JP2003524018A

JP2003524018A - フィブロネクチンのｅｄ‐ｂドメインに特異的な抗体、前記抗体を含む複合体、および血管形成を検出および治療するためのその使用

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Publication number: JP2003524018A
Application number: JP2001562581A
Authority: JP
Inventors: ダリオネリ; ロレンツォタルリ; フランチェスカヴィティー; マンフレートビルヒラー
Original assignee: アイトゲネーシシェテクニシェホッホシューレチューリッヒ
Priority date: 2000-02-24
Filing date: 2001-02-23
Publication date: 2003-08-12
Also published as: US20060133994A1; EP1259548A1; AU2001242432B2; WO2001062800A1; US8097254B2; AU4243201A; CA2400622A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、フィブロネクチンのＥＤ‐Ｂドメインの固有エピトープに特異的なナノモル以下の親和性を有する抗体、血管形成のマーカーに関する。さらに、本発明は、生体内(in vivo)で新生血管を検出するための、高親和性の放射標識抗ＥＤ‐Ｂ抗体、および前記抗体を含む診断キットの使用に関する。さらに、本発明は、前記抗体および適切な光活性分子（例えば、適切に選択された光増感剤または放射性核種）を含む複合体、および新生血管の選択的な光仲介閉塞へのその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、フィブロネクチンのＥＤ‐Ｂドメインの固有エピトープに特異的な
ナノモル以下の親和性を有する抗体、血管形成のマーカーに関する。本発明は、
生体内（in vivo）で新生血管を検出する高親和性放射標識抗ＥＤ‐Ｂ抗体の使
用および前記抗体を含む診断キットにも関する。

【０００２】さらに、本発明は、上記の前記抗体および適切な光活性分子（例えば、光増感
剤）を含む複合体、および新しい血管の検出および／または凝固でのその使用に
関するものである。

【０００３】発明の背景腫瘍は、新しい血管を形成（血管形成）することなく一定量を超えて成長する
ことは不可能であり、微小血管密度と腫瘍侵襲性との間の相関性は、多くの腫瘍
に関して報告されている（フォークマン（Folkman）(1995). Nature Med., 1, 2
7-31)。さらに、血管形成は、視力を失う結果となる眼疾患の大部分の根底にあ
る[リー（Lee）等, Surv. Ophthalmol. 43, 245-269 (1998); フリエドランダー
（Friedlander),M.等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 9764-9769 (1996).
]。血管形成のマーカーを選択的に標的化することが可能な分子によって、腫瘍
および糖尿病性網膜症および加齢黄斑変性症などの血管増殖を特徴とする他の疾
患を診断し、かつ治療する臨床の機会が提供されるだろう。血管形成のマーカー
は、攻撃的な固形腫瘍の大部分に発現し、静脈内注射された特異的バインダーに
容易に到達可能であるはずである(パスクアリーニ(Pasqualini)等(1997). Natur
e Biotechnol., 15, 542-546;ネリ(Neri)等(1997), Nature Biotechnol., 15 12
71-1275)。新生血管系の標的化された閉塞によって、結果として腫瘍の梗塞およ
び虚脱を生じさせることができる(オーレイリー(O'Reilly)等(1996).Nature Med
., 2, 689-692; ファング(Huang)等(1997). Science, 275, 547-550)。フィブロ
ネクチン分子に選択的スプライシングによって挿入される、マウス、ラットおよ
びヒトにおいて同一の９１個のアミノ酸配列であるフィブロネクチンのＥＤ‐Ｂ
ドメインは、新生血管構造の周りに特異的に蓄積し(カステラーニ（Castellani
）等 (1994). Int. J. Cancer 59, 612-618)、分子介入のための標的であること
が可能である。実際に、本発明者らは最近、抗ＥＤ‐Ｂ一本鎖Ｆｖ抗体フラグメ
ント（ｓｃＦｖ）が、腫瘍を有するマウスの腫瘍血管中で選択的に蓄積し、かつ
抗体親和性が標的化性能を示すらしいことを、蛍光技術を用いて示した(ネリ(Ne
ri)等(1997). Nature Biotechnol., 15 1271-1275; ＧＢ９６／１０９６７．３
に基づく国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９７／０１４１２)。注入して２４時間後、
またはその後の時点で、腫瘍標的化を評価した。

【０００４】腫瘍の標的化に使用するために、ＥＤ‐Ｂドメインに対する抗体を産生する様
々な試みが、当技術分野で知られている。

【０００５】ピーターズ（Peters )等(Cell Adhesion and Communication 1995, 3: 67-89)
によって、完全な(intact)ＥＤ‐Ｂドメイン以外に、ＦＮ配列を含有しない抗原
に対して産生されるポリクローナル抗体が開示されており、このポリクローナル
抗体は、このドメインに特異的かつ直接に結合することが示されている。

【０００６】しかしながら、ピーターズ（Peters)等の試薬には、一連の欠点：ピーターズ
(Peters)等の抗血清は、Ｎ‐グリカナーゼで処理した後にのみ、ＥＤ‐Ｂ（＋）
−ＦＮを認識するという欠点がある。このため、腫瘍の標的化、イメージングお
よび治療などの用途にはこれらの試薬は不適切である。というのは、糖鎖除去は
生体内(in vivo)で行うことができないからである。

【０００７】その著者らは自ら、それらの抗体が、哺乳類細胞により産生された完全長ＥＤ
‐Ｂ（＋）−ＦＮを認識しないことを認めている。彼らは、フィブロネクチンの
他のドメイン（ＥＤ‐Ａなど）に対する抗体が産生されていたとしても、フィブ
ロネクチンのＥＤ‐Ｂドメインに特異的なモノクローナル抗体を産生することは
不可能であったこともまた認めている。ポリクローナル抗血清が、上述の用途に
は容認できないことは、当技術分野では公知である。

【０００８】この分野における、何年にもわたる一心不乱の研究の後でさえ、フィブロネク
チンのＥＤ‐Ｂドメインを認識するモノクローナル抗体を、Ｎ‐グリカナーゼで
処理することなく、本発明で適用するファージディスプレイ技術を用いてのみ産
生することができるにすぎない。

【０００９】ザング(Zang)等 (Matrix Biology 1994, 14: 623-633)によって、イヌのＥＤ
‐Ｂドメインに対して産生されたポリクローナル抗血清が開示されている。著者
らは、これを試験してはいないが、ヒトのＥＤ‐Ｂ（＋）−ＦＮに対する交差反
応性を期待している。しかしながら、この著者らは、フィブロネクチンのＥＤ‐
Ｂドメインを直接認識するモノクローナル抗体を産生する難しさを認識している
（p.631）。その抗血清は、Ｎ−グリカナーゼで処理した後でのみ、ウエスタン
ブロット法においてＥＤ‐Ｂ（＋）−ＦＮを認識する。先に述べたように、グリ
カナーゼで処理すると、これらの試薬は、本発明による用途に不適切なものとな
る。

【００１０】ＥＬＩＳＡ法でのＥＤ‐Ｂ（＋）−ＦＮの認識は、変性剤（４Ｍ尿素）で抽出
され、かつゼラチンを用いてプラスチック上に取り込まれた軟骨に関してのみで
あるが、糖鎖除去の必要なく進行する。その著者らは、「ＥＬＩＳＡプレートの
プラスチック面上に結合したゼラチンにＦＮ分子を結合させることによって、何
とか、抗血清による認識のために十分にエピトープを露出することができる」と
述べている。生体内(in vivo)の用途では、ＦＮを変性させず、ゼラチンを結合
させることができることから、本発明のモノクローナルバインダーは、特異な利
点を提供する。

【００１１】日本特許ＪＰ０２０７６５９８およびＪＰ０４１６９１９５は、抗ＥＤ‐Ｂ抗
体に関する。モノクローナル抗ＥＤ‐Ｂ抗体が記述されているかどうかは、これ
らの特許から明らかではない。さらに、単一抗体（ＪＰ０２０７６５９８に記載
の抗体など）は、以下の証拠：ｉ）モノクローナル抗体は、明確に定義されたエピトープを認識するはずであ
る; ｉｉ）フィブロネクチンのＥＤ‐Ｂドメインの三次元構造は、ＮＭＲスペクト
ロスコピーによって決定される；ことに基づいて、式（１）、（２）、または（３）のアミノ酸配列： −（１）ＥＧＩＰＩＦＥＤＦＶＤＳＳＶＧＹ −（２）ＹＴＶＴＧＬＥＰＧＩＤＹＤＩＳ −（３）ＮＧＧＥＳＡＰＴＴＬＴＱＱＴの抗原決定基を有することは不可能であるように思われる。セグメント（１）、
（２）、または（３）は、ＥＤ‐Ｂ構造の反対面に位置し、１つのモノクローナ
ル抗体によって同時には結合されない。

【００１２】さらに、抗体の有用性を実証するために、腫瘍における局在性、ならびに構造
破壊試薬で処理することなく、生物サンプル中のＥＤ‐Ｂ（＋）−ＦＮ構造を染
色する証拠を示すべきである。

【００１３】カルネモーラ（Carnemolla）等，1992, J. Biol. Chem. 267, 24689-24692に
記載のＢＣ１抗体は、フィブロネクチンのＥＤ‐Ｂドメインの存在下で潜在性で
ある、ＥＤ‐Ｂドメイン上ではないが、ＦＮの第７ドメイン上のエピトープを認
識する。それは厳密には、ヒト特異的である。したがって、ＢＣ１抗体および本
発明の抗体は、異なる反応性を示す。さらに、ＢＣ１抗体は、単独でフィブロネ
クチンの第７ドメイン、およびＥＤ‐Ｂドメイン非存在下でフィブロネクチンの
第７〜８ドメインを認識する（カルネモーラ（Carnemolla）等 1992, J. Biol.
Chem. 267, 24689-24692)。かかるエピトープは、ＦＮ分子のタンパク分解性の
分解によって生体内(in vivo)で産生することができる。本発明による試薬の利
点は、それらがＥＤ‐Ｂドメインを含有する場合のみ、ＦＮ分子もしくはフラグ
メント上で局在化することができることである。

【００１４】癌の診断、さらに詳細には原発性および続発性腫瘍病変のイメージングには、
免疫シンチグラフィは、選択されるべき技術の一つである。この方法論では、患
者に放射標識化合物（例えば、適切な賦形剤に結合させた放射性核種）を注射し
た後に、適切な装置（例えば、ガンマカメラ）で患者をイメージングする。シン
チグラフィの用途では、電離放射線への患者の暴露を最小限にするために、テク
ネチウム‐９９ｍ、ヨウ素‐１２３またはインジウム‐１１１などの短寿命のガ
ンマ放出体が通常使用される。

【００１５】核医学研究部門で最も多く用いられている放射性核種は、テクネチウム‐９９
ｍ（９９ｍＴｃ）、６時間の半減期を有するガンマ放出体である。通常、９９ｍ
Ｔｃベースの放射性医薬品を注射した患者を、注射して１２〜２４時間後までに
イメージングすることができる；しかしながら、目的の病変において、核種が早
い時点で蓄積することが望ましい。

【００１６】さらに、新たに形成した血管上での迅速かつ選択的な局在化が可能な抗体が利
用可能であるならば、研究者らは刺激を受けて、診断上および／または治療上の
利点を得るために、抗体に結合する他の適切な分子を探すであろう。

【００１７】発明の概要注入の数時間後に、腫瘍病変を局在化させることが可能な放射性医薬品に関す
る核医学の必要性、および血管形成の標的化において抗体親和性がその性能に影
響を及ぼすようだという情報を考慮すると、本発明の目的は、ナノモル以下の解
離定数を有するフィブロネクチンのＥＤ‐Ｂドメインに特異的な抗体を産生する
ことである（抗体‐抗原親和性の決定および測定について検討するためには、ネ
リ(Neri)等(1996). Trends in Biotechnol. 14, 465-470を参照のこと）。本発
明の他の目的は、注入して数時間後には既に腫瘍病変を検出する、フィブロネク
チンのＥＤ‐Ｂドメインに対する、適切なフォーマットの放射標識抗体を提供す
ることである。

【００１８】本発明の一態様において、フィブロネクチンのＥＤ‐Ｂドメインの固有エピト
ープに対して特異的な親和性を有し、かつ前記ＥＤ‐Ｂエピトープに対して向上
した親和性を有する抗体によって、これらの目的が達成される。

【００１９】本発明のさらなる態様では、上述の抗体は、血管形成のマーカーを迅速に標的
化するのに使用される。

【００２０】本発明の他の態様は、前記抗体と、血管形成を検出するための１種または複数
種の試薬とを含む診断キットである。

【００２１】本発明のさらに他の態様は、腫瘍および血管増殖を特徴とする疾患を診断かつ
治療するための前記抗体の使用である。

【００２２】最後に、本発明の重要な態様は、前記抗体および適切な光活性分子（例えば、
適切に選択された光増感剤）を含む複合体と、新生血管の選択的な光仲介（ligh
t-mediated）閉塞へのその使用によって表される。

