JP2004298184A

JP2004298184A - ホスホグリセリン酸キナーゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質

Info

Publication number: JP2004298184A
Application number: JP2004081622A
Authority: JP
Inventors: Shigenori Kuramitsu; 成紀倉光; Ryoji Masui; 良治増井
Original assignee: Osaka University NUC
Current assignee: University of Osaka NUC
Priority date: 2003-03-20
Filing date: 2004-03-19
Publication date: 2004-10-28

Abstract

【課題】ホスホグリセリン酸キナーゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質を提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ホスホグリセリン酸キナーゼ活性を有する。このタンパク質は、超好熱性古細菌であって、好気性thermoacidophilic crenarchaeonの１種であるスルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)種７（JCM１０５４５）の遺伝子配列から耐熱性ホスホグリセリン酸キナーゼ活性を示すと推定される遺伝子をクローニングし、これを大腸菌を用いて発現させることにより得たものである。
【選択図】図１

Description

本発明は、ホスホグリセリン酸キナーゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質に関する。本出願は、国の委託に係る成果の出願である。

ホスホグリセリン酸キナーゼ（EC2.7.2.3.）は、解糖系においてはＡＴＰの存在下に３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸に作用して、Ｄ−１,３−ビスホスホグリセリン酸およびＡＤＰを生成するホスホトランスフェラーゼの１種である。このような酵素としては、多くの起源から生成され、数多く報告されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５など参照）。また、好熱性古細菌由来のホスホグリセリン酸キナーゼとして、メタノバクテリウム・ブリアンチイ（Methanobacteriumbryantii）由来のもの、メタノサーマス・フェルビダス（Methanothermus fervidus）由来のもの(非特許文献６参照)、パイロコッカス・ウオセイ（Pyrococcuswoesei）由来のもの（非特許文献７、非特許文献８）などが知られている。

他方、超好熱性古細菌（非特許文献９参照）についての研究があり、スルホロブス属細菌の１種であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（JCM１０５４５）（非特許文献１０参照）は、その遺伝子が既に解析されている（非特許文献１１参照）。したがって、この超好熱古細菌が、ホスホグリセリン酸キナーゼを産生するとすれば、それは優れた耐熱性を有すると予想され、また前述の好熱性古細菌由来のものとは異なる機能および活性を有する可能性がある。
J. Biol. Chem. 204 (1953) 939-948 Biochim. Biophys. Acta (1947) 292-314 Biochim. Biophys. Acta 65 (1962) 355-357 Biochem. J. 81 (1961) 405-411 Biocheim. Biophys. Acta, 1998 Jul 28;1386(1):179-88 Gene, 91, 19-25 (1990) Gene, 172, 121,(1996) Eur. J. Biochem., 1995 Ocr 1;233(1):227-37 Advances in Protetin Chemistry, Volume 48, Enzymes and Proteins from Hyperthermophilic Microorganisms (M.Adams ed.), Academic Press (1996) Suzuki, T. et al., Extremophiles, 2002 Feb;6(1):39-44 Kawarabayashi,Y. et al., "Complete genome sequence of an aerobic thermoacidophilic crenarchaeon, Sulfolobus tokodaii strain7", DNA Res. 8 (4), 123-140 (2001)

本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、ホスホグリセリン酸キナーゼ活性を持つ新規耐熱性タンパク質の提供を、その目的とする。

前記目的を達成するために、超好熱性古細菌であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（JCM１０５４５）のゲノム情報について調べたところ、この細菌が、ホスホグリセリン酸キナーゼを産生する可能性があることを突き止めた。この知見に基づき、さらに研究を重ねたところ、この細菌の遺伝子から、ホスホグリセリン酸キナーゼ活性を持つ新規タンパク質を発現させることに成功し、本発明に到達した。なお、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（JCM１０５４５）は、理化学研究所生物基盤研究部微生物系統保存施設に保存されており、第三者の要求により分譲可能である。スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（JCM１０５４５）の生育温度は８０℃であり、生育限界温度が８７℃であるから、本発明のタンパク質は、８０〜８７℃の高温であっても活性がある。また、前述の好熱性古細菌が嫌気性であるのに対し、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（JCM１０５４５）は、好気性であるから、この株由来のホスホグリセリン酸キナーゼは、従来のものと異なる機能および活性を有する可能性がある。

すなわち、本発明のタンパク質は、下記の（ａ）または（ｂ）のタンパク質である。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、ホスホグリセリン酸キナーゼ活性を有する耐熱性タンパク質。

