[go: up one dir, main page]

DE69938623T2 - Microarrays und ihre verwendungen - Google Patents

Microarrays und ihre verwendungen Download PDF

Info

Publication number
DE69938623T2
DE69938623T2 DE69938623T DE69938623T DE69938623T2 DE 69938623 T2 DE69938623 T2 DE 69938623T2 DE 69938623 T DE69938623 T DE 69938623T DE 69938623 T DE69938623 T DE 69938623T DE 69938623 T2 DE69938623 T2 DE 69938623T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
antibodies
cells
antibody
protein
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69938623T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69938623D1 (de
Inventor
James P. Anchorage HOEFFLER
Joseph M. Carlsbad Fernandez
Marc S. San Diego Nasoff
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Life Technologies Corp
Original Assignee
Invitrogen Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Invitrogen Corp filed Critical Invitrogen Corp
Publication of DE69938623D1 publication Critical patent/DE69938623D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69938623T2 publication Critical patent/DE69938623T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/548—Carbohydrates, e.g. dextran
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00608—DNA chips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/0061—The surface being organic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00612—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports the surface being inorganic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/00626—Covalent
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00632—Introduction of reactive groups to the surface
    • B01J2219/00637—Introduction of reactive groups to the surface by coating it with another layer
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00639—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium
    • B01J2219/00641—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium the porous medium being continuous, e.g. porous oxide substrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659—Two-dimensional arrays

