JP2004004124A - 分析対象物の脱着およびイオン化のための方法および装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 分析対象物検出についてプローブから該分析対象物を脱着可能なエネルギーを放射するエネルギー源に対して該分析対象物を提示するための表面を有する、質量分光計中に取り外し可能に挿入され得るプローブを提供すること。
【解決手段】 質量分光計中に取り外し可能に挿入され得るプローブであって、該プローブが、分析対象物検出について該プローブから該分析対象物を脱着可能なエネルギーを放射するエネルギー源に対して該分析対象物を提示するための表面を有し、ここで少なくとも該表面が非金属材料を含む、プローブ。
【選択図】　なし

Description

本発明は一般的には、例えば、質量分析測定（ＭＳ）あるいはバイオセンサなどの方法による、後の科学的分析のための、分析対象物の脱着およびイオン化のための方法および装置に関するものである。

一般的に、質量分析測定による分析は、レーザービームを含む、レーザーなどの高エネルギー源を用いた少量のサンプルの気化およびイオン化を伴っている。物質はレーザービームによって、プローブ先端の表面からガスあるいは気相に気化され、このプロセス中に、個々の分子の一部は陽子を取リ込んで、イオン化される。これら正の電荷にイオン化された分子は、次に、短い高圧電界で加速され、高真空度チェンバーに導かれ（ドリフト）、その先で、感度の高い検出装置の表面に衝突する。飛行時間はイオン化された分子の質量の関数であるから、イオン化と衝突との間に経過する時間は、その分子の質量の判定に用いることができ、その分子質量は、次に特定の質量の既知の分子が存在しているかどうかの判定に用いることができる。

レーザー脱着／イオン化、飛行時間質量分析測定（ＴＯＦ）にプローブ先端に蛋白質あるいは他の大型の生物分子を載置（ｐｒｅｓｅｎｔ）する従来のすべての技術は、金属製プローブ端のむき出しの表面上に置かれる酸性基質の大過剰モルの蛋白質あるいは他の分析対象分子の結晶性固体混合物の調製を必要としている。（サンプルプローブ端は通常金属製であり、ステンレススチール、ニッケルメッキ材、あるいはプラチナでできている。）レーザービームによる分析対象物分子の破壊を防ぐためには、こうした基質に分析対象物を埋め込むことが必要だと考えられていた。レーザービームはプローブ端上の固体混合物に衝突し、そのエネルギーが、埋め込まれた分析対象物分子の一部と共に基質の小部分を気化するのに用いられてしまう。こうした基質がないと、分析対象物分子はレーザーのエネルギーですぐ砕かれてしまい、最初の巨大分子の質量や特性の判定が非常に困難であるか、あるいは不可能になってしまう。

こうした先行技術に基づく手順にはいくつかの制約があリ、蛋白質やその他の巨大生物分子分析対象物への適用を不可能にしている。第１に、非常に未精製のサンプルの場合、基質／分析対象物結晶あるいは固体混合物における過剰な外来性物質が存在しないようにするために、部分的に分別する（あるいは、できるだけそのサンプルを精製）ことが必要になる。大量の成分が存在していると、目標とされる分析対象物のイオン信号（脱着、イオン化、および／あるいは検出）を抑制してしまう可能性がある。こうした精製は時間がかかり、費用がかかリ、通常、分析対象物の回収率の低下（または完全な損失）につながり、そして、自動化分析装置での実行は非常に困難である。

第２に、従来の技術に基づく分析のために必要とされる分析対象物物質の量はそれ程大きくないが（通常はピコモル程度）、小児科患者でのテストなど、いくつかの状況においては、分析対象物の流体は極端に少量（マイクロリットル）でしか利用できず、しかも、種々の異なった分析を行う必要がある。したがって、ひとつの分析のための分析対象物／基質結晶性混合物の調製のために必要とされる非常に少量（体積などで）のものでさえ、重要な意味を持つ場合がある。また、プローブ端上で使用するための固体分析対象物／基質混合物の調製で用いられる分析対象物のごく一部（数千分の一またはそれより少ない）だけが脱着あるいは質量分析測定では用いられることになる。したがって、１）もっとずっと少ない量の分析対象物を用いれば済み、２）プローブの先端あるいは表面の予め決められた場所にひとつ、あるいは複数の分析対象物を配置し、３）（たとえば、１回、あるいは複数回の化学的、あるいは酵素反応の前後に）分析対象物の同じアリコットの分析を繰り返し行うことが可能で、そして４）より定量的な方法でテストを行うことができるようにする、従来の手順におけるどのような改良でも、多くの臨床領域で極めて有益であろう。

第３に、プローブの先端上で使用するための分析対象物／基質の固溶体の調製に用いられる、分析対象物である蛋白質あるいは他の巨大分子は、基質にとざされている（埋め込まれている）ため、その後のいかなる化学的検査あるいは処置にも適さない。また、今日まで使われた基質物質はすべて強い酸性であるため、後の試験のために分析物質を修飾する目的で混合物に試みられるはずの多くの化学反応に、有害な影響を及ぼす。したがって、分析対象物分子についての、後の化学的修飾あるいは反応を、基質またはプローブ先端からそれらの分子を除去することなく、あるいは全く「基質」なしに、導くことができるようにする方法におけるどのような改良でも、研究者および臨床医にとって大きな利益となるであろう。

いかなる形式の質量分析測定にせよ、完全なペプチドあるいは小さな蛋白質（わずか約１５ｋＤａまで）の分子質量測定に初めて成功したのは、高エネルギー粒子による表面のボンバーディング（プラズマ脱着および高速原子ボンバードメント分析測定）によってであり、この大躍進は１９８１年および１９８２年に起こった。１９８５年および１９８６年に改良が行われたが、収率（信号の強さ）、感度、精密さ、および質量の精度は比較的低いままであった。分子の質量がより高いタンパク質（約２０〜２５ｋＤａ）は、まれな場合を除いて観察されず、これらの方法では平均的な分子量（約７０ｋＤａ）のタンパク質は全く観察されなかった。したがって、質量分析測定によるほとんどのタンパク質の測定は、実現しないままであった。

１９８８年Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐとその共同研究者らは、ＵＶレーザー脱着飛行時間質量分析測定を用いて、大過剰のモル数のＵＶ吸収性酸性化学基質（ニコチン酸）の存在下に、比較的高い分子質量のタンパク質をプローブ先端上に置くと、それらのタンパク質を完全な状態で脱着できることを発見した。この新しい技術を、基質補助レーザー脱着／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、飛行時間質量分析測定と呼ぶ。レーザー脱着飛行時間質量分析測定（化学基質なし）が何度か用いられる状態があったが、タンパク質あるいは核酸のような大きな完全な生体高分子は、脱着に際しフラグメント化（破壊）されるため、それらの分子量測定にはまだ成功していないことが注目さる。したがって、化学基質の導入する以前は、完全な巨大分子の質量の明確な変化の検出には、レーザー脱着質量分析測定は基本的には有用ではなかった。基質結晶のランダムな形成および分析対象物分子の固溶体中にランダムに包含することが、先行技術であることに注目すべきである。

この先行技術には多くの問題および制約がある。例えば、以前には、分析対象物あるいは基質中に存在する混入物を洗浄除去することは難しいとされてきた。他の問題には、分析対象物−塩イオン付加物の形成、基質中の分析対象物の最適より低い溶解度、固体基質内の分析対象物の未知の局在性および濃度、複数の成分が同時に存在することによるシグナル（分子イオン）抑制「毒作用」、および選択的な分析対象物の脱着／イオン化が含まれる。しかし、ＫａｒａｓおよびＨｉｌｌｅｎｋａｍｐを含む先の研究者らが質量分析学を用いた分析対象物検出のための種々の技術を報告する前は、これらの先行技術は、少ない体積の均一化されたサンプル中の分析対象物の検出における制約特に、の感度および選択性における固有の技術的制約があった（Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ，Ｂｏｒｄｅａｕｘ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｏｍｅｔｒｙ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔ，ｐｐ．３５４−６２（１９８８）；Ｋａｒａｓ ａｎｄ Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ，Ｂｏｒｄｅａｕｘ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅＲｅｐｏｒｔ，ｐｐ．４１６−１７（１９８８）；Ｋａｒａｓ ａｎｄ Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６０：２２９９（１９８８）；Ｋａｒａｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（印刷中））。飛行時間質量分析測定にレーザービームを用いることは、例えば、米国特許第４，６９４，１６７号、第４，６８６，３６６号、第４，２９５，０４６号および第５，０４５，６９４号に示されている。これは参考文献として本明細書に組み入れる。

高分子量の生体高分子をフラグメント化することなく揮発させることに成功したことにより、多くの種類の生物学上の巨大分子の質量分析測定による分析が可能になった。さらに重要なことは、恐らく、生物学的な研究において決まって遭遇する問題を解くために、質量分析測定がさらに創造的に用いられる可能性を示したことであろう。最も新しい関心は、高速（分）高感度（サンプルの必要量は、ｐモルより少ない）であり複雑な混合物を分析できるという理由から、基質補助されたレーザー脱着／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、飛行時間（ＴＯＦ）質量分析測定（ＭＳ）の有用性に集められている。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳは、個々の分析対象物の質量の静的な測定／検証に用いるために引き続き有用であるが、生体高分子の場合には、未知の構造について最も重要な情報を与える相違がある。したがって、構造生物学において慣例的に用いるためには、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ技術の不利な制約は、サンプルの調製および不活性なサンプルプローブ素子の表面上への載置（析出）に関係し、特に、プローブ表面において、新たに調製した結晶性有機酸基質中に分析対象物が埋め込まれること（共凝固）を必要とすることに関係がある。プローブ素子の表面上の、結晶基質の不均一な並びの中に、分析対象物がランダムに分布していると、適量より多くの質量スペクトルを収集する（例えば、各々１００ショットの多数のセット）ため、レーザー脱着法に必要とされるよりはるかに多くの分析対象物あるいはサンプルの析出を必要とする。分析対象物の残リの部分は、通常、追加的な分析あるいは後の特徴づけのために回収されることはない。プローブ表面上での脱着には、１ないし１０ｐモル（それより少ないこともある）の分析対象物が必要であるにも拘らず、数個よリも少ない原子がレーザー脱着の間に消費されるにすぎないことが報告されてきた。したがって、１０⁵個ないし１０⁶個の用いた分析対象物の中の、ごく一部分が必要なのであって、残りは無駄になる。

固体基質中に分析対象物を埋め込むことに伴う有力なデータの、別の重要な損失は、プローブ表面上に残っている埋め込まれた分祈対象物（例えば蛋白質あるいはＤＮＡ）について、後の化学的および（または）酵素による修飾を行う可能性の減少あるいは完全な排除である。分析対象物の、他のアリコットあるいは、埋め込まれた分析対象物を基質を含まずに回収する能力（回収率が低く困難）のみが、構造に関するデータを得るために行われる、本発明者らが示差質量分析測定と呼ぶ方法を可能にする。

さらに、恐らく多くの生物学者および臨床医らが、ＭＳに慣れていること、および（または）その有用性に関しては懐疑的であるため、生物学の分野においてはＭＳの適用が制約されてきた。さらに、ＭＳは、ＭＡＬＤＩが適応されたいくつかの例では、特にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動が十分な代用法であるため、取りつきにくいか、あるいは費用がかかりすぎるとされている（例えば、生物学的な粗溶液の分離）。さらに、ＭＡＬＤＩは生物学雑誌および臨床雑誌にはほとんど現れない。

本発明の１つの目的は、複数あるいは選択した分析対象物のガス（蒸気）相への、一連の吸着、脱着、およびイオン化のための、改良された方法、材料の組成、および装置を提供することである。

別の目的は、多くの種類の化学的、物理学的、および生物学的修飾あるいは認識反応を、受け入れることができるかまたは受け入れやすい場所においての、分析対象物が基質溶液あるいは結晶性構造の中に分散されているのではなく、分子認識という事象を通して、エネルギーを吸収する「基質」物質の中、または上、または接着した表面の上に分析対象物が載置されている状況での分析対象物の脱着およびイオン化を含む、親和性による分析対象物の検出のための方法および装置を提供することである。

別の目的は、分析対象物質が、プローブ先端のサンプル載置表面を形成している基体に、化学的に結合しているか、あるいは物理的に接着するような方法および装置を提供することである。

別の目的は、サンプル載置表面を、エネルギー吸収性の分子を用いて修飾して、先行技術において行われる外来性の基質分子の添加なしに、分析対象物分子の好結果をもたらす脱着を可能にするための手段を提供することである。

別の目的は、質量の変わる分析対象物分子の脱着を容易にするために単層および多層の接着したエネルギー吸収分子が用いられているような種々の配置において、結合した（共有結合あるいは非共有結合）エネルギー吸収分子の適切な濃度を提供することである。

別の目的は、エネルギー吸収分子、親和性指向分祈対象物捕捉デバイス、光電管などを用いて修飾した表面の、多数の組み合わせを提供することである。

別の目的は、プローブ先端あるいは他のサンプル載置表面を形成している物質が、あらかじめ決められた分析対象物あるいは何種類かの分析対象物と選択的に結合するよう、１つあるいはそれ以上の親和性試薬（種々の、濃度および増幅の程度）で誘導されるような方法および装置を提供することである。

別の目的は、標的である分析対象物あるいは一団の分析対象物に対し、親和性試薬が化学的に結合するかあるいは生物学的に接着するようなシステムを提供することである。

別の目的は、載置している表面上に含まれている分析対象物の未使用の部分が、化学的反応性を残しており、そのため分析対象物の一連の化学的、酵素的、あるいは物理的処理に続いて、修飾された分析対象物の連続的な分祈ができるように、分析対象物を脱着およびイオン化するための方法および装置を提供することである。

別の目的は、分析対象物およびその成分の１次、２次、３次、または４次構造を解明する目的のための、標的分析対象物の、組み合わされた化学的あるいは酵素的修飾のための方法および装置を提供することである。

別の目的は、プロトン（Ｈ⁺）以外の陽イオンが、分析対象物である巨大分子の脱着およびイオン化に用いられる、分析対象物質の脱着およびイオン化のための方法および装置である。

従って、前述の目的を達成するため、本発明によれば、質量分析測定法による、分析対象物サンプルの分析対象物分子の質量の測定のための装置が供せられ、前記装置は、分析計チューブと；前記チューブの内側に真空を適用するための真空手段と；前記チューブ内で、前記分析対象物サンプルから脱着した分析対象物分子に加速電位を与えるための電位手段と；前記分析対象物分子の脱着およびイオン化を促進するために表面に結合している分子と共同して、前記分析対象物サンプルを載置するための、前記分析計チューブに可動的に差し込み可能なサンプル載置手段において、前記表面分子が、エネルギー吸収分子、親和性捕捉デバイス、光感作性付着分子、およびそれらの組み合わせから成る群から選択したサンプル載置手段と；前記の表面に結合した分子と共に、前記サンプル載置手段の上に置かれた分析対象物サンプルにおいて、前記質量分析測定分析に消費されなかった前記分析対象物分子の少なくとも一部が、後の化学的、生物学的、あるいは物理的分析処置を受けやすいまま残っている分析対象物サンプルと；前記分祈対象物サンプルから前記分析対象物分子の一部を脱着およびイオン化するために、十分なエネルギーを与えるために、前記分析対象物サンプルに向けるレーザー光線を発生させるためのレーザー光線手段と；前記分析計チューブに結合し、イオン化された分析対象物の加速された分子を検出するための検出手段とから成る。

さらに、前述の目的を達成するため、本発明によれば、分析対象物分子の質量を測定するための質量分析測定法が供せられ、その方法は以下の段階すなわち、プローブ先端面上のサンプル載置表面を、分析対象物分子と結合するための手段を有する親和性捕捉デバイスで誘導するステップと；前記の誘導したプローブ先端面を、前記分析対象物分子の源にさらし、前記分析対象物分子が結合するようにするステップと；前記分析対象物分子が結合している、誘導されたプローブ先端を、飛行時間質量分析測定器の一方の端に置き、真空および電場を与えて分析測定器内に加速電位を作るステップと；前記先端より前記分析対象物分子のイオンを脱着させるために、分析測定器内の、誘導されたプローブ先端面に結合している分析対象物の少なくとも一部分を、１つあるいはそれ以上のレーザーパルスを用いて、打つステップと；前記質量分析測定器内で、飛行時間によってイオンの質量を検出するステップと；このように検出された質量を表示するステップとから成る。

さらに、前述の目的を達成するため、本発明によれば、レーザー脱着／イオン化、飛行時間質量分析測定法により、分析対象物分子の質量を測定する方法が提供せられ、この方法においては、分析対象物の脱着およびイオン化を容易にするために、前記分析対象物と一緒にエネルギー吸収物質が使われ、その改良点は、エネルギー吸収物質の上あるいは表面上に分析対象物分子を載置することを含み、前記質量分析測定分析において脱着されなかった、分析対象物分子の少なくとも一部は、後の分析を化学的に受け入れられる状態のまま残る。

さらに、前述の目的を達成するため、本発明によれば、分析対象物分子の脱着およびイオン化を容易にするための装置が提供せられ、その装置は、サンプルを載置する表面と、表面に結合した分子とから成り、前記表面結合分子は、エネルギー吸収分子と、親和性捕捉デバイスと、光感作性付着分子と、それらの組み合わせとから成る群から選ばれ、前記表面結合分子は、前記サンプル載置表面と結合し、前記分析対象物分子と結合する手段を有する。

さらに、サンンプル載置表面上の分析対象物分子を捕捉し、後の分析のため前記サンプル載置表面上から前記の捕捉された分析対象物分子を脱着／イオン化するための方法が提供せられ、その方法は、前記サンプル載置表面を、親和性捕捉デバイスあるいは前記分析対象物分子と結合するための手段を有する光感作性付着分子を用いて誘導するステップと；前記の誘導したサンプル載置表面を、前記分析対象物分子を含んでいるサンプルに当てるステップと；前記の誘導したサンプル載置表面上の分析対象物分子を、前記親和性捕捉デバイスあるいは光感作性付着分子により捕捉するステップと；前記親和性捕捉デバイスあるいは光感作性付着分子により、誘導されたサンプル載置表面に結合されると同時に、前記分析対象物分子をエネルギー源あるいは光源にさらして前記分析対象物分子の少なくとも一部を前記表面より脱着させることから成る。

さらに、本発明によれば、分析対象物分子を分析用に載置するための、表面の調製法が提供せられ、その方法は、前記分析対象物を支持するため、前記表面上に基質を供するステップと；その基質を、親和性捕捉デバイスあるいは前記分析対象物と選択的に結合する手段を有する光感作性付着分子で誘導するステップと；前記親和性捕捉デバイスあるいは光感作性付着分子と結合した前記分析対象物を検出する手段とから成る。

さらに、前記の目的を達成するため、本発明によれば、ガス相への完全な分析対象物の脱着を促進するためのプローブが供され、それは、サンプル提示表面と；そのサンプル提示表面に結合したエネルギー吸収分子とから成り、前記サンプルプローブがエネルギー源によって打たれると、前記サンプルプローブは、エネルギー吸収分子の上、上方、あるいは間に位置している完全な分析対象物分子の脱着を促進する。さらに、このプローブにおけるエネルギー吸収分子は、シンナムアミド、シンナミル臭化物、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、およびα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸からなる群から選択される。

さらに、前記の目的を達成するため、本発明によれば、完全な分析対象物をガス相に脱着するためのサンプルプローブが提供され、それは、サンプル載置表面と；表面に結合している分子とから成り、その表面に結合している分子は、少なくとも２つの結合部位を有する光感作性付着分子であリ、少なくとも１つの部位は、分析対象物と結合することができ、さらに、その分析対象物結合部位は光不安定性である。

さらに、前記の目的を達成するため、本発明によれば、完全な分析対象物のガス相への脱着を促進するための、サンプルプローブが供され、それは、サンプル提示表面と；以下の２つのいずれか、すなわち前記サンプル提示表面に結合している、親和性捕捉デバイス、エネルギー吸収分子、および光感作性付着分子とから成る群より選択した、少なくとも２つの異なる分子であり、分析対象物が前記サンプルプローブと結合すると、そのサンプルプローブが、エネルギー源により打たれる際に分析対象物のガス相への移行を促進するというものと、前記サンプル提示表面に結合している少なくとも２つの異なる親和性捕捉デバイスであり、前記サンプルプローブがエネルギー源により打たれると、そのサンプルプローブが、前記分析対象物分子と結合している親和性捕捉デバイスに依存して異なる速度で、ガス相への分析対象物の移行を促進するというものとのいずれかから成る。

さらに、前記の目的を達成するため、本発明によれば、完全な分析対象物のガス相への脱着を促進するためのサンプルプローブが供され、それは、サンプル提示表面と；表面に結合している分子において、その表面に結合している分子が、エネルギー吸収分子として、さらに親和性捕捉デバイスとしても機能することができる分子か；あるいは、表面に結合している分子において、その表面に結合している分子が、少なくとも２つの異なる結合部位を有しており、少なくとも１つの結合部位がサンプル提示表面に結合しており、さらに、少なくとも１つの部位が分析対象物と結合することができ、分析対象物結合部位が光不安定性である分子のいずれかから成る。

さらに、本発明によれば、分析対象物の質量を測定するための質量分析測定法が供せられ、その方法は以下の段階、すなわち、プローブ先端面上のサンプル提示表面を光感作性付着分子（ＰＡＭ）により誘導して、前記ＰＡＭが少なくとも２つの結合部位を有し、１つの結合部位が、サンプル載置表面と結合し、そして少なくとも１つの結合部位が、分析対象物分子と結合することができるようにするステップと；前記の誘導されたプローブ先端面を、前記分析対象物分子源に当て、そこに分析対象物分子が結合できるようにすることと；前記分析対象物が結合している誘導されたプローブ先端を、飛行時間質量分析計の一方の端に設置し、真空および電場を与えて分析計内に加速電位を作るステップと；分析計内の前記の誘導されたプローブ先端面に結合した分祈対象物分子の少なくとも一部を、１つあるいはそれ以上のレーザーパルスでたたいて、前記先端より分析対象物分子のイオンを脱着させるステップと；前記質量分析計内での飛行時間によって、イオンの質量を検出することと；それらの検出された質量を表示することから成る。

さらに、レーザー脱着／イオン化、飛行時間質量分析測定法による分析対象物分子の質量の測定法において、分析対象物分子の脱着およびイオン化を容易にするために、前記分析対象物分子と共に光感作性付着分子（ＰＡＭ）を用いる測定法が供せられ、その改良点は、ＰＡＭの上あるいは表面上に分析対象物を載置して、前記質量分析測定分析において脱着されなかった分析対象物の少なくとも１部を、後の分析法のために化学的な変化を受けやすい状態に残すことを含む。

さらに、本発明により、完全な分析対象物分子のガス相への差動脱着を促進するための、サンプルプローブが提供せられ、それは、サンプル提示表面と；そのサンプル提示表面に結合する２つの異なる光感作性分子とから成り、前記サンプルプローブがエネルギー源によってたたかれると、前記サンプルプローブが、前記分析対象物分子に結合している光感作性付着分子に依存して異なる速度で、分析対象物分子のガス相への移行を促進する。

さらに、本発明により、完全な分析対象物のガス相への脱着を促進する、サンプルプローブが提供せられ、それは、サンプル提示表面と；そのサンプル提示表面に結合している光感作性付着分子とから成り、前記サンプルプローブがエネルギー源によってたたかれると、前記サンプルプローブが、完全な分析対象物分子のガス相への移行を促進する。

さらに、本発明によれば、生体高分子の配列決定のための方法が提供せられ、それは以下の段階すなわち、エネルギー吸収分子、親和性捕捉デバイス、光感作性付着分子、およびそれらの組み合わせから成る群より選択した、表面の選択分子を有するサンプル提示表面を含んでいるプローブ先端に、生体高分子分析対象物を結合するステップと；質量分析測定分析において生体高分子分析対象物を脱着し、前記生体高分子の少なくとも１部が、プローブ先端から脱着されないようにすることと、プローブ先端にまだ結合している生体高分子分析対象物を修飾している、脱着の結果を分析することと；生体高分子が配列決定されるまで、脱着、分析、および修飾の段階を繰り返すことから成る。

以下の明細書を読み、その１部を成し本発明の現在の好ましい実施例の実例を開示のために示している、添付図面を参照することにより、他の目的ならびにさらなる目的、特色、および利益が明らかになり、本発明が理解しやすくなるであろう。

本発明は、分析対象物検出についてプローブから該分析対象物を脱着可能なエネルギーを放射するエネルギー源に対して該分析対象物を提示するための表面を有し、ここで少なくとも該表面が非金属材料を含む、質量分析計中に取り外し可能に挿入され得るプローブを提供する。

１つの実施態様において、上記表面は合成ポリマー、ガラスまたはセラミックを含む。

１つの実施態様において、上記表面はポリアクリルアミド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、テフロン^TMおよびナイロンからなるグループから選択される合成ポリマーを含む。

本発明はまた、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、分析対象物を検出するためのシステムを提供する：（ａ）プローブから該分析対象物を脱着可能なエネルギーを放射するエネルギー源に対して該分析対象物を提示するための表面を有する取り外し可能に挿入され得るプローブであって、ここで少なくとも該表面が非金属物質および該表面上の分析対象物を含む、プローブ；（ｂ）該分析対象物を脱着するために該プローブ表面に対してエネルギーを向けるエネルギー源；および（ｃ）該脱着した分析対象物を検出する該プローブ表面と連絡する検出器。

１つの実施態様において、上記システムは、レーザー脱着質量分析計を含む。

１つの実施態様において、上記表面は合成ポリマー、ガラスまたはセラミックを含む。

１つの実施態様において、上記表面はポリアクリルアミド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、テフロン^TMおよびナイロンからなるグループから選択される合成ポリマーを含む。

本発明はまた、以下のステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、分析対象物を検出するための方法を提供する：（ａ）以下の（１）、（２）および（３）を含むシステムを提供するステップ；（１）プローブから該分析対象物を脱着可能なエネルギーを放射するエネルギー源に対して該分析対象物を提示するための表面を有する取り外し可能に挿入され得るプローブであって、ここで少なくとも該表面は非金属物質および該表面上の分析対象物を含む、プローブ；（２）該分析対象物を脱着するために該プローブ表面に対してエネルギーを向けるエネルギー源；および（３）該脱着した分析対象物を検出する該プローブ表面と連絡する検出器；（ｂ）該エネルギーに対して該分析対象物を露出することによって該表面から該分析対象物の少なくとも１部を脱着するステップ；および（ｃ）該検出器で該脱着した分析対象物を検出するステップ。

１つの実施態様において、上記システムはレーザー脱着質量分析計を含む。

１つの実施態様において、上記表面は合成ポリマー、ガラスまたはセラミックを含む。

１つの実施態様において、上記表面はポリアクリルアミド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、テフロン^TMおよびナイロンからなるグループから選択される合成ポリマーを含む。

１つの実施態様において、上記分析対象物は蛋白質または核酸を含む。

本発明は基本的には、例えば、質量分析測定あるいはバイオセンサーなどの方法で後で行う科学的な分析用に、分析対象物の脱着およびイオン化するための方法および装置に関するものである。より具体的には、本発明は質量分析測定、特に、蛋白質や生態高分子などの巨大分子を分析するために用いられるタイプのレーザー脱着／イオン化、飛行時間質量分析測定に関するものである。量も具体的には、本発明は、完全な巨大分子を含む分析対象物を、化学基質を加えないでプローブ表面から気相（蒸気相）に選択的に捕捉および脱着させるようにするサンプルプローブの形状、サンプルプローブ組成、そしてサンプルプローブ表面化学物質に関するものである。

本発明の前述の目的ならびにそれ以外の目的と有用性は、以下の明細書および添付図面から明らかになるであろう。

ここに開示されている発明に対しては、発明の精神を逸脱しないで、種々の置換や修正が可能であることは、当業者には明らかであろう。

プローブ素子に特定の分析対象物の捕捉および収容に積極的に関与することができるようにする表面を有する新しいＭＳプローブ素子組成物の開発は、最近、親和性質量分析測定（ＡＭＳ）と呼ばれる領域で、いくつかの可能性を明らかにしてきている、要約的に言うと、いくつかのタイプの新しいＭＳプローブ素子が親和性捕捉用強化表面（Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｏｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃａｐｔｕｒｅ：ＳＥＡＣ）を用いて設計されている（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ ａｎｄ Ｙｉｐ，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，７：５７６−５８０（１９９３））。現在までのところ、ＳＥＡＣプローブ素子は蛋白質の表面構造および生物固有分子認識について知られていることを活用して、種々のタイプの生体高分子、特に蛋白質の検索に用いられて、成功を収めている。

構造生物学における進歩は、充分な程度の感度での生体高分子配列情報を入手することができないことから、引き続き一定限度にとどまっている。本発明の方法および装置を用いることによって、ＡＭＳがこのような制約を打破する可能性を提供することを実証した。ＭＳプローブ素子表面（つまり、ＳＥＡＣ）上の不動態化親和性捕捉装置は、そのプローブ表面に対する分析対象物の位置および親和性（特異性）を判定するので、その後で行われる分析的ＡＭＳプロセスがいくつかの理由から一層効率的になる。第一に、プロープ素子上での分析対象物の位置を予め決めることができる。したがって、その後の脱着プロセスは入射レーザービームによるプローブ表面マトリックスフィールドのランダムサーチにはもはや依存しなくてすむ。第２に、分析対象物検出の感度（および動的範囲）が、複雑な構造物の場合にしばしば観察される分子イオン化抑制効果のために増大される。第３に、最初のレーザーによって誘発される脱着プロセスによって実際に消費されない分析対象物を後で行われる分析のために引き続き利用することができる。分析対象物の脱着を速やかに行うために外来性基質（ｍａｔｒｉｘ）を用いた場合、ほとんどの場合で、引き続き使用する分析対象物をロスすることなく、それを取り除くことができる。残った分析対象物は、その場所で（つまり、プローブ素子上で）、化学的および／または酵素的に直接修飾することができる。質量の違いを判定するためにＭＳで再度分析した場合、特殊な構造上の詳細が明らかになる。非常に少量の分析対象物（１０００兆分の１モル以下）しか消費しないで、構造に関する情報を引き出すために、分祈／修飾のプロセス全体を何回も繰り返すことができる。今日までに行われたＡＭＳに基づく蛋白質構造分析としては、Ｎ−およびＣ−両方の端末配列分析、および加リン酸化、脱リン酸化、グリコシル化、システイン残基反応、部位固有化学修飾（ヒスチジン残基など）、および配位子結合など、いくつかのタイプの配列固有の翻訳後修飾の確認などを含んでいる。

生体高分子配列を判定したリ、個々の生体高分子の構造の解明のためには、機能的分子上会合の構造的決定因子を理解する能力が必要になる。高次（たとえぱ、四元）構造物の構造的決定因子を調べる可能性も、ＡＭＳが提供する。本発明を用いることによって、従来の生化学分析手順では簡単には行なかったような共有結合によらない分子認識イベントを、プローブ素子表面の直接、あるいは間接的につながれた巨大分子分析対象物との分子的会合の評価によって直接調べることができる。

ここで用いられている『分析対象物』（ａｎａｌｙｔｅ）とは原子および／または分子を意味し、その錯体および断片イオンを含み、生物巨大分子の場合、蛋白質、ペプチド、ＤＮＡ，ＲＮＡ、炭水化物、ステロイド、および脂質などを含む。生命プロセスの構造あるいはその調節に関与している点で調査の対象となる重要な生化学分子のほとんどは、非常に大型である（通常、Ｈ₂Ｏの数千倍）。

ここで用いられている『分子イオン』とは、通常、１つあるいはそれ以上の陽子（Ｈ⁺）を付加したリ、あるいは失うことによる、荷電あるいはイオン化された状態の分子を意味している。

ここで用いられている『分子断片化』あるいは『断片イオン』は、例えば、レーザー誘発脱着（特に付加された基質（ｍａｔｒｉｘ）が存在しない条件で）中に発生する分析対象物分子の破壊された断片を意味している。

ここで用いられている『固体相』とは、例えば、プローブ素子表面上で固体状態にあることを意味している。

ここで用いられている『ガス』あるいは『蒸気相』とは、気体状態（真空中質量分析測定の場合）の分子を意味している。

ここで用いられている『分析対象物脱着／イオン化』という用語は分析対象物の固体相からイオンなどの気相への変移を意味している。なお、レーザー脱着による大型の、完全な分子イオンの脱着／イオン化が成功したのは比較的最近のことで（１９８８年）、適切な基質（ニコチン酸）が偶然発見されたことは突破口になった。

ここで用いられいてる『気相分子イオン』とは、気相状態にあるイオンのことを意味している。なお、蛋白質など分子量が大きなイオン（標準的な重量＝陽子１個の６０，０００〜７０，０００倍）は通常気化しない（つまり、それらは通常気相あるいは蒸気相の状態には入らない）。しかしながら、本発明による手順においては、蛋白質などの分子量が大きなイオンでも気相あるいは蒸気相に入ることができる。

ＭＡＬＤＩに関連して用いられている『基質』（ｍａｔｒｉｘ）とはいくつかの、小型で、光吸収性のある化学物質（例えばニコチン酸、あるいはシナピン酸）を意味しておリ、プローブ素子上で乾燥した場合に、結晶性の、基質に埋め込まれた分析対象物分子が（レーザー照射によって）良好に脱着され、固体相（結晶）から気相あるいは蒸気相にイオン化され、完全な分子イオンとして加速されるような方法で分析対象物と共に溶液内に混合される。ＭＡＬＤＩプロセスをうまく行わせるためには、分析対象物を新たに作成された化学的基質と混合させ（例えば、基質：分析対象物の１０，０００：１の割合で）、質量分析測定分析を行う直前に、不活性なプローブ素子の表面において空気で乾燥させる。飽和に近い濃度で存在している基質がモル数で何倍も多いので、分析対象物の結晶形成および捕捉が簡単に行われる。

ここで使われている『エネルギー吸収分子（ＥＡＭ）』とは、（ＳＥＮＤの場合のように）プローブ素子の表面に置かれた場合、後で完全な分子イオンとして加速されるようにするために、固体相（つまリ、表面）から気相あるいは蒸気相への脱着をより容易に行わせるようにするいくつかの、小さな、光吸収性化学物質を意味している。ＳＥＮＤという用語との関連では、ＥＡＭという用語を用いるのが好ましい。なお、ＳＥＮＤプロセスによる分析対象物の脱着は、面依存プロセスと定義される（つまリ、分析対象物が結合ＥＡＭによって構成された表面上に配置される）。対照的に、ＭＡＬＤＩは、現在のところ、表面全体を気相に『投げ込む』ような火山の爆発タイプのプロセスによって、分析対象物の脱着を速やかに行わせるものと考えられている。さらに、一部のＥＡＭは、ＭＡＬＤＩプロセスで述べられたように分析対象物分子を埋め込むために遊離化学物質として用いられた場合、作用を発揮しない（つまり、それらは分子脱着を促進しないでの、それらは適した基質分子とは言えない）。

ここで用いられている『プローブ素子』あるいは『サンプル提示装置』とは、以下の様な物理的性質を有する素子を意味している：つまり、不活性で（例えば、ステンレス鋼などの場合のように）、しかも積極的な役割を果すもの（例えばＥＡＭを含む様に強化された表面を有するプローブ素子および／または分子捕捉装置）。

ここで用いられている『ＭＡＬＤＩ』とは、基質支援レーザー脱着／イオン化のことを意味している。

ここで用いられている『ＴＯＦ』とは飛行時間（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ）のことである。

ここで用いられている『ＭＳ』とは質量分析測定（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）のことである。

ここで用いられている『ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ』とは基質支援レーザー脱着／イオン化、飛行時間質量分析測定のことを意味している。

ここで用いられている『ＥＳＩ』とは、電子スプレイイオン化の略語である。

ここで用いられている『化学結合』とは、単に、ひとつの化学物質（例えば、基質）を他の物質（例えば、不活性なプローブ素子表面）上に置いた場合に見られる様な、明確には定義されないような一般的な性格の化学的相互作用から、合理的で、熟慮された、そして分かっている、公知のタイプの化学的相互作用の操作を区別する意味で用いられている。定義されているタイプの化学結合としては、静電あるいはイオン性（＋／−）結合（例えば、蛋白質表面での正に荷電された基と負に荷電された基）、共有結合（電子の共有によって生じる非常に強力で、『永続的な』結合）、同位共有結合（例えば，蛋白質内の電子供与体基と銅または鉄などの遷移金属間の）、そして疎水性相互作用（例えば、２つの非荷電基間の）などがある。

ここで用いられている『電子供与体基』とは、生化学分子内の原子（例えば、Ｎ，Ｓ，Ｏ）が電子を『供与』したり、あるいは弱電基（例えば、銅イオンや他の遷移金属イオン）と電子を共有したりするような場合を意味する。

本発明はレーザー脱着／イオン化用強化表面（ＳＥＬＤＩ）を有する一般的なカテゴリーのプローブ素子（サンプル提示手段）を用い、このＳＥＬＤＩは以下の３つのサブ・カテゴリーがある。プローブ素子表面（サンプル提示手段）がその表面の直接（そのまま）付加された分析対象物の脱着／イオン化を容易に行わせるために、『基質』（ｍａｔｒｉｘ）の代わりにエネルギー吸収分子（ＥＡＭ）を含むように設計されているニート脱着用強化表面（ＳＥＮＤ）。このカテゴリー１（ＳＥＮＤ）は単独で、あるいは、プローブ素子表面（サンプル提示手段）が、種々のメカニズム（ほとんどは共有結合）によって、分析対象物のそのプローブ表面への特異的、あるいは非特異的な付着、あるいは吸着（いわゆる格納、または連結）を容易に行わせるための、化学的に定義された、そして／または生物学的に定義された親和性捕捉装置を含む様に設計されている親和性捕捉用強化表面（ＳＥＡＣ）（カテゴリー２）との組み合わせで用いられる。カテゴリー２（ＳＥＡＣ）は付加された基質と共に用いられるか、あるいは、付加された基質なしでカテゴリー１（ＳＥＮＤ）との組み合わせで用いられる。したがって、ＳＥＮＤとＳＥＡＣの組み合わせは、実際的には、別のカテゴリーとなる。

