JP2001142002A

JP2001142002A - 共焦点レーザ走査顕微鏡

Info

Publication number: JP2001142002A
Application number: JP2000310662A
Authority: JP
Inventors: Werner Knebel; ワーナー、クネベル; Heinrich Ulrich; ハインリッヒ、ウルリッヒ
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 1999-10-12
Filing date: 2000-10-11
Publication date: 2001-05-25
Also published as: EP1093001A3; DE19949272C2; US6388807B1; DE19949272A1; EP1093001A2

Abstract

(57)【要約】【課題】獲得および運転が低コストであるような光源
がＣＬＳＭ用途に使用されることもできるようにした一
般的なタイプの共焦点レーザ走査顕微鏡を提供する。【解決手段】試料（２）を照射するための少なくとも
１つのレーザ光源（１）および試料からくる検出光
（３）を検出するための少なくとも１つの検出器（４）
を有する共焦点レーザ走査顕微鏡は、獲得および運転が
低コストである光源の使用に関して、ＣＬＳＭ用途を拡
張するために、単一モード（ＴＥＭ００）レーザ光源で
はない追加光源（５，８）が設けられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料を照射するた
めの少なくとも１つのレーザ光源および試料からくる検
出光を検出するための少なくとも１つの検出器を有する
共焦点レーザ走査顕微鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、一般的な型のレーザ走査顕微鏡が
知られており、特に、ウェーハ検査用として半導体業界
および生体臨床医学の基礎研究において使用されてい
る。

【０００３】顕微鏡対物レンズの焦点面において回折限
界強度分布を生成することができる単一モードレーザ
は、共焦点レーザ走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）用の光源と
して使用される。このために、単一モードレーザのレー
ザ光は通常、約１００〜３００μｍの直径を有する小さ
な照射用開口部に焦点を結ばせる。その結果、照射用開
口部はＣＬＳＭの単一点光源を構成する。

【０００４】単一モードレーザではない光源は、顕微鏡
対物レンズの焦点における回折限界強度分布の形態にお
いて、十分な照射密度を有するような共焦点照射を形成
することができない。

【０００５】空間的に拡張された非単一モードレーザ光
源の放射光強度は、このような小さな照射用開口部に十
分焦点を結ぶことができないため、大部分のＣＬＳＭ用
途の場合には、顕微鏡対物レンズの焦点において生じる
照射強度が弱すぎる。単に例を挙げるだけであれば、Ｌ
ＥＤ（発光ダイオード）がＣＬＳＭ用の光源として使用
され、その結果生じる問題について記載してある米国特
許第５，５７８，８１８号を参照すると良い。

【０００６】ＣＬＳＭ用途によっては、波長領域が紫外
領域から赤外領域まで及ぶレーザが使用される。特に、
ＣＬＳＭ顕微鏡法に適し、紫外領域で光を放射するレー
ザの場合には、一般に全体サイズが相当あり、例えば、
複雑な水冷循環システムのための極めて特殊な実験室の
構造を必要とする。このような紫外レーザシステムの獲
得および運転が高コストであることは、広範囲な用途に
おいて特に障壁となっている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、獲得および運転が低コストであるような光源がＣＬ
ＳＭ用途に使用されることもできるようにした一般的な
タイプの共焦点レーザ走査顕微鏡を構成し、開発するこ
とにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】前述の目的は、請求項１
の特徴によって実現される。請求項１によれば、共焦点
レーザ走査顕微鏡は、単一モード（ＴＥＭ００）レーザ
光源ではない光源が設けられ、更に試料の画像データに
おいて十分なＳＮ比を得るために、レーザ走査顕微鏡の
システム変数が調整可能であることを特徴とする。

【０００９】本発明によって認識されていることは、第
一に、一つ置きの光源をＣＬＳＭに結合することによっ
て、顕微鏡対物レンズの焦点面における強度分布の照射
密度が低いために、測定される画像データのＳＮ比が通
常の意味におけるデータ解析を行うことができないこと
である。

【００１０】しかし、追加光源を使用することができる
ようにＣＬＳＭのシステム変数を調整することができ、
画像データにおいて十分なＳＮ比を実現する。適切なシ
ステム変数は、例えば、照射の直径または検出ピンホー
ルの直径、記録所要時間または検出信号のゲインであっ
ても良い。

