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ITFI940095A1 - Coniugati fotodinamici aventi proprieta' biocide - Google Patents

Coniugati fotodinamici aventi proprieta' biocide Download PDF

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ITFI940095A1
ITFI940095A1 IT94FI000095A ITFI940095A ITFI940095A1 IT FI940095 A1 ITFI940095 A1 IT FI940095A1 IT 94FI000095 A IT94FI000095 A IT 94FI000095A IT FI940095 A ITFI940095 A IT FI940095A IT FI940095 A1 ITFI940095 A1 IT FI940095A1
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IT
Italy
Prior art keywords
methyl
molecule
formula
conjugates
carrier molecule
Prior art date
Application number
IT94FI000095A
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English (en)
Inventor
Gabrio Roncucci
Giovanni Neri
Original Assignee
Molteni & C
Giovanni Neri
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to AT95920073T priority patent/ATE191852T1/de
Priority to PCT/EP1995/001938 priority patent/WO1995032001A1/en
Priority to AU25662/95A priority patent/AU2566295A/en
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Abstract

Sono descritti coniugati fotodinamici costituiti da una molecola carrier e da una molecola organica capace di produrre efficientemente ossigeno singoletto in seguito ad irradiazione.Tali coniugati nono utili sia a scopo terapeutico che diagnostico.

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: Composti fotodinamici aventi proprietà biocide
Campo dell'invenzione
La presente invenzione si riferisce a coniugati costituiti da una molecola carrier e da una una molecola organica capace di produrre efficientemente ossigeno singoletto in seguito ad irradiazione opportunamente derivatizzata in modo da reagire con un gruppo amminico o tiolico della molecola carrier. Tali coniugati sono capaci di svolgere azione biocida su vari tipi di cellule, sia in vivo che in vitro, quando attivati con radiazioni nel vicino UV e possono essere utilizzati sia a scopo terapeutico che diagnostico. Stato dell'arte
E' noto come molecole organiche, capaci di produrre efficientemente ossigeno singoletto in seguito ad irradiazione, siano dotate di attività biocida fotoiniziata. L' attività biocida di queste molecole si manifesta contro essenzialmente ogni forma vivente, virus, funghi, batteri, invertebrati, vertebrati, cellule eucarioti [vedi J.B.Hudson et al.: Pharm. Ther. 49, 181 (1991); J.B. Hudson et al.: Chemosphere JL9, 1329 (1989); J.B.Hudson et al.: Chemosphere 18. 2317 (1989)].
Le proprietà biocide rendono queste molecole estremamente interessanti per un gran numero di applicazioni in terapia. Tuttavia l'applicazione pratica delle molecole suddette è fortemente limitata dal fatto che esse sono potenti allergeni da contatto e provocano, una volta somministrate ed irraggiate, eritemi, prurito ed iperpigmentazione per periodi anche di settimane e mesi [vedi G.H.N. Towers et al.: Contact Dermatitis 5, 140 (1978); W. Rampone et al.: J. Invest. Dermatol. 87., 354 (1986)].
E' quindi ovvio l'interesse a sviluppare composti che pur possedendo le capacità biocide volute non presentino gli effetti collaterali indesiderati.
Descrizione dettagliata dell'invenzione
E' stato ora sorprendentemente trovato che è possibile annullare gli effetti negativi legati all'uso delle molecole suddette mantenendone intatte le proprietà biocide per mezzo di coniugati in cui la molecola organica capace di produrre efficientemente ossigeno singoletto in seguito ad irradiazione è coniugata ad una molecola carrier capace di indirizzarla su un target biologico definito.
Secondo una particolare realizzazione della presente invenzione la molecola organica capace di produrre efficientemente ossigeno singoletto in seguito ad irradiazione è una molecola di formula generale ( I)
ove Z 1, Z2 , Z3 uguali o diversi fra loro sono S o O, opportunamente derivatizzato in modo da reagire con un gruppo amminico o tiolico della molecola carrier.
Secondo un'ulteriore particolare realizzazione dell'invenzione la molecola organica capace di produrre efficientemente ossigeno singoletto in seguito ad irradiazione è il 2,2':5',2'·- tertiofene (qui di seguito abbreviato in a-T) molecola di formula (I) in cui Z1 = Z2 = Z3 = S.
