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CN1268062A - 具有高活性和降低的变应原性的修饰多肽 - Google Patents

具有高活性和降低的变应原性的修饰多肽 Download PDF

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CN1268062A
CN1268062A CN98808492A CN98808492A CN1268062A CN 1268062 A CN1268062 A CN 1268062A CN 98808492 A CN98808492 A CN 98808492A CN 98808492 A CN98808492 A CN 98808492A CN 1268062 A CN1268062 A CN 1268062A
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D·维斯格格
D·N·儒宾格
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Procter and Gamble Co
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Abstract

本发明涉及一种修饰多肽,其具有大于亲本多肽约70%的酶活力水平和小于亲本多肽约33%的变态反应水平。本发明的实施方案涉及具有降低的变应原性和高酶活力的修饰多肽,它包含下式:A－Bn,其中A是酶及其混合物;B是总分子量为约0.5千道尔顿(KD)至约40KD的双聚合物结构部分,具有分子式(1),并与酶缀合;其中R1和R2本质上是直链聚合物,分子量为约0.25KD至约20KD;其中R1和R2的分子量比为约1∶10至约10∶1,其中X是将双聚合物结构部分连接到酶上单一位点的连接部分;而n是与酶缀合的双聚合物结构部分的数目,代表约1至约15的整数。

Description

具有高活性和降低的变应原性的修饰多肽
                       技术领域
本发明涉及具有高活性和降低的变应原性的修饰多肽，尤其是脂肪酶和蛋白酶。
                       发明背景
如今可得到越来越多的含有活性多肽的商品。这些产品中的大多数是利用酶作为多肽。酶是与化合物或底物反应而使该化合物破坏的多肽。根据与之反应的底物的种类可将酶分为多个类别。每一类酶通常催化不同化学键的断裂，结果产生特异选择的活性。已知脂肪酶类的酶具有水解碳氢化合物和多元醇主链底物间形成的酯键的能力，当然并不限于这两种物质间形成的酯键。这些底物的实例是甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯-多甘油酯。已知蛋白酶类的酶具有水解蛋白质的能力。可将天然产生的和生物工程合成的蛋白酶掺入家用清洁洗涤剂中，以水解蛋白质类污垢和斑；加入个人护理用品中，以去除污垢和死皮；加入口腔清洁用品中，以促进口腔中牙菌斑的去除；加入药品中，以作用于人体内不希望有的蛋白质。
已知目前的清洁用商品通过加入蛋白酶多肽而变得更加有效。美国专利第4,261,868号(Hora等)、美国专利第4,404,115号(Tai)、美国专利第4,318,818号(Letton等)、欧洲专利申请130,756(1985年1月9日公开)和美国专利第5,030,378号(Venegas)中均公开了蛋白酶在清洁或洗涤用品中的应用。
然而，人们也认识到：多肽是潜在的抗原，在某些条件下，可能使人产生变态反应。随着与多肽的接触，人的免疫系统可产生特异性抗体。当获得临床有益的应答时，该产生特异性抗体的过程称之为“免疫”。然而，当应答导致过敏时，该过程称之为“致敏”。在人有规则地接触多肽的环境中已观察到了对多肽的变应原性致敏作用。这样的环境包括生产设施，其中工人们可能与未经控制的、含有多肽的粉尘或烟雾接触，或者市场，其中消费者多次使用含有多肽的产品有时已引起变态反应。
目前，通过将多肽固定、制成颗粒、包衣或溶解以避免其在空中传播的方式可以将对多肽的变态反应减至最小。这些方法虽然解决了接触空气中多肽的对消费者的问题，但仍遗留有与广泛的组织接触最终产品和在生产过程中接触含酶粉尘或烟雾有关的危险。
减小变态反应的另一种方法是选择来源于人的多肽。虽然该方法减小了变应原性问题，但由于经常不可能找到具有预期活性的这样的多肽，因此这一问题并未完全解决。
第三种降低变应原性的主张是减小多肽分子的大小(参见日本专利公开号4,112,753)。但是，尺寸降低会使酶活力显著降低。
第四种降低多肽的变应原性的途径是通过多肽氨基酸序列的表位定位和变更，从而递送具有降低的变应原性的多肽。该方法通常需要投入大量的开发时间和金钱。
在医学领域已提出一些建议，试图通过另一种方法来减小多肽的免疫原性。该方法包括将未反应的聚合物附着于多肽。美国专利第4,179,337号(Davis等)涉及与基本上直链的聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)聚合物分子偶联的多肽。尽管PEG/PPG偶联减轻了多肽的变应原性，但仅维持了15％的生理学活性。PCT申请WO 96/17929(Olsen等，1996年6月13日公开)涉及通过使多肽与合适的聚合物缀合而对其进行修饰。该Olsen申请描述了与亲本多肽相比，变应原性降低了25％至66％而维持了亲本多肽活性的39％至100％的修饰多肽。
Monfardini等(“用于蛋白质修饰的支链一甲氧基聚(乙二醇)”，美国化学学会，1995年)描述了通过使支链一甲氧基聚乙二醇(mPEG)聚合物与活性酶基团缀合而增加天然多肽活性的努力。Monfardini等教导了酶与分子量为5000KD的直链mPEG聚合物的缀合，和与每一分支的分子量为5000KD的支链mPEG聚合物的缀合。显示了与核糖核酸酶、过氧化氢酶、胰蛋白酶和天冬酰胺酶的缀合。结果显示缀合酶的酶活力水平分别是相应亲本酶活力的86％至133％。文中没有记载变应原性数据。
非常希望开发一种酶基化合物，它应事实上消除变态反应，同时保持所希望的高水平的酶活力。如果实现这一点，它将为生产者和消费者提供更安全的利用酶技术利益的方法。
本发明的目的是提供一种修饰的酶化合物，它递送高活性，而显示出对免疫系统的刺激和导致的激活的减少。还有一个目的是提供使用此修饰酶化合物的组合物。
                        发明简述
本发明涉及一种修饰的多肽，其酶活力水平是亲本多肽的约70％以上，而变态反应水平是亲本多肽的约33％以下。本发明的实施方案涉及具有降低的变应原性和高酶活力的修饰多肽，它包含下式化合物：
A-Bn其中A是选自脂肪酶类或蛋白酶类的酶，及其混合物；B是双聚合物结构部分，其总分子量为约0.5千道尔顿(KD)到约40KD，具有与酶缀合的下列分子式：
Figure A9880849200061
其中R1和R2基本上是直链聚合物，具有约0.25KD到约20KD的分子量；其中R1与R2的分子量比例为约1∶10到约10∶1；其中X是将双结构部分连接到酶上单一位点的连接部分；而n是与酶缀合的双聚合物结构部分的数目，并代表约1至约15的整数。
                    本发明的详细描述
本发明的修饰多肽含有作为基本成分的酶A和大量(n个)双聚合物结构部分B，由下式表示：
A-Bn尽管不想受到理论的限制，但我们相信：该双聚合物结构部分与酶的缀合提供了该酶的活化表面的平衡位阻，以便获得高活性但同时防止对免疫系统的刺激和随后的引起变态反应的抗体形成。
