JP2003038200A - 腫瘍細胞の抗癌剤に対する感受性を検定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 腫瘍細胞に、E7070及びその関連化合物を作
用させた際の、該化合物の抗腫瘍効果の代理マーカーを
提供する。 【解決手段】 抗癌剤（E7070及びその関連化合物）を
投与した癌患者より取り出された腫瘍細胞を取り出し
て、第３表及び第４表に記載の遺伝子の発現量を測定す
ることにより、あるいは癌患者より取り出された腫瘍細
胞に抗癌剤を作用させ、第３表及び第４表に記載の遺伝
子の発現量を測定し、第３表に記載の遺伝子の発現量が
増加し、または第４表に記載の遺伝子の発現量が減少す
る場合に、該腫瘍細胞が該抗癌剤に対して感受性である
と判定することにより、該腫瘍細胞の該抗癌剤に対する
感受性を検定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗癌剤に対し腫瘍
細胞が感受性か否かを検定する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来の抗癌剤の臨床治験においては、ま
ず、第一相試験で毒性のプロフィールと最大推奨用量が
決められ、次いで第二相試験で腫瘍縮小率を効果判定基
準とするレスポンスレート(response rate)により薬剤
としての評価が成されてきた。一方、近年の癌生物学の
進展に伴い、細胞内情報伝達系や血管新生などを阻害す
る新しい作用機序の薬剤が、活発な研究開発の途にあ
る。これら新規抗癌剤においては必ずしも毒性用量に近
い最大推奨用量が投与される必要性がない可能性が考え
られる。さらに、腫瘍の縮小よりもむしろ腫瘍の増殖抑
制に伴うQOL（Quality of Life）の改善や延命を指標に
した方が薬剤の効果を適正に判定できるものと推測され
る。この場合、より論理的かつ具体的に薬剤の効果を確
かめるためには、腫瘍の増殖抑制メカニズムに密接に関
連する生物学的マーカーの変化を、代理（surrogate）
マーカーとして利用することが望まれる。

【０００３】一般的に、抗癌療法において、抗癌剤を投
与した際の生体の反応性は、薬剤の標的となる腫瘍細胞
の、その薬剤に対する感受性に大きく依存する。この腫
瘍細胞の薬剤に対する感受性は、腫瘍細胞毎に大きく異
なるものである。このような感受性の差は、その薬剤の
標的分子もしくはそれに関連する因子の量的もしくは質
的な差異、あるいは薬剤耐性の獲得等に起因する。この
ような背景を踏まえると、標的となる腫瘍細胞が、薬剤
に対して感受性を示す際に特異的に引き起こされる腫瘍
細胞の変化を、バイオプシ等により取得した腫瘍組織等
を用いて測定することができれば、これを代理マーカー
として、早期に薬剤の効果判定、治療法の確立、新たな
治療法の選択等が可能となり、非常に有益である。ま
た、治療に先立ってバイオプシ等により取得した腫瘍組
織より、常法に従い腫瘍細胞を分離した後薬剤処理を行
い、この腫瘍細胞が薬剤感受性であるか否かを上記代理
マーカーの変化により測定すれば、予めその薬剤による
治療が奏効するか否かを予測することが可能となり、臨
床上極めて有用である。この代理マーカーは、その変化
が抗腫瘍効果に特異的であることが重要であり、かつ高
感度に測定可能であればよい。具体的には、薬剤の抗腫
瘍効果に特異的な遺伝子発現変動の定量、それら遺伝子
発現の変化に伴うタンパク質の量的変動の解析、さらに
はその変化に伴う機能変化の解析等何れもこの代理マー
カーと成り得る。

【０００４】E7070（N-(3-chloro-7-indolyl)-1,4-benz
enedisulfonamide）は細胞周期のG1期をターゲットとし
た抗腫瘍効果を有する化合物であり、現在臨床開発中で
ある（Takashi Owa, Hiroshi Yoshino, Tatsuo Okauch
i, Kentaro Yoshimatsu, Yoichi Ozawa, Naoko Hata Su
gi, Takeshi Nagasu, Nozomu Koyanagi and KyosukeKi
toh, J. Med. Chem, 1999, 42, 3789-3799）。

【０００５】この化合物の種々の腫瘍細胞に対する細胞
増殖抑制作用の強さのスペクトルは、既存の抗癌剤の何
れとも異なり、新たな作用機序を有する抗癌剤としてそ
の効果が期待される。この薬剤の臨床開発を速やかに進
行させ臨床治療法を早期に確立するために、さらには確
立された治療法に基づき効率よく治療を進め、患者のQO
L向上に貢献するために、本薬剤投与時に特異的に使用
できる代理マーカーを発見し、応用することが望まれ
る。

【０００６】近年、種々のDNAマイクロアレイを用い、
多数の遺伝子の発現量を同時に検出する方法が確立さ
れ、幅広い目的に応用されている（Schena M, Shalon
D, Davis RW, Brown PO, Science 1995, 270, 467-70,
Lockhart, D.J., Dong, H., Byrne, M.C., Folletti
e, M.T., Gallo, M.V., Chee, M.S., Mittmann, M., Wa
ngC., Kobayashi, M., Horton, H. Brown, E.L., Natur
e Biotechnology, 1996,14, 1675-1680 ）。

【０００７】癌研究の分野においてもこのDNAマイクロ
アレイを用いた研究は盛んに行われている。例えばDNA
マイクロアレイを用いた発現解析によりびまん性大Ｂ細
胞リンパ腫(diffuse large B-cell lymphoma; DLBCL)を
解析した研究においては、DLBCLが遺伝子発現プロファ
イルの違いにより２つの異なるタイプに分類され、この
分類が予後の予測にも繋がることが示された（Alizadeh
AA, Eisen MB, DavisRE, Ma C, Lossos IS, Rosenwald
A, Boldrick JC, Sabet H, Tran T, Yu X, Powell JI,
Yang L, Marti GE, Moore T, Hudson J Jr, Lu L, Lew
is DB, Tibshirani R, Sherlock G, Chan WC, Greiner
TC, Weisenburger DD, Armitage JO, Warnke R, Staudt
LM, et al, Nature, 2000, 403, 503-11 ）。また米国
National Cancer Instituteの60種類の癌細胞株パネル
について遺伝子発現プロファイルを解析することによ
り、これら細胞株を再分類し、その特性を検討した報告
（Ross DT, Scherf U, Eisen MB, Perou CM, Rees C, S
pellman P, Iyer V, JeffreySS, Van de Rijn M, Walth
am M, Pergamenschikov A, Lee JC, Lashkari D, Shalo
n D, Myers TG, Weinstein JN, Botstein D, Brown PO,
Nat Genet, 2000, 24, 227-35 ）、さらにこの60種類
の癌細胞株パネルの遺伝子発現プロファイルと、各細胞
株の各種抗癌剤に対する感受性との間の関連について考
察した報告（Scherf U, Ross DT, Waltham M, Smith L
H, Lee JK, Tanabe L, Kohn KW, Reinhold WC, Myers T
G, Andrews DT, Scudiero DA, Eisen MB, Sausville E
A, PommierY, Botstein D, Brown PO, Weinstein JN, N
at Genet, 2000, 24, 236-44 ）等がなされている。