【００２３】用語本明細書全体をとおして、以下の定義に当てはまる、いくつかの技術用語を使
用する。 - 抗体これは、天然に産生されようと、一部もしくは全体が人工的に産生さようと、
免疫グロブリンを意味する。この用語は、抗体結合ドメインであるか、または抗
体結合ドメインに類似している結合ドメインを有するポリペプチドまたはタンパ
ク質もまた含む。これらは天然源から誘導すること、あるいは一部または全体を
人工的に産生することができる。抗体の例としては、免疫グロブリンアイソタイ
プおよびアイソタイプのサブクラス；Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄな
どの抗原結合ドメインを含むフラグメント；および二重特異性抗体が挙げられる
。モノクローナル抗体および他の抗体を利用し、組換えＤＮＡテクノロジーの技
術を用いて、元の抗体の特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を産生する
ことが可能である。かかる技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域、または相補
性決定領域（ＣＤＲ）をエンコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常
領域、または定常領域＋フレームワーク領域に導入することを含むことできる。
例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ２１８８６３８ＡまたはＥＰ−Ａ−２
３９４００を参照のこと。産生された抗体の結合特異性を変化させることができ
る、または変化させることができない、遺伝子突然変異または他の変化に、抗体
を産生するハイブリドーマまたは他の細胞をさらすことが可能である。数多くの
方法で抗体を修飾することができることから、「抗体」という用語は、いずれか
の特異的結合メンバー、および必要な特異性を有する結合ドメインを有する物質
を含むと考えるべきである。このように、この用語には、天然または完全にもし
くは一部人工であろうとなかろうと、免疫グロブリン結合ドメインを含有するい
ずれかのポリペプチドを含む、抗体フラグメント、誘導体、機能的に抗体に相当
する物および抗体の相同体が含まれる。したがって、他のポリペプチドに融合さ
れた、免疫グロブリン結合ドメインを含有するキメラ分子、またはその相当物が
含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４
およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３に記載されている。抗体全体のフラグメントが
、抗原を結合させる機能を実行することができることが示されている。結合フラ
グメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる
Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメ
ント；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント
；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント(ワード(Ward)等(1989) Na
ture, 341, 544-546.)；（ｖ）独立したＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２フ
ラグメント、連結した２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｖ
ｉｉ）２つのドメインが会合して、抗原結合部位を形成するのを可能にするポリ
ペプチドリンカーによって、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが連結している、
一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（バード（Bird)等 (1988) Science, 242, 423-426
）; ヒューストン(Huston)等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879
-83.); （ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖ＦＶ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９
６５）；および（ｉｘ）遺伝子融合よって構成された、「二重特異性抗体」、多
価もしくは多特異性フラグメント（ＷＯ９４／１３８０４; ホリガー(Holliger)
等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, 6444-6448)が挙げられる。二重
特異性抗体は、ポリペプチドの多量体であり、各ペプチドは、免疫グロブリン軽
鎖の結合領域を含む第１ドメインと、免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第２
ドメインとを含有し、その２つのドメインは連結している（例えば、ペプチドリ
ンカーによって）が、互いに会合して、抗原結合部位を形成することはできない
：抗原結合部位は、多量体中の一方のポリペプチドの第１ドメインと、多量体中
の他方のポリペプチドの第２ドメインとが会合することによって形成される（（
ＷＯ９４／１３８０４）。二重特異性抗体を使用すべき場合、これらは、様々な
方法で(ホリガー(Holliger)およびウィンター(Winter)(1993), Curr. Opin. Bio
tech., 4, 446-449)製造することができる、例えば化学的にもしくはハイブリッ
ドハイブリドーマから作製された従来の二重特異性抗体であるか、または上述の
二重特異性抗体フラグメントのいずれかであることが可能である。抗体全体より
もむしろ、ｓｃＦｖ二量体または二重特異性抗体を使用することが好ましい場合
がある。二重特異性抗体およびｓｃＦｖは、可変ドメインのみを用いて、Ｆｃ領
域なしで構成することが可能であり、抗イディオタイプの反応作用が低減される
可能性がある。二重特異性抗体の他の形態には、Neri等((1995) J. Mol. Biol.,
246, 367-373)により記載されている一本鎖ＣＲＡｂが含まれる。

【００２４】 −相補性決定領域従来から、特異的抗原認識に必須の残基を含有する、抗体可変ドメインの相補
性決定領域（ＣＤＲ）は、それらの超可変抗体配列として同定されている。本明
細書中、本発明者らは、コーチア（Chothia)およびレスク(Lesk)(1987) J. Mol.
Biol., 196, 901-917のＣＤＲ定義および番号付けを参照する。

【００２５】 - 機能的に等しい異型これは、もうひとつの分子（親）とは構造的相違を有するが、いくつかの著し
い類似性、および親分子の生物学的機能の少なくとも一部、例えば特定の抗原も
しくはエピトープに結合する能力も保持する分子（変異体）を意味する。変異体
は、フラグメント、誘導体または突然変異体の形態であることが可能である。変
異体、誘導体または突然変異体は、１個または複数のアミノ酸の追加、欠失、置
換もしくは挿入によって、または他の分子の結合によって、親分子を修飾するこ
とによって得られる。これらの変更は、ヌクレオチドまたはタンパク質レベルで
行うことができる。例えば、エンコードしたポリペプチドは、Ｆａｂフラグメン
トであることが可能であり、次いで他のソースからのＦｃ末端に連結する。代わ
りに、酵素、フルオレセインなどのマーカーを連結することができる。例えば、
フィブロネクチンのＥＤ‐Ｂドメインの固有エピトープに対する抗体「Ａ」の機
能的に等しい変異体は、相補性決定領域の異なる配列を有する抗体「Ｂ」である
ことが可能であるが、抗体「Ａ」の同じエピトープを認識する。

【００２６】本発明者らは、フィブロネクチンのＥＤ‐Ｂドメインに特異的であり、かつ組
織切片中でＥＤ‐Ｂ（＋）−フィブロネクチンを認識する、組織抗体ファージデ
ィスプレイライブラリからのｓｃＦｖフォーマットの単離した組換え抗体を有す
る。これらの抗体の１つであるＥ１は、親和性成熟して、向上した親和性を有す
る抗体Ｈ１０およびＬ１９を産生する。抗体Ｌ１９は、ナノモル以下の濃度範囲
でフィブロネクチンのＥＤ‐Ｂドメインに対する解離定数を有する。

【００２７】高親和性抗体Ｌ１９およびＤ１．３（関連のない抗原に特異的な抗体、ニワト
リ卵白リゾチーム(hen egg lysozyme)）を放射標識化し、腫瘍を有するマウスに
注入した。腫瘍、血液および器官の生体内分布を異なる時点で得て、組織１グラ
ム当たりの注入量パーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）として表した。注入して既に３
時間後には、Ｌ１９では、％ＩＤ／ｇ（腫瘍）は％ＩＤ／ｇ（血液）よりも高か
ったが、ネガティブコントロールのＤ１．３ではそうではなかった。腫瘍／血液
比は、より長時間の時点で増大した。これは、高親和性Ｌ１９が、例えば免疫シ
ンチグラフィによる血管形成の検出に有用な腫瘍標的剤であり得ることを示唆し
ている。

【００２８】 - 光増感剤 (または光感作物質) 照射した際に、かつ水および／または器官の存在下で、生体分子と反応するこ
とが可能な有毒分子種（例えば、一重項酸素）を生成し、その結果、細胞、組織
および体液などの生物標的に損傷を与える可能性のある光増感剤を、分子として
定義することができる。

【００２９】光増感剤は、６００ｎｍを超える波長で吸収する場合に特に有用である。実際
に、組織および体液中の光透過は、６００〜９００ｎｍの範囲で最大である[ワ
ン（Wan）等(1981) Photochem. Photobiol. 34, 679-681)。

【００３０】照射を伴う光増感剤の標的化デリバリーは、血管形成関連の疾患の治療に[ヤ
ーマッシュ（Yarmush）, M.L. 等Antibody targeted photolysis. Crit. Rev. T
herap. Drug Carrier Systems 10, 197-252 (1993); ロウ（Rowe）, P.M. ラン
セット（Lancet) 351, 1496 (1998); レビー（Levy）, J. Trends Biotechnol.
13, 14-18 (1995)]、特に眼の新生血管系の選択的切除に魅力のある手段である
。直接にまたは光増感剤を投与した後に利用可能な治療様式、例えばレーザー光
凝固術などは、選択性の欠如によって制限されており、通常、健康な組織および
血管に損傷を与える結果となる[Macular Photocoagulation Study Group, Arch.
Ophtalm. 112, 480-488 (1994); ハイモヴァイサイ（Haimovici), R.等, Curr.
Eye Res. 16, 83-90 (1997); シュミット（schmidt)-エルファース（Erfurth）
, U .等; Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 236, 365-374 (1998).]。

【００３１】上述の議論に基づけば、光増感剤の選択性および特異性を、例えば、適切なキ
ャリア分子にそれらを結合させることによって、向上させる方法を発見すること
が非常に重要であろうことが分かる。良質のキャリア分子の開発は取るに足らな
い課題ではないと思われる。さらに、すべての光増感剤が、目的の部位に生体内
(in vivo)で「輸送」されやすいわけではないらしい。光増感剤の化学構造、溶
解性、親油性、粘着性および効力などの因子は、光増感剤複合体の「標的化能力
」および効力に決定的に影響を及ぼす可能性がある。

【００３２】本明細書において本発明者らは、フィブロネクチンのＥＤ‐Ｂドメインに特異
的な高親和性Ｌ１９抗体が、全身投与すると、眼球血管形成のウサギのモデルに
新たに形成した血管に、選択的に局在化することを示している。光増感剤のスズ
（ＩＶ）塩素ｅ₆に化学的に結合し、赤色光を照射されたＬ１９抗体は、眼球新
生血系の閉塞およびそれに対応する内皮細胞の促進されたアポトーシスを仲介し
た。これらの結果から、眼球の新生血管は、生体内(in vivo)で免疫化学的に既
存の血管と区別すること可能であることが実証されており、照射を伴う光増感剤
の標的化デリバリーが、失明につながる眼疾患および血管形成関連の他の病態を
治療するのに有効である可能性があることが強く示唆されている。

【００３３】光増感剤を含有する複合体を使用する場合、考慮すべき他の重要な特徴は、光
増感剤は、それが結合している抗体のすぐ近くで、その毒性活性を仲介すること
が可能ないくつかの種のうちにあるという事実である。

【００３４】照射すると、かつ酸素の存在下において、大部分の光増感剤は、特に他の反応
性種の中で、一重項酸素：膜、タンパク質およびＤＮＡと反応することによって
細胞に損傷を与えることが可能な拡散性有毒分子を生成する。一重項酸素の平均
的な拡散は、約２００ｎｍであると推定されている(ヤーマッシュ(Yarmush)等 1
993, Crit. Rev. Ther. Drug, 10, 197-252)。

【００３５】範囲５０〜１００μＭの組織透過を有し（ハウク(Hauck)等1998, Brit. J. Ca
ncer 77, 753-759)、β粒子、例えばイットリウム−９０の約５００倍大きい堆
積エネルギー(depositing energy)（０．２ＫｅＶ／μＭに対して１００ＫｅＶ
／μＭ）(マクデビット(McDevitt)等1998, Eur. J. Nucl. Med. 25, 1341-135)
を有する、エネルギー性α粒子を生成するα放出放射性核種、例えばアスタチン
−２１１、ビスマス−２１２およびビスマス−２１３に当てはまる。

【００３６】例えばＬ１９に関して、本明細書中に記載のフィブロネクチンのＥＤ‐Ｂドメ
インに特異的な抗体に結合した光増感剤またはα放出放射性核種は、以降に報告
する実施例に示すように、生体内(in vivo)で新生血管を標的とすることができ
る。局在化の特異性がこのように正確であり、かつ光増感剤およびα放出放射性
核種によって放出される有毒種の作用が短い範囲であるために、隣接する組織／
細胞が残されている間に、標識抗体のすぐ近くの特異的損傷を推測することがで
きる。Ｌ１９抗体によって送達される場合には、作用の短経路を有する有毒種（
例えば、一重項酸素およびα粒子）は、正常な組織および血球が残されている間
に、新生血管の内皮細胞に選択的に損傷を与える可能性を提供する。選択性のこ
のレベルは、癌、リウマチ様関節炎、血管新生関連の眼疾患および乾癬など、血
管形成に関係する疾患の制御に非常に大きな利点を提供するはずである。

【００３７】既存の血管および正常な組織が残されている間に、短い範囲で作用する毒薬剤
を新生血管に送達する革新的な概念は、以下の考察に照らして、容易に理解する
ことができる。

【００３８】実施例３に記述する、放射標識したＬ１９を注入した腫瘍を有するマウスで行
った生体内分布の研究について考えてみよう。β粒子放出放射性核種（例えば、
イットリウム−９０）で標識したＬ１９抗体を用いた場合、その抗体は、数ミリ
メートルの透過で隣接する細胞／組織にβ粒子を送達する。体内のすべての組織
が等しく放射線感受性であると仮定し、放射性崩壊を無視し、放射標識抗体を静
脈内注射した瞬間から（つまり、時間＝０秒から）、放射能がその殺生効果を示
し始めるであろうことを記憶に留めておこう。放射標識抗体の治療上の利点は、
体液または組織１グラム当たりで正規化される、抗体により腫瘍に送達された放
射能の全線量と、抗体により血液もしくは器官に送達された放射線の全線量との
比に関連があるだろう（ベール（Behr）等1998, Int. J. Cancer 77, 787-795)
。

