JP2001511461A

JP2001511461A - 活性が高くアレルゲン性の低い修飾ポリペプチド類

Info

Publication number: JP2001511461A
Application number: JP2000504882A
Authority: JP
Inventors: バイスゲルゲル，デイビッド; ルビン，ドン，ネルトン
Original assignee: Procter and Gamble Co
Current assignee: Procter and Gamble Co
Priority date: 1997-07-30
Filing date: 1998-07-23
Publication date: 2001-08-14
Also published as: AR016561A1; US6284246B1; KR20010022419A; WO1999006071A1; BR9811709A; CN1268062A; CO4810246A1; CA2297437A1; EP1005373A1; AU8583498A; ZA986756B

Abstract

(57)【要約】この発明は、酵素活性のレベルが親ポリペプチドの約７０％より上で、かつ、アレルゲン反応性のレベルが親ポリペプチドの約３３％未満である修飾ポリペプチドに関する。この発明の実施態様は、化学式：Ａ-Ｂn を有するアレルゲン性が低く、そして酵素活性が高い修飾ポリペプチドに関し；式中、Ａは酵素および酵素の混合物であり；Ｂは酵素に接合した化学式(１)を有する、総分子量が約０.５キロドールトン(ＫＤ)〜約４０ＫＤであるツインポリマ部分であり：式中、Ｒ₁とＲ₂は分子量が約０.２５〜約２０ＫＤの範囲にある直鎖ポリマであり；Ｒ₁とＲ₂の分子量の比は約１：１０〜約１０：１であり；Ｘはツイン部分を酵素の単一部位に連結する連結部分であり；そしてｎは酵素に接合したツインポリマ部分の数であり、約１〜約１５の整数を表す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野この発明は修飾ポリペプチド類、とくに活性が高くアレルゲン性の低いリパー
ゼおよびプロテアーゼの両酵素に関する。

【０００２】発明の背景活性ポリペプチド類を含む商業製品の数がますます多くなっている。これらの
製品は、大部分、ポリペプチドとして酵素を利用している。酵素は、化合物や基
質と反応してその化合物を分解するポリペプチド類である。酵素が反応する基質
の種類に基づいて、酵素は多数の種類に分類することができる。酵素の各種類は
一般に種々の化学結合の切断に対して触媒作用を行い、特定の活性を選択する性
質がある。たとえば、リパーゼは、炭化水素類とポリアルコール骨格基質との間
につくられた（これに限定するわけではないが）エステル結合を加水分解する能
力があることが知られている。これらの基質の例には、モノ-，ジ-，トリ- の各
グリセリド-ポリグリセロールエステル類がある。プロテアーゼは、たんぱく質を加水分解する能力があることで知られている。天然およびバイオ技術によるプ
ロテアーゼ酵素は、家庭用洗剤に添加するとたんぱく質性の汚れを加水分解し、
身体ケア製品に添加すると汚れや老化した皮膚を除去し、口腔洗浄製品に添加す
ると口の中のプラークの除去を促進し、さらに医薬に添加すると体内の望ましく
ないたんぱく質に影響を及ぼす。現在市販されている洗浄製品はプロテアーゼ・ポリペプチド類を添加すること
によりより有効な製品が得られることが知られている。次の特許、すなわち、米
国特許第4,261,868号（Horaら）、米国特許第4,404,115号（Tai）、米国特許第4
,318,818号（Lettonら）、欧州特許出願130,756（1985年１月９日に発行された）および米国特許第5,030,378号（Venegas）では、洗浄製品においてプロテアー
ゼ・ポリペプチド類の使用が開示されている。しかし、ポリペプチド類は潜在的な抗原物質であり、そして特定の条件下では
ヒトがアレルゲン性の反応を起こすことも認識されている。ヒトの免疫系はポリ
ペプチド類に接すると特定の抗体をつくることができる。このように特定の抗体
を産生するプロセスは、臨床的に有効な反応が得られる場合「免疫」と呼ばれて
いる。しかし、反応が過敏性に導く場合は、「感作」と呼ばれている。ポリペプ
チドに対するアレルゲン性感作は、人々が規則的にポリペプチドに接している環
境で認められている。このような環境には、作業者がポリペプチドを含むダスト
やエアロゾルに曝されている製造施設、およびポリペプチド類含有製品を繰り返
し使用している消費者がときどきアレルゲン反応を起こすマーケットがある。現在、ポリペプチドに対するアレルゲン性の反応は、ポリペプチド類の空気に
よる運搬を防ぐために、ポリペプチド類を固定したり，粒状にしたり，被覆した
り，または溶解することにより最小限に抑制することができる。これらの方法は
、空気で運ばれるポリペプチド類への消費者の接触の防止には役立っているが、
仕上がり製品との長期にわたる接触、および製造中の酵素含有ダストやエアロゾ
ルへの接触に付随したリスクは残されている。アレルゲン反応を低減するもう一つの方法は、ヒトに由来するポリペプチド類
を選択することであった。この方法はアレルゲン性の問題を最小限に抑制するが
、所望の活性も有するポリペプチドを見いだすことはできないことが多いので完
全な解決策ではない。アレルゲン性を下げる第３の方法は、ポリペプチド分子のサイズを小さくする
方法であった（特開平4-112,753号公報）。しかし、サイズの縮小は酵素活性を著しく低下させる。ポリペプチド類のアレルゲン性を下げる第４の方法は、エピトープ・マッピン
グおよびポリペプチドのアミノ酸配列を変えてアレルゲン性の低いポリペプチド
を提供する方法である。この方法は、開発に多大の時間と費用がかかる。医療分野では、さらに、別の方法でポリペプチドの免疫性を下げることが提案
されている。米国特許第4,179,337号（Davisら）は、ほぼ直鎖のポリエチレン- グリコール（ＰＥＧ）部分またはポリプロピレン-グリコール（ＰＰＧ）部分に結合したポリペプチド類に関する特許である。ＰＥＧ/ＰＰＧ結合は、ポリペプチドのアレルゲン性を軽減することは判明したが、生理学的活性はわずか１５％
保持されただけであった。ＰＣＴ出願ＷＯ96/17929（Olsenら）は、ポリペプチドを適切なポリマに接合してポリペプチドを修飾する方法に関する特許である。
Olsenの願書には、親ポリペプチドの３９〜１００％り活性を保持しながら、親ポリペプチドに比べてアレルゲン性は２５〜６６％に下がった修飾ポリペプチド
が記載されている。アメリカ化学会から1995年に発行された、Monfardiniらの"たんぱく質修飾に関する分岐モノメトキシポリ(エチレングリコール)"には、分岐モノメトキシ-ポ
リエチレングリコール（ｍＰＥＧ）・ポリマを反応性酵素基に接合することによ
り天然のポリペプチドの活性を向上させる方法が記載されている。Monfardiniら
は、分子量５０００ＫＤの線状ｍＰＥＧポリマおよび分岐あたり分子量５０００
ＫＤの分岐ｍＰＥＧポリマと酵素の接合を開示している。リボヌクレアーゼ，カ
タラーゼ，トリプシンおよびアスパラギナーゼへの接合が証明されている。接合
酵素の酵素活性レベルは、それぞれの親酵素の活性の８６〜１３３％の範囲にあ
ることが証明されている。アレルゲン性に関するデータは提示されていない。所望の高レベルの活性を維持しつつ、アレルゲン反応をほぼ排除した酵素をベ
ースにした化合物の開発が強く望まれている。これが実現すると、メーカと消費
者は酵素技術の効果をより安全に利用できるであろう。