本文中所用的短语“氨基酸序列”是指构成多肽的氨基酸特定构型。以下是本文中所用来描述氨基酸的缩写列表：氨基酸                     三字母缩写              一字母代号丙氨酸                         Ala                      A精氨酸                         Arg                      R天冬酰胺                       Asn                      N天冬氨酸                       Asp                      D半胱氨酸                       Cys                      C谷氨酰胺                       Gln                      Q谷氨酸                         Glu                      Q甘氨酸                         Gly                      G组氨酸                         His                      H异亮氨酸                       Ile                      I亮氨酸                         Leu                      L赖氨酸                         Lys                      K甲硫氨酸                       Met                      M苯丙氨酸                       Phe                      F脯氨酸                         Pro                      P丝氨酸                         Ser                      S苏氨酸                         Thr                      T色氨酸                         Trp                      W酪氨酸                         Tyr                      Y缬氨酸                         Val                      V该位上没有氨基酸               Xaa                      *
本文中所用的术语“突变”是指有机体的基因改变，这反过来改变了由该有机体产生的酶的氨基酸序列。已发现酶的突变经常改变该酶的性能。
本文中所用的术语“野生型”是指由未变异的宿主产生的酶。
本文中所用的术语“变体”意思是指因产生该酶的宿主的基因突变而导致的具有与该野生型酶不同氨基酸序列的酶。
本文中所用的术语“亲本多肽”是指没有额外缀合聚合物部分的野生型酶或变体。亲本多肽的活性和变应原性通常可从它们的发展和在医学和/或消费品中的应用中很好地得知。
下面详细描述了本发明的必需组分以及优选和非必选成分的非排他性目录。酶
本发明的必需组分之一是活性酶。任何酶都可用于此处的修饰多肽。优选的酶选自蛋白酶和脂肪酶。也包括蛋白酶和脂肪酶的混合物。
脂肪酶是在酶分类号E.C.3.1.1(羧酸酯水解酶)的规定下，根据国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)的推荐(1992年)分类的。脂肪酶的实例包括来源于以下微生物的脂肪酶。所指出的专利出版物均结合在此作为参考：
腐质霉，(US 4,810,414)
假单胞菌(WO 89/04361，US 4,950,417，EP 218 272，WO 88/09367，US 5,389,536)
镰孢(EP 130 064，WO 90/09446)
毛霉菌(EP 238 023)
色杆菌
曲霉
假丝酵母(WO 88/02775，WO 94/01541，WO 89/02916)
地霉
青霉
根霉
芽孢杆菌(WO 91/16422)
商业脂肪酶的具体实例包括Lipolase，LipolaseTM Ultra，Lipozyme，Palatase，Novozym435，Lecitase(以上均可从NovoNordisk A/S获得)；LumafastTM和Lipomax(可从Genencor Int.，Inc.获得)。
蛋白酶是在酶分类号E.C.3.4(羧酸酯水解酶)的规定下，根据国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)的推荐(1992年)分类的。在以下PCT出版物中也描述了有用的蛋白酶：宝洁公司，1995年11月9日公开的WO 95/30010；宝洁公司，1995年11月9日公开的WO95/30011；宝洁公司，1995年11月9日公开的WO 95/29979。优选在本发明修饰多肽中使用的蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶型蛋白酶。
尤为优选用于本发明的是枯草杆菌蛋白酶型蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶是由嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、糖淀粉芽孢杆菌(Bacillusamylosaccharicus)、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌微生物天然产生的。
特别优选的枯草杆菌蛋白酶型酶是可从解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌得到的细菌丝氨酸蛋白酶及其变体，包括Novo Industries A/S Alcalase，Esperase，Sayinase(哥本哈根，丹麦)，Gist-brocades’Maxatase，Maxacal和Maxapem 15(由Maxacal人工改造的蛋白质)(Delft，荷兰)和枯草杆菌蛋白酶BPN和BPN’，它们可从市场购得。
尤其优选的是可从解淀粉芽孢杆菌得到的蛋白酶及其变体。一种已知的酶是BPN’。来自解淀粉芽孢杆菌的野生型BPN’的特点在于以下氨基酸序列：1                          10                            20AlaGlnSerValProTyrGlyValSerGlnIleLysAlaProAlaLeuHisSerGlnGly
                       30                            40TyrThrGlySerAsnValLysValAlaValIleAspSerGlyIleAspSerSerHisPro
                       50                            60AspLeuLysValAlaGlyGlyAlaSerMetValProSerGluThrAsnProPheGlnAsp
                       70                            80AsnAsnSerHisGlyThrHisValAlaGlyThrValAlaAlaLeuAsnAsnSerIleGly
                       90                            100ValLeuGlyValAlaProSerAlaSerLeuTyrAlaValLysValLeuGlyAlaAspGly
                       110                           120SerGlyGlnTyrSerTrpIleIleAsnGlyIleGluTrpAlaIleAlaAsnAsnMetAsp
                       130                           140ValIleAsnMetSerLeuGlyGlyProSerGlySerAlaAlaLeuLysAlaAlaValAsp