【０００８】また、同様にDNAマイクロアレイ（一部メ
ンブランフィルターを用いたマクロアレイ）を用いて、
腫瘍細胞に抗癌剤を作用させた際に起こる遺伝子発現変
化を検討した報告もいくつか成されている（Rhee CH, R
uan S, Chen S, Chenchik A,Levin VA, Yung AW, Fulle
r GN, Zhang W , Oncol Rep, 1999, 6, 393-401. Zimm
ermann J, Erdmann D, Lalande I, Grossenbacher R, N
oorani M, Furst P,Oncogene, 2000, 19, 2913-20. Ku
doh K, Ramanna M, Ravatn R, Elkahloun AG, Bittner
ML, Meltzer PS, Trent JM, Dalton WS, Chin KV, Canc
er Res, 2000, 4161-6 ）。これらの報告は、遺伝子発
現の変動解析が、複数の細胞集団の特性比較や、薬剤の
処理等により細胞に引き起こされる生物学的な変化を、
分子レベルで包括的に研究する目的で極めて有用である
ことを示している。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、腫瘍
細胞に、E7070及びその関連化合物を作用させた際の、
該化合物の抗腫瘍効果の代理マーカーを提供することに
ある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、E7070及
びその関連化合物を、これら抗癌剤に対し感受性である
腫瘍細胞に作用させた際に引き起こされる遺伝子発現の
変化を、DNAマイクロアレイ法により解析し、これら抗
癌剤により共通に現れる、遺伝子発現の変化を見出し
た。

【００１１】更に、それら遺伝子の中には３癌種に共通
した発現の変化を示すものがあることを見出し、これら
の遺伝子の発現変化が、E7070及びその関連化合物の抗
腫瘍効果の代理マーカーとして使用できることを見出し
て、本発明を完成させた。すなわち本発明は、以下のも
のを提供する。

【００１２】１． 1).下記一般式（Ｉ）で表される抗
癌剤を投与した癌患者より取り出された腫瘍細胞の、第
３表及び第４表に記載の遺伝子からなる群から選択され
る１個または複数の遺伝子の発現量を測定し、 2).該癌患者から抗癌剤投与前に取り出された腫瘍細胞
と比較して、第３表に記載の遺伝子の発現量が増加し、
または第４表に記載の遺伝子の発現量が減少する場合
に、該腫瘍細胞が該抗癌剤に対して感受性であると判定
する、工程を含んで成る、該腫瘍細胞の該抗癌剤に対す
る感受性を検定する方法。

【００１３】

【化３】

【００１４】（式中、Ａ環は、置換基を有していてもよ
い、単環式または二環式芳香環を、Ｂ環は、置換基を有
していてもよい、６員環式不飽和炭化水素またはヘテロ
原子として窒素原子を１個含む不飽和６員ヘテロ環を、
Ｃ環は、置換基を有していてもよい、窒素原子を１また
は２個含む５員ヘテロ環を、Ｗは単結合または−ＣＨ＝
ＣＨ−を、Ｘは−Ｎ（Ｒ¹）−または酸素原子を、Ｙは
炭素原子または窒素原子を、Ｚは−Ｎ（Ｒ²）−または
窒素原子を、Ｒ¹およびＲ²は同一または異なって水素原
子または低級アルキル基を、意味する。）

【００１５】２． 1).癌患者より取り出された腫瘍細
胞に、下記一般式（Ｉ）で表される抗癌剤を作用させ、 2).該腫瘍細胞の、第３表及び第４表に記載の遺伝子か
らなる群から選択される１個または複数の遺伝子の発現
量を測定し、 3).無処理の腫瘍細胞と比較して、第３表に記載の遺伝
子の発現量が増加し、または第４表に記載の遺伝子の発
現量が減少する場合に、該腫瘍細胞が該抗癌剤に対して
感受性であると判定する、工程を含んで成る、該腫瘍細
胞の該抗癌剤に対する感受性を検定する方法。

【００１６】

【化４】

【００１７】（式中、Ａ環は、置換基を有していてもよ
い、単環式または二環式芳香環を、Ｂ環は、置換基を有
していてもよい、６員環式不飽和炭化水素またはヘテロ
原子として窒素原子を１個含む不飽和６員ヘテロ環を、
Ｃ環は、置換基を有していてもよい、窒素原子を１また
は２個含む５員ヘテロ環を、Ｗは単結合または−ＣＨ＝
ＣＨ−を、Ｘは−Ｎ（Ｒ¹）−または酸素原子を、Ｙは
炭素原子または窒素原子を、Ｚは−Ｎ（Ｒ²）−または
窒素原子を、Ｒ¹およびＲ²は同一または異なって水素原
子または低級アルキル基を、意味する。）

【００１８】３． 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子
の転写産物であるRNAをDNAマイクロアレイにより定量す
ることにより行う、１または２に記載の方法。

【００１９】４． 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子
の転写産物であるRNAを定量的PCRにより定量することに
より行う、１または２に記載の方法。

【００２０】５． ４に記載の方法において使用するた
めの、該RNAに相補的なオリゴヌクレオチドを構成要素
として含む、RNAの定量試薬。

【００２１】６． 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子
の遺伝子産物である蛋白質を免疫化学的方法により定量
することにより行う、１または２に記載の方法。

【００２２】７． 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子
の遺伝子産物である蛋白質をELISAにより定量すること
により行う、６に記載の方法。

【００２３】８． 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子
の遺伝子産物である蛋白質をウエスタンブロットにより
定量することにより行う、６に記載の方法。

【００２４】９． ６に記載の方法において使用するた
めの、該蛋白質に対する抗体を構成要素として含む免疫
測定試薬。

【００２５】１０． Ａ環が置換基を有していてもよ
い、ベンゼンまたはピリジンであり、Ｂ環が置換基を有
していてもよいベンゼンであり、Ｃ環が置換基を有して
いてもよいピロールであり、Ｗが単結合であり、かつＸ
およびＺがいずれも−ＮＨ−である、１または２に記載
の方法。

【００２６】

【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の形態につい
て、詳細に説明する。

【００２７】本発明の検定方法は、腫瘍細胞がin vivo
またはin vitroで抗癌剤に暴露されたときの、腫瘍細胞
における特定の遺伝子の発現量の変化を、腫瘍細胞の抗
癌剤に対する感受性の指標とする点に特徴を有する。

【００２８】従って、本発明の第１の態様の検定方法
は、1).下記一般式（Ｉ）で表される抗癌剤を投与した
癌患者より取り出された腫瘍細胞の、第３表及び第４表
に記載の遺伝子からなる群から選択される１個または複
数の遺伝子の発現量を測定し、2).該癌患者から抗癌剤
投与前に取り出された腫瘍細胞と比較して、第３表に記
載の遺伝子の発現量が増加し、または第４表に記載の遺
伝子の発現量が減少する場合に、該腫瘍細胞が該抗癌剤
に対して感受性であると判定する、工程を含んで成る。