【０００３】この発明の一つの目的は、このような高い活性を発揮し、かつ、免疫系につい
て刺激の低下と活性化が得られる修飾酵素化合物を提供することである。この修
飾酵素化合物を使用した組成物を提供することも一つの目的である。

【０００４】発明の概要この発明は、酵素活性のレベルが親ポリペプチドの約７０％より高く、かつ、
アレルゲン反応レベルが親ポリペプチドの約３３％未満である修飾ポリペプチド
に関する。この発明の実施態様は、下記化学式を有するアレルゲン性が低く、そ
して酵素活性が高い修飾ポリペプチドに関し：Ａ-Ｂn 式中、Ａはリパーゼ酵素とプロテアーゼ酵素、およびそれらの混合物からなる群
から選択した酵素であり；Ｂは酵素に接合した下記化学式を有する、総分子量が
約０.５キロドールトン(ＫＤ)〜約４０ＫＤであるツインポリマ部分であり：

【０００５】

【化２】

【０００６】式中、Ｒ₁とＲ₂は分子量が約０.２５〜約２０ＫＤの範囲にある直鎖ポリマであり；Ｒ₁とＲ₂の分子量の比は約１：１０〜約１０：１であり；Ｘはツイン部分を
酵素の単一部位に連結する連結部分であり；そしてｎは酵素に接合したツインポ
リマ部分の数であり、約１〜約１５の整数を表す。

【０００７】発明の詳細な説明この発明の修飾ポリペプチドは、下記化学式で表され：Ａ-Ｂn この式には、必須成分として酵素（Ａ）および複数（ｎ）のツインポリマ部分（
Ｂ）が含まれている。理論により限定する意図はないが、ツイン・ポリマ部分が
酵素に接合すると、活性は高いが、同時に免疫系の刺激とアレルゲン反応による
抗体形成を防止することにより、バランスのとれた立体障害のある酵素の活性表
面が得られると考えられている。この明細書で用いている、「アミノ酸配列」というフレーズは、特定の配置の
アミノ酸を含むポリペプチドを指している。下記リストは、説明するためにこの
明細書で用いているアミノ酸の略語のリストである：

【０００８】

【表１】アミノ酸３文字の略語１文字の略語アラニンＡｌａＡアルギニンＡｒｇＲアスパラギンＡｓｎＮアスパラチン酸ＡｓｐＤシステインＣｙｓＣグルタミンＧｌｎＱグルタミン酸ＧｌｕＱグリシンＧｌｙＧヒスチジンＨｉｓＨイソロイシンＩｌｅＩロイシンＬｅｕＬリシンＬｙｓＫメチオニンＭｅｔＭフェニルアラニンＰｈｅＦプロリンＰｒｏＰセリンＳｅｒＳスレオニンＴｈｒＴトリプトファンＴｒｐＷチロシンＴｙｒＹバリンＶａｌＶ位置にアミノ酸がないＸａａ＊

【０００９】この明細書で用いている「突然変異」という用語は、生物によりつくられた酵
素のアミノ酸配列を変える、その生物の遺伝子異常を意味している。酵素の突然
変異は、酵素の特性を変えることがしばしば認められている。この明細書で用いている「野生型」という用語は、非変異ホストにより産生さ
れた酵素を意味している。この明細書で用いている「変異」という用語は、酵素を産生するホストの遺伝
子の突然変異により、野生型のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する酵
素を意味している。この明細書で用いている「親ポリペプチド」という用語は、ポリマ部分の追加
の接合がない、野生型または変異型の酵素として定義されている。親ポリペプチ
ドの活性とアレルゲン性は、医療および/または消費製品における親ポリペプチドの開発と使用から通常周知である。この発明の必須成分、並びに好適な成分および随意成分の複数のリストについ
て以下に詳細に説明する。

【００１０】酵素この発明の必須成分は活性酵素である。この明細書の修飾ポリペプチドにおい
て、あらゆる酵素を使用することができる。好適な酵素は、プロテアーゼ酵素，
リパーゼ酵素およびこれらの混合物からなる群から選択するものである。リパーゼ酵素は、生化学および分子生物学の国際連合（ＩＵＢＭＢ）の勧告（
1992）による酵素分類番号Ｅ.Ｃ.３.１.１（カルボン酸エステル・ヒドロラーゼ
類）として分類されている。リパーゼの例には、下記微生物から導かれたリパー
ゼがある。括弧内の特許はこの明細書の参考文献の一部である：

【００１１】 Humicola（ＵＳ 4,810,414） Pseudonomas（ＷＯ 89/04361，ＵＳ 4,950,417，ＥＰ 218 272，ＷＯ 88/09367 ，ＵＳ 5,389,536） Fusarium（ＥＰ 130 064，ＷＯ 90/09446） Mucor（ＥＰ 238 023） Chromobacterium Aspergillus Candida（ＷＯ 88/02775，ＷＯ 94/01541，ＷＯ 89/02916） Geotricum Penicillium Rhizopus Bacillus（ＷＯ 91/16422）

