PT2033641E

PT2033641E - Processo de preparação de extractos ricos em proantocianidinas

Info

Publication number: PT2033641E
Application number: PT07113610T
Authority: PT
Inventors: Chrystele Soulier; Natacha Alcouffe; Gilles Laplaige
Original assignee: Ferlux
Priority date: 2007-08-01
Filing date: 2007-08-01
Publication date: 2012-04-10
Also published as: DK2033641T3; EP2033641A1; HK1128421A1; MX2008009885A; ES2379197T3; CN101380338B; CN101380338A; EP2033641B1; ATE537824T1; CA2638158A1; US20090093537A1; AU2008203374A1; AR067643A1; EA200801632A1; JP2009035550A; BRPI0804851A2; US8287933B2; KR20090013692A; PL2033641T3; SI2033641T1

Description

DESCRIÇÃO

PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE EXTRACTOS RICOS EM PROANTOCIANIDINAS

Campo da invenção A presente invenção relaciona-se com extractos que contêm quantidades elevadas de proantocianidinas e o processo relativo de preparação envolvendo a utilização como reagentes de partida de frutas, ou extractos de fruta já pré-purifiçados ricos em proantocianidinas, em que a referida fruta é o arando (Vaccinium macrocarbon).

Antecedentes tecnológicos

As proantocianidinas, ou seja taninos condensados, são ubiquas e estão entre as mais abundantes derivadas de fenol naturais. A proantocianidina é uma mistura de oligómeros e polímeros compostos por unidades de repetição de flavan-3-ol ligadas através das ligações C4-C8, ou C4-C6. As unidades de flavan 3-ol podem também ser duplamente ligadas por uma ligação adicional dupla entre C2-07 (tipo A) . As dimensões das proantocianidinas são definidas pelo grau de polimerização (DP). 0 flavan 3-ols mais comum contido nas proantocianidinas é Afzalequina, Epiafzalequina, Catequina, Epicatequina, Galocatequina, Epigalocatequinan. As proantocianidinas constituídas exclusivamente por catequina e epicatequina são as chamadas procianidinas, enquanto aquelas contendo afzalequina e epiafzalequina ou galocatequina e 1

epigalocatequina são propelargonidina e prodelfinidina. A procianidina é a mais abundante na natureza.

As atividades biológicas das proantocianidinas que foram relatadas na literatura incluem atividade antitumoral, antiinflamatória, antiidade, antioxidante, antialérgica, antibacteriana, especialmente do trato urinário, promoção do crescimento do cabelo, etc. (Bart Schwitters/Jack Masquelier "21st century Biophylaxis substance OPC, Fragrance Journal, 50-135 (1997); Tomoya Takajashi et al., Journal of Investigative dermatology 112 (310.316 (1999).

Muitos métodos são conhecidos para a preparação de extrato enriquecido em proantocianidinas de plantas ou frutas de origem diversas, como arando (Vaccinium macrocarpon), sementes de uva, folhas de chá, amendoins, casca de pinheiro, etc.

Alguns destes processos compreendem as etapas de extração efectuadas com solventes aquosos alcoólicos na presença de ácidos minerais como por exemplo o processo descrito na CN1454896, ou podem consistir no uso de solventes supercriticos como CO2, tal como divulgado na CN174923, ou requer o uso de ultra-filtração de membrana ou envolver filtração osmótica inversa como no processo descrito na JP63267774.

Outros processos requerem uma combinação de etapas de extração múltiplas, utilizando diversos tipos de solventes 2 orgânicos, quer isoladamente ou combinados uns com os outros, associados com, pelo menos, um passo em que uma solução contendo os extractos é absorvida numa resina macroreticular polimérica, sendo o liquido absorvido subsequentemente eluido, concentrado e atomizado como divulgado nos processos descritos nas US6608102, US 6440471.

