[go: up one dir, main page]

HU226233B1 - Erythropoietin derivatives - Google Patents

Erythropoietin derivatives Download PDF

Info

Publication number
HU226233B1
HU226233B1 HU0002553A HUP0002553A HU226233B1 HU 226233 B1 HU226233 B1 HU 226233B1 HU 0002553 A HU0002553 A HU 0002553A HU P0002553 A HUP0002553 A HU P0002553A HU 226233 B1 HU226233 B1 HU 226233B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
thr
conjugate
asn
glycoprotein
sequence
Prior art date
Application number
HU0002553A
Other languages
English (en)
Inventor
Pascal Sebastian Bailon
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27495518&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU226233(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of HU0002553D0 publication Critical patent/HU0002553D0/hu
Publication of HUP0002553A2 publication Critical patent/HUP0002553A2/hu
Publication of HUP0002553A3 publication Critical patent/HUP0002553A3/hu
Publication of HU226233B1 publication Critical patent/HU226233B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

A találmány tárgyát eritropoietin-konjugátumok képezik, melyek legalább egy szabad aminocsoporttal rendelkező eritropoietin-glikoproteint tartalmaznak, és a csontvelősejtekben retikulociták és vörösvértestek termelődésének fokozódását kiváltó in vivő biológiai aktivitással rendelkeznek.
A találmány szerinti konjugátumokban az eritopoietinglikoprotein lehet például humán eritropoietin vagy olyan analógja, melynek szekvenciája humán eritropoietin szekvenciájának módosításával származtatható, 1-6 glikozilációs hely addicionáltatásával vagy legalább egy glikozilációs hely átrendezésével, a glikoprotein kovalensen van kapcsolva -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR- képletű, „n polietilénglikol-csoporthoz, az egyes poliétilénglikolcsoportok -CO (azaz karbonil-) csoportjain keresztül, az egyik aminocsoporttal amidkötést kialakítva, ahol n és m úgy van megválasztva, hogy a konjugátum molekulatömegéből az eritropoietin-glikoprotein molekulatömegét levonva 20 és 100 kilodalton közötti molekulatömeget kapunk.
A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti konjugátumokat tartalmazó gyógyászati készítmények is.
Az eritropoiezis vörösvértestek termelését jelenti, amely sejtpusztulással ellentétes folyamatként játszódik le. Az eritropoiezis kontrollált fiziológiai mechanizmus, amely elegendő mennyiségű vörösvértestet biztosít a szövetek megfelelő oxigénellátásához. A természetesen előforduló humán eritropoietin (hEPO) a vesében termelődik, és humorális plazmafaktorként működik, amely a vörösvértestek termelődését stimulálja [Carnot, P. és Deflandre, C., C. R. Acad. Sci. 143, 432 (1906); Erslev, A. J., Blood 8, 349 (1953); Reissmann, K. R., Blood 5, 372 (1950); Jacobson, L. O., Goldwasser, E., Freid, W. és Plzak, L. F., Natúré 179, 6331-6334 (1957)]. A természetesen előforduló EPO stimulálja a csontvelőben lévő, specifikus eritroidprogenitorok („előalakok) osztódását és differenciálódását, és biológiai aktivitását eritroidprekurzorokon lévő receptorokhoz való kötődés útján fejti ki [Krantz,
B. S„ Blood 77, 419(1991)].
Az eritropoietint bioszintetikusán, rekombináns DNS technológia alkalmazásával állítják elő [Egrié, J.
C. , Strickland, T. W., Lane, J. és munkatársai, Immunbioi. 72, 213-224 (1986)] és klónozott humán EPO terméke, melyet kínai hörcsög petefészek szövetéből származó sejtekben (CHO-sejtekben) expresszálnak. Az EPO túlsúlyban lévő, teljesen processzált formájának primer struktúráját bemutatjuk az 1. azonosító számú szekvenciában. Két diszulfidhíd van a Cys7-Cys161 és Cys29-Cys33 között. Az EPO polipeptidláncának molekulatömege cukorcsoportok nélkül 18 236 Da. Az intakt EPO-molekula molekulatömegének mintegy 40%-a szénhidrátcsoportoknak tulajdonítható, amelyek a fehérjén lévő glikozilációs helyeken glikozilálják a fehérjét [Sasaki, H., Bothner, B., Dell, A. és Fukuda, M., J. Bioi. Chem. 262, 12059 (1987)].
Mivel a humán eritropoietin esszenciális a vörösvértestek képzésében, a hormon hatékonyan alkalmazható olyan vérrel kapcsolatos rendellenességek kezelésében, amelyeket alacsony mértékű vagy tökéletlen vörösvértest-termelés jellemez. AZ EPO-t klinikai gyakorlatban anémia kezelésére alkalmazzák krónikus veseelégtelenségben (CRF) szenvedő pácienseken [Eschbach, J. W., Egrié, J. C., Downing, M. R. és munkatársai, NEJM 316, 73-78 (1987); Eschbach, J. W„ Abdulhadi, Μ. H., Browne, J. K. és munkatársai, Ann. Intern. Med. 111, 992 (1989); Egrié, J. C., Eschbach, J. W., McGuire, T„ Adamson, J. W., Kidney Inti. 33, 262 (1988); Lim, V. S., Degowin, R. L., Zavala, D. és munkatársai, Ann. Intern. Med. 110, 108-114 (1989)] és AIDS-ben, valamint rákban szenvedő pácienseknél, akik kemoterápián estek át [Dánná, R. P., Rudnick, S. A., Abels, R. I., „Erythropoietin in Clinical Applications An International Perspective” c. könyvben, szerk. Μ. B. Garnick, New York, NY: Marcel Dekker; 301-324. old. (1990)]. Azonban a kereskedelemben rendelkezésre álló fehérje-terapeutikák, például EPO biológiai hozzáférhetőségét korlátozza rövid féléletideje a plazmában és proteázos lebontással szembeni érzékenysége. Ezek a hiányosságok megakadályozzák, hogy elérjük a maximális klinikai hatékonyságot.
A találmány tárgya eritropoietin-konjugátum, amely konjugátum legalább egy szabad aminocsoporttal rendelkező eritropoietin-glikoproteint tartalmaz, és olyan in vivő biológiai aktivitással rendelkezik, amely a csontvelősejtekben retikulociták és vörösvértestek termelődésének fokozódását okozza, az eritopoietin-gllkoprotein lehet például humán eritropoietin vagy analógjai, amelyek szekvenciája humán eritropoietin szekvenciájának módosításával származtatható, 1-6 glikozilációs hely addicionáltatásával vagy legalább egy glikozilációs hely átrendezésével; a glikoprotein kovalensen van kapcsolva -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR- képletű, „n” polietilénglikol-csoporthoz az egyes polietilénglikolcsoportok -CO (azaz karbonil-) csoportjain keresztül, amidkötést kialakítva az egyik aminocsoporttal; ahol R jelentése kis szénatomszámú alkilcsoport; x jelentése 2 vagy 3; m jelentése mintegy 400 és mintegy 900 közötti szám; n jelentése 1 és 3 közötti szám; és n és m úgy van megválasztva, hogy a konjugátum molekulatömegéből levonva az eritropoietin-glikoprotein molekulatömegét 20 kilodalton és 100 kilodalton közötti molekulatömeghez jutunk. A találmány tárgyát képezik továbbá a leírás szerinti konjugátumokat tartalmazó készítmények, ahol a készítményben lévő konjugátum (ahol n=1) százalékos mennyisége legalább kilencven százalék.
Módosítatlan EPO-hoz (azaz PEG-kapcsolás nélküli EPO-hoz) és hagyományos PEG-EPO-konjugátumokhoz hasonlítva, a találmány szerinti konjugátumok megnövekedett féléletidővel rendelkeznek a keringésben, több időt töltenek a plazmában, csökkent mértékben ürülnek ki és fokozott in vivő klinikai aktivitást fejtenek ki. A találmány szerinti konjugátumok alkalmazása megegyezik az EPO alkalmazásával. A találmány szerinti konjugátumok páciensek kezelésére alkalmasak, különösen csontvelőben lévő, specifikus eritroid-progenitorok osztódásának és differenciálódásának stimulálásával, az EPO-val megegyező módon alkalmazhatók páciensek kezelésére.
HU 226 233 Β1
A találmány tárgyát konjugátumok képezik, amelyek legalább egy szabad aminocsoporttal rendelkező eritropoietin-glikoproteint tartalmaznak, és olyan in vivő biológiai aktivitással rendelkeznek, amely a csontvelősejtekben retikulociták és vörösvértestek termelődésének fokozódását okozza, az erítopoietin-glikoprotein lehet például humán eritropoietin vagy analógjai, amelyek szekvenciája humán eritropoietin szekvenciájának módosításával származtatható, 1-6 glikozilációs hely addicionáltatásával vagy legalább egy glikozilációs hely átrendezésével; a glikoprotein kovalensen van kapcsolva -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR- képletű, „n” polietilénglikol-csoporthoz az egyes polietilénglikol-csoportok -CO (azaz karbonil-) csoportjain keresztül, amidkötést kialakítva az egyik aminocsoporttal; ahol R jelentése kis szénatomszámú alkilcsoport; x jelentése 2 vagy 3; m jelentése mintegy 400 és mintegy 900 közötti szám; n jelentése 1 és 3 közötti szám; és n és m úgy van megválasztva, hogy a konjugátum molekulatömegéből levonva az eritropoietin-glikoprotein molekulatömegét 20 kilodalton és 100 kilodalton közötti molekulatömeghez jutunk.
Azt találtuk, hogy a találmány szerinti konjugátumot ugyanúgy lehet alkalmazni, mint a módosítatlan EPO-t. A találmány szerinti konjugátumok viszont megnövekedett féléletidővel rendelkeznek a keringésben, több időt töltenek a plazmában, csökkent mértékben ürülnek ki és fokozott in vivő klinikai aktivitást fejtenek ki. Ezen javított tulajdonságok miatt a találmány szerinti konjugátumokat elég hetente egyszer beadni hetente háromszori alkalom helyett, melyet a módosítatlan EPO esetén alkalmaznak. A csökkent beadási gyakoriság alapján várható, hogy jobban szolgálja a páciens igényeit, amely javított kezelési eredményekhez vezet, valamint a páciens életminősége javul. A hagyományos poli(etilénglikolhoz) kapcsolt EPO-konjugátumokhoz viszonyítva azt találtuk, hogy a találmány szerinti konjugátumok molekulatömegével és linkerstruktúrájával rendelkező konjugátumok javított hatékonysággal, stabilitással, AUC-al, keringésben megfigyelt féléletidővel és költségprofillal rendelkeznek.
A találmány szerinti konjugátumokat terápiásán hatásos mennyiségben az EPO-val megegyező módon adhatjuk be pácienseknek. Terápiásán hatásos mennyiség akkora konjugátummennyiség, amely csontvelősejtekre kifejtett in vivő biológiai aktivitáshoz szükséges, retikulociták és vörösvértestek fokozott termelésének előidézéséhez. A konjugátum pontos mennyiségét olyan faktorok alapján választjuk meg, mint a kezelendő állapot pontos típusa, a kezelendő páciens állapota, valamint a készítményben lévő más alkotórész természete. Testtömeg-kg-ként például 0,01 pg és 10 pg, előnyösen 0,1 pg és 1 pg közötti mennyiséget adhatunk be, például hetenként egyszer.
A konjugátumot tartalmazó gyógyászati készítményeket olyan erősségűre lehet formázni, hogy alacsony mértékű vagy tökéletlen vörösvértest-termelést mutató, humán páciensnek különféle módon beadva hatékony legyen. A konjugátum terápiásán hatásos, átlagos mennyisége változhat, és azt elsősorban képzett orvos ajánlatára és előírására kell alapozni.
A találmány szerint előállított eritropoietin-glikoprotein termékeket olyan gyógyászati készítményként állítjuk elő szakember által ismert eljárás alkalmazásával, amely injekcióként való beadásra alkalmas, és amely gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy segédanyagot tartalmaz. Például alkalmas készítményeket írtak le a WO97/09996, WO 97/40850, WO98/58660 és W099/07401 sz. nemzetközi közzétételi iratokban. Előnyösen alkalmazható, a találmány szerinti termékek formázására alkalmas, gyógyászatilag elfogadható hordozó például humán szérumalbumin, humán plazmafehérjék stb. A találmány szerinti készítményeket izotóniát biztosító ágenst, például 132 mM nátrium-kloridot tartalmazó, 10 mM nátrium/kálium-foszfát-pufferben (pH=7) lehet kiszerelni. A gyógyászati készítmény adott esetben tartalmazhat tartósítószert. A gyógyászati készítmény tartalmazhat különböző mennyiségű eritropoietint, például 10 pg/ml és 1000 pg/ml közötti koncentrációban, például 50 pg-ot vagy 400 pg-ot.
Az „eritropoietin vagy „EPO kifejezés a leírásban olyan glikoproteint jelent, amely az 1. vagy 2. azonosító számú szekvenciával vagy ezekkel lényegében homológ aminosavszekvenciával rendelkezik, amelynek biológiai tulajdonságai vörösvértest-termelés stimulálásával és a csontvelőben lévő eritroid-progenitorok osztódásának és differenciálódásának stimulálásával hozható kapcsolatba. A kifejezésen értünk olyan fehérjéket is, amelyeket szándékosan módosítottunk, például helyspecifikus mutagenezissel, vagy amelyek véletlenszerűen módosultak mutációkkal. A kifejezésen értünk olyan analógokat, amelyek 1 és 6 közötti, további glikozilációs hellyel (helyekkel) rendelkeznek; olyan analógokat, amelyek legalább egy további aminosawal rendelkeznek a glikoprotein karboxiterminális végénél, amely további aminosav legalább egy glikozilációs helyet tartalmaz; és olyan analógokat, amelyekben legalább egy glikozilációs hely átrendeződése történt. A kifejezésen értünk természetesen előforduló és rekombinánsan előállított humán eritropoietint.
A találmány szerinti eritropoietin-konjugátumokat az (I) általános képlettel lehet ábrázolni:
P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n (I) ahol x, m, n és R jelentését fentebb definiáltuk. Az (I) általános képletben P jelentése a leírás szerinti eritropoietin-glikoprotein csoportja (azaz az I. általános képletben látható karbonilcsoporttal amidkötést kialakító aminocsoport vagy aminocsoportok nélkül), amelynek in vivő biológiai aktivitása csontvelősejtekben retikulociták és vörösvértestek termelődésének fokozódását okozza.
