DE60107022T2

DE60107022T2 - Verfahren zur Detektion von Prostata-spezifischem Membran-Antigen in Serum

Info

Publication number: DE60107022T2
Application number: DE60107022T
Authority: DE
Inventors: Elzbieta Orchard Park Kawinski; Kailash C. Williamsville Chadha
Original assignee: Health Research Inc
Current assignee: Health Research Inc
Priority date: 2000-07-24
Filing date: 2001-06-21
Publication date: 2005-11-24
Anticipated expiration: 2021-06-22
Also published as: EP1178317A1; JP2002277469A; DE60107022D1; EP1178317B1; ATE282205T1; CA2353267A1; US6692643B2; US20020166814A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es wird zunehmend deutlich, daß die Überwachung des prostataspezifischen Membranantigens (PSMA) für die Feststellung und Handhabung von Prostatakrebs wünschenswert ist.
Prostatakrebs ist der verbreitetste Krebs bei Männern in den Vereinigten Staaten. Die Fähigkeit einer frühen Feststellung von Prostatakrebs hat mit einem Serumtest hinsichtlich des prostataspezifischen Antigens (PSA) zugenommen. Jedoch ist PSA weder gewebespezifisch noch krankheitsspezifisch. Viele andere Zustände der Prostata, von denen einige gutartig sind, können auch zu einer abnormalen Erhöhung der PSA-Menge in dem Serum führen (Polascik et al., Prostate-specific antigen: A decade of discovery – what we have learned and where we are going, J. Urol., Band 162, S. 293–306, 1999).
Prostataspezifisches Membranantigen (PSMA) ist ein Transmembranglycoprotein mit sowohl intra- als auch extrazellulären Domänen, und es ist hochgradig spezifisch für das Prostatagewebe (Israeli et al., Molecular cloning of a complimentary DNA encoding of prostate-specific membrane antigen, Cancer Res., Band 53, S. 227–230, 1993). PSMA wird in gutartigem und malignem Prostataepithel exprimiert und kann immunohistochemisch festgestellt werden (Horoszewicz et al., Monoclonal Antibodies to a new antigenic marker in epithelial prostatic cells and serum of prostatic cancer patients, Anticancer Res., Band 7, S. 927–936, 1987; Silver et al., Prostate-specific membrane antigen expression in normal and malignant human tissues, Clin Cancer Res., Band 3, S. 81–85, 1997; Wright et al., Expression of Prostate-specific membrane antigen (PSMA) in normal, benign, and malignant prostate tissues, Urol Oncol, Band 1, S. 18–28, 1995; Bostwick et al., Prostate-specific membrane antigen expression in prostatic intraepithelial neoplasia and adenocarcinoma: A study of 184 cases, Cancer, Band 82, S. 2256–2261, 1998; und Sweat et al., Prostate-specific membrane antigen expression is greatest in prostate adenocarcinoma and lymph node metastatis, Urology, Band 52, S. 637–640, 1998). Für die Serummengen an PSMA wurde vorgeschlagen, daß sie von prognostischer Signifikanz in Prostatakrebspatienten mit fortgeschrittener Erkrankung sind, siehe z.B. Grasso et al., Combined nested RT-PCR assay for prostate-specific antigen and prostate-specific membrane antigen in prostate cancer patients: correlation with pathological stage, Cancer Research, Band 58, S. 1456–1459, 1998.
Versuche, PSMA im Serum zuverlässig festzustellen, waren nicht erfolgreich, und derzeit steht kein Routineverfahren zur Überwachung von PSMA-Mengen in den Seren von Prostatakrebspatienten zur Verfügung.
PSMA-Expression in menschlichem Prostatagewebe wurde erstmals durch immunohistochemische Färbung unter Verwendung von 7E11.C5-Antikörper (Horoszewicz et al., supra) dokumentiert. Der monoklonale Antikörper 7E11.C5, der gegen menschliche Prostatakrebszellen (LNCaP) gerichtet war, ist dafür bekannt, daß er an ein intrazelluläres Epitop von PSMA in der Nähe des Aminoterminus bindet. Eine mit einem Isotop konjugierte Form von 7E11.C5, die als CYT-356 bezeichnet wird, wurde für die Identifizierung von örtlicher und entfernter Prostatakrebsmetastase und Wiedererkrankung verwendet. 7E11.C5-Antikörper ist bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, USA unter der Hinterlegungsnummer HB10494 hinterlegt. Von der PSMA-Immunreaktivität wurde gefunden, daß sie in schnell wachsenden Prostatatumoren größer ist als im Vergleich zu gutartiger Prostatahyperplasie (BPH) und normalen Zellen (Horoszewicz et al., supra; Silver et al., supra; Wright et al., supra; Bostwick et al., supra; und Sweat et al., supra). Jedoch wurde unter 33 Zellinien, die von Horoszewicz et al., supra, getestet wurden, PSMA-Immunreaktivität nur in Lymphknotenkarzinom von Prostatazellen (LNCaP) festgestellt. 1997 ließ die US-Nahrungs- und Arzneimittelbehörde die Verwendung der Radioimmunkonjugatform von 7E11.C5 (CYT 356) für die Feststellung von lokalisiertem Prostatakrebs zu.
Versuche, die unternommen wurden, um PSMA in dem Serum von Patienten mit Prostatakrebs durch Western-Blot-Analyse zu messen, waren nicht schlüssig (Troyer et al., Detection and characterization of the prostate-specific membrane antigen (PSMA) in tissue extracts and body fluids, Int. J. Cancer, Band 62, S. 552–558, 1995; Rochon et al., Western-blot assay for prostatespecific membrane antigen in serum of prostate cancer patients, Prostate, Band 25, S. 219–223, 1994; und Beckett et al., Prostate-specific membrane antigen levels in sera from healthy men and patients with benign prostate hyperplasia or prostate cancer, Clin Cancer Res, Band 5, S. 4034-4040, 1999). Es wurde berichtet, daß Western-Blot-Analyse eine Zunahme der Serum-PSMA-Mengen in Patienten mit C₁-, D₁- und D₂-Prostatakrebs im Vergleich zu normalen zeigen kann (Rochon et al., supra). Auf der anderen Seite berichteten Troyer et al., supra, daß sie nicht in der Lage waren, PSMA in dem Serum von Prostatakrebspatienten festzustellen. Beckett et al., supra, berichteten, daß sie in der Lage waren, PSMA in dem Serum festzustellen, daß sie aber nicht in der Lage waren, zwischen einem frühen und einem späten Stadium der Krankheit zu unterscheiden.
