CN119120701A - 一种用于诊断或治疗的piRNA-362733生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于诊断或治疗的piRNA‑362733生物标志物及其应用。该新型分子与结直肠癌有关，qPCR验证在人结直肠癌组织和细胞中高表达，该piRNA分子在以往对于结直肠癌、其他类型肿瘤及非肿瘤的研究中均尚未被发现，体外实验显示piRNA‑362733抑制剂(inhibitor)能够抑制结直肠癌细胞增殖、侵袭及迁移，因此piRNA‑362733有望成为预测人结直肠癌侵袭转移的生物标志物和改善预后的潜在分子治疗靶点。

Description

一种用于诊断或治疗的piRNA-362733生物标志物及其应用

技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及一种新的肿瘤标志物piRNA-362733及其在预测、诊断及治疗结直肠癌侵袭转移中的应用。

背景技术：

结直肠癌(CRC)是世界上第三大最常见的癌症和第二大癌症相关死亡原因，结直肠癌早期缺乏特异性症状和有效的筛查手段，大多数患者在确诊时多为晚期，远处转移严重影响患者预后。目前，除了手术切除与化疗，其他治疗方式效果较差。因此，目前寻找优化的标志物与治疗方式已经成为临床迫切的需求。具有改善早期诊断的研究寥寥无几，所以筛选出用于早期诊断与预后判断的新型小分子靶标具有重要意义。

近年来，一类新型的非编码小RNA-Piwi相互作用RNA(Piwi-interacting RNA，piRNA)被进一步深入研究。piRNA的长度一般为24～33核苷酸(nuclotide，nt)，可以特异性地与Piwi蛋白相结合而发挥作用。由于编码piRNA的基因几乎遍布整个基因组，所以piRNA在生命起源早期就已经存在并且在物种的自然选择进化中被保留。自piRNA发现以来，对其研究进展迅速，已发现其在生殖干细胞分化、胚胎发育、维持DNA完整性、表观遗传学调控和物种的性别决定等方面有重要作用。越来越多的证据表明，piRNA在多种肿瘤中均有异常的表达，对癌症的早期诊断和治疗具有非常重要的意义。

发明内容：

为了实现结直肠癌的早期诊断及靶向治疗，本发明的第一个目的是筛选一种对结直肠癌侵袭转移进行预测、诊断及治疗的piRNA。本发明的第二个方面的目的是提供标志物piRNA抑制剂在制备结直肠癌治疗制剂中的应用，尤其是制备抑制人结直肠癌细胞侵袭转移制剂中的应用。本发明第三个方面的目的是提供标志物piRNA抑制剂作为结直肠癌治疗药物。本发明第四个方面的目的是提供检测所述的piRNA-362733的试剂在制备结直肠癌诊断和/或预后制剂中的应用。

为实现第一个目的，本发明提供了结直肠癌组织中显著高表达piRNA，所述标志物为piRNA-362733，其核酸序列：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCAACA

本发明第二个方面的目的是提供抑制所述的piRNA-362733表达的试剂在制备结直肠癌治疗制剂中的应用。尤其是能够降低结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移的制剂。

本发明第三个方面的目的是提供一种治疗结直肠癌的制剂，为抑制piRNA-362733表达的试剂，优选：所述piRNA-362733抑制剂序列为TTCAACATCAGTCTGATAAGCTACC。

本发明第四个方面的目的是提供检测所述的piRNA-362733的试剂在制备结直肠癌诊断和/或预后制剂中的应用。

进一步地，结直肠癌诊断和/或预后制剂包括PCR检测试剂，PCR检测试剂的引物序列如下：

F:5'-GTAGCTTATCAGACTGATGTTG-3'

R:5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；

β-actin内参引物序列如下

F：5'-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3'

R：5'-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3'。

本发明通过实时定量PCR扩大样本验证，确定了piRNA-362733在结直肠癌组织和细胞中高表达，该piRNA分子在以往对于结直肠癌、其他类型肿瘤及非肿瘤的研究中均尚未被发现，因此具有较好的创新性。细胞实验也进一步验证了piRNA-362733在结直肠癌细胞株中的作用机制，piRNA-362733抑制剂能抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移。

