールで容易に実現し得る方法を見出した。

この方法は、既に前もって精製された抽出物又はプロアントシアニジンの豊富な果実若しくは植物から出発して、プロアントシアニジンの豊富な抽出物を得ることを可能にするものであって、下記の各ステップを有する。

ａ）プロアントシアニジンの高い含量の破砕した果実又は植物又はプロアントシアニジンの豊富な既に前もって精製した抽出物を、室温で、５０〜８０容量％のエタノールを有する水性エタノールで抽出するステップ；
ｂ）ステップａ）に由来の混合物を濾過するステップ；
ｃ）ステップｂ）に由来する濾過した溶液を、真空下で濃縮するステップ；
ｄ）ステップｃ）に由来の濃縮した生成物を、５〜２４時間の時間の間、任意で保存するステップであって、この生成物は、任意で前もって脱塩水で希釈されたものである、ステップ；
ｅ）ステップｃ）に由来の濃縮して保存された生成物、又は水を用いた濃縮がステップｄ）で行われなかった場合のステップｄ）に由来の生成物を脱塩水で希釈するステップ；
ｆ）ステップｅ）に由来の混合物を濾過するステップ；
ｇ）上記の溶液を、巨大網状脂肪族架橋ポリマー樹脂に負荷するステップ；
ｈ）この樹脂を水で洗浄するステップ；
ｉ）ステップｈ）に由来の巨大網状脂肪族架橋ポリマー樹脂を、５０〜８０容量％のエタノール含量を有する水性エタノールで溶出するステップ；
ｊ）前のステップに由来する溶出溶液を、真空下で濃縮するステップ；及び
ｋ）ステップｊ）に由来する濃縮生成物を真空下で乾燥し、又は噴霧乾燥するステップ。

この方法は、水性エタノールを用いた穏やかな条件を用いることにより、且つ水性エタノールなどの無毒性の溶媒を脱離ステップで用いた巨大網状ポリマー樹脂によるひとつのみの吸着ステップを用いることにより、１０％以上のプロアントシアニジン、好ましくは１５％以上、さらに好ましくは２０％以上のプロアントシアニジンを含有する抽出物を得ることが可能である。

本発明の目的においてプロアントシアニジンの豊富な果実又は植物の意味するところは、例えば、ツルコケモモ、リンゴ、黒イチゴ、ブドウ、プラム、ザクロ、キイチゴ、イチゴ、ソラマメ、レンティル、茶である。

本発明による方法において、出発材料として、ツルコケモモ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｍａｃｒｏｃａｒｐｏｎ）が好ましく用いられる。

ステップａ）において、抽出溶媒は、好ましくは６０〜７５容量％、より好ましくは７０容量％のエタノール含量を有する。

抽出時間は、好ましくは、１０分〜２時間、より好ましくは３０分である。

本発明による方法は、ステップａ）において破砕した果実又は植物を出発材料として用いる場合、さらなるステップを包含し、水性エタノールを用いた抽出ステップａ）に由来の上記の破砕した果実又は植物は、ステップｂ）の濾過が行われる前に、圧搾される。

ステップｄ）は、任意のステップであって、いかなる場合であっても、このステップが行われる場合、保存時間は、好ましくは８〜２０時間、より好ましくは１５時間である。

吸着された溶液を含有する樹脂の脱塩水による洗浄、いわゆる本発明の方法のステップｈ）は、糖及びフェノール酸を除去する目的で行われる。

果実がアントシアニンを豊富に有する場合、本発明による方法は、水を用いた上記の洗浄ステップの後、６０％（容量／容量）のメタノール含量を有する水性メタノールを用いて樹脂からアントシアニンを除去するさらなる洗浄ステップを有してもよい。

ステップｉ）において、溶出溶媒、いわゆる水性エタノールの濃度は、６０〜７５容量％、より好ましくは７０容量％のエタノール含量を有する。このステップで利用される巨大網状脂肪族架橋樹脂は、公知且つ市販のものから選択してもよい。