Vor der vorliegenden Erfindung waren Versuche, den einfacheren ELISA zum Feststellen von Prostatakrebs zu verwenden, nicht erfolgreich. In einem ELISA mit "kompetitiver Hemmung" wurde PSMA zuvor in 46% der Seren von Prostatakrebspatienten festgestellt und in keinem in BPH- oder normalen Individuen (Horoszewicz et al., supra). Dies ist eine klar ungenügende Zuverlässigkeit für einen Bestimmungstest.
In unseren früheren Studien wurde gezeigt, daß PSA eine starke Affinität für thiophile Gele (1S, 2S und 3S) besitzt, wie es in der anhängigen US-Patentanmeldung 09/624,692, eingereicht am 24. Juli 2000, beschrieben ist. Kürzlich haben wir eine Beobachtung gemacht, daß PSMA auch eine starke Affinität für T-Gele besitzt. Kurz gefaßt wird eine T-Gelmasse in eine Säule (0,5 × 5 cm) gepackt und mit 25 mM Hepes-Puffer, der 1 M Natriumsulfat, pH 7,0, enthält, äquilibriert. Eine Quelle für PSMA, z.B. solubilisierter Zellextrakt von LNCaP-Zellen (5 × 10⁷ Zellen/ml) oder menschliches Serum (400 μl), wird mit Säulenäquilibrierungspuffer rekonstituiert und auf die Säule aufgebracht. Die Säule wird dann mit etwa 10 Leervolumen an Säulenäquilibrierungspuffer gewaschen, und die gebundenen Proteine werden mit 25 mM Hepes-Puffer, pH 7,0, eluiert. Das Vorhanden von PSMA in verschiedenen Säulenfraktionen wird dann durch SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines monoklonalen Anti-PSMA-Antikörpers, wie 7E11.C5, nachgewiesen.
Beispielsweise wurde Elektroforese von Fraktionen unter nicht-reduzierenden Bedingungen in einem 4-15%-igen Polyacrylamidgradientengel durchgeführt. Proben wurden in gleichen Volumina, die vergleichbare Proteinmengen enthielten, aufgetragen und für 40 Minuten bei 200 Volt laufen gelassen. Nach der Elektroforese wurden die Proteine in dem Gel elektroforetisch auf eine Polyvinylidendifluorid- (PVDF-) Membran überführt. Der Transferpuffer enthielt 25 mM Tris, 192 mM Glycin und 20% Methanol bei einem pH-Wert von 8,3. Der Transfer wurde bei 100 Volt für eine Stunde durchgeführt. Nach dem Transfer wurde die Membran für eine Stunde in einem Blockierungsmittel auf der Grundlage von Protein mit weitreichender Funktion unter sanfter Bewegung blockiert. Solche Blockierungsmittel enthalten Albumin-, Kasein- oder Trockenmilchlösung. Solch ein Blockierungsmittel ist handelsüblich als NAP-Sure blocker^TM erhältlich (Geno-Technology, Inc., St. Louis, MO). Immunfärbung wurde unter Verwendung von 7E11.C5-Antikörper oder monoklonalem Antikörper gegen ein α₁-Anitchymotrypsin mit einer Konzentration von 5 μg/ml, verdünnt in NAP-Sure blocker^TM (Geno-Technology, Inc., St. Louis, MO), für 1 h durchgeführt. Sekundärer Antikörper, mit Meerrettichperoxidase konjugiertes Ziege-Anti-Maus-IgG (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc. West Grove, PA) mit einer Verdünnung von 1:5.000 in 1% Albumin/PBS/0,1% Tween 20, wurde für 45 min mit der Membran inkubiert. Die Proteine wurden mit verstärktem Luminolreagens (ECL) für Meerrettichperoxidase nachgewiesen. Solch ein Reagens ist unter der Handelsmarke NEL 102 (NEN, Boston, MA) erhältlich. Das komplexierte Protein wurde dann einem Röntgenfilm ausgesetzt, um die positiven Banden sichtbar zu machen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt einen Western-Blot-Nachweis von PSMA in LNCaP-Zellextrakt und in einem Prostatakrebspatienten nach thiophiler Gelchromatographie. LNCaP-Zellextrakt oder Patientenserum wurde auf 3-S-thiophilem Gel Chromatographie unterzogen. Das Vorhandensein von PSMA in Säuleneluaten wurde durch SDS-PAGE und Western-Blot unter Verwendung von Anti-PSMA-Antikörper, 7E11.C5, nachgewiesen. "A" zeigt LNCaP-Zellextrakt und "B" zeigt Prostatakrebspatientenserum (Stadium T-3). Es wurden insgesamt vier verschiedene Präparationen von LNCaP-Zellextrakten und zehn Patientenseren im Stadium T₃ analysiert. Die Ergebnisse waren in allen Fällen im wesentlichen identisch.
2 zeigt eine Western-Blot-Analyse, die wiedergibt, daß PSMA in Patientenserum in der Form eines Komplexes zwischen diesem Antigen und α₁-Antichymotripsin vorliegt. Serum eines Prostatakrebspatienten im Stadium T₃ wurde auf einem 3S-T-Gel Chromatographie unterzogen, durch Western-Blot analysiert und mit Anti-PSMA-Antikörper immungefärbt, 7E11.C5 (Spur A) oder Anti-α₁-Antichymotripsin-Antikörper (Spur B). Mittels Anti-ACT-Antikörper wurden zwei Banden nachgewiesen, wobei die eine α₁-Antichymotropsin (untere Bande) und die andere dem PSMA-ACT-Komplex (obere Bande) entspricht. Das Vorhandensein von PSMA-ACT-Komplex wurde in 13 weiteren Patienten durch das gleiche Verfahren nachgewiesen.