A találmány előnyös megvalósítási módja szerint R jelentése metil. Előnyösen m jelentése mintegy 650 és mintegy 750 közötti szám, n jelentése előnyösen 1.
A találmány legelőnyösebb megvalósítási módja szerint R jelentése metil, m jelentése mintegy 650 és mintegy 750 közötti szám, és n jelentése 1, azaz a fentebb definiált konjugátum az alábbi általános képlettel írható le:
[CH3O(CH2CH2O)mCH2CH2CH2CO-NH]n-P
HU 226 233 Β1 ahol m jelentése 650 és 750 közötti szám, n jelentése 1, és P jelentését fentebb definiáltuk. Előnyösen m jelentése átlagosan mintegy 680.
A fentebb definiált konjugátumban a glikoprotein előnyösen humán eritropoietin. A fentebb definiált humán eritropoietint és analóg fehérjéket endogén génaktiválással lehet expresszálni. Humán eritropoietin-glikoproteinek előnyösen 1. és 2. azonosító számú szekvenciával, legelőnyösebben az 1. azonosító számú szekvenciával rendelkeznek.
Továbbá P jelentése lehet például olyan humán eritropoietin vagy analógja, amelyek legalább 1 és 6 közötti, további glikozilációs helyet tartalmaznak. A lentebb részletesen bemutatottak szerint, EPO előállítása és tisztítása szakember számára jól ismert. A leírásban az EPO kifejezés a természetes vagy rekombináns, előnyösen humán fehérjét jelenti, ahogyan bármilyen szokásos forrásból előállítjuk azt, például szövetekből, fehérjeszintézissel, természetes vagy rekombináns sejtekből álló sejttenyészetből. Bármilyen EPO-aktivitással rendelkező fehérjét, például muteineket vagy másképpen módosított fehérjéket a találmány tárgyának tekintünk. Rekombináns EPO-t CHO-, BHK- vagy HeLa-sejtvonalakban lehet expresszáltatni rekombináns DNS technológia alkalmazásával vagy endogén génaktiválással. Fehérjék, például EPO expresszálása endogén génaktiválással szakember számára jól ismert, leírásokat lásd 5.733.761, 5.641.670 és 5.733.746 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban, és a WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 és WO 91/09955 számú nemzetközi közzétételi iratokban, melyek tartalmát a kitanítás részének tekintjük. Eritropoietin glikoproteintermékek előállítására szolgáló EPO-fajták előnyösen humán EPO-fajták. Előnyösebben alkalmazott EPO-fajta az 1. vagy 2. azonosító számú aminosavszekvenciával, előnyösebben az 1. számú aminosavszekvenciával rendelkező humán EPO.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, P lehet olyan glikoproteinanalóg, amely 1 és 6 közötti, további glikozilációs hellyel rendelkezik. Fehérje glikozilációja egy vagy több oligoszacharidcsoporttal egy polipeptidváz speciális helyein következik be, és nagymértékben befolyásolja a fehérje fizikai tulajdonságait, például a fehérje stabilitását, szekrécióját, szubcelluláris lokalizációját és biológiai aktivitását. A glikoziláció rendszerint két típusú lehet. O-kapcso(t oligoszacharidok szerinhez vagy treoninhoz kapcsolódnak, és N-kapcsolt oligoszacharidok aszparaginhoz kapcsolódnak. Azonos típusú oligoszacharid található mind az N-kapcsolt és az O-kapcsolt oligoszacharidokon, amely N-acetil-neuraminsav (sziálsav), amely 9 vagy több szénatomos aminocukrok családjába tartozik. A sziálsav rendszerint mind az N-kapcsolt, mind az O-kapcsolt oligoszacharidok terminális csoportja, és mivel negatív töltésű, savas tulajdonságokat határoz meg a glikoproteinen. A 165 aminosavból álló, humán eritropoietin három N-kapcsolt és egy O-kapcsolt oligoszacharidláncot tartalmaz, amely a glikoprotein összmolekulatömegének 40%-át jelenti. N-kapcsolt glikoziláció a 24., 38. és 83. helyzetben lévő aszparaginokon játszódik le, és O-kapcsolt glikoziláció a 126. helyzetben lévő szerinen játszódik le. Az oligoszacharidláncok terminális sziálsavcsoportokkal módosulnak. Az összes sziálsavcsoport enzimatikus eltávolítása a glikozilált eritropoietinről az in vivő aktivitás elvesztését eredményezi, de az in vitro aktivitás elvesztését nem eredményezi, mivel az eritropoietin szialiláltsága megakadályozza a májból származó kötőfehérjék kötődését, és azt követően kiválasztását.
A találmány szerinti glikoproteinek közé tartoznak olyan humán eritropoietinanalógok, amelyek a humán eritpoietin aminosavszekvenciájában egy vagy több olyan változtatást tartalmaznak, amelyek sziálsav-kapcsolódási helyek számának növekedését eredményezik. Ezeket a glikoproteinanalógokat helyspecifikus mutagenezissel lehet előállítani, olyan aminosavak addíciójával, deléciójával vagy szubsztitúciójával, amelyek megnövelik vagy megváltoztatják a glikozilálásra rendelkezésre álló helyeket. Humán eritropoietinben találhatónál több sziálsavat tartalmazó glikoproteinanalógokat glikozilációs helyek hozzáadásával lehet előállítani, amelyek nem zavarják a biológiai aktivitáshoz szükséges másodlagos vagy harmadlagos konformációt. A találmány szerinti glikoproteinek közé tartoznak olyan analógok is, amelyek megnövelt mennyiségben tartalmaznak kapcsolt szénhidrátot egy glikozilációs helynél, amely rendszerint egy N-kapcsolt vagy O-kapcsolt helyhez közeli szomszédságban, egy vagy több aminosav szubsztitúcióját jelenti. A találmány szerinti glikoproteinek közé tartoznak olyan analógok is, amelyek az eritropoietin karboxiterminálisától kiindulva egy vagy több aminosawal rendelkeznek, amely legalább egy további szénhidrátkapcsolódási helyet biztosít. A találmány szerinti glikoproteinek közé tartoznak olyan analógok is, amelyek legalább egy glikozilációs hely átrendeződését tartalmazó aminosavszekvenciával rendelkeznek. Glikozilációs hely ilyen átrendeződése magában foglal humán eritropoietinben egy vagy több glikozilációs hely delécióját, és egy vagy több, természetesen elő nem forduló glikozilációs hely hozzáadását. Az eritropoietinben lévő szénhidrátláncok számának, és ennélfogva az eritropoietinmolekulákra eső sziálsavak számának növelése előnyös tulajdonságokat határozhat meg, például fokozott oldhatóságot, proteolízissel szemben nagyobb rezisztenciát, csökkent immunogenitást, megnövekedett féléletidőt és fokozott biológiai aktivitást. Hozzáadott glikozilációs helyekkel rendelkező eritropoietinanalógokat részletesen leírnak a 640.619 számú európai közzétételi iratban (Elliot, közzétéve 1995. március 1-én).
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti glikoproteinek olyan aminosavszekvenciát tartalmaznak, amely legalább egy hozzáadott glikozilációs helyet tartalmaz, például olyan eritropoietinek, amelyek az alábbiakban leírt módosítások egyikével módosított humán eritropoietinszekvenciát tartalmaznak:
Asn30Thr32;
Asn51Thr53;
HU 226 233 Β1
Asn57Thr59;
Asn69;
Asn69Thr71;
Ser^Asn^hr71;
Val87Asn88Thr90;
Ser87Asn88Thr90;
Ser87Asn88Gly89Thr90;
Ser87Asn88Thr90Thr92;
Ser87Asn88Thr90Ala162;
Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90;
Asn30Thr32Val87Asn88Thr90;
Asn89lle90Thr91;
Ser87Asn89lle90Thr91;
Asn136Thr138;
Asn138Thr140;
Thr125; és
Pro124Thr125.
Aminosavszekvencia módosítására itt alkalmazott feisőindexben lévő jelölések a megfelelő módosítatlan fehérjében (például 1. vagy 2. azonosító számú szekvenciával rendelkező hEPO) lévő pozíció(ka)t jelentik, ahol az aminosavak ki lettek cserélve arra (azokra) az aminosav(ak)ra, amelyet közvetlenül a megfelelő szám előtt feltüntettünk.
A glikoprotein lehet olyan analóg is, amely legalább egy hozzáadott aminosavat tartalmaz a glikoprotein karboxiterminális végénél, amely hozzáadott aminosav legalább egy glikozilációs helyet tartalmaz, azaz a fentebb definiált konjugátum lehet olyan vegyület is, amelyben a glikoprotein humán eritropoietinszekvenciát és egy második szekvenciát tartalmaz a humán eritropoietin karboxiterminálisánál, amely második szekvencia legalább egy glikozilációs helyet tartalmaz. A hozzáadott aminosav tartalmazhat humán choriogonadotropin karboxiterminálisából származó peptidfragmenst. A glikoprotein előnyösen lehet például (a) humán eritropoietin, amely a karboxiterminálistól kiindulva Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-ProSer-Pro-Ser-Arg- (3. azonosító számú szekvencia) szekvenciával rendelkezik; (b) az (a) pontban ismertetett analóg, amely továbbá Ser87Asn88Thr90-EPO-t tartalmaz; és (c) az (a) pontban ismertetett analóg, amely továbbá Asn30Thr32Val87Asn88Thr90-EPO-t tartalmaz.
A glikoprotein lehet olyan analóg is, amelynek aminosavszekvenciájában legalább egy glikozilációs hely át van rendezve. Az átrendeződés jelentheti a humán eritropoietin bármelyik N-kapcsolt szénhidráthelyének delécióját, és egy N-kapcsolt szénhidráthely addícióját a humán eritropoietin aminosavszekvenciájának 88. helyzetében. A glikoprotein előnyösen olyan analóg, amely Gln24Ser87Asn88Thr90-EPO; Gln38Ser8' 7Asn88Thr90-EPO vagy Gln83Ser87Asn88Thr90-EPO.
Az „kis szénatomszámú alkil” kifejezés jelentése a leírásban lineáris vagy elágazó láncú alkilcsoport, amely egy és hat közötti szénatomot tartalmaz. „Kis szénatomszámú alkil” például metil, etil és izopropil. A találmány szerinti megoldásban R jelentése bármilyen kis szénatomszámú alkilcsoport. Olyan konjugátumokat részesítünk előnyben, ahol R jelentése metil.
Az „m az etilén-oxid-csoportok (OCH2CH2) számát jelenti a poli(etilén-oxid)-csoportban. Az etilén-oxid egyetlen PEG-alegysége mintegy 44 dalton molekulatömegű. Tehát a konjugátum molekulatömege (nem számítva az EPO molekulatömegét) az „m” számtól függ. A találmány szerinti konjugátumokban „m jelentése mintegy 450 és mintegy 900 közötti szám (amely megfelel mintegy 20 kDa és mintegy 40 kDa közötti molekulatömegnek), előnyösen mintegy 650 és mintegy 750 közötti szám (amely megfelel mintegy 30 kDa molekulatömegnek). Az „m” számot úgy választjuk meg, hogy az eredményül kapott, találmány szerinti konjugátum a módosítatlan EPO-val összehasonlítható fiziológiai aktivitással rendelkezzen, amely aktivitás ugyanakkora, nagyobb vagy egy része a megfelelő, módosítatlan EPO aktivitásának. A molekulatömegre alkalmazott „mintegy” kifejezésen egy olyan meghatározott számot értünk, amely ezen szám körül egy elfogadható tartományba esik, szokásos analitikai technikákkal meghatározva. Az „m” számot úgy választjuk meg, hogy az eritropoitein-glikoproteinhez kapcsolt polietilénglikol-csoport molekulatömege mintegy 20 kDa és mintegy 40 kDa között legyen, és előnyösen mintegy 30 kDa legyen.
A találmány szerinti konjugátumokban lévő „n” szám eritropoietinfehérje szabad aminocsoportjaihoz (beleértve lizin aminosav ε-amino-csoportjait és/vagy az aminoterminális aminocsoportot) amidkötésen keresztül kovalensen kapcsolt polietilénglikol-csoportok száma. A találmány szerinti konjugátum rendelkezhet egy, kettő vagy három PEG-csoporttal EPO-molekulánként. Az „n” 1 és 3 közötti egész szám, az „n” előnyösen 1 vagy 2, és „n” előnyösebben 1.
Az (I) általános képletű vegyületet az ismert, (II) általános képletű polimer anyagból lehet előállítani:
RO(CH2CH2O)m(CH2)xCOON ahol R és m jelentését fentebb definiáltuk úgy, hogy a (II) általános képlettel rendelkező vegyületet kondenzáljuk az eritropoietin-glikoproteinnel. A (II) általános képletű vegyületek, ahol x jelentése 3:polietilénglikol alfa-(kis szénatomszámú alkoxi)-vajsav-szukcinimidilészterei (kis szénatomszámú alkoxi-PEG-SBA). A (II) általános képletű vegyületek, ahol x jelentése 2:polietilénglikol alfa-(kis szénatomszámú alkoxi)-propionsavszukcinimidil-észterei (kis szénatomszámú alkoxiPEG-SPA). Bármilyen szokásos módszert alkalmazhatunk, amely aktivált észter és amin reagáltatására szolgál amid kialakítása céljából. A fentebb leírt reakcióban a példaként bemutatott szukcinimidil-észter egy távozócsoport, amely amid képződését okozza. Szukcinimidil-észterek, például (II) általános képletű vegyületek alkalmazását fehérjékkel való konjugátumok előállítása céljából lásd az 5.672.662 számú amerikai egyesült ál5
HU 226 233 Β1 lamokbeli szabadalmi leírást (Harris és munkatársai, közzétéve 1997. szeptember 30.).
Humán EPO kilenc szabad aminocsoportot, az aminoterminális aminocsoportot, plusz 8-lizin-e-amino-csoportot tartalmaz. Ha a pegiláló reagenst kombináltuk a (II) általános képletű SBA-vegyülettel, azt találtuk, hogy pH=7,5-n, 1:3 fehérje:PEG aránynál és 20-25 °C reakció-hőmérsékleten mono-, di- és nyomnyi mennyiségben tripegilált vegyületfajták keletkeztek. Ha a pegiláló reagens (II) általános képletű SPA-vegyület volt, hasonló körülmények között, kivéve, hogy a fehérje:PEG arány 1:2 volt, főleg a monopegilált vegyületfajta keletkezett. A pegilált EPO-t beadhatjuk keverék formájában, vagy kationcserére alapuló kromatográfiával a különböző pegilált vegyületfajtákat elválasztva. A reakció körülményeit változtatva (például a reagensek arányát, pH-ját, hőmérsékletet, fehérjekoncentrációt, a reakció idejét stb.) a különböző pegilált formák relatív mennyiségét változtatni lehet.