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die hier dargelegte Erfindung bezieht sich auf eine neue Methode zur Verwendung von Microarray-Technologien. Die Methode ist nützlich zur Charakterisierung von verschiedenen Gewebe und Zellen durch Proteinanalyse.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Neueste bahnbrechende Entwicklungen in der Technologie der Nukleinsäure-Sequenzierung haben die Sequenzierung von ganzen Genomen einer Vielfalt von Organismen, einschließlich des Menschen, ermöglicht. Die möglichen Vorteile der Sequenzierung eines kompletten Genoms sind vielseitig und reichen von Anwendungen im medizinischen Bereich bis zum besseren Verständnis evolutionärer Prozesse. Dennoch können diese Vorteile, ohne zu verstehen wie und wo diese neu sequenzierten Gene funktionieren, noch nicht vollständig realisiert werden.
  • Traditionell beginnt das funktionelle Verstehen mit dem Erkennen einer Aktivität, der Isolierung eines Proteins, das mit dieser Aktivität assoziiert ist, und darauf folgt die Isolierung des Gens oder der Gene, die dieses Protein kodieren. Das isolierte Protein wurde außerdem zur Herstellung von Antikörper-Reagenzien verwendet. Spezifische Antikörper und Fragmente der isolierten Gene wurden beide dazu verwendet, Gewebeexpression und -funktion zu untersuchen.
  • Verschiedenen Methoden sind dazu verwendet worden, Proteinexpressionsmuster zu untersuchen, einschließlich in situ Hybridisierungsstudien von Gewebebereichen und Northernblots. Diese Methoden sind nicht nur zeitaufwendig man benötigt auch relativ große Mengen an Material, um erfolgreich sein zu können.
  • Antikörper, die an spezifische Antigene binden, sind durch eine Vielzahl von Methoden produziert worden, einschließlich der Immunisierung von Tieren, der Fusion von Milzzellen von Säugetieren mit immortalisierten Zellen zur Herstellung von Hybridomazellen, der Herstellung von zufälligen Peptiden mit Hilfe von Phagen- oder Bakterien-Display und mit beschränkten Peptid-Bibliotheken. Ungeachtet dessen, wie der gewünschte Antikörper hergestellt wurde, die zurzeit erhältlichen Methoden zur Identifizierung eines Antikörpers mit einer bestimmten Spezifität sind allgemein aufwendig und können nicht dazu verwendet werden, eine große Anzahl von Unbekannten gleichzeitig zu testen.
  • Eine Methode beinhaltet die Bindung des Antigens an eine poröse Membran, wie zum Beispiel Nitrozellulose, den Kontakt der Membran mit einer Quelle von Test-Antikörpern und schließlich die Bestimmung ob oder ob nicht die Antikörper an das Antigen gebunden haben. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung einer Quelle von Test-Antikörpern pro Stück poröse Membran, was die Methode nicht nur unbequem macht sondern auch eine Materialverschwendung darstellt.
  • Antikörper/Antigen-Reaktionen können auch in Plastikplatten, wie zum Beispiel 98-Well Mikrotiterplatten, mit Methoden, die ähnlich zu den oben beschriebenen sind, evaluiert werden, Diese Methode wird ebenfalls durch die Anzahl der Proben, die in einem Assay getestet werden können, limitiert, daher benötigt man viele Assays, um eine große Anzahl unbekannter Antikörper zu bewerten. Chang ( US Patent Nr 4,591,570 ausgestellt am 27. Mai 1986) beschreibt einen Array mit einer begrenzten Anzahl charakterisierter Antikörper bekannter Antigene auf einer Oberfläche aus Glas, der dazu verwendet werden kann, spezifische Antigene an der Oberfläche von ganzen Zellen zu binden.
  • Kürzlich neu aufgekommene Techniken ermöglichen die Kreation von Microarrays mit Tausenden oder Millionen unterschiedlicher Elemente. Diese Array-Technologie ist hauptsächlich zur Gestaltung von Arrays mit individuellen Nukleinsäuren verwendet worden (siehe zum Beispiel, Marshall and Hodgson, Nature Biotech. 16: 27–31, 1998; Ramsay, Nature Biotech. 16: 40–44, 1998), insbesondere für kurze, in situ synthetisierte Oligonukleotide.
  • Ein früheres Dokument von Ekins et al (Int, Fed. Clin. Chem Ausg. 9 Nr. 3 1997-09) beschreibt eine Methode über die Verwendung eines Arrays mit RNA-Proben zur Identifizierung unterschiedlicher Genexpression in pathologischen bzw. gesunden Gewebeproben. WO97/10365 beschreibt auch das Monitoring von Expressionsleveln einer Zelle mittels eines Microarrays mit RNA-Proben.
  • Benötigt werden Methoden zum einfachen und schnellen Screening einer großen Anzahl von Antikörpern zur Charakterisierung von Geweben und Zellen mittels Proteinanalyse. Die hier beschriebene Erfindung befasst sich mit dieser Notwendigkeit.
  • Kurzbeschreibung der Erfindung
  • Die hier dargelegte Erfindung umfasst Methoden zur Verwendung von Microarrays zur Vereinfachung der Analyse und Charakterisierung von Genen und deren Funktion.
  • Die Erfindung bietet Methoden zum Vergleich der Proteinexpression von zwei oder mehreren Populationen von Zellen, wobei die Methode umfasst:
    • (a) den Kontakt eines Arrays mit Antikörpern auf einer festen Oberfläche mit einem Zelllysat einer ersten Zellpopulation zur Generierung eines ersten Bindungsmusters;
    • (b) den Kontakt einer zweiten Ausfertigung des Arrays mit Antikörpern auf einer festen Oberfläche mit einem Zelllysat einer zweiten Zellpopulation zur Generierung eines zweiten Bindungsmusters; und
    • (c) den Vergleich der Bindungsmuster des ersten Zelllysates mit dem Bindungsmuster des zweiten Zelllysats.
  • Vorzugsweise ist die Bindungsspezifität der Antikörper nicht charakterisiert.
  • Vorzugsweise sind die Antikörper rekombinant.
  • Bei der Erfindung wird bevorzugt, dass das erste Zelllysat von normalen Zellen stammt während das zweite Zelllysat von anormalen Zellen stammt.
  • Die anormalen Zellen können Krebszellen sein.
  • Alternativ dazu kann das erste Zelllysat von normalen Zellen während eines Ruhestadiums stammen und das zweite Zelllysat von normalen Zellen in einem stimulierten Zustand.
  • Vorzugsweise wird der Unterschied zwischen dem ersten und dem zweiten Zelllysat durch unterschiedliche, nachweisbare Markierung sichtbar.
  • Kurzbeschreibung der Abbildungen
  • Die 1A, 1B und 1C zeigen Microarrays von Antikörpern, die an positiv geladene Nylonmembran gebunden wurden, mit dem Antigen reagiert haben und mit nicht fluoreszenten Mitteln nachgewiesen wurden.
  • 2 zeigt ein Microarray hergestellt mit Hilfe eines Array-Roboters. Die Antigen-Bindung ist mit nicht fluoreszenten Mitteln nachgewiesen worden.
  • 3 zeigt die Fähigkeit der Antikörper-Microarrays, die relativen Bindungsaffinitäten zu einem spezifischen Antigen zu evaluieren.
  • 4 zeigt einen Microarray mit monoklonalen Antikörpern im Vergleich zu einem Microarray mit polyklonalen Antikörpern.
  • Die 5A, 5B und 5C zeigen einen Microarray mit Antikörpern, die mit einem Zelllysat unter Bedingungen reagiert haben, die die Menge an Hintergrundbindung variiert.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Methoden zur Verwendung von Microarrays, um die Analyse und Charakterisierung von Genen und deren Funktion zu vereinfachen.
  • Bei der Erfindung werden Microarrays mit Antikörpern verwendet, um Proteinexpressionsprofile von Zellen zu vergleichen. Zum Beispiel können Vergleiche zwischen einer Population von Zellen eines Gewebes, wie zum Beispiel arterielle Endothelialzellen, und einem zweiten Gewebe, wie zum Beispiel venöse Endothelialzellen oder Zellen, die von einem bestimmten Gewebe aber unterschiedlichen Spezies stammen, gemacht werden. Die Vergleiche können zwischen normalen Zellen und Zellen vom selben Gewebetyp, die von einer Person mit einer pathogenen Funktionsstörung stammen, gemacht werden. Zum Beispiel können Vergleiche zwischen normalen Zellen und Krebszellen angestellt werden. Zusätzlich können Vergleiche zwischen Zellen in einem Ruhestadium und Zellen in einem aktivierten Stadium gemacht werden, zum Beispiel zwischen ruhenden T-Zellen und aktivierten T-Zellen.
  • Bei einem anderen Beispiel haben die dargelegten Arrays einen Nutzen für die Bewertung von Proteinexpressionen bei Pathogenen, wie zum Beispiel Bakterien, Parasiten, Viren und Ähnlichem. Eine aus den Pathogenen hergestellte Lösung (wie zum Beispiel ein Lysat), das alle von den Pathogenen exprimierte Proteine repräsentiert, kann dazu verwendet werden, den Antikörper-Array zur Identifizierung antigenerkennender, pathogen-exprimierter Proteine zu kontaktieren. Diese Antikörper haben einen Nutzen als diagnostische Agenzien sowie als potentielles Therapeutikum.
  • In einer bevorzugten Ausführungsart werden uncharakterisierte Antikörper an eine feste Oberfläche eines Array-Formats gebunden, das aus getrennten Spots besteht, deren räumliche Position einfach bestimmt werden kann. Jede Position repräsentiert einen Antikörper aus einer bekannten Quelle, wie zum Beispiel ein bestimmtes Hybridom, das in einem Well in einer 96-Well Mikrotiterplatte wächst. Der Raum zwischen den Antikörperspots wird behandelt, um unspezifische Bindung an den festen Träger zu verhindern. Die aufgetragenen Antikörper werden dann in Kontakt mit einem Antigen oder mit einem Set von Antigenen gebracht für den spezifische Antikörper gesucht werden. Die Antigenlösung wird für einen bestimmten Zeitraum, der notwendig ist zur Ausbildung des Antigen:Antikörper Komplexes, in Kontakt mit dem Array belassen (normalerweise 10 Minuten bis 2 Stunden), dann werden die ungebundenen Antigene unter geeigneten Bedingungen abgewaschen. Das gebundene Antigen wird mittels einer Nachweismethode aus Vielen an einem bestimmten Antikörper-Spot nachgewiesen und damit wird die Quelle des Antikörpers identifiziert, der für ein bestimmtes Antigen spezifisch ist.
  • Der Begriff "Antikörper" wird hier im weitesten Sinne verwendet und umfasst insbesondere intakte monoklonale Antikörper, multispezifische Antikörper (z. B. biospezifische Antikörper) aus mindestens zwei Antikörpern gebildet und Antikörperfragmente einschließlich einzelkettige Antikörper solange sie die gewünschten Bindungseigenschaften, wie hier beschrieben, zeigen.
  • Viele in Fachkreisen gut bekannte Verfahren können für die Herstellung polyklonaler Antikörper eines Epitops oder eines Antigens von Interesse verwendet werden. Ein Wirtstier einer beliebigen Anzahl von Spezies, wie zum Beispiel Hasen, Gänse, Schaf, Pferd, Kuh, Mäuse, usw. wird durch Injektion einer Antigenpräparation immunisiert, die aus Zellen oder von Mikroorganismen isoliert werden kann oder rekombinant oder genetisch hergestellt sein kann. Viele in Fachkreisen bekannte Adjuvanzien können dazu verwendet werden, die Produktion von Antikörpern durch den immunisierten Wirt zu steigern, wie zum Beispiel das Freud'sche Adjuvans (vollständig oder unvollständig), Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie zum Beispiel Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Keyhole Limpet Hämocyanine, Dinitrophenol, Liposomen und möglicherweise nützliche humane Adjuvanzien, wie zum Beispiel BCG (Bacille Calmette-Guerin) und Propionibacterium acanes, und Ähnliches.
  • Der Begriff "monoklonaler Antikörper", wie hier verwendet, bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen wurde. Zum Beispiel sind die einzelnen Antikörper, die eine Population umfassen, identisch, mit Ausnahme möglicher, natürlich vorkommender Mutationen, die zu einem geringen Ausmaß vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper sind hochspezifisch und gegen eine einzelne antigene Stelle gerichtet. Darüber hinaus ist jeder monoklonale Antikörper gegen eine einzelne Determinante des Antigens gerichtet, während konventionelle (polyklonale) Antikörperpräparationen typischerweise mehrere Antikörper umfassen, die gegen unterschiedliche Determinanten (Epitope) gerichtet sind. Bevorzugte Antikörper sind mAks, die zu jeder Immunoglobulinklasse, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA und jeder Unterklasse oder jedem Isotyp davon, gehören können.
  • Zusätzlich zu ihrer Spezifität haben monoklonale Antikörper den Vorteil, dass sie aus Hybridomkulturen, nicht kontaminiert durch andere Immunoglobuline, synthetisiert werden können. Der Modifikator "monoklonal" weist darauf hin, dass der Antikörper aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern gewonnen wurde und ist nicht so auszulegen, dass zur Produktion des Antikörpers irgendeine besondere Methode nötig war. Zum Beispiel können monoklonale Antikörper, die gemäß der vorliegenden Erfindung genutzt werden, nach der Hybridomtechnik hergestellt werden, die zuerst von Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975) beschrieben wurde oder aus einer Phagen-Antikörper-Bibliothek mittels der Techniken, die zum Beispiel bei Clackson et al., Nature, 352: 624–628 (1991) und Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581–597 (1991) beschrieben wurden, isoliert werden.
  • Die monoklonalen Antikörper, die zur Verwendung in Betracht kommen, umfassen "chimäre" Antikörper (Imunoglobuline), bei denen ein Teil der schweren und/oder leichten Kette identisch oder homolog ist zu entsprechenden Sequenzen in den Antikörpern bestimmter Spezies oder zu einer bestimmten Antikörperklasse oder -unterklasse gehört, während der Rest der Kette(n) identisch oder homolog ist zu entsprechenden Sequenzen in den Antikörpern anderer Spezies, sowie Fragmente dieser Antikörper, solange sie die gewünschte biologische Aktivität zeigen ( U.S. Patent Nr. 4,816,567 ; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851–6855 (1984)).
  • "Humanisierte" Formen nicht-humaner (z. B. mäuseartiger) Antikörper sind chimäre Immunoglobuline, Immunoglobulinketten oder Fragmente davon (wie zum Beispiel Fv, Fab, Fab', F(ab')2 oder andere antigenbindende Untersequenzen von Antikörpern), die minimale Sequenzen aus nicht-humanen Immunoglobulinen enthalten. Größtenteils sind humanisierte Antikörper humane Immunoglobuline (Empfängerantikörper) bei denen die Reste einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Empfängers durch Reste einer CDR einer nicht-humanen Spezies, wie zum Beispiel Maus, Ratte oder Hase, ersetzt werden, die die gewünschte Spezifität, Affinität und Kapazität zeigen. In einigen Fällen werden die Reste der Fv umgebenden Bereiche (FR) durch entsprechende nicht-humane Reste ersetzt. Darüber hinaus können humanisierte Antikörper Reste beinhalten, die weder im Empfängerantikörper noch in den importierten CDR Sequenzen oder Sequenzen der umgebenden Bereiche (FR) auftreten. Diese Modifikationen werden zur Verfeinerung und Steigerung der Leistungsfähigkeit der Antikörper gemacht. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen mindestens eine, typischerweise zwei, variable Domänen, in denen alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen denen eines nicht-humanen Immunoglobulins entsprechen, und alle oder im Wesentlichen alle FR-Regionen menschliche Immunoglobulinsequenzen darstellen. Der humanisierte Antikörper umfasst optimalerweise mindestens auch einen Teil der konstanten Region der Immunoglobuline (Fc), typischerweise des menschlichen Immunoglobulins. Für weitere Einzelheiten siehe Jones et al., Nature, 321: 522–525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323–329 (1988) und Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593–596 (1992). Die humanisierten Antikörper schließen einen PRIMATIZEDTM Antikörper mit ein, bei dem die antigenbindende Region des Antikörpers durch einen Antikörper gewonnen wird, der durch die Immunisierung eines Makakenaffen mit dem Antigen von Interesse hergestellt wird.
  • "Antikörperfragmente" umfassen einen Teil eines intakten Antikörpers, vorzugsweise die antigenbindende oder die variable Domäne eines intakten Antikörpers. Beispiele solcher Fragmente schließen Fab, Fab', F(ab')2, und Fv Fragmente; Diabodies; lineare Antikörper (Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057–1062 (1995)); einzelkettige Antikörpermoleküle und multispezifische Antikörper aus Antikörperfragmenten mit ein.
  • Einzelkettige Antikörper sind zur Anwendung in der Erfindung besonders bevorzugt. "Einzelkettige" oder "sFv" Antikörper sind Antikörperfragmente, die VH und VL Domänen eines Antikörpers umfassen, wobei diese Domänen auf einer einzelnen Polypeptidkette liegen. Vorzugsweise tragen die Fv Polypeptide zusätzlich einen Polypeptidlinker zwischen den VH und VL Domänen, der den sFvs die zur Antigenbindung benötigte Struktur verleiht. Als Überblick über sFvs siehe Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Ausg. 113, Rosenburg and Moore Herausgeber, Springer-Verlag, New York, Seiten 269–315 (1994).
  • Große Mengen einzelkettiger Antikörper mit uncharakterisierter zufälliger Bindungsspezifität können, unter Verwendung mehrerer in Fachkreisen bekannter Methoden, erzeugt werden. Rekombinante Antikörper Bibliotheken können zum Beispiel in filamentösen Phagenpartikeln hergestellt werden (Daniels and Lane, Methods 9(3): 494–507, 1996; Reichmann and Weill, Biochemistry 32(34): 9848–8855; Rader and Barbas, Curr Opin Biotechnol 9(4): 503–508, 1997; Iba and Kurosawa, Immunol Cell Biol 75(2): 217–221, 1997, WO 90/05144 , WO 92/01047 , WO 92/20791 , WO 93/19172 , GB 9722131.8 , GB9810228.8 und GB 9810223.9 ) oder gleichermaßen in Hefe, Bakterien oder Ähnlichem. Andere Methoden zur Herstellung von zufälligen Bibliotheken von sFvs schließen verschiedenen Festphasen-Synthesemethoden mit ein.
  • Der Begriff "Diabodies" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigenbindestellen, deren Fragmente eine variable Domäne einer schweren Kette (VH) verbunden mit einer variablen Domäne einer leichten Kette (VL) in einer Polypeptidkette (VH-VL) umfassen. Durch die Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um die Paarung der beiden Domänen der selben Kette zu ermöglichen, sind die Domänen dazu gezwungen, sich mit den komplementären Regionen einer anderen Kette zu paaren und zwei Antigenbindestellen zu erzeugen. Diabodies werden zum Beispiel ausführlich in EP 404,097 ; WO 93/11161 ; und Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444–6448 (1993) beschrieben.
  • Die in dieser Erfindung verwendeten Antikörper können vor der Herstellung eines Microarrays isoliert werden. Ein "isoliertes" Molekül, ob Antikörper, Antigen oder Nukleinsäure, ist aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung identifiziert und getrennt und/oder wieder gewonnen worden. Kontaminierende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die bestimmte Anwendungen des Moleküls beeinträchtigen, und Enzyme, Hormone und andere proteinöse oder nicht-proteinöse gelöste Stoffe beinhalten können. In bevorzugten Ausführungsarten wird das Protein gereinigt (1) zu 95% (Gewichtsprozent) oder am besten 99% (Gewichtsprozent), bestimmt nach der Lowry-Methode, (2) zu einem Grad, der ausreichend ist zur Sequenzierung von mindestens 15 Resten der N-terminalen oder einer internen Aminosäuresequenz mit einem Zentrifugenröhrchen-Sequenzierer oder (3) zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter reduzierenden oder nichtreduzierenden Bedingungen mit Coomassie blue oder vorzugsweise Silberfärbung. Isoliertes Protein beinhaltet das Protein in situ in rekombinanten Zellen, wenn mindestens eine Komponente aus der natürlichen Umgebung des Proteins nicht vorhanden ist. Gewöhnlich jedoch wird isoliertes Protein durch mindestens einen Aufreinigungsschritt präpariert. Ungereinigte Antikörper, zum Beispiel aus Serum, können genauso in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Eine besonders nützliche Methode zur Isolierung von Antikörpern, wie zum Beispiel einzelkettige Antikörper aus Zellextrakt, ist die Affinitätsreinigung. Harze, die zur Antikörperreinigung geeignet sind, sind in Fachkreisen gut bekannt, zum Beispiel Protein A Sepharose. Ein rekombinanter Antikörper mit einem Tag zur Affinitätsreinigung, der die Aufreinigung ermöglicht, kann konstruiert werden. Harze, die zur Antikörperreinigung geeignet sind, sind in Fachkreisen gut bekannt, zum Beispiel Protein A Sepharose
  • Tags zur Affinitätsreinigung sind gewöhnlich Peptidsequenzen, die mit einem Bindungspartner interagiren, der an einen festen Träger immobilisiert wird. Synthetische DNA Sequenzen kodieren verschiedene aufeinander folgende Aminosäuren, wie zum Beispiel Histidine, die fusioniert an das exprimierte Protein zur Einschritt-Aufreinigung des rekombinanten Proteins, durch hohe Affinitätsbindung an eine Harzsäule, wie zum Beispiel Nickelsepharose, genutzt werden können. Eine Endopeptidase Erkennungssequenz kann zwischen dem Polyaminosäure-Tag und dem Protein von Interesse konstruiert werden, so dass das Leaderpeptid durch Verdau mit Enterokinase oder anderen Proteasen entfernt werden kann. Sequenzen, die Proteine kodieren wie zum Beispiel die Chitin-Bindedomäne (die Chitin bindet), Biotin (das Avidin und Straptavidin bindet) und Ähnliche können auch zur Erleichterung der Aufreinigung des Proteins von Interesse eingesetzt werden. Der Tag zur Affinitätsreinigung kann durch in Fachkreisen gut bekannte Methoden vom Protein von Interesse getrennt werden, einschließlich der Verwendung von Inteinen (Protein Self-splicing Elemente, Chong, et al, Gene 192: 271–281, 1997).
