JP2001518300A - Ｈｉｖ−１ｔａｔ及び／又はｎｅｆタンパク質を含んで成る融合タンパク質 - Google Patents
Ｈｉｖ−１ｔａｔ及び／又はｎｅｆタンパク質を含んで成る融合タンパク質Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、（ａ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体；又は（ｂ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｎｅｔタンパク質もしくはその誘導体；又は（ｃ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体及び融合パートナーに連結されたＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体；を提供する。本発明は更にかかるタンパク質をコードする核酸、及びかかる核酸で形質転換された宿主細胞、例えばピチア・パストリスを提供する。
Description
【０００１】 本発明は新規のＨＩＶタンパク質構築体、医薬におけるその利用、それを含む
医薬組成物、及びその製造の方法に関する。
医薬組成物、及びその製造の方法に関する。
【０００２】 詳しくは、本発明はＨＩＶ−１ Ｔａｔ及び／又はＮｅｆタンパク質を含んで
成る融合タンパク質に関する。
成る融合タンパク質に関する。
【０００３】 ＨＩＶ−１は世界中の大きな健康問題の一つとして認識されている後天的免疫
不全症候群（ＡＩＤＳ）の主たる原因である。世界中で多大な研究がワクチンの
製造に費やされているが、かかる努力は今のところ成功を収めていない。
不全症候群（ＡＩＤＳ）の主たる原因である。世界中で多大な研究がワクチンの
製造に費やされているが、かかる努力は今のところ成功を収めていない。
【０００４】 ＨＩＶ−１の非エンベロープタンパク質が発表されており、それには例えば内
部構造タンパク質、例えばｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子、並びにその他の非構造タン
パク質、例えばＲｅｖ，Ｎｅｆ，Ｖｉｆ及びＴａｔが挙げられる（Greeneら、Ne
w England J.Med, 324, 5, 308以降、及びBryantら（Ed. Pizzo), Pediatr.Infe
ct.Dis.J., 11, 5, 390 以降（1992）。
部構造タンパク質、例えばｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子、並びにその他の非構造タン
パク質、例えばＲｅｖ，Ｎｅｆ，Ｖｉｆ及びＴａｔが挙げられる（Greeneら、Ne
w England J.Med, 324, 5, 308以降、及びBryantら（Ed. Pizzo), Pediatr.Infe
ct.Dis.J., 11, 5, 390 以降（1992）。
【０００５】 ＨＩＶ Ｎｅｆ及びＴａｔタンパク質は早期タンパク質であり、即ち、それら
は感染の早期において、且つ構造タンパク質の非存在下で発現される。
は感染の早期において、且つ構造タンパク質の非存在下で発現される。
【０００６】 本発明に従うと、以下を含んで成るタンパク質が提供される： （ａ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしく
はその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘
導体；又は （ｂ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしく
はその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘
導体；又は （ｃ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体及び融合パートナーに連
結されたＨＩＶ Ｎｅｔタンパク質もしくはその誘導体。
はその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘
導体；又は （ｂ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしく
はその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘
導体；又は （ｃ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体及び融合パートナーに連
結されたＨＩＶ Ｎｅｔタンパク質もしくはその誘導体。
【０００７】 融合パートナーとは、Ｔａｔ又はＮｅｆではない任意のタンパク質配列を意味
する。好ましくは、融合パートナーはヘモフィルス・インフレンザＢに由来する
タンパク質Ｄ又はその脂質付加誘導体リポタンパク質Ｄである。特に、Ｎ末端側
の１／３、即ち、およそ最初の１００〜１３０個のアミノ酸が利用される。ここ
ではそれをＬｉｐｏ Ｄ １／３と称する。本発明の好適な態様において、Ｎｅ
ｆタンパク質又はその誘導体はＴａｔタンパク質又はその誘導体に連結されてい
てよい。かかるＮｅｆ−Ｔａｔタンパク質は任意的に融合パートナー、例えばタ
ンパク質Ｄにも連結されていてよい。
する。好ましくは、融合パートナーはヘモフィルス・インフレンザＢに由来する
タンパク質Ｄ又はその脂質付加誘導体リポタンパク質Ｄである。特に、Ｎ末端側
の１／３、即ち、およそ最初の１００〜１３０個のアミノ酸が利用される。ここ
ではそれをＬｉｐｏ Ｄ １／３と称する。本発明の好適な態様において、Ｎｅ
ｆタンパク質又はその誘導体はＴａｔタンパク質又はその誘導体に連結されてい
てよい。かかるＮｅｆ−Ｔａｔタンパク質は任意的に融合パートナー、例えばタ
ンパク質Ｄにも連結されていてよい。
【０００８】 融合パートナーは通常Ｎｅｆ又はＴａｔタンパク質のＮ末端に連結されている
。
。
【０００９】 本発明に包含される誘導体には、５〜１０個のヒスチジン残基を好適に含むＣ
末端ヒスチジンテールを有する分子が含まれる。一般に、ｎ個の残基を含むヒス
チジンテールをここではＨｉｓ（ｎ）と呼ぶ。ヒスチジン（又は「Ｈｉｓ」）テ
ールの存在は精製に役に立つ。より詳しくは、本発明は下記の構造を有するタン
パク質を提供する： Ｌｉｐｏ Ｄ １／３ − Ｎｅｆ − Ｈｉｓ（6 ） Ｌｉｐｏ Ｄ １／３ − Ｎｅｆ−Ｔａｔ − Ｈｉｓ（6 ） Ｐｒｏｔ Ｄ １／３ − Ｎｅｆ − Ｈｉｓ（6 ） Ｐｒｏｔ Ｄ １／３ − Ｎｅｆ−Ｔａｔ − Ｈｉｓ（6 ） Ｎｅｆ−Ｔａｔ − Ｈｉｓ（6 ）
末端ヒスチジンテールを有する分子が含まれる。一般に、ｎ個の残基を含むヒス
チジンテールをここではＨｉｓ（ｎ）と呼ぶ。ヒスチジン（又は「Ｈｉｓ」）テ
ールの存在は精製に役に立つ。より詳しくは、本発明は下記の構造を有するタン
パク質を提供する： Ｌｉｐｏ Ｄ １／３ − Ｎｅｆ − Ｈｉｓ（6 ） Ｌｉｐｏ Ｄ １／３ − Ｎｅｆ−Ｔａｔ − Ｈｉｓ（6 ） Ｐｒｏｔ Ｄ １／３ − Ｎｅｆ − Ｈｉｓ（6 ） Ｐｒｏｔ Ｄ １／３ − Ｎｅｆ−Ｔａｔ − Ｈｉｓ（6 ） Ｎｅｆ−Ｔａｔ − Ｈｉｓ（6 ）
【００１０】 図１はかかる構築体のための融合パートナーのアミノ酸（Seq. ID. No.7 ）及
びＤＮＡ配列（Seq. ID. No.6 ）を示す。
びＤＮＡ配列（Seq. ID. No.6 ）を示す。
【００１１】 好適な態様において、当該タンパク質は５〜１０個、そして好ましくは６個の
ヒスチジン残基を含んで成るヒスチジンテールを伴って発現される。酵母（サッ
カロマイセス・セレビシエ）における、Ｎｅｆ（Macreadie I.G.ら、1993, Yeas
t 9 (6) 565-573 ）及びＴａｔ（Braddock Mら、1989, Cell 58 (2) 269-79）の
個別の発現は既に報告されている。Ｎｅｆタンパク質のみがミリスチル化されて
いる。本発明ははじめてピチア発現系においてＮｅｆ及びＴａｔの個別の発現（
Ｎｅｆ−Ｈｉｓ及びＴａｔ−Ｈｉｓ構築体）、並びに融合構築体Ｎｅｆ−Ｔａｔ
−Ｈｉｓの有効な発現を提供する。代表的なＮｅｆ−Ｈｉｓ（Seq. ID. No.8 及
び９）、Ｔａｔ−Ｈｉｓ（Seq. ID. No.10及び11）、並びにＮｅｆ−Ｔａｔ−Ｈ
ｉｓ融合タンパク質（Seq. ID. No.12及び13）のＤＮＡ及びアミノ酸配列を図１
２に示す。
ヒスチジン残基を含んで成るヒスチジンテールを伴って発現される。酵母（サッ
カロマイセス・セレビシエ）における、Ｎｅｆ（Macreadie I.G.ら、1993, Yeas
t 9 (6) 565-573 ）及びＴａｔ（Braddock Mら、1989, Cell 58 (2) 269-79）の
個別の発現は既に報告されている。Ｎｅｆタンパク質のみがミリスチル化されて
いる。本発明ははじめてピチア発現系においてＮｅｆ及びＴａｔの個別の発現（
Ｎｅｆ−Ｈｉｓ及びＴａｔ−Ｈｉｓ構築体）、並びに融合構築体Ｎｅｆ−Ｔａｔ
−Ｈｉｓの有効な発現を提供する。代表的なＮｅｆ−Ｈｉｓ（Seq. ID. No.8 及
び９）、Ｔａｔ−Ｈｉｓ（Seq. ID. No.10及び11）、並びにＮｅｆ−Ｔａｔ−Ｈ
ｉｓ融合タンパク質（Seq. ID. No.12及び13）のＤＮＡ及びアミノ酸配列を図１
２に示す。
【００１２】 本発明に包含される誘導体には突然変異タンパク質も含まれる。「突然変異」
なる語は、部位特異的突然変異誘発のための周知の技術又は任意のその他の慣用
の方法を利用して１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加又は置換の施された分子
を意味する。
なる語は、部位特異的突然変異誘発のための周知の技術又は任意のその他の慣用
の方法を利用して１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加又は置換の施された分子
を意味する。
【００１３】 突然変異Ｔａｔを図２（Seq. ID. No.22及び23）に、Ｎｅｆ−Ｔａｔ突然変異
−Ｈｉｓ（Seq. ID. No.24及び25）と一緒に示す。
−Ｈｉｓ（Seq. ID. No.24及び25）と一緒に示す。
【００１４】 本発明は更に、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡも提供する。かかる配
列は適当な発現ベクターに挿入でき、そして適当な宿主内で発現されうる。
列は適当な発現ベクターに挿入でき、そして適当な宿主内で発現されうる。
【００１５】 本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は標準のＤＮＡ合成技術、例えば
D.M.Roberts ら、Biochemistry 1985, 24, 5090-5098に記載の酵素ライゲーショ
ンにより、化学合成により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素重合により、又は熱安定ポリ
メラーゼの如きを利用するＰＣＲ技術により、又はこれらの技術の組合せを利用
して合成できる。
D.M.Roberts ら、Biochemistry 1985, 24, 5090-5098に記載の酵素ライゲーショ
ンにより、化学合成により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素重合により、又は熱安定ポリ
メラーゼの如きを利用するＰＣＲ技術により、又はこれらの技術の組合せを利用
して合成できる。
【００１６】 ＤＮＡの酵素重合はｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡ
ポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）を利用し、ヌクレオシド三リン酸、ｄ
ＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを適宜含む適当なバッファーの中で１
０〜３７℃の温度において、一般に５０μｌ以下の容量で実施できうる。ＤＮＡ
フラグメントの酵素的ライゲーションはＤＮＡリガーゼ、例えばＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼを利用し、適当なバッファー、例えば０．０５ＭのＴｒｉｓ（pH７．４）
、０．０１ＭのＭｇＣｌ2 、０．０１Ｍのジチオスレイトール、１mMのスペルミ
ジン、１mMのＡＴＰ及び０．１mg／mlの牛血清アルブミンの中で、４℃乃至室温
の温度で、一般に５０ml以下の容量で実施できうる。このＤＮＡポリマー又はフ
ラグメントの化学合成は慣用のホスホトリエステル、ホスフィット、又はホスホ
ラミジットにより、固相技術、例えば「Chemical and Enzymatic Synthesis of
Gene Fragments-A Laboratory Manual」（ed. H.G.Gassen and A.Lang), Verlag
Chemie, Weinheim (1982)）又はその他の科学文献、例えばM.J.Gait, H.W.D.Ma