【００１２】市販リパーゼの具体的な例には、Lipolase（商品名），Lipolase（商品名）Ul
tra，Lipozyme（商品名），Palatase（商品名），Novozym435，Lecitase（商品名）（すべて Novo Nordisk A/S から入手できる）；Lumafast（商品名）および Lipomax（Genencor Int., Inc. から入手できる）がある。プロテアーゼ酵素は、生化学および分子生物学の国際連合（ＩＵＢＭＢ）の勧
告（1992）による酵素分類番号Ｅ.Ｃ.３.４（カルボン酸エステル・ヒドロラーゼ類）として分類されている。有用なプロテアーゼ類は、1995年11月９日に発行
された The Procter & Gamble Co. のＷＯ 95/30010，1995年11月９日に発行された The Procter & Gamble Co. のＷＯ 95/30011，1995年11月９日に発行された The Procter & Gamble Co. のＷＯ 95/29979 にも記載されている。この明細
書の修飾ポリペプチド類で使用するのに好適なプロテアーゼ酵素は、subtilisin
型，chymotrypsin 型および elastase 型の各プロテアーゼ酵素類である。この明細書で使用するのにとくに好適なのは、subtilisin 型プロテアーゼ酵素である。subtilisin 酵素は、Bacilus alcalophilus，Bacilus amyloliquefac
iens，Bacilus amylosaccharicus，Bacilus licheniformis，Bacilus lentus お
よび Bacilus subtilis の各微生物により自然に産生される。とくに好適な subtilisin 型酵素は、Bacilus amyloliquefaciens，Bacilus l
icheniformis および/または Bacilus subtilis から得られた、商業的に利用で
きる Novo Industries A/S（デンマークのコペンハーゲン）の Alcalase（商品名），Esperase（商品名），Sainase（商品名）、Gist-brocade（オランダのデルフト）の Maxatase（商品名），Maxacal（商品名）および Maxapem 15（商品名）および subtilisin ＢＰＮおよびＢＰＮ'を含む細菌セリン・プロテアーゼ酵素、およびその変異型である。とくに好適なのは、Bacilus amyloliquefaciens から得られたプロテアーゼ酵
素およびその変異型である。その一つがＢＰＮ'である。Bacilus amyloliquefac
iens からの野生型ＢＰＮ'はアミノ酸配列によりキャラクタライズされる：

【００１３】

【表２】

【００１４】以後「プロテアーゼＡ」と呼ぶ、変異型ＢＰＮ'は、米国特許第5,030,378号（
1991年７月９日に Venegas に発行された）で次のような突然変異を有するＢＰＮ'アミノ酸配列に特徴があることが開示されている：ａ）Gly166 の位置における Gly が Asn，Ser，Lys，Arg，His，Gln，Ala または Glu で置換され、Gly169 の位置における Gly が Ser で置換され、Met222 の位置にある Met が Gln，Phe，Cys，His，Asn，Glu，Ala または Thr で置換され、またはｂ）Gly166 の位置における Gly が Lys で置換され、Met222 の位置にある Met が Cys で置換され、またはｃ）Gly160 の位置における Gly が Ala で置換され、Met222 の位置にある Met が Ala で置換されされている。以後「プロテアーゼＢ」と呼ぶ、追加の変異型ＢＰＮ'は、Genencor Internat
ional, Inc.（サンフランシスコ）の欧州特許ＥＰ-Ｂ-251,446（1994年12月28日
に許可され、1988年１月７日に発行された）により、次のアミノ酸の一つ以上で
突然変異がある野生型ＢＰＮ'に特徴がある：Tyr21，Thr22，Ser24，Asp36，Ala
45，Ala48，Ser49，Met50，His67，Ser87，Lys94，Val95，Gly97，Ser101，Gly1
02，Gly103，Ile107，Gly110，Met124，Gly127，Gly128，Pro129，Leu135，Lys1
70，Tyr171，Pro172，Asp197，Met199，Ser204，Lys213，Tyr214，Gly215，およ
び Ser221、または上に挙げたアミノ酸類の２つ以上および Asp32，Ser33，Tyr1
04，Ala152，Asn155，Glu156，Glu166，Gly169，Phe189，Tyr217，および Met22
2、ここで両突然変異は Asp32，Ser33，Tyr104，Ala152，Asn155，Glu156，Gly1
66，Gly169，Phe189，Tyr217 および Met222 の各アミノ酸について行うことはできない。以後「プロテアーゼＤ」と呼ぶ別の好適なＢＰＮ'変異型プロテアーゼは、199
5年４月20日に発行された Genencor International のＷＯ 95/10615 には、Asp
99，Ser101，Gln103，Tyr104，Ser105，Ile107，Asn109，Asn123，Leu126，Gly1
27，Gly128，Leu135，Glu156，Gly166，Glu195，Asp197，Ser204，Gln206，Pro2
10，Ala216，Tyr217，Asn218，Met222，Ser260，Lys265 および/または Ala274 からなる群から選択した一つ以上のアミノ酸位置における突然変異と組み合わさ
れた位置 Asp76 に突然変異がある野生型ＢＰＮ'アミノ酸に特徴があることが開
示されている。以後「プロテアーゼＦ」と呼ぶ別の好適なＢＰＮ'変異型プロテアーゼは、198
8年７月26日に発行された Estellらの米国特許第4,760,025号に記載されており、Asp32，Ser33，His64，Tyr104，Asn155，Glu156，Gly166，Gly169，Tyr217，および Met222 からなる群から選択した一つ以上のアミノ酸位置に突然変異があ
る野生型ＢＰＮ'アミノ酸に特徴がある。次いで、好適なたんぱく質分解酵素を、Alcalase（商品名），ＢＰＮ'，プロテアーゼＡ，プロテアーゼＢ，プロテアーゼＤ，プロテアーゼＦおよびそれらの混合物からなる群から選択する。プロテアーゼＦが最も好適である。

【００１５】ツインポリマ部分この発明で用いた酵素は、複数（ｎ）のツインポリマ部分を酵素に接合して修
飾されている。ここで、ｎは一つのポリペプチドに接合した部分の平均数である
。ポリペプチドあたりの平均部分数は、約１〜約１５、好適には約２〜約１０、
そしてより好適には約３〜約５の範囲にすることができる。ツインポリマ部分の総分子量は、約０.５〜約４０ＫＤ、好適には約０.５〜約
２０ＫＤ、そしてより好適には約１.０〜約１０ＫＤである。この発明のツインポリマ部分の化学式は下記の通りであり：