【００２９】また、本発明の第２の態様の検定方法は、
1).癌患者より取り出された腫瘍細胞に、下記一般式
（Ｉ）で表される抗癌剤を作用させ、 2).該腫瘍細胞の、第３表及び第４表に記載の遺伝子か
らなる群から選択される１個または複数の遺伝子の発現
量を測定し、 3).無処理の腫瘍細胞と比較して、第３表に記載の遺伝
子の発現量が増加し、または第４表に記載の遺伝子の発
現量が減少する場合に、該腫瘍細胞が該抗癌剤に対して
感受性であると判定する、工程を含んで成る。

【００３０】本発明における抗癌剤は、上記一般式
（Ｉ）で表されるスルホンアミド誘導体及びスルホン酸
エステル誘導体である。

【００３１】上記一般式（Ｉ）において、Ａ環の意味す
る「置換基を有していてもよい、単環式または二環式芳
香環」とは、芳香族炭化水素、または窒素原子、酸素原
子および硫黄原子のうち少なくとも１個を含む芳香族ヘ
テロ環であり、当該環上には置換基１〜３個があっても
よいものを示す。Ａ環に含まれる主な芳香環を例示する
と、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、チオフェ
ン、フラン、チアゾール、オキサゾール、ベンゼン、ピ
リジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、ナフタレ
ン、キノリン、イソキノリン、フタラジン、ナフチリジ
ン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、インドー
ル、イソインドール、インドリジン、インダゾール、ベ
ンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンズオキサゾール、
ベンズイミダゾール、ベンゾピラゾール、ベンゾチアゾ
ールなどがある。上記芳香環は置換基１〜３個を有して
いてもよく、置換基が複数個ある場合には、同一または
異なっていてもよい。置換基としては、例えば、低級ア
ルキル基または低級シクロアルキル基で置換されていて
もよいアミノ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、
水酸基、ニトロ基、メルカプト基、シアノ基、低級アル
キルチオ基、ハロゲン基、式−ａ−ｂ［式中、ａは単結
合、−（ＣＨ₂）ｋ−、−Ｏ−（ＣＨ₂）_k−、−Ｓ−
（ＣＨ₂）_k−または−Ｎ（Ｒ³）−（ＣＨ₂）_k−を、ｋ
は１〜５の整数を、Ｒ³は水素原子または低級アルキル
基を、ｂは−ＣＨ₂−ｄ（式中、ｄは低級アルキル基で
置換されていてもよいアミノ基、ハロゲン基、水酸基、
低級アルキルチオ基、シアノ基または低級アルコキシ基
を意味する）を意味する］で示される基、式−ａ−ｅ−
ｆ［式中、ａは前記と同じ意味を、ｅは−Ｓ（Ｏ）−ま
たは−Ｓ（Ｏ）₂−を、ｆは低級アルキル基または低級
アルコキシ基で置換されていてもよいアミノ基、低級ア
ルキル基、トリフルオロメチル基、−（ＣＨ₂）_m−ｂま
たは−Ｎ（Ｒ⁴）−（ＣＨ₂）_m−ｂ（式中、ｂは前記と
同じ意味を示し、Ｒ⁴は水素原子または低級アルキル基
を、ｍは１〜５の整数を意味する）を意味する］で示さ
れる基、式−ａ−ｇ−ｈ［式中、ａは前記と同じ意味を
示し、ｇは−Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｓ）−を、ｈは低
級アルキル基で置換されていてもよいアミノ基、水酸
基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、−（ＣＨ₂）_n
−ｂまたは−Ｎ（Ｒ⁵）−（ＣＨ₂）_n−ｂ（式中、ｂは
前記と同じ意味を示し、Ｒ⁵は水素原子または低級アル
キル基を、ｎは１〜５の整数を意味する）を意味する］
で示される基、式−ａ−Ｎ（Ｒ⁶）−ｇ−ｉ［式中、ａ
およびｇは前記と同じ意味を示し、Ｒ⁶は水素原子また
は低級アルキル基を、ｉは水素原子、低級アルコキシ基
またはｆ（ｆは前記と同じ意味を示す）を意味する］で
示される基、式−ａ−Ｎ（Ｒ ⁷）−ｅ−ｆ（式中、ａ、
ｅおよびｆは前記と同じ意味を示し、Ｒ⁷は水素原子ま
たは低級アルキル基を意味する）で示される基、または
式−（ＣＨ₂）_p−ｊ−（ＣＨ₂）_q−ｂ（式中、ｊは酸素
原子または硫黄原子を意味し、ｂは前記と同じ意味を示
し、ｐおよびｑは同一または異なって１〜５の整数を意
味する）で示される基などを挙げることができる。

【００３２】上記置換基例において、アミノ基が２個の
アルキル基で置換されている場合には、これらのアルキ
ル基が結合して５または６員環を形成していてもよい。
また、Ａ環が水酸基またはメルカプト基を有する含窒素
ヘテロ環である場合には、これらの基が共鳴構造をとる
ことにより、オキソ基またはチオキソ基の形になってい
てもよい。

【００３３】Ｂ環の意味する「置換基を有していてもよ
い、６員環式不飽和炭化水素またはヘテロ原子として窒
素原子を１個含む不飽和６員ヘテロ環」とは、一部が水
素化されていてもよい、ベンゼンまたはピリジンであ
り、当該環上に置換基１または２個を有していてもよ
く、置換基が２個ある場合には同一または異なっていて
もよいものを示す。

【００３４】Ｃ環の意味する「置換基を有していてもよ
い、窒素原子を１または２個含む５員ヘテロ環」とは、
一部が水素化されていてもよい、ピロール、ピラゾー
ル、イミダゾールであり、当該環上に置換基１または２
個を有していてもよく、置換基が２個ある場合には同一
または異なっていてもよいものを示す。

【００３５】Ｂ環およびＣ環が有していてもよい置換基
としては、例えば、ハロゲン基、シアノ基、低級アルキ
ル基、低級アルコキシ基、水酸基、オキソ基、式−Ｃ
（Ｏ）−ｒ（式中、ｒは水素原子、低級アルキル基で置
換されていてもよいアミノ基、低級アルキル基、低級ア
ルコキシ基または水酸基を意味する）、低級アルキル基
で置換されていてもよいアミノ基、トリフルオロメチル
基などを挙げることができる。

【００３６】上記一般式（Ｉ）において、Ｒ¹、Ｒ²なら
びにＡ環、Ｂ環およびＣ環が有していてもよい置換基の
定義中の低級アルキル基は、炭素数１〜６の直鎖もしく
は分枝状のアルキル基、例えばメチル基、エチル基、ｎ
−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブ
チル基、sec−ブチル基、tert−ブチル基、ｎ−ペンチ
ル基（アミル基）、イソペンチル基、ネオペンチル基、
tert−ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブ
チル基、１，２−ジメチルプロピル基、ｎ−ヘキシル
基、イソヘキシル基、１−メチルペンチル基、２−メチ
ルペンチル基、３−メチルペンチル基、１，１−ジメチ
ルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、２，２−ジメ
チルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジ
メチルブチル基、３，３−ジメチルブチル基、１−エチ
ルブチル基、２−エチルブチル基、１，１，２−トリメ
チルプロピル基、１，２，２−トリメチルプロピル基、
１−エチル−１−メチルプロピル基、１−エチル−２−
メチルプロピル基などを意味する。これらのうち好まし
い基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、
イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基などを挙
げることができ、これらのうち、最も好ましい基として
はメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル
基を挙げることができる。

