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CN104203226A - 从针叶木种中分离类黄酮二氢槲皮素（紫杉叶素）的方法 - Google Patents

从针叶木种中分离类黄酮二氢槲皮素（紫杉叶素）的方法 Download PDF

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CN104203226A CN201280071325.8A CN201280071325A CN104203226A CN 104203226 A CN104203226 A CN 104203226A CN 201280071325 A CN201280071325 A CN 201280071325A CN 104203226 A CN104203226 A CN 104203226A
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Abstract

一种用于从木材部分分离类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)的方法，所述木材部分包含树干的下部部分，其被称作为根段原木、树皮和根。所述方法包括用极性溶剂提取通过将根段原木和根碎裂或细分成木屑而得到的颗粒减小的木屑部分，或者作为机械木制品的精加工中的残余物而得到的、树皮的干燥软木部分或粉末状树皮。在所述方法中所使用的木材为选自由下列木材的硬木或针叶木材：落叶松属的木材、云杉属的杉木材、冷杉属的枞木材、松属的松树木材、和黄杉属的木材。从所有上述属中分离的主要物质是诸如二氢槲皮素(紫杉叶素)的类黄酮。

Description

从针叶木种中分离类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)的方法
参考文献 
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技术领域
本发明涉及一种从包括根段原木、树皮和树根的针叶木种中分离木材提取物，即类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)的方法。 
背景技术
已知的是，森林生物质是地球上最重要的生物质，以及木材工业产生巨大量的残余物，而这些残余物可用作重要的植物来源以用于进一步加工以及通过提取而稳定获得生物活性的类黄酮分子，这些类黄酮分子大多是亲水性的。由溶剂提取森林生物质而得到的可提取的类黄酮由于能够容易地从不同类型的森林和木材转化残余物中得到，因而是特别有趣的。按照相同类型分子的森林资源，来总结富含类黄酮的食物。重点放在木材转化的残余物诸如树皮、根段原木、根和有节疤木材(kontwood)上，这是由于这些材料尤其代表了类黄酮，尤其是二氢槲皮素(紫杉叶素)的丰富资源。类黄酮的最杰出的生物活性性质之一是它们的抗氧化活性。与从富含生物活性类黄酮分子的健康食物所得到的提取物相比，森林树木提取物中存在抗氧化能力的最重要的结果。[1]类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)是最有效的天然抗氧化剂和抗炎性化合物之一[1a,b]。 
类黄酮是苯丙素(phenylpropanoid)代谢的衍生物。其结构基于C6-C3-C6骨架，类黄酮结构的A环为乙酸衍生的(3×C2)以及C环和B环源自肉桂酸衍生物(苯丙素途径)。类黄酮构成了迄今为止经鉴定的多于6000种不同的化合物[2]的巨大的一类天然多酚，多酚属于花色素(更通常以花青素(它们的糖苷衍生物)的形式存在)、黄酮和黄酮醇(以及它们的糖苷)、黄烷酮、二氢黄酮醇诸如二氢槲皮素(紫杉叶素)、黄烷-3-醇、黄烷-3,4-二醇(无色花色素)以及属于聚合原花青素。类黄酮特别常见于叶，开花组织以及诸如茎、树皮和根的木质部分。它们对于正常的生长、发育和植物抵御感染和损伤是重要的。 