  • Durch die Verwendung einer Menge Harz mit geeigneten Bindestellen für nur eine kleine Menge des Antikörpers in der ungereinigten Mischung, kann der Isolierungsprozess dazu genutzt werden, gleichzeitig die Ausbeute zu normalisieren und den Antikörper zu isolieren. Zum Beispiel können die Proben, obwohl jede Probe unterschiedliche und unbekannte Mengen des Antikörperproteins enthält, mit einer Menge an Harz, die eine maximale Bindekapazität von 10 mgs hat, in Kontakt gebracht werden. Auf diese Weise werden größere Mengen Antikörper ungebunden durch das Harz durchlaufen. Die maximal gebundene Menge kann dann aus dem Harz eluiert werden.
  • In Fachkreisen sind Methoden zur Herstellung von Microarrays bekannt, einschließlich des Druckens auf eine feste Oberfläche mit Drucknadeln (passive Drucknadel, Federkiehl-Drucknadel oder Ähnliches) oder des Spottens mit einzelnen Tropfen einer Lösung. Passive Drucknadeln geben genügend Probe für einen einzelnen Spot ab. Federkiehl-Drucknadeln geben genügend Probe für mehrere Spots ab. Blasendrucker verwenden einen Ring, um ein kleines Volumen zu halten, das durch das Drücken eines Stempels in den Ring abgegeben wird. Beim Mikrodispensen wird ein Spritzmechanismus verwendet, um mehrere Spots eines festgelegten Volumens abzugeben. Zusätzlich können Proben mit der piezoelektrischen (Inkjet-)Technologie auf feste Träger aufgetragen werden, die aktiv Proben auf den festen Träger transferiert.
  • Eine Methode wird bei Shalon und Brown ( WO 95/35505 , veröffentlicht am 28 Dez. 1995) beschrieben. Mit der von Shalon und Brown beschriebenen Methode und Vorrichtung kann ein Array auf einem Glasobjektträger mit bis zu 600 Spots pro Quadratzentimeter und einem Volumen von 0.01 to 100 nl pro Spot erzeugt werden. Geeignete Antikörperkonzentrationen reichen von 1 ng/P bis 1 pg/P. Bei der vorliegenden Erfindung kann jeder Spot einen oder mehr als einen eindeutigen Antikörper beinhalten.
  • Andere Methoden zur Herstellung von Arrays sind in Fachkreisen bekannt, einschließlich des photolithographischen Druckens (Pease, et al, PNAS 91(11): 5022–5026, 1994) und der in situ Synthese. Während bekannte in situ Synthesemethoden für die Synthese von Polypeptiden, die lang genug sind um Antikörper darzustellen, weniger sinnvoll sind können sie für die Herstellung von bis zu 50 Aminosäure langen Polypeptiden verwendet werden, die wie unten beschrieben als Bindeproteine dienen können.
  • Die Microarrays können auf einer Vielzahl von festen Oberflächen wie zum Beispiel Plastik (z. B. Polycarbonat), komplexen Kohlenhydraten (z. B. Agarose und Sepharose), Acrylharzen (z. B. Acrylamid und Latexperlen) und Nitrocellulose erzeugt werden. Bevorzugte feste Träger umfassen Glasobjektträger, Siliconscheiben und positiv geladenen Nylonmembranen. Typische Beispiele für geeignete feste Träger sind in den unten stehenden Beispielen beschrieben.
  • Methoden für die kovalente Anheftung von Antikörpern an feste Träger sind in Fachkreisen gut bekannt. Beispiele solcher Methoden kommen in Bhatia, et al, Anal. Biochem. 178(2): 408–413, 1989; Ahluwalia, et al, Biosens. Bioelectron. 7(3): 207–214, 1992; Jonsson, et al, Biochem. J. 227(2): 373–378, 1985; und Freij-Larsson, et al, Biomaterials 17(22): 2199–2207, 1996 vor. Zusätzlich können Proteine mittels der Methoden der unten stehenden Beispiele an einen festen Träger gebunden werden.
  • Methoden zur Reduzierung unspezifischer Bindung an feste Oberflächen sind in Fachkreisen bekannt und schließen das Waschen der beladenen festen Oberfläche mit Rinderserumalbumin (BSA), rekonstruierter fettfreier Milch, Lachssperma DNA, Schweineheparin oder Ähnlichem mit ein (siehe Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3. Auflage, 1995).
  • Arrays können dazu verwendet werden, antigenspezifische Antikörper zu identifizieren. Die Arrays werden mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die ein oder mehr als ein bekanntes Antigen enthält, um die Antikörper im Array zu identifizieren, die eine Bindungsspezifität für das Antigen haben. Die Antigene sind oft Proteine, obwohl sie auch organisch-chemische Komponenten, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren oder Ähnliches sein können. Sie können isoliert, halb aufgereinigt, rekombinant oder natürlich vorkommend sein. Die Menge an Antigen kann von 1 bis 100 ng/P variieren. Das Antigen wird für einen Zeitraum in Kontakt mit dem Array belassen, der geeignet ist, zur Bildung von Antigen:Antikörper Komplexen, falls eines der Antikörper im Array spezifisch für das Antigen ist. Der dafür geeignete Zeitraum wird zwischen 5 Minuten und 24 Stunden liegen, und wird im Allgemeinen bei 0,5 bis 2 Stunden liegen.
  • Ein Antigen von besonderem Interesse stellt das rekombinante Protein dar, entweder ein vollständiges Genprodukt oder Fragmente davon, zum Beispiel ein Expressed Sequence Tag (oder EST-Fragment). EST-Fragmente sind relativ kurze cDNA-Sequenzen, die zufällig generiert und sequenziert worden sind, gewöhnlich als Teil eines laufenden Versuchs zur Kartierung eines vollständigen Genoms (Adams, et al, Science 252(5013): 1651–1656, 1991). Eine große Anzahl dieser Sequenzen sind in öffentlichen Datenbanken verfügbar. Die Identität der Proteine, kodiert durch die überwiegende Mehrheit der Sequenzen, ist unbekannt. Die folgende Diskussion kann, obwohl sie sich auf die Expression von EST-kodierten Proteinen bezieht, genauso auf jedes exprimierte Produkt einer Nukleinsäure, einschließlich vollständiger Proteine, angewendet werden.
  • Die Techniken, mit denen Zellen genetisch so konstruiert werden können, dass sie Peptide eines vorgegebenen EST-Fragments exprimieren, sind in Fachkreisen verfügbar. Die Methoden der Erfindung können zur Identifizierung eines Antikörpers, der spezifisch für ein Peptid ist, genutzt werden Diese Antikörper können dann als Reagenzien bei der Reinigung und Identifizierung vollständiger Proteine und in anderen experimentellen Verfahren eingesetzt werden, die die Lokalisierung und Funktion eines Proteins aufklären.
  • Prokaryotische Wirte sind gewöhnlich sehr effizient und zweckdienlich zur Produktion rekombinanter Proteine und stellen daher eine Art bevorzugtes Expressionssystem für EST-Fragmente dar. Prokaryoten werden am häufigsten durch verschiedene E. coli Stämme repräsentiert. Dennoch können auch andere mikrobielle Stämme verwendet werden, einschließlich anderer Bakterienstämme.
  • In prokaryotischen Systemen können Plasmidvektoren mit Replikationsstellen und mit Kontrollsequenzen aus einem, mit dem Wirt kompatiblen, Spezies verwendet werden. Beispiele für geeignete Plasmidvektoren können pBR322, pUC118, pUC119 und Ähnliche mit einschließen; geeignete Phagen- oder Bacteriophagenvektoren können λgt10, λgt11 und Ähnliche mit einschließen; und geeignete Virusvektoren können pMAM-neo, PKRC und Ähnliche mit einschließen. Vorzugsweise hat der ausgewählte Vektor der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit, in der ausgewählten Wirtszelle zu replizieren.
  • Anerkannte prokaryotische Wirte schließen Bakterien wie zum Beispiel E. coli und solche aus Gattungen wie zum Beispiel Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratiau und Ähnliche mit ein. Allerdings werden die Polypeptide unter diesen Bedingungen nicht glycosyliert. Die ausgewählten Wirte müssen mit dem Replikon und den Kontrollsequenzen des Expressionsplasmids kompatibel sein
  • Zur Expresssinn eines EST-Fragments in einer prokaryotischen Zelle ist es notwendig, die Gensequenz funktionsfähig mit einem funktionellen prokaryotischen Promotor, wie zum Beispiel einem T7-Promotor oder einen RSC-Promotor, zu verbinden. Solche Promotoren können entweder konstitutiv oder noch besser regulierbar (z. B. induzierbar oder reprimierbar) sein. Beispiele solcher konstitutiver Promotoren schließen den int-Promotor des Bacteriophagen λ, den bla-Promotor der β-Lactamase Gensequenz aus pBR322, den CAT-Promotor der Chloramphenicolacetyltransferase Gensequenz aus pPR325 und Ähnliche mit ein. Beispiele für induzierbare prokaryotische Promotoren umfassen den rechten und linken Hauptpromotor des Bakteriophagen (PL und PR), die trp-, reca-, lacZ-, Lad-, und und gal-Promotoren von E. coli, die α-amylase (Ulmanen Ett at., J. Bacteriol. 162: 176–182, 1985) und den Sigma 28 spezifischen Promotor von B. subtilis (Gilman et al., Gene sequence 32: 11–20(1984)), die Promotoren der Bacillus Bakteriophagen (Gryczan, In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY (1982)), Promotoren von Streptomyceten (Ward et at., Mol. Gen. Genet. 203: 468–478, 1986) und Ähnliche. Beispiele von eukaryotischen Promotoren werden in Glick (J. Ind. Microtiot. 1: 277–282, 1987); Cenatiempo (Biochimie 68: 505–516, 1986); und Gottesman (Ann. Rev. Genet. 18: 415–442, 1984) besprochen.
  • Für eine angemessene Expression in einer prokaryotischen Zelle wird außerdem eine Ribosomenbindestelle stromabwärts der genkodierenden Sequenz benötigt. Solche Ribosomenbindestellen sind zum Beispiel in Gold et at. (Ann. Rev. Microbiol. 35: 365–404, 1981) dargelegt. Die Auswahl von Kontrollsequenzen, Expressionsvektoren, Transformationsmethoden und Ähnlichem hängt vom Zelltyp der Wirtszelle, die zur Genexpression verwendet wird, ab.
  • Die Wirtszellen, die in Expressionssystemen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind nicht streng begrenzt, vorausgesetzt, sie eignen sich zur Expression des Peptids von Interesse. Geeignete Wirte können häufig eukaryotische Zellen mit einschließen. Bevorzugte eukaryotische Wirte umfassen zum Beispiel Hefen, Pilze, Insektenzellen und Säugerzellen entweder in vivo oder in Zellkulturen. Säugerzellen, die als Wirte einen Nutzen haben können, schließen HeLa-Zellen, Zellen fibroblastischen Ursprungs wie VERO, 3T3 oder CHOK1, HEK 293 Zellen oder Zellen lymphoiden Ursprungs (wie zum Beispiel 32D Zellen) und ihre Derivate mit ein. Bevorzugte Säugerwirtszellen umfassen SP2/0 und JS58L, ebenso wie Neuroblastomazelllinien wie IMR 332 und PC12, die bessere Kapazitäten für eine korrekte posttranslationale Prozessierung bieten können.
  • Zusätzlich stehen auch Pflanzenzellen zur Verfügung, und mit den Pflanzenzellen kompatible Kontrollsequenzen sind verfügbar, wie zum Beispiel die 35S und 19S des Blumenkohlmosaikvirus, der Nopalinsynthase-Promotor und Signalsequenzen zur Polyadenylierung und Ähnliches. Einen anderen bevorzugten Wirt stellen Insektenzellen, zum Beispiel Drosophilalarven, dar. Bei der Verwendung von Insektenzellen als Wirt kann der Alkoholdehydrogenase-Promotor verwendet werden (Rubin, Science 240: 1453-1459, 1988). Alternativ dazu können Baculovirusvektoren konstruiert werden, um große Mengen von einem EST-Fragment kodierten Peptid in Insektenzellen zu exprimieren (Jasny, Science 238: 1653, 1987); Miller et al., In: Genetic Engineering (1986), Setlow, J. K., et al., eds., Plenum, Vol. 8, Seiten 277–297).
  • Jedes beliebige einer Serie von Hefe-Expressionssystemen kann verwendet werden, vorausgesetzt es umfasst einen Promotor und Terminationselemente einer aktiv exprimierten Gensequenz, die für glykolytische Enzyme kodiert, die in großen Mengen produziert werden, wenn Hefe in Medium, das reich an Glukose ist, angezogen wird. Bekannte glykolytische Gensequenzen können außerdem sehr effiziente transkriptionelle Kontrollsignale bieten. Die Hefe bietet, dadurch dass sie posttranslationale Peptidmodifikationen durchführen kann, beträchtliche Vorteile. Es gibt eine Anzahl rekombinanter DNA-Strategien, die starke Promotorsequenzen und Plasmide mit hoher Kopienzahl verwenden, die zur Produktion des gewünschten Peptids in Hefe verwendet werden können. Die Hefe erkennt Leadersequenzen auf klonierten Genprodukten von Säugern und sekretiert Peptide mit Leadersequenzen (z. B. Prepeptide). Für Wirte aus Säugerzellen sind mehrere mögliche Vektorsysteme zur Expression von EST-Fragmenten verfügbar.
  • Eine große Auswahl transkriptioneller und translationaler regulatorischer Sequenzen kann, abhängig von der Natur des Wirts, eingesetzt werden. Die transkriptionellen und translationalen regulatorischen Signale können aus viralen Quellen, wie zum Beispiel aus dem Adenovirus, dem Bovinen Papillomavirus, dem Cytomegalovirus, dem Siamvirus oder Ähnlichen stammen, bei denen die regulatorischen Signale mit einer bestimmten Gensequenz assoziiert sind, die ein hohes Expressionslevel zeigen. Alternativ dazu können Promotoren von Säuger-Expressionsprodukten verwendet werden, wie zum Beispiel Aktin, Kollagen, Myosin oder Ähnliches. Regulatorische Signale zur Transkriptionsinitiation können so ausgewählt werden, dass eine Reprimierung oder Aktivierung möglich ist, so dass die Expression der Gensequenzen reguliert werden kann. Interessant sind regulatorische Signale, die temperatursensitiv sind, so dass durch eine Veränderung der Temperatur die Expression reprimiert oder initiiert werden kann, oder solche, die einer chemischen (wie zum Beispiel Metabolit-)Regulation unterliegen.
  • Die Expression von EST-Fragmenten in eukaryotischen Wirten schließt die Verwendung eukaryotischer regulatorischer Regionen mit ein. Solche Regionen beinhalten im Allgemeinen eine Promotorregion, die dazu geeignet ist die RNA-Sythese zu initiieren. Bevorzugte eukaryotische Promotoren schließen zum Beispiel den Promotor der Methallothionein I Gensequenz aus der Maus (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 273–288, 1982); den TK-Promotor des Herpesvirus (McKnight, Cell 31: 355–365, 1982); den frühen SV40-Promotor (Benoist et al., Nature (London) 290: 304–310, 1981); den Hefepromoter der gal4-Gensequenz (Johnston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 6971–6975, 1982); Silver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 5951–5955, 1984), den CMV-Promotor, den EF-1-Promotor und Ähnliche mit ein.
  • Ein EST-Fragment und ein funktionsfähig verbundener Promotor können in eine prokaryotische oder eukaryotische Empfängerzelle entweder als nicht-replizierbares DNA-(oder RNA-)Molekül eingeführt werden, entweder als lineares Molekül oder noch besser als geschlossenes, kovalentes, zirkuläres Molekül (Plasmid). Da solche Moleküle unfähig zur autonomen Replikation sind, kann die Expression der Gene durch die vorübergehende Expression der eingeführten Sequenzen erfolgen. Alternativ dazu kann eine dauerhafte oder stabile Expression durch die Integration der DNA-Sequenzen in das Wirtschromosom erreicht werden.
  • Ein Vektor der die Fähigkeit besitzt, die gewünschten Gensequenzen in das Wirtszellchromosom zu integrieren, kann verwendet werden. Zellen, die die eingeführte DNA stabil ins Chromosom integriert haben, können durch die Einführung eines oder mehr als eines Markers selektiert werden, der die Selektion auf Wirtszellen, die den Expressionsvektor enthalten, ermöglicht. Der Marker kann einem auxotrophen Wirt Phototrophie verleihen, eine Biozidresistenz z. B. gegen Antibiotika oder Schwermetalle, wie zum Beispiel Kupfer, verleihen oder Ähnliches. Die selektierbare Gensequenz des Markers kann entweder direkt an eine DNA-Gensequenz gebunden sein, um exprimiert zu werden, oder in dieselbe Zelle durch Kotransfektion eingeführt werden. Allgemein selektierbare Gensequenzen für Marker schließen die für Antibiotikaresistenzen mit ein, wie z. B: Ampicillin, Tetracyclin, Kanamycin, Bleomycin, Streptomycin, Hygromycin, Neomycin, ZeocinTM und Ähnliche. Selktierbare auxotrophe Gensequenzen umfassen zum Beispiel hisD, das das Wachstum in histidinfreiem Medium in Gegenwart von Histidinol ermöglicht.
  • Zusätzliche Elemente können für die optimale Synthese der einzelkettigen Bindeprotein mRNA benötigt werden. Diese Elemente können Spleicing-Signale ebenso wie Transkriptionspromotoren, Enhancer und Terminationssignale mit einschließen. cDNA-Expressionsvektoren, die solche Elemente tragen schließen die bei Okayama, Mol. Cell. Bio. 3: 280, 1983 beschriebenen mit ein.
  • Das rekombinante Antigen kann als Fusionsprotein hergestellt werden. Wenn zwei proteinkodierende Sequenzen, die in der Natur nicht miteinander verbunden sind, im selben Leserahmen vorliegen, wird das daraus resultierende Protein "Fusionsprotein" genannt, bei dem zwei unabhängige Proteine "fusioniert" wurden. Fusionsproteine können bei sehr vielen Anwendungen eingesetzt werden. Zum Beispiel können zwei funktionelle Proteine zur Produktion eines einzigen Proteins, mit vielen enzymatischen Aktivitäten, fusioniert werden oder kurze Peptidsequenzen, wie zum Beispiel Epitoptags oder Affinitätstags zur Aufreinigung (siehe oben), können an größere Proteine fusioniert werden und als Hilfsmittel bei der Aufreinigung oder bei der Identifizierung des exprimierten Proteins als Epitope, die von spezifischen Antikörpern detektiert werden, eingesetzt werden,
  • Epitoptags sind kurze Peptidsequenzen, die durch epitopspezifische Antikörper erkannt werden. Ein Fusionsprotein, bestehend aus einem rekombinanten Protein und einem Epitoptag, kann einfach und leicht durch die Verwendung eines Antikörpers, der an eine Chromatographiesäule gebunden ist, aufgereinigt werden. Weiterhin ermöglicht das Vorhandensein des Epitoptags den Nachweis des rekombinanten Proteins in einem nachfolgenden Assay, wie zum Beispiel Westernblot, ohne die Notwendigkeit, einen Antikörper gegen das rekombinante Protein selbst herstellen zu müssen. Beispiele für allgemein verwendete Epitoptags schließen V5, Glutathione-S-Transferase (GST), Hämaglutinin (HA), das Peptid Phe-His-His-Thr-Thr, die Chitinbindedomäne und Ähnliche mit ein.
  • Ein Fusionsprotein kann ein Mittel zum einfachen Nachweis eines rekombinanten Antigenproteins darstellen. Zum Beispiel kann die Fusionskomponente selbst einen detektierbaren Teil darstellen, wie zum Beispiel ein fluoreszierendes Protein (Grün fluoreszierendes Protein, Gelb fluoreszierendes Protein oder Ähnliches), oder es kann alternativ dazu Teil eines spezifischen Bindungspaares sein (wie zum Beispiel Biotin und Streptavidin), das durch die Reaktion mit dem Bindungspartner zu einer detektierbaren Substanz konjugiert.
  • Die vorangegangenen Elemente können zur Herstellung von Vektoren, die geeignet sind für die Verwendung in den Methoden der Erfindung, kombiniert werden. Fachkreise werden fähig sein, die, für die Verwendung in ihren jeweiligen Systemen geeigneten Elemente, auszuwählen und zu kombinieren.
  • Die eingeführten Nukleinsäuremoleküle können in ein Plasmid oder in einen viralen Vektor eingeführt werden, der zur autonomem Replikation im empfangenden Wirt fähig ist. Eine große Auswahl an Vektoren kann für diesen Zweck eingesetzt werden. Wichtige Faktoren bei der Auswahl eines bestimmten Plasmids oder viralen Vektors beinhalten: die Einfachheit mit der Empfängerzellen, die den Vektor enthalten, erkannt werden können und von den Empfängerzellen, die den Vektor nicht enthalten, getrennt werden können; die Kopienzahl des Vektors, die für einen bestimmten Wirt gewünscht wird; und ob gewünscht wird, dass die Möglichkeit besteht den Vektor zwischen den Zellen unterschiedlicher Spezies "hin und her zu bewegen".
  • Geeignete prokaryotische Vektoren schließen Plasmide wie, zum Beispiel die, die zur Replikation in E. coli fähig sind, mit ein (zum Beispiel pBR322, ColEI, pSC101, PACYC 184, itVX, pRSET, pBAD (Invitrogen, Carlsbad, CA) und Ähnliche). Solche Plasmide werden bei Sambrook (cf. "Molecular Cloning: A Laborstory Manual", 2. Auflage, herausgegeben von Sambrook, Fritsch, & Maniatis, Cold Spring Harbor Laborstory, (1989)) dargelegt. Bacillus Plasmide schließen pC194, pC221, pT127 und Ähnliche mit ein und werden bei Gryczan (In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), Seiten 307–329) dargelegt. Geeignete Streptomyceten Plasmide schließen pIJ101 (Kendall et al., J. Bacteriol. 169: 4177–4183, 1987) und Streptoyceten Bacteriophagen wie zum Beispiel ϕC31 (Chater et al., In: Sixth International Symposium an Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), Seiten 45–54) mit ein. Pseudomonas Plasmide werden von John et al. (Rev. Infect. Dis. 8: 693–704, 1986) und Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33: 729–742, 1978) besprochen.