tthes, M.Singh, B.S.Sproat, and R.C.Titmas, Nucleic Acids Research, 1982
, 10, 6243; B.S.Sproat, and W.Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24,
5771; M.D.Matteucci and M.H.Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 71
9; M.D.Matteucci and M.H.Caruthers, Journal of the American Chemical Soc
iety, 1981, 103, 3185; S.P.Adams et al., Journal of the American Chemica
l Society, 1983, 105, 661; N.D.Sinha, J.Biernat, J.McMannus, and H.Koest
er, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; 及びH.W.D.Matthes et al., EM
BO Journal, 1984, 3, 801に記載の固相技術を利用して実施できうる。
ポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）を利用し、ヌクレオシド三リン酸、ｄ
ＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを適宜含む適当なバッファーの中で１
０〜３７℃の温度において、一般に５０μｌ以下の容量で実施できうる。ＤＮＡ
フラグメントの酵素的ライゲーションはＤＮＡリガーゼ、例えばＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼを利用し、適当なバッファー、例えば０．０５ＭのＴｒｉｓ（pH７．４）
、０．０１ＭのＭｇＣｌ2 、０．０１Ｍのジチオスレイトール、１mMのスペルミ
ジン、１mMのＡＴＰ及び０．１mg／mlの牛血清アルブミンの中で、４℃乃至室温
の温度で、一般に５０ml以下の容量で実施できうる。このＤＮＡポリマー又はフ
ラグメントの化学合成は慣用のホスホトリエステル、ホスフィット、又はホスホ
ラミジットにより、固相技術、例えば「Chemical and Enzymatic Synthesis of
Gene Fragments-A Laboratory Manual」（ed. H.G.Gassen and A.Lang), Verlag
Chemie, Weinheim (1982)）又はその他の科学文献、例えばM.J.Gait, H.W.D.Ma
tthes, M.Singh, B.S.Sproat, and R.C.Titmas, Nucleic Acids Research, 1982
, 10, 6243; B.S.Sproat, and W.Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24,
5771; M.D.Matteucci and M.H.Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 71
9; M.D.Matteucci and M.H.Caruthers, Journal of the American Chemical Soc
iety, 1981, 103, 3185; S.P.Adams et al., Journal of the American Chemica
l Society, 1983, 105, 661; N.D.Sinha, J.Biernat, J.McMannus, and H.Koest
er, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; 及びH.W.D.Matthes et al., EM
BO Journal, 1984, 3, 801に記載の固相技術を利用して実施できうる。
【００１７】 本発明は、本発明のタンパク質を調製するための方法も提供し、この方法は： ｉ）宿主細胞内で、前記タンパク質又はその誘導体をコードするヌクレオチド
配列を含んで成るＤＮＡポリマーを発現できる複製可能な又は組込み式発現ベク
ターを用意する； ii）宿主細胞を前記ベクターで形質転換する； iii ）前記形質転換宿主細胞を前記タンパク質が産生されるよう前記ＤＮＡポ
リマーの発現を可能にする条件下で培養する；そして iv）前記タンパク質を回収する； 工程を含んで成る。
配列を含んで成るＤＮＡポリマーを発現できる複製可能な又は組込み式発現ベク
ターを用意する； ii）宿主細胞を前記ベクターで形質転換する； iii ）前記形質転換宿主細胞を前記タンパク質が産生されるよう前記ＤＮＡポ
リマーの発現を可能にする条件下で培養する；そして iv）前記タンパク質を回収する； 工程を含んで成る。
【００１８】 本発明の方法は慣用の組換技術、例えばManiatisらMolecular Cloning-A Labo
ratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989に記載の技術により実施してよ
い。
ratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989に記載の技術により実施してよ
い。
【００１９】 本明細書において用いる語「形質転換」とは、外来ＤＮＡの宿主細胞への導入
を意味する。これは例えばGenetic Engineering; Eds.S.M.Kingsman and A.J.Ki
ngsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988に記載の
慣用の技術を利用しての適当なプラスミド又はウィルスによる形質転換、トラン
スフェクション又は感染により達成できうる。「形質転換」は以降、注目の外来
遺伝子を含み、且つ発現する宿主細胞結果物に適用する。
を意味する。これは例えばGenetic Engineering; Eds.S.M.Kingsman and A.J.Ki
ngsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988に記載の
慣用の技術を利用しての適当なプラスミド又はウィルスによる形質転換、トラン
スフェクション又は感染により達成できうる。「形質転換」は以降、注目の外来
遺伝子を含み、且つ発現する宿主細胞結果物に適用する。
【００２０】 当該発現ベクターは新規であり、そして本発明の一部を構成する。
【００２１】 複製可能な発現ベクターは本発明に従い、前記宿主細胞に適合するベクターを
切断してインタクトなレプリコンを有する線形ＤＮＡセグメントを供し、そして
この線形セグメントを、それと一緒になって所望の生成物をコードする１又は複
数のＤＮＡ分子、例えば本発明のタンパク質又はその誘導体をコードするＤＮＡ
ポリマーとライゲーション条件下で結合させることにより調製できうる。
切断してインタクトなレプリコンを有する線形ＤＮＡセグメントを供し、そして
この線形セグメントを、それと一緒になって所望の生成物をコードする１又は複
数のＤＮＡ分子、例えば本発明のタンパク質又はその誘導体をコードするＤＮＡ
ポリマーとライゲーション条件下で結合させることにより調製できうる。
【００２２】 かくして、当該ＤＮＡポリマーは適宜、予め形成しておく、又は当該ベクター
の構築中に形成してよい。
の構築中に形成してよい。
【００２３】 ベクターの選択はある程度宿主細胞により決定される。かかる細胞は原核系で
も真核系でもよいが、好ましくはＥ．コリ又は酵母とする。適当なベクターには
プラスミド、バクテリオファージ、コスミド及び組換ウィルスが挙げられる。
も真核系でもよいが、好ましくはＥ．コリ又は酵母とする。適当なベクターには
プラスミド、バクテリオファージ、コスミド及び組換ウィルスが挙げられる。
【００２４】 複製可能な発現ベクターの調製は、例えばManiatisら、前掲に記載のＤＮＡの
制限処理、重合及びライゲーション用の適当な酵素により慣用的に実施されうる
。
制限処理、重合及びライゲーション用の適当な酵素により慣用的に実施されうる
。
【００２５】 組換宿主細胞は、本発明に従い、宿主細胞を本発明の複製可能ベクターで形質
転換条件下で形質転換させることにより調製する。適当な形質転換条件は慣用で
あり、そして例えばManiatisら、前掲又は「DNA Cloning 」Vol.II, D.M.Glover
ed., IRL Press Ltd., 1985に記載されている。
転換条件下で形質転換させることにより調製する。適当な形質転換条件は慣用で
あり、そして例えばManiatisら、前掲又は「DNA Cloning 」Vol.II, D.M.Glover
ed., IRL Press Ltd., 1985に記載されている。
【００２６】 形質転換条件の選定は宿主細胞により決定される。即ち、細菌宿主、例えばＥ
．コリをＣａＣｌ2 の溶液（Cohen ら、Proc.Natl.Acad.Sci., 1973, 69, 2110
）又はＲｂＣｌ，ＭｎＣｌ2 、酢酸カリウム及びグリセロールの混合物を含んで
成る溶液、次いで３−〔Ｎ−モルホリノ〕−プロパン−スルホン酸、ＲｂＣｌ及
びグリセロールで処理してよい。培養物中の哺乳動物細胞はこの細胞上へのベク
ターＤＮＡのカルシウム共沈殿により形質転換されうる。本発明は更に本発明の
複製発現ベクターで形質転換された宿主細胞にまで及ぶ。
．コリをＣａＣｌ2 の溶液（Cohen ら、Proc.Natl.Acad.Sci., 1973, 69, 2110
）又はＲｂＣｌ，ＭｎＣｌ2 、酢酸カリウム及びグリセロールの混合物を含んで
成る溶液、次いで３−〔Ｎ−モルホリノ〕−プロパン−スルホン酸、ＲｂＣｌ及
びグリセロールで処理してよい。培養物中の哺乳動物細胞はこの細胞上へのベク
ターＤＮＡのカルシウム共沈殿により形質転換されうる。本発明は更に本発明の
複製発現ベクターで形質転換された宿主細胞にまで及ぶ。
【００２７】 当該ＤＮＡポリマーの発現を可能にする条件下での形質転換宿主細胞の培養は
、例えば上記のManiatisらの「DNA Cloning 」に記載の通りにして慣用的に実施
する。かくして、好ましくは細胞に栄養分を供給し、そして５０℃以下の温度で
培養する。
、例えば上記のManiatisらの「DNA Cloning 」に記載の通りにして慣用的に実施
する。かくして、好ましくは細胞に栄養分を供給し、そして５０℃以下の温度で
培養する。
【００２８】 当該生成物は宿主細胞に従って慣用の方法により回収される。かくして、宿主
細胞が細菌、例えばＥ．コリ又は酵母、例えばピチアのとき、それを物理的、化
学的又は酵素的に溶解し、そして得られるリゼートからタンパク質生成物を単離
してよい。宿主細胞が哺乳類系の場合、その生成物は一般に栄養培地から、又は
細胞フリーエキスから単離されうる。慣用のタンパク質単離技術には選択的沈殿
、吸着クロマトグラフィー、及びモノクローナル抗体アフィニティーカラムを含
むアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
細胞が細菌、例えばＥ．コリ又は酵母、例えばピチアのとき、それを物理的、化
学的又は酵素的に溶解し、そして得られるリゼートからタンパク質生成物を単離
してよい。宿主細胞が哺乳類系の場合、その生成物は一般に栄養培地から、又は
細胞フリーエキスから単離されうる。慣用のタンパク質単離技術には選択的沈殿
、吸着クロマトグラフィー、及びモノクローナル抗体アフィニティーカラムを含
むアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
【００２９】 ヒスチジンテールの施された本発明のタンパク質にとって、精製は金属イオン
アフィニティーカラムの利用により容易に達成されうる。好適な態様において、
このタンパク質はそれを陽イオン交換クロマトグラフィー及び／又はゲル濾過ク
ロマトグラフィーにかけることにより更に精製する。次いでこのタンパク質を０
．２２μｍの膜に通すことにより滅菌する。
アフィニティーカラムの利用により容易に達成されうる。好適な態様において、
このタンパク質はそれを陽イオン交換クロマトグラフィー及び／又はゲル濾過ク
ロマトグラフィーにかけることにより更に精製する。次いでこのタンパク質を０
．２２μｍの膜に通すことにより滅菌する。
【００３０】 本発明のタンパク質はワクチンとして調剤でき、又はヒスチジン残基を酵素的
に浄化してよい。
に浄化してよい。
【００３１】 本発明のタンパク質はＳＤＳ ＰＡＧＥによる可視化に従い、好ましくは純度
８０％以上、より好ましくは純度９０％以上で提供される。好ましくは、このタ
ンパク質はＳＤＳ ＰＡＧＥにより単一バンドとして出現する。
８０％以上、より好ましくは純度９０％以上で提供される。好ましくは、このタ
ンパク質はＳＤＳ ＰＡＧＥにより単一バンドとして出現する。
【００３２】 本発明は医薬的に許容される賦形剤中の本発明のタンパク質を含んで成る医薬
組成物を提供する。
組成物を提供する。
【００３３】 ワクチン製剤はNew Trends and Developments in Vaccines, Voller ら (eds.