本发明验证了piRNA-362733在结直肠癌组织和细胞中表达上调，具有统计学意义，试验过程严谨，结果真实可靠。

本发明提供的piRNA-362733抑制剂可以作为结直肠癌靶向治疗试剂，为提高结直肠癌的治疗疗效提供可靠的产品。

本发明在验证过程中，首先在结直肠癌组织筛选出了高表达的piRNA-362733，piRNA-362733抑制剂可有效下调结直肠癌细胞中piRNA-362733的表达，此外，piRNA-362733抑制剂可以抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移。

本发明通过对临床组织样本(n＝60)进行检测发现piRNA-362733在结直肠癌组织中高表达。使用piRNA-362733抑制剂可以抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移。本发明为肿瘤诊断和治疗提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

以下结合附图和具体实施方式进一步详细说明本发明，而不会形成对本发明的限制。

附图说明：

图1A为3对结直肠癌组织与相应正常组织的差异piRNA表达分析，对差异表达的piRNA进行聚类热图分析；图1B为差异表达的piRNA火山图分析。

图2A为piRNA-362733在结直肠癌组织和正常组织中的表达分析；图2B为piRNA-362733在结直肠癌细胞(SW480和HCT116)中的表达水平；图2C为piRNA-NC和piRNA-inhibitor转染结直肠癌细胞(SW480和HCT116)后piRNA-362733的表达水平。(两组之间采用独立样本的t检验进行统计分析，**代表p<0.01，***代表p<0.001)。

图3为ROC曲线评价piRNA-362733用于结直肠癌诊断的敏感性和特异性结果。AUC值为0.762；敏感度为0.875；特意度为0.649。

图4为使用piRNA-362733抑制剂后抑制结直肠癌细胞HCT116的增殖、侵袭和迁移；图4A为piRNA-NC和piRNA-inhibitor转染HCT116细胞系后细胞增殖情况；图4B为piRNA-362733抑制剂对HCT116细胞克隆形成能力的影响；图4C为piRNA-362733抑制剂对HCT116细胞侵袭和迁移能力的影响。(两组之间采用独立样本的t检验进行统计分析，**代表p<0.01)。

具体实施方式：

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

病人样本的收集

收集原发性结直肠癌患者正常组织60例和癌组织60例，标本来自贵州省人民医院2019年-2023年住院进行手术的患者。所有病历及标本的收集均已获得病人或家属的知情同意并签署相关知情同意书，通过贵州省人民医院伦理委员会审查。选取原发性结直肠癌组织和正常组织标本提取组织RNA。

实施例1：RNA-Seq测序筛选差异表达的piRNA

对结直肠癌组织进行RNA-Seq测序，筛选差异表达的piRNA。这部分实验内容由上海康成生物工程有限公司完成，具体步骤如下：首先，总RNA样本经过预处理RNA后合成cDNA，混合Arraystar Green qPCR Master Mix与cDNA模板，上样至孔板中，通过实时荧光定量PCR设备ABI7900 qPCR进行扩增。基于差异表达倍数(foldchange)≥2且p值<0.05筛选显著表达异常的piRNA。

RNA-seq结果分析

从3对结直肠癌和正常组织中获得的总RNA进行了RNA测序。基于失调piRNA的差异表达水平(|fold change|≥2且p值<0.05，绘制了piRNA差异表达的热图和火山图(图1)。我们选择了结直肠癌组织中高表达最显著的piRNA-362733进行qPCR验证。

实施例2：qPCR检测piRNA-362733在结直肠癌组织和细胞中的表达情况

组织及细胞系总RNA的提取与反转录

利用RNA提取试剂盒提取组织或细胞中的RNA，利用Nano Drop测定RNA浓度后，利用反转录试剂盒将其反转为cDNA。合成的cDNA直接进行下游荧光定量检测或放置于–20℃保存。

qRT-PCR实验步骤及反应程序

(1)反应体系如下：

qRT-PCR实验体系

(2)反应程序如下：

qRT-PCR反应程序

(3)导出反应结果，计算目的基因和参照基因的Ct值、ΔCt值和2^-ΔΔCt值，其具体计算方法如下所述：

Ct值由ABI 7500Manager软件计算给出；ΔCt₁＝实验组待检测的基因Ct-实验组参照基因Ct；ΔCt₂＝Control组待检测的基因Ct-Control组参照基因Ct；ΔΔCt＝ΔCt₁-ΔCt₂；2^-ΔΔCt通过公式计算得出。

piRNA-362733在结直肠癌组织中高表达。此外，相比于正常肠上皮细胞NCM460，piRNA-362733在结直肠细胞(SW460和HCT116)中显著高表达。使用piRNA-362733抑制剂后能降低结直肠细胞SW460和HCT116)的表达(图2A-C)。