カテゴリー３は光の影響により付着及び放出用ＳＥＰＡＲ強化表面を用いるもので、この場合、プローブ素子表面（サンプル提示手段）は１つ、あるいは複数のタイプの、共有結合を利用した収容デバイスとして化学的に定義された架橋分子を含むように設計／修飾されている。これらの光感作付着分子（ＰＡＭ）は２価あるいはそれ以上の電荷を有しており、つまり、一方では先ずサンプル提示手段のプローブ素子表面にＰＡＭを永続的に付着させるように反応し、一方で、ＰＡＭの別の反応面が、分析対象物がＰＡＭ−誘導プローブ表面に接触した場合にその分析対象物を反応できるような状態にある。こうした表面（サンプル提示手段）は、共有結合に基づくものではあるが光の照射を受けた場合に可逆的な反応を示す（つまり、光感作性のある）非常に強力な（つまり、安定した、共有結合による）分析対象物の付着および吸着（つまり、収容あるいは連結）プロセスを可能にしてくれる。こうした表面は構造的回析を目的とする、その場所での（つまり、プローブ端上で直接）化学的および／または酵素的に修正されるための分析対象物のレーザーを利用した脱着のためのプラットフォームを提供してくれる。実際に照射を受ける（全体のうちの極小部分のみ）プローブ表面上の分析対象物だけが脱着される。連結された分析対象物の残りは共有結合で結合されたままとなっており、表面からの何らかの予定外の結合解除によるロスなしで修正される。ＳＥＰＡＲカテゴリー（カテゴリー３）は、光への露出によって可逆的な反応を示す分析対象物付着プロセスによって特徴づけられている。しかしながら、分析対象物とプローブ表面の付着結合の光に依存した可逆反応が進んでも、分析対象物が気相状態にいつでも変化するとは限らない。言い換えると、プローブ表面への分析対象物の光感作性付着に関与する分子が、ＳＥＮＤに関連して述べられたようなエネルギー吸収分子（ＥＡＭ）と同じであるとは限らない。しかしながら、ここに重要な例外がある。本発明はＳＥＮＤおよびＳＥＰＡＲに関して２重の機能性を発揮するハイブリッドＥＡＭ／ＰＡＭ化学物質を含んでいる。つまり、現在ＳＥＮＤのために用いられている一部のＥＡＭ分子は、ＳＥＮＤとＳＥＰＡＲプロセスの両方の媒介因子として作用するように修正することができる。同様に、ＳＥＡＣとＳＥＰＡＲの両方に関して２重の機能性を示す１部のハイブリッド親和性捕捉／ＰＡＭ化学物質も提供される。本発明は１部の親和性捕捉デバイス、特に、生物学的に明確に定義され、ＳＥＡＣとＳＥＰＡＲプロセスの両方の媒介因子として修正されるものを利用する。

本発明は、そうした目的のために、分析対象物の付着（連結あるいは固着）と、その後での連結された分析対象物の光に依存した脱着をすみやかに行わせる表面会合（あるいは表面結合）分子を利用したサンプル提示手段（すなわち、プローブ素子表面）を提供するものであり、ここで、上記表面分子は、分析対象物分子のサンプル提示手段への（共有結合を利用した付着メカニズムなどによる）結合（収容、連結、あるいは架橋）に関与する光に対して反応性を示す（光感作性）分子で構成されるグループから選択されることを特徴とする。さらに、その内部で、光（例えば、ひとつ、あるいは複数のレーザーからの）の入射パルスを用いて、後で行われる分析対象物のプローブの静止した（固体）表面からの気相（蒸気相）への脱着に支障を来たさないような方法で、プローブ表面に結合している分析対象物の光感作性結合を破壊することができるように、分析対象物がひとつ、あるいは複数の光感作性結合によってサンプル提示手段の表面に結合されることを特徴とする、サンプル提示手段（上に述べたような適切なプローブ素子物質のうちのひとつ、あるいは複数のもので構成されている）が提供される。

ＳＥＰＡＲサンプル提示手段（つまり、プローブ素子表面）と分析対象物（例えば、蛋白質）との間の光感作性分子付着点のタイプと数を決定する化学的な特異性には、分析対象物内のひとつ、あるいは複数の残基、あるいは化学構造（例えば、蛋白質やペプチド類の場合のＨｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｔｙｒ，ＰｈｅおよびＣｙｓ残基）が関係している可能性がある。言い換えると、蛋白質やペプチド類の場合、ＳＥＰＡＲサンプル提示手段は、複数の異なったタイプの付着点で分析対象物を固定するためのいくつかの違ったタイプの光感作性付着分子で修正されたプローブ表面を含むことができる。

分析対象物とプローブ素子表面との間の光感作性付着を破壊するのに必要な光の波長、あるいは光の強度は静止状態から気相あるいは蒸気状態への分析対象物の脱着を速やかに行わせるために必要な光の波長や光の強度を同じ場合もあれば、異なる場合もあるであろう。プローブ素子表面（例えば、サンプル提示手段）への分析対象物、特にペプチド、蛋白質、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシボ核酸（ＤＮＡ）および炭水化物（ＣＨＯ）などの生体高分子の付着には、プローブ表面と分析対象物巨大分子間の複数の付着点が関与している可能性がある。生体高分子が複数の付着点を介して付着されると、その生体高分子の骨格の異なった点を、化学的および／または酵素的手段によって切断、あるいは断片化され、その結果生じる断片の多くは分離された別個の分析対象物となり、それぞれ、ひとつ、あるいは複数の光感作性結合によってプローブ表面に付着（連結）されたままであり、飛行時間質量分析装置によって同時に行われる質量分析と同時並行的に気相状態に脱着される。

このプロセスにより、生体高分子（蛋白質、ペプチド、ＲＮＡ，ＤＮＡ，炭水化物）配列決定が可能になる。

ここで用いられている『親和性』とは２つの分子間の物理的および／または化学的吸引を意味している。一般的には、生化学的活性（つまり、情報伝達）の構造や調節を示す目的で用いられる。通常、ひとつの生化学分子の他の生化学分子に対する親和性は非常に特異的である。ここでは、間題の分子分析対象物が捕捉される原理を示す目的で用いられている。ＳＥＡＣの場合、問題の分析対象物に対して特徴的な親和性を示す化学物質あるいは生化学分子はプローブ素子の表面に連結（結合）され、望ましい分析対象物を積極的に『探し』出して、選択的にそれと結合する。

ここで用いられている『分子認識』とは、相互に対する自然な親和性による２つの分子間の相互作用を意味している。

ここで用いられている『分子捕捉』とは、特異的な親和性関係が存在している他の生化学分子を吸引、結合（捕捉）するために連結された生化学分子を用いることを意味する。

ここで用いられている『受動的吸着』とは、単に分析対象物を（例えば、基質と共に）置くことを意味している。

ここで用いられている『能動的収容』とは、ＳＥＡＣの場合のように、活性のあるプローブ素子表面で分析対象物分子を慎重に捕捉することを意味する。

ここで用いられている『静止状態』とは固体相と同じ意味である。ここでは、プローブ素子表面自体、あるいは不活性プローブ素子表面との組み合わせで用いられる『外部』微粒状ＳＥＮＤまたはＳＥＡＣデバイスを意味している。

ここで用いられる『活性表面領域』とは、望ましい反応または事象（例えば、ＥＡＭ付着または親和性捕捉）に関与すると考えられる、あるいは関与することがわかっている表面の領域のことを意味している。この活性表面領域は全表面積と比較すれば相当小さな割合である（これは、立体障害などの物理的な効果によって、総面積の一部が使えない、あるいは役に立たないからである）。

ここで用いられている『配位子』とは、大型の分子（魚）に結合比較的小さな分子（餌）を意味している。ここでは、配位子はリンカーアーム（釣り糸）を介してプローブ素子表面に付着（化学的に結合する）。こうしたプロセスにより、生化学分子の捕捉活動を表面（静止あるいは固体相状態）上で局所化することが可能になる。

ここで用いられている『親和性剤』とは、分析対象物捕捉デバイス、つまり、分析対象物を認識し、それに結合する能力を保持しつつ、（共有結合、化学的吸着などによって）提示表面上に保持される能力を持つタイプの分子（人造、非天然、天然、あるいは生物によるものとを含む）および／または化合物を意味している。

ここで用いられる『脱着』とは、分析対象物のプローブ表面からの脱離、および／または分析対象物の気相への移行を意味している。

ここで用いられている『イオン化』とは、分析対象物上にひとつ、あるいはそれ以上の電子単位に等しいプラスまたはマイナスの電荷をつくりだしたり、あるいは保持したりすることを意味している。

ここで用いられている『内転』とは、分析対象物を会合した付加物質の出現を意味しており、通常、過剰な基質（あるいは基質分解生成物）と分析対象物との直接の反応によって起きる。

ここで用いられている『吸着』とは、上記エネルギー吸収物資、親和性剤（分析対象物捕捉デバイス）、および／または分析対象物のプローブ（提示表面）への化学的な結合（共有結合および／または非共有結合）を意味する。

本発明の１つの実施例は、質量分析測定によって分析対象物サンプルの分析対象物分子の質量を測定する装置であって、該装置は分析計チューブ、該分析対象物サンプルから脱着された分析対象物分子への加速電位を付加するための、上記チューブ内に配置された電位（付加）手段、該分析対象物の脱着およびイオン化を速やかに行わせるために、表面会合分子と会合した状態で該分析対象物サンプルを提示するための、該分析計チューブに取り外し可能に挿入されるサンプル提示手段で、該表面分子がエネルギー吸収分子、親和性捕捉デバイス、光感作性付着分子、およびそれらの組み合わせで構成されるグループから選択されることを特徴とするサンプル提示手段と、該表面会合分子と会合した状態で該サンプル提示手段上に配置され、それによって、該質量分析測定分析で消費されなかった該分析対象物分子の少なくとも一部が後で行なわれる化学的、生物学的、あるいは物理的分析手順に用いることができる分析対象物サンプルと、該分析対象物サンプルからの該分析対象物分子を脱着、イオン化するのに十分なエネルギーを付与するために該分析対象物サンプルに向けられたレーザービームをつくりだすレーザービーム手段と、そして、加速化されたイオン化分子による衝撃を検出するための検出手段によって構成されている。

本発明の他の実施例は、分析対象物分子の質量を測定するための質量分析測定の方法であって、この方法は、分析対象物分子と結合するための手段を有する親和性捕捉デバイスでプローブ端面上のサンプル提示表面を誘導するステップと；該誘導されたプローブ端面を該分析対象物分子の供給源に露出して該分析対象物分子をそこに結合させるステップと；そこに結合した該分析対象物分子によって誘導されたプローブ端を飛行時間質量分析計の一端において真空にし、電場を発生してその分析計内部に加速電位を形成するステップと、上記分析計内部の該誘導されたプローブ端面に結合した分析対象物分子の少なくとも１部を１つ、あるいは複数のレーザーパルスで衝撃を与えて、該先端から該分析対象物分子のイオンを脱着させるためのステップと；該質量分析計内部でのその飛行時間によってそれらイオンの質量を検出するステップと；それら検出された質量を表示するステップとで構成されている。好ましい実施例においては、この方法はさらに脱着／イオン化支援基質物質を親和性捕捉デバイスと組み合わせて該プローブ端に適用するステップを含んでいる。より好ましい実施例においては、この方法はさらに、該プローブ端を該質量分析計から取り外すステップと、脱着されなかった該分析対象物分子の該部分の組成を変えるために、脱着されなかった該分析対象物分子の該部分に化学的、または生物学的手順を行うステップと、該変性された分析対象物分子と共に該プローブ端を再挿入するステップと；そして、該変性された分析対象物分子の分子量を判定するために、後で質量分析測定を行うステップとを含んでいる。

さらに別の実施例では、該親和性捕捉デバイスは該プローブ端の該面に化学的に結合されたり、該プローブ端の該面に物理的に接着されたり、あるいは該分析対象物分子に生物学的に接着するのに適合化されたりする。さらに別の実施例では、該分析対象物分子は生体高分子であり、該親和性剤は分化されていない生体サンプルから該生体高分子を選択的に分離するように調製されている。また、好ましい実施例においては、該基質物質が弱酸性から強酸性のｐＨ範囲にある。さらに好ましい実施例においては、該基質物質は６．０以上のｐＨ値を有している。さらにまた別の実施例では、該プローブ端の面が電気絶縁性の物質で構成されている。

本発明の別の実施例は、その内部でエネルギー吸収物質がその分析対象物分子の脱着およびイオン化を速やかに行わせるために該分析対象物分子と組み合わせて用いられるレーザー脱着／イオン化、飛行時間質量分析計で分析対象物分子の質量を測定する方法であり、その改良点は、上記エネルギー吸収物質の表面上あるいはその上方に上記分析対象物分子を提示し、該質量分析測定分析で脱着されなかった分析対象物分子の少なくとも１部が後で行われる分析手順で化学的に利用できる点にある。

本発明のさらに別の実施例は、分析対象物分子の脱着およびイオン化を速やかに行うための装置で、該装置は、サンプル提示表面と、表面会合分子で構成されており、その表面会合分子はエネルギー吸収物質、親和性捕捉デバイス、光感作性付着分子、およびそれらの組み合わせで構成されるグループから選択され、該表面会合分子は該サンプル提示表面と会合しており該分析対象物分子と結合するための手段を有している。

好ましい実施例においては、該サンプル提示手段は、飛行時間質量分析測定分析計に使用されるプローブ先端の表面で構成されている。さらに、この好ましい実施例では、該サンプル提示表面に化学的に結合したり、該サンプル提示表面に物理的に接着されたり、該分析対象物分子と化学的に結合したり、あるいは、該分析対象物分子と生物学的に接着したりする親和性捕捉デバイス、あるいは光感作性付着分子が用いられる。さらに、この好ましい実施例で用いられる分析対象物分子は生体高分子であり、該親和性捕捉デバイスあるいは光感作性付着分子は分化されていない生物学的サンプルから該生体高分子を選択的に分離するように適応される。

さらに、この装置は、基質物質を該親和性捕捉デバイスあるいは光感作性付着分子と会合させた状態で該サンプル提示表面上に置くようにしてもよい。より好ましい実施例では、この基質物質は弱酸性から強酸性のｐＨ範囲にある。最も好ましい実施例においては、この基質物質のｐＨ６．０以上である。加えて、好ましい実施例では、電気絶縁性物質で形成されたサンプル提示表面が用いられる。

本発明のさらに別の実施例では、サンプル提示表面上に分析対象物分子を捕捉し、後で分析を行うために該捕捉した分析対象物分子を該サンプル提示表面から脱着あるいはイオン化するための、該サンプル提示表面を親和性捕捉デバイスあるいは該分析対象物分子と結合するための手段を有する光感作性付着分子で誘導させるステップと、該親和性捕捉デバイスあるいは光感作性付着分子で該誘導されたサンプル提示表面上に該分析対象物分子を捕捉するステップと、該分析対象物分子を、該親和性捕捉手段あるいは光感作性付着分子によって該誘導されたサンプル提示表面に結合したままの状態で、エネルギーあるいは光源に露出させて、該表面から少なくとも該分析対象物の１部を脱着させるステップで構成されている。

本発明のさらに別の実施例は分析のための分析対象物分子を提示するための表面を作成する方法であって、この方法は該分析対象物を支持するための基板（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を提供するステップと、親和性捕捉デバイスあるいは該分析対象物と選択的に結合するための手段を有する光感作性付着分子によって該基板を誘導させるステップと、そして、該親和性捕捉デバイスあるいは光感作性付着分子を結合した分析対象物分子を検出するための手段とで構成されている。好ましい実施例においては、該表面に検出用の物質を付加するステップが提供される。さらに好ましい実施例においては、こうした検出用物質は蛍光種、放射性種、あるいは発光性種である。

別の好ましい実施例においては、該親和性捕捉デバイスあるいは光感作性付着分子と会合した状態で脱着／イオン化支援物質を該サンプル提示表面に沈着させるステップが含まれている。さらに好ましい実施例においては、エネルギー源はレーザーで構成されている。別の好ましい実施例においては、親和性捕捉デバイスが用いられ、該エネルギー源はイオン源である。さらに、好ましい実施例では、該エネルギー源に露出後も該分析対象物分子が該サンプル提示表面に結合したままである。より好ましい実施例においては、少なくとも該誘導されたサンプル提示表面上に結合したままの分析対象物分子の少なくとも１部を化学的、生物学的、あるいは物理的な反応によって修飾された分析対象物分子に転換するステップが含まれており、ここで、該分析対象物分子は該親和性捕捉デバイスあるいは光感作性付着分子によって該誘導されたサンプル提示表面に結合したままであり、そして、さらに該修飾された分析対象物分子をエネルギー源に露出して少なくとも該修飾された分析対象物分子を該表面から脱着するステップが含まれている。

本発明の１つの実施例においては、完全は分析対象物を気相に脱着するサンプルプローブが、サンプル提示表面と、そして、該サンプル提示表面と会合したエネルギー吸収分子を含んでおり、該サンプルプローブは、該サンプルプローブがエネルギー源によって衝撃を与えられた時にエネルギー吸収分子上、あるいはその上方、あるいはその間に沈着された完全な分析対象物分子の脱着を速やかに行わせることを特徴としている。より好ましい実施例では、エネルギー吸収分子が、桂皮酸アミド、桂皮酸ブロマイド、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、およびα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸で構成されるグループから選択される。さらに別の好ましい実施例においては、ガラス、セラミックス、テフロン^TM被覆磁性物質、有機高分子物および天然の生体高分子で構成されるグループから選択される。

別の好ましい実施例においては、元のままの分析対象物の気相への脱着を促進するサンプルプローブが含まれており、このサンプルプローブはサンプル提示表面と、該サンプル提示表面と会合した親和性捕捉デバイスで構成されており、該サンプルプローブがエネルギー源によって衝撃を与えられた時に、該サンプルプローブが元のままの分析対象物分子を気相に速やかに転移させることを特徴としている。好ましい実施例においては、親和性捕捉デバイスは、金属イオン、蛋白質、ペプチド類、免疫グロブリン、核酸、炭水化物、レクチン、染料、還元剤、およびそれらの組み合わせで構成されるグループから選択される。別の好ましい実施例においては、サンプル提示表面はガラス、セラミックス、テフロン^TMで被覆した磁性物質、有機高分子物、および天然の生体高分子で構成されるグループから選択される。

別の実施例は完全な分析対象物を気相に脱着させるサンプルプローブを含んでおり、このサンプルプローブはサンプル提示表面、および、表面会合分子で構成されており、該表面会合分子は少なくとも２つの結合部位を有する光感作性付着分子であり、少なくとも、その１つの部位はサンプル提示表面と結合しており、少なくとも１つの部位は分析対象物を結合させるために用いることができ、さらに、分析対象物結合部位は光感作性である。

別の実施例では、完全な分析対象物の気相への脱着を促進するためのサンプルプローブが設けられており、このサンプルプローブはサンプル提示表面と、親和性捕捉デバイス、エネルギー吸収分子および該サンプル提示表面と会合した光感作性付着分子で構成されるグループから選択される少なくとも２つの異なった分子の混合物か、あるいは該サンプル提示表面と会合した光感作性付着分子のいずれかで構成されており、分析対象物が該サンプルプローブと会合される場合に、該サンプルプローブがエネルギー源によって刺激を与えられた場合に該サンプルプローブが分析対象物の気相への転移を促進することを特徴としており、さらにこのサンプルプローブは該分析対象物分子と会合した親和性捕捉デバイスによって、異なった速度で分析対象物分子の気相への転移を促進する。