De acordo com outros processos, é possivel obter extractos que contêm quantidades muito elevadas de proantocianidinas. Por exemplo é possivel obter extractos com conteúdo total de proantocianidinas que varia em 80-90% com os oligómeros de proantocianidinas (OPC) em quantidades de 23 a 45% com o processo revelado na CA2539724, que envolve o tratamento de uma planta como casca de pinheiro ou um seu extracto ou sumo, com pelo menos dois tipos de uma resina absorvente diferentes em pelo menos uma das seguintes caracteristicas, nomeadamente o tipo de material, o raio de poro, intervalo de distribuição da área superficial especifica e peso molecular ou é possivel obter extractos com um teor total de proantocianidinas de 67-85% e um teor de OPC de 12,5-51%, com o processo revelado na EP1602653, compreendendo sujeitar um extracto ou um suco espremido de uma planta a uma combinação de um tratamento com um sal ou um alcaloide e um tratamento com uma resina absorvente sintética. Não obstante o grande número de processos da técnica anterior, permitindo a obtenção de extracto com um elevado titulo em proantocianidinas, os extractos comercialmente disponíveis têm um titulo de proantocianidinas não superior a 7%. 3

Isto significa, portanto, que os processos da técnica anterior para a preparação de extracto com um elevado titulo em proantocianidinas não são facilmente realizáveis à escala industrial, por muitas razões, tais como, por exemplo, a utilização de solventes de extração tóxicos ou à temperatura de extração extrema (cerca de 100°C) por um longo período de tempo (cerca de 24 horas) , o uso de dispositivos sob pressão, como no caso de fluidos supercríticos, ou o uso de membrana de ultrafiltração.

Foi, portanto, sentida a necessidade de ter um processo para a preparação dos extractos tendo proantocianidinas com título elevado não sofrendo os inconvenientes dos processos da técnica anterior e que, portanto, pudessem ser facilmente realizáveis à escala industrial.

Resumo da invenção A Requerente descobriu um processo facilmente realizável à escala industrial, permitindo a obtenção de um extracto com um título elevado em proantocianidinas.

Este processo permite a obtenção de um extracto rico em proantocianidinas a partir de extractos de fruta já pré-purificados ou a partir de frutos ricos em proantocianidinas em que a referida fruta é o arando (Vaccinium macrocarpon) , e compreendendo os seguintes passos: a) Tratar o fruto esmagado contendo quantidades elevadas de proantocianidinas ou um extracto rico em proantocianidinas 4 já pré-purifiçado com etanol aquoso, tendo uma concentração de etanol variando de 50 a 80%, em volume, b) Filtrar a mistura vinda do passo (a), c) Concentração da solução filtrada proveniente do passo b) sob vácuo, d) Opcionalmente, armazenar o produto concentrado proveniente do passo (c), cujos produtos foram, opcionalmente, previamente diluidos com água desmineralizada, por um tempo que varia de 5 a 24 horas, e) Diluição com água desmineralizada do produto armazenado vindo do passo (c) ou o produto armazenado concentrado proveniente de (d) no caso desta diluição com água não ter sido realizada no passo (d) , f) Filtração da mistura vinda do passo (e), g) Carregamento da solução sobre uma resina polimérica macroreticular alifática com ligações cruzadas, h) Lavagem da dita resina com água, i) Eluição da resina polimérica macroreticular alifática reticulada proveniente do passo (h) com etanol aquoso tendo um teor de etanol de 50 a 80% em volume, j) Concentração da solução eluida proveniente da etapa anterior sob vácuo, k) Secagem do produto concentrado proveniente do passo (j), sob vácuo, ou por secagem por pulverização, em que o referido passo (a) é realizada por tempos que variam desde 10 minutos até 2 horas.

Este processo permite a obtenção de extractos contendo mais de 10%, de preferência mais de 15%, ainda mais preferencialmente mais de 20%, de proantocianidinas usando condições de extração leves com etanol aquoso, e também apenas a absorção com uma resina macroreticular polimérica 5 usando no passo da dessorção solventes não tóxicos, como o etanol aquoso.

Descrição das figuras A Figura 1 mostra o cromatograma de HPLC; a Fig. 2: os tempos de retenção da área de concentração correspondente, expressa em mg/ml de cada pico e, finalmente, a concentração total da amostra analisada tal como preparada como descrito no Exemplo 1.

Descrição detalhada da invenção

Como fruto rico em proantocianidinas para a finalidade da presente invenção queremos dizer arando.

No processo de acordo com a presente invenção o arando (Vaccinium macrocarpon) é usado como material de partida.

