JP2000509995A - カルシウム結合特性が変性された修飾α―アミラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 カルシウム結合部位に関連する残基を化学的または遺伝子的に変性することにより、新しいカルシウム結合部位が修飾された新しいα−アミラーゼが開示されている。この新しいα−アミラーゼは、低ｐＨデンプン加水分解性能、安定性および活性分布のような、変性された性能特性を有している。

Description

【発明の詳細な説明】 カルシウム結合特性が変性された 修飾α−アミラーゼ 発明の分野 本発明はカルシウム結合特性が変性されたα−アミラーゼに関するものである 。本発明は、特に、分子中の予め知られていないカルシウム結合部位でのカルシ ウムの結合を変性することを意図した修飾、例えば、点突然変異が行われた新た なα−アミラーゼに関するものである。この付加部位でカルシウム結合特性を変 性することにより、修飾α−アミラーゼの安定性を改良することができる。発明の背景 α−アミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、ＥＣ３ ．２．１．１）は、デンプン中の内部α−１，４−グルコース結合を、主に無作 為に加水分解し、分子量のより小さいマルトデキストリンを生成する。α−アミ ラーゼは、重要な商業的価値があるものであり、デンプン加工の初期段階（液化 ）において、アルコール製造において、洗剤マトリクス中の洗浄剤として、そし て、デンプンの糊抜きを行う繊維工業において使用されている。α−アミラーゼ は、BacillusおよびAspergillusを含む幅広い微生物により産生されており、最 も市販されているアミラーゼは、Bacillus licheniformis，Bacillus amyloliqu efaciens，Bacillus subtilisまたはBacillus stearothermophilusのような細菌 源から産生されている。近年、商業用途で好ましい酵素は、少なくとも中性およ び弱アルカリ性のｐＨでのその熱安定性および性能のために、Bacilluslichenif ormisからのものであった。 来国特許第5,322,778号において、重亜硫酸またはその塩、アスコルビン酸ま たはその塩、エリソルビン酸(erythorbic acid)のような酸化防止剤、またはブ チル化水酸化アニソール、ブチル化水酸化トルエンまたはａ−トコフェロールの ような酸化防止剤を液化スラリーに加えることにより、ｐＨ4.0および6.0の間で 液化が行われた。この特許によれば、重亜硫酸ナトリウムを５ｍＭよりも大きい 濃度 で加えなければならない。 米国特許第5,180,669号において、溶液に緩衝作用を及ぼすのに必要とされる 量よりも多くの炭酸イオンを、ひいて粉にしたデンプンスラリーに加えることに より、5.0から6.0までのｐＨで液化が行われた。炭酸イオンを加えたことにより ｐＨの影響が増大したために、一般的に、スラリーは、水素イオンの供給源、例 えば、塩酸または硫酸のような無機酸を加えることにより中和される。 ＰＣＴ公開第WO95/10603号には、洗濯または皿洗いの性能が改良され、Bacill us licheniformisα−アミラーゼ内の位置Ｍ１９７での単突然変異以外の突然変 異を含むα−アミラーゼ突然変異株が開示されている。 ＰＣＴ公開第WO94/02597号には、一つ以上のメチオニンが、システインまたは メチオニン以外のアミノ酸により置換されている、酸化安定性が改良された突然 変異株α−アミラーゼが記載されている。 ＰＣＴ公開第WO94/18314号には、一種類以上の、メチオニン、トリプトファン 、システイン、ヒスチジンまたはチロシンの残基が耐酸化性アミノ酸により置換 された、酸化安定性が改良された突然変異体α−アミラーゼが記載されている。 ＰＣＴ公開第WO91/00353号では、野生型Bacillus licheniformisα−アミラー ゼによる液化に関連する性能の特徴および問題について、このα−アミラーゼを 遺伝子操作して、特定の置換基Ala-111-Thr、His-133-Tyrおよび／またはThr-14 9-lleを含ませることにより着手している。 