3 zeigt einen Vergleich des Nachweises von PSMA-ACT-Komplex in Seren von Prostatakrebspatienten unter Verwendung von Sandwich-ELISA (A) und Western-Blot (B). PSMA wurde in jeder der Serumproben von Prostatakrebspatienten in den Stadien T₁, T₂, T₃ und T₄ nachgewiesen, C, Kontrollen, P, Prostatitis und BPH. Die gezeigten Daten umfassen 12 repräsentative Serumproben in verschiedenen Stadien der Krankheit und Kontrollen.
4 zeigt ein Diagramm der ELISA-Bestimmung von PSMA-ACT-Komplex in Patientenseren. Insgesamt wurden 130 Serumproben durch Sandwich-ELISA analysiert, welche normale Kontrolle (20), Prostatitis (9), BPH (46) und verschiedene Stadien von Prostatakrebs (55) umfaßten. Das Antigen wurde durch monoklonalen Anti-PSMA-Antikörper, 7E11.C5, eingefangen und mittels polyklonalem Anti-ACT-Antikörper nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in willkürlichen Einheiten ausgedrückt, die aus einer Standardkurve, die in jeder Mikrotiterplatte enthalten war, erhalten wurden. Der Standard besteht aus einer zweifachen Reihenverdünnung von vereinigten Seren von Patienten im T-3-Stadium, welche von einer Einheit (Verdünnung von 1:160) bis 100 Einheiten (Verdünnung von 1:5) reicht. Jeder Punkt repräsentiert eine Serumprobe. Das Diagramm zeigt sehr wenig Überlappung bei etwa 10 Einheiten mit Nicht-Prostatakrebs-Proben, welche im allgemeinen unter 10 liegen, und mit Prostatakrebsproben, die über 10 liegen.
5 zeigt eine Kalibrierung des ELISA hinsichtlich PSMA-ACT-Komplex. Vereinigte Serumprobe von drei Prostatakrebspatienten im T-3-Stadium wurde in Reihe verdünnt, und aliquote Teile von 50 μl wurden in dreifacher Ausfertigung auf Mikrotiterplatten, die mit Anti-PSMA-Antikörper beschichtet waren, gegeben. Anti-ACT-Antikörper wurde dazu verwendet, das Vorhandensein von PSMA-ACT-Komplex nachzuweisen. Als eine Kontrolle wurde normales Serum bei einer vergleichbaren Verdünnung verwendet. Der Standard besteht aus einer Reihenverdünnung von vereinigtem Serum, welches den Bereich von einer Einheit (Verdünnung von 1:160) bis 100 Einheiten (Verdünnung von 1:5) überspannt. Die hier gezeigten Ergebnisse geben sechs unabhängige Tests wieder.
6 zeigt einen Nachweis von PSMA in LNCaP-Zelllysat durch Isolierung mittels thiophiler Gelchromatographie, gefolgt von Western-Blot-Analyse unter Verwendung von (A) 7E11.C5-Antikörper und (B) B-6-Antikörper.
7 zeigt einen Vergleich von 7E11.C5- und B-6-Antikörpern beim Messen von PSMA-ACT-Komplex in den Seren von Prostatakrebspatienten mittels ELISA. Insgesamt wurden 58 Serumproben durch Sandwich-ELISA analysiert, welche normale Kontrollen (11), BPH (12) und Prostatakrebspatienten (35) umfaßten. Das Antigen wurde entweder durch monoklonalen 7E11.C5- oder monoklonalen B-6-Antikörper eingefangen und durch polyklonalen Anti-ACT-Antikörper nachgewiesen. Die übrigen Details sind so, wie sie zuvor beschrieben wurden. Die Ergebnisse sind in willkürlichen Einheiten ausgedrückt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Feststellen eines prostataspezifischen Membranantigens (PSMA) in einer PSMA enthaltenden Körperflüssigkeit durch einen Immuntest, welcher die Stufen umfaßt, bei denen man PSMA aus der Probe unter Verwendung eines PSMA-Antikörpers einfängt und das eingefangene PSMA mit einem Anti-α₁-Antichymotrypsin-Antikörper nachweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird PSMA unter Verwendung einer geeigneten Verdünnung von Anti-PSMA-Antikörper, Beschichten einer Oberfläche, wie der Oberfläche von Näpfen in einer Mikrotiterplatte, mit der resultierenden Lösung, Blockieren von unspezifischen Stellen auf der Oberfläche mit einer Blockierungslösung, wie Albumin, Verdünnen der Probe mit einem Blockierungspuffer, wie gepuffertem Albumin, und Aufbringen einer verdünnten Probe auf die Oberfläche zum Einfangen von PSMA eingefangen. Die Körperflüssigkeit ist vorzugsweise Serum, sie kann aber auch eine andere Flüssigkeit sein, wie Urin.
Eine bevorzugte Ausführungsform zum Feststellen von eingefangenem PSMA umfaßt die Stufen, bei denen man nicht eingefangenes Material durch Waschen der Oberfläche entfernt, einen in einer Blockierungslösung, wie Albuminlösung, verdünnten Anti-α₁-Antichymotrypsin-Antikörper aufbringt und gebundenes PSMA unter Verwendung eines sekundären Antikörpers, wie eines mit Peroxidase markierten Anti-Kaninchen-IgG, und eines Substrats, wie O-Phenylendiamin (OPD), feststellt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
"PSMA", wie es hierin verwendet wird, ist ein Antigen, das in Prostatatumor und in der Membran von LNCaP-Zellen vorhanden ist und welches mit α₁-Antichymotrypsin (ACT) komplexiert.
"Anti-α₁-Antichymotrypsin-Antikörper" (Anti-ACT-Antikörper) ist ein Antikörper, der spezifisch mit α₁-Antichymotrypsin komplexiert.
"PSMA-Antikörper", wie es hierin verwendet wird, bezeichnet einen Antikörper, der selektiv PSMA einfängt. Beispiele für PSMA-Antikörper sind 7E11.C5 (ATCC-Hinterlegungsnummer HB-10494, US-Patent 5,162,504) und B-6 (ATCC-Hinterlegungsnummer PTA-3160).