【００３７】Ａ環が有していてもよい置換基の定義中の
低級シクロアルキル基は、炭素数３〜８のシクロアルキ
ル基を意味し、例えばシクロプロピル基、シクロペンチ
ル基、シクロヘキシル基などを挙げることができる。

【００３８】Ａ環、Ｂ環およびＣ環が有していてもよい
置換基の定義中の低級アルコキシ基とは、メトキシ基、
エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ
−ブトキシ基、イソブトキシ基、tert−ブトキシ基など
上記の低級アルキル基から誘導されるアルコキシ基を意
味するが、これらのうち最も好ましい基としてはメトキ
シ基、エトキシ基を挙げることができる。低級アルキル
チオ基は、上記の低級アルキル基から誘導されるアルキ
ルチオ基を意味する。またハロゲン原子としてはフッ素
原子、塩素原子、臭素原子などが挙げられる。

【００３９】上記一般式（Ｉ）で示されるスルホンアミ
ド誘導体またはスルホン酸エステル誘導体は酸または塩
基と塩を形成する場合もある。本発明における抗癌剤は
一般式（Ｉ）で示される化合物の塩をも包含する。酸と
の塩としては、たとえば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩
等の無機酸塩や酢酸、乳酸、コハク酸、フマル酸、マレ
イン酸、クエン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ｐ−
トルエンスルホン酸などの有機酸との塩を挙げることが
できる。また、塩基との塩としては、ナトリウム塩、カ
リウム塩、カルシウム塩などの無機塩、トリエチルアミ
ン、アルギニン、リジン等の有機塩基との塩を挙げるこ
とができる。

【００４０】また、これら化合物の水和物はもちろんの
こと光学異性体が存在する場合はそれらすべてが含まれ
ることはいうまでもない。また、本発明における抗癌剤
は強い抗腫瘍活性を示すが、生体内で酸化、還元、加水
分解、抱合などの代謝を受けて抗腫瘍活性を示す化合物
をも包含する。またさらに、本発明における抗癌剤は生
体内で酸化、還元、加水分解などの代謝を受けて一般式
（Ｉ）で示される化合物を生成する化合物をも包含す
る。

【００４１】感受性を検定する腫瘍細胞は、一般式
（Ｉ）で表される抗癌剤に対して感受性を示すものであ
れば、特に限定されない。例えば、大腸癌、肺癌、乳
癌、白血病、膵臓癌、腎臓癌、メラノーマ、悪性リンパ
腫、頭頸部癌、胃癌などに由来する腫瘍細胞が挙げられ
る。

【００４２】癌患者から取り出された腫瘍細胞は、癌患
者から摘出された癌組織に含まれる腫瘍細胞も包含され
る。

【００４３】第１の態様の検定方法の場合には、癌患者
が取り出された腫瘍細胞は、一般式（Ｉ）で表される抗
癌剤が、腫瘍細胞の感受性が測定可能となる量投与され
ている癌患者から取り出された腫瘍細胞であればよく、
通常には100〜1500 mgの用量で１〜１４日間投与された
癌患者から取り出された腫瘍細胞である。

【００４４】第２の態様の検定方法の場合には、癌患者
から取り出された腫瘍細胞に、一般式（Ｉ）で表される
抗癌剤を作用させる条件は、腫瘍細胞の感受性が測定可
能となるものであればよく、通常には、培地中0.01〜10
μMの抗癌剤濃度で、６〜７２時間の培養という条件が
挙げられる。

【００４５】遺伝子の発現量の測定は、遺伝子の転写産
物であるRNAまたは遺伝子産物である蛋白質を定量する
ことにより行うことができる。RNAまたは蛋白質の定量
は、通常には、腫瘍細胞からRNAまたは蛋白質を抽出
し、抽出物中のRNAまたは蛋白質を定量することによっ
て行うことができる。以下、１．RNAまたは蛋白質の抽
出、２．RNAの定量、３．蛋白質の定量の順に、それら
の例を詳細に説明する。

【００４６】１．RNAの抽出 1).一般式（Ｉ）で表される抗癌剤を投与された患者の
癌組織からの、RNAまたは蛋白質の抽出 一般式（Ｉ）で表される抗癌剤を投与された患者より、
バイオプシ等で摘出された癌組織から以下に述べる方法
で、RNAまたは蛋白質を抽出する。

【００４７】RNAの抽出は、一般的なRNA抽出法に従って
行えばよい。例えばTRIZOL試薬（ライフテックオリエン
タル）等を用いて、添付の操作法に従って行えばよい。
具体的には以下のとおりである。癌組織50〜100 mgに対
して1 mlのTRIZOL試薬を加え、テフロン（登録商標）ホ
モジェナイザーを用いて均一化する。これを遠心し（1
2,000 x g、10分間、4℃）、得られた上清を室温で５分
間放置後、使用したTRIZOL試薬1 mlに対して0.2 mlの割
合でクロロフォルムを添加する。この溶液を15秒間激し
く振盪、攪拌し室温で2〜3分間放置後遠心を行う（12,0
00 x g、15分間、4℃）。遠心後、水層を新しいチュー
ブに移し、使用したTRIZOL試薬1 mlに対して0.5 mlの割
合でイソプロピルアルコールを加え、室温で10分間放置
後、遠心を行う（12,000 x g、10分間、4℃）。得られ
た沈殿を75%エタノールにて洗浄した後、風乾し、全RNA
として以降の操作に供する。

【００４８】癌組織からの蛋白質の抽出は、Bollag, D.
M., Rozycki M. D., Edelstein S.J., Protein Method
s, 1996, Wiley-Liss, Inc., New York, U.S.A. Walke
r,J. M., The protein handbook, 1996, Humana Press,
New Jersey, U.S.A.等に記載の方法に従って行えばよ
い。

【００４９】2).一般式（Ｉ）で表される抗癌剤の存在
下で培養した癌細胞からの、RNAまたは蛋白質の抽出 患者よりバイオプシ等で得られた癌組織から、定法に従
い癌細胞（腫瘍細胞）を分離する。例えばHamburgerら
（Hamburger A., Salmon S. E., Kim M. B., Trent J.
M., Soehnlen B. J., Alberts D. S., and Schmidt H.
t., Cancer Res., 38, 3438-3443, 1978）に従い、得ら
れた組織を無菌的に細切し、その後ステンレスメッシ
ュ、注射針、さらにはナイロンメッシュ等を用いて細胞
の懸濁液を調製する。こうして得られた細胞を適当な培
地（例えば、10〜15%FCSを含むRPMI-1640、MEM、McCoy
培地等）に培養する。得られた癌細胞を一般式（Ｉ）で
表される抗癌剤の存在下に適当な期間、好ましくは3時
間・6時間・12時間あるいは24時間、更に好ましくは12
時間5%CO₂条件下37℃にて培養し、以下に述べる方法
で、RNAまたは蛋白質を抽出する。なお、使用するバイ
オプシ等で得られた組織中から軟寒天培養法（Hamburge
r A., and Salmon S. E., Science, 197, 461-463,197
7、Hamburger A., and Salmon S. E., J. Clin. Inves
t., 60, 846-854, 1977、Von Hoff D. D., and Johnso
n, G. E., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 20, 51, 19
79）を用いて、癌細胞のみを特異的に分離して用いるこ
とも可能である。