A humán eritropoietin (EPO) humán glikoprotein, amely eritrociták képződését stimulálja. Előállítását és terápiás alkalmazását részletesen leírták az 5.547.933 és 5.621.080 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban; az Ep-B 0.148.605 számú európai közzétételi iratban; Huang, S. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2708-2712 (1984); EP-B 0.205.564, EP-B 0.209.539 és EP-B 0.411.678 számú európai közzétételi iratokban, valamint Lai, P. és munkatársai, J. Bioi. Chem. 261, 3116-3121 (1986), Sasaki, H. és munkatársai, J. Bioi. Chem. 262, 12 059-12 076 (1987). Az eritropoietint terápiás alkalmazásra rekombináns eszközökkel lehet előállítani [EP-B 0.148.605, EP-B 0.209.539 számú európai közzétételi iratok, és Egrié, J. C., Strickland, T. W., Lane, J. és munkatársai, Immunobioi. 72, 213-224 (1986)].
Eritropoietin szérummentes tápközegben való expresszálására és előállítására szolgáló eljárások céljából lásd WO 96/35718 számú nemzetközi közzétételi iratot (közzétéve 1996. november 14.) és az 513.738 számú európai közzétételi iratot (Koch, közzétéve 1992. június 12.). A fentebb említett közleményeken kívül ismeretes, hogy EPO-gént tartalmazó, rekombináns CHO-sejtek szérummentes fermentációját lehet végrehajtani. Ilyen eljárásokat leírtak például az EP-A 0.513.738, EP-A 0.267.678 számú európai közzétételi iratokban, és általános formában Kawamoto, T. és munkatársai, Analytical Biochem. 130, 445-453 (1983); EP-A 0.248.656, Kowar, J. és Franek, F„ Methods in Enzymology 421, 277-292 (1986); Bavister, B., Expcology 271, 45-51 (1981); EP-A 0.481.791, EP-A 0.307.247, EP-A 0.343.635, számú európai és WO 88/00967 számú nemzetközi közzétételi iratokban.
Az EP-A 0.267.678 számú európai közzétételi iratban leírtak ioncserére alapuló kromatográfiát S-Sepharose-on, preparatív, fordított fázisú HPLC-t C8-oszlopon és gélszűrést szérummentes tenyészetben termeltetett EPO tisztítására, dialízis után. Ebben a vonatkozásban a gélszűrési lépést helyettesíteni lehet ioncserére alapuló kromatográfiával „S-Sepharose fást flow”-n. Javasolnak festéket alkalmazó kromatográfiát is, melyet Blue Trisacryl-t tartalmazó oszlopon végeznek az ioncserére alapuló kromatográfia előtt.
Rekombináns EPO tisztítására szolgáló eljárást leírtak Nobuo, I. és munkatársai, J. Biochem. 107, 352-359 (1990). Ebben az eljárásban viszont EPO-t Tween®20-at, fenil-metil-szulfonil-fluoridot, etil-maleimidet, pepsztatin-A-t, réz-szulfátot és oxámsavat tartalmazó oldattal kezeltek a tisztítási lépések előtt. Közleményekben, például a WO 96/35718 számú nemzetközi közzétételi iratban (Burg, közzétéve 1996. november 14.) leírnak eritropoietin előállítására szolgáló eljárást szérummentes fermentációs eljárás alkalmazásával (az így előállított EPO jelölése EPOsf).
A találmány szerinti EPO vagy EPO-konjugátumok specifikus aktivitását szakember által ismert, különféle vizsgálati eljárások alkalmazásával lehet meghatározni. A találmány szerinti tisztított EPO-fehérjék biológiai aktivitása olyan, hogy az EPO-fehérje beadása humán pácienseknek injekcióval csontvelősejtekben retikulociták és vörösvértestek termelődésének fokozódását eredményezze, nem injektált vagy kontroll kísérleti alanyok csoportjához viszonyítva. A találmány szerint előállított és tisztított EPO-fehérjék, vagy fragmenseik biológiai aktivitását Annable és munkatársai [Bull. Wld. Hlth. Org. 47, 99-112 (1972)] által, valamint a „Pharm. Európa Spec. Isuue Erythropoietin BRP Bio-ban [1997 (2)] leírtak szerint lehet tesztelni. EPO-fehérje aktivitásának meghatározására szolgáló más biológiai vizsgálati eljárást, normális vörösvértest-tartalommal rendelkező egeret alkalmazó vizsgálati eljárást leírunk a 4. példában.
A találmány tárgyát képezi a fentebb leírt konjugátumokat tartalmazó készítmény. A készítmény legalább kilencven százalék mono-PEG-konjugátumot tartalmaz, azaz olyat, ahol n jelentése 1, és amelyet az 5. példában leírtak szerint lehet előállítani. Általában eritropoietin-glikoproteinek mono-PEG-konjugátumai kívánatosak, mivel nagyobb aktivitást képesek kifejteni, mint a di-PEG-konjugátumok. Mono-PEG-konjugátumok százalékos arányát, valamint mono- és di-PEGfajták arányát úgy lehet szabályozni, hogy a monoPEG százalékos mennyiségének csökkentése céljából szélesebb frakciókat gyűjtünk az elúciós csúcs körül, vagy a készítményben lévő mono-PEG százalékos mennyiségének növelése céljából szűkebb frakciókat gyűjtünk. Mintegy kilencven százalék mono-PEG-konjugátum jó egyensúlyt biztosít hozamban és aktivitásban. Néha olyan készítmények lehetnek kívánatosak, amelyekben a konjugátumok legalább kilencvenkét százaléka vagy legalább kilencvenhat százaléka mono-PEG-vegyületfajta (n=1). A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, n=1 esetén a konjugátumok mennyisége kilencven és kilencvenhat százalék között van.
A találmány tárgyát képezik a megfelelő gyógyászati készítmények, amelyek fentebb leírt konjugátumot vagy készítményt és gyógyászatilag elfogadható segédanyagot tartalmaznak.
A találmány szerinti konjugátumok és készítmények különösen hasznosak olyan gyógyszerek előállítására,
HU 226 233 Β1 amelyek krónikus veseelégtelenségben (CRF) előforduló anémiával, AIDS-el kapcsolatba hozható betegségek kezelésére és profilaxisára, valamint rákban szenvedő, kemoterápián átesett páciensek kezelésére szolgálnak.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás krónikus veseelégtelenségben (CRF) előforduló anémiával, AIDS-el kapcsolatba hozható rendellenességek, valamint rákban szenvedő, kemoterápián átesett páciensek profilaktikus és/vagy terápiás kezelésére, amelyben a páciensnek beadjuk a fentebb leírt készítményt.
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás a fentebb leírt vegyületek előállítására, amely eljárásban a (II) általános képletű vegyületet
kondenzáljuk eritropoietin-glikoproteinnel, amely R, m és x jelentését fentebb definiáltuk.
A találmány tárgyát képezik a fentebb definiált vegyületek krónikus veseelégtelenségben (CRF) előforduló anémiával, AIDS-el asszociált betegségek és kemoterápián átesett, rákban szenvedő páciensek kezelésére.
A találmány szerinti megoldást az alábbi példákra hivatkozva tesszük érthetőbbé, amelyekkel szemléltetjük és nem korlátozzuk a találmány leírás szerinti megoldását.
1. példa
Humán EPO fermentációja és tisztítása
a) Inokulum előállítása és fermentáció
EPO-t termelni képes CHO-sejtvonalat [ATCC
CRL8695 sejtvonalat alkalmazhatunk, közzétéve EP 411.678 számú európai közzétételi iratban (Genetics Institute)] tartalmazó tárolóedényt („Working Cell Bank”) kiveszünk folyékony nitrogént tartalmazó tárolótartály gázfázisából. A sejteket átvisszük üveg rázóedényekbe, és hidrogén-karbonát-pufferolt tápközegben tenyésztjük, párásított C02-inkubátorban. Inokulum preparálásához és fermentációhoz alkalmazott, tipikus szérummentes tápközeg leírását lásd az 513.738 számú európai közzétételi iratban (Koch, közzétéve 1992. június 12.), vagy a WO 96/35718 számú nemzetközi közzétételi iratban (Burg, közzétéve 1996. november 14.), amely például tartalmaz DMEM/F12-tápközeget (például JRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, US, rendelési szám: No. 57-736), és továbbá nátriumhidrogén-karbonátot, L+glutamint, D+glükózt, rekombináns inzulint, nátrium-szelenitet, diamino-butánt, hidrokortizont, vas(ll)-szulfátot, aszparagint, aszparaginsavat, szerint és emlőssejtekhez alkalmazható stabilizátort, például poli(vinil-alkohol)t, metil-cellulózt, polidextránt, polietilénglikolt, Pluronic F68-at, plazmaexpander poligelint (HEMACCEL®) vagy polivinil-pirrolidint tartalmaz (lásd WO 96/35718 számú nemzetközi közzétételi iratot).
A tenyészeteket mikroszkopikusan vizsgáljuk szennyező mikroorganizmusok jelenlétére, és meghatározzuk a sejtsűrűséget. Ezeket a teszteket a folyamatsor valamennyi elágazó lépésénél elvégezzük.
A kezdeti növekedési időszak után a sejttenyészetet friss tápközeggel hígítjuk a kiindulási sejtsűrűségre és egy másik növesztési ciklusnak vetjük alá. Ezt az eljárást addig ismételjük, amíg a tenyészet térfogata rázóedényenként mintegy 2 l-t el nem ér. Mintegy 12 ismétlés után 1-5 liter tenyészet áll rendelkezésre, amelyet azután oltóanyagként használunk 10 l-es inokulum-fermentációhoz.
3-5 nap múlva a 10 l-es fermentorban lévő tenyészet használható 100 l-es inokulum-fermentor oltóanyagaként.
További 3-5 nap tenyésztés után a 100 l-es fermentorban lévő tenyészet használható 1000 l-es, termelő fermentor oltóanyagaként.
b) Sejtek elkülönítése és elválasztása
Rátáplálásos szakaszos eljárást alkalmazunk, azaz ha a kívánt sejtsűrűséget elértük, a tenyészet mintegy 80%-át elkülönítjük. A maradék tenyészetet kiegészítjük friss tenyésztő tápközeggel, és a következő elkülönítésig (vágásig) tenyésztjük. Egy teljes termelési folyamat maximum 10 egymást követő elkülönítésből (vágásból) áll: 9 részleges vágásból és egy teljes elkülönítésből a fermentáció végén. Az egyes vágásokat 3-4 naponként végezzük.
Meghatározott, elkülönített térfogatot átviszünk egy hűtött tartályba. A sejteket centrifugálással vagy szűréssel eltávolítjuk, és kidobjuk. A centrifugálási lépésből származó, EPO-t tartalmazó felülúszót közvetlenül ezután szűrjük és egy második hűtött tartályba gyűjtjük. Valamennyi vágást külön-külön kezeljük a tisztítás alatt.
EPO-fehérje tisztítására szolgáló tipikus eljárást írnak le a WO 96/35718 számú nemzetközi közzétételi iratban (Burg, közzétéve 1996. november 14.). A tisztítási folyamatot az alábbiakban fejtjük ki.
c) Blue-Sepharose kromatográfia
Blue-Sepharose (Pharmacia) olyan Sepharosegyöngyökből áll, amelyek felszínére Cibacron-blue festék van kovalensen kapcsolva. Mivel az EPO erősebben kötődik Blue-Sepharose-hoz, mint a legtöbb nem fehérjetermészetű szennyeződés, néhány fehérjetermészetű idegen anyag és PVA, EPO feldúsítható ebben a lépésben. A Blue-Sepharose-oszlop elúcióját növekvő sókoncentrációval, valamint pH-val végezzük.
Az oszlopot megtöltjük 80-1001 Blue-Sepharose-al, melyet előzőleg nátrium-hidroxiddal regeneráltunk és ekvilibrációs pufferrel (nátrium-/kalcium-klorld és nátrium-acetát) ekvilibráltunk. A savanyított és szűrt fermentációs felülúszót felvisszük az oszlopra. A felvitel befejezése után az oszlopot először olyan pufferrel mossuk, amely hasonló az ekvilibrációs pufferhez, azaz amely nagy koncentrációban tartalmaz nátrium-kloridot, és közvetlenül ezután Tris-bázis-pufferrel mossuk.
HU 226 233 Β1
A terméket Tris-bázis-pufferrel eluáljuk, és egyetlen frakcióban gyűjtjük egy elúciós mintaprofil szerint.
d) Butil-Toyopearl kromatográfia
Butil-Toyopearl 650C (Toso Haas) polisztirolalapú mátrix, amelyhez alifás butilcsoportok vannak kovalensen kapcsolva. Mivel az EPO erősebben kötődik ehhez a gélhez, mint a legtöbb szennyeződés és PVA, izopropanolt tartalmazó pufferrel lehet eluálni.
Az oszlopot megtöltjük 30-40 I Butil-Toyopearl 650C-el, nátrium-hidroxiddal regeneráljuk, Tris-bázispufferrel mossuk és izopropanolt tartalmazó Tris-bázispufferrel ekvilibráljuk.
A Blue-Sepharose-eluátumban az izopropanol koncentrációját beállítjuk az oszlopot ekvilibráló pufferrel megegyezőre, és felvisszük az oszlopra. Azután mossuk az oszlopot ekvilibrálópufferrel, növekvő koncentrációjú izopropanolkoncentrációt alkalmazva. A terméket elúciós pufferrel (Tris-bázis-puffer magas izopropanoltartalommal) eluáljuk és egyetlen frakcióban gyűjtjük egy elúciós mintaprofil szerint.
e) Hidroxi-apatit Ultrogél kromatográfia
A hidroxi-apatit Ultrogél (Biosepra) olyan hidroxiapatitból áll, amely agarózmátrixba van beépítve, a mechanikai tulajdonságok javítása céljából. Az EPO kis affinitással rendelkezik hidroxi-apatit felé, és ezért alacsonyabb foszfátkoncentrációknál eluálható, mint a fehérjeszennyeződések.
Az oszlopot megtöltjük 30-40 I hidroxi-apatit Ultrogél-lel, és kálium-foszfát/kalcium-klorid pufferrel és nátrium-hidroxiddal, azután Tris-bázis-pufferrel regeneráljuk. Azután kis mennyiségű izopropanolt és nátriumkloridot tartalmazó Tris-bázis-pufferrel ekvilibráljuk.
A Butil-Toyopearl kromatográfiából származó, EPO-t tartalmazó eluátumot felvisszük az oszlopra. Ezt követően az oszlopot ekvilibrálópufferrel és izopropanolt és nátrium-kloridot nem tartalmazó Tris-bázis-pufferrel mossuk. A terméket alacsony koncentrációjú kálium-foszfátot tartalmazó Tris-bázis-pufferrel eluáljuk, és egyetlen frakcióban gyűjtjük egy elúciós mintaprofil szerint.
f) Fordított fázisú HPLC Vydac C4 oszlopon
A Vydac C4 (Vydac) RP-HPLC-anyag olyan szilikagél részecskékből áll, amelyek felszínén C4-alkilláncok vannak. Az EPO elválasztása a fehérjetermészetű szennyeződésektől a hidrofób kölcsönhatások erősségének különbözőségére alapul. Az elúciót acetonitrilgradienssel végezzük hígított trifluor-ecetsavban.