好ましい実施例においては、分析対象物は、エネルギー源により刺激の後に上記混合物から選択的に脱着される。別の好ましい実施例においては、その配列が複数の異なった分析対象物を選択的に吸収する。

より好ましい実施例においては、本発明による装置は分析対象物の定量に用いられ、この定量においては、親和性捕捉デバイスの位置と量が吸収された分析対象物の量を判定する。別の好ましい実施例においては、結合は選択的であっても、あるいは非選択的であってもよい。

別の実施例で、完全な分析対象物の気相への脱着を促進するサンプルプローブは、サンプル提示表面と、そして、エネルギー吸収分子と親和性捕捉デバイスの両方の機能を果たすことができる表面会合分子か、あるいは、少なくとも２つの結合分の１を有する光感作性付着分子であって、少なくとも１つの部位がサンプル提示表面と結合しており、そして少なくとも１つの部位が分析対象物を結合させるために利用でき、そしてその分析対象物結合部位が光感作性であることを特徴としている。

本発明の異なった実施例は、質量分析測定における分析対象物分子の質量を測定する方法を含んでおり、この方法は、光感作性付着分子（ＰＡＭ）によってプローブ端面上のサンプル提示表面を誘導するステップで構成されており、該ＰＡＭは少なくとも２つの結合部位を有しており、１つの結合部位はサンプル提示表面と結合し、少なくとも１つの結合部位は分析対象物分子との結合のために利用することができ、さらに、この方法は該誘導されたプローブ端面を該分析対象物分子の供給源の露出させて該分析対象物分子をそこに結合させるステップと、そこに結合した分析対象物分子によってその誘導されたプローブ端を飛行時間質量分析計の一端に入れて、真空にし、そして電場を発生してその分析計内部に加速電位を発生するステップと、１つ、あるいは複数のレーザーパルスで分析計内部の該誘導されたプローブ端面に結合した分析対象物分子の少なくとも１部に刺激を与えて該分析対象物分子のイオンを該プローブ端から脱着するステップと、該質量分析計内部でのそれぞれの飛行時によってそのイオンの質量を検出するステップと、そして、その検出された質量を表示するステップとで構成される。好ましい実施例においては、ＰＡＭと会合させた該プローブ端面に脱着／イオン化支援基質物質を適用するステップも含まれる。より好ましい実施例においては、さらに、該プローブ端を該質量分析計から取り出し、脱着されなかった該分析対象物分子の該部分に化学的、生物学的、あるいは物理的な手順を適用して、脱着されなかった該分析対象物分子の該部分の組成を変えるステップと、該編成された分析対象物分子を載せた該プローブ端を再度挿入するステップと、後で質量分析測定分析を行って該編成された分析対象物分子の分子量を判定するステップとが含まれる。好ましい実施例はまた、該プローブ端の該面に化学的に結合したＰＡＭも含んでおり、ＰＡＭは該分析対象物分子と化学的に結合しており、ＰＡＭと分析対象物分子との間の該結合は光に依存して破壊され、分析対象物分子が放出され、あるいは、該分析対象物分子は生体高分子であり、該ＰＡＭは分化されていない生物学的サンプルから該生体高分子を選択的に分離するのに適応されている。別の好ましい実施例では、該基質物質は弱酸性から強酸性のｐＨ値を有している。さらに好ましい実施例では、該基質物質は６．０以上のｐＨ値を有している。好ましい実施例はまた、電気的絶縁物質で形成された該プローブ端の面を含んでいる。

さらに別の実施例ではレーザー脱着／イオン化、飛行時間質量分析測定による分析対象物分子の質量を測定する方法が提示され、この方法において、光感作性付着分子（ＰＡＭ）がその分析対象物分子の脱着およびイオン化を促進するために該分析対象物分子と組み合わせて用いられており、その改良点は、分析対象物分子をＰＡＭの表面上、あるいはその上方に提示するステップで構成され、該質量分析測定・分析で脱着されなかった分析対象物分子の少なくとも１部は、後で行われる分析手順のために化学的に利用することができる。

本発明の別の実施例は完全な分析対象物の気相への差別的脱着を促進するためのサンプルプローブであり、サンプル提示表面と、そして少なくとも２つの、該サンプル提示表面と会合した光感作性付着分子で構成されており、該サンプルプローブはエネルギー源により刺激を与えられ、該サンプルプローブは該分析対象物分子と会合した光感作性付着分子に依存した異なった速度で分析対象物分子の気相への転移を促進する。好ましい実施例においては、この光感作性付着分子は所定の配列に並べられている。より好ましい実施例においては、これらの配列は複数の異なった分析対象物を選択的に吸収する。

本発明のさらに好ましい実施例においては、完全な分析対象物の気相への転移を促進するサンプルプローブが含まれており、このサンプルプローブはサンプル提示表面と、該サンプル提示表面に会合した光感作性付着分子とで構成されており、サンプルプローブにエネルギー源からの刺激が与えられると、該サンプルプローブは完全な分析対象物分子の気相への転移を促進する。好ましい実施例においては、分析対象物の定量が行なわれ、光感作性付着分子の位置と量とにより、吸着された分析対象物の量の判定が行なわれる。

別の実施例は生体高分子シーケンス決定の方法を示し、この方法は生体高分子分析対象物を、エネルギー吸収分子、親和性捕捉デバイス、光感作性付着分子、およびそれらの組み合わせで構成されるグループから選択される表面選択分子を有するサンプル提示表面を含むプローブ端に結合させるステップと、質量分析測定分析で生体高分子分析対象物を脱着させるステップとを含んでおり、このステップでは該生体高分子の少なくとも一部がプローブ端から脱着されず、さらにこの方法は、まだプローブ端に結合している生体高分子分析対象物を脱着修飾した結果を分析するステップと、そして、生体高分子が得られるまで、その脱着、分析および修飾ステップとを繰り返すステップを含んでいる。好ましい実施例は、蛋白質、ＲＮＡ，ＤＮＡおよび炭水化物で構成されるグループから選択される生体高分子を提示する。

以下の具体例は本発明の具体的な実施例とその材料、方法を示すものであり、本発明を説明するものであって、発明の範囲を限定する意図はない。

本発明の実施例はレーザービームなどの飛行時間質量分析計を用いて、プローブ端の表面から分析対象物を気化させる。このプロセスにおいて、一部の分子はイオン化される。正荷電された分子は短い高電圧場で加速されて、電場のない飛行チューブに入る。この飛行チューブの端部に配置された感度の高い検出装置が、各分子がそれに衝突する度に信号を出す。当業者なら、他のモードの検出やイオン化を用いることができることが分かるであろう。

（実施例１）
水溶性、中性化形態のエネルギー吸収分子基質支援レーザー脱着飛行時間質量分析測定で用いられる先行技術に基づく基質物質は強酸性である。本発見の１つは、完全に水性の溶剤に解かされた中性化エネルギー吸収分子と混合されると、分析対象物が脱着されるということである。ｐＨ６．０以上に適切に中性化することによって、この基質物質はプローブ端表面上に配置された分析対象物分子上で実行される後の化学的、あるいは酵素的反応を基本的には受けられるようにする。分析対象物分子の小部分だけが各脱着／質量分析計測定で用いられるので、プローブ端上のサンプルはその場所で後で行われる化学的または酵素的修飾のために用いることができる。修飾後、このサンプルは質量分析測定によって分析される。同じプローブ端上で分析を行うことによって、分子とその構造を含むその特性についてより正確に判定することができる。

質量分析測定はＱ−切換ネオジミウムイットリウムアルミニウムガーネット（Ｍｄ−ＹＡＧ）パルス化レーザー（３５５ｎｍ，５ｎｓパスル）を用いる修飾ＶｅｓｔｅｃモデルＶＴ２０００、あるいはＭＡＳモデルＳＥＬＤｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈリニアー飛行時間質量分析計で行われる。パルス化レーザー照射によって脱着されたイオンは３０ｋｅＶのエネルギーに加速されて、２メートルの電場のない領域（１０^-8ｔｏｒｒに維持されている）内で遊走させられる。２０ステージ個別ダイノード電子倍増管を用いて検出されるイオン信号は、２００ＭＳ／ｓトランシェントレコーダー（ＬｅＣｒｏｙ ＴＲ８８２８Ｄ，８ビットｙ−軸解像度）あるいは高速信号平均化処理を行うことができるＴｅｋｔｒｏｎｉｘデジタイザ記録される前に高速予備増幅器を用いて１０倍に増幅される。最適イオン信号を達成するために、オッシロスコープ（Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ）でそのプロセスをモニタリングしながら、レーザー照射はリアルタイムで調節される。データ削減（ピーク中心軌跡および時間の質量／電荷への変換）はパソコンによるソフトウエアによって行われる。３３５ｎｍでパルス化レーザーを発生する窒素レーザーを用いるＡＶＧ ＴＯＦ Ｓｐｅｃ質量分析計、あるいは３３５ｎｍでパルス化レーザーを発生する窒素レーザーを用いるニリアＬＤＩ１７００質量分析計を用いることもできる。

（Ｉ．特異分析）
１．シナピン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を２０ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ３．８８）水に懸濁して、トリエチルアミン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてｐＨ６．２〜６．５に中性化する。ヒトヒスチジンを多量に含む糖蛋白質金属結合領域（ＧＨＨＰＨ）₂Ｇ（１２０６Ｄａ），（ＧＨＨＰＨ）₅Ｇ（２９０４Ｄａ）およびヒトエストロゲン受容体２量体化領域（Ｄ４７３−Ｌ５２５）（６１６８．４Ｄａ）を、プローブ端上で２μｌのシナピン酸（２０ｍｇ／ｍｌ水，ｐＨ６．２）に混合して、レーザー脱着飛行時間質量分析測定によって分析した。５つのスペクトル（１スペクトルあたり平均１００レーザーショット）を得た後、プローブを検索して，２μｌの２０ｍＭ Ｃｕ（ＳＯ）₄を加え、質量分析測定でサンプルを再分析した。図１Ａ（上側の図）は、中性化エネルギー吸収分子の存在下で脱着された３つのペプチド類の質量スペクトルを示している。図１Ｂ（下側の図）は、中性エネルギー吸収分子の存在下でのペプチド類の、その場所での金属結合を示している。（ＧＨＨＰＨ）₂Ｇペプチドは少なくとも４つのＣｕ（ＩＩ）を結合させることができ、（ＧＨＨＰＨ）₅Ｇペプチドは、少なくとも５つのＣｕ（ＩＩ）を結合させることができ、２量体化領域は本実験条件の下で少なくとも１つのＣｕ（ＩＩ）を結合させることができる。ｐＨ６．５に中性化されたα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（２０ｍｇ／ｍｌ水）によっても同様の結果が得られる。

２．ヒトβカゼインホスホペプチド（Ｒ１−Ｋ１８＋５Ｐ）（２４８８Ｄａ）の１μｌのアリコットをｐＨ６．５に中性化された桂皮酸（２０ｍｇ／ｍｌ水）の１μｌと混合され、レーザー脱着飛行時間質量分析測定によって分析する。５つのスペクトル（１スペクトルあたり平均１００レーザーショット）を得た後、プローブを除去し、中性化されたシナピン酸と混合された残っているホスホペプチドを、０．５μｌのアルカリ性ホスホターゼ（Ｓｉｇｍａ）によってプローブ端上で直接消化し、２３℃の温度下で５分間培養した。５つのスペクトル（１スペクトルあたり平均１００レーザーショット）を得た後、プローブを取り出し、さらに０．５μｌのアルカリ性ホスホターゼの別のアリコットを追加して残りのホスホペプチド類のさらに消化させ、２３℃の温度で５分間培養した。このサンプルをレーザー脱着質量分析測定で再分析する。図２Ａ（１番上の図）は中性化されたエネルギー吸収分子の存在下で脱着されたホスホペプチドの質量スペクトルを示している。図２Ｂ（上から２番目の図）はホスホペプチドからホスフェート基を取り除くためのその場所でのアルカリ性ホスホターゼの５分間の消化を示している。０Ｐ，１Ｐおよび３Ｐピークは、上記ホスホペプチドからそれぞれ５つ、４つ、そして２つのホスフェート基を取り除いた後の生成物を示している。図２Ｃ（上から３番目の図）は、その場所でさらにアルカリ性ホスホターゼでさらに消化を行うと、ホスホペプチドからすべてのホスフェートが完全に除去されることを示している。対照的に、図２Ｄ（１番下の図）は、予備的な中性化（例えば、ｐＨ３．８８で桂皮酸、あるいはｐＨ２．０７でジヒドロキシ安息香酸）を行わずにエネルギー吸収分子の存在下でアルカリ性ホスホターゼ（０．５μｌ）の消化が行われた対象の実験では、２３℃、１０分間では非常に限定的な消化しか行われなかった。

３．（ＧＨＨＰＨ）₅Ｇペプチド（２９０４Ｄａ）の１μｌアリコットをｐＨ６．２に中性化されたシナピン酸（２０ｍｇ／ｍｌ水）、２μｌと混合し、レーザー脱着飛行時間質量分析測定によって分析された。５つのスペクトル（１スペクトルあたり平均１００レーザーショット）を得た後、中性化されたシナピン酸と混合された残りのペプチド類を１μｌのカルボキシペプチダーゼＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）でプローブ端上で直接消化し、２３℃の温度下で３０分間培養した。このサンプルを質量分析測定で分析した。図３は中性化されたエネルギー吸収分子の存在下でカルボキシペプチダーゼＰによるその場所での消化の前（下側の図）および後（上側の図）の複合質量スペクトルを示している。質量の減少は、ペプチドのＣ端末からのＧｌｙ残基の除去を示している。

これら３つの実施例は水溶液内での中性化エネルギー吸収分子が、大幅なモル過剰で付加された場合でさえ、分析対象物の構造と機能を保持する上でより生化学的に互換性が高い（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）であることを示している。その存在は、残っている分析対象物上での化学的、あるいは酵素的反応に対して何も干渉しない。

（実施例２）非金属プローブ素子（サンプル提示表面）
　本発明のプロセスで用いられているプローブ素子（プローブ端、あるいはサンプル提示表面）は、先行技術の手順に関連して述べたように必ずしも金属、あるいは金属被覆したものでなくてもよい。サンプル提示表面は、多孔性あるいは非多孔性物質を含む種々の物質で構成され、多孔性物質はスポンジ状、ポリマー性、高表面積を有しており、分析対象物の吸着および提示に最適である。

ポリプロピレン、あるいはポリスチレン、あるいはポリエチレン、あるいはポリカーボネートを火炎中で溶かして、２ｍｍ直径ステンレススチールプローブ素子上に薄膜上に沈着させて、それを完全に覆うようにする。固体ガラス棒あるいは固体ナイロンフィラメント（最大１．５ｍｍ径）あるいはポリアクリスアミドを１ｃｍ細片に分割し、ステンレススチールプローブサポート内に挿入される。磁性撹拌棒（１．５×８ｍｍ、テフロン^TM被覆したもの）をステンレススチールプローブ端サポート内に挿入する。（ＧＨＨＰＨ）₂Ｇおよびヒト／エストロゲン受容体２量体領域を含んだペプチド混合物１μｌのアリコットを、２μｌのジヒドロキシ安息香酸（３０％メタノール、０．１％トリフルオロ酢酸に溶かしたもの）とこうしたプローブ素子のそれぞれの上で混合して、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析した。図４は、絶縁性、生化学的に互換性のある表面から脱着されることを示している。

これらの表面は化学結合（共有結合あるいは非共有結合）によって誘導されると、親和性吸着剤（親和性捕捉デバイス）、エネルギー吸収分子（結合『基質』分子）あるいは光感作性付着分子を結合させることができる。サンプル提示表面の形状はいろいろで（例えば、サイズ、構造、柔軟性、厚みなど）、実験（アッセイ）のニーズ（所定のサイズのスペースを通じての生きている生物への挿入）に合わせることができる。

（実施例３）親和性指向レーザー脱着（表面強化親和性捕捉、ＳＥＡＣ）
　この実施例では、（１）１つ、あるいは複数の分析対象物の捕捉（吸着）、（２）これら捕捉された分析対象物の作成（例えば、塩などの汚染物質を除去するための、水や他の緩衝あるいは非緩衝溶液による洗浄、および極性有機溶媒、洗剤−溶剤、希釈酸、希釈塩基あるいは尿素などによる正常サイクルの反復）、そして（３）より重要なことであるが、これら捕捉され、調製された分析対象物を後で行う分析対象物脱着のためにプローブ表面に直接移行させるために設計された既存、および新しい固体相親和性剤の使用について述べる。親和性捕捉デバイスは電気絶縁性素材（多孔性および非多孔性）、柔軟なあるいは固くない素材、光学的に透明な物質（例えば、種々の密度、厚み、色およびいろいろな反射率を有するガラスなど）、および、より反応性の低い素材（例えば、アガロース、デキストラン、セルロース、スターチ、ペプチド、および蛋白質や核酸の断片など）の上で不動態化される。質量分析のためのサンプルの選択的脱着／提示のための好ましいプローブ端、あるいはサンプル面は（１）特定の生体高分子あるいは他の非生物学的親和剤の共有結合による付着に適した合成ポリマー（例えば、架橋デキストランあるいはアガロース、ナイロン、ポリエチレン、ポリスチレン）で被覆したステンレススチール、（２）ガラス、セラミックス、および／または（３）プラスチック（合成ポリマー）などである。これらプローブ表面への親和剤の選択的不動態化に関与する化学構造には、知られているような種類の、共有結合による、または共有結合によらない不動態化のための酸素依存、炭素依存、硫黄依存、および／または窒素依存手段を含んでいる。