【００５０】癌細胞からのRNAの抽出は、癌組織からのR
NAの抽出と同様、一般的なRNA抽出法に従って行えばよ
い。例えばTRIZOL試薬（ライフテックオリエンタル）を
用いた場合、添付の操作法に従って行えばよい。具体的
には癌細胞5〜10ｘ10⁶に対して1 mlのTRIZOL試薬を加
え、以下癌組織からのRNAの抽出と同様の操作を行えば
よい。

【００５１】癌細胞からの蛋白質の抽出についても、癌
組織からの抽出と同様、成書に記載の方法に従えばよ
い。

【００５２】２．RNAの定量 RNAはノーザンブロット解析・DNAマイクロアレイ・RT-P
CR・定量的PCR等の技術により定量できる。好ましくはD
NAマイクロアレイ・定量的PCRであることが好ましい。
以下にそれぞれについて説明するが、本発明はこれによ
り限定されない。

【００５３】DNAマイクロアレイによる定量は次のよう
に行う。最初に得られたRNAを鋳型としてSuperScript C
hoice System（ライフテックオリエンタル）及びT7-d
(T)₂₄プライマーを用いて2本鎖のcDNAを合成し、続いて
そのcDNAを鋳型としてビオチン化したcRNAを合成する。

【００５４】具体的には、先ず得られたRNAよりT7-d(T)
₂₄プライマーを用いて１本鎖のDNAを合成し、次いでdNT
P・DNAリガーゼ・DNAポリメラーゼI・RNase Hを添加し
て反応後、更にT4 DNAポリメラーゼIを添加して2本鎖cD
NAを合成する。得られたcDNAを精製後、RNA Transcript
Labeling Kit（Enzo Diagnostics）を用い、ビオチン
化UTPならびにCTPを加えてラベル化反応を行う。反応生
成物を精製後、200 mMトリス酢酸 pH8.1、150 mM 酢酸
マグネシウム、50 mM 酢酸カリウム中で94℃にて35分間
加熱して、断片化したcRNAを得る。

【００５５】断片化したcRNAを、例えば100 mM MES、1
M ナトリウム塩、20 mM EDTA、0.01% Tween 20中、45℃
にて16時間、GeneChip（Affymetrix）Hu6800あるいは同
等の製品にハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ後、
GeneChipはAffymetrix fluidics stationに添付のプロ
トコールEukGE-WS2に従い洗浄・染色する。染色にはス
トレプトアビジン-フィコエリトリンとビオチン化抗ス
トレプトアビジン山羊抗体を用いる。染色後のGeneChip
をHP アルゴンイオンレーザー共焦点顕微鏡（Hewlett P
ackard）を用いてスキャンし、蛍光強度を測定する。こ
の蛍光色素の場合、測定は488 nmの励起光を用い570 nm
の蛍光を測定する。

【００５６】定量的データ解析を、好ましくはGeneChip
software（Affymetrix）を用いて行う。RNAの定量を行
うために、それぞれのプローブファミリー毎に「差
（[完全マッチハイブリダイゼーションシグナル(perfec
t match hybridization signal)] −[ミスマッチシグナ
ル(mismatch signal)]）」の平均（average differenc
e）を求め、この値が50以上であり、かつ２つの条件間
でRNAの定量値が乖離している場合、好ましくは1.8倍以
上解離している場合につき、その遺伝子の発現が有意に
「増加」あるいは「減少」したと判断する。

【００５７】第３表に記載の１個または複数の遺伝子の
RNA量が増加し、または第４表に記載の１個または複数
の遺伝子のRNA量が減少する場合に、該腫瘍細胞が該抗
癌剤に対して感受性であると判定する。

【００５８】また、定量的PCRはSYBR GreenとABI Prism
7700 Sequence Detection System（Perkin-Elmer Appl
ied Biosystems）を用い、次のように行う。

【００５９】操作は逆転写反応及びPCR反応の2段階で行
う。最初の段階である逆転写反応は、得られたRNAにdNT
P・oligo d(T)₁₆プライマー・Rnaseインヒビター・Mult
iscribe Reverse Transcriptase（Perkin-Elmer Applie
d Biosystems）を加え、25℃にて10分間保温後、48℃に
て30分間加熱することにより行う。反応を95℃ 5分間加
熱することにより停止させる。

【００６０】得られたcDNAを第2段階のPCR反応に供す
る。PCR反応は、例えば4 ng cDNA、1xSYBR PCR バッフ
ァー、3 mM MgCl₂、各200μM dATP, dCTP, dGTP、400μ
M dUTP、200 nM プライマー対、0.01 U/μl AmpErase U
NG、0.025 U/μl AmpliTaq Gold DNA Polymerase（Perk
in-Elmer Applied Biosystems）の反応系で行う。反応
条件は、例えば50℃ 2分間、95℃ 10分間に次いで95℃
20秒間・55℃ 20秒間・72℃ 30秒間を40サイクルで行
う。プライマーとプローブは、例えばPrimer Expressio
n（Perkin-Elmer Applied Biosystems）を用いて設計す
る。複数検体の比較は、定量値を各検体の転写量に変動
の少ないハウスキーピング(house keeping)遺伝子、好
ましくはGAPDHのmRNAレベルにより補正して行う。

【００６１】第３表に記載の１個または複数の遺伝子の
RNA量が増加し、または第４表に記載の１個または複数
の遺伝子のRNA量が減少する場合に、該腫瘍細胞が該抗
癌剤に対して感受性であると判定する。

【００６２】本発明は、本発明の検定方法において使用
するための、発現量を測定する対称の遺伝子の転写産物
であるRNAに相補的なオリゴヌクレオチドを構成要素と
して含む、RNAの定量試薬も提供する。構成成分となる
オリゴヌクレオチドは、定量的PCRに使用されるプライ
マー及び／またはプローブであり、上述のようにして設
計することができる。本発明のRNAの定量試薬は、上記
オリゴヌクレオチドに加えて、一般の定量試薬において
慣用的な成分を含んでいてもよい。

【００６３】３．蛋白質の定量 蛋白質は、その活性あるいは抗原性を基に定量するが、
好ましくは蛋白質一般に適用しやすい抗原性を基にした
定量、即ち免疫化学的定量が好ましい。