【００１６】

【化３】

【００１７】式中、Ｒ₁とＲ₂は、分子量が約０.２５〜約２０ＫＤ、好適には約１.０〜約１０
ＫＤ、そしてより好適には約２〜約５ＫＤの範囲にある直鎖ポリマであり；そし
てＸはツインポリマ部分を酵素の単一部位に連結する連結部分である。Ｒ₁とＲ₂ の分子量の比は１：１０〜約１０：１、好適には１：５〜約５：１、そしてより
好適には１：３〜約３：１である。ツインポリマ部分を含む適切なポリマの例には、ポリエチレン-グリコール類、メトキシポリエチレン-グリコール類、ポリプロピレン-グリコール類、ポリビ
リル-アルコール類、ポリカルボキシレート類、ポリビニル-ピロリドン類、ポリ
-Ｄ,Ｌ-アミノ酸類、カルボキシメチルデキストラン類を含むデキストラン類、メチルセルローズ，カルボキシメチル-セルローズ，エチルセルローズ，ヒドロキシエチル-セルローズ，カルボキシエチル-セルローズ，およびヒドロキシプロ
ピル-セルローズを含むセルローズ類、キトサンの加水分解生成物、ヒドロキシエチル澱粉とヒドロキシプロピル澱粉を含む澱粉類、グリコーゲン、アガロース
類とそれらの誘導体、グアルゴム、プルラン、イヌリン、キサンタン・ゴム、カ
ラギーニン、ペクチン、アルギニン酸加水分解生成物およびバイオポリマがある
。それらのポリマの混合物も、ツインポリマ部分の形成に利用できる。好適なポ
リマはポリエチレン-グリコールである。適切な連結部分は、酵素内の望ましいペプチド基に結合した反応性基の官能基
数を維持しながら、２つのポリマ鎖を適切に連結して機能性をもたせることがで
きる種類の物質から選択できる。連結部分の例および関連した化学については、
1995年８月29日に発行された Harris の米国特許第5,446,090号、1992年12月15 日に発行された Merrill の米国特許第5,171,264号、1992年11月10日に発行され
た Rheeらの米国特許第5,162,430号、1992年10月６日に発行された Shadleらの米国特許第5,153,265号、および 1992年６月16日に発行された Zalipsky の米国
特許第5,122,614号で開示されている。なお、これらの特許はこの明細書の参考文献の一部である。これらの連結部分の好適な例には次のようなものがある：ａ）リシン，チロシン，ヒスチジン，などに結合してアミドまたはエステル結合
が形成されるツインポリマ・サクシニミド：

【００１８】

【化４】

【００１９】ｂ）アミドまたはエステル結合が形成されるリシン，チロシン，ヒスチジン，な
どへのツインポリマ・カルボジイミド結合：

【００２０】

【化５】

【００２１】ｃ）エステル結合を形成するグルタミン酸またはアスパラチン酸へのツインポリ
マ・ＣＨ₂ＯＨ結合：

【００２２】

【化６】

【００２３】ｄ）還元剤（たとえば、ＮａＣＮＢＨ₃）を用いるかどうかによりイミンまたはアミン結合を形成するリシンへのツインポリマ・アルデヒド結合。好適な連結部分（Ｘ）は下記構造の活性化されたリシン-サクシニミジル-エス
テルである。

【００２４】

【化７】

【００２５】この活性化されたリシン-サクシニミジル-エステルは、酵素のリシン，アルギ
ニンおよびヒスチジンの各ペプチドのアミノ酸基と反応する。したがって、この
発明のツインポリマ部分の最も好適な構造は下記の構造である。

【００２６】

【化８】

【００２７】この発明のポリペプチドは、必要な活性と低いアレルゲン性を達成するために
、複数のツインポリマ部分を含むこともできる。

【００２８】酵素活性とアレルゲン性この発明の修飾ポリペプチドにより、それぞれの親ポリペプチドに比べて、高
い活性とかなり大幅に低減したアレルゲン性の両方が得られる。この発明の個々
の修飾ポリペプチドの酵素活性レベルは、後で分析方法のセクションに記載した
酵素活性測定方法により測定した親ペプチドの約７０％より上、好適には約８０
％より上、そしてより好適には約９０％より上である。その上、この発明の個々
の修飾ポリペプチドのアレルゲン反応性レベルは、後で分析方法のセクションに
記載したアレルゲン反応性測定方法により測定した親ペプチドの約３３％未満、
好適には約２０％未満、より好適には約１０％未満、そして最も好適には約５％
未満である。

【００２９】製造方法反応容器において、ｐＨ８.５の０.２Ｍボレート緩衝溶液にポリペプチドを加
える。反応温度を約２５℃に保持しながら、活性ツインポリマの４分の１を加え
３０分反応させる。３０分毎に、２時間にわたり活性ツインポリマの添加を繰り
返し行う。４℃に設定された YM30 Amicon を介して、ｐＨ５.５の緩衝液である
０.０１ＭＫＨ₂ＰＯ₄を用いて緩衝液の交換を行う。ろ過により余剰の反応物を除去する。

【００３０】組成物の利用この明細書の修飾ポリペプチドは、それぞれの親ポリペプチドに適しているあ
らゆる用途で使用することができる。修飾ポリペプチドは、約０.００１％より上、好適には約０.０１％より上、そして最も好適には約０.１％より上の濃度、
かつ、約２０％未満、好適には約１０％未満、そして最も好適には約５％未満の
濃度で使用される。この明細書の修飾ポリペプチドは、たとえば、ラウンドリー用組成物，硬質表
面洗浄製品，軽質洗剤組成物，自動皿洗い機用洗浄剤組成物，塗布してそのまま
残すタイプとさらにすすぎ落とすタイプの両ヘアコンディショナ，ヘアシャンプ
ー，塗布してそのまま残すタイプとさらにすすぎ落とすタイプの両顔面にきび製
剤，顔面ミルクとコンディショナ，シャワーゲル，発泡と非発泡の両顔面洗剤，
化粧品，ハンド・ローションとボディ・ローション，塗布してそのまま残すタイ
プの顔面モイスチャーライザ，化粧品用と洗浄用の拭き取り製品，口腔洗浄組成
物およびコンタクト・レンズ酵素洗浄溶液に添加することができる。これらの製
品はすべて、それぞれの分野で周知の標準材料と標準操作を用いてつくることが
できる。各種組成物の例は下記引用文献に示されている。なお、これらの文献はすべて
、この明細書の参考文献の一部である。