  • Geeignete eukaryotische Plasmide schließen zum Beispiel BPV, Vaccinia, SV40, 2-micron circle, pCDN3.1 (Invitrogen) und Ähnliche und deren Derivate mit ein. Solche Plasmide sind in Fachkreien bekannt (Botstein et al., Miami Wntr. Symp. 19: 265–274, 1982); Broach, In: "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance", Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, NY, Seiten 445–470 (1981); Broach, Cell 28: 203–204, 1982); B (Dilon et al, J. Clin. Hematol. Oncol. 10: 39–48, 1980); Maniatis, In: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Ausgabe 3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY, Seiten 563–608 (1980).
  • Sobald die Antikörper:Antigen Komplexe ausgebildet worden sind, und ungebundenes Antigen unter geeigneten Bedingungen weggewaschen worden ist, kann der Antigen:Antikörper Komplex, mittels einer der in Fachkreisen bekannten Techniken, nachgewiesen werden. Geeignete Waschbedingungen sind in Fachkreisen bekannt (siehe zum Beispiel Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3. Auflage, 1995). Exemplarische Waschbedingungen sind in den unten stehenden Beispielen gezeigt.
  • Im Fall von rekombinaten Antigenen können zur Detektion Expressionsvektoren verwendet werden, die, wie oben beschrieben, chimäre Fusionsproteine bilden. Das Epitop-getaggte Antigen kann mit Antikörpern, die spezifisch gegen die Tagsequenz sind, nachgewiesen werden. Dieser Antikörper kann entweder selbst nachweisbar markiert sein oder durch einen dritten nachweisbar markierten Antikörper detektiert werden. Alternativ dazu kann das Antigen im Komplex mit Biotin vorkommen und mittels nachweisbar markiertem Avidin oder Streptavidin detektiert werden. Außerdem kann das Antigen selbst nachweisbar markiert sein, zum Beispiel mit einer Fluoreszenzfarbstoffverbindung.
  • Der Begriff „nachweisbar markiert", wie er hier benutzt wird, umfasst Antigene, die direkt an eine nachweisbare Substanz, wie zum Beispiel einen Fluoreszenzfarbstoff, gekoppelt sind und Antigene, die an einen Teil eines Bindungspaares, wie zum Beispiel Biotin/Streptavidin, oder einen Epitoptag gebunden sind, der spezifisch mit einem Molekül interagieren kann, das detektiert werden kann, wie zum Beispiel durch die Produktion eines gefärbten Substrats oder durch Fluoreszenz.
  • Substanzen, die zum Nachweis von markierten Proteinen geeignet sind, umfassen Fluoreszenzfarbstoffe wie zum Beispiel Fluoreszinisothiocyanat (FITC), Fluoreszin, Rhodamin, Tetramethyl-Rhodamin-5 (und 6)-Isothionat (TRITC), Texasrot, Cyaninfarbstoffe (Cy3 und Cy5 zum Beispiel) und Ähnliche und Enzyme, die mit colormetrischen Substraten reagieren, wie zum Beispiel Meerretichperoxidase. In der Praxis der Erfindung wird im Allgemeinen die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen bevorzugt, da sehr geringen Mengen nachgewiesen werden können. Liegen mehrere Antigene in einem Array vor, kann darüber hinaus jedes Antigen mit einer unterschiedlichen Fluoreszenzverbindung markiert werden aber gemeinsam detektiert werden. Markierte Spots können mit einem Fluorimeter nachgewiesen werden, wobei jedes Signal auf ein Antigen hinweist, das an einen spezifischen Antikörper gebunden ist.
  • Die Bildung der Antigen:Antikörper Komplexe kann unter einer Vielzahl unterschiedlicher Bedingungen, zur Identifizierung von Antikörpern mit unterschiedlichen Bindungseigenschaften, durchgeführt werden. Reaktionslösungen mit Antigenen können unterschiedliche Salzkonzentrationen enthalten oder können bei unterschiedlichen pH-Werten durchgeführt werden. Zusätzlich kann die Bindungsreaktion bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt werden. Mit jedem Set an Bedingungen werden Antikörper mit unterschiedlicher Affinität zum Antigen identifiziert. Zum Beispiel können Antikörper, die bei pH 2 binden, ihren Nutzen möglicherweise unter sehr sauren Bedingungen entfalten, wie sie zum Beispiel im Magen vorliegen. Genauso können sich Antikörper, die bei Temperaturen um den Siedepunkt binden, möglicherweise bei Untersuchungen von thermophilen Organismen als nützlich erweisen. Im Allgemeinen liegen die pH Bedingungen zwischen 2 und 10 (bestenfalls um pH 8), die Temperaturen liegen zwischen 0°C und 100°C und die Salzkonzentrationen zwischen 1PM und 1M (im Fall von NaCl).
  • Affinitätskonstanten sind ein Maß für die Interaktion zwischen einem bestimmten Liganden und seinem passenden Rezeptor. Die „Bindungsaffinität" oder das Maß für die Stärke einer bestimmten Antigen:Antikörper Wechselwirkung wird im Allgemeinen durch Affinitätskonstanten für ein Konzentrationsgleichgewicht, aus assoziierten oder nicht-assoziierten Konfigurationen eines Antigens und seines Antikörpers, bestimmt. Vorzugsweise sollte die Antigenbindung mit einer Affinität von ungefähr ka = 10–6 M oder größer stattfinden, um einen Nutzen für die vorliegende Erfindung zu haben, noch besser sind ungefähr 10–7 M und bestenfalls liegen die Affinitätskonstanten zwischen ungefähr 10–8 M und 10–11 M. Antikörperfragmente haben im Allgemeinen Affinitäten im Bereich zwischen 10–6 M und 10–7 M.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsart der Erfindung werden Microarrays mit uncharakterisierten Antikörpern verwendet, um Expressionsprofile von Zellen zu vergleichen. Zum Beispiel können Vergleiche zwischen einer Population von Zellen eines Gewebes, wie zum Beispiel arterielle Endothelialzellen, und einem zweiten Gewebe, wie zum Beispiel venöse Endothelialzellen oder Zellen, die von einem bestimmten Gewebe aber unterschiedlichen Spezies stammen, gemacht werden. Die Vergleiche können zwischen normalen Zellen und Zellen vom selben Gewebetyp, die von einer Person mit einer pathogenen Funktionsstörung stammen, gemacht werden. Zum Beispiel können Vergleiche zwischen normalen Zellen und Krebszellen angestellt werden. Zusätzlich können Vergleiche zwischen Zellen in einem Ruhestadium und Zellen in einem aktivierten Stadium gemacht werden, zum Beispiel zwischen ruhenden T-Zellen und aktivierten T-Zellen.
  • Bei einem anderen Beispiel haben die dargelegten Arrays einen Nutzen für die Bewertung von Proteinexpressionen bei Pathogenen, wie zum Beispiel Bakterien, Parasiten, Viren und Ähnlichem. Ein aus den Pathogenen hergestelltes Lysat, das alle von den Pathogenen exprimierte Proteine repräsentiert, kann dazu verwendet werden den Antikörper-Array zur Identifizierung antigenerkennender, pathogen-exprimierter Proteine zu kontaktieren. Diese Antikörper haben einen Nutzen als diagnostische Agenzien sowie als potentielles Therapeutikum.
  • Zelluläre Lysate werden, wie oben beschrieben, als „Antigene" eingesetzt und reagieren mit zwei identischen Microarrays. Antikörper, die sich als reaktiv in einem aber nicht in dem anderen Array erweisen, deuten auf das Vorliegen eines differentiell exprimierten Gens hin. Dieser Antikörper ist dann bei der nachfolgenden Isolierung und Identifizierung dieser Proteine von Nutzen, die sich in den beiden Zellpopulationen unterscheiden. Im Fall von normalen Zellen und Krebszellen können so Proteine identifiziert werden, die in Krebszellen exprimiert werden und zu deren malignen Zustand beitragen.
  • Microarrays mit vorher charakterisierten Antikörpern können für viele Anwendungen eingesetzt werden, wobei die Erstellung von Zellprofilen eine davon darstellt. Ein Array kann zum Beispiel aus Antikörpern bestehen, die ein Set von Antigenen erkennt, von denen bekannt ist, dass sie in aktivierten T-Zellen vorkommen aber nicht in T-Zellen im Ruhezustand. Eine T-Zellpopulation kann dann lysiert werden, und das Lysat mit dem Array in Kontakt gebracht werden, um zu bestimmen, ob die Population das Profil von T-Zellen im aktivierten oder im Ruhezustand repräsentiert.
  • Die Microarrays und die hier beschriebenen Methoden können als Methoden zur Diagnose bestimmter Funktionsstörungen verwendet werden. Zum Beispiel kann eine Sammlung von Antikörpern, die spezifisch für eine Auswahl von Antigenen ist, die mit einer oder mehr als einer Funktionsstörung assoziiert sind, auf ein Array aufgebracht und in Kontakt mit Körperflüssigkeit gebracht werden, die Antigene enthält, deren Vorliegen oder Fehlen auf eine bestimmte Funktionsstörung hinweisen würde. Der Vorteil der Verwendung eines Mikroarrays gegenüber einem konventionellen Immunoassay liegt in der Möglichkeit eine Population von Antikörpern mit einzubeziehen, um eine Vielzahl von Funktionsstörungen auf einer einzigen Oberfläche zu diagnostizieren, eine signifikante Einsparung von Zeit, Kosten und Materialien, die zur Erstellung einer Diagnose benötigt werden.
  • So könnte zum Beispiel, wenn ein Patient mit Symptomen die typisch für mehrere unterschiedliche Funktionsstörungen sind, die sich durch das Vorliegen oder Fehlen von einem oder mehr als einem Protein auszeichnen, ein einziges Microarray Assay zur Erstellung einer spezifischen Diagnose verwendet werden, um so den Patienten richtig zu behandeln. Patienten, die an einem Schlaganfall oder Hirnschlag leiden, geben verschiedene Proteine, wie zum Beispiel neuronspezifische Enolase (NSE) aus den Neuronalzellen und S-100 aus den Gliazellen und den Astrozyten, in die Zerebrospinalflüssigkeit ab. Solche Proteine werden unter Bedingungen, die zu ähnlichen Symptomen führen können, wie zum Beispiel Drogenauswirkungen, nicht freigesetzt, was die richtige Diagnose noch mehr erschwert. Ein diagnostisches Array könnte diese und andere Proteine in der CSF leicht nachweisen und damit zu einer raschen klinischen Diagnose und Behandlung führen.
  • Beispiel I – Bestimmung der optimalen Konzentrationen von Antikörper und Antigen
  • Unterschiedliche Konzentrationen (1 μg/μl, 100 ng/μl, 10 ng/μl, 1 ng/μl) von gesamt Maus-IgG oder eines monoklonalen Maus anti-PLC-gamma wurden auf einen Aldehyd-Objektträger (Cel Associates, Inc., Houston, Texas) gespottet, der eine nicht-kovalente Anheftung der Proteine erlaubt. Mit einem manuellen 8 Nadel Hand-Arrayer wurden die Objektträger für eine Stunde mit PEST (Phosphat-gepufferte Saline mit 0,10% Tween 20) und 3% Milcheiweiß blockiert. Nachfolgend wurden die Objektträger dreimal für je 15 Minuten in PEST gewaschen. Duplikate der Objektträger wurden mit 50 μl Gänse anti-Maus IgG-Antikörpern (GAMG), die an eine CY3 oder CY5 Fluoreszenzfarbstoffverbindung (Amershan, Arlington Heights, Illinois) gebunden waren, mit einer Konzentration von 10 μg/ml oder 1 μg/ml inkubiert. Anschließend wurden die Objektträger nochmal dreimal für je 15 Minuten in PEST gewaschen und vor dem Scannen mittels Zentrifugation getrocknet. Eine Bindung wurde, wie in unten stehender Tabelle 1 gezeigt, nachgewiesen. Tabelle 1
    Antikörper Konz. Antigen Konz. Nachweisgrad
    PLC-gamma 1 μg/μl GAMG-CY3 10 μg/ml +++
    100 ng/μl 10 μg/ml +++
    10 ng/μl 10 μg/ml +
    1 ng/μl 10 μg/ml –
    Maus-IgG 1 μg/μl GAMG-CY3 10 μg/ml +++
    100 ng/μl 10 μg/ml +++
    10 ng/μl 10 μg/ml +
    1 ng/μl 10 μg/ml –
    PLC-gamma 1 μg/μl GAMG-CY3 1 μg/ml +
    100 ng/μl 1 μg/ml +
    10 ng/μl 1 μg/ml –
    1 ng/μl 1 μg/ml –
    Maus-IgG 1 μg/μl GAMG-CY3 1 μg/ml +
    100 ng/μl 1 μg/ml +
    10 ng/μl 1 μg/ml –
    1 ng/μl 1 μg/ml –
    PLC-gamma 1 μg/μl GAMG-CY5 10 μg/ml +++
    100 ng/μl 10 μg/ml +++
    10 ng/μl 10 μg/ml +
    1 ng/μl 10 μg/ml –
    Maus-IgG1 μg/μl GAMG-CY5 10 μg/ml +++
    100 ng/μl 10 μg/ml +++
    10 ng/μl 10 μg/ml +
    1 ng/μl 10 μg/ml –
    PLC-gamma 1 μg/μl GAMG-CY5 1 μg/ml +
    100 ng/μl 1 μg/ml +
    10 ng/μl 1 μg/ml –
    1 ng/μl 1 μg/ml –
    Maus-IgG 1 μg/μl GAMG-CY5 1 μg/ml +
    100 ng/μl 1 μg/ml +
    10 ng/μl 1 μg/ml –
    1 ng/μl 1 μg/ml –
    • +++ starkes Signal, ++ mittelstarkes Signal
    • + schwaches Signal, – kein Signal
  • Beispiel II – Vergleich von festen Trägern
  • Eine Verdünnungsreihe (1 μg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml) mit Maus-IgG oder PLC-gamma wurde von Hand auf Aldehyd, Polystyren, Nitrocellulose und Surmodic Objektträger aufgetragen. Aldehyd, Nitrocellulose, Polystyren und Surmodic Objektträger wurden von unterschiedlichen Anbietern von Außerhalb bezogen (Aldehyd Objektträger-Cel Associates, Inc., Houston, Texas, Nitrocellulose Objektträger-Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon; Polystyren Objektträger-Nunc, Inc., Naperville, Illinois; Surmodic Objektträger-Surmodics, Inc., Eden Prairie, Minnesota). Die Surmodic Objektträger tragen ein geheim gehaltenes Polymer auf der Glasoberfläche, das unter geeigneten Bedingungen (vom Hersteller beschrieben) kovalente Bindungen mit Proteinen ausbildet.
  • Nach dem Auftragen von Hand (ungefähr 20–30 nl pro Spot) wurden die Nitrocellulose, Aldehyd und Polystyren Objektträger sofort für eine Stunde mit PEST und 3% Milcheiweiß blockiert, dreimal mit PEST gewaschen und mit 50 μl GAMQCY3 für 30 Minuten hybridisiert. Die Surmodic Objektträger wurden, wie von Hersteller empfohlen, über Nacht in einer Kammer mit feuchtem Salz inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Surmodic Objektträger, wie oben beschrieben, behandelt. Nach der Hybridisierung wurden alle unterschiedlichen Objektträger dreimal in PEST gewaschen, getrocknet und mit einem Scan Array 3000 Fluoreszenzscanner gescannt.
  • Alle getesteten Objektträger ermöglichten den Nachweis der Antigen:Antikörper Bindung bei höherer Antikörperkonzentration. Die mit Aldehyd und Nitrocellulose behandelten Objektträger zeigten die größte Effizienz in der Antikörperbindung, und eine Antikörper:Antigen Interaktion konnte bei 1 ng/μl nachgewiesen werden.
  • Beispiel III – Nachweis einer Bindung mittels nicht fluoreszierender Methoden
  • Auf positiv geladene Nylonmembranen (Zeta Probe Membranes, Bio Rad Laborstories, Hercules, CA) wurden von Hand 1 μl anti-His, anti-V5, anti-Thioredoxin (anti-Thio), anti-FOS, anti-PLC-gamma und anti-CREB Antikörper (Invitrogen, Carlsbad, CA; alle Antikörper mit einer Konzentration von ungefähr 1 mg/ml) aufgetragen. Alle Filter wurden für 1 Stunde in PEST mit 3% Milcheiweiß blockiert, dreimal mit PEST gewaschen und drei Stunden bei Raumtemperatur mit 1 μg/ml biotinyliertem D1 Protein inkubiert. D1 ist ein Kreatinkinase Fusionsprotein aus einer cDNA-Bibliothek aus humanen, fetalen Herzen isoliert und in den pBAD-Thio-His-TOPO Vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert, zur Erzeugung eines Thioredoxin-V5-His-Kreatinkinase Fusionsproteins. D1 wurde nach Angaben des Herstellers mit dem EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC Biotinylation Kit (Pierce, Rockford, IL) biotinyliert
  • Nach drei weiteren Waschschritten mit demselben Puffer wurden die Filter mit Streptavidin/alkaline Phosphatase Konjugat oder Streptavidin/Meerretich Peroxidase Konjugat (Boehringer Mannheim, GmbH Germany) eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Filter wurden fünfmal mit PEST gewaschen, getrocknet und mittels Eintauchen in ECL Chemilumineszent Substrat (ECL-Amersham, Arlington Heights, Illinois) oder dem chromogenischen Substrat BCIP/NBT (Sigma, Chemicals, st. Louis, MO) entwickelt. Ein Kodak Chemilumineszensfilm wurde für 1 bis 10 Sekunden mit den mit BCL entwickelten Filtern belichtet.
  • Die Ergebnisse sind in den 1A, 1B und 1C gezeigt. In allen Fällen waren nur die Antikörper nachweisbar, die spezifisch für die Epitope auf dem Antigen-Fusionsprotein waren, und nur in den aufgetragenen Spots, was zeigt, dass das System sowohl ein gutes Signal-Stör-Verhältis als auch Spezifität aufweist.
  • Das Experiment wurde mit einem Array wiederholt, das mit einem automatisierten Arrayer erzeugt worden war. Die Antikörper (1 mg/ml) wurden mit einem von Invitrogen entwickelten, automatisierten 96 Nadel Microarrayer gespottet. Neben den drei Antikörpern zur Positivkontrolle (anti-His, anti-Thio, anti-V5) wurden fünfzehn Antikörper als Negativkontrolle (gemischte Maus Monoklonale) aufgetragen. Die Filter wurden, wie oben beschrieben, unter Verwendung des alkalinen Phosphatase Konjugats und des chromogenischen Substrats BCIP/NBT behandelt.
  • Wie 2 zeigt waren Bindung und Nachweis des Antikörpers hoch spezifisch und sensitiv.
  • Beispiel IV – Bewertung der Antikörperaffinität
  • Anti-His, anti-V5, anti-FOS, anti-PLC-gamma, 25C1 DG und anti-VEGF (vaskulärer endothlialer Wachstumsfaktor) Antikörper wurden auf einen Nitrocellulose Objektträger aufgetragen und reagierten, wie oben beschrieben, mit biotinyliertem D1 Protein. Die Bindung wurde, wie oben beschrieben, mit Sreptavidin-CY3 nachgewiesen. Die anti-V5 Antikörperspots zeigten eine rote, die anti-His Spots eine grüne Färbung, während die Negativkontrollen nicht nachweisbar waren (siehe 3). In einer schwarz-weiß Abbildung zeigt sich die relative Zunahme der Bindungsaffinitäten durch eine Zunahme von Weiß in einem vorgegebenen Bereich. Die Färbung der Spots weist generell auf das Vorliegen einer größeren Menge von fluoreszenzmarkiertem Antigen hin und zeigt damit die relative Bindungsaffinität zwischen Antikörper und Antigen an. Die Färbungen in absteigender Reihenfolge, von der höchsten bis zur geringsten Affinität, sind weiß, rot, gelb, grün und blau. Mit dieser Technik können viele Antikörper auf ihre Affinität zu einem einzelnen Antigen getestet werden.
  • Beispiel V – Polyklonale Antikörper Microarravs
  • Zum Nachweis einer spezifischen Bindung an polyklonale Antikörper wurden sechs Antikörper von Hand auf einen Nitricellulose Objektträger aufgetragen, drei polyklonale Antikörper (anti-E12 (ungereinigtes polyklonales Serum vom Hasen an einem His-V5-Thioredoxin-Thymidinkinase Fusionprotein), anti-lexA (lexA Repressorprotein) und anti-GFP (grünes Fluoreszenprotein)) und drei monoklonale Antikörper (anti-V5, anti-His und anti-GalU (ein Transkriptionsfaktor vom Säuger). Der Objektträger wurde mit PEST und 3% Micheiweiß für eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert und mit E12-Biotinkonjugat inkubiert, das analog zum D1-Protein nach dem oben beschriebenen Protokoll hergestellt wurde. Nach ausführlichen Waschschritten mit PEST wurden die Objektträger für eine Stunde mit Streptavidin-CY3 Konjugat (Amersham, Arlinton Heights, IL) inkubiert, fünfmal mit PEST gewaschen und vor dem Scannen auf dem Scan Array 3000 mittels Zentrifugation getrocknet.
  • Wie in 4 zu sehen ist, wurde die Bindung mit beiden Antikörper, dem antigenspezifischen polyklonalen Antikörper (anti-B12) und den antigenspezifischen monoklonalen Antikörpern (anti-His, anti-V5) nachgewiesen und nicht mit einem der Antikörper, die als Negativkontrolle verwendet wurden.
  • Beispiel VI – Microarrayanalyse markierter Zelllysate
  • Eine Reihe von Experimenten wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Antikörper eines Mikroarrays in der Lage sind, Antikörper in einem Zelllysat spezifisch nachzuweisen.
  • CHO Zellen, die große Mengen an beta-Galaktosidase expremieren, wurden bis zur Konfluenz in einer T-175-Flasche angezogen (Rams Medium mit Pen/Strep und L-Glutamin mit 10% FCS, bei 37°C mit 5% CO2). Die Zellen wurden mit Trypsin/EDTA geerntet. NP40 Extrakte wurden durch Pelletieren der Zellen (107 Zellen), einen Waschschritt mit PBS und der Aufnahme in 5% NP40 präpariert. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt. Die löslichen Proteine wurden mittels eines Pierce Biotinylierungskit, nach Angaben des Herstellers, biotinyliert.
  • Nitrocellulose Objektträger (siehe oben) mit aufgetragenen monoklonalen Antikörpern (anti-beta-Gal, anti-His, anti-Thio, anti-V5, anti-FOS, anti-PLC-gamma, anti-VEGF und 25C10G (ein anti-CRM Antikörper) wurden blockiert, gewaschen, hybridisiert und mit Streptavidin-CY3, wie in Beispiel VI oben beschrieben, entwickelt. Wie in 5A zu sehen ist, kann beta-Galaktosidase Bindung nachgewiesen werden, auch wenn zusätzlich einige unspezifische Bindungen zu sehen sind.
  • Das Experiment wurde wiederholt, außer dass nach der Zentrifugation des Extraktes die löslichen Proteine, vor der Biotinylierung, über Nacht bei 4°C gegen 50 mM Phosphatpuffer dialysiert wurden. Wie in 5B zu sehen ist, wurde der größte Teil der unspezifischen Bindungen, die im vorherigen Experiment auftraten, beseitigt.
  • Beim nächsten Experiment wurden die dialysierten Extrakte mit den biotinylierten, löslichen Proteinen zur Reduktion der unspezifischen, hydrophoben Wechselwirkungen auf 10% Glycerol eingestellt. Außerdem wurde die Natriumchlorid-Konzentration auf 0,2 M eingestellt, um die spezifischen, ionischen Wechselwirkungen zu erhöhen. Alle anderen Bedingungen blieben unverändert. Wie in 5C zu sehen ist wurden durch dieses Protokoll alle unspezifischen Bindungen beseitigt.