针叶木种，特别是来自松科家族的树木被认为是类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)的丰富来源，其中类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)涉及类黄酮家族的二氢黄酮醇子类。[3,4,5,6,7,8,9,10]二氢黄烷酮醇是类黄酮生物合成的重要中间体。经测定，工业木种的有节疤木料中存在的主要类黄酮属于二氢黄烷酮醇(也被称为黄烷-醇)。在来自不同的杨树的有节疤木料中发现了二氢杨梅素和二氢山萘酚以及二氢槲皮素(紫杉叶素)，它们均属于二氢黄烷酮醇。[11]还已经测定二氢槲皮素(紫杉叶素)为树皮的主要类黄酮成分。在白杨的有节疤木料也检测到了二氢槲皮素(紫杉叶素)。[12]Antonova等人(1980)研究了来自落叶松的芯材的有机可溶提取物。所发现的主要类黄酮是槲皮素(类黄酮总量的11％)、二氢槲皮素(69％)和二氢山萘酚。[13]还已经研究了北美落叶松芯材的溶剂可溶性成分。黄烷酮醇二氢槲皮素(紫杉叶素)和二氢山萘酚(香树素)以0.30％和0.05％的产率被分离，并且得到了微量的槲皮素。[14]扭叶松的树皮具有高含量的二氢黄酮醇、二氢杨梅素和二氢槲皮素(紫杉叶素)[15]。 
在本发明之前，已知的是，针叶木种的不同部分的提取物含有多种化合物，其中一种是类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)。由于二氢槲皮素(紫杉叶素)以游离分子的形式存在于木材的多孔结构中，这就意味着分子并没有化学键合到细胞壁的聚合物和结构性木材组分(纤维素、半纤维素和木质素)，所以这种生物活性物质能够通过溶剂提取来得到。二氢槲皮素(紫杉叶素)通过低能量的分子间相互作用与这些结构聚合物或多或少相关联，或仅仅简单沉积在细胞腔或其它类型的空腔中。被自由地放置在木质纤维素材料的多孔系统中，二氢槲皮素(紫杉叶素)分子可以根据其物理化学特性被不同的溶剂溶解。诸如二氢槲皮素(紫杉叶素)的物质被统称提取物以表示在不同的溶剂体系中它们的共同溶解度，但事实上，它们包括大量的化学结构。 
虽然在文献[3-15]中提到，某些类黄酮，尤其是二氢槲皮素(紫杉叶素)出现在包含茎、树皮和根的木材中，但至今为止还没有实际有用的统一方法来从针叶木种的这些木材部分中分离出这些化合物。 
发明内容
在一个总的方面，本发明涉及将从木材中分离类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)的过程与在制造各种机械木制品中利用木材的过程相结合。因此，本发明 的目的在于，ⅰ)为有用的类黄酮物质提供实际有用的来源，以及ii)改善机械木制品的制造过程中的经济性，其中，提出了将迄今仅用于能量生产和其它非提取目的的副产物的一种新应用，即将该副产物提供作为类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)的来源。 
因此，本发明涉及一种从包含树干的下部部分的木材部分(称为根段原木、树皮和根)分离类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)的方法，所述方法包括以下步骤： 
a)利用极性溶剂提取 
i)通过将根段原木和根碎裂或细分成木屑而得到的颗粒减小的木屑部分，或 
ii)作为机械木制品的精加工中的残余物而得到的、树皮的干燥软木部分或粉末状树皮；以及 
b)回收所述提取物， 
其中，所述木材为选自由下列木材所组成的组中的硬木或针叶木材 
-落叶松属的木材； 
-云杉属的杉木材； 
-冷杉属的枞木材； 
-松属的松树木材； 
-黄杉属的木材， 
并且从所有上述属中分离的主要物质是类黄酮，诸如二氢槲皮素(紫杉叶素)。 
上述方面、优点和特征仅仅是代表性的实施例。应当理解的是，它们不能被认为是对本发明的限制，本发明由权利要求书来限定。在下面的描述、附图以及权利要求书中，本发明的其它特征和优点将更加明显。 
附图说明
通过示例性而非限制性的方式来描述本发明，而对于附图中的数字，相似的附图标记表示相同或相应的部件，并且其中： 