Secondo l'invenzione la molecola carrier è scelta nel gruppo costituito da: anticorpi (nativi, monoclonali o ricombinanti) peptidi, aptameri (acidi nucleici capaci di legame selettivo verso un target), zuccheri, o altri carrier analoghi capaci di indirizzare il derivato di formula (I) verso un target biologico come ad esempio il coniugato Avidina-Biotina;
In particolare il composto tertienilico può essere derivatizzato con un gruppo capace di coniugarsi con gruppi amminici (ad esempio catene laterali di residui di lisina in peptidi o proteine), con gruppi tiolici (ad esempio catene laterali di cisteina), con residui saccaridici opportunamente modificati della molecola carrier o con un coniugato avidina-biotina sfruttando i gruppi funzionali presenti in questa molecola; queste soluzioni permettono di coniugare il derivato tetienilico con un vasto spettro di molecole diverse.
La derivatizzazione del composto tertienilico è effettuata preferibilmente in posizione 2.
Nel caso in cui la molecola carrier sia il coniugato avidina-biotina il coniugato oggetto della presente invenzione può essere formato direttamente in vivo somministrando separatamente la parte costituita da biotina legata alla molecola veicolo e la parte costituita da avidina legata al derivato a-T o viceversa. Poiché il legame Avidina-Biotina possiede un elevatissimo coefficiente di affinità (1015M-11-1) si rende possibile la immobilizzazione della molecola di a-T sull'agente patogeno in modo temporalmente differenziato, per esempio legando l'Avidina all'anticorpo e poi somministrando l'a-T legato alla Biotina procedura che consente la somministrazione di quantità inferiori di a-T senza tuttavia diminuire la sua efficacia curativa.
Il coniugato secondo l'invenzione, come precedentemente definito, può essere utilizzato sia per il trattamento topico di malattie superficiali (melanomi, malattie dell'occhio, infezioni fungine o virali della pelle) sia veicolato per via intramuscolare o endovenosa.
Nel caso di somministrazione topica si utilizzeranno le composizioni comunemente previste per questo scopo come: pomate, creme, unguenti contenenti il composto di formula (I) in combinazione con gli opportuni diluenti noti nello stato dell'arte per questo tipo di applicazioni.
La composizione verrà applicata direttamente nell'area di interesse quindi si laverà la parte in modo da ridurre la presenza di a-T presso cellule sane ma senza compromettere la sua localizzazione sul patogeno ed infine sottoponendo la parte ad irraggiamento con luce del vicino ultravioletto (circa 360 nm) o semplicemente esponendo la parte trattata alla luce solare.
Nel caso di iniezioni il prodotto attivo verrà disciolto negli opportuni liquidi fisiologicamente accettabili per la preparazione di soluzioni iniettabili.
In questo caso l'irraggiamento successivo, necessario ad attivare la molecola, potrà essere effettuato utilizzando fibre ottiche e le tecniche chirurgiche correlate.
Vengono ora riportati, a titolo esplicativo ma non limitativo, alcuni esempi di realizzazione di prodotti secondo l'invenzione.
In particolare, negli Esempi 1 - 8 qui di seguito riportati si descrive la preparazione di derivati del 2,2':5',2" tertienile opportunamente funzionalizzato per poter reagire covalentemente con gruppi aimninici presenti sulla molecola carrier; negli esempi 9 - 11 la funzionalizzazione è effettuata per consentire la analoga reazione con gruppi tiolici presenti sulla molecola carrier; nell'esempio 12 la funzionalizzazione è effettuata per consentire l'analoga reazione con gruppi saccaridici.
Gli esempi 13 - 19 si riferiscono a coniugati secondo l'invenzione; ed infine gli esempi 20 - 22 descrivono prove sull'attività biocida dei prodotti considerati.
Derivati dell'a-T reattivi verso eruppi amminici
Esempio 1
5-Formil-2,2 ':5',2" -tertiofene [(a-T)-CHO]
La preparazione è stata eseguita secondo la procedura descritta da R. Rossi et al. Tetrahedron 47, (39) 8443-60 (1991) .
44.8 mmol di N-metilformanilide e 40,7 mmol di POCl3 vengono miscelati a temperatura ambiente e la soluzione agitata per 15'.
Viene aggiunta una soluzione di 2/2':5',2l, tertiofene (40,7 mmoli) in 200 mi di diclorometano e la miscela risultante agitata a riflusso per 40h.
La miscela viene quindi versata in una soluzione di HC1 al 10%, agitata per ih ed estratta con diclorometano.
Gli estratti organici, dopo essere stati lavati con una soluzione di NaCl ed anidrificati sono evaporati a secco ed il residuo purificato per cromatografia su colonna (gel di silice-benzene) per dare un solido giallo-oro cristallino, p.f .: 137-8'C.
Esempio 2
Metil(E)-3-(2,2 ':5',2"-tertien-5-il)propenoato
Ad una soluzione di 358 mg di dimetilfosfono acetato in 50 mi di THF anidro, raffreddata a O’C, vengono aggiunti 59 mg di idruro di sodio e la soluzione risultante lasciata prima in agitazione per 30 minuti, quindi riportata a temperatura ambiente continuando l'agitazione per altri 15 minuti.