Claims (7)

  1. Ein Verfahren für das Vergleichen von Proteinexpression in zwei oder mehr als zwei Populationen von Zellen, wobei dieses Verfahren Folgendes umfasst: (a) Kontaktieren einer Antikörper-Anordnung auf einer festen Oberfläche mit einem Zelllysat einer ersten Zellpopulation, wobei ein erstes Bindungsmuster erzeugt wird; (b) Kontaktieren einer zweiten Antikörper-Anordnung auf einer festen Oberfläche mit einem Zelllysat einer zweiten Zellpopulation, wobei ein zweites Bindungsmuster erzeugt wird; und (c) Vergleichen des Bindungsmusters des ersten Zelllysats mit dem Bindungsmuster des zweiten Zelllysats.
  2. Ein Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Antikörper nicht charakterisierte Bindungsspezifität aufweisen.
  3. Ein Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei es sich bei den Antikörpern um rekombinante Antikörper handelt.
  4. Ein Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, wobei das erste Zelllysat von normalen Zellen und das zweite Zelllysat von anormalen Zellen stammt.
  5. Ein Verfahren wie in Anspruch 4 beansprucht, wobei es sich bei den anormalen Zellen um Krebszellen handelt.
  6. Ein Verfahren wie ein einem der Ansprüche 1 bis 4 beansprucht, wobei das erste Zelllysat von normalen Zellen in einem ruhenden Zustand und das zweite Zelllysat von anormalen Zellen in einem angeregten Zustand stammt.
  7. Ein Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 beansprucht, wobei der Unterschied zwischen dem ersten und dem zweiten Zelllysat in dem Vorhandensein einer detektierbaren Markierung besteht.
DE69938623T 1998-02-04 1999-02-04 Microarrays und ihre verwendungen Expired - Lifetime DE69938623T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7360598P 1998-02-04 1998-02-04
US73605P 1998-02-04
PCT/US1999/002442 WO1999040434A1 (en) 1998-02-04 1999-02-04 Microarrays and uses therefor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69938623D1 DE69938623D1 (de) 2008-06-12
DE69938623T2 true DE69938623T2 (de) 2009-05-28