                       150                           160LysAlaValAlaSerGlyValValValValAlaAlaAlaGlyAsnGluGlyThrSerGly
                       170                           180SerSerSerThrValGlyTyrProGlyLysTyrProSerValIleAlaValGlyAlaVal
                       190                           200AspSerSerAsnGlnArgAlaSerPheSerSerValGlyProGluLeuAspValMetAla
                       210                           220ProGlyValSerIleGlnSerThrLeuProGlyAsnLysTyrGlyAlaTyrAsnGlyThr
                       230                           240SerMetAlaSerProHisValAlaGlyAlaAlaAlaLeuIleLeuSerLysHisProAsn
                       250                           260TrpThrAsnThrGlnValArgSerSerLeuGluAsnThrThrThrLysLeuGlyAspSer
                       270                           275PheTyrTyrGlyLysLysGlyLeuIleAsnAsnValGlnAlaAlaAlaGln
美国专利5,030,378(1991年7月9日颁发给Venegas)中公开了BPN’的变体，下文中称之为“蛋白酶A”，其特征在于BPN’氨基酸序列发生以下突变：
a.)Gly166位的Gly被替换为Asn，Ser，Lys，Arg，His，Gln，Ala或Glu；Gly169位的Gly被替换为Ser；Met222位的Met被替换为Gln，Phe，Cys，His，Asn，Glu，Ala或Thr；或者
b.)Gly166位的Gly被替换为Lys，而Met222位的Met被替换为Cys；或者
c.)Gly160位的Gly被替换为Ala，而Met222位的Met被替换为Ala。
Genencor International公司(San Francisco，Calofornia)的欧洲专利EP-B-251,446(1988年1月7日公开，1994年12月28日授权)公开了其他BPN’的变体，在此以前称之为“蛋白酶B”，其特征在于野生型BPN’氨基酸中，下列氨基酸中的一个或多个发生了突变：Tyr21，Thr22，Ser24，Asp36，Ala45，Ala48，Ser49，Met50，His67，Ser87，Lys94，Val95，Gly97，Ser101，Gly102，Gly103，Ile107，Gly110，Met124，Gly127，Gly128，Pro129，Leu135，Lys170，Tyr171，Pro172，Asp197，Met199，Ser204，Lys213，Tyr214，Gly215和Ser221；或上列氨基酸中的两个或多个和Asp32，Ser33，Tyr104，Ala152，Asn155，Glu156，Gly166，Gly169，Phe189，Tyr217和Met222发生了突变，其中这两种突变不能都发生在Asp32，Ser33，Tyr104，Ala152，Asn155，Glu156，Gly166，Gly169，Phe189，Tyr217和Met222氨基酸上。
Genencor International公司的、1995年4月20日公开的WO95/10615中描述了另一种优选的BPN’变体蛋白酶，下文中称之为“蛋白酶D”，其特征在于野生型BPN’氨基酸中Asn76位发生了突变，并且还有以下位置上的一种或多种其他氨基酸发生了突变：Asp99，Ser101，Gln103，Tyr104，Ser105，Ile107，Asn109，Asn123，Leu126，Gly127，Gly128，Leu135，Glu156，Gly166，Glu195，Asp197，Ser204，Gln206，Pro210，Ala216，Tyr217，Asn218，Met222，Ser260，Lys265和/或Ala274。
1988年7月26日颁发给Estell等的美国专利4,760,025中描述了另一种优选的BPN’变体蛋白酶，下文中称之为“蛋白酶F”，其特征在于野生型BPN’氨基酸中，下列位置上的一个或多个氨基酸发生了突变：Asp32，Ser33，His64，Tyr104，Asn155，Glu156，Gly166，Gly169，Phe189，Tyr217和Met222。
然后，优选的蛋白酶选自Alcalase，BPN’，蛋白酶A，蛋白酶B，蛋白酶D和蛋白酶F，及其混合物。蛋白酶F是最优选的。双聚合物结构部分
本发明中使用的酶通过大量(n个)双聚合物结构部分与该酶的缀合而修饰，其中n是与多肽缀合的结构部分的平均数。与每个多肽缀合的结构部分的平均数可以是约1至约15个，优选约2至约10个，更优选约3至约5个。
该双聚合物结构部分的总分子量为约0.5KD至约40KD，优选约0.5KD至约20KD，更优选约1.0KD至约10KD。
本发明的双聚合物结构部分具有以下结构其中R1和R2基本上是直链聚合物，具有约0.5千道尔顿(KD)到约20KD、优选约1.0KD到约10KD、更优选约2KD到约5KD的分子量，而X是将双聚合物结构部分连接到酶上单一位点的连接部分。R1与R2的分子量比例为1∶10到约10∶1，优选1∶5到约5∶1，更优选1∶3到约3∶1。
构成该双聚合物结构部分的适宜聚合物的实例包括聚乙二醇，甲氧基聚乙二醇，聚丙二醇，聚乙烯醇，聚羧酸酯，聚乙烯基吡咯烷酮，聚-D，L-氨基酸，葡聚糖包括羧甲基葡聚糖，纤维素包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素和羟丙基纤维素，脱乙酰壳多糖的水解产物，淀粉包括羟乙基淀粉和羟丙基淀粉，糖原，琼脂糖及其衍生物，瓜尔胶，出芽短梗孢糖，菊粉，黄原胶，角叉菜胶，果胶，海藻酸水解产物和生物聚合物。聚合物的混合物也可用于形成该双聚合物结构部分。优选的聚合物是聚乙二醇。
合适的连接部分可以取自能被适当地功能化以连接两个聚合物链、同时又保持对酶中预期肽基团上的活性基的官能度的那类物质。1995年8月29日颁发给Harris的美国专利5,446,090；1992年12月15日颁发给Merrill的美国专利5,171,264；1992年11月10日颁发给Rhee等的美国专利5,162,430；1992年10月6日颁发给Shadle等的美国专利5,153,265；和1992年6月16日颁发给Zalipsky的美国专利5,122,614中公开了连接部分及相关化学过程的实例，这些专利均结合在此作为参考。
这些连接部分的优选实例是：
a)双聚合物琥珀酰亚胺与赖氨酸、酪氨酸、组氨酸等偶合，此时形成酰胺键或酯键：
Figure A9880849200121
b)双聚合物碳酰二亚胺与赖氨酸、酪氨酸、组氨酸等偶合，此时形成酰胺键或酯键：
Figure A9880849200131
c)双聚合物-CH2OH与谷氨酸或天冬氨酸偶合形成酯键
Figure A9880849200132
d)双聚合物醛与赖氨酸偶合，根据是否使用还原剂(例如NaCNBH3)而形成亚胺或胺键。
优选的连接部分X是下式表示的活化赖氨酸琥珀酰亚胺基酯
Figure A9880849200133
该活化赖氨酸琥珀酰亚胺基酯与酶的赖氨酸、精氨酸和组氨酸肽的氨基酸基团反应。因此，本发明的双聚合物部分的最优选的结构是本发明的多肽也可包含双聚合物结构部分的混合物，以达到所需的活性和降低的变应原性。酶活力和变应原性