), University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978 に一般に記載してある
。リポソーム内での封入はFullerton 、米国特許第４，２３５，８７７号に記載
されている。
), University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978 に一般に記載してある
。リポソーム内での封入はFullerton 、米国特許第４，２３５，８７７号に記載
されている。
【００３４】 本発明のタンパク質は好ましくは本発明のワクチン製剤の中でアジュバント付
加されている。適当なアジュバントにはアルミニウム塩、例えば水酸化アルミニ
ウムゲル（みょうばん）又はリン酸アルミニウムが挙げられるが、カルシウム、
鉄もしくは亜鉛の塩であってもよく、又はアシル化チロシンの不溶性懸濁物、又
はアシル化糖、陽イオンもしくは陰イオン誘導多糖類、又はポリホスファゼン類
が挙げられる。
加されている。適当なアジュバントにはアルミニウム塩、例えば水酸化アルミニ
ウムゲル（みょうばん）又はリン酸アルミニウムが挙げられるが、カルシウム、
鉄もしくは亜鉛の塩であってもよく、又はアシル化チロシンの不溶性懸濁物、又
はアシル化糖、陽イオンもしくは陰イオン誘導多糖類、又はポリホスファゼン類
が挙げられる。
【００３５】 本発明の製剤において、当該アジュバント組成物が優先的なＴＨ１応答を誘導
することが好ましい。適当なアジュバント製剤には、例えばモノホスホリル脂質
Ａ又はその誘導体、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３
Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩との組合せが挙げられる。
することが好ましい。適当なアジュバント製剤には、例えばモノホスホリル脂質
Ａ又はその誘導体、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３
Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩との組合せが挙げられる。
【００３６】 増強システムはモノホスホリル脂質Ａとサポニン誘導体との組合せ、特にＷＯ
９４／００１５３に開示のＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、又はＷＯ９６／
３３７３９に開示の如きＱＳ２１がコレステロールでクエンチングされた反応性
の弱い組成物を包含する。
９４／００１５３に開示のＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、又はＷＯ９６／
３３７３９に開示の如きＱＳ２１がコレステロールでクエンチングされた反応性
の弱い組成物を包含する。
【００３７】 ＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ及びトコフェロールを水中油エマルションの中で包含
する極めて有効なアジュバント製剤がＷＯ９５／１７２１０に記載され、そして
好適な製剤である。
する極めて有効なアジュバント製剤がＷＯ９５／１７２１０に記載され、そして
好適な製剤である。
【００３８】 従って、本発明の一の態様において、モノホスホリル脂質Ａ又はその誘導体、
特に３Ｄ−ＭＰＬで強化された本発明に係るタンパク質を含んで成るワクチンを
提供する。
特に３Ｄ−ＭＰＬで強化された本発明に係るタンパク質を含んで成るワクチンを
提供する。
【００３９】 好ましくは、このワクチンは更にサポニン、より好ましくはＱＳ２１を含んで
成る。
成る。
【００４０】 好ましくは、この製剤は更に水中油エマルション及びトコフェロールを含んで
成る。本発明は更に、本発明のタンパク質を医薬的に許容される賦形剤、例えば
３Ｄ−ＭＰＬと混合することを含んで成るワクチン製剤の製造のための方法を提
供する。
成る。本発明は更に、本発明のタンパク質を医薬的に許容される賦形剤、例えば
３Ｄ−ＭＰＬと混合することを含んで成るワクチン製剤の製造のための方法を提
供する。
【００４１】 本発明のワクチンは更にＨＩＶタンパク質、例えばエンベロープ糖タンパク質
ｇｐ１６０又はその誘導体ｇｐ１２０を含んで成る。
ｇｐ１６０又はその誘導体ｇｐ１２０を含んで成る。
【００４２】 別の観点において、本発明はピチア・パストリスにおいて発現されたＨＩＶ
Ｎｅｆ又はＨＩＶ Ｔａｔタンパク質、又はそれらの誘導体に関連する。
Ｎｅｆ又はＨＩＶ Ｔａｔタンパク質、又はそれらの誘導体に関連する。
【００４３】 本発明を以下の実施例を参考に更に説明する。
【００４４】 実施例 一般事項 ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１）によりコードされる２種類の調節タンパ
ク質、Ｎｅｆ及びＴａｔタンパク質をＥ．コリ及びメチロール向性酵母ピチア・
パストリスの中で生産した。
ク質、Ｎｅｆ及びＴａｔタンパク質をＥ．コリ及びメチロール向性酵母ピチア・
パストリスの中で生産した。
【００４５】 Ｂｒｕ／Ｌａｉ単離体由来のｎｅｆ遺伝子（Cell 40: 9-17, 1985 ）をこれら
の構築体のために選定し、なぜならこの遺伝子はとりわけ共通Ｎｅｆに最も似し
ているからである。
の構築体のために選定し、なぜならこの遺伝子はとりわけ共通Ｎｅｆに最も似し
ているからである。
【００４６】 Ｂｒｕ／Ｌａｉ ｎｅｆ遺伝子のための出発材料は哺乳動物発現ベクターｐｃ
ＤＮＡ３上にクローニングされた１１７０bp ＤＮＡのフラグメントとした（ｐ
ｃＤＮＡ３／ｎｅｆ）。
ＤＮＡ３上にクローニングされた１１７０bp ＤＮＡのフラグメントとした（ｐ
ｃＤＮＡ３／ｎｅｆ）。
【００４７】 ｔａｔ遺伝子はＢＨ１０分子クローンに由来する。この遺伝子にはＨＴＬＶII
I ｃＤＮＡクローン名ｐＣＶ１が付与され、そしてScience, 229, p-69-73, 198
5 に記載されている。
I ｃＤＮＡクローン名ｐＣＶ１が付与され、そしてScience, 229, p-69-73, 198
5 に記載されている。
【００４８】 １．ＨＩＶ−１ ｎｅｆ及びｔａｔ配列のＥ．コリ内での発現 Ｎｅｆタンパク質をコードする配列並びにｎｅｆ及びｔａｔ配列の融合体をプ
ラスミドベクターｐＲＩＴ１４５８６及びｐＲＩＴ１４５８９に設置した（図１
参照）。
ラスミドベクターｐＲＩＴ１４５８６及びｐＲＩＴ１４５８９に設置した（図１
参照）。
【００４９】 Ｎｅｆ及びＮｅｆ−Ｔａｔ融合体を、融合パートナーとしてタンパク質Ｄの一
部を利用して製造した。タンパク質Ｄはグラム陰性菌、ヘモフィルス・インフレ
ンザの表層に露出したイムノグロブリンＤ結合タンパク質である。
部を利用して製造した。タンパク質Ｄはグラム陰性菌、ヘモフィルス・インフレ
ンザの表層に露出したイムノグロブリンＤ結合タンパク質である。
【００５０】 ｐＲＩＴ１４５８６は、λＰＬプロモーターのコントロール下で、タンパク質
Ｄの最初の１２７個のアミノ酸をコードするヘモフィルス・インフレンザ菌に由
来するＤＮＡ配列（Infect.Immun. 60: 1336-1342, 1992 ）、その直後に後続す
る多重クローニング部位領域、並びに１個のグリシン、６個のヒスチジン残基及
び停止コドンをコードするＤＮＡ配列を含む（図１Ａ）。
Ｄの最初の１２７個のアミノ酸をコードするヘモフィルス・インフレンザ菌に由
来するＤＮＡ配列（Infect.Immun. 60: 1336-1342, 1992 ）、その直後に後続す
る多重クローニング部位領域、並びに１個のグリシン、６個のヒスチジン残基及
び停止コドンをコードするＤＮＡ配列を含む（図１Ａ）。
【００５１】 このベクターはプロセシングされた脂質化Ｈｉｓテール付き融合タンパク質（
Ｌｉｐｏ Ｄ融合タンパク質）を発現するようにデザインされている。この融合
タンパク質は長さ１８個のアミノ酸残基のシグナル配列を有する前駆体として合
成し、そしてプロセシングの後、この前駆体分子内の１９位のシステインはアミ
ノ末端残基となり、その後共有結合した脂肪酸により修飾される（図１Ｂ）。
Ｌｉｐｏ Ｄ融合タンパク質）を発現するようにデザインされている。この融合
タンパク質は長さ１８個のアミノ酸残基のシグナル配列を有する前駆体として合
成し、そしてプロセシングの後、この前駆体分子内の１９位のシステインはアミ
ノ末端残基となり、その後共有結合した脂肪酸により修飾される（図１Ｂ）。
【００５２】 ｐＲＩＴ１４５８９はｐＲＩＴ１４５８６とほぼ同一であるが、ｐｒｏｔ Ｄ
誘導配列がシステイン１９コドンの直後で始まる。
誘導配列がシステイン１９コドンの直後で始まる。
【００５３】 このベクターからの発現はＨｉｓテール付き、脂質無しの融合タンパク質（Ｐ
ｒｏｔ Ｄ融合タンパク質）をもたらす。
ｒｏｔ Ｄ融合タンパク質）をもたらす。
【００５４】 ＬｉｐＯＤ−ｎｅｆ−Ｈｉｓ，ＬｉｐｏＤ−ｎｅｆ−ｔａｔ−Ｈｉｓ，Ｐｒｏ
ｔＤ−ｎｅｆ−Ｈｉｓ及びＰｒｏｔＤ−ｎｅｆ−ｔａｔ−Ｈｉｓの４つの構築体
を作った。
ｔＤ−ｎｅｆ−Ｈｉｓ及びＰｒｏｔＤ−ｎｅｆ−ｔａｔ−Ｈｉｓの４つの構築体
を作った。
【００５５】 最初の２つの構築体は発現ベクターｐＲＩＴ１４５８６を利用して作り、最後
の２つの構築体はｐＲＩＴ１４５８９を利用して作った。
の２つの構築体はｐＲＩＴ１４５８９を利用して作った。
【００５６】 １．１ ＬＩＰＯＤ−Ｎｅｆ−ＨＩＳ融合タンパク質を産生する組換株ＥＣＬＤ −Ｎ１の構築 １．１．１ ｌｉｐｏＤ−ｎｅｆ−Ｈｉｓ発現プラスミドｐＲＩＴ１４５９５の 構築 ｎｅｆ遺伝子（Ｂｒｕ／Ｌａｉ単離体）をＰＣＲによりｐｃＤＮＡ３／Ｎｅｆ
プラスミドから、プライマー０１及び０２を用いて増幅した。
プラスミドから、プライマー０１及び０２を用いて増幅した。
【００５７】 ＮｃｏＩ プライマー０１（Seq ID NO 1 ）：５′ATCGT CCATG.G GT.GGC.AAG.TGG.T３′ ＳｐｅＩ プライマー０２（Seq ID NO 2 ）：５′CGGCT ACTAGTGCAGTTCTTGAA３′
【００５８】 ｎｅｆＤＮＡ領域の増幅はヌクレオチド８３５７で開始し、そしてヌクレオチ
ド８９７１で終結する（Cell, 40: 9-17, 1985）。
ド８９７１で終結する（Cell, 40: 9-17, 1985）。
【００５９】 ＮｃｏＩ制限部位（ｎｅｆ遺伝子のＡＴＧコドンを担持する）をＰＣＲフラグ
メントの５′末端に導入し、そしてＳｐｅＩ部位は３′末端に導入した。
メントの５′末端に導入し、そしてＳｐｅＩ部位は３′末端に導入した。
【００６０】 得られるＰＣＲフラグメント及び発現プラスミドｐＲＩＴ１４５８６を共にＮ
ｃｏＩ及びＳｐｅＩで制限処理し、アガロースゲルで精製し、ライゲーションし
、そして適当なＥ．コリ宿主、株ＡＲ５８に形質転換させた。この株はｇａｌＥ
：：Ｔｎ１０，Δ−８（ｃｈｌＤ−ｐｇｌ），Δ−Ｈ１（ｃｒｏ−ｃｈｌＡ），
Ｎ+ 及びｃＩ８５７であるＮ９９に由来するクリプチックλリソゲンである。
ｃｏＩ及びＳｐｅＩで制限処理し、アガロースゲルで精製し、ライゲーションし
、そして適当なＥ．コリ宿主、株ＡＲ５８に形質転換させた。この株はｇａｌＥ
：：Ｔｎ１０，Δ−８（ｃｈｌＤ−ｐｇｌ），Δ−Ｈ１（ｃｒｏ−ｃｈｌＡ），
Ｎ+ 及びｃＩ８５７であるＮ９９に由来するクリプチックλリソゲンである。
【００６１】 得られる組換プラスミドを、自動配列決定によりｎｅｆ増幅した領域の確認後
（下記１．１．２章参照のこと）、ｐＲＩＴ１４５９５と命名した。
（下記１．１．２章参照のこと）、ｐＲＩＴ１４５９５と命名した。
【００６２】 １．１．２ ｐＲＩＴ１４５９５を有するＥ．コリ株ＡＲ５８の形質転換体の選 定 ＡＲ５８Ｅ．コリ宿主株で形質転換を行うと、組換プラスミドは異種タンパク
質の熱誘導性生産を指令する。
質の熱誘導性生産を指令する。
【００６３】 いくつかの組換ｌｉｐｏＤ−Ｎｅｆ−Ｈｉｓ形質転換体の熱誘導性タンパク質
生産をクマジーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。形質転換体は
全て熱誘導性異種タンパク質生産を示した。組換ＬｉｐｏＤ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−
Ｈｉｓ融合タンパク質の量は総タンパク質の１０％と推定された。
生産をクマジーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。形質転換体は
全て熱誘導性異種タンパク質生産を示した。組換ＬｉｐｏＤ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−
Ｈｉｓ融合タンパク質の量は総タンパク質の１０％と推定された。
【００６４】 形質転換体の一つを選定し、そして実験室承認番号ＥＣＬＤ−Ｎ１を付与した
。
。
【００６５】 組換プラスミドを株ＥＣＬＤ−Ｎ１から再単離し、そしてｎｅｆ−Ｈｉｓコー
ド領域の配列を自動配列決定により確認した。このプラスミドに公共名ｐＲＩＴ
１４５９５を付与した。
ド領域の配列を自動配列決定により確認した。このプラスミドに公共名ｐＲＩＴ
１４５９５を付与した。
【００６６】 株ＥＣＬＤ−Ｎ１により生産された完全にプロセシングされ、且つアシル化さ
れた組換ＬｉｐｏＤ−ｎｅｆ−Ｈｉｓ融合タンパク質は ・脂肪酸 ・１０９ａ．ａ．のタンパク質Ｄ（ａ．ａ．１９で始まり、ａ．ａ．１２７に
至る） ・ｐＲＩＴ１４５８６のＮｃｏＩクローニング部位を利用して構築したメチオ
ニン（図１） ・２０５ａ．ａ．のＮｅｆタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．２０６
に至る） ・クローニング手順により構築したスレオニン及びセリン（ｐＲＩＴ１４５８
６のＳｐｅＩ部位においてクローニング） ・１個のグリシン及び６個のヒスチジン から成る。
れた組換ＬｉｐｏＤ−ｎｅｆ−Ｈｉｓ融合タンパク質は ・脂肪酸 ・１０９ａ．ａ．のタンパク質Ｄ（ａ．ａ．１９で始まり、ａ．ａ．１２７に
至る） ・ｐＲＩＴ１４５８６のＮｃｏＩクローニング部位を利用して構築したメチオ