No passo (a) o solvente de extração tem de preferência um teor etanólico de desde 60 a 75%, mais preferivelmente 70% em volume. O tempo de extração está, de preferência, compreendido entre 10' a 2 horas, mais preferencialmente 30'. O processo de acordo com a presente invenção, quando é usado como o material de partida no passo (a) um fruto 6 esmagado ou vegetal, abrange um passo adicional, em que o referido fruto ou vegetal esmagado proveniente da etapa de extração (a) com etanol aquoso é pressionado antes da filtração do passo (b) ser levada a cabo. 0 passo (d) é um passo opcional e, em qualquer caso, quando este passo é realizado, o tempo de armazenamento está de preferência compreendido entre 8h e 20 horas, mais preferencialmente 15 horas. A lavagem com água desmineralizada da resina que contém a solução absorvida, a saber, o passo (h) do processo da invenção, é realizada com a finalidade de remover os açúcares e o ácido fenólico.

No caso de o fruto ser também rico em antocianinas o processo pode compreender um passo de lavagem adicional, após o passo de lavagem com água, para remover as antocianinas a partir da resina com metanol aquoso tendo um teor de metanol de 60% (volume/volume)

No passo (i) a concentração do solvente eluido, a saber etanol aquoso tem um teor de etanol de 60 a 75%, em volume, mais preferencialmente 70% em volume. A resina macroreticular alifática reticulada utilizada no dito passo pode ser selecionada a partir daquelas já conhecidas e comercialmente disponíveis. 7 0 passo (j) é realizado de preferência sob vácuo, a temperaturas compreendidas entre 35 e 45°C, mais preferivelmente 40°C. O requerente também optimizou um método analítico para determinar por HPLC o título de proantocianidinas no extracto final.

Este método compreende dois passos separados: 1. A purificação do extracto a ser analisado 2. A análise.

Passo 1: purificação do extracto a ser analisado Preparação da coluna Sephadex LH20 10 gramas de Sephadex LH20 foram expandidos com água desmineralizada (cerca de 50 ml) em pelo menos 3 horas e, em seguida introduzidos numa coluna de vidro Cl 6 vendido por Pharmacia Biotech. A resina foi lavada com cerca de 130 ml de água desmineralizada.

Preparação da solução para ser carregada na resina Sephadex LH20.

Com o objectivo de obter um teor de compostos que absorvem a λ = 280 nm carregados na coluna serem sempre aproximadamente os mesmos, foi realizada uma análise espectrofotométrica. 8

Os extractos ou a solução foi diluída em metanol a 20% para se obter uma absorvência variando de 32 a 48 (ou após diluição a 1/50 ABS = 0,8+20%) em λ = 280 nm.

Purificação em Sephadex LH20 A solução diluída com metanol a 20% com a absorvância compreendida no intervalo acima mencionado foi centrifugada durante 15 minutos a 4000 rpm. 20 ml desta solução decantada foi carregada na resina anteriormente mencionado e foram realizadas as três eluições seguintes:

Eluição 1, 80 ml de metanol a 20%,

Eluição 2, 160 ml de metanol a 60%,

Eluição 3, 240 ml de metanol a 100%.

Estas eluições foram realizadas a um caudal de cerca de 2ml/min. A solução eluída proveniente da eluição 1 e 2 foi descartada.

Os primeiros 20-30 ml da solução proveniente de eluição 3 foram descartados, em seguida, a restante solução eluída foi recolhida. O solvente foi removido por evaporação a partir da solução eluída e o resíduo obtido foi seco. 9 0 extracto seco foi diluído numa mistura de acetona/água/ácido acético tendo a razão volumétrica seguinte 79:29.5:0.5 para ser analisado por HPLC, de forma a obter um volume final compreendido entre 1 e 1,7 ml, este volume foi indicada como Vi. 2. Análise de HPLC Tabela de calibração A norma utilizada para a análise de proantocianidinas é Procianidina B2 (Epicatequina 4β 8).

As seguintes soluções foram preparados como relatado na tabela a seguir

Solução procianidina B2 (mg) Acetona/água/ácido acético (70:29.5:0.5) (ml) 1 0,15 10 2 0,75 5 3 1,7 5 4 0,6 1 5 0,9 1 Cálculo da concentração de procianidina B2

CB2 = (mx1000)/ V em que CB2 é a concentração de procianidina B2 em mg/1 m é o peso da procianidina em mg V é o volume de acetona/água/ácido acético em ml. 10

Condições de HPLC:

Coluna: Sílica Luna 5 ym (250x4.6 mm) Phenomenex, Cartucho de detecção (Cartucho de guarda) 3 mm Solventes de eluição:

Solvente (A): Metanol,

Solvente (B): Diclorometano,

Solvente (C): Ácido acético/água (1:1) (V/V)

Tempos de eluição (min) Solvente (A) (%)1 Solvente (B) (%) 1 Solvente (C) (%)1 0 14,0 82,0 4 20 23, 6 72,4 4 50 35,0 61,0 4 55 86, 0 10,0 4 65 86, 0 10,0 4 70 14,0 82,0 4 1 percentagens de volume

Taxa de eluição de fluxo: 1 ml/min Temperatura da coluna: 37°C Faixa de espectro: 200-700nm Comprimento de onda: = λ 280 nm Volume injetado = 5μ1

Análises de solução padrão

As soluções padrão acima referidas foram analisadas por HPLC.

Após a análise a tabela de calibração foi inserida em software de HPLC (área como uma função da concentração de procianidina B2) . 11

Análise da amostra A amostra diluída em acetona/água/ácido acético (70:29:0.5) foi analisada por HPLC.

Análise cromatográfica

Arandos vaccinium macrocarpon obtidos após purificação e análise HPLC foram identificados por espectrometria de massa, as proantocianidinas são os picos com tempo de retenção a partir de 13,5 e 50 minutos. O método de integração foi derivado do "Fractionation of from low bush blueberry and quantification of procyanidins in selected foods with optimised normal phase HPLC.MS fluorescent detection method", Gu L. Kelm et al J. Agr, Food Chem. 2002, 50, 4852-4860).

Consiste em desenhar uma linha de base plana a partir do início do funcionamento até ao fim. Uma linha perpendicular foi traçada a partir do ponto mais baixo do vale entre os picos adjacentes de oligómeros com a linha de base plana. A área delimitada por picos das curvas perpendiculares foi integrada com duas linhas adjacentes e a linha de base plana. Esta área deve estar compreendida na tabela de calibração acima.

Análise dos dados obtidos 0 software HPLC permite calcular a concentração de proantocianidinas (mg/1) da solução analisada. 12 A tabela de calibração de procianidina B2 permite ter a concentração de proantocianidinas correspondente à área de cada pico.

Foi adicionada a concentração de cada pico de proantocianidinas, os resultados correspondem à concentração de proantocianidinas da solução analisada (CLUE em mg/1). A saber, a concentração em proantocianidinas C (mg/1) da solução carregada em Sephadex, expressa em equivalente de procianidina B2 pode ser obtida aplicando a seguinte equação: C= (Clue x Vi)/20

Em que Vi: volume da solução analisada (1-1,7 ml)

Relatamos aqui a seguir para fins ilustrativos mas não limitativos os exemplos de preparação a partir de arando esmagado (exemplo 1) e começando a partir de extractos já pré-purifiçados (Exemplo 2).

EXEMPLO 1 ~ EXTRACTO RICO EM PROANTOCIANIDINAS DE ARANDO ESMAGADO 50 kg de arando esmagado (Vaccinium macrocarpon), 100 1 de etanol aquoso a 70% (V/V) foram agitados durante 30 minutos, depois dos frutos esmagadas terem sido prensados e 13 toda a mistura foi filtrada n uma peneira de 25 pm obtendo-se assim um extracto etanólico claro pesando cerca de 120 kg.

Este extracto etanólico foi concentrado sob vácuo a uma temperatura de 40°C obtendo-se assim um residuo pesando cerca de 10 kg. Foi então diluído com 10 1 de água desmineralizada obtendo-se assim um extracto diluído pesando cerca de 20 kg, que é armazenado à temperatura ambiente durante 15 horas. 0 extracto diluído foi então filtrado sobre uma peneira de 10 pm e adicionou-se 25 1 de uma resina comercial macroreticular alifática reticulada e foram lavadas com 75 1 de água desmineralizada, depois foram carregadas numa coluna de vidro e adicionados 20 kg da solução aquosa filtrada referida. A resina com os extractos adsorvidos foi lavada com 100 1 de água desmineralizada e em seguida, foi eluída com 100 1 de etanol a 70% V/V. A solução eluída foi então concentrada sob vácuo a 40°C obtendo-se assim cerca de 20 kg de extracto concentrado, que é finalmente atomizado obtendo-se assim um pó. O extracto foi analisado com o método analítico acima relatado, as Figuras 1 e 2 mostram o cromatograma HPLC, os tempos de retenção, a área de cada pico e a concentração correspondente, expressa em mg/ml de cada pico e, finalmente, a concentração total de proantocianidinas ou 14 CLue que é 6824,24 mg/1 VI = 1,7 ml (solução total analisada por HPLC).