本発明により、ホスホグリセリン酸キナーゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質が提供できる。

前記ホスホグリセリン酸キナーゼ活性は、ＡＴＰの存在下に３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸に作用して、Ｄ−１,３−ビスホスホグリセリン酸およびＡＤＰを生成する機能である。なお、本発明のタンパク質は、前記反応の逆反応を触媒してもよい。

前述のように、本発明の新規耐熱性タンパク質は、超好熱性古細菌由来であり、具体的には、スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii) （JCM１０５４５）由来である。但し、本発明のタンパク質は、この菌が産生するものに限定されず、遺伝子工学的手法により、他の生物が産生するものであってもよい。

つぎに、本発明の発現ベクターは、前記本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたは配列番号２に記載のＤＮＡを含むベクターである。

つぎに、本発明の形質転換体は、前記本発明のベクターにより形質転換された形質転換体である。なお、宿主は特に制限されず、例えば、大腸菌等がある。

つぎに、本発明のタンパク質の製造方法は、前記本発明の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法である。

つぎに、本発明の製造方法は、酵素反応により、ＡＴＰの存在下、３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸から、Ｄ−１,３−ビスホスホグリセリン酸およびＡＤＰを製造する方法であって、前記酵素として前記本発明のタンパク質を用い、温度８０〜９０℃の条件で前記酵素反応を行う製造方法である。

また、本発明の別の製造方法は、酵素反応により、ＡＤＰの存在下、Ｄ−１,３−ビスホスホグリセリン酸から３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸およびＡＴＰを製造する方法であって、前記酵素として前記本発明のタンパク質を用い、温度８０〜９０℃の条件で前記酵素反応を行う製造方法である。

このように、前記本発明のタンパク質を用いれば、温度８０〜９０℃の高温領域で酵素反応を実施でき、この結果、ホスホグリセリン酸キナーゼの工業的な用途が広がる。なお、この製造方法において、前記酵素反応のｐＨは、ｐＨ３〜９の範囲が好ましい。

前記２つの本発明の製造方法において、一定時間酵素反応を行った後、キレート剤により前記酵素反応を停止させることもできる。前記キレート剤としては、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）が好ましい。

以下、本発明について、さらに詳細に説明する。

本発明者らは、海洋底から採取された超好熱性古細菌であって、好気性thermoacidophilic crenarchaeonの１種であるスルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)種７（JCM１０５４５）の遺伝子配列からシスタチオニン−γ−シンターゼ活性を示すと推定される遺伝子（配列番号２）をクローニングし、これを大腸菌を用いて発現させることにより、本発明の新規耐熱性タンパク質を得るに至った。遺伝子のクローニング方法は、後記した実施例１に記載した通り実施した。クローニングされた遺伝子の塩基配列は配列番号２に示す通りであり、また、その推定アミノ酸配列は配列番号１に示す通りである。なお、本発明の耐熱性タンパク質は、ホスホグリセリン酸キナーゼ活性を有していれば、配列番号１のアミノ酸配列において、一つ以上若しくは数個のアミノ酸残基が、欠質、置換、付加若しくは挿入されていてもよい。このアミノ酸配列における「アミノ酸の欠失、置換、付加若しくは挿入」は、当業者に公知の方法（例えば、突然変異誘発法）に従って実施することができる。

本発明のタンパク質は、前述の本発明のタンパク質の製造方法により製造可能であるが、これに限定されず、他の製造方法で製造されてもよい。例えば配列番号１に示すように、そのアミノ酸配列が決定されているタンパク質については、その配列を元に当業者に公知の手法、例えば、個々のアミノ酸を化学的に重合してタンパク質を合成する方法に従って調製することができる。

本発明のタンパク質をコードする遺伝子の一例としては、配列番号２に示す遺伝子がある。前記遺伝子は、例えば、後記する実施例２に示すように超好熱性古細菌スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)（JCM１０５４５）のゲノムから、例えば配列番号２で示される塩基配列の一部をプライマーとして用いるＰＣＲ法あるいは該ＤＮＡ断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により調製することができる。また、その塩基配列をもとに、当業者に公知である核酸化学合成法等に従って前記遺伝子を得ることもできるが、これらに限定されない。