ニン（図１） ・２０５ａ．ａ．のＮｅｆタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．２０６
に至る） ・クローニング手順により構築したスレオニン及びセリン（ｐＲＩＴ１４５８
６のＳｐｅＩ部位においてクローニング） ・１個のグリシン及び６個のヒスチジン から成る。
【００６７】 １．２ ＰＲＯＴＤ−Ｎｅｆ−ＨＩＳ融合タンパク質を産生する組換株ＥＣＤ− Ｎ１の構築 ＰｒｏｔＤ−Ｎｅｆ−Ｈｉｓ融合タンパク質をコードする発現プラスミドｐＲ
ＩＴ１４６００の構築は実施例１に記載のプラスミドの構築と同じであるが、Ｐ
ＣＲ増幅ｎｅｆフラグメントのためのレセプタープラスミドとしてｐＲＴ１４５
８９を使用した。
ＩＴ１４６００の構築は実施例１に記載のプラスミドの構築と同じであるが、Ｐ
ＣＲ増幅ｎｅｆフラグメントのためのレセプタープラスミドとしてｐＲＴ１４５
８９を使用した。
【００６８】 Ｅ．コリＡＲ５８株をｐＲＩＴ１４６００で形質転換し、そしてその形質転換
体を実施例１．１．２に記載の通りにして分析した。選定した形質転換体に実験
室承認番号ＥＣＤ−Ｎ１を付与した。
体を実施例１．１．２に記載の通りにして分析した。選定した形質転換体に実験
室承認番号ＥＣＤ−Ｎ１を付与した。
【００６９】 １．３ ＬＩＰＯＤ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−ＨＩＳ融合タンパク質を産生する組換株 ＥＣＬＤ−ＮＴ６の構築 １．３．１ ｌｉｐｏＤ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ発現プラスミドｐＲＩＴ１４ ５９６の構築 ｔａｔ遺伝子（ＢＨ１０単離体）をＰＣＲにより、ｐＣＶ１プラスミドの誘導
体から、プライマー０３及び０４を用いて増幅させた。ＳｐｅＩ制限部位をＰＣ
Ｒフラグメントの両端に導入した。
体から、プライマー０３及び０４を用いて増幅させた。ＳｐｅＩ制限部位をＰＣ
Ｒフラグメントの両端に導入した。
【００７０】 ＳｐｅＩ プライマー０３（Seq ID NO 3 ）：５′ATCGT ACTAGT. GAG.CCA.GTA.GAT.C ３′ ＳｐｅＩ プライマー０４（Seq ID NO 4 ）：５′CGGCT ACTAGTTTCCTTCGGGCCT ３′
【００７１】 増幅ｔａｔ遺伝子のヌクレオチド配列はｐＣＶ１クローンにおいて示され（Sc
ience 229: 69-73, 1985）、そしてヌクレオチド５４１４乃至ヌクレオチド７９
９８をカバーする。
ience 229: 69-73, 1985）、そしてヌクレオチド５４１４乃至ヌクレオチド７９
９８をカバーする。
【００７２】 得られるＰＣＲフラグメント及びプラスミドｐＲＩＴ１４５９５（ｌｉｐｏＤ
−Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質を発現する）を共にＳｐｅＩ制限酵素により消化し
、アガロースゲルで精製し、ライゲーションし、そしてコンピテントＡＲ５８細
胞に形質転換させた。得られる組換プラスミドに、自動配列決定によるｔａｔ増
幅配列の確認後（以下の１．３．２章参照のこと）、名称ｐＲＩＴ１４５９６を
付与した。
−Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質を発現する）を共にＳｐｅＩ制限酵素により消化し
、アガロースゲルで精製し、ライゲーションし、そしてコンピテントＡＲ５８細
胞に形質転換させた。得られる組換プラスミドに、自動配列決定によるｔａｔ増
幅配列の確認後（以下の１．３．２章参照のこと）、名称ｐＲＩＴ１４５９６を
付与した。
【００７３】 １．３．２ ｐＲＩＴ１４５９６を有する株ＡＲ５８の形質転換体の選定 形質転換体を増殖させ、熱誘導し、そしてそのタンパク質をクマジーブルー染
色したゲルにより分析した。組換タンパク質の生産レベルは総タンパク質の１％
と推定された。一の組換株を選定し、そして実験室名ＥＣＬＤ−ＮＴ６を付与し
た。
色したゲルにより分析した。組換タンパク質の生産レベルは総タンパク質の１％
と推定された。一の組換株を選定し、そして実験室名ＥＣＬＤ−ＮＴ６を付与し
た。
【００７４】 ｌｉｐｏＤ−ｎｅｆ−ｔａｔ−Ｈｉｓ組換プラスミドをＥＣＬＤ−ＮＴ６株か
ら再単離し、配列決定し、そして公共名ｐＲＩＴ１４５９６を付与した。
ら再単離し、配列決定し、そして公共名ｐＲＩＴ１４５９６を付与した。
【００７５】 株ＥＣＬＤ−Ｎ６により産生された完全にプロセシングされ、且つアシル化さ
れた組換ＬｉｐｏＤ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質は ・脂肪酸 ・１０９ａ．ａ．のタンパク質Ｄ（ａ．ａ．１９で始まり、ａ．ａ．１２７に
至る） ・ｐＲＩＴ１４５８６のＮｃｏＩクローニング部位を利用して構築したメチオ
ニン ・２０５ａ．ａ．のＮｅｆタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．２０６
に至る） ・クローニング手順により構築したスレオニン及びセリン ・８５ａ．ａ．のＴａｔタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．８６に至
る） ・クローニング手順により導入されたスレオニン及びセリン ・１個のグリシン及び６個のヒスチジン から成る。
れた組換ＬｉｐｏＤ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質は ・脂肪酸 ・１０９ａ．ａ．のタンパク質Ｄ（ａ．ａ．１９で始まり、ａ．ａ．１２７に
至る） ・ｐＲＩＴ１４５８６のＮｃｏＩクローニング部位を利用して構築したメチオ
ニン ・２０５ａ．ａ．のＮｅｆタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．２０６
に至る） ・クローニング手順により構築したスレオニン及びセリン ・８５ａ．ａ．のＴａｔタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．８６に至
る） ・クローニング手順により導入されたスレオニン及びセリン ・１個のグリシン及び６個のヒスチジン から成る。
【００７６】 １．４ ＰＲＯＴＤ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−ＨＩＳ融合タンパク質を産生する組換株 ＥＣＤ−ＮＴ１の構築 ＰｒｏｔＤ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質をコードする発現プラス
ミドｐＲＩＴ１４６０１の構築は実施例１．３．１に記載のプラスミド構築と同
じであるが、ＰＣＲ増幅ｎｅｆフラグメントのためのレセプタープラスミドとし
てｐＲＩＴ１４６００を使用した。
ミドｐＲＩＴ１４６０１の構築は実施例１．３．１に記載のプラスミド構築と同
じであるが、ＰＣＲ増幅ｎｅｆフラグメントのためのレセプタープラスミドとし
てｐＲＩＴ１４６００を使用した。
【００７７】 Ｅ．コリＡＲ５８株をｐＲＩＴ１４６０１で形質転換し、そして形質転換体を
前述の通りに分析した。選定した形質転換体に実験室承認番号ＥＣＤ−ＮＴ１を
付与した。
前述の通りに分析した。選定した形質転換体に実験室承認番号ＥＣＤ−ＮＴ１を
付与した。
【００７８】 ２．ピチア・パストリス内でのＨＩＶ−１ ｎｅｆ及びｔａｔ配列の発現 Ｎｅｔタンパク質、Ｔａｔタンパク質及び融合体Ｎｅｆ−Ｔａｔをメチロール
向性酵母ピチア・パストリス内で誘導性アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プ
ロモーターのコントロール下で発現させた。
向性酵母ピチア・パストリス内で誘導性アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プ
ロモーターのコントロール下で発現させた。
【００７９】 これらのＨＩＶ−１遺伝子を発現させるため、組込み式ベクターＰＨＩＬ−Ｄ
２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）の改良バージョンを利用した。このベクターは異種
タンパク質の発現がＡＯＸ１遺伝子の天然ＡＴＧコドンの直後で開始し、そして
１個のグリシン及び６個のヒスチジン残基のテールを有する組換タンパク質が産
生できるように改良されている。このＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを、ＰＨ
ＩＬ−Ｄ２ベクターの隣接ＡｓｕII及びＥｃｏＲＩ部位の間にオリゴヌクレオチ
ドリンカーをクローニングすることにより構築した（図３参照）。Ｈｉｓテール
の他に、このリンカーはＮｃｏＩ，ＳｐｅＩ及びＸｂａＩ制限部位を担持し、そ
の間にｎｅｆ，ｔａｔ及びｎｅｆ−ｔａｔ融合体が挿入されている。
２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）の改良バージョンを利用した。このベクターは異種
タンパク質の発現がＡＯＸ１遺伝子の天然ＡＴＧコドンの直後で開始し、そして
１個のグリシン及び６個のヒスチジン残基のテールを有する組換タンパク質が産
生できるように改良されている。このＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを、ＰＨ
ＩＬ−Ｄ２ベクターの隣接ＡｓｕII及びＥｃｏＲＩ部位の間にオリゴヌクレオチ
ドリンカーをクローニングすることにより構築した（図３参照）。Ｈｉｓテール
の他に、このリンカーはＮｃｏＩ，ＳｐｅＩ及びＸｂａＩ制限部位を担持し、そ
の間にｎｅｆ，ｔａｔ及びｎｅｆ−ｔａｔ融合体が挿入されている。
【００８０】 ２．１ 組込み式ベクターｐＲＩＴ１４５９７（Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質をコ ード）、ｐＲＩＴ１４５９８（Ｔａｔ−Ｈｉｓタンパク質をコード）及 びｐＲＩＴ１４５９９（融合体Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓをコード）の構 築 ｎｅｆ遺伝子をＰＣＲにより、ｐｃＤＮＡ３／Ｎｅｆプラスミドから、プライ
マー０１及び０２を用いて増幅させた（１．１．１章、ｐＲＩＴ１４５９５の構
築参照）。得られるＰＣＲフラグメント及び組込み式ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベ
クターを共にＮｃｏＩ及びＳｐｅＩにより制限処理し、アガロースゲルで精製し
、そしてライゲーションして組込み式プラスミドｐＲＩＴ１４５９７を構築した
（図３参照）。
マー０１及び０２を用いて増幅させた（１．１．１章、ｐＲＩＴ１４５９５の構
築参照）。得られるＰＣＲフラグメント及び組込み式ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベ
クターを共にＮｃｏＩ及びＳｐｅＩにより制限処理し、アガロースゲルで精製し
、そしてライゲーションして組込み式プラスミドｐＲＩＴ１４５９７を構築した
（図３参照）。
【００８１】 ｔａｔ遺伝子をＰＣＲにより、ｐＣＶ１プラスミドの誘導体から、プライマー
０５及び０４を利用して増幅させた（１．３．１章、ｐＲＩＴ１４５９６の構築
参照）： ＮｃｏＩ プライマー０５（Seq ID NO 5 ）：５′ATCGT CCATGGAGCCAGTAGATC３′
０５及び０４を利用して増幅させた（１．３．１章、ｐＲＩＴ１４５９６の構築
参照）： ＮｃｏＩ プライマー０５（Seq ID NO 5 ）：５′ATCGT CCATGGAGCCAGTAGATC３′
【００８２】 ＮｃｏＩ制限部位をＰＣＲフラグメントの５′末端に導入し、一方でＳｐｅＩ
部位をプライマー０４により３′末端に導入した。得られるＰＣＲフラグメント
及びＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯ２ベクターを共にＮｃｏＩ及びＳｐｅＩにより制限処
理し、アガロースゲルで精製し、そしてライゲーションして組込み式プラスミド
ｐＲＩＴ１４５９８で構築した。
部位をプライマー０４により３′末端に導入した。得られるＰＣＲフラグメント
及びＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯ２ベクターを共にＮｃｏＩ及びＳｐｅＩにより制限処
理し、アガロースゲルで精製し、そしてライゲーションして組込み式プラスミド
ｐＲＩＴ１４５９８で構築した。
【００８３】 ｐＲＩＴ１４５９９を構築するため、ｎｅｆ−ｔａｔ−Ｈｉｓコード配列に対
応する９１０bpのＤＮＡフラグメントをＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯ２ベクターのＥｃ
ｏＲＩ平滑末端化（Ｔ４ポリメラーゼ）とＮｃｏＩ部位との間にライゲーション
した。このｎｅｆ−ｔａｔ−ＨｉｓコードフラグメントはｐＲＩＴ１４５９６の
ＸｂａＩ平滑末端化（Ｔ４ポリメラーゼ）及びＮｃｏＩ消化物により得た。
応する９１０bpのＤＮＡフラグメントをＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯ２ベクターのＥｃ
ｏＲＩ平滑末端化（Ｔ４ポリメラーゼ）とＮｃｏＩ部位との間にライゲーション
した。このｎｅｆ−ｔａｔ−ＨｉｓコードフラグメントはｐＲＩＴ１４５９６の
ＸｂａＩ平滑末端化（Ｔ４ポリメラーゼ）及びＮｃｏＩ消化物により得た。
【００８４】 ２．２ ピチア・パストリス株ＧＳ１１５（ｈｉｓ４）の形質転換 Ｎｅｆ−Ｈｉｓ，Ｔａｔ−Ｈｉｓ及び融合体Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓを発現す
るピチア・パストリス株を得るため、株ＧＳ１１５を、対応の発現カセットと、
宿主ゲノム内のｈｉｓ４を相補するＨＩＳ４遺伝子とを担持する線形ＮｏｔＩフ
ラグメントで形質転換した。ＧＳ１１５のＮｏｔＩ−線形フラグメントによる形
質転換はＡＯＸＩ座での組換を優先する。
るピチア・パストリス株を得るため、株ＧＳ１１５を、対応の発現カセットと、
宿主ゲノム内のｈｉｓ４を相補するＨＩＳ４遺伝子とを担持する線形ＮｏｔＩフ