与它们各自的亲本多肽相比，本发明的修饰多肽提供了高酶活力和显著降低的变应原性。根据下文中的“分析方法”部分所列的“酶活力分析法”测定，本发明的特定修饰多肽的酶活力水平是亲本多肽的约70％以上，优选约80％以上，更优选约90％以上。另外，根据下文中的“分析方法”部分所列的“变态反应分析法”测定，本发明的特定修饰多肽的变态反应水平是亲本多肽的约33％以下，优选约20％以下，更优选约10％以下，最优选约5％以下。
制备方法
在反应锅中，加入多肽在pH8.5的0.2M硼酸盐缓冲液中的溶液。加入四分之一的活化双聚合物，维持反应温度为约25℃并使反应进行30分钟。在2小时内，每30分钟重复加入活化双聚合物。通过YM30Amicon装置，在4℃下，将缓冲液替换为0.01M KH2PO4，5.5pH缓冲液。经过滤除去过量反应物。
组合物的应用
本发明的修饰多肽可以用于其各自的亲本多肽适于使用的任何场所。该修饰多肽以大于约0.001％的浓度使用，优选大于约0.01％，最优选大于约0.1％，而小于约20％浓度，优选小于约10％，最优选小于约5％。
例如本发明的修饰多肽可以加入洗衣组合物、硬表面清洁用品、轻垢清洁组合物、自动洗碗机用洗涤剂组合物、免洗除式和洗除式头发调理剂、洗发香波、免洗除式和洗除式面部痤疮制剂、面部奶液和调理剂、浴用凝胶、发泡和无泡型洁面剂、化妆品、手用和体用水剂、免洗除式面部滋润剂、美容和清洁擦、口腔清洁组合物和加酶隐形眼镜清洗液。这些产品均用其各自领域中已知的标准方法和标准物质制备。
下列参考文献中显示了各类型组合物的实例，这些文献均结合在此作为参考。个人清洁组合物
皮肤清洁剂-1997年6月24日颁发给Linares等的美国专利5,641,479；1997年2月4日颁发给Wivell等的美国专利5,599,549；1996年12月17日颁发给Ha等的美国专利5,585,104；1996年7月30日颁发给Kefauver等的美国专利5,540,852；和1996年4月23日颁发给Dunbar等的美国专利5,510,050。
面部痤疮制剂-1997年3月18日颁发给Guang Lin等的美国专利5,612,324；1996年12月24日颁发给Warren等的美国专利5,587,176；1996年8月27日颁发给Venkateswaran的美国专利5,549,888；和1995年11月28日颁发给Corless等的美国专利5,470,884。
浴用凝胶-1997年7月22日颁发给Gordon等的美国专利5,650,384；和1997年3月4日颁发给Moore等的美国专利5,607,678。
头发调理剂和洗发香波-1997年4月29日颁发给Coffindaffer等的美国专利5,624,666；1997年4月8日颁发给Bolich，Jr等的美国专利5,618,524；1997年3月18日颁发给Inman的美国专利5,612,301；1996年11月12日颁发给Wells的美国专利5,573,709；1996年1月9日颁发给Pings的美国专利5,482,703；和1994年4月12日颁发给Grote等的美国专利Re.34,584。局部护肤组合物
化妆品-1997年6月24日颁发给Date等的美国专利5,641,493；1997年2月25日颁发给Blank等的美国专利5,605,894；1996年12月17日颁发给Yoshioka等的美国专利5,585,090。
手用、面用及体用水剂-1990年7月3日颁发给Cheney等的美国专利4,939,179；和1997年3月4日颁发给McAtee等的美国专利5,607,980。
美容和清洁擦-1977年8月30日颁发给Richter等的美国专利4,045,364；1994年10月12日公开的Touchet等的欧洲专利申请EP 0619 074；和1990年12月4日颁发给Brown-Skrobot等的美国专利4,975,217。洗衣清洁组合物
液体织物洗涤剂-1981年4月14日颁发给Hora等的美国专利4,261,868；1983年9月13日颁发给Tai的美国专利4,404,115；1982年3月9日颁发给Letton等的美国专利4,318,818。
颗在织物洗涤剂-1996年10月29日颁发给Dinnewell等的美国专利5,569,645；1996年9月10日颁发给Scott的美国专利5,554,587；1995年10月17日颁发给Fredj等的美国专利5,458,810；1983年4月5日颁发给Murphy的美国专利4,379,080；1983年11月1日颁发给Chung等的美国专利4,412,934。其他清洁组合物
口腔清洁组合物(包括牙用组合物、漱口剂、锭剂、口香糖和假牙清洗片剂)-1992年3月17日颁发给Seibel的美国专利5,096,700；1991年7月2日颁发给Sampathkumar的美国专利5,028,414和1991年7月2日颁发给Benedict等的美国专利5,028,415。
加酶隐形眼镜清洗液-1989年9月5日颁发给Davies等的美国专利4,863,627；1988年5月24日重新颁发给Huth等的美国专利Re.32,672；和1986年9月2日颁发给Schafer的美国专利4,609,493。
硬表面清洁用品-1990年7月24日颁发给Hastedt等的美国专利4,943,392。
轻垢餐具清洁组合物-1997年2月4日颁发给Mao等的美国专利5,599,400；1996年8月13日颁发给Ofosu-Asante的美国专利5,545,354；和1997年6月3日颁发给Burdon等的美国专利5,635,466。
自动洗碗机用洗涤剂组合物-1997年4月1日颁发给Raleigh等的美国专利5,616,277；1997年3月25日颁发给Painter的美国专利5,614,485；1996年11月26日颁发给Taylor等的美国专利5,578,136；和1996年9月24日颁发给Hartman等的美国专利5,559,089。
分析方法酶活力分析法
通过测量多肽或修饰多肽与底物的反应速率来检定多肽或修饰多肽的酶活力。底物
对于蛋白酶：利用底物琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phep-硝基苯胺(PNP)来测定蛋白酶的活力。蛋白酶使肽和对硝基苯胺之间的键裂开，产生在410nm处吸收的可见黄光。
对于脂肪酶：利用底物对硝基苯辛酸(carbrilate)来测定脂肪酶的酶活力。脂肪酶使辛酸和对硝基苯之间的键裂开，产生在410nm处吸收的可见黄光。设备：
能在410nm处测量吸光度变化率的任何校准分光光度计均可使用。原料：
缓冲溶液：0.1M Tris(三羟甲基氨基甲烷)，0.01M CaCl2，pH8.6。(例如将21.7g Tris(三羟甲基氨基甲烷)、2.6g CaCl2-2H2O和1.8L蒸馏去离子过滤水混合)。
底物溶液：将20mg适宜底物溶于1ml二甲基亚砜(DMSO)。
多肽溶液：利用分光光度法测定280nm处吸光度，确认修饰多肽的溶液和亲本多肽的溶液具有相等多肽浓度。
工作溶液：用缓冲溶液将252.5μl底物溶液稀释到最多25ml。过程：
1、在烧瓶中混合10μl测试多肽溶液和990μl缓冲溶液。
2、在分离的容器中，将50μl步骤1所得溶液加入950μl缓冲溶液中。
3、在分光光度计烧瓶中，加入990μl工作溶液。
4、将10μl步骤2所得溶液加到分光光度计烧瓶中。记录作为时间和ABS/分钟的函数的410nm处吸光度。应控制温度(根据蛋白酶控制在20℃-25℃)。数据和结果
酶活力水平是修饰多肽的吸光度与时间曲线(Abs/min)的斜率与亲本多肽的吸光度与时间曲线的斜率的比值并乘以100，表示为亲本多肽活力的百分数。变态反应分析法
利用ELISA(酶联免疫吸附测定)技术来测量多肽的变态反应。亲本多肽和修饰多肽的抗体结合均用在相等多肽浓度下修饰多肽的结合量来定量，表示为与亲本多肽的结合量的百分数。与修饰多肽结合的抗体的百分数的减少预示了体内免疫应答的减少。过程：
1、微量滴定板用100μl/孔兔抗酶抗体(2μg/mL，溶于15mM碳酸钠、35mM碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)涂敷过夜。未结合的涂敷抗体用洗涤缓冲液(0.5M NaCl，13mM氨基丁三醇碱，0.2％BSA，0.5％吐温20，pH8.0)洗出，然后用100μl/孔2％BSA的水溶液封阻1小时。