本発明の発現ベクターは、前記遺伝子もしくは配列番号２のＤＮＡを適当なベクターに挿入することによって得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ＡｃＭＮＰＶなどのバキュロウイルスなどが挙げられる。プラスミドＤＮＡは、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法またはその変法などにより調製することができる。また、市販プラスミドとして、例えばｐＥＴ-１１ａ（Novagen社製）あるいはバチルス属の宿主を用いて分泌型のプラスミドなどを用いてもよい。これらのプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが含まれていてもよい。

ベクターへの遺伝子等の挿入は、例えば、精製された遺伝子の塩基配列を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などを用いることができるが、これらに限定されない。また、本発明の遺伝子の機能が発揮されるように、本発明の発現ベクターには本発明の遺伝子のほか、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合配列などを組み込んでいてもよい。さらに、本発明の遺伝子も他のタンパク質のコードする配列を融合したものを挿入してもよい。

前記発現ベクターで宿主生物を形質転換すれば、本発明の形質転換体が得られる。宿主生物としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、大腸菌などの原核生物細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。形質転換法としては、既に公知である塩化カルシウム法などを使用することができるが、これらの方法に限定されない。

本発明のタンパク質の製造方法は、前記形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法である。前記培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の微生物を宿主とした形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行えるものであれば、天然培地、合成培地などのいずれを用いてもよい。本発明のタンパク質の回収は、特に制限されない。前記タンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することによって前記タンパク質を回収する。また、本発明の前記タンパク質が菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離などにより菌体または細胞を除去した後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。なお、培養液をそのまま使用する場合、熱処理をすることにより、本発明のタンパク質以外のタンパク質が失活するので、実質上、本発明のタンパク質のみの酵素液として使用できる。

以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されない。

染色体ＤＮＡの調製
スルフォロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii(ＪＣＭ１０５４５))をＬ培地中で37℃にて一晩培養して集菌したものに、ＳＳＣ溶液 (０．１５ＭＮａＣｌ, ０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム)１０ｍＬ、０．５ＭＥＤＴＡ、１００ｍｇ／ｍｌニワトリ卵白リゾチーム０．１ｍＬおよび１０％非イオン性界面活性剤Ｂｒｉｊ-５８を０．５ｍＬ加え、０℃で３０分間放置した後、プロテイナーゼＫ(Ｍｅｒｃｋ社製)５ｍｇを１０％ＳＤＳ０．２ｍＬに溶かした溶液を加え、３７℃で２、３日間放置した。この溶液に水飽和フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールの混合溶液を加えて、３７℃で１時間放置した後、水層を分取し、そこへエタノールを加えてＤＮＡを沈殿濃縮した。このＤＮＡの沈殿をＴＥ溶液(１０ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１ｍＭＥＤＴＡ(ｐＨ８．０))１０ｍＬに溶解し、リボヌクレアーゼ０．２５ｍＬ(最終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬ)を加えて、３７℃で一晩放置した後、エタノールで沈殿させた。次いで、ＤＮＡをＴＥ溶液５ｍＬに溶解した後、２６０ｎｍの吸光度より、ＤＮＡ濃度を決定した（Clarke,L.& Carbon,J.(1979) Methods Enzymol.68,396-408）。

発現プラスミドの構築と遺伝子発現
１．発現プラスミドの構築
耐熱性ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子の翻訳領域の後ろに制限酵素ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩサイトを含むＤＮＡを構築する目的で下記のＤＮＡプライマーを合成し、このプライマーを用いたＰＣＲで耐熱性ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子の翻訳領域の後ろに制限酵素サイトを導入した。用いたＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤ-ｐｌｕｓ-（東洋紡社製）であった。
Forwadr primer（配列番号３）：5'-TGATCAAAGTAGCTGACCTTAATATTCCTGTT-3'
Reverse primer（配列番号４）：5'-ATATGGATCCGCGGCCGCTTATTAACTTTTTCCACTTTGCAT-3'

ＰＣＲ反応後、増幅断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、その遺伝子断片を精製した。ｐＥＴ-１１ａ（Novagen社製）を制限酵素ＮｄｅＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗｆrａｇｍｅｎｔで末端を平滑化した後，制限酵素ＢａｍＨＩでさらに切断したものを精製し、上記の構造遺伝子とＴ４リガーゼで１５℃、３０分間反応させ連結した。連結したＤＮＡの一部を大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体のコロニーを得た。得られた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地(１８ｍＬ)で２４時間培養し、その培養液から発現プラスミドを改変アルカリSDS法で精製した。精製プラスミドのインサートの塩基配列は、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｋｉｔ(登録商標：Applied Biosystems社製)とＡＢＩＰＲＩＳＭ３７００ＤＮＡＡｎａｌｙｚｅｒ(登録商標：Applied Biosystems社製)を用いて決定し、インサートの塩基配列が、耐熱性ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子の正しい配列であることを確認した。