組換えＤＮＡ技術を用いて、どの残基がアミラーゼの触媒活性にとって重要で あるかを探求する、および／または様々なアミラーゼおよびグリコシラーゼの活 性部位内のあるアミノ酸を修飾する効果を探求する研究が、様々な研究者により 行われてきた（Vihinen等、J.Biochem.，107巻，267-272頁(1990)；Holm等、Pro tein Engineering，３巻，181-191頁(1990)；Takase等、Biochemia et Biophysi ca Acta，1120巻，281-288頁(1992)；Matsui等、Febs Letters，310巻，216-218 頁(1992)；Matsui等、Biochemistry，33巻，451-458頁(1992)；Sogaard等、J.Bi ol.Chem.，268巻，22480-22484頁(1993)；Sogaard等、Carbohydrate Polymers， 21巻，137-146頁(1993)；Svensson、Plant Mol.Biol.，25巻，141-157頁(19994) ；Svensson等、J.Biotech.，29巻，1-37頁(1993)）。研究者達はまた、どの残基 が熱安 定性にとって重要であるかを研究しており（Suzuki等、J.Biol.Chem.，246巻，1 8933-18938頁(1989)；Watanabe等、Eur.J.Biochem.，226巻，277-283頁(1994)) 、あるグループは、そのような方法を用いて、Bacillus licheniformisアミラー ゼ内の様々なヒスチジン残基で突然変異株を導入している。その理論的根拠は、 Bacillus licheniformisアミラーゼは、他の類似のBacillusアミラーゼと比較し た場合、比較的熱安定性であることが知られ、このアミラーゼは、過剰のヒスチ ジンを有しており、したがって、ヒスチジンを置換すると、酵素の熱安定性に影 響があることが示唆されている。この研究により、＋133位置のヒスチジン残基 および＋209位置のアラニン残基で、突然変異株の安定化が確認された（Declerc k等、J.Biol.Chem.，265頁，15481-15488頁(1990)；Joyet等、Bio/Technology， 10巻，1579-1583頁(1992)）。 異なる微生物からのα−アミラーゼが、一次構造が著しく異なるにもかかわら ず、同様の三次元構造を有することが示された。図１は、Bacillus licheniform isα−アミラーゼの構造を示している。様々なα−アミラーゼの間で、いくつか の種間変種が存在するけれども、Bacillus licheniformisα−アミラーゼの主要 構造要素が、一般的にα−アミラーゼ構造を示すと考えられている（Brayer等、 Protein Sci.，4巻，1730-1742頁(1995)；Larson等、J.Mol.Biol.，235巻，1560 -1584頁(1994)；Qian等、J.Mol.Biol.，231巻，785-799頁(1993)を参照のこと） 。例えば、部位特異的突然変異誘発により、触媒作用にとって重要な（Svensson 等、Plant Mol.Biol.，25巻，141頁(1994)）、三種類の不変カルボキシレートお よび二種類の不変ヒスチジン（Bacillus licheniformisα−アミラーゼ中のD231 ，E261，D328およびH104およびH327）が確認され、一般機構が提案された（Mazu r等、Biochem.Biophys.Res.Comm.，204巻，297(1994)）。カルシウムと塩化物の 結合に関与すると考えられている発見された残基が、特徴付けられ、異なる酵素 間で高度に保存されることが分かった（例えば、Kadziola等、J.Mol.Biol.，239 巻，104頁81994)；Qian等、前出；Larson等、前出；Brayer等、前出；Machius等 、J.Mol.Biol.，246巻，545-559頁(1995)；およびBoel等、Biochem.，29巻，624 4頁(1990)を参照のこと）。 さらに、植物から、哺乳動物および細菌までに亘る、現在までに塩基配列決定 されたほとんど全てのエンドアミラーゼの間で相同性が発見された（Nakajima等 、Appl.Microbiol.Biotechnol.