"Blockierungslösung" ist eine Lösung, die eine blockierende Verbindung mit einer breiten Vielfalt an Antigenen enthält und zum Blockieren von unspezifischen Bindungsstellen verwendet wird. Die gebräuchlichste Blockierungslösung ist eine Lösung von Albumin, üblicherweise Rinderserumalbumin (BSA). Andere Blockierungsverbindungen, wie Milchfeststoffe, Kasein oder gemischte Polysaccharide, können zur Herstellung einer Blockierungslösung verwendet werden.
"Blockierungspuffer" ist eine gepufferte Blockierungslösung. Der gebräuchlichste Puffer ist ein Phosphatpuffer. Wo Blockierungslösungen in mehr als einer Stufe für einen Nachweis mittels eines bestimmten Antikörpers verwendet werden, ist in den Blockierungslösungen üblicherweise die gleiche Blockierungsverbindung vorhanden.
Serumproben von 55 Prostatakrebspatienten, 9 Proben von Patienten, bei denen Prostatitis diagnostiziert wurde, 46 Proben von BPH-Patienten und 20 Serumproben von normalen Spendern wurden durch thiophile Adsorptionschromatographie, die selektiv PSMA zurückhält, verarbeitet. Isoliertes PSMA wurde mittels SDS-PAGE und Western-Blot unter Verwendung von 7E11.C5-Antikörper analysiert.
Es ist wesentlich, daß Serumproben vor einem PSMA-Nachweis in einer Western-Blot-Analyse durch thiophile Gelchromatographie verarbeitet werden. Jedoch ist im Falle einer PSMA-Bestimmung durch ELISA die Stufe der thiophilen Gelchromatographie nicht erforderlich. PSMA kann in dem Serum ohne jede Verarbeitung kontrolliert werden.
Doppelbestimmungs-ELISA wurde unter Verwendung von PSMA-Antikörper als einem "Einfang"-Antikörper für PSMA und polyklonalem Anti-α₁-Antichymotrypsin-Antikörper als einem "Nachweis"-Antikörper entwickelt. ELISA-Ergebnisse werden in willkürlichen Einheiten ausgedrückt, die von einer Standardkurve auf der Grundlage einer Verdünnung von vereinigten Seren von drei Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs erhalten wurden.
Ergebnisse: PSMA besitzt eine starke Affinität für thiophiles Gel. Chromatographie von Patientenserum an thiophilem Gel entfernt mehr als 90% der Proteine, einschließlich Albumin, und ermöglicht somit die Sichtbarmachung von PSMA in einer Western-Blot-Analyse als eine einzelne Bande, die ~ 75 bis 90 kDa entspricht, wenn sie mit dem PSMA-Antikörper gefärbt wird. Die Färbung war intensiver bei den Seren von Prostatakrebspatienten gegenüber nicht von Krebs hergeleiteten Seren (normal, Prostatitis und BPH). PSMA, das von der Prostatakrebszellinie LNCaP isoliert und in identischer Weise verarbeitet wurde, zeigte ebenfalls eine einzelne Bande, aber mit einem etwas höheren Molekulargewicht, das 100 bis 110 kDa entsprach. Ein direkter enzymgekoppelter Sandwich-Immunosorbenttest (ELISA) wurde für den Nachweis von Serum-PSMA entwickelt. Im ELISA werden PSMA-Mengen in willkürlichen Einheiten ausgedrückt, und die Ergebnisse korrelieren gut mit dem Stadium der Krankheit.
Herstellung von LNCaP-Zellextrakt
LNCaP-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC-Hinterlegungsnummer CRL1740, Rockville, MD) erhalten. Diese Zellen waren ursprünglich am Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY, isoliert und charakterisiert worden. Details bezüglich der Entwicklung und Charakterisierungen der Zellinie wurden von Horoszewicz et al., LNCaP model of prostatic carcinoma, Cancer Res, Band 43, S. 1809–1818, 1983, veröffentlicht.
Die LNCaP-Zellen wurden in vollständigem RPMI 1640-Wachstumsmedium (wie von G. Moore et al., AMA, B. 199, S. 519, 1967, veröffentlicht), das mit 10% fötalem Kälberserum und 1 mM L-Glutamin versetzt war, gehalten. Konfluente Einzellagen von LNCaP-Zellen wurden mit Trypsin behandelt, mit PBS gewaschen, und die Zellsuspension wurde bei –70°C in der Gegenwart von 1 μg/ml Proteaseinhibitor (Aprotinin, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) eingefroren. Nach einem weiteren Zyklus des Einfrierens und Auftauens wurde das Zelllysat bei 3.000 × g zentrifugiert, um die Kerne und unvollständig zerstören Zellen zu entfernen. Der Überstand wurde wieder eingestellt, so daß er 0,5% NP40 enthielt, und für 30 min bei 4°C auf den Rotationsmischer gestellt. Das gelöste Material wurde bei 15.000 × g für 30 min zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und bei –70°C bis zur Verwendung gelagert.
Serumproben
Serumproben von 110 Patienten (Prostatitis, BPH und Prostatakarzinom) und von 20 gesunden Spendern wurden in dieser Studie eingesetzt. Von den Patienten wurden 37 Blutproben während routinemäßiger ambulanter Besuche in der Klinik frisch abgenommen, und 18 Patientenserumproben wurden als archivierte Serumproben von der Abteilung für Labormedizin am Roswell Park Cancer Institute erhalten. Die übrigen 54 Patientenserumproben wurden von Patienten bei routinemäßigen Besuchen in urologischen Kliniken im Gebiet von West New York frisch abgenommen. Alle Serumproben wurden bei –70°C gefroren gehalten und innerhalb von 72 Stunden verarbeitet mit Ausnahme von archivierten Proben, die innerhalb von 90 Tagen nach dem Sammeln analysiert wurden. Alle Spender, einschließlich der normalen gesunden Individuen, gaben gemäß den örtlichen Richtlinienanforderungen schriftliche Einverständniserklärungen ab. Serumproben wurden bei –70°C bis zur Verwendung gefroren gehalten.