【００６４】蛋白質に対する抗体は、そのアミノ酸配列
よりParkerらの報告（Parker J. M.R., Guo D., Hodges
R. S., Biochemistry, 25,5425, 1986）あるいはKarpl
usらの報告（Karplus P. A., Schulz G. E., Naturwiss
enschaften, 72, 212, 1985）に基づいて抗原決定基を
予測し、ペプチドを合成し、あるいは融合蛋白例えばグ
ルタチオン合成酵素（GST）との融合蛋白を発現させて
グルタチオンカラムで精製して、抗原を作製し、得られ
た抗原を家兎・マウス等に免疫してポリクローナル、好
ましくはモノクローナル抗体（Harlow E., Lane D., An
tibodies: ALaboratory Manual, 1988, Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press, New York）を作製することが
できる。また、市販の抗体が利用可能な場合は、特異性
を確かめた上で使うことも許される。

【００６５】得られた抗体を用い、例えば酵素免疫測定
法（石川栄治他、医学書院、1982）またはEnzyme Immun
oassay（Ishikawa E., Kawai T., Miyai, K., Igaku-Sh
oin,Tokyo New York, 1981）に記載の方法によりELISA
あるいはRIAを行い蛋白質を定量する。蛋白質が腫瘍細
胞外に分泌されるものである場合には、腫瘍細胞から蛋
白質を抽出をすることなく培地中の蛋白質を定量するこ
とが可能である。

【００６６】第３表に記載の１個または複数の遺伝子の
蛋白質量が増加し、あるいは第４表に記載の１個または
複数の遺伝子の蛋白質量が減少する場合に、該腫瘍細胞
が該抗癌剤に対して感受性であると判定する。

【００６７】本発明は、本発明の検定方法において使用
するための、該蛋白質に対する抗体を構成要素として含
む免疫測定試薬も提供する。構成成分となる抗体は、上
述のようにして得ることができる。本発明の免疫測定試
薬は、上記抗体に加えて、一般の免疫測定試薬において
慣用的な成分を含んでいてもよい。

【００６８】

【実施例】以下に、具体的な例をもって本発明を示す
が、本発明はこれに限られるものではない。

【００６９】

【実施例１】 E7070感受性株及び耐性株の培養とRNAの
抽出 全ての細胞は10%の胎児牛血清、100 units/mlのペニシ
リン、100 mg/mlのストレプトマイシンを添加したRPMI-
1640培地を用いて5%CO₂条件下37℃にて培養した。

【００７０】E7070 または下記に構造式を示すER-35748
もしくはER-68487をE7070感受性株HCT116-C9及びE7070
耐性株HCT116-C9-C1の培地に8μMの濃度で添加して培養
し、0, 3, 6, 12時間後の細胞を回収した。また、薬剤
を加えずに12時間培養した細胞も同様に回収した。

【００７１】

【化５】

【００７２】これらの細胞より全RNAを抽出しその後の
解析に供した。薬剤添加12時間後の細胞から抽出したRN
Aならびに薬剤を添加せずに12時間培養した細胞から抽
出したRNAを実施例２に示すDNAマイクロアレイによる遺
伝子発現解析に用いた。なお、HCT116-C9はヒト大腸癌
由来HCT116（American Type Culture Collection, Mana
ssas, VA, U.S.A.）から分離した亜株であり、このHCT1
16-C9をE7070存在下培養、E7070濃度を漸次的に上昇さ
せることにより得たE7070耐性亜株がHCT116-C9-C1であ
る。

【００７３】同様にE7070をE7070感受性株LX-1及びE707
0耐性株LX-1-E2の培地に8μMの濃度で添加して培養し、
0, 3, 6, 12時間後の細胞を回収した。これらの細胞よ
り全RNAを抽出しその後の解析に供した。なお、LX-1（C
ancer Chemotherapy Center,Japan Foundation for Can
cer Research, Tokyo, Japan）はヒト小細胞性肺癌由来
の細胞株であり、このLX-1をE7070存在下培養、E7070濃
度を漸次的に上昇させることにより得たE7070耐性亜株
がLX-1-E2である。

【００７４】使用した細胞株HCT116-C9、HCT116-C9-C
1、LX-1、LX-1-E2にE7070を添加し72時間培養し、MTT法
（Mosmann T., J. Immunol. Methods, 65, 55, 1983）
により測定した細胞増殖抑制曲線を図１に示す。実際の
操作はCellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferat
ion Assay（Promega, Madison, WI）を用いて、添付の
操作法に従って行った。

【００７５】回収した細胞からの全RNAの抽出は、TRIZO
L試薬（ライフテックオリエンタル）を用いて添付の操
作法に従って行った。

【００７６】

【実施例２】 DNAマイクロアレイによる遺伝子発現解
析 1).cDNA合成とビオチン標識 実施例１で得られたRNAを100μlのジエチルピロカーボ
ネート（DEPC）処理をした滅菌水に溶解し、さらにRNea
syカラム（QIAGEN）を用いて精製し、SuperScript Choi
ce System（ライフテックオリエンタル）及びT7-d(T)₂₄
プライマーを用いて2本鎖のcDNAを合成した。

【００７７】まず10μgのRNAに5μMのT7-d(T)₂₄プライ
マー、1x First strand buffer、10mM DTT、500μMのdN
TP mix、20 units/μlのSuperScript II Reverse Trans
criptaseを加え、42℃にて1時間反応させ1本鎖DNAを合
成した。続いて1x Second strand buffer、200μMのdNT
P mix、67 U/ml DNA ligase、270 U/ml DNAポリメラー
ゼI、13 U/ml RNase Hを添加して16℃にて2時間反応さ
せ2本鎖cDNAを合成した。さらに67 U/ml T4 DNAポリメ
ラーゼIを添加して16℃にて5分間反応させたのち、10μ
lの0.5 M EDTAを加え反応を停止した。

【００７８】得られたcDNAをフェノール/クロロフォル
ムにて精製し、RNA Transcript Labeling Kit（Enzo Di
agnostics）を用い、添付の操作法に従って、ビオチン
化UTPならびにCTPによるラベル化反応を行った。反応生
成物をRneasyカラムにて精製後、200 mM トリス酢酸 pH
8.1、150 mM 酢酸マグネシウム、50 mM 酢酸カリウム中
で94℃にて35分間加熱してcRNAを断片化した。

【００７９】2).DNAマイクロアレイ（GeneChip）へのハ
イブリダイズと測定 断片化したcRNAを、100 mM MES、1 M ナトリウム塩、20
mM EDTA、0.01% Tween 20中、45℃にて16時間、GeneCh
ip（Affymetrix）Hu6800にハイブリダイズさせた。ハイ
ブリダイズ後、GeneChipはAffymetrix fluidics statio
nに添付のプロトコールEukGE-WS2に従い洗浄・染色し
た。染色にはストレプトアビジン-フィコエリトリンと
ビオチン化抗ストレプトアビジン山羊抗体を用いた。染
色後のGeneChipをHP アルゴンイオンレーザー共焦点顕
微鏡（Hewlett Packard）を用いてスキャンし、蛍光強
度を測定した。測定は、488 nmの励起光を用い570 nmの
蛍光で行った。