，23巻，355-360頁(1986)；Rogers、Biochem.Bio phys.Res.Commun.，128巻，470-476頁(1985)；Janecek、Eur.J.Biochem.，224巻 ，519-524頁(1994)）。下線部分が相同性の高い領域を示している図５に示すよ うに、あるBacillusアミラーゼには、特に相同性の高い四つの領域がある。Baci llusエンドアミラーゼ間の関係の遺伝地図を作製するのに、配列アライメントも 用いられた（Feng等、J.Molec.Evol.，35巻，351-360頁(1987)）。Holm等、Prot ein Engineering，3巻，181-191(1990)により測定されたように、Bacillus stea rothremophilusアミラーゼとBacillus licheniformisアミラーゼとの間の相対的 な配列相同性は約66％であり、Bacillus licheniformisアミラーゼとBacillus a myloliquefaciensアミラーゼとの間の相対的な配列相同性は約81％である。配列 相同性は重要であるけれども、アミラーゼまたは他の酵素を比較する際に、構造 的相同性も重要であることが一般的に認識されている。 異なる微生物からの様々なα−アミラーゼ（およびシクロデキストリングリコ シルトランスフェラーゼおよびα−グルコシダーゼのような関連するデンプン分 解酵素）間の三次元構造の類似性が、一次構造が異なっているにもかかわらず、 中央部分（ドメインＡ）を形成するα／β−バレル、別のドメインＣとしてのグ リークキーモチーフ(Greek Key motif)およびドメインＢである少なくとも一つ の付加ドメインが共通して存在する場合に見られる（Machius等、前出）。種に 応じて、様々な長さのいくつかのβ鎖からなる基質結合は、α／β−バレルとド メインＢとの間の中裂に局在化されると考えられている（Machius、前出）。ま た、構造的完全性を維持すると考えられているカルシウムに関する必要条件も共 通している。Machiusは、Bacillus licheniformisからの、カルシウムが除去さ れたα−アミラーゼの結晶構造から由来したN104、D200およびH235に対応する残 基を関係付けるカルシウム結合部位を開示している。Bacillus licheniformis の構造に加えて、Aspergillus niger（Brady等、Acta Crystallog.B，47巻，5 27頁(1991)）、ブタの膵臓（Qian等、J.Mol.Biol.，231巻，758頁(1993)；Jarso n等、J.Mol.Biol.，235巻，1560頁(1994)）、および人の膵臓（Brayer等、Prot. Sci.，4巻，1730頁(1995)）の構造も決定された。 従来技術において遂げられた進歩にもかかわらず、活性および安定性を含む性 能が、デンプンの液化、洗濯と皿洗いの洗浄剤、ベーキング、繊維の糊抜きおよ び他のアミラーゼに標準的な用途への使用を促進するように変性されたα−アミ ラーゼが今もなお望まれている。市販のアミラーゼは、安定性および／または活 性に問題があるために、多くの条件下で許容されないので、そのような条件下で 性能のプロフィールが変性された、好ましくは向上したアミラーゼが必要とされ ている。例えば、デンプンの液化最中に存在する極端な条件または洗浄剤に関連 する高アルカリ度および酸化体（漂白剤）のレベルによって、α−アミラーゼの 活性が欠如し、不安定になることがある。したがって、野生型または前駆体の酵 素と比較して、酵素活性を変性、維持、または増大させながらも達成できる、熱 安定性、ｐＨ安定性、酸化安定性またはカルシウム安定性のような性能の特徴を 変性することが望ましい。同様に、多くのα−アミラーゼには、安定性のために カルシウムイオンを添加する必要があることが知られている。これは、処理コス トが増加してしまうために、ある用途においては望ましくない。発明の概要 本発明の目的は、性能プロフィールが変性された、例えば、ｐＨ安定性、アル カリ安定性、酸化安定性、熱安定性または酵素活性が変性されたα−アミラーゼ を提供することにある。 本発明のさらなる目的は、カルシウム結合特性が変性された、例えば、活性レ ベルを維持するのに必要とされるカルシウムを添加する量の減少した、α−アミ ラーゼを提供することにある。 