２．組換え遺伝子の発現
大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ-ｇａｍｉ(ＤＥ３)(Novagen社製)のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに０．１ｍＬ移した。その中に上記１．の精製発現プラスミドの溶液０．００２ｍＬを加え氷中に２０分間放置した後、４２℃でヒートショックを９０秒間行い、氷中に1分間放置した後、クロラムフェニコールとアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地(５ｍＬ)で18時間培養し、耐熱性ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子を発現した。培養後、遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）で集菌した。

集菌した菌体に，破砕液(２０ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ、１００ｍＭＫＣｌ、ｐＨ７．５)を０．２ｍＬ加え，超音波発生器で細胞を破砕し，その懸濁液を０．１ｍＬずつ２本のサンプルチューブに分けた。一方のサンプルチューブは遠心分離(１３，０００Ｇ、１０分)して上清と沈殿に分け，沈殿は破砕液０．１ｍＬで懸濁した。もう一方のサンプルチューブは，熱処理（７０℃，１０分）を施した後，遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）して上清と沈殿に分け，沈殿は破砕液０．１ｍＬで懸濁した。これらの試料の一部をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析し，発現を確認できた。この結果を図１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真に示す。

耐熱性ホスホグリセリン酸キナーゼの発現が見られた試料についてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後，エレクトロブロッティングによってＰＶＤＦ膜に転写し，染色によって可視化された目的組換えタンパク質である耐熱性ホスホグリセリン酸キナーゼのバンドを切り出し，プロテインシーケンサーＭｏｄｅｌ４９２Ｐｒｏｃｉｓｅ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて，アミノ末端配列を解析した結果、配列番号５に示すように６残基のアミノ末端配列を決定できた。この配列より，発現タンパク質が耐熱性ホスホグリセリン酸キナーゼであることを確認できた。この発現タンパク質は、４１５アミノ酸残基より構成されており、その推定分子量は４５．４ｋＤであり、図１の結果とほぼ一致した。

組換え大腸菌の大量培養
実施例２と同様にして調製したプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ−１１ａベクター）を用いて、大腸菌ＤＨ５α株を常法に従い形質転換した。形質転換された大腸菌ＤＨ５αからアルカリＳＤＳ法を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡを用いて、大腸菌ロゼッタ・ガミ(Rosetta-Gami)（ＤＥ３）株を形質転換した。プレート上に生えてきたコロニーを３白金耳量とり、５ｍＬのＬＢＬ培地(１％ペプトン、０．５％酵母抽出液、０．５％ＮａＣｌ、０．１％ラクトース、５０μｇ／ｍＬアンピシリン、４０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール)に植菌して、培養開始直前まで約６時間、３７℃で前培養した。この前培養液を全量、３Ｌの４×ＬＢＬ培地(４％ペプトン、２％酵母抽出液、２％ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍＬアンピシリン)に加え、高密度培養槽(ABLE社製)にて３７℃、ｐＨ７．２、圧力０．０２Ｐａでコンピュータプログラム制御し、培養した。ｐＨは、オートクレーブ済みの２ＭＨＣｌ(和光純薬社製)および２ＭＮａＯＨ(和光純薬社製)で調整した。集菌約２３時間前にオートクレーブ済みの３００ｍＬ発現誘導液（１０％ラクトース、２０％グリセロール）を加えた。大腸菌の生育度が定常期に入ったところ（培養開始５０時間後）で大型遠心分離機(Beckman社製 AvantiHP-30I)を用い集菌した。回収した菌体は、−３０℃で保存した。この時、菌体を少量、別に取り、１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ β-メルカプトエタノール(和光純薬社製)に溶解・懸濁し、超音波破砕装置（TOMY社製 UD-201）で破砕した。この溶液を２等分し、一方を９１００Ｇ、４℃で１０分間、遠心分離し、上清と沈殿に分け、他方を７５℃に設定した恒温槽（TAITEC社製DryThermounit DTU-1C）で１０分間、加熱した後、９１００Ｇ、４℃で１０分間、遠心分離し、上清と沈殿に分けた。これら４種の上清および沈殿（沈殿は、菌体破砕液にて再縣濁）に変性剤（６２．５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、２．４％β−メルカプトエタノール、０．００５％ブロムフェノールブルー（和光純薬社製））を加え、９５℃で５分間加熱し、変性させた。これらの変性させたタンパク質溶液を１２．５％または１５％(発現させるタンパク質の分子量により異なる)ポリアクリルアミドゲルに加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行った。染色液(Quick-CBB、和光純薬社製)を用い、電気泳動後のゲルを染色・脱色し、目的タンパク質の発現を確認した。