【００３９】腫瘍および血液に送達される生物致死線量（放射標識抗体を用いて、通常、限
界毒性である骨髄毒性を表す）を調べてみよう。

【００４０】腫瘍１グラム当たりに送達される放射能線量は、％ＩＤ／ｇ（腫瘍）の曲線（
ＡＣＵ）の下の領域に比例し、時間に対してプロットされる。同様に、血液に送
達される放射能線量は、％ＩＤ／ｇ（血液）の曲線（ＡＣＵ）の下の領域に比例
し、時間に対してプロットされる。静脈内注射して最初の２４時間の間、ＡＵＣ
（腫瘍）／ＡＵＣ（血液）比は３．６に等しい（図１３）。長時間にわたりＡＵ
Ｃを測定した場合、この比は幾分増大するが、６〜７を超える治療可能比はほと
んど達成されない。短い範囲で作用する有毒種（例えば、光増感剤またはα粒子
放出放射性核種）は腫瘍血管に送達され、そのため、腫瘍塊中に均一に分布しな
い状況を考えてみよう。拡散性有毒種（例えば、一重項酸素またはα粒子）は、
２層以上の細胞をほとんど透過しないだろう。つまり腫瘍血管壁を裏打ちする内
皮細胞のみに達する。大部分の腫瘍（Ｆ９奇形癌腫を含む）に新たに形成する血
管は、腫瘍塊の２％未満を占めるため、治療上の利点を予測するための関連のあ
るパラメーターは、ＡＵＣ（血管）／ＡＵＣ（血液）比であるだろう。

【００４１】図１４から分かるように、Ｌ１９は、新生血管周辺のみに蓄積する。この観察
は、腫瘍のミクロオートラジオグラフによる腫瘍の分析によってもまた確認され
ている(ターリ（Tarli）等1999, Blood, 94, 192-198)。腫瘍に送達された放射
能は、新生血管構造の周りで濃縮されるため、かつ腫瘍血管系または腫瘍重量が
２％を占めると仮定すると、ＡＵＣ（血管）＝（１００／２）×ＡＵＣ（腫瘍）
＝５０×ＡＵＣ（腫瘍）を計算することができる。換言すれば、処理の選択性は
、本発明者らの実験システムでは２４時間にわたって＞１５０：１である、ＡＵ
Ｃ（血管）／ＡＵＣ（血液）比に比例すると考えられる（説明のために、図１５
もまた参照のこと）。

【００４２】生物医学的用途で、特に興味深いα粒子放出放射性核種としてアスタチン−２
１１について考えてみよう。その放射性崩壊の半減期は、ビスマス−２１２およ
びビスマス−２１３よりもかなり長い（それぞれ１．０時間および４５分と比較
して、７．２時間）(ラーセン(Larsen)およびブルランド(Bruland)1998, Brit.
J. Cancer 77, 1115-1122)。アスタチンは、最も重いハロゲンであり、この元素
の安定な同位体は存在しない。周期表においてヨウ素の真下に記載されているた
め、その２種類のハロゲンは、同様の化学的性質を有するだろうと考えられる。
しかしながら、タンパク質アミノ酸のレベルで直接、求電子アスタチン化(astat
ination）することによって²¹¹Ａｔでタンパク質を標識する試みは、生体内(in
vivo)での投与後に標識が急速に減少するため、結果としては成功しなかった(ヴ
ォーン(Vaughan)等1978, Int. J. Nucl. Med. 5, 229-230)。この問題を回避す
るために、ガルグ（Garg）(1989, Appl. Radiat. Isot. 40, 485-490)により公
開されている二段階標識法によって、重要な核種を取り込み、抗体特異性が減少
することなく、Ｌ１９を²¹¹Ａｔと結合することができる。その方法は、２官能
化学化合物、Ｎ‐スクシンイミジル‐３‐（トリメチルスタンニル）‐ベンゾエ
ート（ｍ‐ＭｅＡＴＥ；ＡＴＥ、「アルキルスズエステル」）の使用を含み(ザ
ルツキー（Zalutsky）等1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,7149-7153)、本
発明者らは、実施例７に示すように、ガルグ(Garg)（図１６を参照）によって公
開されているプロトコルに従って、その化合物を合成した。

【００４３】等モル量のｍ‐ブロモ安息香酸およびトリメチルスタンニル‐クロライドを用
いると、その反応生成物は、公開されているトリメチルスタンニル‐３‐（トリ
メチルスタンニル）ベンゾエート）ではなく、３‐（トリメチルスタンニル）安
息香酸であることを報告することが重要である。以下に記述する標識化実験の結
果に基づいて、本発明者らは、この化合物が、先に記載のトリメチルスタンニル
‐３‐（トリメチルスタンニル）ベンゾエート誘導体と比較して、優れた品質を
有することが可能であると考える。

【００４４】２段階方法において、２官能性ｍ‐ＭｅＡＴＥ剤を両方に使用して、γ放出ヨ
ウ素‐１２５およびα放出アスタチン‐２１１でＬ１９を標識することができる
。従来の求電子法（例えば、クロラミンＴ法およびヨードゲン法）の代わりに、
ｍ‐ＭｅＡＴＥによるヨウ素‐１２５でのタンパク質標識を報告して、生体内(i
n vivo)で脱ハロゲンに対してさらに不活性であるタンパク質ヨウ素化部位を提
供する(ガルグ(Garg)等1989, Appl. Radiat. Isot. 40, 485-490)。この２段階
放射標識方法から生じる共役免疫活性に加えて、標識タンパク質の結合効率を、
ヨウ素‐１２５との反応により研究した。

【００４５】第１段階では、ｍ‐ＭｅＡＴＥおよびｔ‐ブチルヒドロパーオキシド（ＴＢＨ
Ｐ）をＮａ¹²⁵Ｉに添加した。インキュベーションを２０分間行った後、使い捨
てのシリカゲルＳｅｐ‐Ｐａｋカラム、および溶出相としてヘキサンに溶解した
酢酸エチル勾配を用いたクロマトグラフィーによって、放射ヨウ素標識生成物Ｎ
‐スクシンイミジル‐３‐（¹²⁵Ｉ）‐ベンゾエートを単離し、分離した。１０
０μＣｉのＮａ¹²⁵Ｉから始まり、本発明者らは、Ｎ‐スクシンイミジルベンゾ
エートに９０μＣｉの¹²⁵Ｉを結合させた。第２段階では、ホウ酸緩衝液中のＬ
１９の溶液（ｐＨ＝８．５）を、精製したＮ‐スクシンイミジル‐３‐（¹²⁵Ｉ
）‐ベンゾエートに添加した。氷上での３０分間のインキュベーションに続いて
、使い捨てのＰＤ‐１０ゲル濾過カラムを用いて、取り込まれていないヨウ素か
ら、放射標識Ｌ１９を分離した。放射ヨウ素標識したＡＴＥを用いたＬ１９標識
化の得られた効率は、初期のタンパク質濃度に大きく依存する結果となった。濃
度０．４２μｇ／μｌおよび１μｇ／μｌでＬ１９を用いると、元の放射標識ベ
ンゾエートの１８％および２８％がそれぞれ、Ｌ１９に結合した。これらの結果
によれば、１ｍＣｉのＮａ¹²⁵ＩおよびＬ１９濃度１μｇ／μｌから始めれば、
比放射能１μｇ／μｌにて¹²⁵Ｉで標識したＬ１９が得られるだろう。標識した
後、Ｌ１９の初期濃度によって、複合体の免疫活性は影響を受けなかった。実施
例３に記述する方法に続いて、ヴィティ(Viti)等(1999, Cancer Research 59, 3
47-352)により報告されているように定義された免疫活性は、どちらの場合にも
＞９０％という結果となった。

【００４６】これらの結果は、２官能性ｍ−ＭｅＡＴＥを用いた、放射性ハロゲンでのＬ１
９の標識化の可能性を実証している。

【００４７】アスタチン‐２１１は、腫瘍血管中ではなく、腎糸球体中のデハロゲナーゼに
よってＬ１９から脱離する可能性があり、その結果、腎経路による免疫複合体の
クリアランスにもかかわらず、放射標識化合物の腎臓毒性が低減されるという更
なる利点を提供することができる。大部分の用途で腎臓の照射が予見されないこ
とから、光増感剤の場合には、腎臓中の糸球体は損傷を受けないだろう。

【００４８】両方の活性を活用するために、光増感剤および放射性核種に結合した抗体から
なる複合体を作製することも可能であることは明白である。

【００４９】本発明の実施形態を以下の図面によって説明する。図１には：設計した抗体ファージライブラリを示す。（ａ）図示するように、抗体フラグ
メントをｐＩＩＩ融合としてファージ上に提示する。抗体結合部位において（抗
原の視点）、ＶｋＣＤＲ主鎖は黄色であり、ＶＨＣＤＲ主鎖は青色である。
ランダムな突然変異にさらされている残基は、ＶｋＣＤＲ３位置９１、９３、
９４および９６（黄色）であり、ＶＨＣＤＲ３位置９５、９６、９７および９
８（青色）である。これららの側鎖のＣｂ原子は、暗い色で示されている。突然
変異して、抗体親和性を向上させることができる、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の残
基もまた示されている（灰色）。ＲａｓＭｏｌプログラム (http://www.chemist
ry.ucsc.edu/wipke/teaching/rasmol.html)を用いて、ｓｃＦｖの構造をｐｄｂ
ファイル１igm（Brookhaven Protein Data Bank; http://www2.ebi.ac.uk/pcser
v/pdbdb.htm)からモデリングした。（ｂ）ＰＣＲ増幅およびライブラリクローニ
ング戦略。ＤＰ４７およびＤＰＫ２２生殖系列の鋳型を修飾して（テキスト参照
）、ＣＤＲ３領域中で突然変異を引き起こした。遺伝子は長方形で示し、ＣＤＲ
は、長方形内の番号が付いているボックスで示す。次いで、ＶＨおよびＶＬセグ
メントを集合し、ｐＤＮ３３２ファージミドベクターにクローニングした。増幅
および集合に使用したプライマーは、最後に列挙する。

【００５０】図２には：２Ｄゲルおよびウェスタンブロットを示す。（ａ）組換えＥＤ‐Ｂ含有７Ｂ８
９が添加されている、ヒト悪性黒色腫ＣＯＬＯ‐３８細胞のライセートの２Ｄ‐
ＰＡＧＥ銀染色。２つの７Ｂ８９スポット（円）は、タンパク質精製に使用した
Ｈｉｓタグの部分的タンパク質分解が原因である。（ｂ）検出試薬として抗ＥＤ
‐ＢＥ１（表１）およびＭ２抗ＦＬＡＧ抗体を用いた、図２ａと同一なゲルの
イムノブロット。７Ｂ８９のみが検出され、ゲルスポットから単離された組換え
抗体の特異性が確認された。

【００５１】図３には：ＳｃＦｖｓＥ１（Ａ）、Ａ２（Ｂ）およびＧ４（Ｃ）を用いて染色した通常の
糸球体様血管構造を示す多形性膠芽腫の連続切片での免疫組織化学的実験を示す
。スケールバー：２０μｍ。

【００５２】図４には：抗体‐（ＥＤ‐Ｂ）複合体の安定性を示す。フィブロネクチンＥＤ‐Ｂドメイ
ンへのｓｃＦｖｓＥ１、Ｈ１０およびＬ１９の結合の分析。（ａ）抗体の親和性
成熟で得られた向上した解離プロフィールを示すＢＩＡｃｏｒｅセンサーグラム
。（ｂ）ｓｃＦｖ-（ＥＤ−Ｂ）複合体の天然ゲル電気泳動分析。高親和性抗体
Ｌ１９のみが、蛍光標識抗原と安定な複合体を形成することができる。蛍光検出
は、記載されているように(ネリ(Neri）等 (1996) BioTechniques, 20, 708-712
)行った。（ｃ）Ｏｒｉｇｅｎ装置を用いたエレクトロケミルミネッセンスによ
りモニターした、１００倍モル過剰量の非ビオチン化ＥＤ‐ＢとのｓｃＦｖ‐（
ＥＤ‐Ｂビオチン）複合体の競合。Ｌ１９‐（ＥＤ‐Ｂ）複合体の長い半減期を
観察することができる。黒色の四角形：Ｌ１９；白色の三角形：Ｈ１０。

【００５３】図５には：放射標識抗体フラグメントを注入した、腫瘍を有するマウスの生体内分布を示
す。

【００５４】１グラム当たりの注入量％として表す、腫瘍および血液の生体内分布を、時間
に対してプロットする。関連する器官の生体内分布もまた報告する。

【００５５】図６には、重鎖（ＶＨ）、リンカーおよび軽鎖（ＶＬ）を含む抗体Ｌ１９のア
ミノ酸配列を示す。

【００５６】図７には、血管形成物質で浸漬した移植ポリマーペレットを有するウサギの眼
球を示す。

【００５７】図８には、Ｌ１９抗体で染色した、新生血管を有するウサギの角膜切片の免疫
組織化学を示す。

【００５８】図９には、Ｌ１９抗体を用いた、眼球構造の免疫組織化学的研究を示す。特異
的赤色染色は、角膜（ａ）中の新生血管構造周辺に認められるが、虹彩（ｂ）お
よび結膜（ｃ）中の血管周辺には認められない。小さな矢印：角膜上皮。関連す
る血管を大きな矢印で示す。スケールバー：５０μｍ。