图1表示用于分离类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)的最合适的木材原料。 
图2示意性地表示了木质材料。 
图3示出了在分离类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)的过程中利用的系统的示意图。 
具体实施方式
术语“类黄酮”应被理解为涵盖花色素、黄酮和黄酮醇、黄烷酮、二氢黄酮醇、黄烷-3-醇、黄烷-3,4-二醇(无色花色素)和聚合原花色素。 
所有这些组主要为能够用极性溶剂，即亲水性溶剂来提取的亲水性物质。 
图1中的附图标记12所表示的术语“根段原木”应当被理解为包含“原木”，即在树木树干的下部部分，也即从土壤表面13向上最多1米高的茎。 
图1中的附图标记14所表示的术语“根”或“根球”应当被理解为包含“树木的器官”，即通常位于土壤表面13下方的树木的部分。 
图1中的附图标记15所表示的术语“树皮”应当被理解为包含维管形成层的组织外部，即茎的最外层和木本植物的根。 
图2示出相对于木材材料10所使用的不同的术语，其中，附图标记1表示木髓；附图标记2表示年轮；附图标记3表示初生木射线(木髓射线)；附图标记4表示次生木射线(从外向内)；附图标记5表示形成层；附图标记6表示内树皮；附图标记7表示的外树皮；截面11是指水平截面；截面9是指径向截面；并且截面8是指弦切面。经测定，类黄酮性质的提取物，诸如二氢槲皮素(紫杉叶素)的含量随着密度的增加而增加，并且使得得到更耐用的木材，就如同心材的更密集形成使得得到更耐用的树木。当生长缓慢时，发现存在最好的强度性能和最好的耐用性，这意味着较宽的年轮由于较低的基材密度而使得耐用性较低。通常来说，与来自茎的较高部分的心材相比，来自茎的下部部分的心材具有更高的耐用性，这是因为耐用性从髓心向外增加。更具体地，类黄酮性质的乙醇提取物，诸如二氢槲皮素(紫杉叶素)以1.2％和2.2％之间每100轮的增量增加至双倍提取液浓度，其中1.2％和2.2％分别相当于104轮和175轮。在超过200树轮的时段里达到双倍浓度。类黄酮为可溶于乙醇的提取物，其在每10cm或更小的径向距离内浓度加倍。 
“颗粒减小的木屑部分”是指通过筛分或研磨至旨在用于机械木制品的制造过程中的优选尺寸的木屑而得到的被弃部分。除了根段原木和根之外，该木屑部分包括相当数量的“正常木材”，即该木材能够在机械木制品的制造过程 中使用并且被用作材料。该木材应当被细分为木屑，优选被细分为具有平均长度为约5mm至约20mm，并且平均宽度为约3mm至10mm的木屑。颗粒减小的树皮部分包括能够在机械木制品的制造过程中使用的、树皮的干燥软木部分或粉末状树皮。 
尽管能够利用颗粒减小的木屑部分和树皮的干燥软木部分或粉末状树皮来提取诸如二氢槲皮素(紫杉叶素)的类黄酮类物质，然而可能优选的是首先将材料分为根段原木部分、根部分和树皮部分，并且将这些部分用于各个部分提取。“根段原木部分”和“根部分”均指的是能够被用于得到机械木制品的过程的“正常木材”。“树皮的干燥软木部分”或“粉末状树皮”指的是能够用于机械木制品的制造过程中的材料。所述部分的分离能够直接由所述材料来获得，并且在其被细分至木屑或粉末状阶段之前，可首先进行精磨。 
根段原木、根和树皮可以作为原木加工的废料或副产品来得到，其中原木加工包含切割、打滑，利用整棵树(包含根、树皮、树枝和树冠)的就地处理。所利用的材料可以进一步被碎裂或粉末化，并且用于清洁电能或热的生产。 
“极性溶剂”可以是单一极性试剂，或者两种或更多种极性试剂的混合物，其中所述极性试剂或多种极性试剂的介电常数在25℃下测定大于3。可提及的作为极性溶剂的实例可以仅为纯水，并且可为水和醇的混合物，诸如水和乙醇。 
对于提取，可使用干燥的木材或木材原材料。 
尽管提取可被物理地整合至制造机械木制品期间的木材的利用中，然而可替代地，所述提取也可作为单独的过程来进行，这是因为根段原木、根和树皮，特别是根段原木和根的颗粒减小的木屑部分以及树皮的干燥软木部分或粉末状树皮能够容易地运输并储存以用于后续处理。 