ラグメントで形質転換した。ＧＳ１１５のＮｏｔＩ−線形フラグメントによる形
質転換はＡＯＸＩ座での組換を優先する。
【００８５】 マルチコピー組込み式クローンを定量ドットブロット分析により選定し、そし
て組込み、挿入（Ｍｕｔ+ 表現型）又は転位（Ｍｕｔ5 表現型）のタイプを決定
した。
て組込み、挿入（Ｍｕｔ+ 表現型）又は転位（Ｍｕｔ5 表現型）のタイプを決定
した。
【００８６】 各形質転換体から、組換タンパク質について高い生産レベルを示す一の形質転
換体を選定した： ミリスチル化された２１５個のアミノ酸のタンパク質である組換Ｎｅｆ−Ｈｉ
ｓタンパク質を産生する株Ｙ１７３８（Ｍｕｔ+ 表現型）は： ・ミリスチン酸 ・ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターのＮｃｏＩクローニング部位を利用して構
築したメチオニン ・２０５ａ．ａ．のＮｅｆタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．２０６
に至る） ・クローニング手順により構築したスレオニン及びセリン（ＰＨＩＬ−Ｄ２−
ＭＯＤベクターのＳｐｅＩ部位でクローニング） ・１個のグリシン及び６個のヒスチジン から成る。
換体を選定した： ミリスチル化された２１５個のアミノ酸のタンパク質である組換Ｎｅｆ−Ｈｉ
ｓタンパク質を産生する株Ｙ１７３８（Ｍｕｔ+ 表現型）は： ・ミリスチン酸 ・ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターのＮｃｏＩクローニング部位を利用して構
築したメチオニン ・２０５ａ．ａ．のＮｅｆタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．２０６
に至る） ・クローニング手順により構築したスレオニン及びセリン（ＰＨＩＬ−Ｄ２−
ＭＯＤベクターのＳｐｅＩ部位でクローニング） ・１個のグリシン及び６個のヒスチジン から成る。
【００８７】 ９５個のアミノ酸のタンパク質であるＴａｔ−Ｈｉｓタンパク質を産生する株
Ｙ１７３９（Ｍｕｔ+ 表現型）は： ・ＮｃｏＩクローニング部位を利用して構築したメチオニン ・８５ａ．ａ．のＴａｔタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．８６に至
る） ・クローニング手順により導入したスレオニン及びセリン ・１個のグリシン及び６個のヒスチジン から成る。
Ｙ１７３９（Ｍｕｔ+ 表現型）は： ・ＮｃｏＩクローニング部位を利用して構築したメチオニン ・８５ａ．ａ．のＴａｔタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．８６に至
る） ・クローニング手順により導入したスレオニン及びセリン ・１個のグリシン及び６個のヒスチジン から成る。
【００８８】 ミリスチル化された３０２個のアミノ酸タンパク質である組換Ｎｅｆ−Ｔａｔ
−Ｈｉｓ融合タンパク質を産生する株Ｙ１７３７（Ｍｕｔs 表現型）は： ・ミリスチン酸 ・ＮｃｏＩクローニング部位を利用して構築したメチオニン ・２０５ａ．ａ．のＮｅｆタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．２０６
に至る） ・クローニング手順により構築したスレオニン及びセリン ・８５ａ．ａ．のＴａｔタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．８６に至
る） ・クローニング手順により導入されたスレオニン及びセリン ・１個のグリシン及び６個のヒスチジン から成る。
−Ｈｉｓ融合タンパク質を産生する株Ｙ１７３７（Ｍｕｔs 表現型）は： ・ミリスチン酸 ・ＮｃｏＩクローニング部位を利用して構築したメチオニン ・２０５ａ．ａ．のＮｅｆタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．２０６
に至る） ・クローニング手順により構築したスレオニン及びセリン ・８５ａ．ａ．のＴａｔタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．８６に至
る） ・クローニング手順により導入されたスレオニン及びセリン ・１個のグリシン及び６個のヒスチジン から成る。
【００８９】 ３．ピチア・パストリス内でのＨＩＶ−１ Ｔａｔ−突然変異体の発現 Ｎｅｆ−Ｔａｔ突然変異融合タンパク質と同様に、突然変異組換Ｔａｔタンパ
ク質も発現させた。この突然変異Ｔａｔタンパク質は生物学的に不活性であり、
一方でその免疫原エピトープは維持している。
ク質も発現させた。この突然変異Ｔａｔタンパク質は生物学的に不活性であり、
一方でその免疫原エピトープは維持している。
【００９０】 D.Clements（Tulane University ）により構築された二重突然変異ｔａｔ遺伝
子をこれらの構築体のために選定した。
子をこれらの構築体のために選定した。
【００９１】 このｔａｔ遺伝子（ＢＨ１０分子クローンを起源とする）は突然変異を活性部
位領域（Ｌｙｓ４１→Ａｌａ）及びＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ７８→Ｌｙｓ及びＡ
ｓｐ８０→Ｇｌｕ）において保有する（Virology 235: 48-64, 1997 ）。
位領域（Ｌｙｓ４１→Ａｌａ）及びＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ７８→Ｌｙｓ及びＡ
ｓｐ８０→Ｇｌｕ）において保有する（Virology 235: 48-64, 1997 ）。
【００９２】 突然変異ｔａｔ遺伝子に、ＣＭＶ発現プラスミド（ｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧ
Ｅ）内のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII 部位の間にサブクローニングしたｃＤＮＡ
フラグメントを付与した。
Ｅ）内のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII 部位の間にサブクローニングしたｃＤＮＡ
フラグメントを付与した。
【００９３】 ３．１ 組込み式ベクターの構築 ｐＲＩＴ１４９１２（Ｔａｔ突然変異−Ｈｉｓタンパク質をコード）及びｐＲ
ＩＴ１４９１３（融合Ｎｅｆ−Ｔａｔ突然変異−Ｈｉｓをコード） ｔａｔ突然変異遺伝子をＰＣＲにより、ｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧＥプラスミ
ドから、プライマー０５及び０４を利用して増幅させた（２．１章、ｐＲＩＴ１
４５９８の構築参照）。
ＩＴ１４９１３（融合Ｎｅｆ−Ｔａｔ突然変異−Ｈｉｓをコード） ｔａｔ突然変異遺伝子をＰＣＲにより、ｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧＥプラスミ
ドから、プライマー０５及び０４を利用して増幅させた（２．１章、ｐＲＩＴ１
４５９８の構築参照）。
【００９４】 ＮｃｏＩ制限部位をＰＣＲフラグメントの５′末端に導入し、ＳｐｅＩ部位は
プライマー０４で３′末端に導入した。得られるＰＣＲフラグメント及びＰＨＩ
Ｌ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを共にＮｃｏＩ及びＳｐｅＩにより制限処理し、アガ
ロースゲルで精製し、そしてライゲーションして組込み式プラスミドｐＲＩＴ１
４９１２を構築した。
プライマー０４で３′末端に導入した。得られるＰＣＲフラグメント及びＰＨＩ
Ｌ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを共にＮｃｏＩ及びＳｐｅＩにより制限処理し、アガ
ロースゲルで精製し、そしてライゲーションして組込み式プラスミドｐＲＩＴ１
４９１２を構築した。
【００９５】 ｐＲＩＴ１４９１３を構築するため、ｔａｔ突然変異遺伝子をＰＣＲにより、
ｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧＥプラスミドから、プライマー０３及び０４を利用し
て増幅した（１．３．１章、ｐＲＩＴ１４５９６の構築参照）。
ｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧＥプラスミドから、プライマー０３及び０４を利用し
て増幅した（１．３．１章、ｐＲＩＴ１４５９６の構築参照）。
【００９６】 得られるＰＣＲフラグメント及びプラスミドｐＲＩＴ１４５９７（Ｎｅｆ−Ｈ
ｉｓタンパク質を発現）を共にＳｐｅＩ制限酵素により消化し、アガロースゲル
で精製し、そしてライゲーションして組込み式プラスミドｐＲＩＴ１４９１３を
構築した。
ｉｓタンパク質を発現）を共にＳｐｅＩ制限酵素により消化し、アガロースゲル
で精製し、そしてライゲーションして組込み式プラスミドｐＲＩＴ１４９１３を
構築した。
【００９７】 ３．２ ピチア・パストリス株ＧＳ１１５の形質転換 Ｔａｔ突然変異−Ｈｉｓタンパク質及び融合体Ｎｅｆ−Ｔａｔ突然変異−Ｈｉ
ｓを発現するピチア・パストリスを、２．２章に前述した組込み及び組換株選定
戦略を適用することにより、得た。
ｓを発現するピチア・パストリスを、２．２章に前述した組込み及び組換株選定
戦略を適用することにより、得た。
【００９８】 ９５個のアミノ酸のタンパク質であるＴａｔ突然変異−Ｈｉｓタンパク質を産
生する２種類の組換株、Ｙ１７７５（Ｍｕｔ+ 表現型）及びＹ１７７６（Ｍｕｔ s 表現型）を選別した。
生する２種類の組換株、Ｙ１７７５（Ｍｕｔ+ 表現型）及びＹ１７７６（Ｍｕｔ s 表現型）を選別した。
【００９９】 ３０２個のアミノ酸のタンパク質であるＮｅｆ−Ｔａｔ突然変異−Ｈｉｓ融合
タンパク質を発現する一の組換株、Ｙ１７７４（Ｍｕｔ+ 表現型）を選定した。
タンパク質を発現する一の組換株、Ｙ１７７４（Ｍｕｔ+ 表現型）を選定した。
【０１００】 ４．Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質（ピチア・パストリス）の精製 精製スキームを１４６ｇの組換ピチア・パストリス細胞（湿潤重量）又は２Ｌ
のＤｙｎｏ−ｍｉｌｌホモジネートＯＤ５５から展開した。クロマトグラフィー
手順は室温で実施した。工程の間、Ｎｅｆ−Ｔａｔ陽性画分を低温室（＋４℃）
に夜間保存しておいた。長期間のためには、サンプルを−２０℃で冷凍した。
のＤｙｎｏ−ｍｉｌｌホモジネートＯＤ５５から展開した。クロマトグラフィー
手順は室温で実施した。工程の間、Ｎｅｆ−Ｔａｔ陽性画分を低温室（＋４℃）
に夜間保存しておいた。長期間のためには、サンプルを−２０℃で冷凍した。
【０１０１】 １４６ｇのピチア・パストリス細胞 ↓ ホモジナイゼーション バッファー：２Ｌ ５０mMのＰＯ4 pH７．０ 最終ＯＤ：５０ ↓ Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ破砕（４回） ↓ 遠心分離 ＪＡ１０ローター／９５００rpm ／３０min ／室温 ↓ Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌペレット ↓ 洗浄 バッファー：＋２Ｌ １０mMのＰＯ4 pH７．５−１５ （１ｈ−４℃） ０mMのＮａＣｌ−０．５％のエンピジェン ↓ 遠心分離 ＪＡ１０ローター／９５００rpm ／３０min ／室温 ↓ ペレット
【０１０２】 ↓ 可溶化 バッファー：＋６６０mlの１０mMのＰＯ4 pH７．５− （Ｏ／Ｎ−４℃） １５０mMのＮａＣｌ−４．０ＭのＧｕＨＣｌ ↓ 還元 ＋０．２Ｍの２−メルカプトエタンスルホン酸、ナト （４Ｈ−室温−暗所） リウム塩（粉末添加）／pHインキュベーション前に７ ．５に調整（０．５ＭのＮａＯＨ溶液で） ↓ カルボキシメチル化 ＋０．２５Ｍのヨードアセトアミド（粉末添加）／pH
（１／２ｈ−室温−暗所）インキュベーション前に７．５に調整（０．５ＭのＮ ａＯＨ溶液で） ↓ Ｎｉ++−ＮＴＡ−アガ 平衡バッファー：１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５０mM
ロース（Qiagen−３０ のＮａＣｌ−４．０ＭのＧｕＨＣｌ mlの樹脂）上での固定 洗浄バッファー：１）平衡バッファー 化金属イオンアフィニ ２）１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５
ティークロマトグラフ ０mMのＮａＣｌ−６Ｍの尿素 ィー ３）１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５ ０mMのＮａＣｌ−６Ｍの尿素−２５mMのイミダゾール 溶出バッファー：１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５０mM のＮａＣｌ−６Ｍの尿素−０．５Ｍのイミダゾール
（１／２ｈ−室温−暗所）インキュベーション前に７．５に調整（０．５ＭのＮ ａＯＨ溶液で） ↓ Ｎｉ++−ＮＴＡ−アガ 平衡バッファー：１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５０mM
ロース（Qiagen−３０ のＮａＣｌ−４．０ＭのＧｕＨＣｌ mlの樹脂）上での固定 洗浄バッファー：１）平衡バッファー 化金属イオンアフィニ ２）１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５
ティークロマトグラフ ０mMのＮａＣｌ−６Ｍの尿素 ィー ３）１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５ ０mMのＮａＣｌ−６Ｍの尿素−２５mMのイミダゾール 溶出バッファー：１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５０mM のＮａＣｌ−６Ｍの尿素−０．５Ｍのイミダゾール