Preparatív HPLC-t rozsdamentes acéloszlopban végzünk (2,8-3,2 liter Vydac C4 szilikagéllel megtöltve). A hidroxi-apatit Ultrogél eluátumot trifluor-ecetsav hozzáadásával savanyítjuk, és felvisszük a Vydac C4-oszlopra. Mosásra és elúcióra acetonitrilgradienst alkalmazunk hígított trifluor-ecetsavban. Frakciókat gyűjtünk és közvetlenül ezután foszfátpufferrel semlegesítjük. Azokat az EPO-frakciókat egyesítjük, amelyek az IPC-limitbe esnek.
g) DEAE-Sepharose kromatográfia
A DEAE-Sepharose (Pharmacia) anyag olyan Sepharose-gyöngyökből áll, amelyek felszínére dietil-amino-etil (DEAE)-csoportok vannak kovalensen kapcsolva. Az EPO kötődését a DEAE-csoportokhoz ionos kölcsönhatások közvetítik. Az acetonitril és a trifluorecetsav visszatartás nélkül átmegy az oszlopon. Miután ezeket az anyagokat lemostuk, nyomokban lévő szennyeződéseket úgy távolítunk el, hogy az oszlopot alacsony pH-jú acetátpufferrel mossuk. Azután semleges foszfátpufferrel mossuk az oszlopot, és az EPO-t növekvő ionerősségű pufferrel eluáljuk.
Az oszlopot megtöltjük „DEAE-Sepharose fást flow-val. Az oszlop térfogatát olyanra állítjuk, hogy lehetővé tegyen EPO-felvitelt 3-10 mg EPO/ml géltartományban. Az oszlopot vízzel és ekvilibrálópufferrel (nátrium/kálium-foszfáttal) mossuk. A HPLC-eluátum egyesített frakcióit felvisszük az oszlopra, és az oszlopot ekvilibrálópufferrel mossuk. Azután mosópufferrel (nátrium-acetát-pufferrel) mossuk az oszlopot, melyet ekvilibrálópufferrel való mosás követ. Ezt követően az EPO-t elúciós pufferrel (nátrium-klorid, nátrium/káliumfoszfát) eluáljuk az oszlopról, és egyetlen frakcióban gyűjtjük egy elúciós mintaprofil szerint.
Beállítjuk a DEAE-Sepharose oszlopról eluált anyag vezetőképességét. Az így kapott droganyagot sterilre szűrjük Teflon-edényekbe, és -70 °C-on tároljuk.
2. példa
EPO pegilálása mPEG-SBA-val
Az 1. példában leírt, szérummentes eljárás (EPOsf) szerint tisztított EPO analitikai módszerekkel meghatározva homogén volt, és tipikus, 8 izoformából álló izoforma-mintázatot mutatott. 190 000 lU/mg specifikus biológiai aktivitással rendelkezett, melyet normális vörösvértest-tartalommal rendelkező egeret alkalmazó vizsgálati eljárással határoztunk meg. Az alkalmazott pegiláló reagens metoxi-PEG-SBA volt, amely (II) általános képlettel rendelkező vegyület, ahol R jelentése metil; x jelentése 3; és m jelentése 650 és 750 közötti szám (átlagosan mintegy 680, amely megfelel mintegy 30 kDa átlagos molekulatömegnek).
Pegilálásl reakció
100 mg EPOsf-hez (9,71 ml-t véve a 10,3 mg/ml-es EPOsf-törzsoldatból, 5,48 pmol) hozzáadtunk 506 mg (16,5 pmol), 30 kDa méretű metoxi-PEG-SBA-ot (Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama) tartalmazó, 10 ml, 0,1 M kálium-foszfát-puffert (pH=7,5), és 2 óra hosszáig kevertettük a környezet hőmérsékletén (20-23 °C). A fehérje végkoncentrációja 5 mg/ml volt, és a fehérje:PEG-reagens aránya 1:3 volt. 2 óra múlva a reakciót leállítottuk úgy, hogy a pH-t4,5-re állítottuk jégecettel, és -20 °C-on tároltuk a tisztításig.
Tisztítás
1. Konjugátumkeverék: Mintegy 28 ml SP-Sepharose FF-et (szulfo-propil-kationt tartalmazó ioncserélő gyanta) töltöttünk AMICON üvegoszlopba (2,2*7,5 cm), és 20 mM acetátpufferrel (pH=4,5) ekvilibráltuk, 150 ml/óra áramlási sebességgel. 30 mg fehérjét tartalmazó, 6 ml reakciókeveréket ötszörösére hígítottunk ekvilibrálópufferrel, és felvittük az oszlopra. A nem adszorbeált anyagot lemostuk a pufferrel, és az adszorbeált PEG-konjugátumot ekvilibrálópufferben oldott, 0,175 M nátrium-kloriddal eluáltuk az oszlopról. Az oszlopon maradt, módosítatlan EPOsf-et 750 mM nátrium8
HU 226 233 Β1 kloriddal eluáltuk. Az oszlopot újraekvilibráltuk a kiindulási puffemel. A mintákat SDS-PAGE-val analizáltuk, és meghatároztuk pegiláltsági fokukat. Azt találtuk, hogy a 0,175 M nátrium-kloriddal eluált anyag mono-, valamint di- és nyomokban tripegilált anyagot tartalmazott, míg a 750 mM nátrium-kloriddal eluált anyag módosítatlan EPOsf-et tartalmazott.
2. Di-PEG és mono-PEG-EPOsf
Az előző lépésben, az oszlopról eluált, tisztított konjugátumkeveréket négyszeresére hígítottuk a puf- 10 ferrel, és újra felvittük az oszlopra, a leírtak szerint mostuk. Di-PEG-EPOsf és mono-PEG-EPOsf elkülönülve eluáltuk az oszlopról, 0,1 M nátrium-kloriddal és 0,175 M nátrium-kloriddal, sorrendben. Elúciót végeztünk 750 mM nátrium-kloriddal is, amelyben eluáltuk az 15 esetleg megmaradt módosítatlan EPOsf-et.
Más módszer szerint, a reakciókeveréket ötszörösére hígítottuk az acetátpufferrel, és felvittük az SP-Sepharose-oszlopra (mintegy 0,5 mg fehérje/ml gól). Az oszlopot mostuk, és az adszorbéált mono- 20 PEG-EPOsf-et, di-PEG-EPOsf-et és a módosítatlan EPOsf-et az előző szakaszban leírtak szerint eluáltuk.
Eredmények
PEG-EPOsf-et úgy szintetizáltunk, hogy kémiailag konjugáltunk 30 kDa átlagos molekulatömeggel rendelkező, lineáris PEG-molekulával. PEG-EPOsf az EPOsf primer aminocsoportjai és a 30 kDa méretű PEG-vajsav szukcinimidil-észter-származéka közötti reakcióból származott, amidkötést eredményezve.
Az eredményeket összefoglaljuk az 1. táblázatban.
A tisztított konjugátumkeverék mono- és di-PEGEPOsf-et tartalmazott, és mentes volt módosítatlan EPOsf-től, SDS-PAGE-analízissel meghatározva.
A konjugátumkeverék mennyisége 23,4 mg volt vagy a kiindulási anyag 78%-a. A mono- és di-PEG-EPOsf-ek 35 kationcserélő kromatográfiás elválasztása azt mutatta, hogy a mono:di-PEG arány a konjugátumkeverékben megközelítőleg 1:1 volt. A reakció befejeződése után az egyes komponensek (mono:di:módosítatlan) aránya 40:38:20(%) volt. Az összhozam majdnem kvantitatív 40 volt.
1. táblázat
EPOsf-pegilálás eredményeinek összesítése
Minta Fehérje (mg) Hozam (%)
Reakciókeverék 30 100
Mono 12,0 40
Di 11,4 38
Minta Fehérje (mg) Hozam (%)
Módosítatlan 6,0 20
Konjugátumkeverék 23,4 78
3. példa
EPO pegilálása mPEG-SPA-val
A 2. példában leírtaktól különböző EPOsf-aliquotot reagáltattunk 30 kDa méretű metoxi-PEG-SPA-val (Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama). A reakciót 1:2 fehérje:reagens aránynál végeztük, és a
2. példában leírt tisztítási technikákat alkalmaztuk. Elsősorban monopegilált terméket állítottunk elő.
4. példa
Pegilált EPO in vivő aktivitása, normális vörösvértest-tartalommal rendelkező egeret alkalmazó vizsgálati eljárással meghatározva A normális vörösvértest-tartalommal rendelkező egeret alkalmazó, biológiai vizsgálati eljárás szakember számára ismert [Pharm. Európa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997 (2); és Ph. Eur. BRP eritropoi25 etin-monográfiájában lévő módszer], A mintákat BSAPBS-el hígítottuk. Normál, 7-15 hetes, egészséges egereknek se. beadtunk 0,2 ml pegilálatlan EPO-t, vagy tri-, di- vagy monopegilált EPO-t tartalmazó, 2. vagy 3. példa szerint előállított EPO-frakciót. Hat nap 30 múlva vért vettünk a farokvénába szúrással, és úgy hígítottuk, hogy 1 μΙ vér legyen 1 ml, 0,15 pmol akridinnarancs festőoldatban. A festési idő 3-10 perc volt. A retikulociták számlálását mikrofluorometriásan végeztük áramlásai citométerben, a vörös fluoreszcenciahisztogram analízisével. A retikulocitaszámlálás eredményeit abszolút számokkal fejeztük ki (30 000 analizált vérsejtre). Az adatok bemutatásához az egyes csoportok naponta 5 egérből álltak, és az egeret csak egyszer véreztettük.
Egy külön kísérletben egyetlen dózis módosítatlan EPO-t (25 ng EPO), a 2. példából származó PEG(SBA)EPO-keveréket (10 ng konjugátum), a 2. példából származó mono- és dipegilált EPO-kat (10 ng konjugátum), a
3. példából származó PEG(SPA)-EPO-t (10 ng konjugá45 tűm) és pufferoldatot adtunk be az egereknek. Az eredményeket bemutatjuk a 2. táblázatban. Az eredmények azt mutatják, hogy a pegilált EPO-fajták meghosszabbodott féléletidővel rendelkeztek, amelyet szignifikánsan megnövekedett mennyiségű retikulociták és a retikulocitaszám maximumának eltolódása jelzett, egerenként ugyanakkora dózist (10 ng) alkalmazva, 25 ng módosítatlan EPO-hoz hasonlítva.
2. táblázat
EPO (módosítatlan) 30 kDa SPA PEG Mono 30K SBA Di 30K SBA PEG-EPO SBAkonj. keverék Kontrollpuffer
Ti óra 1000 1393 1411 994 1328 857
96 óra 500 1406 1501 926 1338 697
HU 226 233 Β1
2. táblázat (folytatás)
EPO (módosítatlan) 30 kDa SPA PEG Mono 30K SBA Di 30K SBA PEG-EPO SBAkonj. keverék Kontrollpuffer
120 óra kb. 200 1100 1182 791 944 701
144 óra kb. 0 535 607 665 660 708
5. példa
Túlnyomórészt mono-PEG-EPO-ból álló konjugátum előállítása Pegilálási reakció
100 mM kálium-foszfát-pufferben (pH=7,5) oldott, 100 mg (5,48 μιτιοΙ) EPOsf-ből indulunk ki, amelyhez hozzáadunk 3 ml, 1 mM HCI-ben oldott, 329 mg (10,96 μιτιοΙ), 30 kDa méretű PEG-SBA-reagenst. Hozzáadunk annyi 100 mM kálium-foszfát-puffert (pH=7,5), hogy a reakció térfogata 20 ml legyen. A fehérje végkoncentrációja 5 mg/ml volt, és a fehérje:PEG-reagens aránya 1:2 volt. A reakciókeveréket 2 óra hosszáig kevertettük a környezet hőmérsékletén (20-22 ’C). 2 óra múlva a reakciót leállítottuk úgy, hogy a pH-t4,5-re állítottuk jégecettel, és -20 ’C-on tároltuk a tisztításig.
Tisztítás
Az előző lépésből származó reakciókeveréket 1:5 arányban hígítottuk 10 mM nátrium-acetáttal (pH=4,5) és felvittük 300 ml SP-Sepharose FF-el (szulfo-propil-kationcserélő gyanta) megtöltött, 4,2*19 cm-es oszlopra. Az oszlopot előzőleg ugyanezzel a pufferrel ekvilibráltuk. Az oszlopról lefolyó anyagot 280 nm-en követtük, Gilson UV-monitorral, és felvettük Kipp and Zonen rekorder alkalmazásával. Az oszlopot 300 ml vagy 1 oszloptérfogat ekvilibrálópufferrel mostuk a feleslegben lévő reagensek, a reakció melléktermékeinek és oligomer PEG-EPO eltávolítása céljából. Ezután 2 oszloptérfogat 100 mM nátrium-kloriddal mostunk di-PEG-EPO eltávolítása céljából. Mono-PEG-EPO-t azután 200 mM nátrium-kloriddal eluáltuk. A monoPEG-EPO elúciója alatt az első 50 ml-es fehérjecsúcsot kidobtuk, és a mono-PEG-EPO-t 150 ml-es frakcióként gyűjtöttük. Az oszlopon maradt, módosítatlan EPOsf-et 750 mM nátrium-kloriddal eluáltuk. Valamennyi elúciós puffért az ekvilibrálópufferben készítettünk el. Az eluált mintákat SDS-PAGE-val és nagy hatékonyságú, méretkizáráson alapuló kromatográfiával (SEC) analizáltunk. A 150 ml-es frakcióból származó, egyesített monoPEG-EPO-t, amely nem tartalmazott detektálható módosítatlan EPOsf-et, azután töményítettük mintegy 4,5-7,5 mg/ml-re, és diafiltráltuk tárolópufferbe (10 mM kálium-foszfát, 100 mM nátrium-klorid, pH=7,5). A töményítést/diafiltrálást „Millipore Labscale™ TFF System” alkalmazásával végeztük a környezet hőmérsékletén, amely 50 kDa molekulatömeg-kizárást biztosító, „Millipore Pellicon XL Biomax 50” membránnal volt felszerelve. A töményített mono-PEG-EPO-t sterilre szűrtük és -20 ’C-on fagyasztva tároltuk.
Az EPOsf mintegy 75%-át pegiláltuk. Tisztítás után az összhozam mintegy 30% mono-PEG-EPO (amely nem tartalmazott detektálható módosítatlan EPOsf-et) és 25% di-PEG-EPO volt. A maradék fehérjét oligomerek és nem pegilált EPOsf alkotta. A 150 ml-es frakcióból származó, egyesített mono-PEG-EPO-készlet mintegy 90% mono-PEG-EPO-t és mintegy 10% di-PEG-EPO-t tartalmazott.
SZEKVENCIALISTA <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
Alá 1 Pro Pro Arg Leu 5 Ile Cys Asp Ser Arg 10 Val Leu Glu Arg Tyr 15 Leu
Leu Glu Alá Lys Glu Alá Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Alá Glu His
20 25 30
Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
35 40 45
Tyr Alá Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Alá Val Glu Val Trp
50 55 60
Gin Gly Leu Alá Leu Leu Ser Glu Alá Val Leu Arg Gly Gin Alá Leu
65 70 75 80
HU 226 233 Β1
Leu Val Asn Ser Ser Gin 85 Pro Trp Glu Pro 90 Leu Gin Leu His Val 95 Asp
Lys Alá Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Alá Leu
100 105 110
Gly Alá Gin Lys Glu Alá Ile Ser Pro Pro Asp Alá Alá Ser Alá Alá
115 120 125
Pro Leu Arg Thr Ile Thr Alá Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Alá
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp
165 <210>2 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>2
Alá Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu
1 5 10 15
Leu Glu Alá Lys Glu Alá Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Alá Glu His
20 25 30
Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
35 40 45
Tyr Alá Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Alá Val Glu Val Trp
50 55 60
Gin Gly Leu Alá Leu Leu Ser Glu Alá Val Leu Arg Gly Gin Alá Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp
85 90 95
Lys Alá Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Alá Leu
100 105 110
Gly Alá Gin Lys Glu Alá Ile Ser Pro Pro Asp Alá Alá Ser Alá Alá
115 120 125
Pro Leu Arg Thr Ile Thr Alá Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Alá
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
<210>3 <211> 28
HU 226 233 Β1
Leu Pro Ser Pro Ser Arg
Pro Gin <212> PRT <213> Homo sapiens <400>3
Ser Ser Ser Ser Lys Alá Pro Pro Pro 1 5
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile 20 25