【００５９】図１０には、眼球血管形成を標的化する蛍光標識抗体の免疫蛍光検出を示す。
強い蛍光角膜新血管新生が、ＦＮのＥＤ‐Ｂドメインに特異的な抗体複合体Ｌ１
９‐Ｃｙ５（ａ）を注入したウサギで認められるが、抗体ＨｙＨＥＬ‐１０‐Ｃ
ｙ５（ｂ）を注入したウサギでは認められない。角膜切片での免疫蛍光顕微鏡検
査によって、角膜中の新生血管構造周辺にＬ１９‐Ｃｙ５（ｃ）は局在化するが
、ＨｙＨＥＬ‐１０‐Ｃｙ５（ｄ）は局在化しないことを確認した。抗体注入の
８時間後に、画像（ａ、ｂ）を得た；画像（ｃ、ｄ）は、抗体注入の２４時間後
に、ウサギから単離した角膜切片を用いて得た。Ｐはペレットを表す。

【００６０】図１１には、感光剤複合体で処置したウサギの眼球の巨視的画像を示す。赤色
光を照射する前（ａ）および照射して１６時間後（ｂ）に、ウサギの眼球にＬ１
９‐ＰＳを注入した。矢印は、照射から１６時間後にパネル（ｃ）のＣｙ５蛍光
血管造影図において低蛍光性領域として確認される凝固した新生血管系を示す。
他の血管構造、例えば拡張した結膜血管には凝固は認められないことを留意のこ
と。比較のために、漏出血管(leaky vessels)の過蛍光を有するＣｙ５蛍光血管
造影図および未処置のウサギの眼球の対応するカラー写真を（ｄ）および（ｈ）
に示す。写真（ｅ、ｆ、ｇ）は、オボアルブミンを注入し、赤色光を照射したウ
サギに相当する（ａ、ｂ、ｃ）と類似している。凝固を確認することができず、
血管造影図には、漏出血管の過蛍光が現れている。初期段階の血管形成を有し、
Ｌ１９‐ＰＳを注入したウサギの眼球を（ｉ〜ｌ）に示す。赤色光を照射する前
（ｉ）および照射して１６時間後（ｊ）の画像には、広範かつ選択的な光誘導血
管内凝固（矢印）が現れている。血管閉塞（矢印）は、安楽死直後のウサギの照
射した眼球（ｌ）において特に明らかであるが、同じウサギの照射していない眼
球（ｋ）では検出できない。Ｐはペレットを表す。矢印は、強角膜接合部（縁）
を示す。すべての図で、拡張した既存の結膜血管は縁の上で目に見え、角膜の新
血管新生の成長を、ペレット（Ｐ）に向かって縁から観察することができる。

【００６１】図１２には、選択的血管閉塞の顕微鏡分析を示す。オボアルブミン‐ＰＳ（ａ
、ｅ、ｉ）またはＬ１９‐ＰＳ（ｂ、ｆ、ｊ）を注入し、照射したウサギの角膜
（ａ、ｅ、ｂ、ｆ：固定されていない；ｉ、ｊ：パラホルムアルデヒド固定され
た）のＨ／Ｅ切片。大きな矢印は、典型的な損傷を受けていない血管（ｅ、ｊ）
または完全に閉塞した血管（ｆ、ｊ）を示す。照射後にＬ１９−ＰＳにより仲介
された、角膜新生血管系および血管周囲の限定された損傷（好酸球増加症）の選
択的閉塞（ｂ、ｆ、ｊ）と比較して、結膜（ｋ）および虹彩（ｌ）中の血管は、
同じウサギで損傷のサインを示さない。蛍光ＴＵＮＥＬアッセイによって、Ｌ１
９‐Ｓ（ｃ、ｇ）またはオボアルブミン‐ＰＳ（ｄ、ｈ）を注入した、照射した
ウサギの切片中におけるアポトーシス細胞の数が異なることが示される。大きな
矢印は、関連するいくつかの血管構造を示す。小さな矢印は、角膜上皮を示す。
スケールバー：１００μｍ（ａ〜ｄ）および２５μｍ（ｅ〜ｌ）

【００６２】図１３には、静脈内注射して最初の２４時間の、ｓｃＦｖ（Ｌ１９）により血
液および腫瘍に送達された放射能曲線下の領域（ＡＵＣ）を示す。Ｆ９奇形癌を
有するマウスで行ったこの実験的研究において、腫瘍１グラム当たりに送達され
た放射標識抗体の注入量は、血液１グラム当たりに送達された量よりも３．６倍
高い。ＡＵＣを長期間にわたり測定した場合には、この比が増大する。

【００６３】図１４には、放射標識ｓｃＦｖ（Ｌ１９）注入後に、ヌードマウスから解剖し
たＦ９奇形癌のミクロオートラジオグラフィー分析を示す。その写真により、ｓ
ｃＦｖ（Ｌ１９）は、血管構造周辺に蓄積するが、正常なマウス組織の周囲には
蓄積しないことが示されている。

【００６４】図１５には、βもしくはα放出放射性核種と結合する抗‐血管形成ｓｃＦｖ（
Ｌ１９）を用いて行った放射免疫治療の略図を示す。Ｆ９奇形癌中の新生血管は
、全腫瘍量の０．５〜５％を占めるため、血管構造に送達される放射能は、正常
な組織および血管に送達される放射能よりもかなり高い（７０〜７００倍）。β
放出体（例えば、イットリウム‐９０）にｓｃＦｖ（Ｌ１９）を結合させると、
標的腫瘍領域の大部分は照射される。というのは、これらのβ粒子は、数ミリメ
ートルの組織中での範囲を有するからである。一方、α放出体（例えば、アスタ
チン‐２１１またはビスマス‐２１２またはビスマス‐２１３）にｓｃＦｖ（Ｌ
１９）を結合させると、放射線は、標的腫瘍血管周辺のみにしか堆積しない（透
過：数十マイクロメートル）。この場合には、治療効率の関連パラメーターは、
β放出核種の関連パラメーターである腫瘍／血液比ではなく、組織１グラム当た
りの放射能注入量％の血管／血液比である。

【００６５】図１６には、ｍ‐ブロモ安息香酸から合成したＮ‐スクシンイミジル３‐（ト
リメチルスタンニル）ベンゾエート（ｍ−ＭｅＡＴＥ）を用いて、ヨウ素‐１２
５およびアスタチン‐２１１でｓｃＦｖ（Ｌ１９）を標識する手順を示す。

【００６６】図１７Ａには、ＣＤＣｌ₃中の３‐（トリメチルスタンニル）安息香酸の¹Ｈ‐
ＮＭＲスペクトルを示す。その化学シフト（ｐｐｍ）をＸ軸に示す。

【００６７】図１７Ｂには、ＮＭＲスペクトルの低磁場に位置する芳香族部位中のプロトン
ｐｐｍの化学シフトを示す。

【００６８】図１８Ａには、ＣＤＣｌ₃中のｍ‐ＭｅＡＴＥの¹Ｈ‐ＮＭＲスペクトルを示す
。化学シフト（ｐｐｍ）を示すＸ軸と、スペクトルベースラインとの間のピーク
強度の相対値を報告する。

【００６９】図１８Ｂには、ｍ‐ＭｅＡＴＥの¹Ｈ‐ＮＭＲスペクトルの拡大部分を示す。

【００７０】図１９には、ｍ‐ＭｅＡＴＥ（分子量３８３）の電子衝撃イオン化質量分析（
ＥＩ−ＭＳ）を示す。３６８の電荷値（ｍ／ｅ）に対する質量は、分子イオン（
Ｍ⁺）‐１５（ＣＨ₃）の質量を表す。

【００７１】以下の実施例によって、本発明をさらに詳細に説明する。実施例１抗体ファージディスプレイライブラリからの、フィブロネクチンのＥＤ‐Ｂドメ
インに特異的なヒトｓｃＦｖ抗体フラグメントの単離ヒト抗体ライブラリを、ＶＨ(DP47; トムリンソン（Tomlinson）(1992). J. M
ol. Biol., 227 , 776-798.)およびＶｋ（DPK22; コックス（Cox）等(1994). Eu
r. J. Immunol., 24, 827-836)生殖系列を用いてクローニングした（クローニン
グおよび増幅戦略についての図１を参照のこと）。ＰＣＲに基づく方法で、一部
変性したプライマー（図１）を用いて、ライブラリのＶＨ成分を生成して、ＣＤ
Ｒ３中の位置９５〜９８でランダム突然変異を導入した。ＣＤＲ３の位置９１、
９３、９４および９６でランダム突然変異を導入することによって、ライブラリ
のＶＬ成分を同じ手法で生成した。記載のように（マークス（Marks）等 (1991)
. J. Mol. Biol., 222, 581-597)ＰＣＲ反応を行った。ＶＨ‐ＶＬｓｃＦｖフ
ラグメントは、ゲル精製したＶＨおよびＶＬセグメントから、ＰＣＲの集合(図1
;クラックソン(Clackson)等(1991). Nature , 352, 624-628)により構成された
。精製したＶＨ‐ＶＬｓｃＦｖフラグメント３０μｇを、ＮｃｏIおよびＮｏ
ｔIそれぞれの３００ユニットで二重消化し、次いでＮｏｔI／ＮｃｏI消化ｐＤ
Ｎ３３２ファージミドベクター１５μｇにライゲートした。ｐＤＮ３３２は、フ
ァージミドｐＨＥＮ１の誘導体であり(フーゲンブーム（Hoogenboom )等 (1991)
. Nucl. Acids Res., 19, 4133-4137)、ＮｏｔI部位と、遺伝子ＩＩＩの前にあ
る終止コドンとの間の配列は、Ｄ３ＳＤ３‐ＦＬＡＧ‐Ｈｉｓ６タグをコードす
る以下の配列に置き換えられている（ネリ(Neri)等(1996). Nature Biotechnolo
gy, 14, 385-390)： NotI D D D S D D D Y K D D 5' - GCG GCC GCA GAT GAC GAT TCC GAC GAT GAC TAC AAG GAC GAC D D K H H H H H H アンバー GAC GAC AAG CAC CAT CAC CAT CAC CAT TAG - 3'

【００７２】Ｍａｒｋｓ等(1991. J. Mol. Biol., 222, 581-597)に従って、ＴＧ１大腸菌
株への形質転換を行い、標準プロトコル（ニシム（Nissim）等 (1991). J. Mol.
Biol., 222, 581-597)に従って、ファージを作製した。ランダムに５つのコロ
ニーを選択し、配列して、コンタミネーションが広がっていないことを調べた。

【００７３】ｐＱＥ‐１２ベースの発現ベクター(Ｑｉａｇｅｎ社、米国、カリフォルニア
州チャッツワース)から、それぞれ１つおよび４つのＩＩＩ型ホモロジー反復を
含有する、組換えフィブロネクチンフラグメントＥＤ‐Ｂおよび７Ｂ８９を、記
載のように(カルネモーラ(Carnemolla)等 (1996). Int. J. Cancer, 68, 397-40
5)発現させた。

【００７４】フィブロネクチンの組換えＥＤ‐Ｂドメインに対する選択(カルネモーラ（Car
nemolla）等，(1996). Int. J. Cancer, 68, 397-405, Zardi et al. (1987). E
MBO J., 6, 2337-2342)を、ビオチンジスルフィドＮ‐ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（試薬Ｂ−４５３１；Ｓｉｇｍａ社、スイス、Ｂｕｃｈｓ；１０）で
ビオチン化し、かつ２Ｄゲルから溶出した抗原、およびストレプトアビジンコー
ティングダイナビーズ捕獲（Ｄｙｎａｌ社、ノルウェイ、オスロ）を用いて濃度
１０ｎＭで行った。反応１ｍｌ中で、各回のパニングに１０１３ファージを使用
した。２％ミルク／ＰＢＳ（ＭＰＢＳ）中で抗原と共に、ファージを１０分間イ
ンキュベートした。この溶液に、ＭＰＢＳ中のプレブロックしたダイナビーズ１
００μｌ（１０ｍｇ／ｍｌ；Ｄｙｎａｌ社、ノルウェイ、オスロ）を加えた。混
合して５分後、ビーズを溶液から磁気により分離し、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０（ＰＢＳＴ）で７回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄した。５０ｍＭジチオト
レイトール（ＤＴＴ）５００μｌと共に２分間インキュベートすることによって
、溶出を行い、抗原とビオチンとの間のジスルフィドブリッジを減らした。再度
、ビーズを捕獲し、得られた溶液を使用して、指数的に増殖するＴＧ１大腸菌細
胞に感染させた。パニングを３回行った後、溶出したファージを使用して、指数
的に増殖するＨＢ２１５１大腸菌細胞に感染させて、（２ｘＴＹ＋１％グルコー
ス＋アンピシリン１００μｇ／ｍｌ）‐１．５％寒天板上にプレーティングした
。単一コロニーを２ｘＴＹ＋０．１％グルコース＋アンピシリン１００μｇ／ｍ
ｌ中で成長させ、１ｍＭＩＰＴＧで３０度にて誘導して、抗体発現を達成した。
１０ｎＭビオチン化ＥＤ‐Ｂで処理したストレプトアビジンコーティングマイク
ロタイタープレート、および検出試薬として抗ＦＬＡＧＭ２抗体（ＩＢＩＫ
ｏｄａｋ社、コネチカット州ニューヘブン）を用いて、得られた上清をＥＬＩＳ
Ａによってスクリーニングした。スクリーニングしたクローンの３２％がこのア
ッセイで陽性であり、最も強いＥＬＩＳＡシグナルを現すもののうち３つ（Ｅ１
、Ａ２およびＧ４）をシーケンスし、さらに特徴決定した。