【０１０３】 ↓ 希釈 １８mS／cm2 のイオン強度にまで下げる 希釈バッファー：１０mMのＰＯ4 pH７．５−６Ｍの尿 素 ↓ SP Sepharose FF 上で 平衡バッファー：１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５０mM
の陽イオン交換クロマ のＮａＣｌ−６．０Ｍの尿素 トグラフィー 洗浄バッファー：１）平衡バッファー （Pharmacia −３０ml ２）１０mMのＰＯ4 pH７．５−２５
の樹脂） ０mMのＮａＣｌ−６Ｍの尿素 溶出バッファー：１０mMの硼酸塩pH９．０−２ＭのＮ ａＣｌ−６Ｍの尿素 ↓ 濃縮 ５mg／mlに至る １０kDa Ｏｍｅｇａ膜（Filtron ） ↓ Superdex200 XK上での 溶出バッファー：１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５０mM
ゲル濾過クロマトグラ のＮａＣｌ−６Ｍの尿素 フィー１６／６０ ５mlのサンプル／インジェクション→５回インジェク
（Pharmacia −１２０ ション mlの樹脂） ↓ 透析 バッファー：１０mMのＰＯ4 pH６．８−１５０mMのＮ （Ｏ／Ｎ−４℃） ａＣｌ−０．５Ｍのアルギニン* ↓ 無菌濾過 Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ ０．２２μｍ* 比：１６００μｇ／mlのタンパク質濃度に対して０．５Ｍのアルギニン
の陽イオン交換クロマ のＮａＣｌ−６．０Ｍの尿素 トグラフィー 洗浄バッファー：１）平衡バッファー （Pharmacia −３０ml ２）１０mMのＰＯ4 pH７．５−２５
の樹脂） ０mMのＮａＣｌ−６Ｍの尿素 溶出バッファー：１０mMの硼酸塩pH９．０−２ＭのＮ ａＣｌ−６Ｍの尿素 ↓ 濃縮 ５mg／mlに至る １０kDa Ｏｍｅｇａ膜（Filtron ） ↓ Superdex200 XK上での 溶出バッファー：１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５０mM
ゲル濾過クロマトグラ のＮａＣｌ−６Ｍの尿素 フィー１６／６０ ５mlのサンプル／インジェクション→５回インジェク
（Pharmacia −１２０ ション mlの樹脂） ↓ 透析 バッファー：１０mMのＰＯ4 pH６．８−１５０mMのＮ （Ｏ／Ｎ−４℃） ａＣｌ−０．５Ｍのアルギニン* ↓ 無菌濾過 Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ ０．２２μｍ* 比：１６００μｇ／mlのタンパク質濃度に対して０．５Ｍのアルギニン
【０１０４】 純度 ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより推定する純度のレベルを図４でダイイチ銀染色により
、そして図５でクマジーブルーＧ２５０により示す。 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００工程の後：＞９５％ 透析及び無菌濾過工程の後：＞９５％
、そして図５でクマジーブルーＧ２５０により示す。 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００工程の後：＞９５％ 透析及び無菌濾過工程の後：＞９５％
【０１０５】 回収率 ５１mgのＮｅｆ−Ｔａｔ−ｈｉｓタンパク質が１４６ｇの組換ピチア・パスト
リス細胞（＝２ＬのＤｙｎｏ−ｍｉｌｌホモジネートＯＤ５５）から精製された
。
リス細胞（＝２ＬのＤｙｎｏ−ｍｉｌｌホモジネートＯＤ５５）から精製された
。
【０１０６】 ５．ワクチン製剤 本発明に従って調製したワクチンは実施例１及び２に例示する抗原をコードす
るＤＮＡ組換体の発現生成物、並びにアジュバントとして、油／水エマルション
中の３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ ３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１の混
合物を含んで成る配合物を含んで成る。
るＤＮＡ組換体の発現生成物、並びにアジュバントとして、油／水エマルション
中の３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ ３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１の混
合物を含んで成る配合物を含んで成る。
【０１０７】 ３Ｄ−ＭＰＬはグラム陰性菌サルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）
のリポ多糖（ＬＰＳ）の化学的に解毒した形態である。
のリポ多糖（ＬＰＳ）の化学的に解毒した形態である。
【０１０８】 Smith Kline Beecham Biologicals で行った実験は、様々なビヒクルと組合せ
た３Ｄ−ＭＰＬが体液及びＴＨ１型細胞免疫の双方を非常に高めることを示した
。
た３Ｄ−ＭＰＬが体液及びＴＨ１型細胞免疫の双方を非常に高めることを示した
。
【０１０９】 ＱＳ２１はキラジャ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina ）樹
木の樹皮の粗エキスから精製した一種のサポニンであり、これは強力なアジュバ
ント活性を有する：これは抗原特異的リンパ増殖及びいくつかの抗原に対するＣ
ＴＬの双方を活性化する。Smith Kline Beecham Biologicals で実施した実験は
体液及びＴＨ１型細胞免疫応答の双方の誘導における３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１
の組合せの明確な相乗効果を示した。
木の樹皮の粗エキスから精製した一種のサポニンであり、これは強力なアジュバ
ント活性を有する：これは抗原特異的リンパ増殖及びいくつかの抗原に対するＣ
ＴＬの双方を活性化する。Smith Kline Beecham Biologicals で実施した実験は
体液及びＴＨ１型細胞免疫応答の双方の誘導における３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１
の組合せの明確な相乗効果を示した。
【０１１０】 油／水エマルションは２種類の油（トコフェロール及びスクワレン）並びに乳
化剤としてＴｗｅｅｎ８０を含むＰＢＳから成る。このエマルションは５％のス
クワレン、５％のトコフェロール、０．４％のＴｗｅｅｎ８０を含んで成り、そ
して１８０nmの平均粒径を有する（ＷＯ９５／１７２１０参照）。
化剤としてＴｗｅｅｎ８０を含むＰＢＳから成る。このエマルションは５％のス
クワレン、５％のトコフェロール、０．４％のＴｗｅｅｎ８０を含んで成り、そ
して１８０nmの平均粒径を有する（ＷＯ９５／１７２１０参照）。
【０１１１】 Smith Kline Beecham Biologicals で実施した実験は、３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２
１に対するこのＯ／Ｗエマルションの付加がその免疫刺激特性を更に強めること
を実証した。
１に対するこのＯ／Ｗエマルションの付加がその免疫刺激特性を更に強めること
を実証した。
【０１１２】 油／水エマルションの調製（２倍濃縮物） Ｔｗｅｅｎ８０をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶かし、ＰＢＳ中の２％の溶
液にした。１００mlの２倍濃縮エマルションを供するため、５ｇのＤＬアルファ
トコフェロール及び５mlのスクワレンをボルテックスにかけてよく混合する。９
０mlのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液を加え、そしてよく混合する。得られるエマルシ
ョンをシリンジに通し、そして最後にＭ１１０Ｓマイクロ流動装置を用いてマイ
クロ流動化した。得られる油滴は約１８０nmのサイズを有していた。
液にした。１００mlの２倍濃縮エマルションを供するため、５ｇのＤＬアルファ
トコフェロール及び５mlのスクワレンをボルテックスにかけてよく混合する。９
０mlのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液を加え、そしてよく混合する。得られるエマルシ
ョンをシリンジに通し、そして最後にＭ１１０Ｓマイクロ流動装置を用いてマイ
クロ流動化した。得られる油滴は約１８０nmのサイズを有していた。
【０１１３】 水中油製剤の調製 実施例１又は２に従って調製した抗原（５μｇ）を１０倍濃縮ＰＢＳ pH６．
８及びＨ2 Ｏに希釈し、そしてＳＢ６２，３Ｄ−ＭＰＬ（５μｇ），ＱＳ２１（
５μｇ）及び保存剤としての５０μｇ／mlのチオメルサールを５分間隔で順々に
添加した。エマルションの容量は総容量の５０％に相当させた（１００μｌの用
量のために５０μｌ）。
８及びＨ2 Ｏに希釈し、そしてＳＢ６２，３Ｄ−ＭＰＬ（５μｇ），ＱＳ２１（
５μｇ）及び保存剤としての５０μｇ／mlのチオメルサールを５分間隔で順々に
添加した。エマルションの容量は総容量の５０％に相当させた（１００μｌの用
量のために５０μｌ）。
【０１１４】 インキュベーションは全て撹拌しながら室温で実施した。
【０１１５】 げっ歯動物でのＴａｔ及びＮｅｆ−Ｔａｔの免疫原性 Ｔａｔ及びＮｅｆＴａｔによる免疫を経て誘導される免疫応答の特性決定を実
施した。アイソタイププロフィール及び細胞媒介免疫（ＣＭ１）についての情報
を得るため、マウスで２通りの免疫実験を実施した。第一の実験では、マウスに
２回、２週間あけて酸化又は還元型のＴａｔ又はＮｅｆＴａｔそれぞれで肉趾に
免疫を施した。抗原をスクワレン、Ｔｗｅｅｎ８０（商標）（ポリオキシエチレ
ンソルビタンモノオレエート）、ＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ及びα−トコフェロー
ルを含んで成る水中油エマルションに配合し、そしてコントロールグループにア
ジュバントのみを与えた。最後の免疫の２週間後、血清を獲得し、そして抗体力
価及びアイソタイプの決定のためにＴａｔ特異的ＥＬＩＳＡ（コーティングのた
めに還元Ｔａｔ使用）にかけた（図６ａ）。抗体力価は酸化型Ｔａｔを受容した
マウスにおいて最高であった。一般に、酸化型分子は還元型よりも高い抗体力価
を誘導し、そしてＴａｔ単独はＮｅｆＴａｔよりも高い抗体力価を誘導した。こ
の観察は第二の実験で確認された。最も興味深いことには、Ｔａｔ特異的抗体の
アイソタイププロフィールが免疫のために利用した抗原に依存して相違した。Ｔ
ａｔのみはバランスのとれたＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａプロフィールを誘引し、Ｎ
ｅｆＴａｔははるかに強いＴH2片寄りを誘導した（図６ｂ）。これも第二の実験
で確認された。
施した。アイソタイププロフィール及び細胞媒介免疫（ＣＭ１）についての情報
を得るため、マウスで２通りの免疫実験を実施した。第一の実験では、マウスに
２回、２週間あけて酸化又は還元型のＴａｔ又はＮｅｆＴａｔそれぞれで肉趾に
免疫を施した。抗原をスクワレン、Ｔｗｅｅｎ８０（商標）（ポリオキシエチレ
ンソルビタンモノオレエート）、ＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ及びα−トコフェロー
ルを含んで成る水中油エマルションに配合し、そしてコントロールグループにア
ジュバントのみを与えた。最後の免疫の２週間後、血清を獲得し、そして抗体力
価及びアイソタイプの決定のためにＴａｔ特異的ＥＬＩＳＡ（コーティングのた
めに還元Ｔａｔ使用）にかけた（図６ａ）。抗体力価は酸化型Ｔａｔを受容した
マウスにおいて最高であった。一般に、酸化型分子は還元型よりも高い抗体力価
を誘導し、そしてＴａｔ単独はＮｅｆＴａｔよりも高い抗体力価を誘導した。こ
の観察は第二の実験で確認された。最も興味深いことには、Ｔａｔ特異的抗体の
アイソタイププロフィールが免疫のために利用した抗原に依存して相違した。Ｔ
ａｔのみはバランスのとれたＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａプロフィールを誘引し、Ｎ
ｅｆＴａｔははるかに強いＴH2片寄りを誘導した（図６ｂ）。これも第二の実験
で確認された。
【０１１６】 第二のマウス実験では、動物に還元型の分子のみ、又はアジュバントのみを与
えた。血清学分析の他（上記参照）、リンパ節細胞からのリンパ増殖応答を評価
した。Ｔａｔ又はＮｅｆＴａｔによるｉｎ ｖｉｔｒｏでのかかる細胞の再刺激
の後、3 Ｈ−チミジン組込みを４日間の培養の後に測定した。刺激指数としての
結果の紹介は、抗体を受容したマウスの双方のグループにおいて非常に強い応答
が誘導されたことを示す（図７）。
えた。血清学分析の他（上記参照）、リンパ節細胞からのリンパ増殖応答を評価
した。Ｔａｔ又はＮｅｆＴａｔによるｉｎ ｖｉｔｒｏでのかかる細胞の再刺激
の後、3 Ｈ−チミジン組込みを４日間の培養の後に測定した。刺激指数としての
結果の紹介は、抗体を受容したマウスの双方のグループにおいて非常に強い応答
が誘導されたことを示す（図７）。
【０１１７】 まとめると、マウス研究はＴａｔ及びＮｅｆ−Ｔａｔが極めて免疫原性の候補
ワクチン抗原であることを示唆する。２種類の分子に対して特異的な応答は５０
％以上のＩｇＧ１を有する高い抗体応答を特徴とする。更に、強力なＣＭＩ応答
（リンパ増殖により測定）が観察された。
ワクチン抗原であることを示唆する。２種類の分子に対して特異的な応答は５０
％以上のＩｇＧ１を有する高い抗体応答を特徴とする。更に、強力なＣＭＩ応答
（リンパ増殖により測定）が観察された。
【０１１８】 ７．Ｔａｔ及びＮｅｆ−Ｔａｔタンパク質の機能特性 酸化型又は還元型のＴａｔ及びＮｅｆＴａｔ分子をヒトＴ細胞系に結合するそ
の能力について調べた。更に、かかる細胞系の増殖に対する作用を評価した。Ｅ
ＬＩＳＡプレートに一夜、様々な濃度のＴａｔ及びＮｅｆＴａｔタンパク質、II
型ヘルペス単純ウィルス由来の異常ｇＤ、又はバッファーコントロールのみをコ
ーティングした。コーティング溶液の除去の後、ＨＵＴ−７８細胞をウェルに加