【００３１】身体洗浄組成物皮膚洗浄剤 1997年６月24日に発行された Linaresらの米国特許第5,641,479号、1997年２月４日に発行された Wivellらの米国特許第5,599,549号、1996年12月
17日に発行された Haらの米国特許第5,585,104号、1996年７月30日に発行された Kefauverらの米国特許第5,540,852号、および 1996年４月23日に発行された Du
nbarらの米国特許第5,510,050号。顔面にきび製剤 1997年３月18日に発行された Guang Linらの米国特許第5,612,
324号、1996年12月24日に発行された Warrenらの米国特許第5,587,176号、1996 年８月27日に発行された Venkateswarenらの米国特許第5,549,888号、および 19
95年11月28日に発行された Corlessらの米国特許第5,470,884号。シャワーゲル 1997年７月22日に発行された Gordonらの米国特許第5,650,384号
、および 1997年３月４日に発行された Mooreらの米国特許第5,6076780号。ヘア・コンディショナとシャンプー 1997年４月29日に発行された Coffindafer
らの米国特許第5,624,666号、1997年４月８日に発行された Bolich, Jr.らの米国特許第5,618,524号、1997年３月18日に発行された Inman の米国特許第5,612,
301号、1996年11月12日に発行された Wells の米国特許第5,573,709号、1996年１月９日に発行された Pings の米国特許第5,482,703号、および 1994年４月12 日に再発行された Groteらの米国再発行特許第34,584号。

【００３２】局所用スキンケア組成物化粧品 1997年６月24日に発行された Dateらの米国特許第5,641,493号、1997年
２月25日に発行された Blankらの米国特許第5,605,894号、および 1996年12月17
日に発行された Yoshiokaらの米国特許第5,585,090号。手，顔面およびボディの各ローション 1990年７月３日に発行された Cheneyらの米国特許第4,939,179号、および 1997年３月４日に発行された McAteeらの米国特許第5,607,980号。化粧品および洗浄拭き取り製品 1977年８月30日に発行された Richterらの米国
特許第4,045,364号、1994年10月12日に発行された Touchetらの欧州特許出願、ＥＰ 0 619 074、および 1990年12月４日に発行された Brown-Skrobotらの米国特許第4,975,217号。

【００３３】ラウンドリー洗浄組成物織物用液体洗浄剤 1981年４月14日に発行された Horaらの米国特許第4,261,868
号、1983年９月13日に発行された Tai の米国特許第4,404,115号、および 1982 年３月９日に発行された Lettonらの米国特許第4,318,818号。織物用粒状洗浄剤 1996年10月29日に発行された Dinnewellらの米国特許第5,56
9,645号、1996年９月10日に発行された Scott の米国特許第5,554,587号、1995 年10月17日に発行された Fredjらの米国特許第5,458,810号、1983年４月５日に発行された Murphy の米国特許第4,379,080号、および 1983年11月１日に発行さ
れた Chungらの米国特許第4,412,934号。

【００３４】他の洗浄組成物口腔洗浄組成物（歯磨き剤組成物，口内洗浄剤，薬用ドロップ，チューイング
ガム，および入れ歯洗浄錠剤を含む） 1992年３月17日に発行された Seibel の
米国特許第5,096,700号、1991年７月２日に発行された Sampathkumar の米国特許第5,028,414号、および 1991年７月２日に発行された Benedictらの米国特許第5,028,415号。コンタクト・レンズ酵素洗浄溶液 1989年９月５日に発行された Daviesらの米国特許第4,863,627号、1988年５月24日に再発行された Huthらの米国再発行特許
第32,672号、および 1986年９月２日に発行された Schafer の米国特許第4,609,
493号。硬質表面洗浄製品 1990年６月３日に発行された Hastedtらの米国特許第4,943,
392号、軽質皿洗浄組成物 1997年２月４日に発行された Maoらの米国特許第5,614,485 号、1996年８月13日に発行された Ofosu-Asante の米国特許第5,578,136号、および 1997年６月３日に発行された Burdonらの米国特許第5,559,089号。自動皿洗い機用洗浄剤組成物 1997年４月１日に発行された Raleighらの米国特
許第5,616,277号、1997年３月25日に発行された Painter の米国特許第5,614,48
5号、1996年11月26日に発行された Taylorらの米国特許第5,578,136号、および
1996年９月24日に発行された Hartmanらの米国特許第5,559,089号。