【００７５】ゲルスポットから回収したビオチン化ＥＤ‐Ｂ、変性していないビオチン化Ｅ
Ｄ‐Ｂ、隣接するフィブロネクチンドメイン（７Ｂ８９ドメインを含有する組換
えタンパク質）に結合したＥＤ‐Ｂ、および多数の無関係な抗原を用いて、ＥＬ
ＩＳＡアッセイを行った。抗体Ｅ１、Ａ２およびＧ４は、３種のＥＤ‐Ｂ含有タ
ンパク質すべてと強くかつ特異的に反応した。その３種の組換え抗体を、ＥＤ‐
Ｂアフィニティーカラムを用いて細菌上清から精製することが可能であるという
事実と共に、これによって、それらが、ＥＤ‐Ｂの負のコンフォメーション(neg
ative conformation)中に存在するエピトープを認識することが強く示唆されて
いる。ＥＤ‐Ｂドメインを含有しないフィブロネクチンフラグメントとの反応は
検出されなかった（データは示さず）。

【００７６】ゲルスポットから単離した抗体が、天然抗原に対して良好な親和性を有するか
どうかを試験するために、記載のように（ネリ(Neri）等(1997) Nature Biotech
nol., 15, 1271-1275)、ＢＩＡｃｏｒｅ装置で表面プラズモン共鳴を用いて、実
時間の相互作用分析を行った。Ｅ１、Ａ２およびＧ４ｓｃＦｖフラグメントのモ
ノマー画分は、１０７〜１０８Ｍ−１の範囲の親和性を有するＥＤ‐Ｂに結合し
た（表１）。

【００７７】抗体特異性および有用性の他の試験として、ＥＤ‐Ｂ含有組換え７Ｂ８９タン
パク質の微量を添加してあるヒト黒色腫細胞系のライセートをゲル上に流して、
２Ｄ−ＰＡＧＥイムノブロットを行った。ＳｃＦｖ（Ｅ１）は、７Ｂ８９スポッ
トのみを強くかつ特異的に染色した。

【００７８】抗体Ｅ１、Ａ２およびＧ４を用いて、多形性膠芽腫、顕著な血管形成プロセス
を有する攻撃的なヒト脳腫瘍のクリオスタット切片中のＥＤ‐Ｂ含有フィブロネ
クチン（Ｂ−ＦＮ）を免疫局在化した。図３には、３種の抗体により赤色に染色
された通常の糸球体様血管構造を有する、多形性膠芽腫の連続切片を示す。外科
的方法により除去した直後に、液体窒素中で凍結させた多形性膠芽腫サンプルの
切片の免疫染色を、記載のように（カルネモーラ(Carnemolla)等(1996). Int. J
. Cancer, 68, 397-405, カステラーニ(Castellani)等(1994). Int. J. Cancer,
59, 612-618)行った。要するに、Ｍ２‐抗ＦＬＡＧ抗体（ＩＢＩＫｏｄａｋ
社）、ビオチン化抗マウスポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社）、ストレプトア
ビジン‐ビオチンアルカリホスファターゼ複合体染色キット（ＢｉｏＳｐａ社、
イタリア、ミラン）およびナフトール‐ＡＳ‐ＭＸ‐ホスフェートおよびファー
ストレッド(fast-red)ＴＲ（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、免疫染色を行った。Ｇｉ
ｌｌのヘマトキシリンを対比染色として使用し、続いて、先に記載のように(カ
ステラーニ（Castellani）等 (1994). Int. J. Cancer, 59, 612-618)、グリセ
ルゲル（Ｄａｋｏ社、カリフォルニア州カーペンテリア）中に固定した。

【００７９】同様の技術および抗体Ｌ１９を用いて（次の実施例を参照のこと）、本発明者
らは、血管内皮増殖因子もしくはホルボールエステルなどの血管形成物質で浸漬
したウサギの角膜中にポリマーペレットを移植することによって誘導した新生血
管を特異的に染色することもできた。

【００８０】実施例２ナノモル以下の親和性を有するＥＤ‐Ｂに結合するヒトｓｃＦｖ抗体フラグメン
トの単離ＳｃＦｖ（Ｅ１）を選択して、抗原結合部位の周囲に位置する（図１Ａ）ＣＤ
Ｒ残基の限定された数の突然変異によって、その親和性が向上する可能性を試験
した。本発明者らは、抗体ＶＨの３１〜３３番目、５０番目、５２および５４番
目の残基をコンビナトリアルに突然変異させ、繊維状ファージ上に対応するレパ
ートリーをディスプレイした。これらの残基は、抗体‐抗原複合体の公知の３Ｄ
構造中で抗原と頻繁に接触することが見出されている。その結果得られた、４×
１０⁸個のクローンのレパートリーを、フィブロネクチンのＥＤ‐Ｂドメインに
結合させるために選択した。パニングを２回行い、９６個の個々のクローンをス
クリーニングした後に、２７倍の向上した親和性を有する抗体を単離した（Ｈ１
０；表１および２）。他の人が親和性成熟させた抗体で観察した場合と同様に、
その向上した親和性は、向上したＫｏｎ値よりはむしろ、抗原からのゆっくりと
した解離によるものであった(シヒアー(Schier）等(1996). Gene, 169, 147-155
, Ito (1995). J. Mol. Biol., 248, 729-732)。軽鎖を欠いている天然抗体およ
び人工抗体のどちらも、それでもなお抗原に結合することができるという事実に
よって支持されるように、抗体の軽鎖は、抗原結合親和性にあまり寄与しないと
考えられることが多い(ワード(Ward)等 (1989) Nature, 341, 544-546, ハマー
ズ-キャスターマン(Hamers-Casterman)等(1993). Nature, 363, 446-448)。この
理由のために、本発明者らは、抗原結合部位の中心に位置し（図１ａ）、かつ抗
原と接触する３Ｄ構造中でしばしば見られる、ＶＬドメインの２個の残基（３２
番目および５０番目）のみをランダム化することを選択する。４００個のクロー
ンを含有する、得られたライブラリをファージ上にディスプレイし、抗原結合の
ために選択した。ＢＩＡｃｏｒｅ装置での実時間の相互作用分析を用いた解離プ
ロファイルの分析およびエレクトロケミルミネッセンス検出を用いた競合実験に
よるＫｏｆｆ測定値から、Ｋｄ＝５４ｐＭを有するフィブロネクチンのＥＤ‐Ｂ
ドメインに結合したクローン（Ｌ１９）を同定した（表１および２）。親和性成
熟実験を以下のように行った。ｓｃＦｖ（Ｅ１）の遺伝子を、プライマーＬＭＢ
１ｂｉｓ（５’−ＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣ
ＧＡＧ−３’）およびＤＰ４７ＣＤＲ１ｆｏｒ（５’−ＧＡＧＣＣＴＧＧ
ＣＧＧＡＣＣＣＡＧＣＴＣＡＴＭＮＮＭＮＮＭＮＮＧＣＴＡＡ
ＡＧＧＴＧＡＡＴＣＣＡＧＡＧＧＣＴＧ−３’）でＰＣＲ増幅して
、ＶＨのＣＤＲ１における第３１〜３３番目の位置でランダム突然変異を導入し
（番号付け：２８）、プライマーＤＰ４７ＣＤＲ１ｂａｃｋ（５’−ＡＴＧＡ
ＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣ−３’）およびＤＰ４７
ＣＤＲ２ｆｏｒ（５’−ＧＴＣＴＧＣＧＴＡＧＴＡＴＧＴＧＧＴＡ
ＣＣＭＮＮＡＣＴＡＣＣＭＮＮＡＡＴＭＮＮＴＧＡＧＡＣＣ
ＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＴ−３’）でＰＣＲ増幅して、ＶＨのＣＤ
Ｒ１における第３１〜３３番目の位置にランダム突然変異を導入し（番号付け：
２８）、プライマーＤＰ４７ＣＤＲ１ｂａｃｋ（５’−ＡＴＧＡＧＣＴＧＧ
ＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣ−３’）およびＤＰ４７ＣＤＲ２ｆｏ
ｒ（５’−ＧＴＣＴＧＣＧＴＡＧＴＡＴＧＴＧＧＴＡＣＣＭＮＮ
ＡＣＴＡＣＣＭＮＮＡＡＴＭＮＮＴＧＡＧＡＣＣＣＡＣＴＣ
ＣＡＧＣＣＣＣＴＴ−３’）でＰＣＲ増幅して、ＶＨのＣＤＲ２における
第５０、５２、５４番目の位置をランダムに突然変異させた。ＶＨ遺伝子の３’
−部分を包含する、ＳｃＦＶ遺伝子、ペプチドリンカーおよびＶＬ遺伝子の残存
するフラグメントを、プライマーＤＰ４７ＣＤＲ２ｂａｃｋ（５’−ＡＣＡＴ
ＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧ−３’）およびＪｆｏ
ｒＮｏｔ（５’−ＴＣＡＴＴＣＴＣＧＡＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ
ＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣ
ＧＡＡＣＧ−３’）で増幅した（９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で
１分間）。得られた３つのＰＣＲ産物をゲル精製し、プライマーＬＭＢ１ｂｉｓ
およびＪｆｏｒＮｏｔを用いたＰＣＲ（２１）によって（９４℃で１分間、６０
℃で１分間、７２℃で１分間）、集合させた。その結果得られたＰＣＲ産物をＰ
ＣＲ混合物から精製し、ＮｏｔＩ／ＮｃｏＩで二重消化し、ＮｏｔＩ／ＮｃｏＩ
消化ｐＤＮ３３２ベクターにライゲートした。ベクター約９μｇおよび挿入断片
３μｇをライゲーション混合物中に使用し、その混合物は、フェノール処理（ph
enolisation）およびエタノール沈殿によって精製し、滅菌水５０μｌ中に再懸
濁し、エレクトロコンピテントＴＧＩ大腸菌細胞中に電気穿孔した。得られた親
和性成熟ライブラリは、４×１０⁸個のクローンを含有した。記載のように（ニ
ッシム（Nissim）等(1994). EMBO J., 13, 692-698)、生成した抗体ファージ粒
子を、７Ｂ８９コーティングイムノチューブでの選択の１回目に使用した(カル
ネモーラ（Carnemolla）等 (1996). Int. J. Cancer, 68, 397-405)。ストレプ
トアビジンコーティング磁気ビーズ（ＤＹｎａｌ社、ノルウェイ、オスロ）を用
いた捕獲を伴う、ビオチン化ＥＤ‐Ｂで行われるパニングの２回目に、選択した
ファージを使用した。選択後、クローンの約２５％は、可溶性ＥＬＩＳＡにおい
て陽性であった（実験的プロトコルに関する前の章を参照のこと）。ＥＬＩＳＡ
において陽性である候補から、本発明者らはさらに、ＢＩＡｃｏｒｅ分析(ジョ
ンソン(Jonsson)等(1991), BioTechniques, 11, 620-627)によって、最も低いＫ
ｏｆｆを有するもの（Ｈ１０；表１）を同定した。

【００８１】ｓｃＦｖ（Ｈ１０）の遺伝子を、プライマーＬＭＢ１ｂｉｓおよびＤＰＫＣＤ
Ｒ１ｆｏｒ（５’−ＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＧＣＴ
ＡＡＭＮＮＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧ
）でＰＣＲ増幅して、ＶＬのＣＤＲ１における第３２番目の位置でランダム突然
変異を導入し（番号付けについては：コーチア(Chothia)およびレスク(1987)J.M
ol.Biol., 196, 901-917)、プライマーＤＰＫＣＤＲ１ｂａｃｋ（５’−ＴＴＡ
ＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣ−５’）およびＤＰ
ＫＣＤＲ２ｆｏｒ（５’−ＧＣＣＡＧＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡ
ＴＧＣＭＮＮＡＴＡＧＡＴＧＡＧＧＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＣ
Ｃ−３’）でＰＣＲ増幅して、ＶＬのＣＤＲ２における第５０番目の位置でラン
ダム突然変異を導入した。ｓｃＦＶ遺伝子の残存する部分を、オリゴＤＰＫＣＤ
Ｒ２ｂａｃｋ（５’−ＧＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧ
Ｃ−３’）およびＪｆｏｒＮｏｔで増幅した（９４℃で１分間、６０℃で１分間
、７２℃で１分間）。重鎖を突然変異生成するために、得られた３つの産物を集
合し、消化し、上述のようにｐＤＮ３３２にクローニングした。その結果得られ
たライブラリを、３％ＢＳＡ中のビオチン化ＥＤ‐Ｂと共に３０分間インキュベ
ートし、続いて、ストレプトアビジンコーティングマイクロタイタープレート（
ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＧｍｂＨ社、ドイツ）上に１０分間
捕獲した。そのファージを２０ｍＭＤＴＴ溶液（１，４−ジチオ−ＤＬ−スレイ
トール、Ｆｌｕｋａ）で溶出し、それを用いて、指数的に増殖するＴＧ１細胞に
感染させた。