2、用样品制备缓冲液(6.6mM氨基丁三醇碱，0.5M NaCl，1mMCaCl2·2H2O，30mM Na2S2O3，0.1％BSA，0.1％吐温20，pH8.0)制备一系列0.2-20ng/mL的酶标准物。
3、对于每种修饰酶样品，需要相同浓度(蛋白质水平)的亲本物质(未修饰的酶)作为对照，酶浓度利用分光光度法在280nm处测量。然后将样品及其对照品相等地稀释到样品制备缓冲液中，使它们达到标准曲线范围内。
4、将标准品、样品和对照品以50μl/孔的量加入到涂敷、封阻并洗涤过的滴定板中。样品制备缓冲液用于空白。然后加入50μl/孔兔抗酶抗体、碱性磷酸酶缀合物在检测缓冲液(0.5M NaCl，50mM氨基丁三醇碱，1.5％BSA，0.15％吐温20，pH8.4)中的稀释溶液。该滴定板在37℃下温育2小时，然后排空并洗涤。
5、以100μl/孔的量将对硝基苯磷酸酯底物溶液(1mg/mL，溶于二乙醇胺缓冲液)加入各孔中。该滴定板在37℃下温育直到已显示出足够的颜色，大约30分钟。用微量滴定板读数器以双波长模式、以620nm波长作对照、读取405nm处的吸光度。
6、用标准物的净吸光度对它们的浓度作图得到标准曲线。用该曲线计算样品及它们的对照品的浓度。将样品的浓度除以其对照品的浓度并乘以100，得到“保留的抗体结合百分数”。
实施例
以下是本发明修饰多肽的非限制性实施例。实施例1
蛋白酶B与平均3个(n＝3)双聚合物结构部分缀合，该双聚合物结构部分由两个分子量各为5000KD的聚乙二醇部分和活化赖氨酸琥珀酰亚胺基酯组成。该修饰多肽用以下方法制备：将20mg蛋白酶B和15ml0.2M硼酸盐缓冲液(pH8.5)加入到反应锅中。反应温度维持约25℃。将约240mg Twin PEG 10K琥珀酰亚胺(Shearwater Polymers公司)加入该反应锅并反应30分钟。在2小时内，以每30分钟再加入240mgTwin PEG琥珀酰亚胺的方式再加三次，使加入的Twin PEG 10K琥珀酰亚胺的总量为960mg。将缓冲液置换为0.01M KH2PO4(pH5.5)缓冲液，并过滤除去过量反应物。实施例2
蛋白酶F与平均8个(n＝8)双聚合物结构部分缀合，该双聚合物结构部分由两个分子量各为2000KD的聚乙二醇部分和活化赖氨酸琥珀酰亚胺基酯组成。该修饰多肽用以下方法制备：将20mg蛋白酶F和15ml0.2M硼酸盐缓冲液(pH8.5)加入到反应锅中。反应温度维持约25℃。将约240mg Twin PEG 4K琥珀酰亚胺加入该反应锅并反应30分钟。在2小时内，以每30分钟再加入240mg Twin PEG 4K琥珀酰亚胺的方式再加三次，使加入的Twin PEG 4K琥珀酰亚胺的总量为960mg。将缓冲液置换为0.01M KH2PO4(pH5.5)缓冲液，并过滤除去过量反应物。实施例3
蛋白酶F与平均5个(n＝5)双聚合物结构部分缀合，该双聚合物结构部分由两个分子量各为2000KD的聚乙二醇部分和活化赖氨酸琥珀酰亚胺基酯组成。该修饰多肽用以下方法制备：将20mg蛋白酶F和15ml0.2M硼酸盐缓冲液(pH8.5)加入到反应锅中。反应温度维持约25℃。将约150mg Twin PEG 4K琥珀酰亚胺加入该反应锅并反应30分钟。2小时内以每隔30分钟再加入150mg Twin PEG 4K琥珀酰亚胺的方式再加三次，使加入的Twin PEG 4K琥珀酰亚胺的总量为600mg。将缓冲液置换为0.01M KH2PO4(pH5.5)缓冲液，并过滤除去过量反应物。实施例4
蛋白酶A与平均5个(n＝5)双聚合物结构部分缀合，该双聚合物结构部分由两个分子量各为4000KD的聚乙二醇部分和活化碳酰二亚胺组成。该修饰多肽用以下方法制备：将20mg蛋白酶A和15ml 0.2M硼酸盐缓冲液(pH8.5)加入到反应锅中。反应温度维持约25℃。将约300mgTwin PEG 8K碳酰二亚胺加入该反应锅并反应30分钟。2小时内以每隔30分钟再加入300mg Twin PEG琥珀酰亚胺的方式再加三次，使加入的Twin PEG 8K碳酰二亚胺的总量为1200mg。将缓冲液置换为0.01MKH2PO4(pH5.5)缓冲液，并过滤除去过量反应物。实施例5
蛋白酶F与平均8个(n＝8)双聚合物结构部分缀合，该双聚合物结构部分由两个分子量各为5000KD的聚乙二醇部分和活化碳酰二亚胺组成。该修饰多肽用以下方法制备：将20mg蛋白酶F和15ml 0.2M硼酸盐缓冲液(pH8.5)加入到反应锅中。反应温度维持约25℃。将约640mgTwin PEG 10K碳酰二亚胺加入该反应锅并反应30分钟。2小时内以每隔30分钟再加入640mg Twin PEG琥珀酰亚胺的方式再加三次，使加入的Twin PEG 8K碳酰二亚胺的总量为2560mg。将缓冲液置换为0.01MKH2PO4(pH5.5)缓冲液，并过滤除去过量反应物。实施例6
蛋白酶F与平均8个(n＝8)双聚合物结构部分缀合，该双聚合物结构部分由两个分子量各为5000KD的聚乙二醇部分和活化赖氨酸琥珀酰亚胺基酯组成。该修饰多肽用以下方法制备：将20mg蛋白酶F和15ml0.2M硼酸盐缓冲液(pH8.5)加入到反应锅中。反应温度维持约25℃。将约640mg Twin PEG 10K琥珀酰亚胺加入该反应锅并反应30分钟。2小时内以每隔30分钟再加入640mg Twin PEG琥珀酰亚胺的方式再加三次，使加入的Twin PEG 10K琥珀酰亚胺的总量为2560mg。将缓冲液置换为0.01M KH2PO4(pH5.5)缓冲液，并过滤除去过量反应物。实施例7
蛋白酶B与平均3个(n＝3)双聚合物结构部分缀合，该双聚合物结构部分由两个分子量各为10,000KD的聚乙二醇部分和活化赖氨酸琥珀酰亚胺基酯组成。该修饰多肽用以下方法制备：将20mg蛋白酶B和15ml 0.2M硼酸盐缓冲液(pH8.5)加入到反应锅中。反应温度维持约25℃。将约480mg Twin PEG 20K琥珀酰亚胺加入该反应锅并反应30分钟。2小时内以每隔30分钟再加入480mg Twin PEG 20K琥珀酰亚胺的方式再加三次，使加入的Twin PEG 10K琥珀酰亚胺的总量为19200mg。将缓冲液置换为0.01M KH2PO4(pH5.5)缓冲液，并过滤除去过量反应物。实施例8
蛋白酶A与平均3个(n＝3)双聚合物结构部分缀合，该双聚合物结构部分由两个分子量各为20,000KD的聚乙烯醇部分和活化赖氨酸琥珀酰亚胺基酯组成。该修饰多肽用以下方法制备：将20mg蛋白酶A和15ml 0.2M硼酸盐缓冲液(pH8.5)加入到反应锅中。反应温度维持约25℃。将约960mg Twin PVA 40K琥珀酰亚胺加入该反应锅并反应30分钟。2小时内以每隔30分钟再加入960mg Twin PVA琥珀酰亚胺的方式再加三次，使加入的Twin PVA 40K琥珀酰亚胺的总量为3840mg。将缓冲液置换为0.01M KH2PO4(pH5.5)缓冲液，并过滤除去过量反应物。实施例9
蛋白酶B与平均4个(n＝4)双聚合物结构部分缀合，而该双聚合物结构部分是两个聚乙二醇部分的等摩尔混合物。其中一部分具有分子量各为1000KD的双聚乙二醇基团，而另一部分具有分子量各为5000KD的双聚乙二醇基团。两部分均含有活化赖氨酸琥珀酰亚胺基酯连接剂。该修饰多肽用以下方法制备：将20mg蛋白酶B和15ml 0.2M硼酸盐缓冲液(pH8.5)加入到反应锅中。反应温度维持约25℃。将约320mg Twin PEG 2K琥珀酰亚胺和Twin PEG 10K琥珀酰亚胺(均购自Shearwater Polymers公司)的等摩尔混合物加入该反应锅并反应30分钟。2小时内以每隔30分钟再加入320mg Twin PEG混合物的方式再加三次，使加入的Twin PEG混合物的总量为1280mg。将缓冲液置换为0.01M KH2PO4(pH5.5)缓冲液，并过滤除去过量反应物。
以下实施例进一步描述和说明了本发明范围内的实施方案。在下列实施例中，所有成分均以活性浓度列出。给出这些实施例仅是为了阐述本发明而不是限制本发明。在不背离本发明实质和范围的情况下，有可能对其进行多种改变。