本発明のさらなる目的は、特にデンプンの液化中において、低ｐＨでの安定性 または活性が増大したために、性能が改良されたα−アミラーゼを提供すること にある。 本発明のさらなる目的は、高温または高ｐＨの環境における、もしくは酸化体 または漂白剤の存在下の性能が改良されたα−アミラーゼを提供することにある 。 本発明のさらなる目的は、安定性または活性が変性されたために、繊維の糊抜 きまたはベーキングにおける性能が改良されたα−アミラーゼを提供することに ある。 本発明によれば、Ａドメイン、Ｃドメインおよびカルシウム結合部位を含むα −アミラーゼであって、カルシウム結合部位が、ＡドメインおよびＣドメインに 関連し、Ａドメインおよび／またはＣドメイン中のリガンド残基を含み、α−ア ミラーゼが、カルシウム結合部位の特徴を変性し、それによって、α−アミラー ゼの性能を変性するように修飾されたα−アミラーゼが提供される。 好ましい実施の形態において、その修飾は、Bacillus licheniformisα−アミ ラーゼ中の一つ以上のアミノ酸残基290-309、339-347、402-411、426-436または 472-477に相当する残基で置換、欠失または付加が生じる遺伝的修飾からなる。 特に好ましい実施の形態において、その遺伝子修飾は、Bacillus licheniformis α−アミラーゼ中の一つ以上のG301、M304、H405、H406および／またはK436に相 当する残基での置換、欠失または付加を含む。 組成物の実施の形態において、本発明は、本発明のα−アミラーゼをコード化 するＤＮＡからなる。さらなる組成物の実施の形態において、本発明は、本発明 によるα−アミラーゼをコード化するＤＮＡを含む発現ベクター、並びにそのよ うなＤＮＡおよび／または発現ベクターがその中に形質転換された宿主細胞から なる。方法の実施の形態は、本発明のα−アミラーゼをコード化するＤＮＡまた はそのようなＤＮＡを含有する発現ベクターを宿主細胞中で発現させる工程から なる。 さらなる組成物の実施の形態において、本発明は、本発明によるα−アミラー ゼを含む洗濯または皿洗い用洗浄剤組成物からなる。別の組成物の実施の形態に おいて、本発明は、本発明によるα−アミラーゼを含む繊維糊抜き組成物からな る。さらに別の組成物の実施の形態において、本発明は、本発明によるα−アミ ラーゼを含むデンプン液化組成物からなる。さらに別の組成物の実施の形態にお いて、本発明は、本発明によるα−アミラーゼからなるベーキング助剤からなる 。 本発明の方法の実施の形態において、本発明によるα−アミラーゼを含む皿洗 い用洗浄剤組成物により皿を洗うまたは衣類を洗濯する方法を提供する。本発明 の別の方法の実施の形態において、本発明によるα−アミラーゼを含む組成物に より繊維を糊抜きする方法を提供する。本発明のさらに別の方法の実施の形態に おいて、本発明によるα−アミラーゼを含むデンプン液化組成物によりデンプン を液化する方法を提供する。本発明のさらに別の方法の実施の形態において、本 発明によるα−アミラーゼを含む組成物を加える工程からなるベーキング方法を 提供する。 本発明による修飾α−アミラーゼにより、従来技術のα−アミラーゼと比較す ると、いくつかの重要な利点が得られる。例えば、通常のデンプン液化方法に典 型的な低ｐＨおよび高温での活性が増大した突然変異株において、一つの利点が 見られる。洗浄剤中への使用を促進する、酸化安定性および高ｐＨでの安定性が 増大した突然変異株において、別の利点が見られる。低濃度のカルシウムイオン またはそれを含まない状態での安定性が増大した突然変異株により、さらに別の 利点が得られる。本発明の目的およびそれに付随する利点が、以下の詳細な説明 および実施例においてより明確になる。図面の簡単な説明 図１は、ＡドメインとＢドメインに関連するカルシウム結合部位（ＣａｌＡ） およびＡドメインとＣドメインに関連する第二のカルシウム結合部位（ＣａｌＢ ）の位置並びに主鎖の折り重なりを示す、Bacillus licheniformisα−アミラー ゼの構造を示している。 図２は、Bacillus licheniformis由来のα−アミラーゼのＡドメインおよびＣ ドメインに関連するカルシウム結合部位でのＳｍ異常差フーリエおよび最終的な ２ｆｌｏ−ｆｃ差地図の立体図を示している。 