Claims (31)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Konjugátum, amely legalább egy szabad aminocsoporttal rendelkező eritropoietin-glikoproteint tartalmaz, és olyan in vivő biológiai aktivitással rendelkezik, amely csontvelősejtekben retikulociták és vörösvértestek termelődésének fokozódását okozza, az eritropoietin-glikoprotein a humán eritropoietin vagy olyan analógja lehet, melynek szekvenciája a humán eritropoietin szekvenciájának módosításával származtatható, 1-6 glikozilációs hely addicionáltatásával vagy legalább egy glikozilációs hely átrendezésével; és a glikoprotein kovalensen van kapcsolva „n darab
    -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-ORképletű, polietilénglikol-csoporthoz az egyes polietilénglikol-csoportok -CO csoportjain keresztül, amidkötést kialakítva az egyik aminocsoporttal; ahol R jelentése 1-6 szénatomszámú alkilcsoport; x jelentése 2 vagy 3;
    m jelentése mintegy 450 és mintegy 900 közötti szám; n jelentése 1 és 3 közötti szám; és n és m úgy van megválasztva, hogy a konjugátum molekulatömegéből levonva az eritropoietin-glikoprotein molekulatömegét 20 kilodalton és 100 kilodalton közötti molekulatömeget kapunk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerint konjugátum, amely az (I) általános képlettel írható le;
    P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n (I) ahol x, m, n és R jelentése az 1. igénypont szerinti, és P a glikoproteint jelenti, a polietilénglikol-csoporttal (-csoportokkal) amidkötés(eke)t kialakító n darab aminocsoport nélkül.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti konjugátum, ahol R jelentése metil.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, ahol m jelentése mintegy 650 és mintegy 750 közötti szám.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, ahol n jelentése 1.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, ahol R jelentése metil; m jelentése mintegy 650 és mintegy 750 közötti szám; és n jelentése 1.
  7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, amely [CH3O(CH2CH2O)rnCH2CH2CH2CO-NH]n-P általános képlettel írható le, ahol m jelentése 650 és 750 közötti szám, n jelentése 1, és P jelentését a 2. igénypont szerinti.
  8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, amely glikoproteinként humán eritropoietint tartalmaz.
  9. 9. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, amely endogén génaktiválással expresszálódott humán eritropoietin-glikoproteint tartalmaz.
  10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, amely 1. azonosító számú szekvenciájú glikoproteint tartalmaz.
  11. 11. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, amely olyan humán eritropoietinszekvenciával rendelkező glikoproteint tartalmaz, amely 1 és 6 közötti glikozilációs hely hozzáadásával lett módosítva.
  12. 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, amelyben a glikoprotein az alábbiakban leírt módosítások egyikével módosított humán eritropoietinszekvenciával rendelkezik:
    Asn30Thr32;
    Asn51Thr53;
    Asn57Thr59;
    Asn69;
    Asn69Thr71;
    Ser^Asn^Thr71;
    Val87Asn88Thr90;
    Ser87Asn88Thr90;
    Ser87Asn88Gly89Thr90;
    Ser87Asn88Thr90Thr92;
    Ser^Asn^Thr^Ala162;
    Asn69Thr71 Ser^Asn^Thr90;
    Asn^Thr-^al^Asn^Thr90;
    Asn89lle90Thr91;
    Sere7Asn89lle90Thr91;
    Asn136Thr138;
    Asn138Thr140;
    Thr125; vagy
    Pro124Thr125.
  13. 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, amelyben a glikoprotein humán eritropoietinszekvenciát és egy második szekvenciát tartalmaz a humán eritropoietinszekvencia karboxiterminálisánál, amely második szekvencia legalább egy glikozilációs helyet tartalmaz.
  14. 14. A 13. igénypont szerinti konjugátum, amely második szekvenciaként humán choriogonadotropin karboxiterminálisából származó szekvenciát tartalmaz.
  15. 15. A 13. igénypont szerinti konjugátum, amely az alábbi szekvenciák egyikével rendelkező glikoproteint tartalmaz:
    HU 226 233 Β1
    a) humán eritropoietinszekvenciát és a humán eritropoietinszekvencia karboxiterminálisánál 3. azonosító számú szekvenciát tartalmaz:
    b) az a) pontban leírt szekvenciát Ser^Asn^Thr90nel módosítva tartalmaz; vagy
    c) az a) pontban leírt szekvenciát Asn30Thr32· Val87Asn88Thr90-nel módosítva tartalmaz.
  16. 16. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, amely olyan humán eritropoietinszekvenciával rendelkező glikoproteint tartalmaz, amely módosítva van legalább egy glikozilációs hely átrendezésével.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti konjugátum, amelyben az átrendeződés a humán eritropoietinban bármelyik N-kapcsolt glikozilációs hely delécióját és egy N-kapcsolt glikozilációs hely addícióját jelenti a humán eritropoietin szekvenciájának 88. helyzetében.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti konjugátum, amelyben a glikoprotein az alábbiakban leírt módosítások egyikével módosított humán eritropoietinszekvenciával rendelkezik:
    Gln^Ser^Asn^Thr90;
    Gln38Ser87Asn88Thr90; vagy
    Gln^Ser^Asn^Thr90.
  19. 19. Készítmény, amely olyan konjugátumokat tartalmaz, amelyek mindegyike legalább egy szabad aminocsoporttal rendelkező erítropoietln-glikoproteint tartalmaz, és olyan in vivő biológiai aktivitással rendelkezik, amely a csontvelősejtekben retikulociták és vörösvértestek termelődésének fokozódását okozza, az eritopoietinglikoprotein a humán eritropoietin vagy olyan analógja lehet, melynek szekvenciája a humán eritropoietin szekvenciájának módosításával származtatható, 1-6 glikozilációs hely addicionáltatásával vagy legalább egy glikozilációs hely átrendezésével: a glikoprotein kovalensen van kapcsolva -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)ni-OR- képletű, „n polietilénglikol-csoporthoz az egyes polietilénglikol-csoportok -CO csoportjain keresztül, amidkötést kialakítva az egyik aminocsoporttal; ahol R jelentése 1-6 szénatomszámú alkilcsoport; x jelentése 2 vagy 3; m jelentése mintegy 450 és mintegy 900 közötti szám; n jelentése 1 és 3 közötti szám; és n és m úgy van megválasztva, hogy az egyes konjugátumok molekulatömegéből levonva az eritropoietin-glikoprotein molekulatömegét 20 kilodalton és 100 kilodalton közötti molekulatömeget kapunk; és a készítményben az olyan konjugátumok százalékos aránya, melyek esetén n=1, legalább kilencven százalék.
  20. 20. Készítmény, amely 1-18. igénypontok bármelyike szerinti konjugátumokat tartalmaz, és a készítményben az olyan konjugátumok százalékos aránya, melyek esetén n=1, legalább kilencven százalék.
  21. 21. A 19. vagy 20. igénypont szerinti készítmény, amelyben az olyan konjugátumok százalékos aránya, melyek esetén n=1, legalább kilencvenkét százalék.
  22. 22. A 21. igénypont szerinti készítmény, amelyben az olyan konjugátumok százalékos aránya, melyek esetén n=1, legalább kilencvenhat százalék.
  23. 23. A 19. vagy 20. igénypont szerinti készítmény, amelyben az olyan konjugátumok százalékos aránya, melyek esetén n=1, kilencven és kilencvenhat százalék közötti.
  24. 24. Gyógyászati készítmény, amely 1-23. igénypontok bármelyike szerinti konjugátumot vagy készítményt, és gyógyászatilag elfogadható segédanyagot tartalmaz.
  25. 25. Az 1-23. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum vagy készítmény alkalmazása krónikus veseelégtelenségben (CRF) előforduló anémiával kapcsolatba hozható betegségek kezelésére és profilaxisára szolgáló gyógyszerek előállítására.
  26. 26. Az 1-23. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum vagy készítmény alkalmazása AIDS-szel kapcsolatba hozható betegségek kezelésére és profilaxisára szolgáló gyógyszerek előállítására.
  27. 27. Az 1-23. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum vagy készítmény alkalmazása rákban szenvedő, kemoterápián átesett páciensek kezelésére szolgáló gyógyszerek előállítására.
  28. 28. Eljárás az 1-23. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum előállítására, azzal jellemezve, hogy a (II) általános képletű vegyületet
    RO(CH2CH2O)m(CH2)xCOON kondenzáljuk eritropoietin-glikoproteinnel, ahol R, m és x jelentése az 1-6. igénypontok bármelyike szerint van definiálva.
  29. 29. Az 1-23. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, krónikus veseelégtelenségben (CRF) előforduló anémiával asszociált betegségekben szenvedő páciensek kezelésében történő alkalmazásra.
  30. 30. Az 1-23. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, AIDS-szel asszociált betegségekben szenvedő páciensek kezelésében történő alkalmazásra.
  31. 31. Az 1-23. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, kemoterápián átesett, rákban szenvedő páciensek kezelésében történő alkalmazásra.
HU0002553A 1999-07-02 2000-06-30 Erythropoietin derivatives HU226233B1 (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14225499P 1999-07-02 1999-07-02
US15022599P 1999-08-23 1999-08-23
US15154899P 1999-08-31 1999-08-31
US16615199P 1999-11-17 1999-11-17