类黄酮物质在根段原木、根和树皮中的量差别很大，并且取决于所使用的合格木材材料和所使用的木材物种。因此，源自提取阶段的提取物可含有相当浓度的类黄酮物质，并因此根据目的可以被用于得到粗类黄酮生产的物质而无须进一步纯化。 
在需要进一步纯化的情况下，待使用的方法特别取决于物质纯度的所需程度。有用的纯化方法的实例可以是提及的色谱和/或结晶。 
通过本发明的方法进行分离的重要的类黄酮物质是二氢槲皮素(紫杉叶 素)。然而，术语“类黄酮物质”并不限于该化合物。 
“二氢槲皮素(紫杉叶素)”是指具有基于C6-C3-C6骨架的分子结构的化合物，其中C6-C3-C6骨架由通过不存在C2-C3双键的三个碳链连接子连结的两个芳香环并且在2位和3位上具有两个手性碳原子。类黄酮结构的A环为乙酸衍生的(3×C2)，并且C环和B环源自于肉桂酸衍生物(苯丙素途径)。因此，B环可为(2S)构型或(2R)构型。二氢黄酮醇二氢槲皮素(紫杉叶素)的C-3原子上带有氢原子和羟基，因此是不对称的额外的中心。因此，每个二氢黄酮醇的结构可能具有四种立体异构体：(2R，3R)、(2R，3S)、(2S，3R)和(2S，3S)。已经在天然存在的二氢黄酮醇中发现了所有的四种构型，然而至今为止(2R，3R)构型是最常见的。 
与利用其它来源的相比，从根段原木、根和树皮中分离类黄酮物质或二氢槲皮素(紫杉叶素)是非常有利的。在这些“根段原木部分”、“根部分”和“树皮的干燥软木部分或粉末状树皮”来源中，类黄酮物质的浓度是正常木材中的类黄酮物质的2至20倍。许多这些化合物并不能存在于正常的木材中。因此，根据该方法得到的提取物的约20％至70％可为类黄酮试剂或多种类黄酮试剂。另一个特点是某种化合物可作为物质的衍生的类黄酮组的主导化合物存在。例如，源自落叶松木材根段原木的类黄酮的约65-85％可为二氢槲皮素(紫杉叶素)。 
因此，本发明提供了一种用于在提取物中以高浓度获得所需的类黄酮化合物或二氢槲皮素(紫杉叶素)的独特的方法。根据该优点，用于提取的木材材料是迄今为止被认为仅用于能量来源的木材部分的材料。 
分离的方法 
为了说明的目的，在此通过示例的方式来描述从落叶松树木的木材中分离类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)，但是该方法可以容易地适用于从其它纤维材料(诸如其他类型的针叶树木)中分离化合物。在处理之前，可选地，利用本领域中可用的方法使得例如源自落叶松属的纤维植物材料(诸如木材、根或树皮)尺寸达到优选的尺寸。在典型的系统中，木材材料根段原木12、根14和树皮15必须通过本领域已知的机器进行切割并且研磨或加工以使得原料木材材料被粉碎成木材颗粒。落叶松木材颗粒的优选尺寸取决于用于处理木材颗粒 的设备的类型。然后原料木材颗粒被送入进料斗用于储存直至需要该木材颗粒进行下一步骤。 
如图3所示，准备用于处理的木材颗粒，该木材颗粒经合适筛分和研磨而制备，并且将其从进料斗经由斜槽16运送到提取器单元20。提取器单元是本领域所熟知的，并且通常包含入口和出口；用于控制水平面的水平面检测器，以及可选地用于混合所制备的溶剂混合物和木材颗粒的溶剂预处理入口。溶剂混合物预处理用于解冻或软化木材颗粒，以便降低在后续步骤中从木材颗粒得到渗析液所需的能量。 
用于获得所需的类黄酮化合物或二氢槲皮素(紫杉叶素)方法中，优选地，在真空系统中进行提取，其中使用能量来加热溶剂混合物，其中溶剂混合物为两种或更多种极性试剂的混合物，并且该溶剂混合物与木材颗粒接触以从木材颗粒中提取类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)。对下列的提取条件进行优化：固/液比、提取时间、提取温度和真空度。被认为是优化的条件为：固/液比为1:4至1:6；在38℃至40℃的温度下进行提取，使用食品级的乙醇并且混合物中乙醇/水的比例为：含有20％至40％的乙醇和80％至60％的水(v/v)。 