図３Ａ−Ｃは、Bacillus licheniformis（ＮＣＩＢ８０６１）からのα−アミ ラーゼについての遺伝子のＤＮＡ配列およびGray等のJ.Bacteriology，166巻，6 35-643頁(1986)により記載された翻訳産物の演鐸アミノ酸配列を示している。 図４は、Bacillus licheniformisからの成熟α−アミラーゼ酵素のアミノ酸配 列を示している。 図５Ａ−Ｂは、三種類のBacillusα−アミラーゼの一次構造の配列を示してい る。Bacillus licheniformisα−アミラーゼ（Ａｍ−Ｌｉｃｈ）は、Gray等、J. Bacteriology，166巻，635-643頁(1986)により記載されており；Bacillusamylol iquefaciensα−アミラーゼ（Ａｍ−Ａｍｙｌｏ）は、Takkinen等、J.Biol.Chem .，258巻，1007-1013頁(1983)により記載されており；Bacillus stearothermop hilusα−アミラーゼは、Ihara等、J.Biochem.，98巻，95-103頁(1985)により記 載されている。発明の詳細な説明 「α−アミラーゼ」は、α（１−４）グリコシド結合、例えば、デンプン、ア ミロペクチンまたはアミロース高分子中の結合を開裂するまたは加水分解する酵 素活性を意味する。ここで用いられるα−アミラーゼは、自然に生じるα−アミ ラーゼ並びに組換えα−アミラーゼを含む。本発明によるα−アミラーゼは、前 駆体アミラーゼに由来していてもよい。前駆体α−アミラーゼは、α−アミラー ゼを産生できるいかなる供給源からも産生される。α−アミラーゼの適切な供給 源は、菌類、細菌、植物または動物を含む、原核生物および真核生物である。好 ましくは、前駆体α−アミラーゼは、Bacillusまたは真菌、例えば、Aspergillu s（すなわち、A.oryzaeおよびA.niger）由来のものにより産生される。より好ま しくは、前駆体は、Bacillus licheniformis、Bacillus amyloliquefaciensまた はBasillus stearothermophilusにより産生され、より好ましくは、前駆体α− アミラーゼは、Bacilluslicheniformisより由来している。 「修飾」α−アミラーゼは、生化学的特性、構造的特性または物理化学的特性 を変性させるように遺伝子修飾または化学的修飾が施されたα−アミラーゼであ る。α−アミラーゼにおける「遺伝子修飾」は、自然に生じるα−アミラーゼま たは前駆体α−アミラーゼをコード化するＤＮＡ配列を修飾して、その自然に生 じるα−アミラーゼまたは前駆体α−アミラーゼに匹敵するα−アミラーゼ配列 における一つ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失をコード化する突然変異株 ＤＮＡを産生することを意味する。 「発現ベクター」は、一般的に適切な制御配列に操作可能に結合した、適切な 宿主内でＤＮＡの発現を行うことのできるＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を意味 する。そのような制御配列は、転写を行うプロモータ、そのような転写を制御す る任意のオペレータ配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコード化する配 列、並びに転写および翻訳の終了を制御する配列を含んでもよい。好ましいプロ モータは、Bacillus subtilis aprEプロモータである。ベクターは、プラスミド 、ファージ粒子、またはゲノム挿入、すなわち、組込みを行うことを意図したＤ Ｎ Ａであってもよい。一度適切な宿主中に形質転換されたら、ベクターは、複製を 行い、宿主ゲノムと独立して機能してもよく、または、ある場合には、ゲノム自 体中に組み込まれてもよい。プラスミドおよびベクターは、プラスミドは現在、 ベクターの最も一般的に用いられる形態であるので、ときどき交換可能に使用さ れる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たし、特にファージディスプレ ーを含む技術において知られている、または知られる発現ベクターのそのような 他の形態を含むことを意図している。 