Publications (4)

Publication Number Publication Date
HU0002553D0 HU0002553D0 (en) 2000-08-28
HUP0002553A2 HUP0002553A2 (en) 2001-03-28
HUP0002553A3 HUP0002553A3 (en) 2005-11-28
HU226233B1 true HU226233B1 (en) 2008-07-28

Family

ID=27495518

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0002553A HU226233B1 (en) 1999-07-02 2000-06-30 Erythropoietin derivatives

Country Status (51)

Country Link
US (2) US6583272B1 (hu)
EP (2) EP1839676A3 (hu)
JP (2) JP3727009B2 (hu)
KR (1) KR100593143B1 (hu)
CN (2) CN1184233C (hu)
AR (2) AR024625A1 (hu)
AT (1) ATE370748T1 (hu)
AU (1) AU736067B2 (hu)
BG (1) BG65449B1 (hu)
BR (2) BR0002276A (hu)
CA (1) CA2310536C (hu)
CO (1) CO5190661A1 (hu)
CY (2) CY1107719T1 (hu)
CZ (1) CZ299516B6 (hu)
DE (3) DE60036053T2 (hu)
DK (1) DK1064951T3 (hu)
DO (1) DOP2000000030A (hu)
EA (1) EA003777B1 (hu)
ES (2) ES2289985T3 (hu)
FR (2) FR2795734B1 (hu)
GB (2) GB2353281B (hu)
GC (1) GC0000197A (hu)
GE (1) GEP20022804B (hu)
GT (1) GT200000109A (hu)
HR (1) HRP20000436B1 (hu)
HU (1) HU226233B1 (hu)
ID (1) ID26447A (hu)
IL (1) IL137056A0 (hu)
IS (1) IS2492B (hu)
IT (1) IT1318606B1 (hu)
LU (1) LU91363I2 (hu)
MA (1) MA26746A1 (hu)
MX (1) MXPA00006547A (hu)
MY (1) MY128500A (hu)
NL (1) NL300289I9 (hu)
NO (2) NO327043B1 (hu)
NZ (1) NZ505454A (hu)
OA (1) OA11442A (hu)
PA (1) PA8497801A1 (hu)
PE (1) PE20010297A1 (hu)
PL (1) PL202758B1 (hu)
PT (1) PT1064951E (hu)
RS (1) RS49928B (hu)
SG (1) SG92717A1 (hu)
SI (1) SI1064951T1 (hu)
SK (1) SK286301B6 (hu)
SV (1) SV2002000120A (hu)
TN (1) TNSN00147A1 (hu)
TR (1) TR200001956A2 (hu)
TW (1) TWI235667B (hu)
UY (1) UY26228A1 (hu)