【００８２】９６個のコロニーから得た上清のＥＤ‐Ｂ結合をＥＬＩＳＡおよびＢＩＡｃｏ
ｒｅにより分析することによって、クローンＬ１９の同定が可能となった。抗Ｅ
Ｄ‐ＢＥ１、Ｇ４、Ａ２、Ｈ１０およびＬ１９のｓｃＦｖ抗体フラグメントは
、攻撃的な腫瘍の切片中の新生血管を選択的に染色する（図３）。

【００８３】次いで、ピニ(Pini)等 ((1997), J. Immunol. Meth., 206, 171-182) に記載
のように、２ｘＴＹ培地１リットル中に新鮮な単一のコロニーを接種して、上述
の抗ＥＤ‐Ｂ抗体フラグメントを産生し、ＥＤ‐Ｂ含有７Ｂ８９組換えタンパク
質１０ｍｇと結合しているＣＮＢＲ活性化セファロースカラム（Ｐｈａｒａｍｃ
ｉａ社、スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ）で親和性精製した(カルネモーラ（Car
nemolla）等 (1996). Int. J. Cancer, 68, 397-405)。添加した後、平衡緩衝液
（ＰＢＳ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５ＭＮａＣｌ）５０ｍｌでカラムを洗浄し
た。次いで、抗体フラグメントを１００ｍＭトリエチルアミンで溶出し、１Ｍ
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）で直ちに中和し、ＰＢＳに対して透析した。記載のように
（ネリ(Neri)等(1997). Nature Biotechnol., 15 1271-1275) [図４]、精製した
抗体を用いて、ＢＩＡｃｏｒｅによる親和性測定を行った。記載のように（ネリ
(Neri)等(1997). Nature Biotechnol, 14, 385-390)、Ｎ‐末端で蛍光標識した
組換えＥＤ‐Ｂ(カルネモーラ(Carnemolla)等(1996). Int. J. Cancer, 68, 397
-405, ネリ(Neri)等 (1997). Nature Biotechnol., 15 1271-1275)を赤外蛍光体
Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）と共に用いて、バンドシフト分析を行った［図４
］。ＢＩＡｃｏｒｅ分析では、可能性のある再結合の影響、ベースラインの不安
定性、および必要とされる長い測定時間が原因のゆっくりとした解離に対して、
動的パラメーターを正確に決定し、解離相が単一指数関数的プロファイルに従う
ことを常に確認できるわけではない。したがって、本発明者らは、競合実験（ネ
リ(Neri)等 (1996), Trends in Biotechnol., 14, 465-470)によって動力学的解
離定数Ｋｏｆｆの測定を行った[図４]。手短に言えば、記載のように(デーバー(
Deaver), D. R. (1995). Nature, 377, 758-760)、ルテニウム複合体で予め標識
してあるＭ２抗ＦＬＡＧ抗体（０．５μｇ／ｍｌ）およびポリクローナル抗マウ
スＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社）の存在下にて、抗ＥＤ‐Ｂ抗体（３０ｎＭ）をビオチ
ン化ＥＤ‐Ｂ（１０ｎＭ）と共に１０分間インキュベートした。並発反応におい
て、この溶液に、非ビオチン化ＥＤ‐Ｂ（１μＭ）を異なる時間に添加した。次
いで、Ｏｒｉｇｅｎアッセイの緩衝液（デーバー(Deaver), D. R. (1995). Natu
re, 377, 758-760)に希釈したストレプトアビジンコーティングダイナビーズ（
２０μｌ、１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、得られた混合物を、ＯＲＩＧＥＮアナライ
ザー（ＩＧＥＮ社、米国、メリーランド州ゲーサーズバーグ）で分析した。この
装置は、競合反応の終わりにビオチン化ＥＤ‐Ｂにまだ結合しているｓｃＦＶフ
ラグメントの量と相関するエレクトロケミルミネッセンスシグナル（ＥＣＬ）を
検出する。競合時間に対するＥＣＬシグナルのプロットによって、固有定数Ｋｏ
ｆｆを有する単一指数関数に適合するプロファイルが得られる[図４；表２]。

【００８４】実施例３フィブロネクチンのＥＤ‐Ｂドメインに特異的な高親和性放射標識ｓｃＦｖを用
いた腫瘍の標的化放射標識ｓｃＦｖ（Ｌ１９）またはｓｃＦｖ（Ｄ１．３）（ニワトリ卵白リゾ
チームに特異的な無関係の抗体）を、皮下に移植したマウスＦ９奇形癌、急速に
成長する攻撃的な腫瘍を有するマウスに静脈内注射した。抗体の生体内分布を異
なる時点で得た（図４）。ｓｃＦｖ（Ｌ１９）またはｓｃＦｖ（Ｄ１．３）を
抗原カラム上で親和性精製し(ネリ（Neri）等(1997, Nature Biotechnol. 15, 1
271-1273)、ヨードゲン法を用いてヨウ素‐１２５（Ｐｉｅｒｃｅ社、米国、イ
リノイ州ロックフォード）で放射標識した。放射標識抗体フラグメントは、抗原
カラムに放射標識抗体を充填し、続いて流液(flow-through)および溶出液画分を
放射能計数することによって求めた＞８０％の免疫活性を保持した。皮下にＦ９
奇形癌を移植したヌードマウス（生後１２週間のスイスヌードマウス、雄）(ネ
リ(Neri)等(1997, Nature Biotechnol. 15, 1271-1273)に、生理食塩水溶液１０
０μｌ中のｓｃＦｖ３μｇ（３〜４μＣｉ）を注入した。大きな腫瘍は、壊死性
の中心を有する傾向があるため、腫瘍の大きさは５０〜２５０ｍｇであった。し
かしながら、大きな腫瘍（３００〜６００ｍｇ）で行った標的化実験では、本質
的に同じ結果が得られた。３匹の動物を各時点で使用した。人道的な方法でマウ
スを殺し、器官を計量し、放射能計数した。代表的な器官の標的化の結果を、組
織１グラム当たりの抗体注入量％（％ＩＤ／ｇ）として表す。ＳｃＦｖ（Ｌ１９
）を、腎臓を通して血液から迅速に除去する；従来の抗体と異なり、それは、肝
臓もしくは他の器官中に蓄積しない。組織１グラム当たりに注入した量の８％が
、注入から３時間後には既に腫瘍上に局在化する；その後にこの値が減少するの
は、腫瘍の大きさが２４〜４８時間以内に２倍になるという事実が原因である。
注入して３、５時間後および２４時間後の腫瘍：血液比は、それぞれ１．９、３
．９および１１．８であったが、ネガティブコントロールでは常に１．０未満で
あった。

【００８５】放射標識ｓｃＦＶ（Ｌ１９）は、注入から既に数時間後には腫瘍上に局在化し
、患者における血管形成の免疫シンチグラフィによる検出に有用であることが示
唆されることが好ましい。

【００８６】実施例４新たに形成した眼球血管を選択的に染色する抗ＥＤ‐Ｂ抗体血管形成、既存の血管からの新たな血管の形成は、癌を含む多くの疾患および
視力を失う結果となる眼疾患の大部分の根底にある特徴的なプロセスである。新
生血管系を選択的に標的化かつ閉塞する能力は、診断上の機会および治療上の機
会を開くであろう。

【００８７】本発明者らは、Ｂ−ＦＮが眼球血管形成の特異的マーカーであるかどうかと、
Ｂ‐ＦＮを認識する抗体が、全身投与の場合に、生体内(in vivo)で眼球新生血
管構造を選択的に標的化することができるかどうかを調べた。この目的のために
、本発明者らは、血管内皮増殖因子もしくはホルボールエステルを含有するペレ
ットを外科的に移植することによって、新生血管を直接観察することが可能な、
ウサギ角膜中の血管形成を刺激した（図７）。スクラルファート（Ｍｅｒｃｋ社
、ドイツ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔの寄贈）／血管内皮増殖因子（Ｓｉｇｍａ社）８
００ｎｇまたはホルボール１２‐ミリステート１３‐アセテート（「ＰＭＡ」；
Ｓｉｇｍａ社）４００ｎｇを含有するヒドロンペレットを、雌のニュージーラン
ドホワイトウサギの角膜に、記載のように[Ｄ'アマート（D'Amato）, R.J., et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4082-4085 (1994)]移植した。両方の要
素によって、血管形成を誘導した。ウサギを毎日モニターした。どちらの誘導物
質を用いた場合も、新しく形成した血管は、免疫組織化学において強いＥＤ‐Ｂ
陽性であった。他の実験ではすべて、ＰＭＡペレットを使用した。免疫組織化学
研究によって、Ｌ１９は、ウサギの角膜中に誘導された新生血管系を強く染色す
るが、眼球の既存する血管（図９ｂ、ｃ）および他の既存する血管（データを示
さず）は染色しないことが示された。免疫組織化学は記載のように[カルネモー
ラ(Carnemolla), B. 等, Int. J. Cancer 68, 397-405 (1996)]行った。

【００８８】実施例５生体内(in vivo)で眼球血管形成を標的化する、ナノモル以下の親和性を有する
ＥＤ‐Ｂに結合するヒト抗体フラグメントＬ１９本発明者らは、先の実施例に記載の血管形成のウサギ角膜モデルおよびイムノ
フォト検出（immunophotodetection）法を用いて、赤色蛍光体Ｃｙ５に化学結合
したＬ１９は、静脈内注射すると眼球血管形成を選択的に標的化するが、無関係
な抗原に対する抗体フラグメント（ＨｙＨＥＬ−１０）−Ｃｙ５（図１０ａ、ｂ
）はそうではないことを実証した。成長する眼球血管の蛍光染色は、注入直後に
Ｌ１９ではっきりと検出することが可能であり、腫瘍血管形成に関する以前の観
察と同様に、少なくとも２日間存続した。続いて、角膜切片上での生体外(ex vi
vo)の免疫蛍光顕微鏡分析によって、血管構造の周りにＬ１９の局在化が確認さ
れたが、ＨｙＨＥＬ−１０の局在化は確認されなかった（図１０ｃ、ｄ）。異な
る種における抗Ｂ‐ＦＮ抗体の反応性と共に、抗体をベースとする眼球血管新生
の選択的標的化を証明することによって、将来の臨床的研究が保証される。免疫
蛍光イメージングは、病変が蛍光血管造影で明らかになる前に、リスク患者の眼
球血管形成を早期発見するのに有効である可能性がある。

【００８９】いくつかの方法論的詳細：生体外(ex vivo)の免疫蛍光法および一部のＨ／Ｅ染色については、包埋前に
、４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液で角膜を固定した。蛍光フォト検出(F
luorescence photodetection)の実験を、アセプロマジン５ｍｇ／ｋｇを用いて
鎮静させたウサギで行った。標的化の実験では、ｓｃＦｖ（Ｌ１９）₁−Ｃｙ５₀ _.66 ３．５ｍｇおよびｓｃＦｖ（ＨｙＨＥＬ−１０）₁−Ｃｙ５_0.83２．８ｍｇを
各ウサギに静脈内注射した（注入時間＝１５分）。ＨｙＨＥＬ−１０の注入直後
には認められなかったが、Ｌ１９の注入直後には既に、角膜新生血管系中で強い
蛍光を観察し、その蛍光は数時間持続した。特異性のその他の試験として、ｓｃ
Ｆｖ（ＨｙＨＥＬ−１０）−Ｃｙ５を前日に注入し、かつ蛍光フォト検出に陰性
であるウサギに、翌日ｓｃＦｖ（Ｌ１９）−Ｃｙ５を注入すると、そのウサギは
、角膜血管形成の強い蛍光染色を示した。

【００９０】蛍光検出については、Ｃｙ５励起フィルター（Ｃｈｒｏｍａ社、米国、バーモ
ント州ブラトルバロ）と、その端が眼球から約２ｃｍの距離に配置された２つの
光ガイドとを備えたタングステンハロゲンランプ（ＳｃｈｏｔｔＫＬ１５００
型；Ｚｅｉｓｓ社、ドイツ、Ｊｅｎａ）で、眼球を照射した。Ｃマウントキャノ
ンズームレンズ（Ｖ６×１６；１６〜１００ｎｍ；１：１．９）および直径５０
ｍｍのＣｙ５放出フィルター（Ｃｈｒｏｍａ社）を備え、照射した眼球から３〜
４ｃｍの距離に配置されている、冷却されたＣ‐５９８５モノクロＣＣＤカメラ
（浜松、日本、浜松市）で蛍光を検出した。捕捉時間は０．４秒だった。