【００８０】定量的データ解析は全てGeneChip softwar
e（Affymetrix）を用いて行った。RNAの定量を行うため
に、それぞれのプローブファミリー毎に「差（[完全マ
ッチハイブリダイゼーションシグナル(perfect match h
ybridization signal)] −[ミスマッチシグナル(mismat
ch signal)]）」の平均（average difference）を求
め、この値が50以上であり、かつ２つの条件間でRNAの
定量値が乖離している場合、好ましくは1.8倍以上解離
している場合につき、その遺伝子の発現が有意に「増
加」あるいは「減少」したと判断した。

【００８１】E7070 またはER-35748、ER-68487をHCT116
-C9の培地に8μMの濃度で添加して培養し、12時間後に
細胞から抽出したRNAのGeneChipによる解析結果を、薬
剤を加えないで同様の操作により得たHCT116-C9細胞のR
NA解析結果と比較した。この結果、E7070 、ER-35748、
ER-68487の３種の薬剤の処理により、共通してその発現
が上昇した遺伝子のリスト（GenBankの登録番号もあわ
せて示す(以下の表において同じ)）を第１表に、同様に
３種の薬剤の処理により共通してその発現が減少した遺
伝子のリストを第２表に示す。

【００８２】

【表１】

【００８３】

【表２】

【００８４】

【表３】

【００８５】

【表４】

【００８６】

【表５】

【００８７】

【表６】

【００８８】第１表及び第２表に示した遺伝子に関し、
E7070耐性株２株（C9-C1及びC9-C1と同様の方法により
得られた別の耐性株(C9-C4)）を用い、上記と同様に、8
μMのE7070で12時間処理した後に、遺伝子の変動をGen
eChipにより解析した。この結果、１．８倍以上発現が
増加または減少する遺伝子は両株において認められなか
った。

【００８９】以上の結果から、これら3種の抗癌剤の処
理により共通に変動する遺伝子は、単独または組み合わ
せでその変化を測定することによりE7070及びその関連
化合物の抗腫瘍効果の代理マーカーとして使用できるこ
とが明らかである。

【００９０】

【実施例３】 定量的PCRによる遺伝子発現解析 実施例２で得られた遺伝子の発現変動が、腫瘍細胞のE7
070に対する感受性を反映したものであることを確認す
る目的で、実施例１に示したRNAを用いて、E7070感受性
細胞と耐性細胞におけるこれら遺伝子発現の変化をSYBR
GreenとABI Prism 7700 Sequence Detection System
（Perkin-Elmer Applied Biosystems）を用いた定量的P
CRにより検討した。

【００９１】操作は逆転写反応及びPCR反応の2段階で行
った。最初の段階である逆転写反応は、1μgの全RNAに1
x TaqMan RT buffer、5.5 mM MgCl₂、500μMのdNTP mi
x、2.5 μM oligo d(T)₁₆プライマー、0.4 U/μl RNase
Inhibitor、1.25 U/μl Multiscribe Reverse Transcr
iptase（Perkin-Elmer Applied Biosystems）を加え、2
5℃にて10分間保温後、48℃にて30分間加熱することに
より行った。反応を95℃5分間加熱することにより停止
させた。

【００９２】得られたcDNAを第2段階のPCR反応に供し
た。PCR反応は4 ng cDNA、1xSYBR PCRバッファー、3 mM
MgCl₂、各200μM dATP, dCTP, dGTP、400μM dUTP、20
0 nMプライマー対、0.01 U/μl AmpErase UNG、0.025 U
/μl AmpliTaq Gold DNA Polymerase（Perkin-Elmer Ap
plied Biosystems）の反応系で行った。反応条件は50℃
2分間、95℃ 10分間に次いで95℃ 20秒間・55℃ 20秒
間・72℃ 30秒間を40サイクルで行った。プライマーはG
APDHは配列番号１及び２、S80343は配列番号３及び４、
U07919は配列番号５及び６、U11791は配列番号７及び
８、M95809は配列番号９及び１０、U18291は配列番号１
１及び１２、U63743は配列番号１３及び１４、M61764は
配列番号１５及び１６に示す塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドを用いた。

【００９３】各検体中のmRNA量は蛍光強度を測定するこ
とにより定量した。なお、複数検体の比較においては、
定量値を各検体のGAPDHのmRNA量により補正して行っ
た。薬剤処理0時間における定量値をコントロール（100
%）として、薬剤処理時間と各mRNA量の関係を示したも
のが図２〜図５である。各遺伝子は感受性が最も高いHC
T116-C9で最大の発現変動を示し（図２）、感受性株LX-
1ではHCT116-C9よりは変動の幅は小さいものの、S80343
を除く全ての遺伝子で発現変動を示した（図３）。これ
に対し耐性株HCT116-C9-C1では、全く発現変動が認めら
れず（図４）、実験に用いた8μMの薬剤濃度で多少の増
殖抑制の効果が認められる耐性株LX-1-E2では、U11791
が発現変動を示しM95809およびU18291に僅かな発現変動
が認められた（図５）。

【００９４】実施例２で示された遺伝子の発現変動はE7
070に対する感受性と相関しており、実施例２で示され
た遺伝子は、単独または組み合わせでその変化を測定す
ることによりE7070及びその関連化合物の抗腫瘍効果の
代理マーカーとして使用できることが確認された。

【００９５】

【実施例４】 ELISAによる解析 実施例２の第２表に示した遺伝子のうち、細胞外に分泌
されることが報告されているX51956（Human ENO2 gene
for neuron specific (gamma) enolase）について既に
報告されているELISA法（Duncan M. E., McAleese S.
M., Booth N. A., Melvin W. T., and Fothergill J.
E., J. of Immunol. Methods, 151, 227-236, 1992、Ya
maguchi K., Aoyagi K., Urakami K., Fukutani T., Ma
ki N., Yamamoto S., Otsubo K., Miyake Y., and Koda
ma T., Jpn. J. Cancer Res., 86,698-705, 1995）によ
りその発現レベルを検討した。実際の測定には栄研化学
（東京）のNSE ELISA kitを用い、操作は添付の資料に
従った。

【００９６】

【実施例５】 ３癌種における遺伝子発現解析 HCT116-C9（ヒト大腸癌細胞株）、MDA-MB-435（ヒト乳
癌細胞株）及びMOLT-4（ヒトＴリンパ芽球系白血病細胞
株）の三癌種について、実施例２と同様にして、E7070
（8 μMで12 h処理）による遺伝子発現変化をGene Chip
を用いて調べた。

【００９７】三癌種で共通して1.8培以上発現が亢進さ
れる遺伝子のリストを第３表に示す。また、三癌種で共
通して1.8培以上発現が抑制される遺伝子のリストを第
４表に示す。遺伝的背景の全く異なる癌患者から樹立さ
れたこれら三癌種で共通して発現が変動（亢進または減
少）する遺伝子は、腫瘍細胞に共通するE7070の抗腫瘍
作用メカニズムにより深く関係している可能性が高いの
で、腫瘍細胞のE7070及びその関連化合物に対する感受
性を検定する際に有効なマーカーになり得ると考えられ
る。