提取溶剂混合物在真空下的沸点低于其在正常的空气压力下的沸点。因此，在25℃至最高40℃的较低温度下进行所述提取。这对于防止热敏性化合物二氢槲皮素(紫杉叶素)的降解是有益的。同时，溶剂混合物能够保持沸腾和较低温度下(例如最佳范围为30℃至38℃)回流。优选的是，将木材材料与溶剂的混合物相混合并且从木材材料中提取化合物。此外，提取系统中的空气大部分被泵出，从而由于在提取过程中存在较少的氧气，避免或减少了热敏性化合物的氧化。 
真空度和提取温度对类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)的提取率具有明显的影响。真空度可以根据在30℃至38℃下的提取温度来调节以使得在该温度下溶剂混合物具有更高性能，并且足以使溶剂连续地回流。此外，在预提取阶段中溶剂和木材颗粒的混合将导致该化合物的较高提取率。 
在真空系统中固-液提取的原理是：当固体材料与溶剂混合物进行接触时，在固体木材颗粒中能够溶解在混合物中的成分，诸如类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)移至溶剂中。因此，在真空下木材材料的溶剂提取物导致可溶性活性成 分(二氢槲皮素或紫杉叶素)传质至所述溶剂中，并且其在浓度梯度下发生。由于活性成分二氢槲皮素(紫杉叶素)的传质传还取决于其在溶剂混合物中的溶解度，因此加热该溶剂混合物能够提高传质。 
对于提取，根据所需的类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)的类型，来选择溶剂或溶剂混合物。在此，极性是重要的考虑因素。用乙醇或乙醇/水混合物来提取极性较大的类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)。大多数含类黄酮材料的提取仍然在真空系统中通过简单直接的溶剂提取来进行。 
所得到的水-乙醇渗析液或提取物通常含有多种物质，诸如糖和树脂、脂肪、萜类、木脂素等。因此，纯化步骤是必要的。通过提取器的内置的假底将提取物滴入至储存罐22，使如此得到的提取物从浆渣(耗尽的木材材料)中分离出来，其中假底上覆盖有滤布18。酱渣保留在假底并且提取物被容纳在储存罐中。将提取物从储存罐泵入有气泡的过滤机24中以去除提取物中的细颗粒或胶体颗粒。 
将来自提取器的富集的提取物(被称为混合油)进料至刮板式薄膜真空蒸发器26，在刮板式薄膜真空蒸发器26中，该富集的提取物在真空下浓缩以产生粗浓缩的提取物。该浓缩的提取物进一步被进料至真空室干燥器28中以产生不含有溶剂的固体膏状物。从刮板式薄膜蒸发器26和真空室干燥器28中回收的溶剂再循环回到提取器以用于下一批次的木材料。由此得到的浓缩的提取物被直接用于进一步的处理以用于分离类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)。 
现有技术是谨慎地使用真空蒸发法，其中，蒸发温度不超过45℃。相对于蒸发时间，温度对于该步骤的质量是特别重要的，尤其是如果该提取物中含有不耐热的成分，诸如类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)。 
含水的浓缩萃取物随后例如利用Gulf结晶器通过冷冻在两个阶段中进行浓缩。在第一阶段之后，该提取物为可用泵吸的浆料形式，其被离心以提供含约40％总固体的浓缩液，随后在第二阶段中被进一步浓缩至含约50％总固体的浓缩液。如下面述，随后冷冻二氢槲皮素(紫杉叶素)提取物。将冷冻的产物打碎并研磨至0.1mm～0.2mm的粒度。在冷冻干燥之后，粉末聚集在合适的聚集室中。聚集的粉末(密度高达0.5g/cm3)在惰性气氛中可被包装在气密容器中。 
优选地，在受控条件下进行浓缩的提取物的干燥，从而使得成品具有合适的密度和颜色。膏块提取物被冷冻成片或块状的形式的固体。在第一阶段中，膏块的提取物可被冷却至-12℃至-29℃的温度，同时在第二阶段中，冷却可以在较低的温度下进行，例如，在-40℃至-70℃之间进行。通常来说，可取的是，膏块提取物在冷却容积中的停留时间不少于约7分钟，并且可能长达25分钟。 