各成分由化学或CTFA命名确定。实施例10-13：体用清洁品
                     实施例10  实施例11  实施例12  实施例13
                     (重量％)水                        55.00      55.00     55.00     55.00EDTA二钠                  0.20       0.20      0.20      0.20甘油                      3.00       3.00      3.00      3.00聚季铵盐10                0.40       0.40      0.40      0.40月桂基醚-3-3.6硫酸钠/镁   12.00      12.00     12.00     12.00椰油酰胺MEA               2.80       2.80      2.80      2.80月桂基两性乙酸钠(Sodium   6.00       6.00      6.00      6.00Lauraphoacetate)肉豆蔻酸                  1.60       1.60      1.60      1.60七水硫酸镁                0.30       0.30      0.30      0.30三羟基硬脂精              0.50       0.50      0.50      0.50PEG-6辛酸/癸酸甘油三酸酯  3.00       0.00      0.00      0.00棉子酸脂肪酸的蔗糖多酯    3.00       0.00      0.00      0.00廿二碳酸脂肪酸的蔗糖多酯  3.00       0.00      4.00      0.00矿脂                      0.00       4.00      8.00      0.00矿物油                       0.00      0.00      0.00     6.00DMDM乙内酰脲                 0.08      0.08      0.08     0.08实施例1-9的修饰多肽          0.10      2.00      2.00     5.00柠檬酸                       1.40      1.40      1.40     1.40水                           适量      适量      适量     适量
                         100.00    100.00    100.00   100.00实施例14-17：洗面用品
                       实施例14   实施例15  实施例16  实施例17
                       (重量％)水                           50.00     50.00     50.00    50.00EDTA二钠                     0.10      0.10      0.20     0.20柠檬酸                       0.00      0.00      1.40     1.40月桂基醚-3硫酸钠             3.00      3.50      0.00     0.00月桂基醚-4羧酸钠             3.00      3.50      0.00     0.00月桂基醚-12                  1.00      1.20      0.00     0.00聚季铵盐10                   0.00      0.00      0.40     0.40聚季铵盐25                   0.30      0.30      0.00     0.00甘油                         3.00      3.00      3.00     3.00月桂酰两性乙酸钠             0.00      0.00      6.00     6.00月桂酸                       6.00      6.00      3.00     3.00肉豆蔻酸                     0.00      0.00      3.00     3.00七水硫酸镁                   2.30      2.00      2.00     2.00三乙醇胺                     4.00      4.00      4.00     4.00三羟基硬脂精                 0.50      0.50      0.50     0.50廿二碳酸脂肪酸的蔗糖多酯     2.00      2.00      0.00     0.00棉子酸脂肪酸的蔗糖多酯       3.00      2.00      0.00     0.00PEG-6辛酸/癸酸甘油三酸酯     0.00      0.00      0.00     2.00矿脂                         0.00      0.00      4.00     0.00矿物油                     0.00      0.00      0.00      2.00椰油酰胺基丙基甜菜碱       2.00      3.00      1.80      1.80月桂基二甲基氧化胺         1.00      1.20      1.20      1.20D-泛醇                     1.00      0.25      0.25      0.00DMDM乙内酰脲               0.08      0.08      0.08      0.08实施例1-9的修饰多肽        1.00      2.00      0.50      0.50香料                       0.20      0.20      0.20      0.20水                         适量      适量      适量      适量
                       100.00    100.00    100.00    100.00实施例18-19：免洗除式皮肤增湿组合物
                     实施例18    实施例19
                     (重量％)甘油                       5.00      0.00硬脂酸                     3.00      0.00C11-13异链烷烃             2.00      0.00硬脂酸乙二醇酯             1.50      0.00丙二醇                     0.00      3.00矿物油                     1.00      10.00芝麻油                     0.00      7.00矿脂                       0.00      1.80三乙醇胺                   0.70      0.00鲸蜡醇醋酸酯               0.65      0.00硬脂酸甘油酯               0.48      2.00硬脂酸三乙醇胺             0.00      2.50鲸蜡醇                     0.47      0.00羊毛脂醇                   0.00      1.80DEA-鲸蜡醇磷酸酯           0.25      0.00对羟基苯甲酸甲酯           0.20      0.20对羟基苯甲酸丙酯                 0.12        0.10Carbomer934                      0.11        0.00EDTA二钠                         0.10        0.00实施例1-9的修饰多肽              0.10        0.5水                               适量        适量实施例20：清洁擦组合物清洁组合物