Portanto, se aplicarmos a equação acima C= (Ci_L!E x V1 )/20 C= 6824.24X1,7/20 =580.06 mg/l

Foi preparada uma solução aquosa metanólica (MeOH 20%) com 201.5 mg do extracto final, cujo volume = V2 = 72 ml. 580.06 X 0,072 = 41,76 mg de proantocianidinas (41,76/201,5) x 100 = 20,73%.

EXEMPLO 2 ~ EXTRACTOS ELABORADOS A PARTIR DE EXTRACTOS JÁ PRÉ-PURIFICADA O extracto de arando utilizado para este ensaio é EXOCYAN CRAN 10, produzido por Tournay Technologies lote n° L7015, que foi analisado com o método acima descrito. Conteúdo em proantocianidinas: 7% 607,7 mg do extracto de arando foram tratados com 100 ml de 70% (V/V) durante 30 minutos. A solução foi filtrada e depois concentrada sob vácuo usando as modalidades do Exemplo 1, e armazenada durante 1 noite. 15 A solução concentrada foi diluída com 10 ml de água desmineralizada e, em seguida, filtrada. A solução foi carregada sobre uma resina comercial alifática macroreticular reticulada e, em seguida, lavada com água (200 ml) e eluída com etanol a 70%, a solução obtida foi concentrada sob vácuo. O concentrado obtido foi seco e o extracto final obtido (158,2 mg) foi analisado. O seu conteúdo em proantocianidina avaliado com o método acima é 18,0%.

Por conseguinte, a concentração de proantocianidinas no extracto final foi 2,6 vezes maior do que no extracto de partida. 16

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a obtenção de um extracto rico em proantocianidinas a partir de, frutos ou de extractos já pré-purifiçados de fruta rica em proantocianidinas, em que o referido fruto é arando (Vaccinium macrocamon), compreendendo os seguintes passos: a) Tratar o fruto esmagado ou um extracto rico em proantocianidinas já pré-purifiçado com etanol aquoso, tendo uma concentração de etanol variando de 50 a 80%, em volume, b) Filtrar a mistura vinda do passo (a), c) Concentração da solução filtrada proveniente do passo b) sob vácuo, d) Opcionalmente, armazenar o produto concentrado proveniente do passo (c) , cujos produtos foram, opcionalmente, previamente diluídos com água desmineralizada, por um tempo que varia de 5 a 24 horas, e) Diluição com água desmineralizada do produto armazenado vindo do passo (c) ou o produto armazenado concentrado proveniente de (d) no caso desta diluição com água não ter sido realizada no passo (d), f) Filtração da mistura vinda do passo (e), g) Carregamento da solução sobre uma resina polimérica macroreticular alifática com ligações cruzadas, h) Lavagem da dita resina com água desmineralizada, i) Eluição da resina polimérica macroreticular alifática reticulada proveniente do passo (h) com etanol aquoso tendo um teor de etanol de 50 a 80% em volume, j) Concentração da solução eluída proveniente da etapa anterior sob vácuo, k) Secagem do produto concentrado proveniente do passo (j), sob vácuo, ou por secagem por pulverização, 1 em que o referido passo (a) é realizada por tempos que variam desde 10 minutos até 2 horas.
2. Processo de acordo com as reivindicações 1, em que o referido etanol aquoso utilizado no passo (a) tem um teor etanólico de desde 60 a 75% em volume.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o referido etanol aquoso tem um conteúdo de etanol de 70% em volume.
4. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-3, em que o dito tempo é de 30'.
5. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-4, em que o fruto esmagado proveniente do tratamento com etanol é pressionado antes de realizar o passo (b).
6. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-5, em que os tempos para o armazenamento do passo (d) estão compreendidos entre 8h e 20 horas.
7. Processo de acordo com a reivindicação 6, em que o referido tempo de armazenamento é de 15 horas.
8. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-7 em que no passo (i) é usada uma solução aquosa de etanol tendo um teor de etanol de 60 a 75% em volume.
9. Processo de acordo com a reivindicação 8 em que o referido etanol aquoso tem um teor de etanol de 7 0% em volume. 2