Family

ID=22114700

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69938623T Expired - Lifetime DE69938623T2 (de) 1998-02-04 1999-02-04 Microarrays und ihre verwendungen

Country Status (8)

Country Link
US (5) US7794946B1 (de)
EP (3) EP1965213A3 (de)
JP (1) JP2002502977A (de)
AT (1) ATE393912T1 (de)
AU (1) AU2583899A (de)
CA (1) CA2318175A1 (de)
DE (1) DE69938623T2 (de)
WO (1) WO1999040434A1 (de)

Families Citing this family (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999039210A1 (en) * 1998-01-29 1999-08-05 Miller, Samuel High density arrays for proteome analysis and methods and compositions therefor
EP1965213A3 (de) 1998-02-04 2009-07-15 Invitrogen Corporation Microarrays und ihre Verwendungen
US6406921B1 (en) 1998-07-14 2002-06-18 Zyomyx, Incorporated Protein arrays for high-throughput screening
US6780582B1 (en) 1998-07-14 2004-08-24 Zyomyx, Inc. Arrays of protein-capture agents and methods of use thereof
US6682942B1 (en) 1998-07-14 2004-01-27 Zyomyx, Inc. Microdevices for screening biomolecules
US6576478B1 (en) 1998-07-14 2003-06-10 Zyomyx, Inc. Microdevices for high-throughput screening of biomolecules
US6897073B2 (en) 1998-07-14 2005-05-24 Zyomyx, Inc. Non-specific binding resistant protein arrays and methods for making the same
CA2350111A1 (en) 1998-11-16 2000-05-25 Genway Biotech, Inc. Generation of antibodies using polynucleotide vaccination in avian species
NZ525421A (en) 1998-12-23 2004-10-29 Univ Sydney Method of treating cancer by determining the presence of the disease condition using an assay to determine the binding pattern of immobilised immunoglobulins
WO2001016600A1 (fr) * 1999-08-31 2001-03-08 Mitsubishi Chemical Corporation Methode d'analyse d'une interaction mutuelle entre une proteine et une molecule
ATE263375T1 (de) * 1999-10-13 2004-04-15 Incyte Corp Multiple analyse von zytokinen
KR20020059808A (ko) 1999-11-28 2002-07-13 와이즈먼 앤드루 항체 친화도에 기초한 루프스 치료방법 및 그것의 사용을위한 스크리닝 방법과 조성물
GB9928789D0 (en) * 1999-12-03 2000-02-02 Medical Res Council Naive screening method
EP1276900A2 (de) * 2000-01-11 2003-01-22 Maxygen, Inc. Integrierte systeme und verfahren zur generierung und screening der diversität
US9335328B2 (en) * 2000-02-03 2016-05-10 Instant Medical Diagnostics, Llc Method and apparatus for signal transduction pathway profiling
US6953551B2 (en) 2000-02-22 2005-10-11 Genospectra, Inc. Microarray fabrication techniques and apparatus
WO2001062377A2 (en) * 2000-02-22 2001-08-30 Genospectra, Inc. Microarray fabrication techniques and apparatus
CN1654956A (zh) 2000-05-04 2005-08-17 耶鲁大学 用于筛选蛋白活性的高密度蛋白阵列
DE10023130B4 (de) * 2000-05-11 2007-10-18 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Hyphenspezifische Faktoren aus Candida albicans
WO2002008261A2 (en) * 2000-07-26 2002-01-31 Stanford University Bstp-trans protein and related reagents and methods of use thereof
US20020048823A1 (en) * 2000-08-11 2002-04-25 Qianjin Hu Methods and universal monoclonal antibody array
AUPR005600A0 (en) * 2000-09-12 2000-10-05 University Of Sydney, The Diagnostic assay
US7354721B2 (en) 2000-09-22 2008-04-08 Clontech Laboratories, Inc. Highly sensitive proteomic analysis methods, and kits and systems for practicing the same
US20020137104A1 (en) * 2000-11-27 2002-09-26 Antonio Cosma High throughput determination of antigen expression
EP1270740A1 (de) * 2001-06-29 2003-01-02 SIRS-Lab GmbH Biochip und dessen Verwendung zur Bestimmung von Entzündungen
US7297553B2 (en) 2002-05-28 2007-11-20 Nanosphere, Inc. Method for attachment of silylated molecules to glass surfaces
AU2002322458A1 (en) 2001-07-13 2003-01-29 Nanosphere, Inc. Method for immobilizing molecules onto surfaces
KR20030011982A (ko) * 2001-07-25 2003-02-12 주식회사 인투젠 ｃＤＮＡ 마이크로어레이 분석법을 이용한 위암의 진단과항암제 개발에 사용되는 표적유전자 및 이것이 배열된마이크로어레이용 고형 지지체
US20030228709A1 (en) * 2002-03-25 2003-12-11 Kozlowski Roland Zbignieiw Arrays
EP1552300B1 (de) * 2002-10-15 2011-07-20 Abmetrix, Inc. Sätze gegen kurze epitope gerichteter digitaler antikörper sowie diese verwendende verfahren
WO2004037206A2 (en) * 2002-10-23 2004-05-06 University Of Hawaii Methods for diagnosing and treating pre-term labor
CA2512181A1 (en) * 2003-01-02 2004-07-22 Bioforce Nanosciences, Inc. Method and apparatus for molecular analysis in small sample volumes
DE10315031B4 (de) * 2003-04-02 2014-02-13 Analytik Jena Ag Verfahren zur Erkennung von Sepsis und/oder sepsisähnlichen Zuständen
EP2366799A3 (de) * 2003-04-02 2012-06-20 SIRS-Lab GmbH Verfahren zur in vitro Erkennung schwerer Sepsis
US20040248323A1 (en) 2003-06-09 2004-12-09 Protometrix, Inc. Methods for conducting assays for enzyme activity on protein microarrays
DE102004015605B4 (de) * 2004-03-30 2012-04-26 Sirs-Lab Gmbh Verfahren zur Vorhersage des individuellen Krankheitsverlaufs bei Sepsis
DE102004049897B4 (de) 2004-10-13 2007-11-22 Sirs-Lab Gmbh Verfahren zur Unterscheidung zwischen nichtinfektiösen und infektiösen Ursachen eines Multiorganversagens
US20060292559A1 (en) * 2005-06-23 2006-12-28 Beckman Coulter, Inc. Cell-based microarrays, and methods for their preparation and use
AU2006283130B2 (en) 2005-08-22 2012-02-09 Cornell Research Foundation, Inc. Compositions and methods for analyzing protein interactions
US9463458B2 (en) 2009-03-02 2016-10-11 Dignity Health Diagnostic devices and methods of use
WO2010107825A2 (en) 2009-03-16 2010-09-23 Pangu Biopharma Limited Compositions and methods comprising histidyl-trna synthetase splice variants having non-canonical biological activities
JP5848236B2 (ja) 2009-03-31 2016-01-27 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド 非標準的な生物活性を有するアスパルチルｔＲＮＡ合成酵素を含む組成物および方法
AU2011248625B2 (en) 2010-04-26 2017-01-05 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of cysteinyl-tRNA synthetase
WO2011139799A2 (en) 2010-04-27 2011-11-10 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of isoleucyl trna synthetases
CN103097524B (zh) 2010-04-28 2016-08-03 Atyr医药公司 与丙氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
US9068177B2 (en) 2010-04-29 2015-06-30 Atyr Pharma, Inc Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glutaminyl-tRNA synthetases
CA2797393C (en) 2010-04-29 2020-03-10 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of valyl trna synthetases
CN103097523B (zh) 2010-04-29 2016-09-28 Atyr医药公司 与天冬酰胺酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
WO2011135459A2 (en) 2010-04-29 2011-11-03 Medical Prognosis Institute A/S Methods and devices for predicting treatment efficacy
WO2011140132A2 (en) 2010-05-03 2011-11-10 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of phenylalanyl-alpha-trna synthetases
CN103096925A (zh) 2010-05-03 2013-05-08 Atyr医药公司 与精氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
JP6008841B2 (ja) 2010-05-03 2016-10-19 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド メチオニルｔＲＮＡ合成酵素のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見
CN102985103A (zh) 2010-05-04 2013-03-20 Atyr医药公司 与p38多-tRNA合成酶复合物相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
US8945541B2 (en) 2010-05-14 2015-02-03 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of phenylalanyl-beta-tRNA synthetases
JP6027965B2 (ja) 2010-05-17 2016-11-16 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド ロイシルｔＲＮＡ合成酵素のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見
JP5906237B2 (ja) 2010-06-01 2016-04-20 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド リジルｔＲＮＡ合成酵素のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見
CN103118695B (zh) 2010-07-12 2016-08-03 Atyr医药公司 与甘氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的发现
US9188593B2 (en) 2010-07-16 2015-11-17 The University Of British Columbia Methods for assaying cellular binding interactions
WO2012027611A2 (en) 2010-08-25 2012-03-01 Atyr Pharma, Inc. INNOVATIVE DISCOVERY OF THERAPEUTIC, DIAGNOSTIC, AND ANTIBODY COMPOSITIONS RELATED TO PROTEIN FRAGMENTS OF TYROSYL-tRNA SYNTHETASES
AU2012265177B2 (en) 2011-06-01 2017-03-02 Medical Prognosis Institute A/S Methods and devices for prognosis of cancer relapse
ES1076494Y (es) * 2012-02-15 2012-06-12 Duart Andoni Monforte Dispositivo para la elaboracion de bebida
US8835387B2 (en) 2012-02-16 2014-09-16 Atyr Pharma, Inc. Histidyl-tRNA synthetases for treating autoimmune and inflammatory diseases
DE102012020496A1 (de) 2012-10-18 2014-04-24 Charité - Universitätsmedizin Berlin Biomarker zur Diagnostik und Behandlung von Neurofibromatose Typ 1
US10260103B2 (en) 2012-11-27 2019-04-16 Pontificia Universidad Catolica De Chile Compositions and methods for diagnosing thyroid tumors
US10392667B2 (en) 2013-06-07 2019-08-27 Medical Prognosis Institute A/S Methods and devices for predicting treatment efficacy of fulvestrant in cancer patients
WO2016008048A1 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Ontario Institute For Cancer Research Methods and devices for predicting anthracycline treatment efficacy
CN108398550B (zh) * 2018-03-07 2022-07-26 深圳市伯劳特生物制品有限公司 一种组合物、芯片及其制备方法和包含有该芯片的检测装置
CN108398554B (zh) * 2018-03-07 2020-08-07 深圳市伯劳特生物制品有限公司 一种抗torch-IgM型抗体谱芯片及其制备方法与TORCH检测的试剂盒
CN108398564B (zh) * 2018-03-07 2020-08-07 深圳市伯劳特生物制品有限公司 一种抗torch-IgG型抗体谱芯片及其制备方法与TORCH检测的试剂盒
US20250034623A1 (en) * 2021-10-25 2025-01-30 Singular Genomics Systems, Inc. Manipulating and detecting biological samples