【００３５】分析方法酵素活性測定方法ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドの酵素活性は、基質とポリペプチドまた
は修飾ポリペプチドの反応速度を測定して評価する。基質プロテアーゼの場合：プロテアーゼの酵素活性は、succiny-Ala-Ala-Pro-Phe-p-
Nitroaniline（ＰＮＡ）基質を用いて測定する。プロテアーゼはペプチドとｐ- ニトロアニリンの間の結合を解裂し、４１０ｎｍで吸収する黄色を呈する。リパーゼの場合：リパーゼの酵素活性は、ｐ-ニトロフェニル-カルビレート基質
を用いて測定する。リパーゼはカプリレートとｐ-ニトロフェニルの間の結合を解裂し、４１０ｎｍで吸収する黄色を呈する。装置：４１０ｎｍにおける吸光度の変化速度を測定できる校正済みの分光光度計を用
いることができる。物質：緩衝溶液：０.１Ｍトリス（トリスヒドロキシ-メチルアミノメタン）、０.０１Ｍ塩化カルシウム、ｐＨ８.６。［たとえば、２１.７ｇのトリス（トリスヒド
ロキシ-メチルアミノメタン），２.６ｇのＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏおよび１.８Ｌの蒸留・脱イオン・ろ過水を混合する。］基質溶液：２０ｍｇの適切な基質を１ｍＬのジメチル-スルホキサイド（ＤＭＳＯ）に溶解する。ポリペプチド溶液：分光光度計により２８０ｎｍにおける吸光度を測定した場
合同等のポリペプチド濃度を有する、修飾ポリペプチド溶液と親ポリペプチドの
溶液。作業溶液：２５２.５μＬの基質溶液を緩衝溶液を用いて２５ｍＬに希釈する。操作手順：１．フラスコで１０μＬのテスト・ポリペプチド溶液と９９０μＬの緩衝溶液を
混合する。２．別の容器でステップ１からの５０μＬの溶液と９５０μＬの緩衝溶液を混合
する。３．分光光度計フラスコに９９０μＬの作業溶液を入れる。４．分光光度計フラスコにステップ２からの１０μＬの溶液を入れる。時間およ
び吸光度/分の関数として４１０ｍｍにおける吸光度を記録する。温度はコントロールする必要がある（プロテアーゼにより２０〜２５℃に）。データと結果酵素活性レベルは、修飾ポリペプチドの吸光度対時間の勾配（吸光度/分）と親ポリペプチドの吸光度対時間の勾配の比に１００をかけて、活性を親のパーセ
ントとして表示している。アレルゲン反応性測定方法ポリペプチド類のアレルゲン反応性はＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント
検定法）技術を用いて測定する。親と修飾の両ポリペプチドについて抗体結合を
定量し、等しいポリペプチド濃度における、修飾ポリペプチドの場合に結合した
量を親に結合した量のパーセンテージとして表す。修飾ポリペプチドに結合した
抗体のパーセンテージの低下は、生体内の免疫反応の低下を予測している。操作手順：１．マイクロタイタ・プレートに１００μＬ/容器のウサギアンチ酵素ベース抗体（１５ｍＭ炭酸ナトリウムと３５ｍＭ重炭酸ナトリウムにおいて２μｇ/ｍＬの緩衝溶液、ｐＨ９.６）を一晩塗布する。非結合被覆抗体は、洗浄緩衝溶液（０.５ＭＮａＣｌ，１３ｍＭＴｒｉｚｍａ-ｂａｓｅ，０.２％ＢＳＡ，０.５％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ８.０）で洗い出し、次いで１００μＬ/容器の２％ＢＳ
Ａ水溶液で１時間ブロックした。２．０.２〜２０ｎｇ/ｍＬの範囲の一連の酵素スタンダードを試料調製緩衝溶液
（６.６ｍＭＴｒｉｚｍａ-ｂａｓｅ，０.５ＭＮａＣｌ，１ｍＭＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ，３０ｍＭＮａ₂Ｓ₂Ｏ₃，０.１％ＢＳＡ，０.１％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ８.０）において調製する。３．各修飾酵素試料について、親物質（非修飾酵素）は、２８０ｎｍにおいて分
光光度計により測定した場合の参照液として同じ濃度（たんぱく質濃度で）にす
る必要がある。試料およびその参照液は、スタンダード曲線の範囲に入るように
、試料調製緩衝溶液と同等に希釈する必要がある。４．被覆され・ブロックされそして洗浄されたプレートに、スタンダード，試料
および参照液を５０μＬ/容器にて加える。ブランクについては、試料調製緩衝溶液を用いる。次いで、ウサギアンチ酵素抗体，検定緩衝溶液（０.５ＭＮａＣ
ｌ，５０ｍＭＴｒｉｚｍａ-ｂａｓｅ，１.５％ＢＳＡ，０.１５％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ８.４）を５０μＬ/容器の参照液を加える。このプレートを３７℃で
２時間保温し、次いで空にして、洗浄する。５．ｐ-ニトロフェニルホスフェート基質溶液（ジエタノールアミン緩衝溶液中１ｍｇ/ｍＬ）を、１００μＬ/容器にて容器に加える。このプレートを３７℃で
十分発色するまで、約３０分保温する。６２０ｎｍの参照波長とともに４０５ｎ
ｍにおける二元波長モードで、マイクロタイタ・プレート読みとり器で吸光度を
読みとる。６．スタンダードのネット吸光度をそれらの濃度に対してプロットして、スタン
ダード曲線をつくる。試料とそれらの参照液の濃度を曲線から計算する。「保持
されたパーセント抗体結合」を試料の濃度をその参照液の濃度で割り、さらに１
００をかけて計算する。

【００３６】

【実施例】

以下は、この発明の修飾ポリペプチド類の実施例である。実施例１プロテアーゼＢは、平均３個（ｎ＝３）の、各々が５０００ＫＤの分子量と活
性化されたリシン-サクシニミジル-エステルを有する２個のポリエチレン-グリコール部分からなるツインポリマ部分と接合している。この修飾ポリペプチドは
、反応容器に２０ｍｇのプロテアーゼＢとｐＨ８.５の０.２Ｍボレート緩衝溶液
を１５ｍＬ加えてつくられる。反応温度は約２５℃に維持する。約２４０ｍｇの Twin PEG 10K Succinimide（Shearwater Polymers, Inc.）を反応容器に加え、
３０分反応させる。さらに、３０分毎に３度２４０ｍｇの Twin PEG Succinimid
e を２時間にわたり加え、合計９６０ｍｇの Twin PEG 10K Succinimide を加え
る。緩衝溶液を０.０１ＭのＫＨ₂ＰＯ₄，ｐＨ５.５緩衝溶液と交換し、ろ過して
過剰の反応物を除去する。

【００３７】実施例２プロテアーゼＦは、平均８個（ｎ＝８）の、各々が２０００ＫＤの分子量と活
性化されたリシン-サクシニミジル-エステルを有する２個のポリエチレン-グリコール部分からなるツインポリマ部分と接合している。この修飾ポリペプチドは
、反応容器に２０ｍｇのプロテアーゼＦとｐＨ８.５の０.２Ｍボレート緩衝溶液
を１５ｍＬ加えてつくられる。反応温度は約２５℃に維持する。約２４０ｍｇの Twin PEG 4K Succinimide を反応容器に加え、３０分反応させる。３０分毎に３度２４０ｍｇの Twin PEG 4K Succinimide を２時間にわたり加え、合計９６０ｍｇの Twin PEG 4K Succinimide を加える。緩衝溶液を０.０１ＭのＫＨ₂ＰＯ₄，ｐＨ５.５緩衝溶液と交換し、ろ過して過剰の反応物を除去する。

【００３８】実施例３プロテアーゼＦは、平均５個（ｎ＝５）の、各々が２０００ＫＤの分子量と活
性化されたリシン-サクシニミジル-エステルを有する２個のポリエチレン-グリコール部分からなるツインポリマ部分と接合している。この修飾ポリペプチドは
、反応容器に２０ｍｇのプロテアーゼＦとｐＨ８.５の０.２Ｍボレート緩衝溶液
を１５ｍＬ加えてつくられる。反応温度は約２５℃に維持する。約１５０ｍｇの Twin PEG 4K Succinimide を反応容器に加え、３０分反応させる。３０分毎に３度１５０ｍｇの Twin PEG 4K Succinimide を２時間にわたり加え、合計６００ｍｇの Twin PEG 4K Succinimide を加える。緩衝溶液を０.０１ＭのＫＨ₂ＰＯ₄，ｐＨ５.５緩衝溶液と交換し、ろ過して過剰の反応物を除去する。