Families Citing this family (230)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1037927T3 (da) 1997-12-08 2004-09-06 Emd Lexigen Res Ct Corp Heterodimere fusionsproteiner, der er nyttige til målrettet immunterapi og generel immunstimulering
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
WO1999052562A2 (en) * 1998-04-15 1999-10-21 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with angiogenesis inhibitor
US7304150B1 (en) 1998-10-23 2007-12-04 Amgen Inc. Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia
US7345019B1 (en) * 1999-04-13 2008-03-18 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
PL202058B1 (pl) * 1999-08-09 2009-05-29 Merck Patent Gmbh Wielofunkcyjne białko fuzyjne cytokin i przeciwciała
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
JP2003514552A (ja) 1999-11-12 2003-04-22 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング 改善された性質を有するエリトロポエチンの形態
DE60122286T2 (de) * 2000-02-11 2007-08-02 Merck Patent Gmbh Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
MXPA02011303A (es) † 2000-05-15 2003-04-25 Hoffmann La Roche Nueva composicion farmaceutica.
ES2288967T3 (es) * 2000-06-29 2008-02-01 Merck Patent Gmbh Reforzamiento de las respuestas inmunes mediadas por la proteina de fusion anticuerpo-citoquina por medio del tratamiento combinado por agentes que mejoran la incorporacion de inmunocitoquina.
ES2320101T3 (es) * 2000-10-16 2009-05-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Eritropoyetina conjugada con mono-peg.
JP4656814B2 (ja) * 2000-12-20 2011-03-23 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー エリスロポエチンコンジュゲート
WO2002049673A2 (en) * 2000-12-20 2002-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg)
US7767643B2 (en) 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
US20030072737A1 (en) * 2000-12-29 2003-04-17 Michael Brines Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs
EP1234583A1 (en) * 2001-02-23 2002-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag PEG-conjugates of HGF-NK4
BR0207854A (pt) * 2001-03-07 2004-08-24 Merck Patent Gmbh Tecnologia de expressão para proteìnas contendo uma porção de anticorpo de isotipo hìbrido
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
WO2002079415A2 (en) * 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
HUP0400284A3 (en) 2001-05-03 2012-09-28 Merck Patent Gmbh Recombinant tumor specific antibody and use thereof
US6818613B2 (en) 2001-11-07 2004-11-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Aqueous sustained-release formulations of proteins
KR100467751B1 (ko) 2001-12-03 2005-01-24 씨제이 주식회사 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질
PL206975B1 (pl) * 2001-12-04 2010-10-29 Merck Patent Gmbh Immunocytokiny o modulowanej selektywności oraz ich zastosowanie
EP1463823B1 (en) * 2001-12-06 2013-03-06 Fibrogen, Inc. Methods of increasing endogenous erythropoietin (epo)
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
AU2003218045A1 (en) 2002-03-11 2003-09-29 Ortho Mcneil Pharmaceutical, Inc Methods for shp1 mediated neuroprotection
KR20060019501A (ko) * 2002-07-01 2006-03-03 더 케네쓰 에스. 워렌 인스티튜트 인코포레이티드 응답 세포, 조직 및 기관을 보호, 회복 및 향상시키기위한 재조합 조직 보호 사이토카인 및 이를 코딩하는 핵산
MXPA05000796A (es) 2002-07-24 2005-04-19 Hoffmann La Roche Aditivos de acidos polialquilenglicolicos.
US7459435B2 (en) * 2002-08-29 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
US20050176627A1 (en) * 2002-09-09 2005-08-11 Anthony Cerami Long acting erythropoietins that maintain tissue protective activity of endogenous erythropoietin
EP1539960B1 (en) * 2002-09-09 2010-04-28 Hanall Pharmaceutical Co., Ltd. Protease-resistant modified interferon alpha polypeptides
BR0314107A (pt) 2002-09-11 2005-07-19 Fresenius Kabi De Gmbh Método de produção de derivados de hidroxialquil amido
US7459436B2 (en) * 2002-11-22 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
US7388079B2 (en) * 2002-11-27 2008-06-17 The Regents Of The University Of California Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
RU2366664C2 (ru) * 2002-12-17 2009-09-10 Мерк Патент Гмбх Гуманизированное антитело (н14.18) на основании антитела 14.18 мыши, связывающееся с gd2, и его слияние с il-2
US7553930B2 (en) 2003-01-06 2009-06-30 Xencor, Inc. BAFF variants and methods thereof
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
AU2004227937B2 (en) 2003-03-31 2007-09-20 Xencor, Inc Methods for rational pegylation of proteins
US7610156B2 (en) 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
US7642340B2 (en) 2003-03-31 2010-01-05 Xencor, Inc. PEGylated TNF-α variant proteins
US7279174B2 (en) * 2003-05-08 2007-10-09 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Stent coatings comprising hydrophilic additives
DE602004028725D1 (de) * 2003-05-12 2010-09-30 Affymax Inc Neue poly(ethylenglycol) modifizierte erythropoietinagonisten und deren verwendungen
US7919118B2 (en) 2003-05-12 2011-04-05 Affymax, Inc. Spacer moiety for poly (ethylene glycol) modified peptide based compounds
KR101227666B1 (ko) * 2003-05-12 2013-01-31 아피맥스, 인크. 에리스로포이에틴 수용체에 결합하는 펩티드
DE602004020610D1 (de) 2003-05-12 2009-05-28 Affymax Inc Neue, an den erythropoietinrezeptor bindende peptide
WO2004108667A2 (en) * 2003-05-30 2004-12-16 Centocor, Inc. Formation of novel erythropoietin conjugates using transglutaminase
WO2005011587A2 (en) * 2003-07-30 2005-02-10 New Century Pharmaceuticls Chalaropsis lysozyme protein and its method of use in anti-bacterial applications
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
WO2005032467A2 (en) * 2003-09-29 2005-04-14 Warren Pharmaceuticals, Inc. Tissue protective cytokines for the treatment and prevention of sepsis and the formation of adhesions
AU2004279895A1 (en) 2003-10-10 2005-04-21 Xencor, Inc Protein based TNF-alpha variants for the treatment of TNF-alpha related disorders
SI1696947T1 (sl) * 2003-12-19 2014-05-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Uporaba eritropoetina pri zdravljenju motenj porazdelitve železa pri kroničnih vnetnih črevesnih boleznih
EP1548031A1 (en) * 2003-12-22 2005-06-29 Dubai Genetics FZ-LLC Nature-identical erythropoietin
CA2551916C (en) * 2003-12-31 2014-04-29 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
ES2720078T3 (es) * 2004-01-21 2019-07-17 Nektar Therapeutics Método para preparar polímeros terminados en ácido propiónico
ZA200606224B (en) * 2004-02-02 2007-11-28 Ambrx Inc Modified human growth hormone polypeptides and their uses
EA010501B1 (ru) 2004-03-11 2008-10-30 Фрезениус Каби Дойчланд Гмбх Конъюгаты гидроксиалкилкрахмала и белка, полученные восстановительным аминированием
US7588745B2 (en) * 2004-04-13 2009-09-15 Si Options, Llc Silicon-containing products
US7253650B2 (en) 2004-05-25 2007-08-07 International Business Machines Corporation Increase productivity at wafer test using probe retest data analysis
WO2006062685A2 (en) * 2004-11-11 2006-06-15 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
CN101142234A (zh) * 2004-11-11 2008-03-12 阿费麦克斯公司 结合红细胞生成素受体的新肽
RU2007132188A (ru) 2005-01-25 2009-03-10 Селл Терапьютикс, Инк. (Us) Конъюгаты биологически активных белков, имеющие модифицированное время полужизни in vivo
US7714114B2 (en) * 2005-02-16 2010-05-11 Nektar Therapeutics Conjugates of an EPO moiety and a polymer
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7919461B2 (en) 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7550433B2 (en) * 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US20070072795A1 (en) * 2005-09-28 2007-03-29 Anton Haselbeck Treatment of neurodegenerative disorders
DE602006018969D1 (de) * 2005-10-04 2011-01-27 Bristol Myers Squibb Co Herstellung und reinigung von il-29
US8741260B2 (en) * 2005-10-07 2014-06-03 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of GDNF to the CNS
US8053569B2 (en) * 2005-10-07 2011-11-08 Armagen Technologies, Inc. Nucleic acids encoding and methods of producing fusion proteins
US8124095B2 (en) * 2005-10-07 2012-02-28 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of erythropoietin to the CNS
EP1937294A4 (en) * 2005-10-21 2009-11-04 Synageva Biopharma Corp GLYCOLIC AND GLYCOSYLATED THERAPEUTIC PROTEINS DERIVED FROM POULTRY
US20080171696A1 (en) * 2005-10-21 2008-07-17 Avigenics, Inc. Pharmacodynamically enhanced therapeutic proteins
US20130172274A1 (en) * 2005-12-20 2013-07-04 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US8841255B2 (en) 2005-12-20 2014-09-23 Duke University Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides
SI1988910T1 (en) 2006-02-28 2018-02-28 Kodiak Sciences Inc. Polymeric conjugates containing acryloyloxyethylphosphorylcholine and their preparations
WO2007108505A1 (ja) 2006-03-22 2007-09-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha エリスロポエチン溶液製剤
KR101304081B1 (ko) * 2006-08-04 2013-09-05 프로롱 파마슈티컬스, 엘엘씨 수식된 에리스로포이에틴
AU2007285763B2 (en) 2006-08-18 2011-12-15 Armagen Technologies, Inc. Agents for blood-brain barrier delivery
KR101248252B1 (ko) 2006-11-28 2013-03-27 한올바이오파마주식회사 변형된 에리스로포이에틴 폴리펩티드와 이의 치료용 용도
PE20090722A1 (es) * 2007-02-02 2009-07-13 Amgen Inc Hepcidina, antagonistas de la hepcidina y metodos de uso
WO2008137066A1 (en) * 2007-05-02 2008-11-13 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Use of compacted nucleic acid nanoparticles in non-viral treatments of ocular diseases
AR067537A1 (es) * 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Purificacion de polipeptidos pegilados
AR067536A1 (es) * 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Metodo para obtener una eritropoyetina mono-pegilada en una forma sustancialmente homogenea
US8974791B2 (en) 2007-07-27 2015-03-10 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing α-L-iduronidase activity in the CNS
CA2701032C (en) * 2007-09-27 2021-01-26 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
ES2962777T3 (es) 2007-11-15 2024-03-21 Amgen Inc Formulación acuosa de anticuerpos estabilizada por antioxidantes para la administración parenteral
EP3042922B1 (en) 2008-01-11 2017-07-19 Serina Therapeutics, Inc. Multifunctional forms of polyoxazoline copolymers and drug compositions comprising the same
US8101706B2 (en) 2008-01-11 2012-01-24 Serina Therapeutics, Inc. Multifunctional forms of polyoxazoline copolymers and drug compositions comprising the same
CA2711826C (en) 2008-01-25 2018-02-27 Amgen Inc. Ferroportin antibodies and methods of use
NZ620606A (en) 2008-02-08 2015-08-28 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
WO2009128917A2 (en) 2008-04-14 2009-10-22 Halozyme, Inc. Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions
US9315577B2 (en) 2008-05-01 2016-04-19 Amgen Inc. Anti-hepcidin antibodies and methods of use
WO2009158704A2 (en) 2008-06-27 2009-12-30 Duke University Therapeutic agents comprising elastin-like peptides
CN102232085A (zh) 2008-09-26 2011-11-02 Ambrx公司 修饰的动物促红细胞生成素多肽和其用途
WO2010056981A2 (en) 2008-11-13 2010-05-20 Massachusetts General Hospital Methods and compositions for regulating iron homeostasis by modulation bmp-6
CN103205407B (zh) 2008-12-09 2016-03-16 哈洛齐梅公司 延长的可溶性ph20多肽及其用途
JP5873003B2 (ja) 2009-03-18 2016-03-01 アーメイゲン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＡｒｍａｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． ＩｇＧデコイ受容体融合タンパク質の血液脳関門送達のための組成物および方法
CA2768326C (en) 2009-07-30 2019-01-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Moveable chromatography column separator
WO2011024025A1 (en) * 2009-08-28 2011-03-03 Avesthagen Limited An erythropoietin analogue and a method thereof
PL2477603T3 (pl) 2009-09-17 2016-10-31 Trwały preparat złożony hialuronidazy i immunoglobuliny oraz sposoby jego stosowania
UA107678C2 (uk) * 2009-09-23 2015-02-10 ратіофарм ГмбХ Процес очищення рекомбінантного людського еритропоетину (епо), епо, очищений таким чином, та фармацевтична композиція, що містить його
US8834874B2 (en) 2009-10-09 2014-09-16 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing iduronate 2-sulfatase activity in the CNS
AU2010310457B2 (en) 2009-10-23 2015-07-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
US8765432B2 (en) 2009-12-18 2014-07-01 Oligasis, Llc Targeted drug phosphorylcholine polymer conjugates
AU2011247659B2 (en) 2010-04-27 2014-07-24 Scil Technology Gmbh Stable aqueous MIA/CD-RAP formulations
PT2575935E (pt) 2010-06-07 2015-10-20 Amgen Inc Dispositivo de administração de medicamento
MX348420B (es) 2010-07-20 2017-06-12 Halozyme Inc Efectos secundarios adversos asociados con la administracion de agentes anti-hialuronano y metodos para mejorar o prevenir los efectos secundarios.
CA2808748C (en) 2010-09-14 2018-09-11 Roberto Falkenstein Method for purifying pegylated erythropoietin
ES3001535T3 (en) 2011-02-02 2025-03-05 Hoffmann La Roche Chromatography column support
JP2014510045A (ja) 2011-02-08 2014-04-24 ハロザイム インコーポレイテッド ヒアルロナン分解酵素の組成物および脂質製剤ならびに良性前立腺肥大症の治療のためのその使用
MX341790B (es) 2011-03-31 2016-09-02 Amgen Inc Adaptador de viales y sistema.
CA3021845C (en) 2011-04-20 2022-03-29 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
US9993529B2 (en) 2011-06-17 2018-06-12 Halozyme, Inc. Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
SMT201800287T1 (it) 2011-10-14 2018-07-17 Amgen Inc Iniettore e metodo di assiemaggio
SG11201401797TA (en) 2011-10-24 2014-09-26 Halozyme Inc Companion diagnostic for anti-hyaluronan agent therapy and methods of use thereof
EP4338797A3 (en) 2011-12-02 2024-06-12 Armagen, Inc. Methods and compositions for increasing arylsulfatase a activity in the cns
IL317266A (en) 2011-12-30 2025-01-01 Halozyme Inc PH20 Polypeptide Variants, Formulations and Uses Thereof
US9913822B2 (en) 2012-04-04 2018-03-13 Halozyme, Inc. Combination therapy with an anti-hyaluronan agent and therapeutic agent
CN102816227A (zh) * 2012-08-30 2012-12-12 深圳赛保尔生物药业有限公司 回收促红细胞生成素的方法
US9278124B2 (en) 2012-10-16 2016-03-08 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods
AU2013348071B2 (en) 2012-11-21 2018-05-24 Amgen Inc. Drug delivery device
TWI639453B (zh) 2013-03-15 2018-11-01 美商安美基公司 用於注射器之匣盒
EP2968503B1 (en) 2013-03-15 2018-08-15 Intrinsic LifeSciences LLC Anti-hepcidin antibodies and uses thereof
JP6336564B2 (ja) 2013-03-15 2018-06-06 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入器、および自動注入器システム
JP6643977B2 (ja) 2013-03-15 2020-02-12 アムゲン・インコーポレーテッド 体輪郭に適応可能な自動注入機デバイス
CN113559363B (zh) 2013-03-22 2023-10-31 美国安进公司 注射器及装配方法
TW201534726A (zh) 2013-07-03 2015-09-16 Halozyme Inc 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途
WO2015035342A2 (en) 2013-09-08 2015-03-12 Oligasis Llc Factor viii zwitterionic polymer conjugates
EP3789064B1 (en) 2013-10-24 2024-11-27 Amgen Inc. Injector and method of assembly
WO2015061389A1 (en) 2013-10-24 2015-04-30 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
SG11201609219QA (en) 2014-05-07 2016-12-29 Amgen Inc Autoinjector with shock reducing elements
US20170124285A1 (en) 2014-06-03 2017-05-04 Amgen Inc. Devices and methods for assisting a user of a drug delivery device
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
PL3186281T3 (pl) 2014-08-28 2019-10-31 Halozyme Inc Terapia skojarzona enzymem rozkładającym hialuronian i inhibitorem punktu kontrolnego odpowiedzi immunologicznej
AU2015321462B2 (en) 2014-09-22 2020-04-30 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
MX392725B (es) 2014-10-14 2025-03-24 Amgen Inc Dispositivo de inyeccion de farmaco con indicadores visuales y audibles.
EA201700181A1 (ru) 2014-10-14 2017-09-29 Галозим, Инк. Композиции аденозиндеаминазы-2 (ада-2), их варианты и способы использования
JP6849590B2 (ja) 2014-10-17 2021-03-24 コディアック サイエンシーズ インコーポレイテッドＫｏｄｉａｋ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ． ブチリルコリンエステラーゼ両性イオン性ポリマーコンジュゲート
JP6716566B2 (ja) 2014-12-19 2020-07-01 アムジエン・インコーポレーテツド 近接センサ付き薬物送達装置
WO2016100055A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
US10538589B2 (en) 2015-01-14 2020-01-21 Armagen Inc. Methods and compositions for increasing N-acetylglucosaminidase (NAGLU) activity in the CNS using a fusion antibody comprising an anti-human insulin receptor antibody and NAGLU
US10583245B2 (en) 2015-02-17 2020-03-10 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
ES2905870T3 (es) 2015-02-27 2022-04-12 Amgen Inc Dispositivo de suministro de fármacos que tiene un mecanismo de protección de aguja con un umbral de resistencia ajustable al movimiento de la protección de aguja
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
WO2017100501A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
EP3397276A4 (en) 2015-12-30 2019-12-18 Kodiak Sciences Inc. ANTIBODIES AND CONJUGATES THEREOF
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
ES2814287T3 (es) 2016-03-15 2021-03-26 Amgen Inc Reducir la probabilidad de rotura de cristal en dispositivos de administración de fármaco
CN105820232B (zh) * 2016-04-08 2019-05-17 昂德生物药业有限公司 单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法及其制品和应用
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
AU2017263558B2 (en) 2016-05-13 2022-12-22 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
US11238150B2 (en) 2016-05-16 2022-02-01 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
EP3465124B1 (en) 2016-06-03 2026-02-11 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
MX391087B (es) 2016-07-15 2025-03-21 Hoffmann La Roche Método para purificar eritropoyetina pegilada.
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
EP3532127A1 (en) 2016-10-25 2019-09-04 Amgen Inc. On-body injector
EP3570917A1 (en) 2017-01-17 2019-11-27 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
WO2018152073A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
AU2018220538B2 (en) 2017-02-17 2023-12-14 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
WO2018165143A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
IL268478B2 (en) 2017-03-07 2023-10-01 Amgen Inc Inserting a needle using super pressure
MX2019010671A (es) 2017-03-09 2019-10-21 Amgen Inc Mecanismo de insercion para dispositivo de administracion de farmacos.
CN110446499A (zh) 2017-03-20 2019-11-12 豪夫迈·罗氏有限公司 一种体外糖基工程化红细胞生成刺激蛋白的方法
KR102651078B1 (ko) 2017-03-28 2024-03-22 암겐 인코포레이티드 플런저 로드 및 주사기 조립 시스템 및 방법
EP3634546A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
CA3061982A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
SG10202110500TA (en) 2017-06-22 2021-11-29 Catalyst Biosciences Inc Modified membrane type serine protease 1 (mtsp-1) polypeptides and methods of use
AU2018288604B2 (en) 2017-06-22 2023-12-21 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
MA49461A (fr) 2017-06-23 2020-04-29 Amgen Inc Dispositif électronique d'administration de médicament comprenant un bouchon activé par un ensemble commutateur
JP7408398B2 (ja) 2017-07-14 2024-01-05 アムジエン・インコーポレーテツド 二重ねじりばねシステムを有する針挿入後退システム
WO2019018169A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Amgen Inc. PERMEABLE GAS SEALING ELEMENT FOR MEDICINE CONTAINER AND METHODS OF ASSEMBLY
JP7242562B2 (ja) 2017-07-25 2023-03-20 アムジエン・インコーポレーテツド 容器アクセスシステムを有する薬物送達デバイス及び関連する組立方法
MA49677A (fr) 2017-07-25 2021-04-21 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament avec module d'engrenage et procédé d'assemblage associé
US12318593B2 (en) 2017-08-09 2025-06-03 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
WO2019036181A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Amgen Inc. BODY INJECTOR WITH STERILE ADHESIVE PATCH
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
MA50611A (fr) 2017-10-04 2020-08-12 Amgen Inc Adaptateur d'écoulement destiné à un dispositif d'administration de médicament
CN111132711B (zh) 2017-10-06 2022-07-01 安进公司 带有联锁组件的药物递送装置及相关组装方法
EP3694578B1 (en) 2017-10-09 2025-09-24 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
IL273663B2 (en) 2017-11-03 2025-05-01 Amgen Inc System and methods for disinfecting a drug delivery device
ES2994389T3 (en) 2017-11-06 2025-01-23 Amgen Inc Drug delivery device with placement and flow sensing
WO2019090303A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
MA50557A (fr) 2017-11-10 2020-09-16 Amgen Inc Pistons pour dispositifs d'administration de médicament
JP7747438B2 (ja) 2017-11-16 2025-10-01 アムジエン・インコーポレーテツド 失速及び終点検出を有するオートインジェクタ
JP7370969B2 (ja) 2017-11-16 2023-10-30 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスの扉ラッチ機構
KR102500631B1 (ko) 2017-12-29 2023-02-15 에프. 호프만-라 로슈 아게 페길화 단백질 조성물의 제공 방법
JP7227633B2 (ja) 2017-12-29 2023-02-22 エフ． ホフマン－ラ ロシュ エージー． Ｐｅｇ化タンパク質組成物を提供するための方法
KR102523239B1 (ko) 2017-12-29 2023-04-18 에프. 호프만-라 로슈 아게 페길화 단백질 조성물을 제공하기 위한 방법
KR20200140817A (ko) 2018-03-02 2020-12-16 코디악 사이언시스 인코포레이티드 Il-6 항체 그리고 이의 융합 작제물 및 접합체
WO2019222435A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Halozyme, Inc. Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
MA53379A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
WO2020023451A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
US12303677B2 (en) 2018-07-24 2025-05-20 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation
MA53320A (fr) 2018-07-31 2021-11-03 Amgen Inc Ensemble de trajet de fluide pour dispositif d'administration de médicament
EP3613486B1 (de) * 2018-08-24 2020-10-07 UGA Biopharma GmbH Verfahren und anlage zur reinigung von epo und/oder einem epo-derivat
MA53724A (fr) 2018-09-24 2021-12-29 Amgen Inc Systèmes et procédés de dosage interventionnel
CA3110371A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
CN117159846A (zh) 2018-10-02 2023-12-05 安进公司 具有内部力传递的用于药物递送的注射系统
WO2020072846A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
AR116704A1 (es) 2018-10-15 2021-06-02 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con mecanismo de amortiguación
SG11202101824VA (en) 2018-10-15 2021-03-30 Amgen Inc Platform assembly process for drug delivery device
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
ES3010833T3 (en) 2018-11-01 2025-04-04 Amgen Inc Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
IL281908B2 (en) 2018-11-01 2025-06-01 Amgen Inc Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
US11613744B2 (en) 2018-12-28 2023-03-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use
MX2021007843A (es) 2018-12-28 2021-08-11 Vertex Pharma Polipeptidos de activador de plasminogeno, tipo urocinasa, modificados y metodos de uso.
US20220160972A1 (en) 2019-04-24 2022-05-26 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
EP4017560A2 (en) 2019-08-23 2022-06-29 Amgen, Inc Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
CN114786731A (zh) 2019-10-10 2022-07-22 科达制药股份有限公司 治疗眼部病症的方法
WO2022063082A1 (zh) 2020-09-22 2022-03-31 美国杰科实验室有限公司 一种糖基化修饰的促红细胞生成素及其应用
WO2022159414A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 University Of Rochester Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction
IL308169A (en) 2021-05-10 2024-01-01 Chiome Bioscience Inc Purification method of antibody composition
MX2023013640A (es) 2021-05-21 2023-11-30 Amgen Inc Metodo de optimizacion de una receta de llenado para un contenedor de medicamento.
WO2023209074A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods of restoring erythropoiesis in patients suffering from a sf3b1 mutant myelodysplastic syndrome by correcting coasy mis-splicing
IL319976A (en) 2022-11-02 2025-05-01 Hoffmann La Roche Method for producing glycoprotein compositions
CN116492448A (zh) * 2023-04-12 2023-07-28 深圳赛保尔生物药业有限公司 负载peg-epo及间充质干细胞的组合物、药物及其制备方法
WO2025227129A2 (en) 2024-04-25 2025-10-30 Starrock Pharma Llc Delivery vehicles comprising proglucagon derived polypeptides and anabolic polypeptides and uses thereof