【００９１】Ｃｙ５−トリス０．２５ｍｇを静脈内注射したが（Ｃｙ５−ＮＨＳとトリス［
ヒドロキシメチル］アミノメタンとの反応生成物：注入時間＝５秒）、Ｃｙ５蛍
光血管造影実験を同じ実験設定で行った。捕捉時間は０．２秒だった。

【００９２】抗体フラグメントは、ｓｃＦｖフォーマットであった。ｓｃＦｖ（Ｌ１９）お
よびｓｃＦｖ（ＨｙＨＥＬ−１０）の精製およびインドシアニン染料のＮ−ヒド
ロキシスクシンイミド（ＨＮＳ）エステルでのその標識化は、他に記載されてい
る[ネリ(Neri), D.等, Nature Biotechnol. 15, 1271-1275 (1997);ファットル
ッソ(Fattorusso)R.等 (1999) Structure, 7, 381-390]。抗体：２種類の抗体の
Ｃｙ５標識比はそれぞれ、１．５：１および１．２：１であった。Ｃｙ５‐ＮＨ
ＳをＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社（スイス、チュ
ーリッヒ）から購入し、オボアルブミンをＳｉｇｍａ社（スイス、Ｂｕｃｈｓ）
から購入した。

【００９３】標識化反応の後、５０ｍＭリン酸、ｐＨ７．４、１００ｍＭＮａＣｌ（ＰＢ
Ｓ）中で平衡化したＰＤ−１０カラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて、取り込まれなかった蛍光体または光増感剤から抗
体複合体を分離した。

【００９４】抗体複合体の免疫活性を、抗体カラムでアフィニティークロマトグラフィーに
よって測定し[ネリ(Neri), D.等, Nature Biotechnol. 15, 1271-1275 (1997)]
、すべてのケースで＞７８％であった。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって免疫複合体を分析し、免疫複合体は、ＭＷ＝３０,０
００ダルトン（純度＝９０％）のバンドとして移動した。

【００９５】実施例６赤色光を照射した場合に、眼球血管形成を選択的に標的化し、かつその閉塞を仲
介する、光増感剤Ｓｎ（ＩＶ）塩素ｅ６に化学的に結合するヒト抗体フラグメン
トＬ１９選択的血管切除を、抗体仲介標的化によって達成することができるかどうかを
試験するために、本発明者らは、光増感剤Ｓｎ（ＩＶ）塩素ｅ６（以降、「ＰＳ
」とする）に結合する、Ｌ１９抗体または新たに形成した血管中に局在化しない
無関係なタンパク質（オボアルブミン）をウサギに注入した。注入した動物の眼
球を赤色光（光量＝７８Ｊ／ｃｍ²）で照射した。代表的な結果を図１１に示す
。Ｌ１９−ＰＳで処置したウサギを照射して１６時間後、顕著な巨視的相違が認
められ（図１１ａ、ｂ）、角膜新生血管系は凝固したが、結膜もしくは他の眼球
構造中の血管は凝固しなかった。インドシアニン蛍光体Ｃｙ５を用いた蛍光血管
造影によって、固有の低蛍光領域として血管閉塞を確認した。これに対して、過
蛍光領域は、照射していない眼球の漏出新生血管系で観察された（図１１ｄ、ｈ
）。オボアルブミン‐ＰＳで処置したウサギの照射血管中では（図１１ｅ〜ｇ）
、検眼鏡検査またはＣｙ５蛍光血管造影によって、巨視的変化は検出不可能であ
った。角膜血管形成の初期段階での標的化Ｌ１９‐ＰＳ複合体の照射の影響を図
１１ｉ〜ｌに示す。選択的に結合した血管は、生きている動物で巨視的に目に見
え（図１１ｉ、ｊ）、安楽死させた直後の動物ではさらに明らかである（図１１
ｋ、ｌ）。

【００９６】顕微鏡技術を用いて、光力学的損傷をさらに調べた。照射後、標準ヘマトキシ
リン／エオシン（Ｈ／Ｅ）染色技術によって、Ｌ１９−ＰＳで処置した動物の非
固定角膜切片およびパラホルムアルデヒド固定角膜切片の両方で（図１１ｂ、ｆ
、ｊ）血管閉塞を検出することができたが、オボアルブミン‐ＰＳで処置した場
合（図１１ａ、ｅ、ｉ）には検出することができなかった。光増感剤複合体によ
って標的化した角膜部分におけるアポトーシスは、蛍光ＴＵＮＥＬアッセイでは
はっきりと目に見えるが（図１１ｃ、ｇ）、検出可能インクのネガティブコント
ロールではほとんど目に見えなかった（図１１ｄ、ｈ）。これより高い拡大率で
は、血管構造中の内皮細胞のアポトーシスが示された（図１１ｇ）。処置した動
物の虹彩、強膜および結膜の血管に対する損傷は、ＴＵＮＥＬアッセイ（図示せ
ず）またはＨ／Ｅ染色（図１１ｋ、ｌ）によって認めることができなかった。

【００９７】新生血管系の選択的光力学的切除は、光ディフューザーまたは光ファイバー技
術を用いた照射に利用し易い、眼疾患および他の血管形成関連の病態の治療に有
益である見込みがある。この研究結果から、既存の血管および正常な組織に損傷
を与えることなく、眼球新生血管系を選択的に閉塞させることができることが明
白に示されている。

【００９８】いくつかの方法論的詳細：ウサギ抗マウスポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社）に結合させた後に、光増
感剤のパネルから、効力、可溶性、および特異性に基づいて、スズ（ＩＶ）塩素
ｅ６を選択した。ヒトＣＤ４７（Ｎｏ．３１３４４１Ａ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ
社、米国、カリフォルニア州サンディエゴ）に特異的なモノクローナル抗体でコ
ーティングした赤血球の標的化光分解によって、これらの免疫複合体をスクリー
ニングした。スズ（ＩＶ）塩素ｅ６を記載のように[ルー(Lu), X.M. 等, J. Imm
unol. Methods 156, 85-99 (1992)]調製した。タンパク質に結合させるために
、１０倍モル過剰量のＥＤＣ（Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピル−Ｎ−エチル
カルボジイミドハイドロクロライド、Ｓｉｇｍａ社）およびＮＨＳ（Ｎ‐ヒドロ
キシスクシンイミド、Ｓｉｇｍａ社）と、スズ（ＩＶ）塩素ｅ６（２ｍｇ／ｍｌ
）をジメチルホルムアミド中で室温にて３０分間混合した。次いで、得られた活
性化混合物を８倍容積のタンパク質溶液に添加し（１ｍｇ／ｍｌ）、室温で１時
間インキュベートした。

【００９９】標識化反応後に、５０ｍＭリン酸、ｐＨ７．４、１００ｍＭＮａＣｌ（ＰＢ
Ｓ）中で平衡化したＰＤ−１０カラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて、取り込まれない蛍光体または光増感剤から抗体複
合体を分離した。抗体複合体の免疫活性を、先の実施例に記載のように測定した
。フォトキリング（photokilling）の実験では、ｓｃＦｖ（Ｌ１９）₁‐スズ（
ＩＶ）塩素ｅ６_0.8１２ｍｇ、またはオボアルブミン₁‐スズ（ＩＶ）塩素ｅ６_0. ₃₆ ３８ｍｇを、ウサギに静脈内注射し、実験を継続している間、暗所に保持した
。注入して８時間後、ケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（５ｍｇ／ｋｇ
）／アセプロマジン（１ｍｇ／ｋｇ）でウサギを麻酔し、Ｃｙ５フィルター（Ｃ
ｈｒｏｍａ社）と、その端が眼球から１ｃｍの距離に配置された２つの光ガイド
とを備えたＳｃｈｏｔｔＫＬ１５００タングステンハロゲンランプで、２個の
眼球のうち１個を１３分間照射した。その照射領域は約１ｃｍ²であり、照射出
力密度は１００ｍＷ／ｃｍ²であり、ＳＬ８１８光検出器（Ｎｅｗｐｏｒｔ社、
米国、カリフォルニア州アーヴィン）を用いて測定した。動物の苦痛のシグナル
は認められなかった。予防策として、照射後、ウサギに鎮痛薬を与えた（ブプレ
ノルフィン０．０３ｍｇ／ｋｇ）。フォトキリングをモニターするために、検眼
鏡で眼球を調べて、眼底カメラＫＯＷＡＳＬ−１４（ＧＭＰＳＡ社、スイス
、ローザンヌ、Ｒｅｎｎｅｎｓ）を用いて写真を撮った。スズ（ＩＶ）塩素ｅ６
複合体のそれぞれで、ウサギ５匹を処置し、一方の眼球のみに照射し、他方の眼
球はインターナルネガティブコントロールとしての役割を果たした。追加のコン
トロールとして、ウサギ２匹に照射のみを行い、光増感剤複合体を与えなかった
。

【０１００】過量の麻酔薬でウサギを安楽死させた直後、眼球除去を行い、角膜を除去し、
次いでＴｉｓｓｕｅＴｅｋ（ＳａｋｕｒａＦｉｎｅｔｅｃｈｎｉｃａｌ社、
日本、東京）に包埋し、凍結した。生体外(ex vivo)の免疫蛍光法および一部の
Ｈ／Ｅ染色では、包埋する前に、４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液で角膜
を固定した。さらなる顕微鏡分析に、５μｍのクライオスタット切片を使用した
。製造元の指示（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ社、スイス、Ｒｏｔｋｒｅ
ｕｚ）に従って、蛍光ＴＵＮＥＬ分析を行った。

【０１０１】実施例７ｍ‐ＭｅＡＴＥを介した、ヒト抗体フラグメントＬ１９へのアスタチン‐２１１
の結合無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２５ｍｌに溶解したｍ‐ブロモ安息香酸（
１ｇ、５ｍｍｏｌ）の溶液を、２５０ｍｌ二口丸底フラスコに入れ、窒素雰囲気
下で保持し、浴（エーテル：ドライアイス）を用いて−７５℃に冷却した。上記
の溶液に、ｎ‐ブチルリチウム（１．６Ｍヘキサン溶液）６．２５ｍｌを２５分
間かけてゆっくりと添加する。このようにして生成したジリチウムアニオン(dil
ithio anion)をさらに１０分間攪拌する。引き続き窒素雰囲気下にて、無水ＴＨ
Ｆ１０ｍｌ中に溶解したトリメチルスタンニルクロライド（１．０９ｍｇ、５．
４７ｍｍｏｌ）を２０分かけて反応混合物に添加する。冷却浴を取り除き、その
反応をゆっくりと室温（ＲＴ）にし、攪拌を１時間続ける。水（１０ｍｌ）を添
加することによって、その反応をクエンチし、ジエチルエーテル１００ｍｌで３
回抽出する。５％ＮａＨＣＯ₃（２×２５ｍｌ）および水（２×２０ｍｌ）で、
有機相を洗浄する。ＭｇＳＯ₄で乾燥させた後、回転蒸発装置でそれを濃縮する
。分析用、プレコートシリカゲルプラスチック製プレート上で以下の移動相：ヘ
キサン：エチルアセテート（ＥｔＯＡｃ）：酢酸（ＡｃＯＨ）（７０：２９．７
：０．３）を用いて薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行う。上述の同じ相で
溶出したシリカゲル６０カラム（４０〜６３μ、２００×３ｍｍ）を用いて、重
量クロマトグラフィーによって、３−（トリメチルスタンニル）ベンゾエート（
Ｒｆ＝０．４６）を精製する。オイルとして生成物１００ｍｇ（０．３５ｍｍｏ
ｌ）が収率７％で得られる。割り当てられた構造（¹Ｈ‐ＮＭＲ）を図１７ａ、
ｂに報告する。

【０１０２】再懸濁したスタンニルエステルに、Ｎ‐ヒドロキシ‐スクシンイミド（４８．
３４ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（８６．
６６ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍｌ）に添加し、室温で一晩攪拌
する。沈殿したジシクロヘキシルウレアを濾過除去し、溶媒を回転蒸発装置で蒸
発させて、オイルを得る。シリカゲル６０カラムを用いた、ヘキサン：ＥｔＯＡ
ｃ（２：１）の重量クロマトグラフィーによって、所望のｍ‐ＭｅＡＴＥ（Ｒｆ
＝０．３４）を単離する。溶媒を蒸発させた後、ｍ‐ＭｅＡＴＥ９２．３ｍｇ（
０．２４１ｍｍｏｌ）が相対収率６８．８％で得られる。割り当てられた構造は
、¹Ｈ‐ＮＭＲおよび質量分析によって確認される（図１８ａ、ｂおよび１９）
。この２官能化合物を用いて、α放出放射性核種のアスタチン‐２１１にｓｃＦ
ｖ（Ｌ１９）を結合させる。