ステップｊ）は、３５〜４５℃、より好ましくは４０℃の温度で、真空下で好ましく実行される。

また、本願出願人は、最終抽出物におけるプロアントシアニジンの力価をＨＰＬＣにより同定する分析方法を最適化した。

この方法は、下記の２つの異なるステップを有する。

１．分析対象の抽出物の精製
２．その分析

（ステップ１：分析対象の抽出物の精製）
ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ２０カラムの調製
１０ｇのＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ２０を、少なくとも３時間、脱塩水（約５０ｍＬ）で膨潤させ、その後、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製のガラスカラムＣ１６に充填した。この樹脂を、約１３０ｍＬの脱塩水で洗浄した。

ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ２０樹脂に負荷される溶液の調製
カラムに負荷されるλ＝２８０ｎｍの吸光を有する傾向の化合物を得る目的で、分光光度分析を行った。

抽出物又は溶液を、λ＝２８０ｎｍにおいて３２〜４８の吸光度（又は、１／５０で希釈後した吸光度が０．８±２０％）を得るように、２０％メタノールで希釈した。

ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ２０での精製
２０％のメタノールで希釈し上記の範囲の吸光度を有する上記の溶液を、４０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離した。

その上清の溶液２０ｍＬを、上記の樹脂に負荷し、下記の３つの溶出を行った。

溶出１：２０％メタノール８０ｍＬ
溶出２：６０％メタノール１６０ｍＬ
溶出３：１００％メタノール２４０ｍＬ

約２ｍＬ／分の流速で、これらの溶出を行った。溶出１及び２に由来する溶出された溶液は、廃棄した。

溶出３に由来する溶液の最初の２０〜３０ｍＬは、廃棄し、その後、残りの溶出された溶液を収集した。

溶出された溶液から、蒸発により溶媒を除去し、得た残渣を乾燥した。

乾燥抽出物を、ＨＰＬＣによる分析用の７９：２９．５：０．５の容量比を有するアセトン／水／酢酸の混合物で希釈して、１〜１．７ｍＬの最終容量のものを得た。なお、この容量は、Ｖ_１として表記する。

（２．ＨＰＬＣ分析）
較正表
プロアントシアニジンの分析に用いる標準物質は、プロシアニジンＢ２（エピカテキン４β→８）である。

各溶液を、下記の表に記載の通り、調製した。

溶液 プロシアニジンＢ２（ｍｇ） アセトン／水／酢酸
（７０：２９．５：０．５）（ｍＬ）
１ ０．１５ １０
２ ０．７５ ５
３ １．７ ５
４ ０．６ １
５ ０．９ １

プロシアニジンＢ２の濃度の算出
Ｃ_Ｂ２＝（ｍ×１０００）／Ｖ
ここで、Ｃ_Ｂ２は、プロシアニジンＢ２の濃度（ｍｇ／Ｌ）であり、
ｍは、プロシアニジンの重量（ｍｇ）であり、
Ｖは、アセトン／水／酢酸の容量（ｍＬ）である。

ＨＰＬＣの条件
カラム：
Ｌｕｎａ ｓｉｌｉｃａ５μｍ（２５０×４．６ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
検出カートリッジ（カートリッジのグレード）３ｍｍ
溶出溶媒：
溶媒（Ａ）：メタノール
溶媒（Ｂ）：ジクロロメタン
溶媒（Ｃ）：酢酸／水（１：１）（ｖ／ｖ）

溶出時間（分） 溶媒（Ａ）（％）^１ 溶媒（Ｂ）（％）^１ 溶媒（Ｃ）（％）^１
０ １４．０ ８２．０ ４
２０ ２３．６ ７２．４ ４
５０ ３５．０ ６１．０ ４
５５ ８６．０ １０．０ ４
６５ ８６．０ １０．０ ４
７０ １４．０ ８２．０ ４
印^１：容量百分率

溶出の流速：１ｍＬ／分
カラム温度：３７℃
スペクトルの範囲：２００〜７００ｎｍ
波長：λ＝２８０ｎｍ
注入容量：５μＬ

標準溶液の分析
上記の標準溶液を、ＨＰＬＣで分析した。

分析後、上記の較正表を、ＨＰＬＣソフトウェアに挿入する（プロシアニジンＢ２濃度に対する面積）。

サンプルの分析
アセトン／水／酢酸（７０：２９：０．５）で希釈したサンプルを、ＨＰＬＣで分析した。

クロマトグラフ分析
精製及びＨＰＬＣ分析の後に得たツルコケモモ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｍａｃｒｏｃａｒｐｏｎ）を、質量分光光度分析により同定し、プロアントシアニジンは、１３．５〜５０分の保持時間を有するピークに対応する。