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
KR850004274A (ko) * 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
JPS6197229A (ja) 1984-10-18 1986-05-15 Chugai Pharmaceut Co Ltd 安定なエリトロポエチン製剤
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5641663A (en) * 1985-11-06 1997-06-24 Cangene Corporation Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and other heterologous proteins from steptomyces
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5674534A (en) * 1992-06-11 1997-10-07 Alkermes, Inc. Composition for sustained release of non-aggregated erythropoietin
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5359030A (en) * 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
ZA946122B (en) * 1993-08-17 1995-03-20 Amgen Inc Erythropoietin analogs
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
ES2093593T1 (es) * 1995-05-05 1997-01-01 Hoffmann La Roche Proteinas obesas (ob) recombinantes.
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US6025324A (en) * 1996-05-15 2000-02-15 Hoffmann-La Roche Inc. Pegylated obese (ob) protein compositions
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
ATE255634T1 (de) * 1997-09-01 2003-12-15 Aventis Pharma Gmbh Rekombinantes humanes erythropoietin mit vorteilhaftem glykosylierungsmuster
WO2000032772A2 (en) 1998-11-30 2000-06-08 Eli Lilly And Company Erythropoietic compounds
JO2291B1 (en) * 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
WO2001068141A2 (en) 2000-03-17 2001-09-20 Maxygen Aps Dispersions of polypeptide conjugates
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
MXPA02011303A (es) * 2000-05-15 2003-04-25 Hoffmann La Roche Nueva composicion farmaceutica.

Also Published As

Publication number Publication date
HU0002553D0 (en) 2000-08-28
TNSN00147A1 (fr) 2005-11-10
CY2007021I1 (el) 2009-11-04
NL300289I9 (nl) 2019-08-21
CN1280137A (zh) 2001-01-17
ITMI20001479A1 (it) 2001-12-30
ES2289985T3 (es) 2008-02-16
PL202758B1 (pl) 2009-07-31
TR200001956A2 (tr) 2001-01-22
CZ20002386A3 (cs) 2002-04-17
CY2007021I2 (el) 2009-11-04
NL300289I1 (nl) 2007-11-01
FR07C0051I2 (fr) 2008-05-09
NO20003372D0 (no) 2000-06-28
NO20003372L (no) 2001-01-03
EP1064951A3 (en) 2002-03-20
DE60036053D1 (de) 2007-10-04
LU91363I2 (fr) 2007-11-12
GB0016205D0 (en) 2000-08-23
PT1064951E (pt) 2007-09-10
BG65449B1 (bg) 2008-08-29
EP1839676A3 (en) 2008-09-03
AR024625A1 (es) 2002-10-16
CZ299516B6 (cs) 2008-08-20
US6583272B1 (en) 2003-06-24
EP1839676A2 (en) 2007-10-03
HUP0002553A2 (en) 2001-03-28
DOP2000000030A (es) 2002-07-15
ES2191511A1 (es) 2003-09-01
SV2002000120A (es) 2002-01-31
PA8497801A1 (es) 2001-12-14
NO2009010I1 (no) 2009-05-25
EP1064951B1 (en) 2007-08-22
JP3727009B2 (ja) 2005-12-14
ITMI20001479A0 (it) 2000-06-30
GB2393960C (en) 2012-08-29
BRPI0002276B1 (pt) 2019-05-14
HK1033328A1 (en) 2001-08-24
OA11442A (fr) 2004-04-28
NZ505454A (en) 2001-12-21
SG92717A1 (en) 2002-11-19
IS5554A (is) 2001-01-02
FR07C0051I1 (hu) 2007-12-14
HUP0002553A3 (en) 2005-11-28
MY128500A (en) 2007-02-28
AU4274400A (en) 2001-01-04
CA2310536C (en) 2007-09-11
RS49928B (sr) 2008-09-29
CA2310536A1 (en) 2001-01-02
PL341187A1 (en) 2001-01-15
EA200000607A1 (ru) 2001-02-26
DE122007000064I1 (de) 2008-01-03
UY26228A1 (es) 2000-10-31
CO5190661A1 (es) 2002-08-29
GT200000109A (es) 2001-12-21
NO2009010I2 (no) 2014-06-02
NL300289I2 (nl) 2010-02-01
DE60036053T2 (de) 2008-01-03
PE20010297A1 (es) 2001-03-07
ES2191511B1 (es) 2005-01-01
GEP20022804B (en) 2002-09-25
FR2795734A1 (fr) 2001-01-05
NO327043B1 (no) 2009-04-06
IS2492B (is) 2009-02-15
KR100593143B1 (ko) 2006-06-26
CY1107719T1 (el) 2010-07-28
YU40700A (sh) 2003-12-31
CN1515590A (zh) 2004-07-28
FR2795734B1 (fr) 2005-09-30
JP2001064300A (ja) 2001-03-13
GB2393960B (en) 2004-08-04
HRP20000436B1 (en) 2008-01-31
MXPA00006547A (es) 2004-10-28
IT1318606B1 (it) 2003-08-27
CN1283664C (zh) 2006-11-08
SK286301B6 (en) 2008-07-07
BR0002276A (pt) 2001-12-11
IL137056A0 (en) 2001-06-14
SI1064951T1 (sl) 2007-12-31
AR055650A2 (es) 2007-08-29
GC0000197A (en) 2006-03-29
GB2353281B (en) 2004-06-09
LU91363I9 (hu) 2018-12-31
EA003777B1 (ru) 2003-08-28
DE10031839A1 (de) 2001-02-01
DE122007000064I2 (de) 2010-03-25
BRPI0002276B8 (pt) 2021-05-25
BG104570A (en) 2001-09-28
GB2393960A (en) 2004-04-14
TWI235667B (en) 2005-07-11
CN1184233C (zh) 2005-01-12
EP1064951A2 (en) 2001-01-03
KR20010049676A (ko) 2001-06-15
ATE370748T1 (de) 2007-09-15
ID26447A (id) 2001-01-04
US20030120045A1 (en) 2003-06-26
HK1068354A1 (en) 2005-04-29
DK1064951T3 (da) 2007-10-08
GB2353281A (en) 2001-02-21
MA26746A1 (fr) 2004-12-20
SK9872000A3 (en) 2002-06-04
GB0400086D0 (en) 2004-02-04
HRP20000436A2 (en) 2001-06-30
AU736067B2 (en) 2001-07-26
JP2004155787A (ja) 2004-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2310536C (en) Erythropoietin derivatives
AU2002233230B2 (en) Erythropoietin conjugates
EP1345628B1 (en) Conjugates of erythropoietin (epo) with polyethylene glycol (peg)
JP4190184B2 (ja) ポリエチレングリコールを有するエリスロポエチン接合体
CA2460489C (en) Pegylated and diglycosylated erythropoietin

Legal Events

Date Code Title Description
AA1S Information on application for a supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: MIRCERA-METHOXY POLYETHYLENE GLYCOL-EPOETIN BETA; REG. NO/DATE: EU/1/07/400/001-016 20070720

Spc suppl protection certif: S0800019

Filing date: 20081128

Expiry date: 20200630

FG4S Grant of supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: MIRCERA-METHOXY POLYETHYLENE GLYCOL-EPOETIN BETA; REG. NO/DATE: EU/1/07/400/001-016 20070720

Spc suppl protection certif: S0800019

Filing date: 20081128

Expiry date: 20200630

Extension date: 20220720