Antikörper
Die 7E11.C5-Hybridomzellinie (ATCC – HB-10494) und die B-6-Hybridomzellinie (ATCC-PTA 3160) werden in unserem Labor routinemäßig gehalten und wurden hinterlegt bei und sind erhältlich von der American Type Culture Collection. 7E11.C5-Antikörper und B-6-Antikörper wurden von Maus-Aszites durch Affinitätschromatographie gereinigt, wobei Protein-A verwendet wurde, das über chemisch stabile Amidbindungen (Affi-Gel Protein-A MAPS II-System, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) gemäß den veröffentlichten Anleitungen des Herstellers an Perlen mit vernetzter Agarose gekoppelt war. Monoklonale Antikörper 7E11.C5 und B-6 sind ein Maus-Immunglobulin (IgG1), das durch Immunisierung mit LNCaP-Zellen erzeugt wurde. Diese Antikörper reagieren mit membranreichen Fraktionen von LNCaP-Zellen, weisen aber keine Reaktivität mit Cytosol oder antigenen Substanzen, wie prostataspezifischem Antigen (PSA) oder Prostatasäurephosphatase (PAP), auf.
PSMA-Quantifizierung durch Doppelbestimmungs-ELISA
PSMA-Quantifizierung in unverarbeiteten Serumproben wurde wie folgt durchgeführt: Monoklonaler Antikörper 7E11.C5 wurde auf 5 μg/ml in 20 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,0, PBS, verdünnt und zur Beschichtung der Näpfe in einer Mikrotiterplatte über Nacht bei 4°C verwendet. Die Näpfe wurden mit 2% Rinderalbumin in PBS-Blockierungspuffer für eine Stunde blockiert. Die Blockierung und alle nachfolgenden Stufen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Testproben wurden mit Blockierungspuffer verdünnt und in dreifacher Ausfertigung auf die Platte aufgebracht (50 μl/Napf). Nach einer Stunde Inkubation wurden die Platten mit PBS gewaschen, und polyklonaler α₁-Antichymotrypsin-Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:2.000 in 1% Albumin in PBS/0,1% Tween 20 aufgebracht (50 μl/Napf). Gebundenes Antigen wurde durch mit Peroxidase markiertes Anti-Kaninchen-IgG und O-Phenylendiamin- (OPD-) Substrat nachgewiesen. Ein vereinigtes Serum von Krebspatienten im T₃-Stadium wurde als ein interner Standard verwendet, und die Ergebnisse sind in willkürlichen Einheiten ausgedrückt, die von einer Standardkurve abgeleitet sind, welche auf jeder Platte durchgeführt wurde.
Ergebnisse
Nachweis von PSMA in LNCaP-Zellextrakt und in Prostatakrebspatientenserum durch Western-Blot
In einer separaten Reihe von Experimenten haben wir gezeigt, daß PSMA eine starke Affinität für 3S-thiophiles Gel besitzt. LNCaP-Zellextrakt (1 ml; 5 × 10⁷ Zellen) oder Serum (400 μl) von Prostatakrebspatienten wurde auf einem 3S-T-Gel Chromatographie unterzogen, wie es zuvor beschrieben wurde. Zehn Mikroliter eluierter Fraktionen wurden SDS-PAGE/Western-Blot-Analyse unterzogen und mit dem 7E11.C5-Antikörper immungefärbt. Im Falle von LNCaP-Zellextrakt war es notwendig, die eluierten Fraktionen vor der SDS-PAGE-Analyse zu konzentrieren (6 ×). Säuleneluate von thiophiler Gelchromatographie wurden unmittelbar ohne jegliches Einfrieren analysiert. Die Ergebnisse eines solchen Experiments sind in 1 gezeigt. In verschiedenen Proben wurde nur eine Bande mit Immunreaktivität gesehen, welche 75 bis 90 kDa (Serum) oder 100 bis 110 kDa (LNCaP-Zellextrakt) entsprach. In allen Fällen hat PSMA, das von Patientenserum gewonnen wurde, ein niedrigeres Molekulargewicht im Vergleich zu PSMA in LNCaP-Zellen. Jedoch zeigten Säuleneluate von LNCaP-Zellextrakten nach wenigen Zyklen des Einfrierens und Auftauens häufig eine zweite schwache PSMA-Bande, die 180 kDa entsprach. Diese 180 kDa-Bande wurde von anderen beobachtet, z.B. von Troyer et al., supra. Thiophile Gelchromatographie entfernt deutlich viele Proteine in dem Serum, was einen PSMA-Nachweis nach elektroforetischer Auftrennung und Übertragung auf PVDF-Membrane erlaubt, wenn mit Anti-PSMA-Antikörper gefärbt wird. Keine Immunreaktivität wurde festgestellt, wenn 7E11.C5-Antikörper zum Färben von Western-Blots von Patientenserum vor einer thiophilen Gelchromatographie verwendet wurde.