Vengono aggiunti successivamente, a piccole porzioni, 500 mg (1,79 mmoli) dell'aldeide ottenuta nell'esempio 1 e la miscela di reazione lasciata in agitazione per 2 ore.
Il solvente viene quindi evaporato ed il residuo ripreso con acqua.
Il solido giallo ottenuto viene seccato e cristallizzato da AcOEt; p.f.: 197-99°C.
Analisi elementare
Calcolato: C 57,80 H 3,64
Trovato : C 57,27 H 3,47
Esempio 3
Acido (E)-3-f2.2':5'.2 "-tertien-S-il )propenoico
50 mg dell'estere ottenuto dall'esempio 2 vengono sospesi in 3 mi di metanolo. Alla sospensione si aggiungono 0,5 mi di una soluzione di KOH al 20% e la miscela di reazione riflussata per 56 ore. Al termine della reazione il solvente viene evaporato a secco, il solido ripreso con HC1 6N ed estratto con cloroformio.
Gli estratti lavati, anidrificati ed evaporati danno un solido giallo; p.f.: 300’C (dee.).
Esempio 4
Acido (E)-3-(2,2':5',2"-tertien-5-il)propenoico N-idrossi succinimido estere
0,063 mmoli dell'acido ottenuto nell'esempio 3 sono sospesi in 2 mi di DMF. Vengono successivamente aggiunti alla sospensione 1,5 equivalenti di N-idrossisuccinimide, la miscela di reazione agitata a temperatura ambiente ed addizionata di 0,063 mmoli di dicicloesilcarbodimmide solubilizzata in 5 mi di diclorometano distillato.
Il tutto viene lasciato in agitazione a temperatura ambiente per 48 ore. Il solido che si ottiene, costituito per la maggior parte di dicicloesil urea, viene filtrato via, lavato con poco diclorometano, le soluzioni riunite ed evaporate a secco per eliminare la DMF, quindi il solido ripreso con diclorometano. La dicicloesil urea residua, che si separa nuovamente, è eliminata e la soluzione evaporata dopo averla lavata con acqua ed anidrificata. Si ottiene un solido giallo.
Esempio 5
N-(5-raetil-2,2':5',2"-tertienil)-l-prolina
0,58 mmoli di aldeide dell'esempio 1 vengono sospesi in 30 mi di metanolo a temperatura ambiente ed alla sospensione vengono aggiunti 1,15 mmoli di prolina e 300 mg di setacci molecolari.
Dopo aver saturato la miscela di reazione con azoto si aggiungono 100 mg di sodio cianoboroidruro ed il tutto è mantenuto in agitazione per 12 ore a temperatura ambiente.
Al termine della reazione il solvente viene evaporato a secco ed il residuo grigiastro, dopo essere stato ripreso con acqua, viene filtrato, previa eliminazione dei setacci molecolari.
Si ottiene un solido giallo chiaro; p.f.: 157-63*C (dee.) (MeOH-DMF) che imbrunisce per esposizione alla luce.
Esempio 6
N- (5-metil-2,2':5',2"-tertienil)-1-prolina-N-idrossisuccinido estere [a-TPOSu]
A 0,13 mmoli del composto ottenuto nell'esempio precedente, cristallizzati e sospesi in una miscela costituita da 3 mi di DMF e 5 mi di diclorometano, si aggiungono, in una sola volta, 0,13 mmoli di idrossisuccinimide.
La sospensione viene sonicata per favorire la massima solubilizzazione dei reagenti e addizionata, a temperatura ambiente, di 0,13 mmoli di dicicloesilcarbodiimmide precedentemente solubilizzata in 5 mi di diclorometano.
La miscela di reazione viene lasciata in agitazione per 20 ore a temperatura ambiente. Il solido che si ottiene viene eliminato per filtrazione; la soluzione residua evaporata a secco permette di ottenere un olio giallo chiaro che viene solidificato per aggiunta di etere di petrolio per dare un solido che corrisponde al prodotto desiderato.
Analogamente è stato preparato l' N-(5-metil-2,2':5',2 tertienil )-1-prolina-N-idrossisulfosuccinimido estere
N-metil-N-( 5-metil-2, 2 ' : 5 ' , 2" -tertienil ) glieina
0, 89 mmoli dell 'aldeide secondo l 'esempio 1 vengono sospesi in 50 mi di una miscela metanolo/acido acetico 99 : 1 , preventivamente deareata e saturata con azoto. Si aggiungono 3 equivalenti di sarcosina e , sotto agitazione , 0 , 5 equivalenti di sodio cianoboroidruro e temperatura ambiente. La miscela di reazione viene mantenuta sotto agitazione, al riparo dalla luce, per 24 ore, durante le quali si forma un abbondante precipitato giallo.