在冷冻干燥结束时，该提取物作为连续的刚性片材被除去，其随后可被打碎成适用于研磨的碎片。这些片段例如可被研磨至在优选的范围内的粒度。经研磨的颗粒随后在常规柜中被冷冻干燥，其负载在板上直至例如达到0.1mm厚度的层。冰晶体的升华在高真空下进行约150到175微米，且通常持续约7小时。具有0.2至0.5g/cm3密度的集聚的粉末可以在气密容器被包装在惰性气氛中或包装成所需的。 
使显示出所需生物活性的天然产物的不同纯度的提取物经受活性追踪分离直至其活性成分被分离和鉴定。这探索性的分离过程通常涉及不理想的色谱条件，因此，为了避免潜在不稳定成分二氢槲皮素(紫杉叶素)的破坏，必须在整个分离的过程中对其进行密切注意。 
高效液相色谱法(HPLC)成为至今为止用于分离制备规模和分析规模的类黄酮的最流行的技术。在分析方法学和制备方法学之间的区别在于：分析HPLC并不依赖于样品的回收率，而制备HPLC是纯化过程，并且旨在从混合物中分离出纯的物质。加工规模的HPLC是为了分离出用于商业化所需纯度的有价值的分子，诸如二氢槲皮素(紫杉叶素)的选择。随着世界各地对用于卫生保健的类黄酮类产品、保健品以及天然产品需求的增加，类黄酮提取物制造者已经开始使用最合适的提取技术以生产批次与批次之间存在最小变化的具有所规定质量的提取物。 
在前面的说明书中，参照本发明的具体的示例性实施方式对本发明进行了描述。然而，明显的是，在不脱离如在下文权利要求中所提出的本发明的更宽的精神和范围下，可对本发明进行各种更改和改变。相应地，说明书和附图应当被认为是解释说明的方式而不具有限制性意义。 

Claims (9)

1.一种从包括根段原木、树皮和根的木材中分离类黄酮的方法，所述方法包括以下步骤：
a)从极性溶剂与木材颗粒的组合中提取提取物，所述木材颗粒包括i)和ii)中的至少一种：
i)通过将所述根段原木和所述根细分成木屑而得到的颗粒减小的木屑部分，和
ii)作为机械木制品的精加工中的残余物而得到的、树皮的干燥软木部分或粉末状树皮；以及
b)回收作为所述提取步骤的结果而得到的所述提取物，
其中，所述木材选自由下列木材所组成的组中的针叶木材：落叶松属的木材、云杉属的杉木材、冷杉属的枞木材、松属的松树木材、和黄杉属的木材，并且，其中从所有上述属中分离的主要物质是类黄酮，或者所述木材为硬木。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述极性溶剂为单一极性试剂、或者两种或更多种极性试剂的混合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，在所述混合物中的所述两种极性试剂进一步包括20体积％～40体积％的乙醇和80体积％～60体积％的水。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述提取步骤在真空系统中进行，在所述真空系统中，使用能量来加热与所述木材颗粒接触的所述极性溶剂的所述组合，以从所述木材颗粒中提取所述类黄酮二氢槲皮素(紫杉叶素)。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述提取步骤在真空系统中进行，在所述真空系统中，使用能量来加热与所述木材颗粒接触的所述混合物，以从所述木材颗粒中提取所述类黄酮。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述提取物被进一步纯化以释放所需的类黄酮物质。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述所需的类黄酮物质是二氢槲皮素(紫杉叶素)。
8.根据权利要求6所述的方法，进一步包括冷冻干燥纯化后的提取物。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述硬木为落叶松，并且所分离的类黄酮是二氢槲皮素(紫杉叶素)。
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