Das Molekulargewicht von PSMA variiert in Abhängigkeit von seinem Ursprung: PSMA in LNCaP-Zellextrakten hat ein Molekulargewicht von 100 bis 110 kDa (Israeli et al., supra; und Troyer et al., supra); PSMA, das von Prostatakrebstumorgewebe isoliert wurde, hat 120 kDa (Troyer et al., supra). In unseren Studien haben wir beobachtet, daß PSMA in den Seren von verschiedenen Prostatakrebspatienten ein Molekulargewicht von etwa 75 bis 90 kDa hat (1). Die Gründe für diese Unterschiede sind nicht bekannt. PSA ist dafür bekannt, daß es mit verschiedenen Proteaseinhibitoren komplexiert (Polascik et al., supra). Es ist denkbar, daß auch PSMA mit verschiedenen Proteinen/Proteaseinhibitoren komplexiert. In unseren Studien haben wir solch eine Möglichkeit untersucht. Seren von Prostatakrebspatienten in verschiedenen Stadien der Krankheit wurden anfänglich durch thiophile Geladsorptionschromatographie verarbeitet und durch SDS-PAGE/Western-Blot analysiert. Nach dem Elektroblotten wurden die Membrane mit Anti-PSMA-Antikörper, 7E11.C5, oder mit monoklonalen Antikörpern gegen Proteaseinhibitoren, wie α₁-Antitrypsin, α₁-Antichymotrypsin und Protein-C-Inhibitor, gefärbt. Die in 2A wiedergegebenen Daten zeigen eine Bande der Immunreaktivität mit 7E11.C5-Antikörper. Keine Immunreaktivität wurde mit Antikörpern gegen α₁-Antitrypsin oder Protein-C-Inhibitor gesehen. Zwei Banden der Immunreaktivität wurden mit Antikörper gegen α₁-Antichymotrypsin gesehen, wobei eine dem PSMA/α₁-Antichymotrypsin-Komplex entspricht und die andere freiem α₁-Antichymotrypsin, von dem bekannt ist, daß es in dem Serum vor handen ist, entspricht (2B). In unseren früheren Studien (Daten nicht gezeigt) haben wir dokumentiert, daß freies α₁-Antichymotrypsin eine Affinität für thiophiles Gel besitzt.
Dies ist der erste Nachweis, daß PSMA in dem Serum als ein Komplex mit α₁-Antichymotrypsin vorliegt (PSMA-ACT). Versuche, solch einen Komplex durch Inkubieren von PSMA-Präparationen von LNCaP-Zellen mit weiblichem Serum oder mit kommerziell erhältlichem α₁-Antichymotrypsin herzustellen, waren nicht erfolgreich.
Feststellung von PSMA-ACT-Komplex in Prostatakrebspatientenserum durch Western-Blot und ELISA
Seren von 55 Prostatakrebspatienten in verschiedenen Stadien der Krankheit wurden zusammen mit einigen normalen (20), BPH- (46) und Prostatitis- (9) Serumproben in einem Blindversuch randomisiert und hinsichtlich des Vorhandenseins von PSMA analysiert. Alle Serumproben wurden anfänglich thiophiler Gelchromatographie unterzogen. Die Säuleneluate wurden hinsichtlich des Vorhandenseins von PSMA durch SDS-PAGE/Western-Blot-Analyse analysiert und mit 7E11.C5-Antikörper immungefärbt. Die in 3A wiedergegebenen Daten repräsentieren eines oder jedes der folgenden: Kontrolle, BPH, Prostatitis-Serum und Seren von 8 Prostatakrebspatienten in verschiedenen Stadien der Krankheit (T₁, T₂, T₃ und T₄). In allen Fällen wurde nur eine Bande der Immunreaktivität gesehen, die 75 bis 90 kDa entsprach. Die Intensität der Immunfärbung war signifikant höher in Seren von Krebspatienten im Vergleich zu nicht mit Krebs befallenen Patienten. Ähnliche Ergebnisse findet man unter Verwendung von Anti-PSMA-Antikörper B-6, siehe 6. Wir haben in den 2 und 6 dokumentiert, daß PSMA-ACT-Komplex in Patientenserum mit PSMA-Antikörper und Anti-α₁-Antichymotrypsin-Antikörper identifiziert werden kann. Diese Beobachtung lieferte erstmals eine Möglichkeit, einen ELISA-Test zur Überwachung des PSMA in Patientenserum durch Verwendung von PSMA-Antikörper, z.B. 7E11.C5 oder B-6, als einen "Einfang"-Antikörper und Anti-α₁-Antichymotrypsin-Antikörper als einen "Nachweis"-Antikörper zu entwickeln. Alle Serumproben, wie sie in 3B angegeben sind, wurden hinsichtlich des Vorhandenseins von PSMA-ACT-Komplex im Sandwich-ELISA analysiert. Die ELISA-Ergebnisse, wie sie in 3A gezeigt sind, sind als Absorption bei 490 nm ausgedrückt. Wie man sehen kann, sind die Mengen an PSMA-ACT in BPH oder Prostatitis niedrig im Vergleich zu fortgeschrittenerer Krankheit. Die Mengen an PSMA, wie sie durch Western-Blot-Analyse festgestellt wurden (3 bei B), entsprechen dem, was man im Sandwich-ELISA sehen kann (3 bei A). Da PSMA-ACT-Komplex in dem Serum nachgewiesen werden kann und aufgrund der Tatsache, daß derzeit keine auf Serum basierende PSMA-Präparation zur Verfügung steht, haben wir ein vereinigtes Serum von drei Prostatakrebspatienten (im T₃-Stadium) zur Herstellung von internen Standards verwendet, die für eine Durchmusterung der Seren verwendet werden sollten. Wir erhielten eine lineare Dosis-Reaktions-Kurve mit Serumverdünnungen im Bereich von 1:5 bis 1:160 (5). Insgesamt 130 Serumproben wurden hinsichtlich PSMA-ACT-Komplexmengen in diesem neu entwickelten Sandwich-ELISA untersucht, und die Ergebnisse sind in 4 wiedergegeben. PSMA-Ergebnisse sind in willkürlichen Einheiten ausgedrückt, welche von einer Standardkurve erhalten wurden, die auf jeder Platte durch geführt wurde. PSMA-Mengen in den Kontrollen, BPH und Prostatitis sind üblicherweise geringer als 10 Einheiten, wogegen die PSMA-Mengen in verschiedenen Stadien der Krankheit höher sind und üblicherweise gut mit dem Krankheitsfortschritt korrelieren. Diese Ergebnisse sind viel besser als der derzeitige PSA-Test, bei dem falsche positive routinemäßig wahre positive übertreffen.
Ein B-6-Hybridomklon wurde ursprünglich von einer ungeklonten Kultur von 7E11-Hybridomzellen isoliert, welche auch die Ausgangsquelle für 7E11.C5-Zellen sind. B-6-Hybridomzellen wurden in RPMI 1640-Medium, das 10% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum enthielt, eingebracht. B-6-Hybridomzellen wurden kältekonserviert.