【００３９】実施例４プロテアーゼＡは、平均５個（ｎ＝５）の、各々が４０００ＫＤの分子量と活
性化されたカルボジイミドを有する２個のポリエチレン-グリコール部分からなるツインポリマ部分と接合している。この修飾ポリペプチドは、反応容器に２０
ｍｇのプロテアーゼＡとｐＨ８.５の０.２Ｍボレート緩衝溶液を１５ｍＬ加えて
つくられる。反応温度は約２５℃に維持する。約３００ｍｇの Twin PEG 8K Car
bodiimide を反応容器に加え、３０分反応させる。３０分毎に３度３００ｍｇの Twin PEG Succinimide を２時間にわたり加え、合計１２００ｍｇの Twin PEG 8K Carbodiimide を加える。緩衝溶液を０.０１ＭのＫＨ₂ＰＯ₄，ｐＨ５.５緩衝
溶液と交換し、ろ過して過剰の反応物を除去する。

【００４０】実施例５プロテアーゼＦは、平均８個（ｎ＝８）の、各々が５０００ＫＤの分子量と活
性化されたカルボジイミドを有する２個のポリエチレン-グリコール部分からなるツインポリマ部分と接合している。この修飾ポリペプチドは、反応容器に２０
ｍｇのプロテアーゼＦとｐＨ８.５の０.２Ｍボレート緩衝溶液を１５ｍＬ加えて
つくられる。反応温度は約２５℃に維持する。約６４０ｍｇの Twin PEG 10K Ca
rbodiimide を反応容器に加え、３０分反応させる。３０分毎に３度６４０ｍｇの Twin PEG Succinimide を２時間にわたり加え、合計２５６０ｍｇの Twin PE
G 8K Carbodiimide を加える。緩衝溶液を０.０１ＭのＫＨ₂ＰＯ₄，ｐＨ５.５緩
衝溶液と交換し、ろ過して過剰の反応物を除去する。

【００４１】実施例６プロテアーゼＦは、平均８個（ｎ＝８）の、各々が５０００ＫＤの分子量と活
性化されたリシン-サクシニミジル-エステルを有する２個のポリエチレン-グリコール部分からなるツインポリマ部分と接合している。この修飾ポリペプチドは
、反応容器に２０ｍｇのプロテアーゼＦとｐＨ８.５の０.２Ｍボレート緩衝溶液
を１５ｍＬ加えてつくられる。反応温度は約２５℃に維持する。約６４０ｍｇの Twin PEG 10K Succinimide を反応容器に加え、３０分反応させる。３０分毎に
３度６４０ｍｇの Twin PEG Succinimide を２時間にわたり加え、合計２５６０
ｍｇの Twin PEG 10K Succinimide を加える。緩衝溶液を０.０１ＭのＫＨ₂ＰＯ ₄ ，ｐＨ５.５緩衝溶液と交換し、ろ過して過剰の反応物を除去する。

【００４２】実施例７プロテアーゼＢは、平均３個（ｎ＝３）の、各々が１０,０００ＫＤの分子量と活性化されたリシン-サクシニミジル-エステルを有する２個のポリエチレン- グリコール部分からなるツインポリマ部分と接合している。この修飾ポリペプチ
ドは、反応容器に２０ｍｇのプロテアーゼＦとｐＨ８.５の０.２Ｍボレート緩衝
溶液を１５ｍＬ加えてつくられる。反応温度は約２５℃に維持する。約４８０ｍ
ｇの Twin PEG 20K Succinimide を反応容器に加え、３０分反応させる。３０分
毎に３度４８０ｍｇの Twin PEG 20K Succinimide を２時間にわたり加え、合計
１９２０ｍｇの Twin PEG 10K Succinimide を加える。緩衝溶液を０.０１ＭのＫＨ₂ＰＯ₄，ｐＨ５.５緩衝溶液と交換し、ろ過して過剰の反応物を除去する。

【００４３】実施例８プロテアーゼＡは、平均３個（ｎ＝３）の、各々が２０,０００ＫＤの分子量と活性化されたリシン-サクシニミジル-エステルを有する２個のポリビニルアル
コール部分からなるツインポリマ部分と接合している。この修飾ポリペプチドは
、反応容器に２０ｍｇのプロテアーゼＦとｐＨ８.５の０.２Ｍボレート緩衝溶液
を１５ｍＬ加えてつくられる。反応温度は約２５℃に維持する。約９６０ｍｇの Twin PVA 40K Succinimide を反応容器に加え、３０分反応させる。３０分毎に
３度９６０ｍｇの Twin PVA Succinimide を２時間にわたり加え、合計３８４０
ｍｇの Twin PVA 40K Succinimide を加える。緩衝溶液を０.０１ＭのＫＨ₂ＰＯ ₄ ，ｐＨ５.５緩衝溶液と交換し、ろ過して過剰の反応物を除去する。

【００４４】実施例９プロテアーゼＢは、平均４個（ｎ＝４）のツインポリマ部分と接合しており、
これらの部分は２個のポリエチレン-グリコール部分の等モル混合物である。一つの部分には各々が１０００ＫＤの分子量を有するツイン・ポリエチレン-グリコール部分があり、そして他の部分には各々が５０００ＫＤの分子量を有するツ
イン・ポリエチレン-グリコール部分がある。両者には、活性化されたリシン-サ
クシニミジル-エステル連結剤が含まれている。この修飾ポリペプチドは、反応容器に２０ｍｇのプロテアーゼＢとｐＨ８.５の０.２Ｍボレート緩衝溶液を１５
ｍＬ加えてつくられる。反応温度は約２５℃に維持する。約３２０ｍｇの Twin PEG 2K Succinimide と Twin PEG 10K Succinimide（両方とも Shearwater Poly
mers, Inc. より）の等モル混合物を反応容器に加え、３０分反応させる。３０分毎に３度３２０ｍｇのこの Twin PEG 混合物を２時間にわたり加え、合計１２
８０ｍｇの Twin PEG 混合物を加える。緩衝溶液を０.０１ＭのＫＨ₂ＰＯ₄，ｐＨ５.５緩衝溶液と交換し、ろ過して過剰の反応物を除去する。以下実施例により、この発明の範囲内にある実施態様について説明し・実証す
る。以下の実施例では、すべての成分は活性濃度で表示されている。この発明の
精神と範囲を逸脱することなくこの発明の多くの変形態様が可能であるから、こ
れらの実施例は単に説明のためのものであり、この発明を制約するものと解釈し
てはならない。成分は化学名またはＣＴＦＡ名で識別している。