（Ｉ．親和性捕捉デバイスとしての表面不動態化金属イオン）
１．多孔性アガロース・ビーズ（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔ Ｆｌｏｗ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ、配位子密度２２〜３０μモル／ｍｌゲル）あるいは固体シリカゲルビーズ（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＴＳＫ−ＳＷ，Ｔｏｙｏ Ｓｏｄａ，日本、配位子密度１５〜２０μモル／ｍｌゲル）のいずれかに対し共有結合で結合したイミノジアセテート（ＩＤＡ）基によって、Ｃｕ（ＩＩ）をキレート化する。ニューロテンシン（１６５５Ｄａ）、スペルム活性化ペプチド（９３３Ｄａ）、およびアンギオテンシンＩ（１２９６．５Ｄａ）を含んだ合成ペプチドの混合物を、ｐＨ７．０のＴＳＫ−ＳＷ ＩＤＡ−Ｃｕ（ＩＩ）（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム）５０μｌを用いて、２３℃の温度下で１０分間、混合した。このゲルを遠心分離によって残っているペプチド溶液から分離し、次に、２００μｌリン酸ナトリウム、塩化ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で３度洗浄して、非特異的に結合したペプチド類を取り除く。最後に、このゲルを５０μｌの水に懸濁させる。２μｌのゲル懸濁液と非吸収ペプチド溶液のアリコットをステンレススチールプローブ端上で１μｌのシナピン酸（メタノールに溶解したもの）と混合させて、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。プローブ端のいろいろの場所で５つのスペクトルを得た後（１スペクトルあたり平均１００レーザーショット）、メタノールでシナピン酸を取り除く。２μｌの２０ｍＭ ＣｕＳＯ₄のアリコットを付加し、その後、１μｌのシナピン酸と混合して、レーザー脱着飛行時間質量分析測定によって再分析する。プローブ端のいろいろの場所で別の５つのスペクトルを得た後（１スペクトルあたり平均１００レーザーショット）、メタノールで除去する。ＩＤＡ−Ｃｕ（ＩＩ）ゲルビーズに吸着された残りのペプチドを、ｐＨ８．０の０．１Ｍ重炭酸ナトリウム内で、トリプシン（シグマ）１μｌで、モイスト・チェンバー内で２３℃の温度下で１０分間消化させる。このゲル・ビーズを水で洗浄して酵素と塩を除去した後、１μｌのシナピン酸を加えて、そのサンプルをレーザー脱着飛行時間質量分析測定で再分析する。図５Ａは、ＩＤＡ−Ｃｕ（ＩＩ）によって吸収されなかった残りのペプチド溶液内のスペルム活性化因子（９３３Ｄａ）およびニューロテンシン（１６５５Ｄａ）の分子イオン（および多重Ｎａ−アダクト）を示している。アンギオテンシンＩ（１２９６．５Ｄａ）に対応する有意のピークは存在しない。図５Ｂの質量スペクトルはＩＤＡ−Ｃｕ（ＩＩ）ゲルにかなり選択的に吸収されたアンギオテンシンＩ＋Ｎａ−アダクトピークを示している。ＩＤＡ−Ｃｕ（ＩＩ）ゲルをさらに５００μｌの水で２度洗浄した場合に得られる質量スペクトルは、ペアレントアンギオテンシンだけを示し、他のアダクトピーク（図５および６図Ｃ）は示されなかった。図６Ｄは、アンギオテンシンペプチドによるその場所での銅結合を示している。図６Ｅは、その配列のシングルＡｒｇ２位置でのアンギオテンシンのその場所でのトリプシン消化を示す。

　この実施例は、ａ）表面が不動態化された金属イオン上に親和性吸着された分析対象物レーザー脱着が良好に行われること、ｂ）一度結合すると、分析対象物の非常に明確な質量スペクトルを得ることができるようにサンプル内の含むすべての汚染化合物を除去するために、種々の溶剤で洗浄することができ、ｃ）この親和性捕捉デバイスが明確に定義された分析対象物だけを選択すること（本例では、ＩＤＡ−Ｃｕ（ＩＩ）によってペプチド混合物からアンギオテンシンが選択的に吸収される。このペプチドは自由なＮ−端末と２つのヒスチジンアミノ酸残基をその配列に有しており、両方の性質とも強力なＣｕ（ＩＩ）−結合にとって必要であるのに対して、スペルム活性化因子とニューロテンシンの両方ともＮ−端末は塞がれており、その配列内にヒスチジンアミノ酸残基を有していない）、ｄ）吸着された分析対象物上で、その場所での化学的、あるいは酵素による配列修飾を通じて構造および機能回析を行うことができ、しかも反応、洗浄の各ステップでサンプルのロスが非常に少ないこと、そしてｅ）表面が結合した基質（例えば、アンギオテンシンＩ）を有するプローブ素子を用いて、その場所で（例えば、人体の胃腸内部で）特殊な酵素活性（例えば、トリプシン）をモニターすることができる、ことを示している。

２．ウマ心臓のミオグロビン（３２５ｐモル、１６，９５２Ｄａ）の溶液を、ｐＨ７．０（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム）でＴＳＫ−ＳＷ ＩＤＡ−Ｃｕ（ＩＩ）の５０μｌと２３℃の温度下で１０分間混合する。このゲルを遠心分離で溶液から分離し、５００μｌの緩衝液で２回、さらに、５００μｌの水で２回洗浄する。これらすべての溶液中に残っているミオグロビンを分析光度計で測定することにより、ゲルに吸収された量を計算することができる。このゲルを５０μｌの水に懸濁させて、その後、水で希釈する。希釈されたゲル５０μｌのアリコットを（３０％メタノール、０．１％トリフルオロ酢酸）と混合し、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。図７はミオグロビンの検出可能な信号（平均５０レーザーショットを与えた後の信号／ノイズ比＝６）が得られ、プローブ端上に沈着したミオグロビンの量が４〜８ｆモルと計算されることを示している。

この実施例は、表面上に親和性吸着された分析対象物が一層簡単に転移され、容器や転移装置の表面への非特異的な吸着によるロスがないことを示している。吸着された分析対象物を、レーザー脱着／イオン化、飛行時間質量分析測定によって効率的に検出するために必要な明確に定義された表面密度あるいは局所的濃度で、低（アット乃至フェムトモル）量でサンプル提示表面の予め決められた領域（レーザースポットサイズより小さい）上で配列決定される。

３．ヒトβカゼインペプチド（Ｅ２−Ｋ１８）をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社のモデル４３０Ａペプチドシンセサイザー上で、ＮＭＰ−ＨＯＢｔプロトコルを用いて合成する。ホスホリル化されるべきＳｅｒ残基を側鎖保護基のないペプチド鎖に結合させる。保護されないＳｅｒを、先ず、ｄｉ−ｔ−ブチル−Ｎ，Ｎ，−ジイソプロピル−ホスホルアミダイトを用いてホスホル化する。次に、このリン酸エステルをｔ−ブチルペロキサイドで酸化し、水洗し、レシンから分割する。９５％トリフルオロ酢酸ですべての側鎖保護基を除去する。未精製ホスホペプチドをメチルｔ−ブチルエーテルで抽出して、乾燥する。この合成ホスホペプチドの未精製調製物を５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．５の０．１５Ｍ塩化ナトリウムに溶解し、多孔性セファロース（Ｙｉｐ，Ｔ−ＴおよびＨｕｔｃｈｅｎｓ，Ｔ．Ｗ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：３５５−３６２（１９９１）に従って合成されたもの）上で不動態化されたトリス（カルボキシメチル）−エチレンジアミン（ＴＥＤ）−Ｆｅ（ＩＩＩ）５０μｌ、配位子密度６５μモル／ｍｌ、と２３℃の温度下で１５分間混合する。このゲルを同じ緩衝液で３回洗浄し、その後、５００μｌの水で１回洗浄した。ゲル１μｌのアリコットをプローブ端上で１μｌのシナピン酸（３０％メタノール、０．１％トリフルオロ酢酸）と混合して、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。プローブ端のいろいろなスポトで５つのスペクト（１スペクトルあたリ平均１００レーザーショット）を得た後、メタノールでシナピン酸を取リ除き、ＴＥＤ−Ｆｅ（ＩＩＩ）上に吸着された残りのホスホペプチドを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０内で、モイストチェンバー内で２３℃の温度下で１０分間、１μｌのアルカリ性ホスファターゼ（硫化アルミニウム懸濁液、Ｓｉｇｍａ）を用いて、プローブ端上で直接消化する。このゲルを水で洗浄して酵素および塩を除去する。シナピン酸を加えて、サンプルをレーザー脱着質量分析測定で分析する。図８（１番上の図）はいろいろなホスホリレート化形態を有するカセインペプチド（１９３４Ｄａ）の分布を示す。その場所でのアルカリ性ホスファターゼ消化を行った後、最初の非ホスホリレート化された形態だけが残っている（下側の図）。

この実施例は、予め清浄化せずに、未精製の混合物内でのホスホペプチド合成のクイックモニターとしてのＳＥＡＣの応用の可能性を示している。その場所でのアルカリホスファターゼ消化によって、ホスホペプチドの確認を簡単に確認することができる。

４．プレタームインファント調製液（ｐｒｅｔｅｒｍ ｉｎｆａｎｔ ｆｏｒｍｕｌａ）（ＳＩＭＩＬＡＣ，Ｍｅａｄｅ Ｊｏｈｎｓｏｎ）１００μｌのアリコットとこの調製液を与えた後、９０分間呼吸させたプレタームインファントの消化内容物を、０．１Ｍ ＭＥＳ，０．１５Ｍ塩化ナトリウム内で５０μｌのＴＥＤ−Ｆｅ（ＩＩＩ）セファロース５０μｌと混合する。このゲルを５００μｌの同じ緩衝液で３回洗浄し、その後、５００μｌの水で１回洗浄する。１μｌのゲル懸濁液、プレタームインファント調製液、あるいは胃吸引物（ｇａｓｔｒｉｃ ａｓｐｉｒａｔｅ）をプローブ端上で２μｌのシナピン酸（５０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸に溶解したもの）と混合して、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。図９は、胃吸引物全体の質量スペクトル（上から２番目の図）がインファント調製液（１番下の図）とまったくよく似ており、１，０００〜１５，０００Ｄａ領域の分子量を持っていることを示している。しかしながら、これら２つのサンプルからＴＥＤ−Ｆｅ（ＩＩＩ）によって選択的に吸着された分析対象物の質量スペクトルはまったく違ったものであり、調製液（下から２番目の図）より胃吸引物（１番上の図）の方により多く低分子量ホスホペプチド（ＴＥＤ−Ｆｅ（ＩＩＩ）により結合したもの）が存在しているが、これは調製液内に存在するホスフォプロテインが胃吸引物を消化するからである。この実例は、ＳＥＡＣが生物学的なサンプル内部の特定の分析対象物の分析に特に有用であることを示している。複合サンプル内に他の汚染物質が存在している場合、ホスフォペプチド類を検出するのはより困難であるが、これはそれらが正イオンモード内でイオン化される程度が低いからである。しかしながら、ホスフォペプチドが選択的に吸着され、サンプル中の他のすべての成分が取り除かれると、そうした信号抑制は観察されない。

５．ヒトおよび仔ウシのヒスチジンを多量に含んだ糖蛋白質２００μｌのアリコットをｐＨ７．０でＩＤＡ−Ｃｕ（ＩＩ）セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム）５０μｌと２３℃の温度下で１０分間混合した。このゲルを５００μｌの緩衝液で２回洗浄し、さらに５００μｌの水で１回洗浄する。ゲル１μｌのアリコットを２μｌのシナピン酸（３０％メタノール、０．１％トリフルオロ酢酸に溶解したもの）と混合し、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。プローブ端上のいろいろな揚所で５つのスペクトルを得た後（１スペクトルあたり平均１００レーザーショット）、メタノール酸で洗浄して、シナピン酸を取り除く。ＩＤＡ−Ｃｕ（ＩＩ）ゲル上に吸着された残リの糖蛋白質を２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩酸ナトリウム、３Ｍ尿素内で，ｐＨ７．０、３７℃の温度下で、モイスト・チェンバー内で１夜消化する。水で洗浄して酵素と塩を取り除いた後、２μｌのシナピン酸を加えて、サンプルを質量分析測定で分析する。５つのスペクトル（１スペクトルあたり平均１００レーザーショット）を得た後、シナピン酸をメタノールで取り除いた。０．１Ｍ重炭酸ナトリウム内に２μｌのトリプシンを溶解したアリコットを加えて、モイストチェンバー内で３７℃の温度下、３０分間培養した。水洗して酵素と塩を取り除いた後、シナピン酸を加えて、質量分析測定でサンプルを分析した。プローブ端のいろいろな場所で５つのスペクトル（１スペクトルあたり平均１００レーザーショット）を得た後、メタノールでシナピン酸を除去する。２０ｍＭ ＣｕＳＯ₄ ２μｌのアリコットを加える。その後、２μｌのシナピン酸を加え、その後、質量分析測定で分析した。プローブ端のいろいろな場所で５つのスペクトル（１スペクトルあたリ平均１００レーザーショット）を得た後、メタノールでシナピン酸を取り除く。５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，ｐＨ６．５に溶解した２μｌのジエシルピロカルボネート（Ｓｉｇｍａ）のアリコットを加え、２３℃の温度下、３０分間培養した。水洗して化学物質と緩衝塩類を除去した後、２μｌのシナピン酸を加えて、サンプルを質量分析測定で分析する。ジエチルピロカルボネートでヒスチジン残基を修飾する代わりに、金属結合ペプチドの部分配列を得るためには、表面上に吸着されたトリプティックダイジェスト（ｔｒｙｐｔｉｃｄｉｇｅｓｔ）に１ｕｌのカルボキシペプチダーゼＹ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加えて、モイストチェンバー内で室温で５分間培養する。水で酵素と塩を洗い流した後、１ｕｌのシナピン酸を加えて、質量分析測定で分析する。図１０ＡはＮ−グリカナーゼ消化の前と後のＩＤＡ−Ｃｕ（ＩＩ）セファロース上に吸着されたヒトおよび仔ウシのヒスチジンを多量に含む糖蛋白質の複合質量スペクトルを示している。質量変移はそれぞれの糖蛋白質から炭水化物が除去されることを示している。図１０Ｂは２つの種の脱グリコシレート化された蛋白質からのトリプシンで消化されたペプチド類の複合質量スペクトル（上の図はヒト蛋白質、下から図は仔ウシ蛋白質）と、これら２つの種のトリプシン消化ペプチドのその場所でのＣｕ（ＩＩ）結合（上から２番目の図はヒト蛋白質、１番下の図は仔ウシ蛋白質：１，２の数字は結合した銅の数を示す）を示している。図１０Ｃは、そうした１つのＣｕ（ＩＩ）結合ペプチド（１番下の図）が少なくとも４つのＨｉｓ残基を有しており、それらがジエチルピロカルボネートで修飾された、４Ｎ−カルベトキシ−ヒスチジルアダクト（１〜４、１番上の図）を形成していることを示している。図１０Ｄは仔ウシのヒスチジンを多量に含む糖蛋白質内の主要Ｃｕ結合ペプチドの部分的Ｃ−端末配列を示している。この例は、異なった種からの金属結合領域の構造と機能を解明するためにＳＥＡＣの使用が有効であることを示している。

（ＩＩ．親和性捕捉デバイスなどの表面不動態化抗体）
１．ポリクローナルウサギ抗−ヒトラクトフェリン抗体はＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）によって精製されたヒトラクトフェリンによってつくりだされるものである。この抗体は、チオフィリック吸着および不動態化ラクトフェリンカラムによって親和性純化さる。磁性ビーズに共有結合で付着されたヒツジ抗ウサギＩｇＧを、Ｎｏｒｗａｙ，Ｏｓｌｏ，ＤｙｎａｌＡＳから入手した（均一２．８μｍ超磁性体ポリスチレンビーズ、１ｍｇビーズあたり配位子密度１０μｇヒツジＩｇＧ）。ヒトラクトフェリン（１ｎモル、⁵⁹Ｆｅでラベル、８１，１００Ｄａ）を２０ｍＭリン酸ナトリム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０で、３７℃の温度下、３０分間、ウサギ抗−ヒトラクトフェリンで培養する。その後、ダイナビーズ（６−７×１０⁸ビーズ／ｍｌ）に載せた４０μｌのヒツジ抗ウサギＩｇＧを加えて、３７℃の温度で３０分間培養する。このビーズを５００μｌのリン酸ナトリウム緩衝液で３回洗浄し、さらに５００μｌの水で２回洗浄する。この複合体に結合したヒトラクトフェリンの最終的な量は４ｐモルと判定されるビーズのほぼ１０分の１がテフロン^TMで被覆した磁性プローブ端に転移され、２μｌのシナピン酸（３０％メタノール、０．１％トリフルオロ酢酸に溶解したもの）と混合され、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析される。図１１は抗原−１次抗体−２次抗体複合体（上側の図）内にラクトフェリン（８１，１４３Ｄａ）が存在していることを示しており、一方、この１次抗体−２次抗体コントロール（下側の図）はウサギ抗体信号（単独荷電で１４９，０００Ｄａ、２重荷電で７４，５００Ｄａ）のみを示している。この実施例はａ）表面不動態化抗体上に親和性吸着された分折対象物でレーザー脱着が良好に脱着されること（１次抗体−分析対象物複合体の混合物内で分析対象物信号が不明瞭にしか確認されない場合は、本方法においては、分析対象物を確認するために、表面を不動態化した２次抗体、蛋白質Ａ、蛋白質Ｇ、ストレプタビジンなどの、１次抗体のいずれかの捕捉デバイスが用いられる）；ｂ）分析対象物の１つがその捕捉の主要対象物との会合を通じて検出される特異性蛋白質識別現象を通じての蛋白質発見の原理；そしてｃ）効率的な捕捉デバイスとしての磁性表面の使用を示している。

２．親和性純化されたウサギ抗−ヒトラクトフェリンをグルタルアルデヒドを介して活性化されたナイロンプローブ素子（２ｍｍ径）の先端に共有結合を利用して結合させる。これを３５０ｆモルのヒト・ラクトフェリンを含む１ｍｌのプレタームインファントウリン（胎仔の尿），ｐＨ７．０に浸して、４〜８℃の温度下で１５時間撹拌する。ナイロンプローブ端を取り出して、ｌｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、３Ｍの尿素，ｐＨ７．０で３回洗浄し、さらに１ｍ１の水で２回洗浄する。シナピン酸２μｌのアリコット（３０％メタノール、０．１％トリフルオロ酢酸）を加えて、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。図１２はヒトラクトフェリン分子イオン（信号・ノイズ比＝２．５、平均２５レーザーショット）を質量スペクトルで示したものである。図１３はｌｎモル／ｍｌのラクトフェリンを含んでいるプレタームインファントウリン全体の等価質量スペクトルを示すもので、尿サンプル内に他の成分が存在している場合に引き起こされる信号抑制が非常に大きいので、図１２に関して述べたように３５０ｆモル／ｍｌのラクトフェリンに数千倍の比率で付加しても、検出されない程である。この実施例は、柔軟なプローブ素子の平たい表面（２次元構成）上でのＳＥＡＣデバイスの使用を示している。このＳＥＡＣデバイスは血液、涙、尿、唾液、胃腸液、脊椎液、羊水、骨髄液、バクテリア、ウイルス、培養中の細胞、生体標本組織、植物の組織あるいは液体、昆虫の組織や液体などの未分化の生物学的なサンプルから目的の分析対象物を分離するのに用いることができる。この特異性のある親和性吸着ステップは複雑なサンプル内での他の成分による汚染から分析対象物を隔離することを可能にし、特に、分析対象物の濃度が非常に低い場合（フェムトモル／ｍｌ）に信号抑制効果を克服する。

３．ＳＥＡＣを用いた技術による検出感度のさらなる改善を分析対象物に結合した標識物質の増幅によって達成される。これを行う１つの方法は、酵素触媒とストレプタビジン−ビオチンシステムとの組み合わせによって行うことができる。実施例３．ＩＩ．２．で述べたナイロンプローブ素子上で微量のラクトフェリンを捕捉した後、ビオチニル化した抗ラクトフェリン抗体、あるいはビオチニル化した単一鎖ＤＮＡを用いて、ラクトフェリンに特異的に結合させる。次にストレプタビジンを加えて、ビオチニル化した標識物質に特異的に結合させる。最後にビオチニル化したアルカリ性ホスファターゼを加えて、ストレプタビジンに特異的に結合させる。こうしたビオチニル化したアルカリ性ホスファターゼのいくつかが１つのストレプタビジンに結合することができるので、１次レベルでの増幅が行われる。第２のレベルの増幅は酵素触媒によってもたらされ、この場合酵素は１分あたリ１０²から１０³分^-1のターンオーバー数を達成することができる。アルカリ性ホスファターゼ酵素活性のアッセイは、ＡＴＰ，ＮＡＤＰＨ、あるいはホスフォペプチドなどの低分子量ホスフォリル化基質を用いることによって、簡単に行うことができる。低分子量分析対象物の重量変移を検出する効率は、８０ｋＤａ糖蛋白質の場合よりずっと高い。