Die Fähigkeit von B-6-Hybridomzellen, Antikörper herzustellen, der selektiv prostataspezifisches Membranantigen identifiziert, wurde durch drei verschiedene Verfahren bestätigt: (a) indirekte Immunperoxidasefärbung, (b) Western-Blot und (c) Sandwich-ELISA. Konditioniertes Medium von B-6-Zellen, welches Antikörper gegen PSMA enthielt, wurde für eine Immunfärbung von Prostatakrebszellen verwendet. B-6-Zellen wurden dazu verwendet, in Balb/c-Mäusen Aszites herzustellen, und gereinigter Antikörper wurde für ELISA- und Western-Blot-Analyse verwendet.
Herstellung und Reinigung von monoklonalem Antikörper
Balb/c-Mäuse im Alter von 6–8 Wochen wurden intraperitoneal mit B-6-Zellen injiziert (5 × 10⁶ Zellen/Maus in 0,5 ml PBS). Drei Wochen später wurde Aszites geerntet, und monoklonaler Antikörper (B-6) wurde zuerst durch Präzipitation mit Ammoniumsulfat, gefolgt von Protein-A-Agarose-Säulenchromatographie nach den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die Reinheit von IgG wurde durch SDS-PAGE und Coomassie-Blau-Färbung bestätigt. Die IgG-Konzentration wurde nach dem BCA-Testverfahren (Pierce, Rockford, IL) gemessen.
Indirekte Immunperoxidasefärbung
Für eine Immunfärbung wurden vier menschliche Prostatakrebszellinien (PC-3, PC-3M, DU-145, LNCaP) und zwei Linien von normalen menschlichen Fibroblastenzellen (BG-9, MLD) verwendet. Frisch hergestellte Cytospin-Abstriche von kultivierten Zellen, nicht fixiert und mit Formalin fixiert, wurden zuerst für 1 Stunde mit einer Blockierungslösung (1% Albumin in PBS) behandelt und anschließend für 1 Stunde mit B-6-konditioniertem Medium (1:500 verdünnt in Blockierungslösung), das B-6-Antikörper enthielt, inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Zellen mit PBS wurden sie einem mit Peroxidase konjugierten Ziege-Anti-Maus-IgG (Jackson Immune Research Laboratories) in einer Verdünnung von 1:10.000 für 60 min ausgesetzt. Die Farbreaktion wurde mit 3,3'-Diaminobenzidin (0,05%) : H₂O₂ (0,01%) in PBS, pH 7,2, entwickelt. PBS anstelle von primärem Antikörper und Kulturflüssigkeit von Myelomzellinie wurden als zusätzliche Kontrollen aufgenommen. Die Intensität von immunspezifischer Färbung wurde unter Verwendung eines Zeiss-Mikroskops (40× Objektiv; 10× Okular) beurteilt.
Keine der nicht-fixierten Zellinien zeigte irgendeine Immunreaktivität mit B-6-Antikörper. Unter den mit Formalin fixierten Zellen zeigten nur LNCaP-Zellen spezifische Immunreaktivität mit B-6-Antikörper. Die Intensität der Immunperoxidasefärbung von LNCaP-Zellen ist vorherrschend in der Transmembranregion. Keine solche Immunreaktivität wurde mit fixierten PC-3-, PC-3M-, DU-145-, BG-9- und MLD-Zellen beobachtet.
Western-Blot-Analyse
Zelllysat von LNCaP, PC-3 und DU-145 wurde für Western-Blot-Analyse unter Verwendung von B-6-Antikörper verwendet. Die Zellen wurden mit Trypsin behandelt, mit PBS gewaschen und zwei Zyklen des Einfrierens und Auftauens unterzogen. Das Zelllysat wurde bei 2.000 × g für 10 min zentrifugiert, und der Überstand wurde für 30 min bei 4°C nach Zugabe von NP-40 (0,5% Endkonzentration) inkubiert. Das solubilisierte Material wurde bei 10.000 × g für 20 min zentrifugiert, und der Überstand wurde für 3S-T-Gelchromatographie, wie zuvor beschrieben, verwendet. Die Fraktionen aus der T-Gel-Säule, welche PSMA enthielten, wurden vereinigt, konzentriert (6×) und 4–15%-iger SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen unterzogen. Nach elektroforetischem Transfer auf PVDF-Membran wurde PSMA-Antigen mittels B-6-Antikörper identifiziert.
Zelllysat von DU-145- und PC-3-Zellen zeigte keine Immunreaktivität mit B-6-Antikörper. Jedoch wurde eine einzelne immunreaktive Bande, die 100 bis 110 kDa entsprach, im Falle der LNCaP-Zellpräparation gesehen. In einem separaten Experiment wurde LNCaP-Zelllysat parallel sowohl mit B-6- als auch 7E11.C5-Antikörpern sondiert. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Beide Antikörper waren in der Lage, PSMA-Antigen in LNCaP-Zelllysat zu identifizieren.
ELISA
B-6- und 7E11.C5-Antikörper wurden dazu verwendet, PSMA in dem Serum von Prostatakrebspatienten durch ELISA-Test zu messen. Seren von normalen Individuen und Patienten mit BPH wurden ebenfalls aufgenommen. 96-Napf-Immunplatten wurden in zwei gleiche Hälften aufgeteilt, eine Hälfte für die Beschichtung mit B-6-Antikörper und die andere Hälfte für die Beschichtung mit 7E11.C5-Antikörper. Jede Hälfte der Platte hatte ihren eigenen internen Standard hinsichtlich PSMA. Die übrigen Details des ELISA-Verfahrens gleichen denjenigen, die zuvor beschrieben wurden. Die Ergebnisse dieses Tests sind in 7 gezeigt. Für jedes Serum ist der Index von PSMA-Antigen im wesentlichen identisch bei sowohl B-6- als auch 7E11.C5-Antikörpern.
Auf der Grundlage der Ergebnisse von ELISA- und Western-Blot-Analyse ist klar, daß sowohl B-6- als auch 7E11.C5-Antikörper erfolgreich zum Feststellen des Vorhandenseins von PSMA in den Seren von Prostatakrebspatienten verwendet werden können. Die Menge an PSMA in Krebspatienten ist signifikant höher im Vergleich zu BPH oder Prostatitis.