Il solido così ottenuto, dopo essere stato separato per filtrazione, viene seccato e cristallizzato da una miscela isopropanolo/DMF . p.f.: 230°C (dec.)
Procedendo in modo analogo a quanto descritto nell'esempio 6 si sono ottenuti:
N-metil-N- (5-metil-2,2':5',2"-tertienil)glicina-N-idrossi-
succinimido estere.
N-metil-(5-metil-2,2 ':5',2 "-tertienil)gicina-N-idrossisolfosuccinimido estere.
Derivati dell'a-T reattivi verso gruppi tiolici
Esempio 8
5-metilaminometil-2,2':5',2"-tertiofene
1,44 mmoli dell'aldeide dell'esempio 1 vengono sospese in 50 mi di metanolo precedentemente degassato e addizionate di 6 equivalenti di metilammina cloridrato.
Alla sospensione, mantenuta in agitazione a temperatura ambiente sotto battente di azoto, vengono aggiunti 0,5 equivalenti di NaCNBH3. La miscela di reazione è lasciata in agitazione per 2 ore al riparo dalla luce quindi la sospensione risultante evaporata parzialmente. Il prodotto purificato per cromatografia su strato sottile (gel di silice, cloroformio:etanolo 93:7)permette di ottenere un solido giallo chiaro.
Esempio 9
N-metil-N-(5-metil-2 ,2':5',2"-tertienil)-bromo acetamide [ (a-T)-BrAc]
0,24 mmoli dell 'ammina ottenuta nell'esempio 5 sono solubilizzati in 50 mi di diclorometano deareato e mantenuto sotto battente di azoto.
La soluzione si raffredda a 0°C e sotto agitazione al riparo dalla luce vengono aggiunti 0,24 moli di estere N-idrossisuccinimido dell'acido bromoacetico precedentemente preparato. Dopo 30' la temperatura viene fatta risalire a valori ambientali e mantenutavi per 2 ore.
Il residuo cristallino che rimane per evaporazione del solvente viene ripreso con etere di petrolio e purificato per cromatografia su strato sottile (gel di silice, cloroformio). Il solido cristallino giallo chiaro che si ottiene ha p.f.: 107-9*C.
Analisi elementare
Esempio 10
S,S-piridil-ditio-N-metil-(5-metil-2,2':5',2 "-tertienil)-propanamide
0,20 moli dell'ammina ottenuta nell'esempio 5 vengono solubilizzate in 30 mi di diclorometano distillato, degassato e saturato con azoto. La soluzione viene raffreddata a 0"C e, al riparo della luce e sotto agitazione, addizionata di 0,22 mmoli di acido S,S-piridilditiopropionico-N-idrossisuccinimido estere (SPDP). Dopo 1 ora la soluzione è riportata a temperatura ambiente lasciando poi il tutto in agitazione per altre 48 ore.
Il solvente viene quindi evaporato completamente ed il prodotto residuo purificato per cromatografia su colonna (gel di silice, cloroformio/metanolo 98:2).
Analisi elementare
Esempio 11
N-metil-N-(5-metil-2,2':5 ':2 "-tertienil)-4-(N-maleimidometil) cicloesil-l-carbossiamide
0,27 mmoli di ammina secondo l'esempio 8 vengono solubilizzati in 2 mi di DMF.
La soluzione ottenuta viene diluita con 30 mi di diclorometano saturato con azoto e raffreddata a 0‘C.
Alla soluzione vengono aggiunti 0,30 mmoli (1,1 equivalenti) di succiniraidil-4-(N-maleimidometil)-cicloesano-l-carbossilato (SMCC) sotto agitazione.
La temperatura viene fatta risalire, quindi la miscela di reazione riscaldata a 35’C per 12h e successivamente addizionata di altri 0,09 mmoli di SMCC.
Dopo 24h in agitazione il solvente viene evaporato, il residuo solido ripreso con ET20, filtrato e purificato per cromatografia su colonna (gel di silice - CHCI3).
Solido bianco cristallino, p.f.: 171 - 3*C (CHCI3)
Esempio 12
N-metil-N-(5-metil-2,2':5',2"-tertienil)glicil idrazide
0,5 mmoli del prodotto descritto nell'esempio 7(N-metil-N-(5-metil-2,2':5' ,2"-tertienil)glicina N idrossisuccinimido estere) solubilizzati in 5 mi di THF anidro, vengono aggiunti goccia a goccia a 5 mi di una soluzione di idrazina idrato in THF al 5% raffreddata a O’C, sotto vigorosa agitazione.
