JP2008033263A - 蛍光検査用の走査型レーザ顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】放出フィルタの不要な蛍光検査用の走査型レーザ顕微鏡を提供すること。
【解決手段】蛍光検査用の走査型レーザ顕微鏡では、照明用および検出用の放射線経路が、２色性の主カラー・スプリッタ（１）によって光学的に結合されており、検出された試料光が、更なるビーム・スプリッタ（２）によって複数の検出器に導かれ、少なくとも主カラー・スプリッタまたは少なくとも１つの更なるスプリッタのスプリッタ面での、照明光の入射角度および／または試料光の入射角度が４５度より小さい。
【選択図】 図３

Description

本発明は、蛍光検査用の走査型レーザ顕微鏡に関する。

基本的に走査型レーザ顕微鏡（ＬＳＭ）は、図１に示されたように、光源と、走査モジュールと、検出ユニットと、顕微鏡の４つのモジュールに分かれている。これらのモジュールを以下に詳細に説明する。これに加えて（特許文献１）を援用する。

プレパラート中の様々な色素を特異的に励起させるために、ＬＳＭでは様々な波長のレーザが用いられる。励起波長の選択は、検査する色素の吸収特性に基づいて行われる。励起放射線は光源モジュールで発生させる。その際に様々なレーザ（アルゴン、アルゴン・クリプトン、ＴｉＳａレーザ）が用いられる。光源モジュールでの異なる波長の統合は、図１で光源モジュールの右半分に示されているように、ビーム・スプリッタまたはミラーを介して行われる。

さらに光源モジュールでは、波長の選択および必要な励起波長の強度調整が、例えば音響光学結晶（ＡＯＴＦ）を用いて行われる。
続いてレーザ光線は、ファイバまたは適切なミラー構成を介して走査モジュールに達する。

光源で発生したレーザ光線は、回折を制限されて、スキャナ、走査光学系、および鏡筒レンズを経由し、対物レンズによってプレパラートに集束される。焦点は点状で、試料をｘ−ｙ方向にラスタ走査する。試料を走査する際の１ピクセル滞在時間は、大抵の場合、１マイクロ秒未満から数秒までの範囲にある。

蛍光の共焦点検出（デスキャン検出（ｄｅｓｃａｎｎｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ））の場合、焦点面（試料（Ｓｐｅｃｉｍｅｎ））から、ならびにその上および下にある平面から放出される光は、スキャナを経由して２色性ビーム・スプリッタ（ＭＤＢ）に達する。ビーム・スプリッタは、蛍光を励起光から分離する。続いて蛍光は、焦点面に対する共役面に正確に存在する絞り（共焦点絞り／ピンホール）上に集束される。これにより焦点の外にある蛍光が抑制される。絞りのサイズを変えることで、顕微鏡の光学解像度を調整することができる。

絞りの後ろには、更なる２色性のブロック・フィルタ（ＥＦ）があり、このフィルタが再度、励起放射線を抑制する。ブロック・フィルタを通過した後に、蛍光は、点検出器（ＰＭＴ）によって測定される。

多光子吸収を用いる場合、色素の蛍光発光の励起は、励起強度が特に高い小さな体積で行われる。この領域は、共焦点構成を用いる場合に検出される領域よりほんの少しだけ大きい。したがって、共焦点絞りの使用を省略し、検出を対物レンズの直後に行ってもよい（非デスキャン検出）。

多光子吸収によって励起された色素の蛍光を検出するための更なる構成では、さらにデスキャン検出が行われるが、但し今回は対物レンズの瞳が検出ユニットに結像される（非共焦点のデスキャン検出）。

３次元で照明された画像から、対応する１光子吸収または多光子吸収と関連する両方の検出構成によって、対物レンズの焦点面にある平面（光切断面）のみが再現される。ｘ−ｙ面における試料の様々な深さｚでの複数の光切断面を記憶することによって、続いて計算機を用いて試料の３次元画像を生じさせることができる。

したがって、ＬＳＭは、肉厚のプレパラートの検査に適している。励起波長は、使用された色素の固有の吸収特性によって決まる。色素の放出特性に合わせられた２色性フィルタは、それぞれの色素から出た蛍光だけが点検出器によって測定されることを保証する。

生物医学の応用分野では、現在、細胞の複数の異なる領域が、異なる色素によって同時に標識される（マルチ蛍光）。現況技術では、それぞれの色素は、異なる吸収特性、または異なる放出特性（スペクトル）に基づいて別々に検出できる。
そのために、副ビーム・スプリッタ（ＤＢＳ）を用いて複数の色素の蛍光を追加的に分離し、それぞれの色素放出を別々の点検出器（ＰＭＴｘ）で別々に検出する。

カール ツァイス マイクロイメージング社（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ ＧｍｂＨ）のＬＳＭ ＬＩＶＥは、毎秒約１２０の画像を生成する非常に速いライン・スキャナを実現している（非特許文献１参照）。
ＤＥ １９７０２７５３ Ａ１ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｅｉｓｓ．ｄｅ／ｃ１２５６７ｂｅ００４５９７９４／Ｃｏｎｔｅｎｔｓ−Ｆｒａｍｅ／ｆｄ９ｆａ００９０ｅｅｅ０１ａ６４１２５６ａ５５００３６２６７ｂ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｅｍｒｏｃｋ．ｃｏｍ／Ｃａｔａｌｏｇ／Ｎｏｔｃｈ ＳｐｅｃｔｒｕｍｖｓＡＯＩ．ｈｔｍ