【００１１】データ記録用としてＣＬＳＭのレーザ光源
と同時に、追加光源を作動させることができる。結果と
して、ＣＬＳＭのビーム経路において、目的に適った適
切なフィルタまたはビームスプリッタがある場合には、
レーザ光源および追加光源からの光に関する試料特性を
同時に検出することができる。

【００１２】対応するフィルタ／ビームスプリッタが使
用されていない場合には、追加光源をレーザ光源の代わ
りに作動させることができる。これに関連して、まずレ
ーザ光源に関する試料特性を検出するデータ記録を行
い、次に追加光源を用いてデータ記録を行っても良い。

【００１３】

【発明の実施の形態】具体的な実施態様において、共焦
点原理に基づいて検出光を検出することができる。従っ
て、試料がレーザ光源および追加光源の両方を用いて照
射される場合には、共焦点によって試料の検出光が検出
される。

【００１４】レーザ光源および追加光源の両方を用いて
照射される場合には、試料の検出光は同一の光ビーム経
路に沿って通過するため、これは、この方式で記録され
る画像データが空間座標（補足的な配置）の点では一致
していることを保証する。

【００１５】極めて一般的な言い方をすれば、メタルハ
ライド蒸気ランプ、放電ランプまたはアークランプとし
て構成される追加光源が考えられる。特定のＣＬＳＭ用
途に関して、それぞれの場合において使用される追加光
源が、必要とされる光の特定の属性の作用として選択さ
れ、ＣＬＳＭに結合されることになっている。ＨＢＯま
たはＸＢＯランプを追加光源として使用しても良い。

【００１６】好都合なことに、共焦点蛍光レーザ走査顕
微鏡は、従来の蛍光顕微鏡として機能することもよくあ
るため、ＨＢＯランプは通常、共焦点蛍光レーザ走査顕
微鏡に既に含まれており、共焦点検出に対応する利用に
はほとんど追加的な設計の費用がかからず、追加コスト
もほとんどかからない。特に、紫外および可視領域にお
いて高光放射によって、複数のＣＬＳＭ用途を可能にす
る。

【００１７】更に、ハロゲンランプも追加光源として使
用することができる。これは特定の用途に適したハロゲ
ンランプであっても良いが、ＣＬＳＭにおいて通常含ま
れるＨＢＯランプなどの従来の顕微鏡のランプに使用さ
れる。

【００１８】多重モードレーザも追加光源として供給す
ることができる。ＬＥＤまたは電子ビーム衝突光源の使
用も考えられる。

【００１９】追加光源の光は、ミラー、レンズおよびフ
ィルタによってＣＬＳＭのビーム経路に結合される。こ
れに関して、追加光源の光のビーム特性に影響を及ぼす
ためにレンズを使用することができ、追加光源の光のビ
ーム方向を１つ以上のミラーを用いて修正することがで
き、最後にフィルタまたはビームコンバイナを用いて、
ＣＬＳＭのビーム経路に結合することができる。このよ
うなフィルタ／ビームコンバイナは、例えば、ダイクロ
イックビームスプリッタとして具体化することができ
る。

【００２０】好都合なことに、追加光源の光は、結合素
子を介することなく光ファイバに結合される。従って、
ランプ本体と光ファイバ先端との間に、例えばレンズの
形態の集束光学系は存在しない。代わりに、光ファイバ
先端はランプ本体に直接配置される。このために必要な
ことは、ランプに対する光ファイバ先端の位置を確定
し、不動にする適切な装置を利用可能な状態にしておく
ことだけである。

【００２１】結合される光の波長領域に関して、光ファ
イバは、単一モード光ファイバまたは多重モード光ファ
イバのいずれとしても構成される。結合されることにな
っている追加光源の光の総強度および光ファイバから射
出している光ビームの断面に関する強度分布に関して、
多重モード光ファイバが優先的に使用される可能性があ
る。光ファイバから射出している光のビーム分布が補助
的な役割を担っている場合には、多重モード光ファイバ
は更に多くの光を伝送することができる。

【００２２】具体的な実施態様において、追加光源を用
いた照射は、概ね点状の強度分布を顕微鏡対物レンズの
試料面に形成するような方法で行われる。この種の照射
は、ミラー、レンズ、照射用開口部およびフィルタの適
切な装置を用いて実現されても良い。