Dopo 4h la miscela di reazione viene evaporata ed il residuo oleoso purificato per cromatografia su colonna 8gel di silice; CHCl3/CH3OH 95;5) per dare un solido giallo chiaro; p.f.: 158°C.
Funzionalizzazione dei carrier
Esempio 13
Coniugato (a-T)-Concanavalina A
A 2 mg di Concanavalina A (prodotta dalla Sigma) solubilizzati in 0,25 mi di 100 mM tampone fosfato (pH 8) si aggiungono lentamente 100 ul di una soluzione di aTPOSu 16,5 mg/ml (conc finale 3,5xl0”3 mmoli) e la sospensione che si ottiene è lasciata in blanda agitazione per una notte a 4“C al buio.
Dopo aver centrifugato la sospensione, la Concanavalina A tertienilata viene purificata per gel filtrazione su Sephadex G25 raccogliendo le frazioni che mostrano una caratteristica fluorescenza.
La Concanavalina A tertenilata è stata caratterizzata in termini di moli di a-T per mole di proteina e questo valore è risultato essere uguale a 10.
Esempio 14
Coniugato (a-T)-Succinil Concanavalina A (SuConA)
La reazione di tertienilazione della SuConA è stata effettuata in modo analogo a quanto riportato nell'esempio 13.
Il rapporto moli di a-T per mole di proteina è risultato essere uguale a 1,5, quindi minore rispetto al coniugato con Concanavalina A a causa di una minore disponibilità dei gruppi aminici.
Esempio 15
Coniugato (a-T)-Avidina
A 2 mg di Avidina (prodotto Boheringer) solubilizzati in 0,5 mi di 100 mmol tampone fosfato (pH 8), vengono aggiunti 100 ul di soluzione 1,54 mg/ml in DMSO di aTPOSu (esempio 6). La sospensione è lasciata in blanda agitazione per una notte a 4 "C al buio, centrifugata, quindi il coniugato purificato per gel filtrazione su Sephadex G10R eluendo con 100 MM tampone fosfato (pH 8), raccogliendo le frazioni visibilmente fluorescenti a 360 nm.
Il rapporto tra il numero di moli di a-tertienile introdotte per mole di Avidina è stato ricavato dal valore del coefficiente di estinzione molare determinato per il derivato a-tertienilico impiegato in relazione a quello della proteina ed è risultato essere uguale a 7.
Esempio 16
N,N '—dimetil-N-(5-metil-2,2':5',2 "-tertienil)-N'-biotinil-
1,2-diamminoetano
0 , 2 mmoli dell ' aldeide ottenuta nell ' esempio 1 vengono sospesi in 30 mi di una miscela CH3OH/CH3COOH ( 99 : 1 ) .
Dopo aver saturato la sospensione con azoto si aggiungono 2 equivalenti di N,N'-dimetil-N'-biotinil-l, 2-diamininoetano e 0,5 equivalenti di sodio cainoboroidruro.
La sospensione viene mantenuta in agitazione per 48h quindi il solvente evaporato, il residuo ripreso con acqua, filtrato e purificato per HPLC.
Esempio 17
Bovine Serum Albumin (BSA) è stata sciolta in PBS alla concentrazione di 50 mg/ml; l'aldeide ottenuta secondo l'esempio 1 e il prodotto ottenuto nell'esempio 6 (aTPOSu) sono stati disciolti in dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione di 2 mg/ml. In due esperimenti paralleli 1,8 mi di soluzione di BSA sono stati fatti reagire per una notte a 4 *C e al buio con 0,2 mi delle due soluzioni di derivati dell'a-T suddette. All'indomani una piccola aliquota dei due prodotti di reazione è stata conservata mentre il resto del prodotto grezzo di reazione è stato sottoposto a gel filtrazione su colonne PD-10 (Pharmacia), per separare la BSA tertienilata dai reagenti tertienilici eventualmente in eccesso. Durante la gel filtrazione si è osservato che la colorazione giallognola dell'a-T derivato co-migrava quantitativamente con la frazione proteica, indicando che i composti tertienilici avevano reagito in maniera quantitativa con la proteina. I prodotti grezzi di reazione ed i prodotti purificati per gel filtrazione sono infine stati analizzati per elettroforesi su gel di acrilammide in condizioni native, usando BSA marcata con fluoresceina come marker. Le bande nel gel sono state visualizzate mediante irraggiamento con luce ultravioletta il gel è stato quindi fotografato in queste condizioni. Tale analisi ha rivelato che la tertienilazione della BSA con i due reagenti impartiva una fluorescenza ben rivelabile dalle due bande caratteristiche della BSA su gel nativo, che migravano in maniera simile alle due bande della BSA marcata con fluoresceina.