Family Cites Families (199)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4071409A (en) 1976-05-20 1978-01-31 Corning Glass Works Immobilization of proteins on inorganic support materials
US4281061A (en) * 1979-07-27 1981-07-28 Syva Company Double antibody for enhanced sensitivity in immunoassay
US4722896A (en) 1981-01-26 1988-02-02 The Beth Israel Hospital Association Method for affinity purification of hybridoma antibodies
US4444879A (en) * 1981-01-29 1984-04-24 Science Research Center, Inc. Immunoassay with article having support film and immunological counterpart of analyte
NZ199722A (en) 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
AR231590A1 (es) * 1981-04-29 1984-12-28 Ciba Geigy Ag Dispositivo de analisis inmunologico y procedimiento para obtenerlo
US4483929A (en) 1982-05-03 1984-11-20 Liposome Technology Incorporated Liposomes with glycolipid-linked antibodies
US4690715A (en) 1982-06-18 1987-09-01 American Telephone And Telegraph Company, At&T Bell Laboratories Modification of the properties of metals
US4514508A (en) * 1982-07-06 1985-04-30 Biond Inc. Assaying for a multiplicity of antigens or antibodies with a detection compound
US4973493A (en) 1982-09-29 1990-11-27 Bio-Metric Systems, Inc. Method of improving the biocompatibility of solid surfaces
US4994373A (en) 1983-01-27 1991-02-19 Enzo Biochem, Inc. Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes
US4591570A (en) 1983-02-02 1986-05-27 Centocor, Inc. Matrix of antibody-coated spots for determination of antigens
US4865998A (en) 1983-03-11 1989-09-12 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Monoclonal antibodies to human lung cancers and method
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8314523D0 (en) 1983-05-25 1983-06-29 Lowe C R Diagnostic device
US5096807A (en) 1985-03-06 1992-03-17 Murex Corporation Imaging immunoassay detection system with background compensation and its use
EP0218680A1 (de) * 1985-04-10 1987-04-22 Immunicon Corporation Direktes homogenes testverfahren
US5866363A (en) 1985-08-28 1999-02-02 Pieczenik; George Method and means for sorting and identifying biological information
US4894146A (en) 1986-01-27 1990-01-16 University Of Utah Thin channel split flow process and apparatus for particle fractionation
US4802951A (en) 1986-03-07 1989-02-07 Trustees Of Boston University Method for parallel fabrication of nanometer scale multi-device structures
US4728591A (en) 1986-03-07 1988-03-01 Trustees Of Boston University Self-assembled nanometer lithographic masks and templates and method for parallel fabrication of nanometer scale multi-device structures
US5643948A (en) 1986-06-11 1997-07-01 Procyon Pharmaceuticals, Inc. Protein kinase C modulators. K.
US4859538A (en) 1986-11-20 1989-08-22 Ribi Hans O Novel lipid-protein compositions and articles and methods for their preparation
US5079600A (en) 1987-03-06 1992-01-07 Schnur Joel M High resolution patterning on solid substrates
JPH056800Y2 (de) * 1987-04-27 1993-02-22
US4987032A (en) 1987-06-26 1991-01-22 Fuji Photo Film Co., Ltd. Functional organic thin film and method of manufacture thereof
US5154808A (en) 1987-06-26 1992-10-13 Fuji Photo Film Co., Ltd. Functional organic thin film and process for producing the same
US4880750A (en) 1987-07-09 1989-11-14 Miragen, Inc. Individual-specific antibody identification methods
GB8803000D0 (en) 1988-02-10 1988-03-09 Ekins Roger Philip Determination of ambient concentrations of several analytes
US5807755A (en) 1987-08-06 1998-09-15 Multilyte Limited Determination of ambient concentrations of several analytes
US5217869A (en) * 1987-10-13 1993-06-08 Terrapin Technologies, Inc. Method to produce immunodiagnostic reagents
US5300425A (en) 1987-10-13 1994-04-05 Terrapin Technologies, Inc. Method to produce immunodiagnostic reagents
CA1339069C (en) * 1987-11-09 1997-07-29 Henry Lee Niman Polypeptide-induced monoclonal receptors to protein ligand
US6692751B1 (en) 1988-05-06 2004-02-17 New York Blood Center Methods and systems for producing recombinant viral antigens
US4908112A (en) 1988-06-16 1990-03-13 E. I. Du Pont De Nemours & Co. Silicon semiconductor wafer for analyzing micronic biological samples
US5075077A (en) 1988-08-02 1991-12-24 Abbott Laboratories Test card for performing assays
US5281540A (en) 1988-08-02 1994-01-25 Abbott Laboratories Test array for performing assays
SE462454B (sv) 1988-11-10 1990-06-25 Pharmacia Ab Maetyta foer anvaendning i biosensorer
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
IT1229691B (it) 1989-04-21 1991-09-06 Eniricerche Spa Sensore con antigene legato chimicamente a un dispositivo semiconduttore.
US6416952B1 (en) 1989-06-07 2002-07-09 Affymetrix, Inc. Photolithographic and other means for manufacturing arrays
US6346413B1 (en) 1989-06-07 2002-02-12 Affymetrix, Inc. Polymer arrays
US6919211B1 (en) 1989-06-07 2005-07-19 Affymetrix, Inc. Polypeptide arrays
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US6040138A (en) * 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5491097A (en) 1989-06-15 1996-02-13 Biocircuits Corporation Analyte detection with multilayered bioelectronic conductivity sensors
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5252743A (en) 1989-11-13 1993-10-12 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of anti-ligands on surfaces
DE3939973A1 (de) 1989-12-02 1991-06-06 Basf Ag Zweidimensional kristallisierte makromolekuelschichten
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
US5858188A (en) 1990-02-28 1999-01-12 Aclara Biosciences, Inc. Acrylic microchannels and their use in electrophoretic applications
SE470347B (sv) 1990-05-10 1994-01-31 Pharmacia Lkb Biotech Mikrostruktur för vätskeflödessystem och förfarande för tillverkning av ett sådant system
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ATE185601T1 (de) 1990-07-10 1999-10-15 Cambridge Antibody Tech Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
US5665582A (en) 1990-10-29 1997-09-09 Dekalb Genetics Corp. Isolation of biological materials
US5639620A (en) 1990-10-31 1997-06-17 Coulter Corporation Polymeric particles having a biodegradable gelatin or aminodextran coating and process for making same
IE914007A1 (en) 1990-11-19 1992-05-20 Univ Illinois A protein being genetically engineered to provide¹orientability and a substrate having an oriented layer of¹proteins
US5294369A (en) 1990-12-05 1994-03-15 Akzo N.V. Ligand gold bonding
WO1992010588A1 (en) 1990-12-06 1992-06-25 Affymax Technologies N.V. Sequencing by hybridization of a target nucleic acid to a matrix of defined oligonucleotides
WO1992013629A1 (en) * 1991-01-31 1992-08-20 Wayne State University A method for analyzing an organic sample
US5763170A (en) 1991-04-16 1998-06-09 Amersham International Plc Method for forming an array of biological particles
US5283283A (en) 1991-08-02 1994-02-01 The Goodyear Tire & Rubber Company High modulus blend of poly(α-amino acid) in rubbery elastomer
DE69223980T2 (de) 1991-10-15 1998-05-28 Multilyte Ltd Bindungstest unter benutzung eines markierten reagens
US5605662A (en) * 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
US6051380A (en) 1993-11-01 2000-04-18 Nanogen, Inc. Methods and procedures for molecular biological analysis and diagnostics
US5846708A (en) 1991-11-19 1998-12-08 Massachusetts Institiute Of Technology Optical and electrical methods and apparatus for molecule detection
IL103674A0 (en) 1991-11-19 1993-04-04 Houston Advanced Res Center Method and apparatus for molecule detection
US5412087A (en) 1992-04-24 1995-05-02 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of oligonucleotides and other biological polymers on surfaces
US6943034B1 (en) 1991-11-22 2005-09-13 Affymetrix, Inc. Combinatorial strategies for polymer synthesis
EP0916396B1 (de) 1991-11-22 2005-04-13 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) Kombinatorische Strategien für die Polymersynthese
US5384261A (en) 1991-11-22 1995-01-24 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis using mechanically directed flow paths
WO1993011161A1 (en) 1991-11-25 1993-06-10 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
DE69233782D1 (de) 1991-12-02 2010-05-20 Medical Res Council Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken
EP0544969B1 (de) 1991-12-06 1997-03-05 Ciba-Geigy Ag Elektrophoretische Trennvorrichtung und elektrophoretisches Trennverfahren
JP3507073B2 (ja) 1992-03-24 2004-03-15 ケンブリッジ アンティボディー テクノロジー リミティド 特異的結合対の成員の製造方法
CA2064683A1 (en) 1992-03-26 1993-09-27 Krishna Mohan Rao Kallury Formation of thermostable enzymes with extra-ordinary heat tolerance by immobilization on phospholipid matrices
US6100099A (en) 1994-09-06 2000-08-08 Abbott Laboratories Test strip having a diagonal array of capture spots
US5756355A (en) 1992-04-22 1998-05-26 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Lipid membrane sensors
US6107059A (en) 1992-04-29 2000-08-22 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
US5726026A (en) 1992-05-01 1998-03-10 Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale sample preparation device and systems for determination and processing of analytes
US5304487A (en) 1992-05-01 1994-04-19 Trustees Of The University Of Pennsylvania Fluid handling in mesoscale analytical devices
US5637469A (en) 1992-05-01 1997-06-10 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and apparatus for the detection of an analyte utilizing mesoscale flow systems
US5348886A (en) 1992-09-04 1994-09-20 Monsanto Company Method of producing recombinant eukaryotic viruses in bacteria
DE4237113B4 (de) 1992-11-03 2006-10-12 "Iba Gmbh" Peptide und deren Fusionsproteine, Expressionsvektor und Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins
US5472881A (en) 1992-11-12 1995-12-05 University Of Utah Research Foundation Thiol labeling of DNA for attachment to gold surfaces
US5532142A (en) 1993-02-12 1996-07-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Method of isolation and purification of fusion polypeptides
IT1270866B (it) 1993-03-10 1997-05-13 Eniricerche Spa Vettore ricombinante e suo impiego per la preparazione esocellulare di anticorpi in forma di singola molecola da bacillus subtilis
US5436134A (en) 1993-04-13 1995-07-25 Molecular Probes, Inc. Cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes
US5512492A (en) 1993-05-18 1996-04-30 University Of Utah Research Foundation Waveguide immunosensor with coating chemistry providing enhanced sensitivity
US5677196A (en) 1993-05-18 1997-10-14 University Of Utah Research Foundation Apparatus and methods for multi-analyte homogeneous fluoro-immunoassays
NZ267842A (en) 1993-05-28 1997-09-22 Baylor College Medicine Apparatus for measuring molecular mass (by mass spectrometry) in which the sample is ionised on the sample holder and desorbed therefrom by laser pulses
US5861242A (en) 1993-06-25 1999-01-19 Affymetrix, Inc. Array of nucleic acid probes on biological chips for diagnosis of HIV and methods of using the same
US5837832A (en) 1993-06-25 1998-11-17 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
US5441876A (en) 1993-07-30 1995-08-15 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Process for the preparation of headgroup-modified phospholipids using phosphatidylhydroxyalkanols as intermediates
RU2041262C1 (ru) 1993-08-11 1995-08-09 Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН Способ иммобилизации водорастворимых биоорганических соединений на капиллярно-пористый носитель
US5512131A (en) 1993-10-04 1996-04-30 President And Fellows Of Harvard College Formation of microstamped patterns on surfaces and derivative articles
US5776748A (en) 1993-10-04 1998-07-07 President And Fellows Of Harvard College Method of formation of microstamped patterns on plates for adhesion of cells and other biological materials, devices and uses therefor
US5429807A (en) 1993-10-28 1995-07-04 Beckman Instruments, Inc. Method and apparatus for creating biopolymer arrays on a solid support surface
DE69435196D1 (de) 1993-10-28 2009-04-23 Houston Advanced Res Ct Mikrofabriziertes poröses Durchflussgerät zur diskreten Bestimmung von Bindungsreaktionen
US5429708A (en) 1993-12-22 1995-07-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Molecular layers covalently bonded to silicon surfaces
GB9326451D0 (en) 1993-12-24 1994-02-23 Multilyte Ltd Binding assay
GB9326450D0 (en) * 1993-12-24 1994-02-23 Multilyte Ltd Binding assay
DE4435728A1 (de) 1994-01-19 1995-07-20 Boehringer Mannheim Gmbh Biotinsilan-Verbindungen und diese Verbindungen enthaltende Bindematrix
ATE221660T1 (de) 1994-01-19 2002-08-15 Roche Diagnostics Gmbh Biotinsilan-verbindungen und diese verbindungen enthaltende bindematrix
US5594151A (en) 1994-01-28 1997-01-14 Prolinx, Inc. Phenylboronic acid complexing reagents derived from aminosalicylic acid
US5594111A (en) 1994-01-28 1997-01-14 Prolinx, Inc. Phenylboronic acid complexes for bioconjugate preparation
US5623055A (en) 1994-01-28 1997-04-22 Prolinx, Inc. Phenylboronic acid complexes derived from aminosalicylic acid for bioconjugate preparation
WO1995022051A1 (en) 1994-02-09 1995-08-17 Abbott Laboratories Diagnostic flow cell device
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
GB9404709D0 (en) 1994-03-11 1994-04-27 Multilyte Ltd Binding assay
US5538897A (en) 1994-03-14 1996-07-23 University Of Washington Use of mass spectrometry fragmentation patterns of peptides to identify amino acid sequences in databases
US5514501A (en) 1994-06-07 1996-05-07 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Commerce Process for UV-photopatterning of thiolate monolayers self-assembled on gold, silver and other substrates
US6287850B1 (en) 1995-06-07 2001-09-11 Affymetrix, Inc. Bioarray chip reaction apparatus and its manufacture
EP0695941B1 (de) 1994-06-08 2002-07-31 Affymetrix, Inc. Verfahren und Vorrichtung zum Verpacken von Chips
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5498545A (en) * 1994-07-21 1996-03-12 Vestal; Marvin L. Mass spectrometer system and method for matrix-assisted laser desorption measurements
SE9403245D0 (sv) 1994-09-26 1994-09-26 Pharmacia Biosensor Ab Improvements relating to bilayer lipid membranes
US5620850A (en) 1994-09-26 1997-04-15 President And Fellows Of Harvard College Molecular recognition at surfaces derivatized with self-assembled monolayers
US6121048A (en) 1994-10-18 2000-09-19 Zaffaroni; Alejandro C. Method of conducting a plurality of reactions
US5571410A (en) 1994-10-19 1996-11-05 Hewlett Packard Company Fully integrated miniaturized planar liquid sample handling and analysis device
US5585069A (en) 1994-11-10 1996-12-17 David Sarnoff Research Center, Inc. Partitioned microelectronic and fluidic device array for clinical diagnostics and chemical synthesis
US5603351A (en) 1995-06-07 1997-02-18 David Sarnoff Research Center, Inc. Method and system for inhibiting cross-contamination in fluids of combinatorial chemistry device
US5688642A (en) 1994-12-01 1997-11-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Selective attachment of nucleic acid molecules to patterned self-assembled surfaces
US5622826A (en) 1994-12-22 1997-04-22 Houston Advanced Research Center Method for immobilization of molecules on platinum solid support surfaces
US5814565A (en) 1995-02-23 1998-09-29 University Of Utah Research Foundation Integrated optic waveguide immunosensor
DE19507166C1 (de) 1995-03-01 1996-04-18 Deutsches Krebsforsch Antikörper gegen ein Histidin-Fusionspolypeptid, das einen Histidin-Anteil aufweist
US5629213A (en) 1995-03-03 1997-05-13 Kornguth; Steven E. Analytical biosensor
JPH11503005A (ja) 1995-03-08 1999-03-23 アクゾ ノーベル ナムローゼ フェンノートシャップ 表面修飾されたアフィニティ分離膜
EP2280268B1 (de) 1995-03-10 2014-09-03 Meso Scale Technologies, LLC. Multispezifische Multiarray-Elektrochemielumineszenz-Prüfung
US6140045A (en) 1995-03-10 2000-10-31 Meso Scale Technologies Multi-array, multi-specific electrochemiluminescence testing
US6309820B1 (en) 1995-04-07 2001-10-30 University Of North Carolina At Chapel Hill Polypeptides having a functional domain of interest and methods of identifying and using same
ATE254965T1 (de) * 1995-04-25 2003-12-15 Discovery Partners Internation Fernprogrammierbare matrizen mit speichern und verwendungen davon
US5624711A (en) 1995-04-27 1997-04-29 Affymax Technologies, N.V. Derivatization of solid supports and methods for oligomer synthesis
US5827659A (en) * 1995-05-19 1998-10-27 Perseptive Biosystems, Inc. Methods and apparatus for sequencing polymers using mass spectrometry
US5625184A (en) * 1995-05-19 1997-04-29 Perseptive Biosystems, Inc. Time-of-flight mass spectrometry analysis of biomolecules
US5700642A (en) 1995-05-22 1997-12-23 Sri International Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers
US5776674A (en) 1995-06-05 1998-07-07 Seq, Ltd Chemical biochemical and biological processing in thin films
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
US5840300A (en) 1995-09-11 1998-11-24 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions comprising single chain recombinant antibodies
DE19543232A1 (de) 1995-11-07 1997-05-15 Knoell Hans Forschung Ev Herstellung einer Matrix-gebundenen miniaturisierten kombinatorischen Poly- und Oligomerbibliothek
US5763263A (en) 1995-11-27 1998-06-09 Dehlinger; Peter J. Method and apparatus for producing position addressable combinatorial libraries
DE69632921T2 (de) 1995-12-01 2005-07-14 Innogenetics N.V. System und verfahren zur bestimmung der impedanz und herstellungsverfahren
DE19548152A1 (de) 1995-12-22 1997-06-26 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur Bedeckung einer Oberfläche mit einem Film eines Oligoethylenglykolderivates
US5837196A (en) * 1996-01-26 1998-11-17 The Regents Of The University Of California High density array fabrication and readout method for a fiber optic biosensor
US5942443A (en) 1996-06-28 1999-08-24 Caliper Technologies Corporation High throughput screening assay systems in microscale fluidic devices
US5925552A (en) 1996-04-25 1999-07-20 Medtronic, Inc. Method for attachment of biomolecules to medical devices surfaces
US5731152A (en) 1996-05-13 1998-03-24 Motorola, Inc. Methods and systems for biological reagent placement
US6103479A (en) 1996-05-30 2000-08-15 Cellomics, Inc. Miniaturized cell array methods and apparatus for cell-based screening
JPH1025299A (ja) 1996-07-12 1998-01-27 Nec Corp 整列ペプチド、及びそれを用いたタンパク質の結合・相互作用部位検出方法
US5827658A (en) 1996-08-09 1998-10-27 The United States Of America As Reprsented By The Department Of Health And Human Services Isolation of amplified genes via cDNA subtractive hybridization
US20030017149A1 (en) 1996-10-10 2003-01-23 Hoeffler James P. Single chain monoclonal antibody fusion reagents that regulate transcription in vivo
GB9624927D0 (en) 1996-11-29 1997-01-15 Oxford Glycosciences Uk Ltd Gels and their use
US5905024A (en) 1996-12-17 1999-05-18 University Of Chicago Method for performing site-specific affinity fractionation for use in DNA sequencing
CA2389358C (en) 1996-12-31 2008-07-15 Genometrix Incorporated Multiplexed molecular analysis apparatus and method
NZ516848A (en) 1997-06-20 2004-03-26 Ciphergen Biosystems Inc Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine
US5981734A (en) 1997-07-17 1999-11-09 University Of Chicago Methods for immobilizing nucleic acids on a gel substrate
JP4313861B2 (ja) 1997-08-01 2009-08-12 キヤノン株式会社 プローブアレイの製造方法
US6960457B1 (en) 1997-09-04 2005-11-01 Stanford University Reversible immobilization of arginine-tagged moieties on a silicate surface
US5922617A (en) 1997-11-12 1999-07-13 Functional Genetics, Inc. Rapid screening assay methods and devices
US6232066B1 (en) 1997-12-19 2001-05-15 Neogen, Inc. High throughput assay system
US6087102A (en) 1998-01-07 2000-07-11 Clontech Laboratories, Inc. Polymeric arrays and methods for their use in binding assays
WO1999039210A1 (en) * 1998-01-29 1999-08-05 Miller, Samuel High density arrays for proteome analysis and methods and compositions therefor
EP1965213A3 (de) * 1998-02-04 2009-07-15 Invitrogen Corporation Microarrays und ihre Verwendungen
US6087103A (en) 1998-03-04 2000-07-11 Lifespan Biosciences, Inc. Tagged ligand arrays for identifying target-ligand interactions
US6001607A (en) 1998-04-13 1999-12-14 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human growth-associated methyltransfeases
WO1999053300A1 (en) 1998-04-14 1999-10-21 California Institute Of Technology Method and system for determining analyte activity
WO1999057311A2 (en) 1998-04-30 1999-11-11 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Novel method for the identification of clones conferring a desired biological property from an expression library
US20020119579A1 (en) 1998-07-14 2002-08-29 Peter Wagner Arrays devices and methods of use thereof
US6780582B1 (en) 1998-07-14 2004-08-24 Zyomyx, Inc. Arrays of protein-capture agents and methods of use thereof
US6406921B1 (en) 1998-07-14 2002-06-18 Zyomyx, Incorporated Protein arrays for high-throughput screening
US6576478B1 (en) 1998-07-14 2003-06-10 Zyomyx, Inc. Microdevices for high-throughput screening of biomolecules
US6897073B2 (en) 1998-07-14 2005-05-24 Zyomyx, Inc. Non-specific binding resistant protein arrays and methods for making the same
US6682942B1 (en) 1998-07-14 2004-01-27 Zyomyx, Inc. Microdevices for screening biomolecules
US6197599B1 (en) 1998-07-30 2001-03-06 Guorong Chin Method to detect proteins
US6190908B1 (en) 1998-08-12 2001-02-20 The Scripps Research Institute Modulation of polypeptide display on modified filamentous phage
US6635311B1 (en) 1999-01-07 2003-10-21 Northwestern University Methods utilizing scanning probe microscope tips and products therefor or products thereby
FR2792285B1 (fr) 1999-04-16 2001-06-08 Onera (Off Nat Aerospatiale) Surface aerodynamique d'aeronef a deflecteur de bord de fuite
US7107329B1 (en) 1999-05-21 2006-09-12 Lucent Technologies Inc. In networks of interconnected router nodes for routing data traffic, a method of and system for imperceptibly upgrading router node software and the like without traffic interruption
KR100379411B1 (ko) 1999-06-28 2003-04-10 엘지전자 주식회사 바이오칩 및 그의 생체 물질 패터닝 및 측정 방법
US6899137B2 (en) 1999-06-28 2005-05-31 California Institute Of Technology Microfabricated elastomeric valve and pump systems
EP1250453B1 (de) 1999-12-10 2008-04-09 Invitrogen Corporation Verwendung einer vielzahl von rekombinationsstellen mit einzigartiger spezifität beim rekombinatorischen klonen
US6406840B1 (en) 1999-12-17 2002-06-18 Biomosaic Systems, Inc. Cell arrays and the uses thereof
CA2401118A1 (en) 2000-02-23 2001-08-30 Zyomyx, Inc. Microfluidic devices and methods
CN1654956A (zh) 2000-05-04 2005-08-17 耶鲁大学 用于筛选蛋白活性的高密度蛋白阵列
US7132251B1 (en) 2000-05-04 2006-11-07 Procognia Ltd Method and composition for analyzing a carbohydrate polymer
US6531283B1 (en) 2000-06-20 2003-03-11 Molecular Staging, Inc. Protein expression profiling
DE10039643A1 (de) 2000-08-14 2002-02-28 Max Planck Gesellschaft Funktionalisierte Perylentetracarbonsäurediimide
US7094568B2 (en) 2000-08-17 2006-08-22 Sense Proteomic Ltd. Method for producing proteins tagged at the N- or C-terminus
US7354721B2 (en) 2000-09-22 2008-04-08 Clontech Laboratories, Inc. Highly sensitive proteomic analysis methods, and kits and systems for practicing the same
US6699665B1 (en) 2000-11-08 2004-03-02 Surface Logix, Inc. Multiple array system for integrating bioarrays
CN1527720A (zh) 2001-05-11 2004-09-08 Ү³��ѧ 利用蛋白组芯片全面分析蛋白活性
CA2467456A1 (en) 2001-11-19 2003-05-30 Protometrix, Inc. Method of using a non-antibody protein to detect and measure an analyte
US20050233473A1 (en) 2002-08-16 2005-10-20 Zyomyx, Inc. Methods and reagents for surface functionalization
GB0300150D0 (en) 2003-01-04 2003-02-05 Banks J & Co Ltd Lockable releasable safety catch
US20040248323A1 (en) 2003-06-09 2004-12-09 Protometrix, Inc. Methods for conducting assays for enzyme activity on protein microarrays
US20050026215A1 (en) 2003-07-17 2005-02-03 Predki Paul F. Method for the prediction of an epitope