                               (重量％)
丙二醇                          1.00％
月桂基硫酸铵                    0.60％
琥珀酸                          4.00％
琥珀酸钠                        3.20％
三氯羟基二苯醚Triclosan       0.15％
实施例1-9的修饰多肽             0.05％
水                              适量至100％
将上述清洁组合物以吸收片重量约250％的量浸渍到由纤维素和/或聚酯构成的纺织吸收片中。实施例21-24：香波
                  实施例21    实施例22    实施例23    实施例24
                  (重量％)水                     50.00       50.00       50.00       50.00月桂基硫酸铵           10.00       10.00       8.00        6.00月桂基醚硫酸铵         4.00        3.00        2.00        2.00椰油酰胺MEA            2.00        2.00        2.00        2.00乙二醇二硬脂酸酯       2.00        2.00        2.00        2.00鲸蜡醇                 2.00        2.00        2.00        2.00硬脂醇                 1.20        1.20        1.20        1.20甘油                      1.00     1.00     1.00     1.00聚季铵盐10                0.25     0.25     0.00     0.00聚季铵盐24                0.00     0.00     0.50     0.25月桂基硫酸铵              1.50     1.50     1.50     1.50氯化钠                    0.10     0.10     0.10     0.10棉子酸脂肪酸的蔗糖多酯    3.00     3.00     0.00     0.00廿二碳酸脂肪酸的蔗糖多酯  2.00     3.00     0.00     0.00聚二甲基硅氧烷            0.00     0.00     3.00     2.00椰油酰胺基丙基甜菜碱      0.00     1.00     3.00     3.00月桂基二甲基氧化胺        1.50     1.50     1.50     1.50癸基聚葡萄糖              0.00     0.00     1.00     1.00DMDM乙内酰脲              0.15     0.15     0.15     0.15实施例1-9的修饰多肽       2.00     5.00     0.10     5.00苯氧基乙醇                0.50     0.50     0.50     0.50香料                      0.50     0.50     0.50     0.50水                        适量     适量     适量     适量
                      100.00   100.00   100.00   100.00实施例25：液体餐具洗涤剂
                               (重量％)
C12乙氧基(1)硫酸盐              12.00
2-甲氧基十一酸                  4.50
C12乙氧基(2)羧酸盐              4.50
C12脂肪醇乙氧基化物(4)          3.00
C12氧化胺                       3.00
异丙基苯磺酸钠                  2.00
乙醇                            4.00
Mg++(为MgCl2)                  0.20
Ca++(为CaCl2)                  0.40
实施例1-9的修饰多肽                  1.00
水                                   适量
                                     100.00实施例26-27：洗衣粉
                     实施例26  实施例27
                     (重量％)C13直链烷基苯磺酸盐       22.0      12.0磷酸盐(为三聚磷酸钠)      23.0      0.0碳酸钠                    23.0      0.0硅酸钠                    14.0      0.0沸                        8.2       26.02-丁基辛酸                0.0       4.0C12-14仲链(2，3)烷基硫酸钠0.0       5.0柠檬酸钠                  0.0       5.0荧光增白剂                0.0       0.1二亚乙基三胺五乙酸        0.4       0.0硫酸钠                    5.5       17.0实施例1-9的修饰多肽       3.0       0.2水                        适量      适量
                      100.0     100.0实施例28：液体衣物洗涤剂
                               (重量％)
C13-C17链烷烃磺酸钠          10.00
月桂基醚-8                     5.00
月桂酰两性二丙酸钠             5.00
酶                             1.00
乙醇                           4.00
丙二醇                           6.00
聚季铵盐10                       0.50
柠檬酸                           2.00
三乙醇胺                        调至pH4.0
香精                             1.00
实施例1-9的修饰多肽              2.00