積分方法は、非特許文献３に由来するものである。

これは、開始から終点までの平坦なベースラインを描くことからなる。隣合うオリゴマーのピーク間の谷の最も低い位置から上記の平坦なベースラインまでに垂線をひく。曲線のカーブ、２つの隣り合う垂線及び平坦なベースラインで囲まれた面積を積分した。この面積は、上記の較正表に含まれるべきである。

得たデータの分析
ＨＰＬＣソフトウェアにより、分析する溶液のプロアントシアニジン濃度（ｍｇ／Ｌ）を算出することが可能となる。

プロシアニジンＢ２の較正表により、各ピーク面積に対応したプロアントシアニジンの濃度を有することが可能となる。

プロアントシアニジンの各ピークの濃度を加算し、その結果は、分析する溶液のプロアントシアニジンの濃度に対応する（Ｃ_ＬＵＥ（ｍｇ／ｍＬ））。

プロシアニジンＢ２の等量として表現された、上記のＳｅｐｈａｄｅｘに負荷した溶液のプロアントシアニジンの濃度Ｃ（ｍｇ／Ｌ）は、下記の式を適用して得てもよい。
Ｃ＝（Ｃ_ＬＵＥ×Ｖ_１）／２０
Ｖ_１は、分析した溶液の容量（１〜１．７ｍＬ）を示す。

破砕したツルコケモモ（例１）から出発して調製した例、及び既に前もって精製された抽出物（例２）の例を、例証目的で且つ非限定的な目的で報告する。

（例１−破砕したツルコケモモに由来のプロアントシアニジンの豊富な抽出物）
５０ｋｇの破砕したツルコケモモ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｍａｃｒｏｃａｒｐｏｎ）、及び１００Ｌの７０％（ｖ／ｖ）水性エタノールを３０分間攪拌し、その後、この破砕した果実を圧搾し、全混合物を、２５μｍのふるい上で濾過し、約１２０ｋｇの重量の澄明なエタノール抽出物を得た。

このエタノール抽出物を、４０℃の温度で、真空下、濃縮し、約１０ｋｇの重量の残渣を得た。その後、これを、１０Ｌの脱塩水で希釈し、約２０ｋｇの重量の希釈抽出物を得、これを、１５時間、室温で保存する。

その後、この希釈抽出物を、１０μｍのふるい上で濾過した。

２５Ｌの市販の巨大網状脂肪族架橋樹脂を、７５Ｌの脱塩水で洗浄し、その後、これを、ガラスカラムに充填し、２０ｋｇの上記の濾過した水溶液を添加した。吸着した抽出物を有する上記の樹脂を、１００Ｌの脱塩水で洗浄し、その後、１００Ｌの７０％（ｖ／ｖ）エタノールで溶出した。

その後、溶出した溶液を、４０℃で、真空下、濃縮し、約２０ｋｇの濃縮抽出物を得、最終的に霧化して、粉末を得た。

この抽出物を、上記に言及した分析方法で分析した。図１及び２は、ＨＰＬＣのクロマトグラム、その保持時間、各ピークの面積、及び各ピークをｍｇ／ｍＬで表記した対応する濃度、並びに６８２４．２４ｍｇ／Ｌであるプロアントシアニジンの全濃度又はＣＬＵＥを示す。

Ｖ_１は、１．７ｍＬ（ＨＰＬＣで分析した全容量）である。

従って、Ｃ＝（Ｃ_ＬＵＥ×Ｖ_１）／２０の式を適用すると、Ｃ＝６８２４．２４×１．７／２０＝５８０．０６ｍｇ／Ｌである。

２０１．５ｍｇの最終抽出物を用いて水性エタノール溶液（ＭｅＯＨ２０％）を調製した。この溶液の容量Ｖ_２は、７２ｍＬである。

５８０．０６×０．０７２＝４１．７６ｍｇのプロアントシアニジン
（４１．７６／２０１．５）×１００＝２０．７３％

（例２−既に前もって精製された抽出物から調製した抽出物）
この例で使用したツルコケモモの抽出物は、Ｔｏｕｒｎａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のバッチ番号Ｌ７０１５であるＥＸＯＣＹＡＮ ＣＲＡＮ１０であって、上記に開示の方法で分析した。プロアントシアニジンの含量は、７％であった。