Also Published As

Publication number Publication date
EP1965213A3 (de) 2009-07-15
US20100022407A1 (en) 2010-01-28
ATE393912T1 (de) 2008-05-15
US8637264B2 (en) 2014-01-28
WO1999040434A1 (en) 1999-08-12
US20130123127A1 (en) 2013-05-16
DE69938623D1 (de) 2008-06-12
EP1060395A1 (de) 2000-12-20
US7794946B1 (en) 2010-09-14
EP1060395B1 (de) 2008-04-30
CA2318175A1 (en) 1999-08-12
US8012703B2 (en) 2011-09-06
EP1060395A4 (de) 2005-02-09
AU2583899A (en) 1999-08-23
EP2189791A2 (de) 2010-05-26
EP1965213A2 (de) 2008-09-03
US20020164656A1 (en) 2002-11-07
EP2189791A3 (de) 2011-03-09
US20120004131A1 (en) 2012-01-05
JP2002502977A (ja) 2002-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69938623T2 (de) Microarrays und ihre verwendungen
DE60108256T3 (de) Allergen-assay auf basis von mikroanordnungen
DE69922365T2 (de) Neue methode zur selektion von klonen einer expressionsbibliothek mittels "rearraying"
DE69835893T2 (de) Diagnostische tests und kits für clostridium difficile
DE69936453T2 (de) Für einen g-protein gekoppelten rezeptor, der an der empfindungstransduktion beteiligt ist, kodierende nukleinsäuren
DE69921982T2 (de) Neuartiges verfahren zur identifizierung von klonen mit einer gewünschten biologischen eigenschaft, ausgehend von einer expressionsgenbank
DE3855890T2 (de) Verfahren zur herstellung von imunodiagnose-mitteln
EP0789076A3 (de) Protein-G-gekoppelter Rezeptorproteine, deren Herstellung und Verwendung
DE60033183T2 (de) Transplantatabstossung und damit verbundene zustände
DE69927691T2 (de) Verfahren zur eiweissanalyse
DE69628847T2 (de) Testverfahren und testsatz zur diagnose von autoimmunerkrankungen
DE60130211T2 (de) Matrix-screening-verfahren
EP0547059B1 (de) Pankreas-elastase-1-spezifischer antikörper, ein verfahren zu seiner gewinnung und ein testkit der solche antikörper enthält
EP0815141B1 (de) Antikörper gegen ein, einen histidin-anteil aufweisendes fusionspolypeptid
CN112239505A (zh) 重组抗cd171八价抗体及神经来源外泌体的捕获方法
DE3650635T2 (de) Monoklonale Antikörper
DE69735760T2 (de) Antikörper gegen menschliches lect2, zellen die diesen produzieren und verfahren und kit zu dessen bestimmung
DE69400936T2 (de) Peptid entsprechend einem Epitop des menschlichen Parvovirus B19
DE19805351A1 (de) Neuer G-Protein-gekoppelter Rezeptor aus menschlichem Gehirn
DE19702065C1 (de) Polyklonaler Antikörper zum Nachweis des tumorassoziierten Antigens hTid
EP1410037A2 (de) Verfahren zur identifikation von immunreaktiven epitopen auf proteinen und verwendung der epitope zu prophylaktischen und therapeutischen zwecken
JPH03503003A (ja) 分子認識ユニット
WO1997010258A2 (de) Antikörper gegen an oberflächen von carcinom-zellen ausserhalb von desmosomen exponierte epitope desmosomaler cadherine
WO2003102591A2 (de) Verfahren zur identifizierung von interaktionspartnern mittels phage display
DE4236915C1 (de) Herstellung eines mono- oder polyklonalen Antikörpers und seine Verwendung

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: LIFE TECHNOLOGIES CORP. (N.D.GES.D. STAATES DE, US