【０１０３】不活性ガスで予め膨張させたグローブボックス内に、ｍ‐ＭｅＡＴＥ１．９ｍ
ｇ（５μｍｏｌ）およびｔ‐ブチルヒドロペルオキシド（２０μｍｏｌ）を、１
ｍＣｉ²¹¹Ａｔアニオンを含有するクロロホルムトラップに加える。その反応を
室温で１５分間保ち、使い捨てのＳｅｐ−Ｐａｋシリカゲルカートリッジを用い
て、その混合物を精製した。その反応混合物をヘキサン３００μｌに添加し、ヘ
キサンで予め平衡化しておいたカラムに充填する。ヘキサン（４０ｍｌ）および
ヘキサンに溶解した８％エチルアセテート（２５ｍｌ）で洗浄した後に、生成物
のＮ‐スクシンイミジル３‐²¹¹Ａｔ‐ベンゾエートを、ヘキサンに溶解した３
０％エチルアセテート（約１５ｍｌ）中で単離する。２官能物質ｍ‐ＭｅＡＴＥ
における放射性核種の取り込みは、²¹¹Ａｔの崩壊で放出されるポロニウムＫ
Ｘ線を含むように設定されたエネルギーウィンドウを有する自動γ線計数器を用
いて測定する。溶出した画分を蒸発させ、ジメチルスルホキシド（１００μｌ）
中に再懸濁し、次いでｓｃＦｖ（Ｌ１９）１３ｎｍｏｌを含有するホウ酸緩衝液
（ｐＨ＝８．５）２００μｌに添加する。その反応を室温で３０分間攪拌し、使
い捨てのＰＤ−１０ゲル濾過カラムを用いて、Ｌ１９‐²¹¹Ａｔ複合体を精製す
る。ＥＤ‐Ｂ‐セファロース樹脂（容量、＞２．５ｍｇＥＤ‐Ｂ／ｍｌ樹脂）２
００μｌ上に放射標識サンプルのアリコートをパスツールピペットで添加するこ
とによって、標識後の免疫活性を評価し、続いて、その流液および溶出液画分の
放射能計数を行う。溶出タンパク質の計数と、溶出および流液画分の計数の合計
との比として定義される免疫活性は、＞８０％である。

【０１０４】

【表１】表１：選択された抗ＥＤ‐Ｂ抗体クローンの配列ＶＨ鎖ＶＬ鎖クローン 31〜33^* 50-54^* 95-98^* 32^* 50^* 91-96^* A2 SYA AISGSG GLSI Y G NGWYPW G4 SYA AISGSG SFSF Y G GGWLPY E1 SYA AISGSG FPFY Y G TGRIPP H10 SFS SIRGSS FPFY Y G TGRIPP L19 SFS SIRGSS FPFY Y Y TGRIPP 設計された合成ライブラリから単離した抗体クローンの関連するアミノ酸位置
（^*：トムリンソン(Tomlinson)等(1995) EMBO J., 14, 4628-4638に従った番号
付け）。１文字アミノ酸コードを、標準ＩＵＰＡＣ命名法に従って使用する。

【０１０５】

【表２】表２：抗ＥＤ‐ＢのｓｃＦｖフラグメントの親和性クローン kon (s^-1M^-1) koff (s^-1)^B koff (s^-1)^C Kd (M)* A2 1.5 x 105 2.8 x 10-3 - 1.9 x 10-8 G4 4.0 x 104 3.5 x 10-3 - 8.7 x 10-8 E1 1.6 x 105 6.5 x 10-3 - 4.1 x 10-8 H10 6.7 x 104 5.6 x 10-4 9.9 x 10-5 1.5 x 10-9 L19 1.1 x 105 9.6 x 10-5 6.0 x 10-6 5.4 x 10-11 ＊）Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ。高親和性バインダーＨ１０およびＬ１９に関し
て、ＢＩＡｃｏｒｅの実験から得られたｋｏｆｆ値は、負の電荷を有するカルボ
キシル化固体デキストランマトリックスの影響のために十分に信頼できるわけで
はない；したがって、Ｋｄ値は、競合実験（実験的方法）によって得られたｋｏ
ｆｆ測定値から計算される。ｋｏｆｆ、動力学的解離定数；ｋｏｎ、動力学的結
合定数；Ｋｄ、解離定数。Ｂ＝ＢＩＡｃｏｒｅで測定；Ｃ＝エレクトロケミルミ
ネッセンス検出との競合によって測定。濃度測定の精度に基づいて、値は＋／−
５０の精度である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａは設計した抗体ファージライブラリを示す図である。

【図２】図１Ｂは設計した抗体ファージライブラリを示す図である。

【図３】図２ａはヒト悪性黒色腫ＣＯＬＯ‐３８細胞のライセートの２Ｄ
ゲルおよびウェスタンブロットを示す図である。

【図４】図２ｂはヒト悪性黒色腫ＣＯＬＯ‐３８細胞のライセートの２Ｄ
ゲルおよびウェスタンブロットを示す図である。

【図５】図３は多形性膠芽腫の免疫組織化学的実験を示す図である。

【図６】図４は抗体‐（ＥＤ‐Ｂ）複合体の安定性の分析を示す図である
。

【図７】図５は放射標識抗体フラグメントを注入した、腫瘍を有するマウ
スの生体内分布を示す図である。

【図８】図６はＬ１９のアミノ酸配列を示す図である。

【図９】図７は移植したペレットを有するウサギの眼を示す図である。

【図１０】図８はウサギの角膜切片の免疫組織化学を示す図である。

【図１１】図９は赤色のアルカリホスファターゼ基質およびヘマトキシリ
ンを用いた、ウサギの眼球構造（角膜、虹彩および結膜）の切片の免疫組織化学
を示す図である。

【図１２】図１０は眼球新生血管系中での蛍光標識抗体の局在化を示す図
である。

【図１３】図１１は照射前および照射後の、光増感剤に結合したタンパク
質を注入したウサギの眼の肉眼的外観を示す図である。

【図１４】図１２は光増感剤に結合し、かつ赤色光を照射したタンパク質
を注入したウサギの眼球構造の切片の顕微鏡分析を示す図である。

【図１５】図１３はそれぞれ血液および腫瘍１ｇ当たりに送達された注入
量％を時間に対してプロットした略図である。

【図１６】図１４は新生血管周辺のＬ１９の蓄積を示す図である。

【図１７】図１５はαおよびβ放射体それぞれに結合したＬ１９抗体のケ
ースで、時間に対してプロットした１ｇあたりの注入量の関連する％を示す略図
である。

【図１８】図１６は以降に記載のように修正した、ガルグ(Garg)のプロト
コルによる標識方法を示す図である。

【図１９】図１７ａは３‐（トリメチルスタンニル）‐安息香酸の１Ｈ‐
ＮＭＲスペクトルを示す図である。

【図２０】図１７ａ’は３‐（トリメチルスタンニル）‐安息香酸の１Ｈ
‐ＮＭＲスペクトルを示す図である。

【図２１】図１７ｂは３‐（トリメチルスタンニル）‐安息香酸の１Ｈ‐
ＮＭＲスペクトルを示す図である。

【図２２】図１７ｂ’は３‐（トリメチルスタンニル）‐安息香酸の１Ｈ
‐ＮＭＲスペクトルを示す図である。

【図２３】図１８ａはＮ‐スクシンイミジル‐３‐（トリメチルスタンニ
ル）‐ベンゾエートの¹Ｈ‐ＮＭＲスペクトルを示す図である。

【図２４】図１８ｂはＮ‐スクシンイミジル‐３‐（トリメチルスタンニ
ル）‐ベンゾエートの¹Ｈ‐ＮＭＲスペクトルを示す図である。

【図２５】図１９はＮ‐スクシンイミジル‐３‐（トリメチルスタンニル
）‐ベンゾエートのＥＩ−ＭＳを示す図である。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １０５Ａ６１Ｋ 43/00 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ヴィティーフランチェスカイタリアイ−16151 ジェノヴァヴィアバッタリーニ 16 (72)発明者ビルヒラーマンフレートスイスツェーハー8004 チューリッヒアンヴァントシュトラーセ 66 Ｆターム(参考） 4C084 AA01 AA02 AA12 NA13 ZA532 ZB221 ZB261 4C085 AA14 CC04 DD21 DD61 4H045 AA11 AA30 BA10 BA71 CA40 DA75 EA27 EA28 EA51

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】フィブロネクチンのＥＤ‐Ｂドメインの固有エピトープに対
して特異的親和性を有する抗体であって、前記ＥＤ‐Ｂのエピトープに対して向
上した親和性を有する抗体。
【請求項２】前記親和性が、ナノモル以下の範囲にある、請求項１に記載
の抗体。
【請求項３】前記抗体が、ＥＤ‐Ｂ（＋）フィブロネクチンを認識する、
請求項１に記載の抗体。
【請求項４】前記抗体が、ｓｃＦｖフォーマットである、請求項１に記載
の抗体。
【請求項５】前記抗体が、組換え抗体である、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】前記親和性が、ＣＤＲ残基に限定された数の突然変異を導入
することによって向上する、請求項４に記載の抗体。
【請求項７】前記残基が、ＶＨの３１〜３３番目、５０番目、５２番目お
よび５４番目の残基であり、かつ突然変異しているそのＶＬドメインの３２番目
および５０番目の２個の残基である、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】前記抗体が、Ｋｄ２７〜５４ｐＭ、最も好ましくはＫｄ５４
ｐＭを有するフィブロネクチンのＥＤ‐Ｂドメインに結合する、請求項１に記載
の抗体。
【請求項９】抗体Ｌ１９である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】以下のアミノ酸配列：ＶＨ E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S S F S M S W V R Q A P G K G L E W V S S I S G S S G T T Y Y A D S V K G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P F P Y F D Y W G Q G T L V T V S S リンカー G D G S S G G S G G A S T G ＶＬ E I V L T Q S P G T L S L S P G E R A T L S C R A S Q S V S S S Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y Y A S S R A T G I P D R F S G S G S G T D F T L T I S R L E P E D F A V Y Y C Q Q T G R I P P T F G Q G T K V E I K を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】前記抗体が、Ｌ１９の機能的に等しい異型である、請求項
１に記載の抗体。
【請求項１２】前記抗体が、放射標識される、請求項９に記載の抗体。
【請求項１３】前記抗体が、放射ヨウ素標識される、請求項１２に記載の
抗体。
【請求項１４】フィブロネクチンのＥＤ‐Ｂドメインの固有エピトープに
対して特異的親和性を有する抗体であって、前記ＥＤ‐Ｂドメインに向上した親
和性を有する抗体が使用される、迅速に血管形成を標的化する方法。
【請求項１５】血管形成の免疫シンチグラフィ検出のための、請求項１４
に記載の方法。
【請求項１６】糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性又は腫瘍などの血管増殖を
特徴とする疾患を検出するための、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】前記抗体が、その注入から３時間ないし４時間後、最も好
ましくは３時間後に、各組織に局在化する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】フィブロネクチンのＥＤ‐Ｂドメインの固有エピトープに
対して特異的親和性を有する抗体であって、前記ＥＤ‐Ｂドメインに対して向上
した親和性を有する抗体と、血管形成を検出するのに必要な１種または複数種の
試薬と、を含む診断キット。
【請求項１９】フィブロネクチンのＥＤ‐Ｂドメインの固有エピトープに
対して特異的親和性を有する抗体であって、前記ＥＤ‐Ｂドメインに対して向上
した親和性を有する抗体が使用される、腫瘍および血管増殖を特徴とする疾患の
診断および治療方法。
【請求項２０】請求項１に記載の抗体と、血液凝固および血管閉塞を誘発
することが可能な分子とを含む複合体。
【請求項２１】血液凝固および血管閉塞を誘発することが可能な前記分子
が、光活性分子である、請求項２０に記載の複合体。
【請求項２２】前記光活性分子が、光増感剤である、請求項２１に記載の
複合体。
【請求項２３】前記光増感剤が、６００ｎｍを超える波長で吸収する、請
求項２２に記載の複合体。
【請求項２４】前記光増感剤が、スズ（ＩＶ）塩素ｅ６の誘導体である、
請求項２２に記載の複合体。
【請求項２５】血液凝固および血管閉塞を誘発することが可能な前記分子
が、放射性核種である、請求項２０に記載の複合体。
【請求項２６】前記放射性核種が、αまたはβ放出放射性核種である、請
求項２５に記載の複合体。
【請求項２７】前記α放出放射性核種が、アスタチン‐２１１、ビスマス
‐２１２、ビスマス‐２１３である、請求項２６に記載の複合体。
【請求項２８】血液凝固および血管閉塞を誘発することが可能な前記分子
が、光増感剤および放射性核種によって表される、請求項２０に記載の複合体。
【請求項２９】請求項２０に記載の複合体を注入する、血管形成関連の病
態を治療する方法。
【請求項３０】請求項２２に記載の複合体を注入し、続いて照射を行う、
血管形成関連の病態を治療する方法。
【請求項３１】前記血管形成関連の病態が、眼球血管形成によって引き起
こされるか、あるいは眼球血管形成に関連する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】請求項２５に記載の複合体を注入する、血管形成関連の病
態を治療する方法。
【請求項３３】前記放射性核種が、アスタチン‐２１１である、請求項３
２に記載の方法。
【請求項３４】請求項２８に記載の複合体を注入する、血管形成関連の病
態を治療する方法。
【請求項３５】３‐（トリメチルスタンニル）安息香酸。