【００４５】

【表３】

【００４６】

【表４】

【００４７】

【表５】

【００４８】

【表６】

【００４９】上の洗浄組成物を、セルローズおよび/またはポリエステルを含む織物吸収シートに、吸収シートの重量で約２５０％含浸させる。

【００５０】

【表７】

【００５１】

【表８】

【００５２】

【表９】

【００５３】

【表１０】

【００５４】

【表１１】

【００５５】

【表１２】

【００５６】

【表１３】

【００５７】

【表１４】

【００５８】

【表１５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 7/50 Ａ６１Ｋ 7/50 47/48 47/48 Ｃ１１Ｄ 3/386 Ｃ１１Ｄ 3/386 Ｃ１２Ｎ 11/08 Ｃ１２Ｎ 11/08 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人ＯＮＥＰＲＯＣＴＥＲ＆ＧＡＮＢＬＥＰＬＡＺＡ，ＣＩＮＣＩＮＮＡＴＩ, ＯＨＩＯ，ＵＮＩＴＥＤＳＴＡＴＥＳＯＦＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者ルビン，ドン，ネルトンアメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、シード、ロード 8224 Ｆターム(参考） 4B033 NA01 NA27 NA30 NB12 NB34 ND13 ND14 4C076 AA12 AA49 BB01 CC41 DD05 DD09 DD21 DD23 DD38 DD51 DD67 EE23 EE38 EE41 EE58 FF67 4C083 AA122 AB032 AB172 AB242 AB332 AB362 AB472 AC012 AC072 AC122 AC132 AC172 AC242 AC302 AC312 AC342 AC352 AC392 AC422 AC482 AC532 AC542 AC562 AC581 AC582 AC642 AC692 AC712 AC782 AC812 AC852 AC862 AD041 AD042 AD092 AD152 AD212 AD222 AD352 AD411 AD412 AD471 AD472 CC01 CC03 CC23 CC24 CC38 CC41 EE09 FF01 4H003 AB03 AB27 AB45 AC05 AC10 AC13 BA12 DA01 DA02 DA05 DA16 DA17 EA12 EB05 EB08 EB16 EB20 EC01 EC02 ED02 FA01 4H045 DA89 EA15 EA22 EA36

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】修飾ポリペプチドにおいて、酵素活性のレベルが親ペプチド
の７０％より上であり、かつ、アレルゲン反応性のレベルが前記親ペプチドの３
３％未満であることを特徴とする前記修飾ポリペプチド。
【請求項２】アレルゲン性が低く、かつ、活性が高い修飾ポリペプチドに
おいて、前記修飾ポリペプチドが下記化学式で表され：Ａ-Ｂn 式中、ａ）Ａは酵素であり；ｂ）Ｂは、総分子量が０.５ＫＤ〜４０ＫＤで、たんぱく質分解酵素に接合し、下記化学式を有するツインポリマ部分であり：【化１】式中、Ｒ₁およびＲ₂は分子量が０.２５〜２０ＫＤの範囲にある実質上の直鎖ポリマであり；Ｒ₁とＲ₂の分子量の比は１：１０〜１０：１であり；Ｘはツインポ
リマ部分を酵素の単一部位に連結する連結部分であり；そしてｃ）ｎは１〜１５である；前記修飾ポリペプチド。
【請求項３】請求項２に記載の修飾ポリペプチドにおいて、前記酵素Ａを
リパーゼ酵素類、プロテアーゼ酵素類およびそれらの混合物からなる群から選択
し；そして酵素活性のレベルが前記親ペプチドの７０％より上であり、かつ、ア
レルゲン反応性のレベルが前記親ペプチドの３３％未満である前記修飾ポリペプ
チド。
【請求項４】請求項２または３に記載の修飾ポリペプチドにおいて、前記
酵素Ａをリパーゼ酵素類、およびサブチリシン型、キモトリプシン型およびエラ
スターゼ型の各酵素からなる群から選択したプロテアーゼ酵素類、およびそれら
の混合物からなる群から選択する前記修飾ポリペプチド。
【請求項５】請求項２ないし４のいずれか１項に記載の修飾ポリペプチド
において、前記酵素をアルカラーゼ（商品名）、ＢＰＮ'、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、プロテアーゼＤ、プロテアーゼＦ、およびそれらの混合物からな
る群から選択する前記修飾ポリペプチド。
【請求項６】請求項２ないし５のいずれか１項に記載の修飾ポリペプチド
において、前記ツインポリマ部分の総分子量が１〜１０ＫＤであり、かつ、前記
個々のポリマ部分である、Ｒ₁とＲ₂の分子量が０.５〜５ＫＤの範囲にある前記修飾ポリペプチド。
【請求項７】請求項６に記載の修飾ポリペプチドにおいて、前記Ｒ₁とＲ₂ の分子量の比が１：５〜５：１である前記修飾ポリペプチド。
【請求項８】請求項２ないし７のいずれか１項に記載の修飾ポリペプチド
において、前記ポリマＲ₁とＲ₂にポリエチレン-グリコールが含まれる前記修飾ポリペプチド。
【請求項９】請求項２ないし８のいずれか１項に記載の修飾ポリペプチド
において、前記ｎが１〜１０である前記修飾ポリペプチド。
【請求項１０】請求項２ないし９のいずれか１項に記載の修飾ポリペプチ
ドにおいて、前記Ｘが活性化されたリシン-サクシニミジル-エステルである前記
修飾ポリペプチド。
【請求項１１】請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の修飾ポリペプ
チドにおいて、酵素活性レベルがプロテアーゼＦの活性の９０％より上で、かつ
、アレルゲン反応性のレベルがプロテアーゼＦのアレルゲン反応性の５％未満で
ある前記修飾ポリペプチド。
【請求項１２】請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の修飾ポリペプ
チドの含有量が０.００１％より上で、かつ、２０％未満である身体洗浄組成物。
【請求項１３】請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の修飾ポリペプ
チドの含有量が０.００１％より上で、かつ、２０％未満であるラウンドリー洗浄組成物。
【請求項１４】請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の修飾ポリペプ
チドの含有量が０.００１％より上で、かつ、２０％未満である口腔洗浄組成物。
【請求項１５】請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の修飾ポリペプ
チドの含有量が０.００１％より上で、かつ、２０％未満である局所スキンケア組成物。
【請求項１６】請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の修飾ポリペプ
チドの含有量が０.００１％より上で、かつ、１０％未満であるシャワーゲル。
【請求項１７】請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の修飾ポリペプ
チドの含有量が０.００１％より上で、かつ、１０％未満である塗布してそのまま残すタイプのスキン・モイスチャーライザ組成物。
【請求項１８】請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の修飾ポリペプ
チドの含有量が０.００１％より上で、かつ、１０％未満である化粧品組成物。
【請求項１９】請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の修飾ポリペプ
チドの含有量が０.００１％より上で、かつ、１０％未満である洗浄拭き取り組成物。