Esempio 18
L'anticorpo monoclonale 225-28S [Natali P.G. et al . J. Nat. cancer Inst. 73, 13-24 ( 1984) è stato f unzionalizzato con aTPOSu ai residui amminici utilizzando il seguente protocollo.
Ad 1 mg del monoclonale 225-28S ad una concentrazione di 5 mg/ml in 100 mM tampone fosfato, pH 8, sono stati aggiunti, lentamente tramite una pipetta a volume variabile, 50ul ul di una soluzione di aTPOSu 14 mg/ml in DMSO (conc. finale l,3xl0“3 mmoli, 200 equivalenti).
La sospensione lattescente che si forma, viene lasciata in agitazione per 2 ore a temperatura ambiente e al buio. Dopo questo tempo il solido ancora presente viene eliminato per centrifugazione e la soluzione dell 'anticorpo marcato purificata per gel filtrazione su Sephadex G25 .
La marcatura del monoclonale è stata verificata registrando lo spettro UV delle frazioni riunite ottenute dalla purificazione per gel filtrazione, che presenta due massimi di assorbimento a 280 nm e 360 nm e che sono attribuibili rispettivamente alla proteina ed alla presenza del derivato alfa tertienilico.
Dalla misura degli assorbimenti UV misurati e dal valore di ε360 = 27000 LM-1cm-1· precedentemente determinato per il derivato atertienilico utilizzato è possibile stimare un rapporto di marcatura di 3 moli di a-T per mole di proteina.
Esempio 19
Un anticorpo ricombinante anti-lisozima, HyHEL-10 [Lavoie T.B. et al.: J. Immunol. 148, 503-513 (1992)], in configurazione scFv (G.Winter e C.Milstein: Nature, 349, 293 (1991)) in cui è stato clonato un residuo di cisteina all'estremità C-terminale della molecola come unico sito di funzionalizzazione tiolo-specifico (qui di seguito indicato come anticorpo scFv-cys), è stato funzionalizzato con la bromo acetamide dell'esempio 9 nella maniera seguente.
L'anticorpo scFv-cys ad una concentrazione di 1 mg/ml in PBS è stato ridotto per 15 minuti mediante aggiunta di ditiotreitolo (DTT) ad una concentrazione finale di 0,1 mM. A 0,9 mi della soluzione di anticorpo ridotto è stato aggiunto 0,1 mi di una soluzione della bromo acetamide secondo l'esempio 9 in DMSO (2 mg/ml; concentrazione finale: 0,48 mM), in modo da avere abbastanza derivato tertienilico per saturare il DTT presente in soluzione e funzionalizzare le cisteine delle molecole di scFv-Cys. La reazione è stata condotta per 2 ore in ghiaccio, quindi fermata tramite aggiunta di 0,1 mi di 100 mM DTT. L'anticorpo tertienilato è stato purificato per gel filtrazione su colonna PD-10 Pharmacia) e l'avvenuta tertienilazione è stata evidenziata mediante gel elettroforesi su gel di acrilamide in condizioni denaturanti. Il gel irraggiato con radiazione ultravioletta, ha mostrato la presenza di una banda fluorescente di peso molecolare di circa 30000 dalton.
Effetto biocida
Esempio 20
Attività antibatterica di derivati tertienilici sostituiti Il ceppo batterico TG1 (Escherichia coli) contenente un plasmide con il gene della resistenza all'ampicillina è stato cresciuto in medium 2xTY 100 ug/ml ampicillina fino a raggiungere un valore di A600 = 0,5. Le cellule sono quindi state centrifugate, risospese in PBS (10 volte il volume originario; A600 = 0,05) in capsule Petri. A ciascuna capsula è stata aggiunta una diluizione 1:1000 di una soluzione madre di fotosensibilizzatore [PBS (Controllo negativo), a-T oppure (a-T)-CHO (secondo l'esempio 1)] in DMSO (lmg/ml ). La concentrazione finale di fotosensibilizzatore era pertanto 1 ug/ml. Le capsule Petri sono state irraggiate sotto leggera agitazione da una lampada UVP BLB e piastrati in diluizioni seriali (10 ul e 100 ul) su piastre di agar 2xTY 100 ug/ml ampicillina. L'efficacia della foto-uccisione di batteri, non solo da parte dell'a-T ma anche del derivato (a-T)-CHO è facilmente rivelabile sulla base del numero delle colonie formate su piastra in seguito ad irraggiamento:
Come si vede il derivato tertienilico sostituito conserva la sua attività biocida.
Esempio 21
Attività antitumorale di anticorpi tertienilati.