図２には現況技術が、また図３には本発明が詳細に示されている。
図２では、対物レンズを経由して試料の方向に光源を反射させるための主カラー・スプリッタが設けられている。試料光は、主カラー・スプリッタＨＦＴを通り抜け、ピンホール光学系ＰＯおよび副カラー・スプリッタを経由して、検出器ＤＥ１およびＤＥ２の方向に達する。その際、目的の蛍光現象が検査できるように、試料光について、試料から反射された照明光および散乱光の除去が行われる。

さらに、検出器の前には、残っている邪魔な放射線を遮蔽するために、特に狭い帯域の放出フィルタＥＦが配置されている。
主および副カラー・スプリッタは、それぞれ光軸に対して４５度の角度で配置されている。

本発明の目的は、放出フィルタの不要な蛍光検査用の走査型レーザ顕微鏡を提供することにある。
本発明の一態様は、照明用および検出用の放射線経路が、２色性の主カラー・スプリッタ（１）によって光学的に結合されており、検出された試料光が、更なるビーム・スプリッタ（２）によって複数の検出器に導かれるように構成された蛍光検査用の走査型レーザ顕微鏡であって、少なくとも該主カラー・スプリッタまたは少なくとも１つの更なるスプリッタのスプリッタ面での、該照明光の入射角度および／または該試料光の入射角度が４５度より小さいことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡である。

本発明によれば、図３で、主カラー・スプリッタの部分的にミラーが貼り付けられた平面を、光軸に対して４５度より小さい角度で配置するのが有利である。光源ＬＱは、顕微鏡の光軸に対して９０度より小さい角度で配置されている。図４には、本発明に基づく更なる構成が示されている。この場合はさらに、副カラー・スプリッタＮＦＴが、光軸に対して４５度より小さい角度で配置されている。

ビーム・スプリッタを４５度より小さい角度で配置することにより、有利なことに、ＨＦＴおよびＮＦＴのフィルタ作用が、ピンホールＰＨの手前に追加の放出フィルタＥＦが要らなくなるほど強くなる（ＯＤが５または３より大きい）。

本発明によれば、コーティング設計は、４５度より小さい角度、好ましくは２０度までの角度に向くように変更され、つまりこの衝突角のとき最良の反射特性および透過特性を示す。

ノッチ・フィルタの場合、特有の入射角に合わせたコーティングは、例えば（非特許文献２）で実現されている。
本発明によれば、カラー・フィルタでは、有利なことに、衝突角がゼロから遠ざかるにつれてコーティングの光学密度が低下していくことが分かった。

本発明によれば、４５度より小さい角度で、コーティングの比較的高い光学密度が達成される。
図５には例として、様々な角度に対して可能なフィルタ特性（波長に依存する透過）が示されている。

光軸に対して４５度より小さい角度の場合に、透過の際に、つまり検出器の方向における励起波長が強く抑制されることが明らかである。
５度〜２０度の角度でＨＦＴおよび／またはＮＦＴを配置するのが特に有利である。その際にカラー・スプリッタで反射された入力放射線と出力放射線の空間的分離の改善を実現するために、光源から来る放射線の光軸に対する角度を大きくする働きをするミラーをさらに取り付けてもよい（図４参照）。このミラーが、特に有利にはＨＦＴ／ＮＦＴの構成要素であってもよい。

現況技術のＬＳＭの構成を示す図。 現況技術のＬＳＭの配置を示す図。 本発明によるＬＳＭの配置を示す図。 本発明によるＬＳＭの更なる配置を示す図。 様々な角度に対して可能なフィルタ特性（波長に依存する透過）を示す図。

符号の説明

１…主カラー・スプリッタ、２…副カラー・スプリッタ

Claims (4)

1. 照明用および検出用の放射線経路が、２色性の主カラー・スプリッタ（１）によって光学的に結合されており、検出された試料光が、更なるビーム・スプリッタ（２）によって複数の検出器に導かれるように構成された蛍光検査用の走査型レーザ顕微鏡であって、
   少なくとも該主カラー・スプリッタまたは少なくとも１つの更なるスプリッタのスプリッタ面での、該照明光の入射角度および／または該試料光の入射角度が４５度より小さい
   ことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
2. 請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記入射角度が２０度より小さい、走査型レーザ顕微鏡。
3. 請求項１または２に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記主カラー・スプリッタ（１）が少なくともＯＤ＝５で前記照明光を抑制し、また前記副カラー・スプリッタ（２）がＯＤ＝３未満で前記照明光を抑制する、走査型レーザ顕微鏡。
4. 請求項１乃至３のうちのいずれか１項に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記ビーム・スプリッタ（２）が、可変のグラデーション・フィルタとして形成され、グラデーションに沿って変位可能に配置されている、走査型レーザ顕微鏡。

Images