組換えタンパク質の精製
実施例３において、−３０℃で保存してあった菌体を、１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ β−メルカプトエタノールに溶解・懸濁し、超音波破砕装置（TOMY社製 UD-201）で破砕し、７５℃に設定した恒温槽（TAITEC社製、DryThermoUnit DTU-1C）で、１０分間、加熱した後、すばやく冷却した。次に、この破砕菌体液を大型遠心分離機（Beckman社製 Avanti HP-30I）を用いて、１００，０００Ｇで１時間、遠心分離し、上清を回収した。

次に、この上清をタンパク質精製装置（Amersham Biosciences社製、AKTA explorer）を用いて、１．０５Ｍ硫安、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ β-メルカプトエタノールの緩衝溶液に置換した後、疎水交換カラム(Amersham Biosciences 社製, RESOURCE^TMPhe 6ml)に通した。１．０５Ｍ→０の硫安濃度勾配で溶出させ、各画分をSDS-PAGEにて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。

次に、回収した画分を２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ β−メルカプトエタノールの緩衝溶液に置換した後、陰イオン交換カラム（Amersham Biosciences社製、RESOURCE^TMQ ６ｍｌ）に通した。塩化ナトリウムで溶出を行い、溶出してきた各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。

次に、回収した画分を１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）、０．５ｍＭ β−メルカプトエタノールに置換した後、遠心濃縮チューブ（ミリポア社製VIVASPIN10000）を用いて遠心分離して濃縮し、活性測定に供した。

活性測定
１．測定方法
実施例４において精製したタンパク質は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）であり、ＰＧＫは、生体内では、基質ＡＤＰと１，３−ビスホスホグリセリン酸からＡＴＰと３−ホスホグリセリン酸を生成する反応を触媒するが、この例では、３−ホスホグリセリン酸（ＰＧＡ）を用い、下記の種々条件で、逆反応（３−ホスホグリセリン酸＋ＡＴＰ→１，３−ビスホスホグリセリン酸＋ＡＤＰ）の活性測定を行った。すなわち、３０ｍＭのＮａＣｌと、５０ｍＭのＭｇＣｌ_２と、２０ｍＭのＡＴＰ（オリエンタル酵母社製）と、２０ｍＭのＰＧＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）とを含む反応溶液を後述の各測定温度で１分間保持した後、実施例４において精製したタンパク質を最終濃度が１０ｎＭになるように加え、５分間保持した（すなわち、反応時間５分）。その後、反応溶液と等量の０．１ＭのＨ_３ＰＯ_４を加え、反応を止めた。測定は、ＨＰＬＣ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ）を用いて陽イオン交換カラム（東ソー社製ＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥ２ＳＷ）で行い、濾過により除タンパクした反応溶液を１５μＬ採取し、リン酸濃度勾配（５０ｍＭ〜５００ｍＭ）により溶出させた。溶出してきたＡＴＰ、ＡＤＰを２５６ｎｍの波長で検出し、ピークを得た。得られたＡＴＰとＡＤＰのクロマトグラフィーのピーク面積の和とＡＤＰのピーク面積との比から生成物（ＡＤＰ）の濃度を求めた。

２．至適温度
３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５℃の各温度において、前記測定を行い、比活性を求めた。各温度での比活性は、８０℃での測定値を基準（１００％）として計算した。測定結果を、表1および図２のグラフに示す。図示のとおり、至適温度が９０℃であることが分かった。

３．金属イオンおよびキレート剤が活性に及ぼす影響
1)さらに５ｍＭＭｇＣｌ_２を加えて前記測定を行った場合の活性を基準（１００％）として、2)さらに０．２ＭＥＤＴＡを加えて前記測定を行った場合、3)さらに２０ｍＭＺｎＣｌ_２を加えて前記測定を行った場合の活性を比較することで、金属イオンおよびキレート剤が活性に及ぼす影響を調べた。反応温度は、８０℃とした。測定結果を、表２および図３のグラフに示す。図示のとおり、０．２ＭＥＤＴＡを加えて行った場合には、活性が見られず、キレート剤が反応の阻害に有効であることが分かった。また、２０ｍＭＺｎＣｌ_２を加えて行った場合には、活性の残留は見られたものの明らかに低下しており、Ｚｎ^２＋が反応の阻害に有効であることが分かった。