このツルコケモモの抽出物６０７．７ｍｇを、１００ｍＬの７０％（ｖ／ｖ）の水性エタノールで３０分処理した。この溶液を濾過し、その後、例１の様式を用いて真空下で濃縮し、一昼夜保存した。

この濃縮した溶液を、１０ｍＬの脱塩水で希釈し、その後、濾過した。

この溶液を、市販の巨大網状脂肪族架橋樹脂上に負荷し、その後、水（２００ｍＬ）で洗浄し、７０％エタノールで溶出し、得た溶液を、真空下で濃縮した。

得た濃縮物を、乾燥し、最終的に得た抽出物（１５８．２ｍｇ）を分析した。上記の方法で評価したそのプロアントシアニジンの含量は、１８．０％である。

従って、この最終的な抽出物におけるプロアントシアニジンの濃度は、出発物質である上記の抽出物よりも、２．６倍高いものであった。

ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 例１で言及したように調製した分析サンプルの、保持時間、面積、各ピークの対応する濃度をｍｇ／ｍＬで表示したもの、及び全濃度を示す。

Claims (15)

1. 植物、果実、又はプロアントシアニジンの豊富な既に前もって精製された抽出物から出発するプロアントシアニジンの豊富の抽出物を得る方法であって：
   ａ）プロアントシアニジンの豊富な破砕した果実若しくは植物又は既に前もって精製された抽出物を、５０〜８０容量％のエタノール濃度を有する水性エタノールで処理するステップと；
   ｂ）ステップａ）に由来の混合物を濾過するステップと；
   ｃ）ステップｂ）に由来する濾過した溶液を、真空下で濃縮するステップと；
   ｄ）ステップｃ）に由来の濃縮した生成物を、５〜２４時間の時間の間、任意で保存するステップであって、この生成物は、前もって脱塩水で任意に希釈されたものである、ステップと；
   ｅ）ステップｃ）に由来の保存された生成物、又は水を用いた濃縮がステップｄ）で行われなかった場合のステップｄ）に由来の濃縮され保存された生成物を脱塩水で希釈するステップと；
   ｆ）ステップｅ）に由来の混合物を濾過するステップと；
   ｇ）前記溶液を、巨大網状脂肪族架橋ポリマー樹脂に負荷するステップと；
   ｈ）前記樹脂を水で洗浄するステップと；
   ｉ）ステップｈ）に由来の巨大網状脂肪族架橋ポリマー樹脂を、５０〜８０容量％のエタノール含量を有する水性エタノールで溶出するステップと；
   ｊ）前のステップに由来する溶出溶液を、真空下で濃縮するステップと；
   ｋ）ステップｊ）に由来する濃縮生成物を真空下で乾燥し、又は噴霧乾燥するステップと；
   を有することを特徴とする方法。
2. 前記ステップａ）で使用されるプロアントシアニジンの豊富な前記果実又は植物は、ツルコケモモ、リンゴ、黒イチゴ、ブドウ、プラム、ザクロ、キイチゴ、イチゴ、ソラマメ、レンティル及び茶から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記のプロアントシアニジンの豊富な果実は、ツルコケモモ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｍａｃｒｏｃａｒｐｏｎ）であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 前記ステップａ）で使用される前記水性エタノールは、６０〜７５容量％のエタノール含量を有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記水性エタノールは、７０容量％のエタノール含量を有することを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 前記ステップａ）は、１０分〜２時間の時間の間、行われることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記時間は、３０分であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
8. 前記ステップａ）においてプロアントシアニジンの豊富な破砕した果実が使用される場合、エタノールを用いた処理に由来する破砕した果実は、前記ステップｂ）を行う前に、圧搾されることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記ステップｄ）の保存時間は、８〜２０時間であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記保存時間は、１５時間であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. 前記ステップｉ）において、６０〜７５容量％のエタノール含量を有する水性エタノールが使用されることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記水性エタノールは、７０容量％のエタノール含量を有することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法で調製した、１０％以上のプロアントシアニジン力価を有することを特徴とする抽出物。
14. 前記プロアントシアニジン力価は、１５重量％以上であることを特徴とする請求項１３に記載の抽出物。
15. 前記プロアントシアニジン力価は、２０重量％以上であることを特徴とする請求項１４に記載の抽出物。

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