４．現段階での検出における最大の改善は、プロメラーゼ鎖反応原理に基づく増幅によって達成される。実施例３．ＩＩ．２．で述べたようにナイロンプローブ素子上に微量のラクトフェリンを捕捉した後、ビオチン化した抗ラクトフェリン抗体あるいはビオチン化した単一鎖ＤＮＡを用いてラクトフェリンに特異的に結合させる。次に、ストレプトアビジンを付加してビオチニル化した標識物質に特異的に結合させる。最後に一片のビオチン化した線状ＤＮＡを付加して、ステレプトアビジンに特異的に結合させる。この結合ＤＮＡ標識物質が３０サイクルポリメラーゼ鎖反応手順で増幅される。各サイクルは９４℃での１分間の変性ステップと、１分間の、７２℃での１次拡張反応とによって構成されている。この手順は１０⁸程度の範囲の増幅倍率をもたらす。この増幅されたＤＮＡを、３−ＯＨピコリン酸を基質として用いて、レーザー脱着質量分析測定で直接検出する。
　５．ポリクローナルウサギ抗−仔ウシヒスチジン含有抗体を、Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）による精製仔ウシヒスチジン含有糖蛋白質に対して作成する。この抗体をチオフェン吸着および不動態化された仔ウシヒスチジン含有糖蛋白質カラムで親和性純化する。この精製された抗体をメーカーの指示に従ってＡｆｆｉＧｅｌ１０（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ、配位子密度１５μモル／ｍｌゲル）上で不動態化する。仔ウシの初乳２００μｌのアリコットを２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、２００μｌで希釈して、５０μｌの不動態化抗体に入れ、２３℃の温度で３０分間撹拌する。このゲルを５００μｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、３Ｍの尿素、ｐＨ７．０で３回洗浄し、次に５００μｌの水で二回洗浄する。洗浄されたゲル１μｌのアリコットを２μｌのシナピン酸（３０％メタノール、０．１％トリフルオロ酢酸に溶解したもの）とプローブ端上で混合して、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。図１４は、精製された仔ウシのヒスチジンを多量に含む糖蛋白質の質量スペクトル（下側の図）と、仔ウシ初乳から得た蛋白質の親和性（下側の図）を示している。この結果は、完全な、ヒスチジンを多量に含む糖蛋白質と、仔ウシ初乳内の主要な原始的断片の存在を示している。この実施例は、少量の生物液内での新しい蛋白質の検出および特徴付けにおける手軽で単純な手法としてＳＥＡＣを用いた場合の有効性を示している。この結果はポリアクリルアミドゲル電気泳動の非常に手間のかかる免疫ブロッティングで得られるた初期の知見を裏づけるものである。
６．ＳＥＡＣ手法を用いることによって、抗体の完全なマッピングを簡単に行うことができる。抗ヒト・卵胞刺激ホルモンの３つの供給源（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣａからのべータＦＳＨに対して特異性を発揮するポリクローナル、Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮからのべータ３エピトープに特異性を示すモノクローナル、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ，ＭＥからのモノクローナル）をメーターの指示に従ってＡｆｆｉＧｅｌ １０上で不動態化した。これらの不動態化した抗体のすべてについて、卵巣刺激ホルモンの２つの異なった製剤（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社からの半精製製剤、およびＡｃｃｕｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏｒｐ．からの粗精製製剤）で培養することによって、卵巣刺激ホルモンと特異的に結合するかどうかをテストし、その後、シナピン酸の存在下で質量分析測定によって分析する。次に、ヒトＦＳＨ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）の半精製製剤をトリプシンで消化して、個別のアリコット（７ｕｌ）をホスフェート緩衝食塩水中で、これらの不動態化された抗体（１０ｕｌ １：１ゲル懸濁液）と、４℃の温度下で、２時間反応させる。

リン酸緩衝食塩水および水で洗浄した後、吸着された蛋白質を、シナピン酸の存在下でレーザー脱着質量分析測定で分析する。図１５は異なった抗体によって認識された卵巣刺激ホルモンのペプチドの複合質量スペクトルを示す。これら２つのモノクローナル抗体は異なったエピトープを明瞭に識別するのに対して、ポリクローナルは両方のモノクローナルによって識別されたものに共通のエピトープだけを識別する。

（ＩＩＩ．親和性捕捉デバイスとしての表面不動態化核酸）
１．４％アガロースビーズ上で不動態化された単一鎖ＤＮＡをＧＩＢＣＣＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ配位子密度０．５〜１．０ｍｇ ＤＮＡ／ｍｌゲル）から入手する。¹²⁵Ｉ−ヒトラクトフェリン（４９ｎモルに相当）のアリコットを１００μｌの不動態化単一鎖ＤＮＡと２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０内で、室温下、１０分間混合する。このゲルを５００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液で五回洗浄し、その後等量の水に懸濁させる。ビーズ１個あたりに結合するラクトフェリンの量は、放射活性の判定、および単位体積あたりのビーズの数を数えることによって６２ｆモルと推定される。０．５ｍｍ直径のプローブ端上にいろいろの数のビーズ（１〜１２）を置いて、０．２μｌのシナピン酸（３０％メタノール、０．１％トリフルオロ酢酸に溶解したもの）と混合し、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。図１６は、単一鎖ＤＮＡアガロースのひとつのビーズに親和性吸着されたラクトフェリンの質量スペクトルを示している。これは、そのひとつのビーズから得られた全部で５つのスペクトル（１スペクトルあたり平均１００レーザーショット）の代表的なスペクトルである。

この実施例は、表面を不動態化された核酸などの生体高分子に親和性吸着された分析対象物上で、レーザー脱着が良好に行われることを示している。ヒトラクトフェリンとＤＮＡとの間の相互作用の特異性は、すでに文献で紹介され、微量のラクトフェリンをプレタームインファントウリン（ｐｒｅｔｅｒｍ ｉｎｆａｎｔ ｕｒｉｎｅ）から捕捉する目的で広く用いられている。このケースでは、ラクトフェリン親和性捕捉デバイスを伝達する効率と、レーザー脱着の感度をうまく組み合わせることによって、質量分析測定の検出感度が大幅に向上することを示している。

２．３０ｐモルの⁵⁹Ｆｅ−ヒトラクトフェリンを含んでいる出産前胎仔の尿の１ｍｌのアリコットを０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中で、２０μｌの単一鎖ＤＡＮアガロースと２３℃の温度下、１５分間混合した。このゲルを５００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液で２回洗浄し、その後、５００μｌの水で２回洗浄する。このゲルを等量の水に懸濁させ、この懸濁液１μｌ（放射活性で判定して吸着ラクトフェリンは３５０ｆモル以上含んでいない）を１μｌのシナピン酸（３０％メタノール，０．１％トリフルオロ酢酸に溶解したもの）とプローブ端上で混合して、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。図１７は、親和性捕捉デバイスとしての表面不動態化ＤＮＡで尿から抽出したラクトフェリンの質量スペクトルを示している。

この例は、ＤＮＡ捕捉デバイスでの、生物液内の微量の高分子量分析対象物の検出における効率と感度を示している。

（ＩＶ．親和性捕捉デバイスとしての表面不動態化したいろいろの生体高分子）
１．大豆トリプシン抑制因子（Ｓｉｇｍａ）をＡｆｆｉＧｅｌ １０（ＢｉｏＲａｄ）上でメーカーの指示にしたがって不動態化させる。１００μｌのヒト十二指腸吸引物アリコットを５０μｌのｐＨ７．０の表面不動態化大豆トリプシン抑制因子（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム）５０μｌと２３℃の温度下で１５分間混合する。次にこのゲルを５００μｌのリン酸緩衝液で３回洗浄し、さらに５００μｌの水で２回洗浄する。ゲル懸濁液あるいは最初の十二指腸吸引物１μｌのアリコットを２μｌのシナピン酸（５０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸に溶解したもの）と混合し、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。図１８Ａは総十二指腸吸引物の複合質量スペクトル（下側の図）と表面不動態化大豆トリプシン抑制因子に吸着された蛋白質の質量スペクトル（下側）とを示している。親和性捕捉されたサンプルの主要なピークはトリプシンを示している。同様の結果はａ）グルタルアルデヒドを介して大豆トリプシン抑制因子に結合されたナイロンプローブ素子の先端か、ｂ）グルタルアルデヒドかジビニルスルフォンを介して大豆トリプシン抑制因子に結合したポリアクリルアミドによって被覆されたアクリルプローブの先端に置かれたわずか１μｌの十二指腸液でも得ることができる（図１８Ｂ）。

これらの結果は、ａ）生物液内での特定の分析対象物の検出および特徴付けにおける非不明瞭性と，ｂ）その場所での、診断の目的で柔軟性のある（例えばナイロン）プローブ素子をエンドスコープを通じて直接人体に挿入することができること、を示している。

２．ダイナビーズ（均一で、２．８μｍ、超磁性、ポリスチレンビーズ）をＤｙｎａ１，ＡＳ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙから入手する。１５０μｌのヒト血漿あるいは１８ｐモルのビオチニル化インシュリン（Ｓｉｇｍａ）を含む尿のアリコットをｐＨ７．０のストレプタビジンダイナビーズの２０μｌ懸濁液（２０ｍＭリン酸ナトリウム，０．５Ｍ塩化ナトリウム）と、２３℃の温度下で１０分間混合した。このビーズを３Ｍ尿を含む５００μｌの緩衝液で３回洗浄した後、５００μｌの水で１回洗浄する。ビーズ懸濁液０．５μｌのアリコットを２μｌのシナピン酸（３０％メタノール、０．１％トリフルオロ酢酸と混合し、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。図１９Ａは尿から親和性吸着されたビオチニル化インシュリンの質量スペクトルを示している。複数のピークはひとつから３つのビオチン基で惹起されたインシュリンを示している。図１９Ｂは血漿から親和性吸着されたビオチニル化されたインシリンの質量スペクトルを示している。

この実施例は、ビオチン−ストレプタビジン結合を介して親和性吸着された分析対象物上でレーザー脱着が行われることを示している。ビオチンとアビジン（Ｋａ＝１０¹⁵Ｍ^-1）との強固な結合から、このシステムは、その場所で化学あるいは酵素による修飾が行われるプローブ表面上での蛋白質および核酸に対する理想的なＳＥＡＣデバイスとして機能する。

３．ヒト／エストロゲン受容体ＤＮＡ−結合領域（８４残基）をバクテリア内で表現する。プラスミド表現ベクターｐＴ⁷ ＥＲＤＢＤ（Ｊ．Ｓｃｈｗａｂｅ，ＭＲＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙＳ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）に移行させる。ＤＮＡ結合領域の表現は１ｍＭイソプロピルチオガラクトシド（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）で誘発され、３時間の誘発後、バクテリアを収穫した。誘発されたバクテリア全体を基質支援レーザー脱着／イオン化質量分析測定で分析して、ＤＮＡ−結合領域が合成される主要なペプチドであることを確認した。ペプチドをバクテリア性リゼートから逆相ＨＰＬＣで純化し、ＡｆｆｉＧｅｌ １０（ＢｉｏＲａｄ）上で不動態化する。エストロゲン反応要素を含む３０−ｂｐＤＮＡ配列をＧｅｎｏｓｙｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）で合成する。表面親和性吸着したａｐｏ−，Ｚｎ−およびＣｕ−結合形態のＤＮＡ−結合領域と配列特異性核酸（エストロゲン反応要素）との相互作用に関して、３−ヒドロキシピコリン酸を基質として用いることによって調査する。

この実施例は、蛋白質表面の機能性領域がＳＥＡＣにおいて捕捉デバイスとして利用できることを示している。各蛋白質表面領域の構造と機能上の金属結合の影響を調べることができる。

４．表面（例えば、Ｃｏｎ Ａ−セファロース、小麦胚レクチンセファロース、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で不動態化されたレクチンの異なったアリコットを用いてヒトのグリコペプチドおよび仔ウシのヒスチジンを多量に含んだ糖蛋白質トリプティックダイジェストを結合させた。緩衝液と水で洗浄して未結合のペプチド類を取リ除いた後、ＦＵＣｃａｓｅ Ｉ，ＭＡ ＮａｓｅＩ，ＨＥＸａｓｅＩ，ＮＡＮａｓｅ ＩＩＩおよびＰＫＧａｓｅ（Ｇｌｙｋｏ，Ｉｎｃ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を用いてその場所で配列酵素消化を行った。このサンプルをレーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析して、これら２つの蛋白質内の糖蛋白質の炭水化物組成について調べる。この実施例は、糖蛋白質を連結するためのＳＥＡＣの利用、そしてその場所で配列決定できる炭水化物成分を示している。

（Ｖ．親和性捕捉デバイスとしての表面不動態化染料）
シバクロンブルー３ＧＡ−ａｇａｒｏｓｅ（タイプ３０００、４％ビーズ化アガロース、配位子密度２〜５μモル／ｍｌゲル）をＳｉｇｍａから入手する。ヒト血漿の２００μｌのアリコットを５０μｌの表面不動態化シバクロンブルー、ｐＨ７．０（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム）と、２３℃の温度下、ｌ０分間混合した。このゲルを５００μｌの緩衝液で３回洗浄し、５００μｌの水で２回洗浄する。１μｌのゲル懸濁液のアリコットを２μｌのシナピン酸（５０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸に溶解したもの）と混合し、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。図２０は表面不動態化シバクロンブルーによる血清サンプルからのヒト血漿アルブミン（２重電荷イオン［Ｍ＋２Ｈ］²⁺，３２，０００ｍ／ｚ、単一電荷イオン［Ｍ＋Ｈ］⁺，６４，０００ｍ／ｚ、２量体イオン、２［Ｍ＋Ｈ］⁺，１２８，０００ｍ／ｚ）の選択的脱着を示している。テストされた他の不動態化染料としては、リアクティブレッド１２０−アガロース、リアクティブブルーアガロース、リアクティブグリーンアガロース、リアクテイブイェロウ・アガロース（すべてＳｉｇｍａ社製）などで、それぞれヒト血漿からの異なった血漿を選択する。

（実施例４）表面強化ニート脱着（ＳＥＮＤ）
　この実施例は分析対象物の脱着およびイオン化の方法を示し、この方法においては分析対象物は基質結晶構造中に分散しているのではなく、エネルギー吸収分子の付着表面内部、あるいはその上、あるいはその上方の、いろいろな化学的、物理的、および生物学的修飾や認識反応への反応を示す位置に存在する。表面は適切な密度の（共有結合により、あるいはそれによらないで）、エネルギー吸収の単層あるいは複数の層を用いていろいろな質量の分析対象物分子の脱着を速やかに行わせるように、いろいろな形状で結合しているエネルギー吸収分子により誘導される。

以下の実施例（グループＩ〜ＩＶ）は、ＳＥＮＤとＳＥＡＣとの組み合わせを示しており、これらの実施例においては、脱着（結合された）エネルギー吸収分子は分析対象物分子の捕捉を促進するための親和性吸着剤としての役割も果たしている。

（Ｉ．表面への共有結合によって結合したエネルギー吸収分子）
１．桂皮酸アミド（Ａｌｄｒｉｃｈ）（先行技術ではレーザー波長３５５ｎｍで基質としての役割は果たさない）をプロパノール：０．５Ｍ炭酸ナトリウム（３：１）に溶解して、ジビニルスルホン（Ｆｌｕｋａ，Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ，ＮＹ）活性化セファローズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と２３℃の温度下で２時間混合した。過剰のエネルギー吸収分子はイソプロパノールで洗浄除去する。この分子構造を図２１に示す。結合、あるいは遊離分子２μｌのアリコットをプローブ端上に置いて、０．１％トリフルオロ酢酸に溶かしたヒトエストロゲン受容体２量体化領域１μｌをその上に加え、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析した。これらの結果はペプチドイオン信号が結合エネルギー吸収分子表面（図２０、上側）上でのみ検出されること、そして遊離分子は有効でないこと（図２０、下側）を示している。

２．桂皮酸ブロマイド（Ａｌｄｒｉｃｈ）（先行技術ではレーザー波長３５５ｎｍで基質として機能しない）をイソプロパノール：０．５Ｍ炭酸ナトリウムに溶かして（３：１）、ジビニルスルホン（Ｆｌｕｋａ）活性化セファロースと２３℃の温度下、１５時間混合した。過剰なエネルギー吸収分子をイソプロパノールで洗浄除去する。その分子構造を図２３に示す。結合、あるいは遊離分子２μｌのアリコットをプローブ端上に置いて、０．１％トリフルオロ酢酸に溶かしたペプチド混合物１μｌをその上に加え、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。その結果は、ペプチドイオン信号は結合したエネルギー吸収分子の表面でだけ検出され（図２４、１番上）、遊離分子は有効ではない（図２４、下側）を示している。

３．ジヒドロキシ安息香酸をジシクロヘキシルカルボジイミドで活性化させ、Ｆｍｏｃ−ＭＡＰ８側鎖樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｒｓｔｅｒ，Ｃｉｔｙ，ＣＡ）と２３℃の温度下で１５時間混合する。過剰なエネルギー吸収分子はメタノールで洗浄除去する。この分子構造を図２５に示す。結合エネルギー吸収分子を含む、および含まないＭＡＰ８側鎖樹脂１μｌのアリコットをプローブ端上に置いて、０．１％トリフルオロ酢酸に溶かしたペプチド混合物１μｌを上に加え、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。その結果は、ペプチドイオン信号が結合エネルギー吸収分子を持った表面上でのみ検出されること（図２６、１番下）、エネルギー吸収分子を含まないコントロール表面は有効ではないことを示す（図２４、１番上）。

４．α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸をメタノールに溶かし、ＡｆｆｉＧｅｌ １０あるいはＡｆｆｉＧｅｌ １５（ＢｉｏＲａｄ）と種々のｐＨ値で、２３℃の温度下、２〜２４時間混合した。過剰なエネルギー吸収分子をメタノールで洗浄除去する。結合した分子２μｌのアリコットをプローブ端上に置いて、１μｌのペプチド混合物、あるいはミオグロビン、あるいはトリプシン、あるいは炭酸アンヒドラーゼを上に加え、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。この結果は、ミオグロビンイオン信号が結合エネルギー吸収分子を有する表面でのみ検出され（図２７Ａ）、汚染性低質量イオン信号はほとんど観察されない（図２７Ｂ）を示している。