４．至適ｐＨ
緩衝溶液を、測定温度７０℃で目的のｐＨになるようにしたものに変更し、前記測定を行い、比活性を求めた。測定に用いた緩衝溶液と目的のｐＨの関係を表３に示す。

各ｐＨでの比活性は、最も活性の高かったｐＨ６．０での測定値を基準（１００％）として計算した。測定結果を表４および図４のグラフに示す。図示のとおり、すべてのｐＨで、最も活性の高かったｐＨ６．０の６５％以上の活性を有していた。なお、ｐＨ７．０での活性の落ち込みは、等電点近傍であるため、等電点沈殿の影響を受けたものと思われる。したがって、この酵素は、ｐＨ３〜９の領域において、等電点付近を除き、均一な活性を有するといえる。

５．熱安定性
前記測定に先立ち、１ｍＭの実施例４において精製したタンパク質溶液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ β−Ｍｅ）を、８０℃で、３０、６０、１２０分間前処理した。前記前処理物を用いて前記測定を行い、比活性を求めた。実施例４において精製したタンパク質の最終濃度は、１０ｎＭに代えて１００ｎＭとし、反応温度は、８０℃とした。なお、前処理時間０時間は、前処理を行っていないものであり、これを基準（１００％）として各前処理時間での相対活性を求めた。測定結果を、表５および図５のグラフに示す。図示のとおり、活性に大きな変化は見られず、この範囲での実施例４において精製したタンパク質の完全失活はないことが分かった。

本発明により、ホスホグリセリン酸キナーゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質が提供できる。本発明のタンパク質は、高温下で使用することが可能であり、工業的用途が広がると共に、基質濃度の増加、反応効率の向上、混入微生物の除去、保存期間および耐用期間の延長などの多くの利点がもたらされる。

図１は、本発明の一実施例における組換えタンパク質のＳＤＳ-ＰＡＧＥ写真である。図２は、本発明の一実施例における温度と比活性の関係を示すグラフである。図３は、本発明の一実施例における金属イオンおよびキレート剤が、精製タンパク質の活性に及ぼす影響を示すグラフである。図４は、本発明の一実施例におけるｐＨと比活性の関係を示すグラフである。図５は、本発明の一実施例における８０℃での熱処理時間と比活性の関係を示すグラフである。

配列番号１：耐熱性ホスホグリセリン酸キナーゼのアミノ酸配列
配列番号２：耐熱性ホスホグリセリン酸キナーゼの塩基配列
配列番号３：耐熱性ホスホグリセリン酸キナーゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを導入するための順方向プライマーを示す。
配列番号４：耐熱性ホスホグリセリン酸キナーゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを導入するための逆方向プライマーを示す。
配列番号５：Ｎ末端アミノ酸配列

Claims

下記の（ａ）または（ｂ）の耐熱性タンパク質。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、ホスホグリセリン酸キナーゼ活性を有する耐熱性タンパク質。
前記ホスホグリセリン酸キナーゼ活性が、ＡＴＰの存在下に３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸に作用して、Ｄ−１,３−ビスホスホグリセリン酸およびＡＤＰを生成する機能である請求項１記載のタンパク質。
超好熱性古細菌由来である請求項１または２記載のタンパク質。
超好熱性古細菌が、スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii) （JCM１０５４５）である請求項３記載のタンパク質。
請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡまたは配列番号２に記載のＤＮＡを含むベクター。
請求項５記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質の製造方法であって、請求項６記載の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法。
酵素反応により、ＡＴＰの存在下、３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸から、Ｄ−１,３−ビスホスホグリセリン酸およびＡＤＰを製造する方法であって、前記酵素として請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質を用い、温度８０〜９０℃の条件で前記酵素反応を行う製造方法。
酵素反応により、ＡＤＰの存在下、Ｄ−１,３−ビスホスホグリセリン酸から３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸およびＡＴＰを製造する方法であって、前記酵素として請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質を用い、温度８０〜９０℃の条件で前記酵素反応を行う製造方法。
前記酵素反応のｐＨが、ｐＨ３〜９の範囲である請求項８または９記載の製造方法。
一定時間酵素反応を行った後、キレート剤により前記酵素反応を停止させる請求項８から１０のいずれかに記載の製造方法。
前記キレート剤が、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）である請求項１１記載の製造方法。