实施例3：使用piRNA-362733抑制剂后对结直肠癌细胞的抑制效果

1.piRNA-362733抑制剂的选择

基于piRNA-362733的序列，设计特异性piRNA-362733抑制剂(上海生工生物公司)。其序列：TTCAACATCAGTCTGATAAGCTACC。

2.piRNA-362733抑制剂转染

结直肠癌细胞系SW480和HCT116细胞置于24孔板中，利用lipo3000转染试剂(购自Thermo fisher公司)转染细胞，每孔加入25pmol的piRNA-362733抑制剂，72小时后提取细胞RNA，通过实时荧光定量PCR检测piRNA-362733的表达。

3.CCK-8检测细胞增殖

将结直肠癌细胞HCT116悬浮在96孔板的孔洞里，每个孔里加入100μL，设置3个复孔；置入5％ CO2、37℃培养箱里中培养，直到铺满整个孔底；每个孔中加入10μL CCK-8溶液,轻轻击打培养板使细胞与溶液混匀，细胞培养箱中孵育4h。使用酶标仪在450nm可见光上计算吸收值(注意在结果中需要减去具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光值)，分析各组细胞的吸光度值。

4.平板克隆形成能力实验

将各组生长状态良好的结直肠癌细胞HCT116经胰蛋白酶消化后收集，用完全培养基重悬细胞沉淀成单细胞悬液，将细胞悬液梯度稀释后，按预实验摸索的最佳条件接种细胞数到六孔板内，铺好细胞的六孔板置于37℃、5％CO2及95％湿度下的环境中继续培养，静置培养2周，当观察到肉眼可见的细胞克隆团时，考虑终止细胞培养。将已形成细胞克隆的六孔板从培养箱内取出后，PBS轻柔地清洗细胞2次，使用甲醇液固定15分钟，并在室温内晾干后，加入吉姆萨染色剂染色细胞30分钟后，并在室温内空气干燥。计算公式：克隆形成率＝克隆数/接种细胞数×100％。

5.Transwell实验

将piRNA-NC或piRNA-inhibitor分别转染至结直肠癌细胞HCT116 48h，取250μL 2×10⁵细胞重悬液(不含FBS的培养基)加入Transwell小室的上室，下室加入含10％ FBS的培养基。37℃，5％ CO₂敷育24h，刮去上室细胞，PBS冲洗2次。用4％多聚甲醛固定细胞10min，弃甲醛，PBS冲洗两次。显微镜下观察并进行细胞计数,进行统计分析。

实验结果发现，piRNA-362733抑制剂可以显著抑制结直肠癌细胞HCT116的增殖、侵袭和迁移(图4)。结果提示piRNA-362733抑制剂对结直肠癌细胞有抑制的作用。

Claims (10)

1.piRNA-362733生物标记物在制备和/或筛选结直肠癌治疗药物中的应用，所述的piRNA-362733核酸序列为：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCAACA。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的结直肠癌治疗药物包括抑制piRNA-362733表达水平的制剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抑制piRNA-362733表达水平的制剂包括：piRNA-362733抑制剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述piRNA-362733抑制剂序列为TTCAACATCAGTCTGATAAGCTACC。

5.一种用于诊断或治疗的piRNA-362733生物标志物，其特征在于，核苷酸序列为GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCAACA。

6.结直肠癌治疗药物，其特征在于，包括抑制piRNA-362733表达水平的制剂。

7.根据权利要求6所述的结直肠癌治疗药物，其特征在于，所述的抑制piRNA-362733表达水平的制剂为piRNA-362733抑制剂，优选所述抑制剂序列为：TTCAACATCAGTCTGATAAGCTACC。

8.检测权利要求1所述的piRNA-362733的试剂在制备结直肠癌诊断和/或预后制剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，检测所述的piRNA-362733的试剂包括检测piRNA-362733表达量的试剂。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，检测piRNA-362733表达量的试剂包括PCR试剂，优选PCR引物序列为：

F:5'-GTAGCTTATCAGACTGATGTTG-3'

R:5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。