「宿主菌株」または「宿主細胞」は、例えば、本発明によるα−アミラーゼを コード化するＤＮＡを含む発現ベクターの適切な宿主を意味する。本発明におい て有用な宿主細胞は一般的に、本発明によるα−アミラーゼの発現を行うことの できるいかなる形質転換可能な微生物を含む、原核宿主または真核宿主である。 特に、Bacillus菌株のような、そのα−アミラーゼが由来する同一の種または属 の宿主菌株が適している。好ましくは、α−アミラーゼ陰性Bacillus菌株（遺伝 子欠失）および／またはα−アミラーゼおよびプロテアーゼ欠失Bacillus菌株（ 例えば、ΔａｍｙＥ、Δａｐｒ、Δｎｐｒ）が用いられる。宿主細胞は、組換え ＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターにより形質転換または形質移入される。 このような形質変換された宿主細胞は、α−アミラーゼおよびその変異株（突然 変異株）をコード化するベクターまたは所望のα−アミラーゼを発現するベクタ ーのいずれかを複製することができる。 「液化」または「液化する」とは、デンプンがより短い鎖または粘性の小さい デキストリンに変換される工程を意味する。一般的に、この工程には、α−アミ ラーゼの添加と同時、または後にα−アミラーゼが添加されるデンプンのゲル化 が含まれる。 「カルシウム結合部位」は、遊離カルシウムの存在下でのカルシウムイオンと の結合に適し、その結合に作用するα−アミラーゼ内の領域を意味する。カルシ ウムは一般的に、多くの条件下でα−アミラーゼの構造的完全性を維持するのに 必要とされると考えられており、カルシウム結合に含まれるアミノ酸残基が、異 なる酵素の中でも高度に保存されることが示されている（Machius等、J.Mol.Bio l.，246巻，545-449頁(1995)）。本発明によれば、カルシウム結合部位の特徴は 、 野生型または前駆体のα−アミラーゼと比較して、α−アミラーゼの性能を変性 するように変性されている。カルシウム結合部位の変性は、カルシウムイオンと 結合するその部位の結合性を減少させるまたは増大させることを含んでいてもよ い。その性能を変性するということは、様々な用途における酵素の安定性（例え ば、酸化安定性または熱安定性）または活性（例えば、そのα−アミラーゼがデ ンプン基質を加水分解する速度または効率）を意味することを意図するものであ る。 「リガンド残基」または「カルシウムリガンド」は、カルシウム結合部位内で 結合したカルシウムイオンとリガンドを形成する、α−アミラーゼ酵素内のアミ ノ酸残基を意味する。本出願人により発見されたα−アミラーゼ内のカルシウム 結合部位に関して、カルシウムリガンドとして作用すると考えられている五つの アミノ酸リガンドが同定されている。そのカルシウムリガンド残基は、Bacillus licheniformisα−アミラーゼ内のG300、Y302、H406、D407およびD430に相当す るアミノ酸残基からなる。特に、これらの同定されたカルシウムリガンドに関し て、G300、Y302およびH406のカルボニル酸素並びにD407およびD430の側鎖は、カ ルシウムとの結合に含まれると考えられている。 本発明によれば、カルシウム結合部位が、ＡドメインおよびＣドメインに関連 し、Ａドメインおよび／またはＣドメイン内のリガンド残基を含み、α−アミラ ーゼがカルシウム結合部位の特徴を変性し、それによって、α−アミラーゼの性 能を変性するように修飾されている、Ａドメイン、Ｃドメインおよびカルシウム 結合部位を含むα−アミラーゼが提供される。 本発明により提供されるα−アミラーゼの少なくとも一部を含むアミノ酸配列 をコード化する核酸分子（ＤＮＡ）、ベクターおよびファージを含有するそのよ うなＤＮＡを含む発現系、そのようなＤＮＡにより形質転換される宿主細胞、お よびそのアミノ酸配列をコード化するＤＮＡ分子に対応するＤＮＡのアンチセン ス鎖もまた提供される。同様に、本発明は、宿主細胞中に形質転換される、発現 系に含まれるＤＮＡを発現することにより、α−アミラーゼを製造する方法を含 む。 ＤＮＡ配列は、適当な発現ベクター内でそれらを発現制御配列に実施可能に結 合させ、よく知られた技術にしたがって、その発現ベクターを用いて適切な宿主 を形質転換することにより発現されてもよい。