５．４０％ポリアクリルアミド溶液を調製して、望ましい形のプローブ端内に入れる。このゲルをサイズで観祭できる程の縮小が認められなくなるまで、空気で乾燥させる。この先端を９％グルタルアルデヒド／緩衝液（ｖ／ｖ）溶液に浸し、緩やかに振りながら３７℃の温度で２時間培養する。培養後、緩衝液を用いて過剰なグルタルアルデヒドを洗い流す。活性化された先端を飽和緩衝エネルギー吸収分子溶液に加えて、（約）３７℃の温度下で、（約）２４時間、穏やかな振動を加えながら培養する。有機溶剤を用いて、それを必要とする状況でエネルギー吸収分子を可溶化する。この先端を緩衝液で洗浄し、９％エタノールアミン／水（ｖ／ｖ）溶液に入れて、２５℃の温度で、緩やかな振動を加えながら３０分間培養する。次に、先端を緩衝液で洗浄してシアノボロハイドライドナトリウム／緩衝液５ｍｇ／ｍＬ溶液に加え、２５℃の温度下で３０分間培養する。最後に、先端を緩衝液で十分に洗浄し、使用時まで保存する。同じ反応を、２分間の超音波処理で６Ｎ ＨＣｌによる加水分解で作成したナイロン端上で行い、その後、水と緩衝液で十分に洗浄する。同じ反応を２０％ＮａＯＨ内に７日間浸し、毎日３０〜６０分間超音波処理を行って活性化させたアクリル端上で行い、その後洗浄した。この実験で推定される表面の一般的な分子構造を図２８に示す。

６．４０％ポリアクリルアミド溶液を調製し、望ましい形のプローブ端に入れる。このゲルを、観察されるようなサイズの縮小が認められなくなるまで、空気で乾燥させる。ｐＨ値が８．８の０．５Ｍ炭酸ナトリウムを洗浄用緩衝液として作成する。上に作成したプローブ端をジビニルスルホン（Ｆｌｕｋａ）の溶液および緩衝液を１０：１で混合した溶液に入れ、２４時間培養する。このプローブ端を緩衝液で洗浄して、ｐＨ８のエネルギー吸収分子緩衝溶液内に入れ、２時間培養する。同じ反応を超音波処理を加えながら６Ｎ ＨＣｌでの加水分解で作成したナイロン端上で実行し、その後で水と緩衝液で十分に洗浄する。同じ反応を２０％ＮａＯＨ内に７日間浸して、毎日３０〜６０分間超音波処理を加えて活性化させたアクリル端上で行い、その後、洗浄した。この実験で推定される表面の一般的な分子構造を図２９に示す。

７．４０％ポリアクリルアミド溶液を調製して、望ましい形のプローブ端に入れる。このゲルを、観察できるようなサイズの縮小が認められなくなるまで空気で乾燥させる。ジクロロメタン／ＮＭＰ（２：１）内にｌ００ｍｇ／ｍＬで溶解したエネルギー吸収分子と、１Ｍジクロロヘキシルカルボジイミド／ＮＭＰ溶液を、それぞれ１：２（ＥＡＭ：ＤＣＣ）の比率で混合する。ＥＡＭ／ＤＣＣ溶液を次に２５℃の温度で１時間、撹拌しながら培養する。培養後、白い沈殿物が観察される。この白い沈殿物をか焼させたガラスフィルターでろ過する。このフィルターの透過フローはＤＣＣ活性化ＥＡＭである。次に、この先端をＤＣＣ活性化ＥＡＭ溶液に入れて、２５℃の温度で（約）２時間培養する。この先端を最終的に、アセトン、ジクロロメタン、メタノール、ＮＭＰ、およびヘキサンなどの種々の溶剤で洗浄する。同じ反応を超音波処理を加えながら６Ｎ ＨＣｌで２分間加水分解することによって調製されたナイロン端上で実行し、その後、水と緩衝液で洗浄する。同じ反応を２０％ＮａＯＨに７日間浸し、毎日３０〜６０分間超音波処理を加えて作成したアクリル端上で行い、その後洗浄する。この表面の一般的な分子構造を図３０に示す。

８．４０％ポリアクリルアミド溶液を調製し、望ましい形のプローブ端に入れる。このゲルを観察できる程のサイズの縮小が認められなくなるまで、空気で乾燥される。ジクロロメタン／ＮＭＰ（２：１）に溶かしたＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅの１００ｍｇ／ｍＬと１Ｍ ＤＣＣ／ＮＭＰ溶液を１：２（リシン：ＤＣＣ）の比率で混合する。このリシン／ＤＣＣ溶液を２５℃の温度下で、撹拌しながら１時間培養する。培養後、白い沈殿物が観察され、か焼したガラスファイバーでろ過する。透過フローはＤＣＣ活性化リシンである。このプローブ端をＤＣＣ活性化リシン溶液に入れて、２５℃の温度下、２時間（程度）培養する。このプローブ端を次に５ｍＬピペリジンに入れて、２５℃の温度で、おだやかな振動を加えながら４５分間培養する。ＤＣＣ活性化リシンをこのプローブ端を用いて、望ましいリシン側鎖ができるまで、連続して反応させる。ジクロロメタン／ＮＭＰ（それぞれ２：１）内に１００ｍｇ／ｍＬで溶かしたＥＡＭ溶液と１Ｍ ＤＣＣ／ＮＭＰ溶液を１：２の比率（ＥＡＭ：ＤＣＣ）で混合する。このＥＡＭ／ＤＣＣ溶液を２５℃の温度下で、緩やかな振動を加えながら１時間培養する。培養後、白い沈殿物が観察され、か焼したグラスファイバーでろ過する。透過フローはＤＣＣ活性化ＥＡＭである。このＥＡＭはＤＣＣと反応する酸機能基を有する。このプローブ端をＤＣＣ活性化ＥＡＭ溶液に入れて、２５℃の温度で２時間（程度）、緩やかな振動を加えながら培養する。最後に、このプローブ端を、使用前に過剰なジクロロメタン、ＮＭＰ、およびメタノールで洗浄する。同じ反応を超音波処理を加えながら６Ｎ ＨＣｌで２分間加水分解することによって調製されたタイロン端で実行し、その後、水と緩衝液で洗浄する。同じ反応を２０％ＮａＯＨ内に７日間浸し、１日３０〜６０分間超音波処理を加えて活性化したアクリル端上でも行い、その後、洗浄する。この実験で推定される表面の一般的な化学構造を図３１に示す。

（ＩＩ．表面への配位共有結合結合によって結合されたエネルギー吸収分子）
１．チオサリチル酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）を水、または５０％メタノール水溶液あるいはメタノールに溶解する。これらの溶液はそのまま用いるか、あるいはそれら溶液のｐＨを炭酸水素ナトリウムあるいは水酸化アンモニウムまたはトリエチルアミンで６．５に調整してから用いる。Ｃｕ（ＩＩ）イオンをイミノジアセテート（ＩＤＡ）（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）あるいはトリス（カルボキシメチル）エチレネイドアミン（ＴＥＤ）（ＹｉｐおよびＨｕｔｃｈｅｓ，１９９１によって述べられているように合成）のいずれかでキレート化する。このエネルギー吸収分子の溶液をＩＤＡ−Ｃｕ（ＩＩ）ゲルと４℃から２３℃の温度下で５分間〜１５時間の範囲で混合する。過剰のエネルギー吸収分子は水か、５０％メタノール水溶液か、あるいはメタノールで洗浄除去する。この実験で推定される表面の分子構造を図３２に示す。結合エネルギー吸収分子１μｌのアリコットをプローブ端上に置いて、１μｌのペプチド混合物、あるいはエストロゲン受容体２量体化領域、またミオグロビンを０．１％トリフルオロ酢酸に溶かしたものを上に加え、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。図３３はこの表面から脱着されるエストロゲン受容体２量体化領域の代表的な質量スペクトルを示す。

２．ＥＡＭ表面の上に置かれたサンプルで、配列決定のためのその場所での反応を簡単に行うことができる。プローブ表面上のＩＤＡ−Ｃｕ（ＩＩ）に配位共有結合しているチオサリチル酸をセクション２．１に示すような方法で調製する。（ＧＨＨＰＨ）₃Ｇペプチド１μｌのアリコットをこの表面上に置いて、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。いくつかのスペクトル（１スペクトルあたり平均５０レーザーショット）を得た後、サンプルを取り出す。カルボキシペプチダーゼＹ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）２μｌのアリコットを表面の直接加えて、モイストチェンバー内で５分〜１時間、３７℃の温度下で培養される。０．１％トリフルオロ酢酸１μｌによってその場所での酵素消化を終わらせ、サンプルを質量分析測定で再分析する。

３．配列決定のその場所での反応の別の実施例はトリプシン消化を行い、その後でＣ−端末配列決定を行う方法である。プローブ表面上でＩＤＡ−Ｃｕ（ＩＩ）に配位共有結合結合したチオサリチル酸をセクション２．１．に述べた方法で調製する。エストロゲン受容体２量体化領域（６１６８．４Ｄａ）１μｌのアリコットをこの表面上に置いて、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。いくつかのスペクトル（１スペクトルあたリ平均２０レーザーショット）を得た後、サンプルを取り出す。０．ｌＭ重炭酸ナトリウムに溶かしたトリプシン（Ｓｉｇｍａ）２μｌのアルコットを表面に付加して、３７℃の温度で１５分間培養する。０．１％トリフルオロ酢酸１μｌを加えてその場所での消化を終わらせ、質量分析測定で再分析する。いくつかのスペクトル（１スペクトルあたリ平均２０レーザーショット）を得た後、サンプルを取リ出す。カルボキシペプチダーゼＹ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）２μｌのアリコットを直接表面に加えて、モイストチェンバー内で３７℃の温度で１時間培養する。０．１％トリフルオロ酢酸を加えてその場所での酵素消化を終わらせ、その後、サンプルを質量分析測定で再分析する。

（ＩＩＩ．表面にイオン結合で結合したエネルギー吸収）
シナピン酸、またはα−シアノ−４−ヒドロキシシナピン酸を水に懸濁させ、ｐＨを希釈した水酸化ナトリウムで６．６に調節する。テンタクルＤＥＡＤ Ｆｒａｃｔｏｇａｌ（ＥＭ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ６．０で洗浄して、吸引乾燥させる。エネルギー吸収分子溶液をこのＤＥＡＥゲルと２３℃の温度下で１５時間混合させる。このゲルを、過剰なエネルギー吸収分子が取り除かれるまで水で洗浄する。この実験から推定される表面の分子構造を図３４に示す。結合されたエネルギー吸収分子０．５μｌのアリコットをプローブ端上に置いて、０．１％トリフルオロ酢酸に溶かした１μｌのエストロゲン受容体２量体化領域あるいはミオグロビンを上に加えて、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。図３５ＡおよびＢはその質量スペクトルを示す。

（ＩＶ．表面への疎水性／ファンデルワールス結合によって結合されたエネルギー吸収）
１．α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸を５０％メタノール水溶液およびジメチルスルホキシドに溶解する。これをアミノメチル化されたポリスチレンと２３℃の温度で１５時間混合する。過剰なエネルギー吸収分子を５０％メタノール水溶液で洗浄除去する。この実験で推定される分子構造を図３６に示す。結合したエネルギー吸収分子１μｌのアリコットをプローブ端上に置いて、１μｌのペプチドを上に加え、レーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。

（実施例５）光感作性付着および放出のために強化された表面（ＳＥＰＡＲ）
　ＤＮＡ，ＲＮＡおよび蛋白質などの生体高分子の構造と特性を決定する個別構成ブロック（モノマー）の線形的な集団が知られているが、これらは、レーザー脱着／イオン化、飛行時間（ＴＯＦ）質量分析測定（ＭＳ）による部分的に消化された（例えば、化学的あるいは酵素による）生体高分子の個別的な質量判定を伴う方法で（全体にせよ、その１部にせよ）配列決定される。

生体高分子を先ず１つ、あるいは複数の共有結合による光感作性（つまり、光に対して感受性のある）結合を介してＳＥＬＤＩプローブ素子に結合したとする。次に、その生体高分子の端末のいろいろな数の個別ユニット（モノマー）を酵素あるいは化学反応により分割する（つまり、取り出す）。プローブ素子表面に残る分析対象物は質量が生体高分子のグループ（ポピュレーション）で構成されており、その端末モノマーユニットはそれぞれ一部が失われている。修飾された生体高分子の、小さな、しかし十分な生体高分子がレーザー光によってプローブ素子から結合解除（連結解除）される、つまり、２６０ｎｍと３６５ｎｍの間の波長の紫外線で光感作性結合が分割される。結合解除された生体高分子は飛行時間質量分析測定によって脱着／イオン化される。

（Ｉ．生体高分子のＳＥＬＤＩ表面への結合）
３つの成分が関連している。１）アミンまたはカルボキシル基のいずれか、あるいはその両方に反応するように活性化された表面；２）光感作性化合物、一般的に一般式がＲ₁−Ｎ＝Ｎ−Ｒ₂のアゾ化合物、例えば、５−（４−アミノフェニルアゾ）サリチル酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）、アゾジカルボンアミド（Ａｌｄｒｉｃｈ）、あるいはその他の活性水素反応性化学物質などの光感作性などを作リ出すメカニズムの使用；３）蛋白質、核酸、炭水化物などの生体高分子。

光感作性化合物を先ず最初に活性化された表面に付着する必要がある。例えば、アゾジカルボンアミドとアミンに対して反応性を示す表面に付着させたり、アミンまたはカルボキシルに対して反応性を示す表面に対してアミノフェニルアゾサリチル酸を付着させるというようにである。次に、従来用いられている多くの化学物質、例えば、アミンに反応性を示す化学物質−臭化シアノゲン、Ｎ−ヒドロキシ桂皮酸イミドエステル、ＦＭＰ活性体、ＥＤＣ−媒介、ジビニルスルホン；ヒドロキシル基に反応性を示す化学物質−エポキシ活性体、ジビニルスルホン；スルフィドリル基に対して反応性を示す−ヨードアセチル活性体、マレイミド、ジビニルスルホン、エポキシ活性体；カルボニル基に反応性を示す化学物質−ヒドラジド、還元性アミン化；活性水素に反応性を示す化学物質−同時に光感作性結合もつくりだすジアゾニウム、などの１つを用いて、光感作性化合物あるいは生体高分子を活性化させる。最後に、この生体高分子を１つ、あるいは複数の結合を介して光感作性化合物に付着させる。過剰な化学物質は、イオン化力が強くｐＨの低い、水性あるいは有機溶媒を用いて、何回か操作を繰リ返して、洗浄除去する。

（ＩＩ．構造上の統合性を検証するための質量分析測定による分析）
２６０ｎｍ〜３６５ｎｍのＵＶレーザーは光分解結合を切断することができる。脱共役生体高分子を、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦによリ脱着／イオン化する（当業者には、ＳＥＮＤ，ＳＥＡＣおよびＳＥＰＡＲも使用できることが周知である）。

（ＩＩＩ．生体高分子のその場所における配列決定）
このことは、酵素的あるいは化学的方法による、周知の連続的な分解のいずれかの方法によって行われ、例えば、タンパク質のＮ−末端はアミノペプチダーゼにより、タンパク質のＣ−末端はカルボキシペプチダーゼにより、タンパク質のＮ−末端はエドマン分解により、核酸はエキソヌクレアーゼにより、またはサンガー法によリ、炭水化物はノイラミニダーゼ、マンナーゼ、フカーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、Ｏ−グリカナーゼ、またはＮ−グリカナーゼにより配列決定される。過剰の試薬ならびに反応生成物を洗浄除去した後、複数の光分解結合によって表面上は繋ぎ止められている、失われた末端モノマーの数が異なる一団の、質量の定義された生体高分子から成る分析対象物を、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳにより分析する（当業者には、ＳＥＮＤ，ＳＥＡＣおよびＳＥＰＡＲも使用できることは周知である）。

酵素的手法あるいは化学的手法を用いた複数の内部配列の決定には、例えば、エンドヌクレアーゼあるいは臭化シアンを用いた蛋白質の分解と、それに続くＮ−および（または）Ｃ−末端の連続的な分解、エンドヌクレアーゼを用いた核酸の分解とそれに続くエキソヌクレアーゼあるいは化学的手法よる連続的な分解、エンドグリコシダーゼＨあるいはエンドグリコシダーゼＦを用いた多糖類鎖の分解とそれに続く特異的な酵素を用いた分解がある。過剰の試薬ならびに反応生成物を洗浄除去した後、表面上に残っている、失われた末端モノマーの数が異なる複数の集団の、質量の定義された生体高分子から成る分析対象物を、ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ（当業者に周知）により分析する。

（ＩＶ．配列決定の特異例）
この原理の実物による説明を、２６残基のペプチドの配列決定により提供する。 ＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨＧこのペプチド（ＣＨＨＰＨ）₅Ｇは、ヒスチジンに富む糖蛋白質（ＨＲＧ）として知られている８０ｋＤａの蛋白質の、完全な配列の中の金属結合ドメインである。

カップリング剤として表面にアリルアミン基をもつガラスビーズ（ｓｉｇｍａ）を、冷却した０．３Ｍ ＨＣｌで洗浄し、懸濁する。５０ｍｇ／ｍＬのＮａＮＯ₂水溶液のアリコットを、ビーズに対して１：５（ｖ／ｖ）の比で（ＮａＮＯ₂：ＨＣｌ）加え、穏やかに振とうしながら４℃で１５分間インキュベートする。インキュベーションの後、０．３Ｍ ＨＣｌおよび５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄する。配列決定されるべきペプチドを、リン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）中のビーズに加え、穏やかに振とうしながら４℃で２４時間インキュベートする。ペプチドを結合したビーズを、リン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、高濃度の塩（例えば１．０Ｍ）、希酸、および有機溶媒（例えば、メタノール）を含むリン酸ナトリウム緩衝液を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析測定（当業者には、ＳＥＮＤ，ＳＥＡＣ、およびＳＥＰＡＲもまた使用できることが周知である）か、または２２０ｎｍの吸光度により、ペプチドの徴候が上清に全く検出されなくなるまで洗浄する。ビーズのアリコット１μｌをプローブ先端上に置き、１μＬ、のシナピン酸（５０％メタノール／０．１％トルフルオロ酢酸に溶かした）をビーズに混合し、このサンプルをレーザー脱着飛行時間質量分析測定により分折した。幾つかのスペクトル（各々平均５０個のレーザーショット）を得た後、表面上に残っているペプチドをメタノールで洗浄してシナピン酸を除き、カルボキシペプチダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、モイストチャンバー内で２３℃で消化する。次に、消化されたペプチドをリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ８．０）で洗浄する。シナピン酸の１μＬのアリコットを表面に加え、レーザー脱着飛行時間質量分析測定により再び分析した。ＧＨＨＰＨＧの配列の、Ｃ−末端分析の結果を図３５に示す。このペプチドの、新生配列が観察される。この配列は、２つのピークの間の質量の差から推断される。

第２の実施例は、光分解結合によって表面上に共有結合された、複数のペプチドの同時の配列決定である。ヒトのエストロゲン受容体の２量ドメイン（６１６８．４Ｄａ）を複数の光分解結合によリ表面上に繋ぎ止める。このペプチドは、その配列中に３つのメチオニン残基を持っており、臭化シアンにより特異的に分解され、２１７０．５８Ｄａ（Ｄ１−Ｍ１８），３１１８．７７Ｄａ（Ａ１９−Ｍ４５）および５３５．６２Ｄａ（Ｓ４６−Ｍ５０）および３９７．６２Ｄａ（Ｅ５１−Ｌ５３）の質量のペプチドを生じる。これらのペプチドはすべて、光分解結合により表面上に結合されている。次に、これらの各ペプチドを、完全に他から識別される新生配列を生じさせるため、カルボキシペプチダーゼＹによりその場所で消化する。