Si utilizza la linea cellulare COLO-38, derivata da un melanoma, e l'anticorpo monoclonale 225-28S tertienilato secondo l'esempio 18 (e qui di seguito denominato IgG-(a-T). Il rapporto molecola di a-T/molecola di IgG è stato stimato essere 1.6 sulla base dell'assorbimento del coniugato a 360 nm, usando il coefficiente di assorbimento 6368 = 27000 LM-1cm—1 per a-T, conoscendo la quantità di proteina usata nella reazione di tertienilazione ed assumendo nessuna perdita oppure dai valori dei coefficienti di estinzione molare ε 360 = 27000 LM-1cm-1 e ε280 = 2700 LM-1cm-1 come contributo dell'assorbimento a 280 nm proprio della proteina in esame.
Cellule COLO-38, cresciute in medium RPMI addizzionato di Fetal Calf Serum (FCS) 10%, sono state lavate ed incubate in parallelo in capsule Petri con IgG (a-T) (5 uM), IgG da sola (5 uM), IgG-(a-T) non correlate (5 uM) o solo con il medium nei controlli negativi. Le capsule sono state irraggiate a 350 nm per 30 minuti, quindi lavate e lasciate ad incubare per 24 ore in RPMI addizionato di FCS 10%. La percentuale di cellule morte e di cellule vive è stata infine determinata nel modo seguente.
Le cellule sono state incubate con bromuro di propidio e fluoresceina diacetato, quindi lavate ed analizzate con un microscopio confocale BioRad MRC 600R. Il bromuro di propidio colora intensamente di rosso il DNA delle cellule morte, mentre la fluoresceina diacetato viene efficientemente idrolizzata ad un prodotto fluorescente verde da parte di esterasi presenti in cellule vive.
In questo modo l'analisi mediante microscopia confocale laser a due lunghezze d'onda evidenzia il numero di cellule morte e vive in una popolazione.
I risultati sopra riportati indicano chiaramente che le cellule di melanoma sono efficientemente uccise da IgG-(a-T) ma non da IgG o nel controllo negativo effettuato in assenza di reagenti e con IgG non correlata cioè non specifica per le cellule COLO-38, in particolare confrontando la " % Uccisioni" causate da IgG-(a-T) e da IgG non correlata risulta evidente che la localizzazione dell'a-T, dovuta alla presenza nel coniugato della molecola carrier, ha come conseguenza l'uccisione selettiva delle cellule bersaglio. Esempio 22
Attività antifungina di a-T veicolato
Seguendo la procedura descritta precedentemente si è coniugato il prodotto ottenuto nell'esempio 6 (aPTOSu) alla Concanavalina A (Con A) e alla succinil-Concanavalina A (SuConA) un derivato della Concanavalina capace di legare una grande varietà di funghi, ma molto meno suscettibile di agglutinazione rispetto alla Concanavalina A.
Una cultura di Saccharomyces cerevisiae, cresciuta in Sabouraud Dextrose Broth a 37’C per 4 h, fu diluita fino ad una concentrazione di circa 2,5x10^ cellule/ml. Aliquote di 0,1 mi di questa sospensione sono state aggiunte nei pozzetti di piastre sterili mediante pipetta multicanale. Sono stati quindi aggiunti nei vari pozzetti 0,1 mi di soluzione ad opportuna concentrazione contenente il derivato tertenilato da saggiare. I composti saggiati sono stati l'a-T a concentrazioni finali di 5 ug/ml e 10 ug/ml, BSA-(a-T), ConA-(a-T), SuConA-(a-T ), BSA, ConA, SuConA, IgG-(a-T) antimelanoma (vedi esempio 19). Una fila non conteneva alcuna sostanza tertenilica aggiunta e fungeva da bianco di riferimento. Le piastre così preparate sono state incubate al buio per 0,5 h, quindi irraggiate a 350 nm per 30 minuti ed infine lasciate incubare al buio per 24 ore. La densità ottica a 492 nm (A492) della sospensione, correiabile in modo quasi lineare alla sopravvivenza del microrganismo, è stata determinata prima dell'irradiazione e 24 ore dopo. La differenza, espressa come percento di assorbenza (A) nei confronti della differenza ottenuta per il bianco è stata denominata "% sopravvivenza" ed usata per valutare l'attività biocida per i vari composti. I valori ottenuti mostrano che i coniugati ConA-(a-T) e SuConA-(a-T) sono efficaci nell'uccisione di funghi, e quale sia l'importanza di usare un veicolo capace di legare il microrganismo (ConA) e (SuConA) nei confronti di un veicolo non legante e non specifico (BSA).