Wir haben Serum-PSMA-Mengen sowohl durch ELISA als auch durch Western-Blot-Analyse überwacht. Für die Western-Blot-Analyse wurde das Serum an einem 3S-thiophilen Gel Chromatographie unterzogen, was einen Großteil der Serumproteine entfernte. Das Serum nach der thiophilen Gelverarbeitung wurde mittels SDS-PAGE und Western-Blot unter Verwendung von PSMA-Antikörper analysiert. In allen Fällen wurde eine einzelne PSMA-Bande gesehen, die 75 bis 90 kDa entsprach. Insgesamt wurden 130 Serumproben verarbeitet. Ein repräsentatives Ergebnis, welches Prostatakrebspatientenseren, BPH-, Prostatitis- und normale Seren einschließt, ist in 3B ge zeigt. Es ist erwähnenswert, daß das Molekulargewicht von PSMA, das in dem Serum und in Extrakten von LNCaP-Zellen vorhanden ist, verschieden ist. Serum-PSMA hat 75 bis 90 kDa, wogegen PSMA von LNCaP-Zellen 100 bis 110 kDa hat. Das Molekulargewicht von PSMA von LNCaP-Zellen blieb sowohl unter reduzierenden als auch unter nicht-reduzierenden Bedingungen gleich. Jedoch ist PSMA aus dem Serum unter reduzierenden Bedingungen im Western-Blot nicht nachweisbar. Da nun zusätzliche Antikörper gegen PSMA zur Verfügung stehen (Liu et al., supra, und Grauer et al., supra), wurden Versuche unternommen, einen Immuntest zur Überwachung von PSMA-Mengen in verschiedenen Körperflüssigkeiten zu entwickeln. Sokoloff et al. haben einen zweifachen monoklonalen Sandwich-Test für PSMA entwickelt (Sokoloff et al., A dual-monoclonal sandwich assay for prostate-specific membrane antigen: Levels in tissues, seminal fluid and urine, Prostate, Band 43, S. 150–157, 2000). Sie waren erfolgreich beim Messen von PSMA-Mengen in Gewebeextrakten, in Urin und in Samenflüssigkeit. Jedoch waren ihre Versuche, PSMA-Mengen im Serum zu kontrollieren, nicht erfolgreich. Unsere Versuche, PSMA-Mengen im Serum zu überwachen, waren erfolgreich. Dieser Erfolg war weitestgehend auf die erstmalige Erkenntnis zurückzuführen, daß PSMA im Serum als ein Komplex mit α₁-Antichymotrypsin vorliegt (PSMA-ACT). In unserem Sandwich-ELISA haben wir einen PSMA-Antikörper, 7E11.C5 und B-6, als "Einfang"-Antikörper und einen Anti-α₁-Antichymotrypsin-Antikörper als den "Nachweis"-Antikörper verwendet.
Es ist bekannt, daß PSMA ein Transmembranglycoprotein ist. Es ist auch bekannt, daß ein PSMA-Antikörper nur an den NH₂-Terminus von PSMA bindet. PSMA, wie es in dem Serum festgestellt wird, muß ein Fragment dieses Antigen enthaltenden Epitops für PSMA sein, und wenn es mit ACT einen Komplex bildet, erlangt es das Molekulargewicht von 75 bis 90 kDa.
PSMA-Nachweis in der Western-Blot-Analyse war erst ausführbar, nachdem LNCaP-Zellextrakte durch thiophile Gelchromatographie verarbeitet worden waren, welche wirkungsvoll den Hauptteil an störenden Proteinen entfernte. Die Molekulargewichte von PSMA in Extrakten von LNCaP-Zellen und in dem Serum sind verschieden. Serum-PSMA hat 75 bis 90 kDa, wogegen PSMA in LNCaP-Zellen 100 bis 110 kDa hat. Erstmals kann Serum-PSMA durch Sandwich-ELISA nachgewiesen werden. Offensichtlich wird ein Fragment von PSMA, das ein Epitop für 7E11.C5- oder B-6-Antikörper enthält, in das Serum freigesetzt, welches dann mit α₁-Antichymotrypsin unter Ausbildung eines PSMA-ACT-Komplexes komplexiert. Dies stellt die Grundlage für den neu entwickelten ELISA-Test dar. In unserem ELISA-Test wurde der 7E11.C5- oder B-6-Antikörper zum Einfangen von PSMA verwendet, und der Nachweis beruhte auf der Verwendung von α₁-Antichymotrypsin-Antikörper. Die Menge an PSMA, wie sie durch ELISA festgestellt wird, korreliert gut mit dem Stadium der Krankheit.

Claims

Verfahren zum Feststellen eines prostataspezifischen Membranantigens (PSMA) in einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß das PSMA durch einen Immuntest festgestellt wird, welcher die Stufen umfaßt, bei denen man PSMA aus einer Körperflüssigkeitsprobe, die PSMA enthält, unter Verwendung eines PSMA-Antikörpers einfängt und das eingefangene PSMA mit einem Anti-α₁-Antichymotrypsin-Antikörper feststellt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das PSMA unter Verwendung eines PSMA-Antikörpers eingefangen wird, indem man den PSMA-Antikörper verdünnt, eine Oberfläche mit der resultierenden Lösung beschichtet, unspezifische Stellen auf der Oberfläche blockiert, die Probe mit einem Blockierungspuffer verdünnt und eine verdünnte Probe in die Gefäße zum Einfangen von PSMA einbringt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eingefangenes PSMA mit Anti-α₁-Antichymotrypsin-Antikörper festgestellt wird, indem man die Gefäße zur Entfernung von nicht eingefangenem Material wäscht, in Blockierungslösung verdünnten Anti-α₁-Antichymotrypsin-Antikörper einbringt und gebundenes PSMA unter Verwendung von Peroxidase, die mit Anti-Kaninchen-IgG und OPD-Substrat markiert ist, feststellt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Serum ist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Serum ist.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Serum ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Urin ist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Urin ist.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Urin ist.