えた。２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、そしてウェルの底に対
する細胞の結合を顕微鏡で評価した。定量手段として、細胞をトルイジンブルー
で染色し、ＳＤＳにより溶解し、そして上清液中のトルイジンブルー濃度をＥＬ
ＩＳＡプレートリーダーで測定した。それらの結果は、４種類のタンパク質全て
、即ち、酸化型又は還元型のＴａｔ及びＮｅｆＴａｔが細胞のＥＬＩＳＡプレー
トに対する結合を媒介することを示唆した（図８）。異常タンパク質（データー
は示さず）及びバッファーは細胞を固定しなかった。このことは、組換発現Ｔａ
ｔ含有タンパク質がヒトＴ細胞系に特異的に結合することを示唆した。
の能力について調べた。更に、かかる細胞系の増殖に対する作用を評価した。Ｅ
ＬＩＳＡプレートに一夜、様々な濃度のＴａｔ及びＮｅｆＴａｔタンパク質、II
型ヘルペス単純ウィルス由来の異常ｇＤ、又はバッファーコントロールのみをコ
ーティングした。コーティング溶液の除去の後、ＨＵＴ−７８細胞をウェルに加
えた。２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、そしてウェルの底に対
する細胞の結合を顕微鏡で評価した。定量手段として、細胞をトルイジンブルー
で染色し、ＳＤＳにより溶解し、そして上清液中のトルイジンブルー濃度をＥＬ
ＩＳＡプレートリーダーで測定した。それらの結果は、４種類のタンパク質全て
、即ち、酸化型又は還元型のＴａｔ及びＮｅｆＴａｔが細胞のＥＬＩＳＡプレー
トに対する結合を媒介することを示唆した（図８）。異常タンパク質（データー
は示さず）及びバッファーは細胞を固定しなかった。このことは、組換発現Ｔａ
ｔ含有タンパク質がヒトＴ細胞系に特異的に結合することを示唆した。
【０１１９】 第二の実験において、ＨＵＴ細胞をタンパク質と１６時間接触させたままにし
た。インキュベーション期間の終了時に、細胞を〔3 Ｈ〕−チミジンでラベルし
、そして組込み速度を細胞増殖の尺度として測定した。このアッセイに含ませた
４種のタンパク質全てが放射活性組込みの消失の判定に従い、細胞増殖を阻害し
た（図９）。バッファーコントロールはこの効果を媒介しなかった。これらの結
果は、組換Ｔａｔ含有タンパク質がヒトＴ細胞系の増殖を阻害できることを示し
た。
た。インキュベーション期間の終了時に、細胞を〔3 Ｈ〕−チミジンでラベルし
、そして組込み速度を細胞増殖の尺度として測定した。このアッセイに含ませた
４種のタンパク質全てが放射活性組込みの消失の判定に従い、細胞増殖を阻害し
た（図９）。バッファーコントロールはこの効果を媒介しなかった。これらの結
果は、組換Ｔａｔ含有タンパク質がヒトＴ細胞系の増殖を阻害できることを示し
た。
【０１２０】 まとめると、Ｔａｔ及びＮｅｆＴａｔタンパク質の機能特性決定は、これらの
タンパク質がヒトＴ細胞系に結合できることを示した。更に、これらのタンパク
質はかかる細胞系の増殖を阻害できる。
タンパク質がヒトＴ細胞系に結合できることを示した。更に、これらのタンパク
質はかかる細胞系の増殖を阻害できる。
【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年３月２７日（２０００．３．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項３１】 前記水中油エマルションがスクワレン、ポリオキシエチレ
ンソルビタンモノオレエート及びα−トコフェロールを含んで成る、請求項３０
記載の組成物。
ンソルビタンモノオレエート及びα−トコフェロールを含んで成る、請求項３０
記載の組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１２月１３日（２０００．１２．１３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】 本発明に従うと、以下を含んで成るタンパク質が提供される： （ａ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしく
はその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘
導体；又は （ｂ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしく
はその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘
導体；又は （ｃ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体及び融合パートナーに連
結されたＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体。
はその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘
導体；又は （ｂ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしく
はその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘
導体；又は （ｃ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体及び融合パートナーに連
結されたＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００７】 融合パートナーとは、Ｔａｔ又はＮｅｆではない任意のタンパク質配列を意味
する。好ましくは、融合パートナーはヘモフィルス・インフレンザＢに由来する
タンパク質Ｄ又はその脂質付加誘導体リポタンパク質Ｄである。特に、Ｎ末端側
の１／３、即ち、およそ最初の１００〜１３０個のアミノ酸が利用される。ここ
ではそれをＬｉｐｏ Ｄ １／３と称する。本発明の好適な態様において、Ｎｅ
ｆタンパク質又はその誘導体はＴａｔタンパク質又はその誘導体に連結されてい
てよい。かかるＮｅｆ−Ｔａｔ融合体は任意的に融合パートナー、例えばタンパ
ク質Ｄにも連結されていてよい。
する。好ましくは、融合パートナーはヘモフィルス・インフレンザＢに由来する
タンパク質Ｄ又はその脂質付加誘導体リポタンパク質Ｄである。特に、Ｎ末端側
の１／３、即ち、およそ最初の１００〜１３０個のアミノ酸が利用される。ここ
ではそれをＬｉｐｏ Ｄ １／３と称する。本発明の好適な態様において、Ｎｅ
ｆタンパク質又はその誘導体はＴａｔタンパク質又はその誘導体に連結されてい
てよい。かかるＮｅｆ−Ｔａｔ融合体は任意的に融合パートナー、例えばタンパ
ク質Ｄにも連結されていてよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８２】 ＮｃｏＩ制限部位をＰＣＲフラグメントの５′末端に導入し、一方でＳｐｅＩ
部位をプライマー０４により３′末端に導入した。得られるＰＣＲフラグメント
及びＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを共にＮｃｏＩ及びＳｐｅＩにより制限処
理し、アガロースゲルで精製し、そしてライゲーションして組込み式プラスミド
ｐＲＩＴ１４５９８で構築した。
部位をプライマー０４により３′末端に導入した。得られるＰＣＲフラグメント
及びＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを共にＮｃｏＩ及びＳｐｅＩにより制限処
理し、アガロースゲルで精製し、そしてライゲーションして組込み式プラスミド
ｐＲＩＴ１４５９８で構築した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８３】 ｐＲＩＴ１４５９９を構築するため、ｎｅｆ−ｔａｔ−Ｈｉｓコード配列に対
応する９１０bpのＤＮＡフラグメントをＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターのＥｃ
ｏＲＩ平滑末端化（Ｔ４ポリメラーゼ）とＮｃｏＩ部位との間にライゲーション
した。このｎｅｆ−ｔａｔ−ＨｉｓコードフラグメントはｐＲＩＴ１４５９６の
ＸｂａＩ平滑末端化（Ｔ４ポリメラーゼ）及びＮｃｏＩ消化物により得た。
応する９１０bpのＤＮＡフラグメントをＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターのＥｃ
ｏＲＩ平滑末端化（Ｔ４ポリメラーゼ）とＮｃｏＩ部位との間にライゲーション
した。このｎｅｆ−ｔａｔ−ＨｉｓコードフラグメントはｐＲＩＴ１４５９６の
ＸｂａＩ平滑末端化（Ｔ４ポリメラーゼ）及びＮｃｏＩ消化物により得た。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１８】 ７．Ｔａｔ及びＮｅｆ−Ｔａｔタンパク質の機能特性 酸化型又は還元型のＴａｔ及びＮｅｆＴａｔ分子をヒトＴ細胞系に結合するそ
の能力について調べた。更に、かかる細胞系の増殖に対する作用を評価した。Ｅ
ＬＩＳＡプレートに一夜、様々な濃度のＴａｔ及びＮｅｆＴａｔタンパク質、II
型ヘルペス単純ウィルス由来の無関係ｇＤ、又はバッファーコントロールのみを
コーティングした。コーティング溶液の除去の後、ＨＵＴ−７８細胞をウェルに
加えた。２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、そしてウェルの底に
対する細胞の結合を顕微鏡で評価した。定量手段として、細胞をトルイジンブル
ーで染色し、ＳＤＳにより溶解し、そして上清液中のトルイジンブルー濃度をＥ
ＬＩＳＡプレートリーダーで測定した。それらの結果は、４種類のタンパク質全
て、即ち、酸化型又は還元型のＴａｔ及びＮｅｆＴａｔが細胞のＥＬＩＳＡプレ
ートに対する結合を媒介することを示唆した（図８）。無関係タンパク質（デー
ターは示さず）及びバッファーは細胞を固定しなかった。このことは、組換発現
Ｔａｔ含有タンパク質がヒトＴ細胞系に特異的に結合することを示唆した。
の能力について調べた。更に、かかる細胞系の増殖に対する作用を評価した。Ｅ
ＬＩＳＡプレートに一夜、様々な濃度のＴａｔ及びＮｅｆＴａｔタンパク質、II
型ヘルペス単純ウィルス由来の無関係ｇＤ、又はバッファーコントロールのみを
コーティングした。コーティング溶液の除去の後、ＨＵＴ−７８細胞をウェルに
加えた。２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、そしてウェルの底に
対する細胞の結合を顕微鏡で評価した。定量手段として、細胞をトルイジンブル
ーで染色し、ＳＤＳにより溶解し、そして上清液中のトルイジンブルー濃度をＥ
ＬＩＳＡプレートリーダーで測定した。それらの結果は、４種類のタンパク質全
て、即ち、酸化型又は還元型のＴａｔ及びＮｅｆＴａｔが細胞のＥＬＩＳＡプレ
ートに対する結合を媒介することを示唆した（図８）。無関係タンパク質（デー
ターは示さず）及びバッファーは細胞を固定しなかった。このことは、組換発現
Ｔａｔ含有タンパク質がヒトＴ細胞系に特異的に結合することを示唆した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１９】 第二の実験において、ＨＵＴ−７８細胞をタンパク質と１６時間接触させたま
まにした。インキュベーション期間の終了時に、細胞を〔3 Ｈ〕−チミジンでラ
ベルし、そして組込み速度を細胞増殖の尺度として測定した。このアッセイに含
ませた４種のタンパク質全てが放射活性組込みの消失の判定に従い、細胞増殖を
阻害した（図９）。バッファーコントロールはこの効果を媒介しなかった。これ
らの結果は、組換Ｔａｔ含有タンパク質がヒトＴ細胞系の増殖を阻害できること
を示した。 （訂正理由１） 誤訳訂正ではないが、ＰＣＴ３４条補正の翻訳文の請求項１における「Ｎｅｔ
タンパク質」は『Ｎｅｆタンパク質』の誤記であるので、訂正する。 （訂正理由２） 国際出願日における明細書の原文第１頁第２９行の翻訳に誤訳があったので訂
正する。原文には「ＨＩＶ Ｎｅｆ」と記載してあるところ、「ＨＩＶ Ｎｅｔ
」と誤訳した。 （訂正理由３） 国際出願日における明細書の原文第２頁第４行の翻訳に誤訳があったので訂正
する。原文には「Ｎｅｆ−Ｔａｔ ｆｕｓｉｏｎｓ」と記載してあるところ、「
Ｎｅｆ−Ｔａｔタンパク質」と誤訳した。 （訂正理由４） 国際出願日における明細書の原文第１６頁第３行の翻訳に誤訳があったので訂
正する。原文には「ＭＯＤ」と記載してあるところ、「ＭＯ２」と誤訳した。 （訂正理由５） 国際出願日における明細書の原文第１６頁第７行の翻訳に誤訳があったので訂
正する。原文には「ＭＯＤ」と記載してあるところ、「ＭＯ２」と誤訳した。 （訂正理由６） 国際出願日における明細書の原文第２６頁第２行及び第１０行の翻訳に誤訳が
あったので訂正する。原文には「ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ」と記載してあり、「無
関係」を意味するが、「異常」と誤訳した。 （訂正理由７） 国際出願日における明細書の原文第２６頁第１４行の翻訳に誤訳があったので
訂正する。原文には「ＨＵＴ−７８」と記載してあるところ、「−７８」の記載
が翻訳文において脱落した。
まにした。インキュベーション期間の終了時に、細胞を〔3 Ｈ〕−チミジンでラ
ベルし、そして組込み速度を細胞増殖の尺度として測定した。このアッセイに含
ませた４種のタンパク質全てが放射活性組込みの消失の判定に従い、細胞増殖を
阻害した（図９）。バッファーコントロールはこの効果を媒介しなかった。これ
らの結果は、組換Ｔａｔ含有タンパク質がヒトＴ細胞系の増殖を阻害できること
を示した。 （訂正理由１） 誤訳訂正ではないが、ＰＣＴ３４条補正の翻訳文の請求項１における「Ｎｅｔ
タンパク質」は『Ｎｅｆタンパク質』の誤記であるので、訂正する。 （訂正理由２） 国際出願日における明細書の原文第１頁第２９行の翻訳に誤訳があったので訂
正する。原文には「ＨＩＶ Ｎｅｆ」と記載してあるところ、「ＨＩＶ Ｎｅｔ
」と誤訳した。 （訂正理由３） 国際出願日における明細書の原文第２頁第４行の翻訳に誤訳があったので訂正