【００２３】結局、追加光源の光のビーム誘導は、ＣＬ
ＳＭのレーザ光源の光のビーム誘導に匹敵する。特に好
都合な態様において、点状の照射は回折限界である。次
に、これは、追加光源によって共焦点照射を生じること
になる。

【００２４】更なる実施態様において、追加光源を用い
た照射は、従来の明視野顕微鏡照射として実現される。
追加光源をＣＬＳＭのビーム経路に結合する光学系は、
追加光源の光によって顕微鏡対物レンズの試料領域全体
を照射することができるような方法で構成される。

【００２５】本発明の好都合な実施態様において、この
種の照射に関して試料から返ってくる検出光は、ＣＬＳ
Ｍの検出器を用いて共焦点原理によって検出される。比
較可能な態様において、従来の暗視野顕微鏡照射として
追加光源を用いた照射が考えられる。

【００２６】試料面における追加光源による照射はま
た、照射パターンの形で実現されることもできる。ここ
でもまた、結合される光学系の照射パターンのサイズお
よび形状は、追加光源によって形成されることができ
る。

【００２７】従って、好都合な態様において、試料面に
おける照射パターンを変化させるために、例えば、交換
可能な投影パターンを導入することによって実現するこ
とができる。具体的な用途において、試料面における照
射パターンは円形であり、直径１０μｍである。

【００２８】特に、蛍光顕微鏡法に関して、追加光源を
装備したＣＬＳＭを使用することができる。例えば、追
加光源としてＨＢＯランプを有するＣＬＳＭは、ＨＢＯ
ランプの発光スペクトルの紫外光部分を用いて、その吸
収スペクトルが紫外領域にある蛍光染料を励起するため
に使用されることもできる。

【００２９】結果として、多くの空間を占め、扱いにく
い高価な紫外レーザを得る必要はない。また、その吸収
スペクトルが可視領域または赤外領域にある蛍光染料を
励起するために、対応する追加光源を有するＣＬＳＭを
使用することも考えられる。

【００３０】基礎的な医学研究の場合には、本発明によ
る顕微鏡を用いて、ＦＲＥＴ顕微鏡法を実現することが
できる。この技術では、染料は照射によって励起され励
起エネルギーを放射するか、またはそれによって今度は
特有の電磁放射を励起および放射させる隣接する染料に
対して非放射方式においてその部分を放射する。

【００３１】例えば、ドナーとしてＣＦＰ（シアン蛍光
プロテイン）およびアクセプタとしてＥＧＦＰ（強化グ
リーン蛍光プロテイン）が適切であろう。更に、本発明
による顕微鏡を用いて、かご型化合物として適切である
蛍光染料を励起することができるであろう。この用途
は、例えばＨＢＯランプを追加光源として用いて実現さ
れることができる紫外領域における励起光を必要とす
る。

【００３２】特に好都合な態様において、画像データに
おける使用可能なＳＮ比を得るために、それによって記
録される画像データを平均化することができるように試
料が十分に走査されることがよくある。

【００３３】追加光源の結合は一般に、ＣＬＳＭのレー
ザ光源に比べて試料領域において更に低い光強度を生じ
るため、追加光源によって形成される検出光の信号はＣ
ＬＳＭのレーザ光源によって形成される検出光より弱
い。同一の試料領域からのデータを反復して記録するこ
とによって、更に小さな検出信号を考慮した統計的な平
均化を行うことができる。

【００３４】従って、同様の方式において、試料の走査
中に画素当たりの組込み時間を選択することができる。
例えば、追加光源によって形成される検出光に関する画
素当たりの組込み時間は、ＣＬＳＭのレーザ光源によっ
て形成される検出光の場合の５倍であっても良い。その
結果、これは、データ記録時間を５倍に増大することに
関連する。

【００３５】使用可能なＳＮ比はまた、検出ピンホール
の直径を選択することによって、得ることもできる。検
出ピンホールの直径が更に大きくなることにより、検出
される画像データのＳＮ比が増大する結果となる。この
場合には、次いで、対応するデータ記録の空間解像度が
基になる光学的な相関に応じて劣化する。

【００３６】図面を参照して、好ましい実施例の説明と
共に、教示する好適実施態様及び進展の結果についての
全体説明を行うこととする。

【００３７】実施例：図１および図２は、それぞれ、レ
ーザ光源１を有する共焦点レーザ走査顕微鏡を示してい
る。レーザ光源１は、試料２を照射するように作用す
る。試料２からくる検出光３は、３つの検出器４によっ
てそのスペクトル特性に関して検出される。