【００９８】

【表７】

【００９９】

【表８】

【０１００】

【表９】

【０１０１】

【表１０】

【０１０２】

【発明の効果】本発明により、一般式（Ｉ）で表される
抗癌剤を投与した癌患者より取り出された腫瘍細胞の、
第３表及び第４表に記載の遺伝子の発現量を測定するこ
とにより、あるいは癌患者より取り出された腫瘍細胞に
一般式（Ｉ）で表される抗癌剤を作用させ、第３表及び
第４表に記載の遺伝子の発現量を測定することにより、
該腫瘍細胞の該抗癌剤に対する感受性を調べることが可
能となる。

【０１０３】

【配列表】 <110> エーザイ株式会社(Eisai Co., Ltd.) <120> 腫瘍細胞の抗癌剤に対する感受性を検定する方法 <130> P-9401 <150> JP 2000-357398 <151> 2000-11-24 <160> 16 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gaaggtgaag gtcggagtc 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gaagatggtg atgggatttc 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gcattttacg gttccctgag at 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gatacgccac atgttcacct tc 22 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cagaatcaat agcccagaga gctt 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gttgtggcgt tagaagattg gatc 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gtcattctgc tgagcttgca ctta 24 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gagagattct accaggtcgt catca 25 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ccaagttacg aagctctgtc cat 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tgtaggctgt ctggagcatc tct 23 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tgttgattcc tcagaacgca tc 22 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tgtatcatct cgcctaagac caag 24 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 atctcaccag gcataagctc ct 22 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 acagttcctc ctcttccttg gat 23 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ctcaagaggc tgacgcagaa t 21 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ctggctgaca tgatggtaga cac 23

【図面の簡単な説明】

【図１】 細胞株HCT116-C9、HCT116-C9-C1、LX-1、LX-
1-E2のE7070による細胞増殖抑制曲線を示す。

【図２】 E7070感受性株HCT116-C9における遺伝子発現
変動の定量的PCRによる解析の結果を示す。

【図３】 E7070感受性株LX-1における遺伝子発現変動
の定量的PCRによる解析の結果を示す。

【図４】 E7070耐性株HCT116-C9-C1における遺伝子発
現変動の定量的PCRによる解析の結果を示す。

【図５】 E7070耐性株LX-1-E2における遺伝子発現変動
の定量的PCRによる解析の結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 河合 隆利 茨城県つくば市東２−11−33 (72)発明者 加藤 弘之 茨城県北相馬郡守谷町御所ヶ丘５−25−41 (72)発明者 長洲 毅志 茨城県土浦市永国852−13 Ｆターム(参考） 4B024 AA12 CA09 HA14 4B063 QA07 QA19 QQ08 QQ43 QQ52 QR32 QR35 QR55 QR62 QR77 QR84 QS25 QS34 QX02

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 1).下記一般式（Ｉ）で表される抗癌剤
   を投与した癌患者より取り出された腫瘍細胞の、第３表
   及び第４表に記載の遺伝子からなる群から選択される１
   個または複数の遺伝子の発現量を測定し、 2).該癌患者から抗癌剤投与前に取り出された腫瘍細胞
   と比較して、第３表に記載の遺伝子の発現量が増加し、
   または第４表に記載の遺伝子の発現量が減少する場合
   に、該腫瘍細胞が該抗癌剤に対して感受性であると判定
   する、工程を含んで成る、該腫瘍細胞の該抗癌剤に対す
   る感受性を検定する方法。 【化１】 （式中、Ａ環は、置換基を有していてもよい、単環式ま
   たは二環式芳香環を、Ｂ環は、置換基を有していてもよ
   い、６員環式不飽和炭化水素またはヘテロ原子として窒
   素原子を１個含む不飽和６員ヘテロ環を、Ｃ環は、置換
   基を有していてもよい、窒素原子を１または２個含む５
   員ヘテロ環を、Ｗは単結合または−ＣＨ＝ＣＨ−を、Ｘ
   は−Ｎ（Ｒ¹）−または酸素原子を、Ｙは炭素原子また
   は窒素原子を、Ｚは−Ｎ（Ｒ²）−または窒素原子を、
   Ｒ¹およびＲ²は同一または異なって水素原子または低級
   アルキル基を、意味する。）
2. 【請求項２】 1).癌患者より取り出された腫瘍細胞
   に、下記一般式（Ｉ）で表される抗癌剤を作用させ、 2).該腫瘍細胞の、第３表及び第４表に記載の遺伝子か
   らなる群から選択される１個または複数の遺伝子の発現
   量を測定し、 3).無処理の腫瘍細胞と比較して、第３表に記載の遺伝
   子の発現量が増加し、または第４表に記載の遺伝子の発
   現量が減少する場合に、該腫瘍細胞が該抗癌剤に対して
   感受性であると判定する、工程を含んで成る、該腫瘍細
   胞の該抗癌剤に対する感受性を検定する方法。 【化２】 （式中、Ａ環は、置換基を有していてもよい、単環式ま
   たは二環式芳香環を、Ｂ環は、置換基を有していてもよ
   い、６員環式不飽和炭化水素またはヘテロ原子として窒
   素原子を１個含む不飽和６員ヘテロ環を、Ｃ環は、置換
   基を有していてもよい、窒素原子を１または２個含む５
   員ヘテロ環を、Ｗは単結合または−ＣＨ＝ＣＨ−を、Ｘ
   は−Ｎ（Ｒ¹）−または酸素原子を、Ｙは炭素原子また
   は窒素原子を、Ｚは−Ｎ（Ｒ²）−または窒素原子を、
   Ｒ¹およびＲ²は同一または異なって水素原子または低級
   アルキル基を、意味する。）
3. 【請求項３】 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転
   写産物であるRNAをDNAマイクロアレイにより定量するこ
   とにより行う、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転
   写産物であるRNAを定量的PCRにより定量することにより
   行う、請求項１または請求項２に記載の方法。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の方法において使用する
   ための、該RNAに相補的なオリゴヌクレオチドを構成要
   素として含む、RNAの定量試薬。
6. 【請求項６】 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の遺
   伝子産物である蛋白質を免疫化学的方法により定量する
   ことにより行う、請求項１または請求項２に記載の方
   法。
7. 【請求項７】 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の遺
   伝子産物である蛋白質をELISAにより定量することによ
   り行う、請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の遺
   伝子産物である蛋白質をウエスタンブロットにより定量
   することにより行う、請求項６に記載の方法。
9. 【請求項９】 請求項６に記載の方法において使用する
   ための、該蛋白質に対する抗体を構成要素として含む免
   疫測定試薬。
10. 【請求項１０】 Ａ環が置換基を有していてもよい、ベ
    ンゼンまたはピリジンであり、Ｂ環が置換基を有してい
    てもよいベンゼンであり、Ｃ環が置換基を有していても
    よいピロールであり、Ｗが単結合であり、かつＸおよび
    Ｚがいずれも−ＮＨ−である、請求項１または請求項２
    に記載の方法。