蛋白質の構造決定のためのもう１つのアプローチは、複数の光分解結合によって表面上に結合された蛋白質の、トリプシン消化によって生じる複数のペプチドの、Ｎ−末端の同時の配列決定である。インシュリンＢ鎖を、複数の光分解結合により表面上に繋ぎ止める。このペプチドは、その配列の中に２つのリジン／アルギニン残基を持っており、それはトリプシンによって特異的に切断されて、２５８５．９Ｄａ（Ｆ１−Ｒ２２）と８５９．０Ｄａ（Ｇ２３−Ｋ２９）の質量のペプチドを生じ、これらはいずれもいる。次いで、これらの各々にその揚所で、アミノペプチダーゼ消化あるいはエドマン分解の複数のサイクルのいずれかを施し、他から識別される新生配列を生じさせる。

核酸のカップリングおよび配列決定も同様の方法で行われる。カップリング剤として、表面にアリルアミン基を持つガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ）を０．３ＭＨＣｌで洗浄し、懸濁する。このビーズに、５０ｍｇ／ｍＬのＮａＮＯ₂水溶液を、１：５（ｖ／ｖ）の比で（ＮａＮＯ₂：ＨＣｌ）加え、４℃で１５分間穏やかに振とうしながらインキュベートする。インキュベーションの後、冷却した０．３Ｍ ＨＣｌおよび５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）でビーズを洗浄する。配列決定されるべきＤＮＡ（例えば、エストロゲン受容体認識要素、３０塩基対のオリゴヌクレオチド）を、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中にてビーズに加え、４℃で２４時間穏やかに振とうしながらインキュベートする。ＤＮＡを結合したビーズをリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、高濃度の塩（例えば、１．０Ｍ），希酸、および有機溶媒（例えば、メタノール）を加えたリン酸ナトリウム緩衝液を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析測定（当業者には、ＳＥＮＤ，ＳＥＡＣおよびＳＥＰＡＲもまた使用できることが周知である）あるいは２６０ｎｍの吸光度によって、上清にＤＮＡの徴候が全く検出されなくなるまで洗浄する。次に、１μＬのビーズのアリコットをプローブ先端上に置き、このビーズに１μＬのアリコットの、３−ヒドロキシピコリン酸（５０％メタノール／０．１％トルフルオロ酢酸に溶かした）を混合し、このサンプルをレーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。幾つかの質量スペクトル（各々平均５０個のレーザショット）を得た後、表面に結合している残ったＤＮＡを、メタノールを用いて洗浄して３−ヒドロキシピコリン酸を除き、モイストチャンバー内で、エキソヌクレアーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用い、２３℃で消化する。次に、表面上の消化したＤＮＡをリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）ｐＨ８．０で洗浄して、過剰の試薬および反応生成物を除く。３−ヒドロキシピコリン酸の１μＬのアリコットを表面に加え、レーザー脱着飛行時間質量分析測定により再び分析した。ＤＮＡの新生の配列を生じる。その配列は、２つのピークの間の質量の差により推断される。

炭水化物鎖は、過ヨウ素酸塩により酸化され、活性化されて、表面上の光分解性化合物に特異的に結合する。この繋ぎ止められた炭水化物について、ノイラミニダーゼ、マンナーゼ、フカーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、Ｏ−、またはＮ−グリカナーゼのような特異的な酵素を用いた配列決定を行い、レーザー脱着飛行時間分析計測定により決定した。５−（４−アミノフェニルアゾ）サリチル酸（Ａｌｄｒｉｃ）を、細孔状ガラスビーズ上のアリルアミンのような、カルボキシル反応性表面に結合させる。ヒトおよびウシのヒスチジンに富む糖タンパク質の炭水化物小部分を低濃度の（０．２Ｍ）ナトリウム過ヨウ酸塩水溶液を用い、２３℃で９０分間酸化する。過剰の試薬を水で洗浄除去する。この蛋白質を、リン酸緩衝液、ｐＨ８．０中で、細孔状ガラスビーズ上に結合した５−（４−アミノフェニルアゾ）サリチル酸に加える。次に、シアノポロハイドライドナトリウム（０．６ｍｇ／１００μｌ）を加え、２３℃で１８時間撹拌する。水、１Ｍ ＮａＣｌで広範囲に洗浄し、さらに水で再び洗浄して過剰な試薬および未反応のタンパク質を除去する。このビーズの１μＬのアリコットをプローブ先端に置き、１μｌのシナピン酸（５０％メタノール／０．１％トルフルオロ酢酸に溶かした）をビーズに加え、このサンプルをレーザー脱着飛行時間質量分析測定により分析する。表面上に結合している残りの蛋白質をメタノールで洗浄してシナピン酸を除去し、リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で、２μｌのトリプシンと共に３７℃で３０分間インキュベートする。糖ペプチドの結合した表面を、リン酸緩衝塩類溶液および水を用いて完全に洗浄し、過剰の試薬および未結合のペプチドを除去する。このビーズに、シナピン酸の１μＬのアリコットを混合し、このサンプルをレーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。幾つかの質量スペクトル（各々平均５０個のレーザショット）を得た後、プローブ表面に残っている糖ペプチド質をメタノールで洗浄してシナピニン酸を除去し、Ｎ−アセチルノイラミニダーゼ（ＮＡＮａｓｅＩＩＩ，Ｇｌｙｋｏ，５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、３７℃１時間）、マンノシダーゼ（ＭＡＮａｓｅＩ，Ｇ１ｙｋｏ，５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、３７℃１８時間）、フコシダーゼ（ＦＵＣａｓｅ Ｉ，Ｇｌｙｋｏ，５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．０、３７℃１８時間）、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＨＥＸａｓｃ Ｉ，Ｇｌｙｋｏ，５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．０、３７℃４時間）、Ｏ−グリコシダーゼ（Ｇｌｙｋｏ，５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．０、３７℃１８時間）、Ｎ−グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅＦ，Ｇｌｙｋｏ，１００ｍＭリン酸、ｐＨ８．６、３７℃１８時間）を用い、連続的に、あるいは組み合わせて消化する。最後に、表面上でフラグメント化された糖ペプチドをリン酸緩衝塩類溶液および水で洗浄し、試薬および反応生成物を除去する。この表面に、シナピン酸の１μＬのアリコットを加え、再びレーザー脱着飛行時間質量分析測定で分析する。糖ペプチドの新生配列が得られる。この配列は、２つのピークの間の質量の差から推断される。

この明細書に述べたすべての特許ならびに刊行物は、本発明に関する当業者のレベルを示すものである。すべての特許ならびに刊行物は、この文中においては、個々の刊行物が各々特異的かつ別個に引用文献に取り入れられていたのと同じ程度に引用文献に取リ入れられている。

当業者には本発明が、その目的を達成し、述べられた目的物ならびに利益、および固有の目的物ならびに利益を得るために、うまく適合していることが容易に認められるであろう。ここに述べたオリゴヌクレオチド、化合物、方法、手順および技術は、必然的に好ましい実施例を代表するものであって、見本となることを意図しており、発明の範囲を限定するものではない。当業者らには変更ならびに他の使用法が生じるであろうが、それらは本発明の精神に含まれるものであり、添付した請求項の範囲により定義されるものである。
〔発明の効果〕

本発明によれば、分析対象物検出についてプローブから該分析対象物を脱着可能なエネルギーを放射するエネルギー源に対して該分析対象物を提示するための表面を有する、質量分析計中に取り外し可能に挿入され得るプローブが得られる。

Ａは中和したエネルギー吸収分子（シナピニン酸、ｐＨ６．２）の存在下に脱着した、３つのペプチド（ヒトの、ヒスチジンに富む糖タンパク質の金属結合ドメイン（ＧＨＨＰＨ）₂Ｇ（１２０６Ｄａ），（ＧＨＨＰＨ）₅Ｇ（２９０４Ｄａ）およびヒトエストロゲン受容体２量化ドメイン（Ｄ４７３−Ｌ５２５）（６１６８．４Ｄａ））の質量スペクトルを示し、Ｂは中性のエネルギー吸収分子の存在下における、これらのペプチドのその場所における連続的な金属（Ｃｕ）結合を示す。 Ａは中和したエネルギー吸収分子（シナピニン酸、ｐＨ６．５）の存在下に脱着した、ヒトカゼインリンペプチド（５Ｐ，２４８８Ｄａ）の、質量スペクトルを示し、Ｂはリンペプチドからリン酸基を除くための、その場所における連続的な５分間のアルカリ性フォスファターゼによる消化を示し、Ｃは先行技術に述べたように、酸性のエネルギー吸収分子（２，５ジヒドロキシ安息香酸、ｐＨ２）の存在下に、さらにその場所におけるフォスファターゼ分解を行った後の、リンペプチドの質量スペクトルを示す。 中和したエネルギー吸収分子（シナピン酸、ｐＨ６．２）の存在下に、カルボキシペプチダーゼＰによりその場所で消化する前（下図）および後（上図）の（ＧＨＨＰＨ）₅Ｇペプチド（２９０４Ｄａ）の混成質量スペクトルを示す。 固体ガラス、ポリプロピレンで被覆したステンレス鋼、ポリスチレンで被覆したステンレス鋼、およびナイロンプローブエレメントから脱着したペプチド混合物の、混成基質補助レーザー脱着質量スペクトルを示す。 ＳＥＡＣ ＡはＩＤＡ−Ｃｕ（ＩＩ）表面によって吸着されないペプチド溶液中の、精子刺激因子（９３３Ｄａ）およびニューロテンシン（１６５５Ｄａ）（およびそれらの複数のＮａ付加物）の、質量スペクトルを示し、ＢはＩＤＡ−Ｃｕ（ＩＩ）表面に選択的に吸着されたＮａ−付加物ピークを加えた、アンジオテンシンＩ（１２９６．５Ｄａ）の、質量スペクトルを示し、ＣはＩＤＡ−Ｃｕ（ＩＩ）上に吸着され、水で洗浄した後の、同じアンジオテンシンＩの質量スペクトルを示す。 Ｃは、ＩＤＡ−Ｃｕ（ＩＩ）上に吸着され、水で洗浄した後の、同じアンジオテンシンＩの質量スペクトルを示し、Ｄは、親和力で吸着したアンジオテンシンＩによる、その場所での連続的な銅の結合（１個および２個のＣｕ）を示し、Ｅは、親和吸着したアンジオテンシンＩの、その場所での連続的なトリプシン消化を示す。 ＩＤＡ−Ｃｕ（Ｈ）表面に親和性吸着した、ミオグロビン（４ないし８ｆモル）の質量スペクトルを示す。 上図は、粗混合物から、ＴＥＤ−Ｆｅ（ＩＩＩ）表面に親和性吸着した、複数のリン酸化した形の合成カゼインペプチド（１９３４Ｄａ）の質量スペクトルを示す。その場所の連続したアルカリ性フォスファターゼによる消化の後、もとのリン酸化されていない形だけが残った（下図）。 Ａは、幼児用処方における全タンパク質の、質量スペクトルを示し、Ｂは、ＴＥＤ−Ｆｅ（ＩＩＩ）表面に親和性吸着した、幼児用処方におけるリンペプチドの質量スペクトルを示し、Ｃは、幼児用処方を与えた後に採取した、胎児の胃吸引物中の、全タンパク質の質量スペクトルを示し、Ｄは、ＴＥＤ−Ｆｅ（ＩＩＩ）表面に親和性吸着した、胃吸引物中のリンペプチドの、質量スペクトルを示す。 Ｎ−グリカナーゼによる消化の前後の、ＩＤＡ−Ｃｕ（ＩＩ）表面に吸着された、ヒトおよびウシの、ヒスチジンに富む糖タンパク質の混成質量スペクトルを示す。質量の変化は、各糖タンパク質からの炭水化物の除去を意味する。 グリコシル化した２種類のタンパク質（上図、ヒトタンパク質；下から２番目の図、ウシタンパク質の）からの、トリプシンで消化したペプチドの混成質量スペクトルおよび、トリプシンで消化した２種のペプチド（上から２番目の図、ヒトタンパク質；下図、ウシタンパク質、１，２の数字は、結合したＣｕの数を表す）の、その場所におけるＣｕ（ＩＩ）との結合を示す。 かかるＣｕ（ＩＩ）結合ペプチド（下図）が、ジエチルピロカルボン酸エステルにより特異的に修飾されて４Ｎ−カルベトキシ−ヒスチジル付加物（上図、１〜４）を形成する、少なくとも４つのＨｉｓ残基を有することを示す。 ウシのヒスチジンに富む糖タンパク質における、主要なＣｕ−結合ペプチドの、Ｃ−末端の部分的な配列を示す。 下図は、ヒツジ抗ウサギＩｇＧ常磁性表面に親和性吸着した、ウサギ抗ヒトラクトフェリン免疫グロブリンのみ（対照）の質量スペクトルを示す。上図は、ヒツジ抗ウサギＩｇＧ常磁性表面に親和性吸着した、ヒトラクトフェリンとウサギ抗ヒトラクトフェリン免疫グロブリンとの複合体の質量スペクトルを示す。 胎児尿から抗ヒトラクトフェリン免疫グロブリンナイロン表面に親和性吸着した、ヒトラクトフェリンの質量スペクトルを示す。 １ｎモル／ｍｌのラクトフェリンを含んでいる、全胎児尿の同等の質量スペクトルを示す。 下図）は、精製したウシのヒスチジンに富む糖タンパク質の質量スペクトルを示す。上図は、ウシ初乳から、ウシのヒスチジンに富むタンパク質に対する免疫グロブリン表面に親和性吸着した、ウシのヒスチジンに富む糖タンパク質およびフラグメントの質量スペクトルを示す。 異種の抗濾胞刺激ホルモン抗体によって認識される、濾胞刺激ホルモンのペプチドの、混成質量スペクトルを示す。 直径０．５ｍｍのプローブエレメント上に置かれた、１本鎖ＤＮＡアガロースの単一のビーズの上に親和性吸着された、ヒトラクトフェリンの質量スペクトルを示す。 胎児尿から１本鎖ＤＮＡ表面に親和性吸着した、ヒトラクトフェリンの質量スペクトルを示す。 ヒト十二指腸吸引物中の全タンパク質（下図）と、この吸引物から大豆トリプシンインヒビター表面に親和性吸着したトリプシン（上図）との、混成質量スペクトルを示す。 この吸引物１ｕｌから大豆トリプシンインヒビターナイロン表面に親和性吸着したトリプシンの質量スペクトルを示す。 ヒト尿からストレプトアビジン表面に親和性吸着した、ビオチン化したインシュリンの質量スペクトルを示す。 ヒト血漿からストレプタビジン表面に親和性吸着した、ビオチン化したインシュリンの質量スペクトルを示す。 上図は、ヒト血清中の全タンパク質の質量スペクトルを示す。下図は、ヒト血清からシバクロン−ブルー（Ｃｉｂａｃｒｏｎ−ｂｌｕｅ）表面に親和性吸着した血清アルブミンの質量スペクトルを示す。 ＳＥＮＤ 表面結合桂皮酸アミドの分子構造を示し、Ｒは架橋剤を加えた表面を表す。 上図）は、表面結合桂皮酸アミドから脱着したペプチド混合物の質量スペクトルを示す。下図は、遊離の桂皮酸アミドを用いた同じペプチド混合物の質量スペクトルを示す。 表面結合桂皮酸ブロマイドの分子構造を示し、Ｒは架橋剤を加えた表面を示す。 上図は、表面結合桂皮酸ブロマイドから脱着した、ペプチド混合物の質量スペクトルを示す。下図は、遊離の桂皮酸ブロマイドを用いた同じペプチド混合物の質量スペクトルを示す。 表面結合ＭＡＰ−ヒドロキシ安息香酸の分子構造を示し、Ｒは架橋剤を加えた表面を表す。 上図は、表面結合ＭＡＰのみから脱着したペプチド混合物の質量スペクトルを示す。下図は、表面結合ＭＡＰ−ジヒドロキシ安息香酸から脱着したペプチド混合物の質量スペクトルを示す。 表面結合α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸から脱着したミオグロビンの質量スペクトル（１，２００〜５０，０００ｍ／ｚ領域）を示す。 低い質量領域（０〜１２００ｍ／ｚ）における、同質量スペクトルを示す。 グルタールアルデヒドによる活性化によって、ポリアクリルアミドあるいはナイロンまたはアクリル表面に結合した、エネルギー吸収分子の分子構造を示す。 ジビニルスルホンによる活性化によって、ポリアクリルアミドあるいはナイロンまたはアクリル表面に結合した、エネルギー吸収分子の分子構造を示す。 ジシクロヘキシルカルボジイミドによる活性化によってポリアクリルアミドあるいはナイロンまたはアクリル表面に結合した、エネルギー吸収分子の分子構造を示す。 ジシクロヘキシルカルボジイミドによる活性化によって、複数の抗原ペプチドをつけたポリアクリルアミドあるいはナイロンまたはアクリル表面に結合した、エネルギー吸収分子の分子構造を示す。 イミノジアセテート（ＩＤＡ）−Ｃｕ（ＩＩ）表面に結合したチオサリチル酸の分子構造を示す。 チオサリチル酸−ＩＤＡ−Ｃｕ（ＩＩ）表面から脱着した、ヒトエストロゲン受容体の２量化ドメイの質量スペクトルを示す。 ＤＥＡＥ表面に結合したα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸の分子構造を示す。 シナピン酸−ＤＥＡＥ表面から脱着した、ヒトエストロゲン受容体の２量化ドメインの質量スペクトルを示す。 α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸−ＤＥＡＥ表面から脱着した、ヒトエストロゲン受容体の２量化ドメインの質量スペクトルを示す。 ポリスチレン表面に結合したα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸の分子構造を示す。 ＳＥＰＡＲ 光分解結合により表面に固定化した、ヒスチジンに富む糖タンパク質の金属結合ドメインの、Ｃ−末端の配列分析を示す。

Claims (1)

1. 分析対象物サンプルの分析対象物分子の質量を質量分析計により測定するための装置であって、
   　分析計チューブ；
   　上記チューブの内部に真空を適用するための真空装置；
   　上記分析対象物からの脱着された分析対象物分子に加速性電位を適用するためのチューブ内の電位手段；
   　上記分析対象物の脱着とイオン化を促進させるための表面結合分子に結合して上記分析対象物サンプルを提示するための、上記分析計チューブ内に取り外し可能なように挿入可能なサンプル提示手段であって、但し、上記表面分子はエネルギー吸着分子、親和性捕捉装置、光感作性付着分子及びそれの組合せから選択され；
   　上記表面結合分子に結合して上記サンプル提示手段上に付着した分析対象物サンプルであって、それにより上記質量分析計分析において消費されなかった上記分析対象物分子の少なくとも一部は次に化学、生物または物理分析手法のために接近可能なまま残り；
   　上記分析対象物からの分析対象物分子の一部を脱着およびイオン化するのに十分なエネルギーを分与するための分析対象物サンプルに向けられたレーザービームを生じさせるレーザービーム手段；および
   　加速されたイオン化分析対象物分子の衝突をその上で検出するための上記分析計チューブに結合した検出器手段
   を含む、装置。

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