Gli esempi sopra riportati indicano chiaramente che l'a-T, o suoi analoghi strutturali, opportunamente veicolati possono essere utilizzati per l'uccisione selettiva e quantitativa di bersagli biologicamente e clinicamente rilevanti quali cellule tumorali, batteri e funghi. Inoltre l'uccisione di virus mediata da a-T veicolato, ad esempio herpes virus, è particolarmente interessante data la possibilità di agire sull'infezione a livello topico sia per quanto riguarda l'applicazione del principio attivo che per le modalità di irraggiamento della zona interessata.
E' ovvio come, oltre alle modifiche operate sulla molecola di a-T in modo da renderla reattiva con gruppi amminici, tiolici e residui saccaridici (come specificatamente descritto), sia possibile modificare il derivato tertienilico in modo da renderlo reattivo con altri gruppi e quindi allargare ulteriormente la possibilità di coniugazione molecole veicolo diverse, specifiche per attacchi mirati.

Claims (15)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Coniugati costituiti da una molecola carrier e da una molecola organica capace di produrre efficientemente ossigeno singoletto in seguito ad irradiazione.
  2. 2. Coniugati secondo la rivendicazione 1 in cui la molecola organica capace di produrre efficientemente ossigeno singoletto in seguito ad irradiazione è un composto di formula (I) ove Ζ1, Z2, Z3 uguali o diversi fra loro sono S o O, opportunamente derivatizzato in modo da reagire con un gruppo amminico, tiolico o saccaridico della molecola carrier.
  3. 3. Coniugati secondo la rivendicazione 2 in cui il composto di formula (I) è 2,2':5 '2 "-tertiofene opportunamente derivatizzato in modo da reagire con un gruppo amminico, tiolico o saccaridico della molecola carrier.
  4. 4. Coniugati secondo la rivendicazione 1 in cui la molecola carrier è scelta nel gruppo costituito da anticorpi, peptidi, aptameri, zuccheri o altri carrier analoghi capaci di indirizzare la molecola capace di produrre efficientemente ossigeno singoletto in seguito ad irradiazione verso un target biologico.
  5. 5. Coniugati secondo la rivendicazione 4 in cui la molecola carrier è costituita dal coniugato Avidina-Biotina.
  6. 6. Coniugati secondo la rivendicazione 2 in cui la molecola di formula (I) è derivatizzata in modo da reagire con un gruppo amminico della molecola carrier.
  7. 7. Composti di formula (I) secondo la rivendicazione 6 rappresentati dalle formule seguenti: 5-Formil-2,2':5',2" -tertiofene Acido (E)-3-(2,2':5',2"-tertien-5-il)propenoico N-idrossi succinimido estere N-(5-metil-2,2 ':5',2"-tertienil)-1-prolina-N-idrossisuccinido estere [a-TPOSu] N-metil-N-(5-metil-2,2 ':5',2 "-tertienil)glicina-N-idrossisuccinimido estere. N-raetil-(5-metil-2,2':5',2"-tertienil)gicina-N-idrossisolfosuccinimido estere.
  8. 8. Coniugati secondo la rivendicazione 2 in cui la molecola di formula (I) è derivatizzata in modo da reagire con un gruppo tiolico della molecola carrier.
  9. 9. Composti di formula (I) secondo la rivendicazione 8 rappresentati dalle formule seguenti: N-metil-N-(5-metil-2,2 ':5',2 "-tertienil)-bromo acetaraide S,S-piridil-ditio-N-metil-(5-metil-2,2 ':5 · , 2"-tertienil)-propanamide
  10. 10. Coniugati secondo la rivendicazione 2 in cui la molecola di formula (I) è derivatizzata in modo da reagire con un gruppo saccaridico della molecola carrier.
  11. 11. Composto di formula (I) secondo la rivendicazione 10 rappresentato da:
  12. 12. Coniugati secondo la rivendicazione 1 ottenuti coniugando: aTPOSu e Concanavalina A aTPOSu e Succinil-Concanavalina A aTPOSu e Avidina (a-T)-CHO e BSA aTPOSu e BSA aTPOSu e anticorpo monoclonale 225-28S (a-T)- BrAc e anticorpo scFv-cys-bromo acetamide
  13. 13. Uso dei coniugati secondo le rivendicazioni 1 per la preparazione di composizioni antibatteriche, antivirali, antifungine, antitumorali in combinazione con gli oppurtuni eccipienti farmaceuticamente accettabili.
  14. 14. Uso secondo la rivendicazione 13 in cui le composizioni sono per uso, orale, intramuscolare, topico.
  15. 15. Metodo per il trattamento di affezioni batteriche, fungine, virali, tumorali in cui si somministrano al paziente quantità terapeuticamente efficaci di prodotto attivo secondo la rivendicazione 1.
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