する。原文には「Ｎｅｆ−Ｔａｔ ｆｕｓｉｏｎｓ」と記載してあるところ、「
Ｎｅｆ−Ｔａｔタンパク質」と誤訳した。 （訂正理由４） 国際出願日における明細書の原文第１６頁第３行の翻訳に誤訳があったので訂
正する。原文には「ＭＯＤ」と記載してあるところ、「ＭＯ２」と誤訳した。 （訂正理由５） 国際出願日における明細書の原文第１６頁第７行の翻訳に誤訳があったので訂
正する。原文には「ＭＯＤ」と記載してあるところ、「ＭＯ２」と誤訳した。 （訂正理由６） 国際出願日における明細書の原文第２６頁第２行及び第１０行の翻訳に誤訳が
あったので訂正する。原文には「ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ」と記載してあり、「無
関係」を意味するが、「異常」と誤訳した。 （訂正理由７） 国際出願日における明細書の原文第２６頁第１４行の翻訳に誤訳があったので
訂正する。原文には「ＨＵＴ−７８」と記載してあるところ、「−７８」の記載
が翻訳文において脱落した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ゴダール，ステファーヌ アンドレ ジョ ルジュ ベルギー国，ベ−1330 リクサンサール, リュ ドゥ ランスティテュ 89，スミス クライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (72)発明者 マルシャン，マルティーヌ ベルギー国，ベ−1330 リクサンサール, リュ ドゥ ランスティテュ 89，スミス クライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA14 BA80 CA07 DA06 DA12 EA04 GA11 4B064 AG01 CA19 CC24 DA03 DA15 4B065 AA26X AA77X AA95Y AA97Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA45 4C085 AA32 BA65 FF14 FF17 FF18 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA05 EA31 FA72 FA74
Claims (24)
- 【請求項１】 タンパク質であって （ａ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくは
その誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導
体；又は （ｂ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくは
その誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導
体；又は （ｃ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体及び融合パートナーに連結
されたＨＩＶ Ｎｅｔタンパク質もしくはその誘導体； を含んで成るタンパク質。 - 【請求項２】 Ｔａｔ−Ｎｅｆ融合タンパク質又はその誘導体である、請求
項１記載のタンパク質。 - 【請求項３】 Ｎｅｆ−Ｔａｔ融合タンパク質又はその誘導体である、請求
項１記載のタンパク質。 - 【請求項４】 前記Ｔａｔタンパク質の誘導体が突然変異Ｔａｔタンパク質
である、請求項１記載のタンパク質。 - 【請求項５】 前記Ｎｅｆタンパク質の誘導体が突然変異Ｎｅｆタンパク質
である、請求項１記載のタンパク質。 - 【請求項６】 前記融合パートナーがリポタンパク質又はその誘導体である
、請求項１〜５のいずれか１項記載のタンパク質。 - 【請求項７】 前記リポタンパク質がヘモフィルス・インフレンザ（Haemop
hilus Influenza ）Ｂのタンパク質Ｄ又はその誘導体である、請求項６記載のタ
ンパク質。 - 【請求項８】 前記融合パートナーがヘモフィルス・インフレンザＢのタン
パク質ＤのＮ末端由来の１００〜１３０個のアミノ酸を含んで成る、請求項７記
載のタンパク質。 - 【請求項９】 前記Ｔａｔタンパク質が全長Ｔａｔタンパク質である、請求
項１〜８のいずれか１項記載のタンパク質。 - 【請求項１０】 前記Ｎｅｆタンパク質が全長Ｎｅｆタンパク質である、請
求項１〜８のいずれか１項記載のタンパク質。 - 【請求項１１】 前記Ｔａｔタンパク質がＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質及び融
合パートナーに融合されている、請求項１〜１０のいずれか１項記載のタンパク
質。 - 【請求項１２】 前記タンパク質がヒスチジンテールを有する、請求項１〜
１１のいずれか１項記載のタンパク質。 - 【請求項１３】 請求項１〜１２のいずれか１項記載のタンパク質をコード
する核酸。 - 【請求項１４】 請求項１３記載の核酸で形質転換された宿主。
- 【請求項１５】 前記宿主がピチア・パストリス（Pichia pastoris ）又は
Ｅ．コリ（E. coli ）のいずれかである、請求項１４記載の宿主。 - 【請求項１６】 医薬的に許容される賦形剤との混合における、請求項１〜
１２のいずれか１項記載のタンパク質を含んで成るワクチン。 - 【請求項１７】 アジュバントを更に含んで成る、請求項１６記載のワクチ
ン。 - 【請求項１８】 前記アジュバントがＴＨ１誘導アジュバントである、請求
項１７記載のワクチン。 - 【請求項１９】 アジュバントがモノホスホリル脂質Ａ又はその誘導体、例
えば３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａを含んで成る、請求項１７又は１
８記載のワクチン。 - 【請求項２０】 サポニンアジュバントを更に含んで成る、請求項１６〜１
９のいずれか１項記載のワクチン。 - 【請求項２１】 請求項１〜１２のいずれか１項記載のタンパク質を製造す
る方法であって、宿主を前記タンパク質をコードする核酸で形質転換し、前記タ
ンパク質を発現させ、そして当該タンパク質を回収する工程を含んで成る方法。 - 【請求項２２】 前記宿主がＥ．コリ又はピチア・パストリスである、請求
項２１記載の方法。 - 【請求項２３】 請求項１〜１２のいずれか１項記載のタンパク質を医薬的
に許容される希釈剤と混合することを含んで成る、請求項１６〜２０のいずれか
１項記載のワクチンの製造方法。 - 【請求項２４】 （ｉ）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体、又
は（ii）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体をピチア・パストリス内
で製造する方法であって、ピチア・パストリスを前記ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質
もしくはその誘導体又はＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体をコード
するＤＮＡで形質転換し、前記タンパク質を発現させ、そしてこのタンパク質を
回収する工程を含んで成る方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9720585.0 | 1997-09-26 | ||
| GBGB9720585.0A GB9720585D0 (en) | 1997-09-26 | 1997-09-26 | Vaccine |
| PCT/EP1998/006040 WO1999016884A1 (en) | 1997-09-26 | 1998-09-17 | Fusion proteins comprising hiv-1 tat and/or nef proteins |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009155916A Division JP2009213492A (ja) | 1997-09-26 | 2009-06-30 | Ｈｉｖ−１ｔａｔ及び／又はｎｅｆタンパク質を含んで成る融合タンパク質 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001518300A true JP2001518300A (ja) | 2001-10-16 |
Family
ID=10819735
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000513953A Withdrawn JP2001518300A (ja) | 1997-09-26 | 1998-09-17 | Ｈｉｖ−１ｔａｔ及び／又はｎｅｆタンパク質を含んで成る融合タンパク質 |
| JP2009155916A Pending JP2009213492A (ja) | 1997-09-26 | 2009-06-30 | Ｈｉｖ−１ｔａｔ及び／又はｎｅｆタンパク質を含んで成る融合タンパク質 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009155916A Pending JP2009213492A (ja) | 1997-09-26 | 2009-06-30 | Ｈｉｖ−１ｔａｔ及び／又はｎｅｆタンパク質を含んで成る融合タンパク質 |
Country Status (27)
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|---|---|
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| JP (2) | JP2001518300A (ja) |
| KR (1) | KR100554487B1 (ja) |
| CN (1) | CN1188519C (ja) |
| AR (2) | AR017147A1 (ja) |
| AT (1) | ATE338128T1 (ja) |
| AU (1) | AU746564B2 (ja) |
| BR (1) | BR9812547A (ja) |
| CA (1) | CA2305013C (ja) |
| CO (1) | CO4810339A1 (ja) |
| CZ (1) | CZ302878B6 (ja) |
| DE (1) | DE69835756T3 (ja) |
| DK (1) | DK1015596T4 (ja) |
| ES (1) | ES2272012T5 (ja) |
| GB (1) | GB9720585D0 (ja) |
| HU (1) | HUP0004896A3 (ja) |
| IL (1) | IL135102A0 (ja) |
| NO (2) | NO328824B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ503482A (ja) |
| PL (1) | PL195243B1 (ja) |
| PT (1) | PT1015596E (ja) |
| SA (1) | SA98190877B1 (ja) |
| SI (1) | SI1015596T2 (ja) |
| TR (1) | TR200000864T2 (ja) |
| TW (1) | TW499436B (ja) |
| WO (1) | WO1999016884A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA988789B (ja) |
Cited By (11)
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|---|---|---|---|---|
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| US12250943B2 (en) | 2019-04-08 | 2025-03-18 | Htyr Acquisition Llc | Compositions and methods for the cryopreservation of immune cells |
| US12370217B2 (en) | 2019-05-14 | 2025-07-29 | Htyr Acquisition Llc | Compositions and methods for treating T cell exhaustion |
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|---|---|---|---|---|
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| GB9720585D0 (en) * | 1997-09-26 | 1997-11-26 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| GB9820525D0 (en) | 1998-09-21 | 1998-11-11 | Allergy Therapeutics Ltd | Formulation |
| EP1156825A2 (en) * | 1999-02-25 | 2001-11-28 | SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. | Immunogens comprising a peptide and a carrier derived from h.influenzae protein d |
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| CN1326873C (zh) * | 2000-01-31 | 2007-07-18 | 史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司 | 用于hiv预防或治疗性免疫的疫苗 |
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