【００３８】図１に示されているような実施例におい
て、その光７が、ダイクロイックビームスプリッタ６に
よってＣＬＳＭの照射ビーム経路に結合されるようなＨ
ＢＯランプ５が追加光源として設けられる。

【００３９】図２に示されているような実施例におい
て、ＸＢＯランプ８として具体化された追加光源が、光
ファイバ９によってＣＬＳＭのビーム経路に結合され
る。ＸＢＯランプ８の光は、追加的な結合光学素子を使
用することなく、光ファイバ１０の入射端に直接結合さ
れる。

【００４０】光ファイバ端１０は、位置決め装置１１を
用いてＸＢＯランプのランプ筐体１２に直接位置決めを
行い、不動にさせることができる。ＸＢＯランプ８の光
は光ファイバの他方の端で射出し、ダイクロイックビー
ムスプリッタ６を介して照射ビーム経路７に結合され
る。光ファイバ９は、多重モード光ファイバとしてＸＢ
Ｏランプ８の光の波長領域に関して、具体化される。

【００４１】ＣＬＳＭの結合光学系およびビーム誘導の
ために、図１のＨＢＯランプ５の励起光７が試料面にお
いて従来の明視野顕微鏡照射を生じる。

【００４２】図２に示されているような実施例におい
て、ＸＢＯランプ８の励起光７の照射は、ＣＬＳＭにお
けるビーム誘導の結果として点状の照射として実現され
る。

【００４３】図１に示されているような本発明による共
焦点ＣＬＳＭは、特に生物学的な基礎研究において蛍光
顕微鏡法のために使用される。この具体的な用途におい
て、アルゴン−クリプトンレーザとして具体化され、４
８８ｎｍ、５６８ｎｍおよび６４７ｎｍの波長を備えた
光を放射するレーザ１は、特に生物試料の一定の試料領
域内に制限される蛍光染料を励起する。追加光源として
のＨＢＯランプ５は、３５５ｎｍ〜３７５ｎｍの領域で
励起されることができる蛍光染料ＤＡＰＩを励起する。

【００４４】いずれの例示の実施態様においても、画像
データにおける使用可能なＳＮ比を得るために、試料が
５回走査され、その結果記録された画像データを平均化
することができる。試料が走査される場合には、追加光
源５，８によって誘起される検出光の検出用に必要な組
込み時間は、レーザ光源によって誘起される検出光の５
倍である。追加光源５，８によって誘起された検出光の
検出用の検出ピンホールの直径は、レーザ光源１によっ
て誘起された検出光の検出用の検出ピンホールの３倍で
ある。

【００４５】結論として、上述した実施例は請求項の教
示を示すためのものに過ぎず、実施例に限定されるもの
ではない。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による共焦点レーザ走査顕微鏡の第１の
実施例の概略図。

【図２】本発明による共焦点レーザ走査顕微鏡の更なる
実施例の概略図。

【符号の説明】

１レーザ光源２試料３検出光４検出器５ＨＢＯランプ６ダイクロイックビームスプリッタ７照射ビーム経路８ＸＢＯランプ９光ファイバ１０光ファイバ端１１位置決め装置１２ランプ筐体

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料（２）を照射するための少なくとも
１つのレーザ光源（１）および前記試料からくる検出光
（３）を検出するための少なくとも１つの検出器（４）
を有する共焦点レーザ走査顕微鏡であって、追加光源（５，８）が、単一モード（ＴＥＭ００）レー
ザ光源ではなく、前記試料の画像データにおいて十分な
ＳＮ比を得るために、前記レーザ走査顕微鏡のシステム
変数が調整可能であり、前記追加光源（５，８）が、前
記レーザ光源（１）と同時に作動するかまたは前記レー
ザ光源（１）と交互に作動するように形成されることを
特徴とする共焦点レーザ走査顕微鏡。
【請求項２】前記追加光源（５，８）の光が、ミラ
ー、レンズおよびフィルタ（６）によって前記共焦点レ
ーザ走査顕微鏡のビーム経路に結合されるか、または光
の結合が光ファイバ（９）によって実現されていること
を特徴とする請求項１記載の顕微鏡。
【請求項３】試料面において、前記追加光源（５，
８）による照射が、照射パターンを形成していることを
特徴とする請求項１記載の顕微鏡。