水                               适量
                                 100.00实施例29-30：硬表面清洁剂
                                实施例29     实施例30
                                 (重量％)
C12烷基苯磺酸钠                  1.95         0.00
C12烷基硫酸钠                    0.00         2.20
C12二乙二醇-己基醚硫酸钠         0.00         2.20
C12二甲基氧化胺                  0.00         0.50
异丙基苯磺酸钠                   1.30         0.00
己基卡必醇                       6.30         6.30
实施例1-9的修饰多肽              0.10         5.00
水                               适量         适量
                                 100.00       100.00实施例31：牙用组合物
                                (重量％)
山梨醇(70％水溶液)                35.0
聚乙二醇(MW＝600)                 1.0
牙用二氧化硅磨料                  20.0
氟化钠                            0.243
二氧化钛                          0.5
糖精钠                                0.286
烷基硫酸钠(27.9％水溶液)              4.0
风味剂                                1.0
羧乙烯基聚合物                        0.3
角叉菜胶                              0.8
实施例1-9的修饰多肽                   5.0
水                                    适量
                                      100.0实施例32：漱口剂组合物
                         (重量％)
SDA 40醇                  8.00
风味剂                    0.08
氟化钠                    0.05
甘油                      10.00
甜味剂                    0.02
苯甲酸                    0.05
氢氧化钠                  0.20
实施例1-9的修饰多肽       10.00
水                        适量
                          100.00实施例33：锭剂组合物
                         (重量％)
山梨醇                    17.50
甘露糖醇                  17.50
淀粉                      13.60
甜味剂                    1.20
风味剂                    11.70
色料                              0.10
实施例1-9的修饰多肽               0.05
玉米糖浆                          适量
                                  100.00实施例34：加酶隐形眼镜清洗液
                                 (重量％)
葡萄糖                            50.00
非离子表面活性剂                  2.00
(聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物)
阴离子表面活性剂                  1.00
(聚氧乙烯-烷基苯基醚硫酸酯钠)
氯化钠                            1.00
硼砂                              0.30
实施例1-9的修饰多肽               1.00
水                                适量
                                  100.00

Claims (19)

1、一种修饰多肽，其特征在于：它的酶活力水平为亲本多肽的70％以上，而变态反应水平为亲本多肽的33％以下。
2、一种具有降低的变应原性和高活性的修饰多肽，其特征在于：它包含下式：A-Bn其中：a)A是酶；b)B是总分子量为0.5KD-40KD并与蛋白酶缀合的双聚合物结构部分，其具有下列分子式：其中R1和R2基本上是直链聚合物，分子量为0.25KD-20KD；其中R1和R2的分子量比为1∶10-10∶1；和其中X是将双聚合物结构部分连接到酶上单一位点的连接部分；和c)n为1-15。
3、按照权利要求2的修饰多肽，其中：
酶A选自脂肪酶和蛋白酶及其混合物；和
其中该修饰多肽的酶活力水平为亲本多肽的70％以上，而变态反应水平为亲本多肽的33％以下。
4、按照权利要求2或3的修饰多肽，其中酶A选自脂肪酶和蛋白酶，它们又选自枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶型酶，及其混合物。
5、按照权利要求2-4任一项所述的修饰多肽，其中酶选自Alcalase、BPN’、蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶D、蛋白酶F，及其混合物。
6、按照权利要求2-5任一项所述的修饰多肽，其中双聚合物结构部分的总分子量为1KD至10KD，而单独的聚合物结构部分R1和R2的分子量为0.5KD至5KD。
7、按照权利要求6的修饰多肽，其中R1和R2的分子量比为1∶5-5∶1。
8、按照权利要求2-7任一项所述的修饰多肽，其中聚合物R1和R2包含聚乙二醇。
9、按照权利要求2-8任一项所述的修饰多肽，其中n为1-10。
10、按照权利要求2-9任一项所述的修饰多肽，其中X是活化赖氨酸琥珀酰亚胺基酯。
11、按照上述权利要求中任一项所述的修饰多肽，它显示出大于蛋白酶F活力的90％的酶活力水平，并显示出小于蛋白酶F的变态反应的5％的变态反应水平。
12、一种个人清洁组合物，它包含大于0.001％而小于20％的按照上述权利要求中任一项所述的修饰多肽。
13、一种衣物清洁组合物，它包含大于0.001％而小于20％的按照上述权利要求中任一项所述的修饰多肽。
14、一种口腔清洁组合物，它包含大于0.001％而小于20％的按照上述权利要求中任一项所述的修饰多肽。
15、一种局部护肤组合物，它包含大于0.001％而小于20％的按照上述权利要求中任一项所述的修饰多肽。
16、一种浴用凝胶，它包含大于0.001％而小于10％的按照上述权利要求中任一项所述的修饰多肽。
17、一种免洗除式皮肤增湿剂组合物，它包含大于0.001％而小于10％的按照上述权利要求中任一项所述的修饰多肽。
18、一种化妆品组合物，它包含大于0.001％而小于10％的按照上述权利要求中任一项所述的修饰多肽。
19、一种清洁擦组合物，它包含包含大于0.001％而小于10％的按照上述权利要求中任一项所述的修饰多肽的清洁组合物。
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