様々な宿主／発現ベクターの組合 せを、本発明のＤＮＡ配列を発現するのに用いてもよい。例えば、有用な発現ベ クターは、この目的に有用な様々な既知のプラスミドおよびファージのような、 染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列の断片を含む。さらに、一般的に、これ らのベクター中に様々な発現制御配列が用いられる。例えば、本出願人は、Baci llus形質転換体の好ましい発現制御配列が、Bacillus subtilis由来のａｐｒＥ 信号ペプチドであることを発見した。したがって、本発明には、ファージ表示系 が有用である。 様々な宿主細胞が、本発明のＤＮＡ配列を発現するのに有用であり、ここに検 討されている。これらの宿主は、E.coli，Pseudomanas，Bacillus，Streptomyce sの菌株、様々な菌類、例えば、TrichodermaまたはAspergillus、酵母および動 物細胞のような、よく知られた真核宿主および原核宿主を含んでいてもよい。好 ましくは、宿主は、本発明のα−アミラーゼを細胞外で発現して、純粋化および 顆粒の工程を促進させる。本発明の突然変異株α−アミラーゼの発現および純粋 化は、そのような工程を実施する従来技術で認識されている手段により行われて もよい。 本発明によるα−アミラーゼは、前駆体α−アミラーゼのアミノ酸配列から由 来するアミノ酸配列からなる。前駆体α−アミラーゼは、自然に生じるα−アミ ラーゼおよび組換えα−アミラーゼを含む。α−アミラーゼ突然変異株のアミノ 酸配列は、前駆体アミノ酸配列の一つ以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入に より、前駆体α−アミラーゼアミノ酸配列から由来する。そのような修飾は一般 的に、前駆体α−アミラーゼ酵素それ自体の操作というよりもむしろ、前駆体α −アミラーゼのアミノ酸配列をコード化する前駆体ＤＮＡ配列の修飾である。α −アミラーゼ遺伝子を修飾し（すなわち、部位定方向オリゴヌクレオチド突然変 異誘発により）、突然変異誘発された遺伝子により産生された酵素産生物を形質 転換し、発現し、分泌する方法が、ＰＣＴ公開第WO95/10603号（Novo Nordisk） 、ＰＣＴ公開第WO94/02597号（Novo Nordisk）、ＰＣＴ公開第WO94/18314号（Ge nencor International，Inc.）およびＰＣＴ公開第WO91/00353（Gist Brocades ）を 含む従来技術に記載されており、これらの開示をここに引用する。前駆体ＤＮＡ 配列を操作するさらなる適した方法として、米国特許第4,760,025号および同第5 ,185,258号に記載された方法が挙げられ、これらの特許をここに引用する。 ここに開示され、α−アミラーゼの性能を変性するようにそれを変化させる新 たに発見されたＣａｌＢ部位を含む、主要構造要素が、ほとんどのα−アミラー ゼに適用可能なものとして一般的に以下に記載されている。図１に示したように 、Ａドメイン、ＢドメインとＣドメイン、並びに二つのカルシウム結合部位であ るＣａｌＡとＣａｌＢの三つの主要ドメインが定義されている。Ａドメインは、 分子の中央部分からなり、α／βまたはＴＩＭバレルとして認識されている。α ／βバレルは、αらせんにより相互接続されている一連の平行なβ鎖から作成さ れている。Ａドメインの一方の側にある酵素のカルボキシ末端には、「Greek ke y」モチーフとして知られている逆平行βバレルからなる領域がある（例えば、R ichardson等、Advan.Protein Chem.，34巻，167-339頁(1981)；Braden等、Intro duction to Protein Structure，Garland Publishing Inc.，New York(1991)を 参照のこと）。このドメインは、Ｃドメインとして認識されている。Ａドメイン のＣドメインとは反対の側（Ｎ末端）には、Ｂドメインとして知られている、種 に依存して様々な長さのいくつかのβ鎖からなる付加ドメインがある。Ｂドメイ ンは、異なる種のα−アミラーゼの間で非常に異なるものとして認識されており 、しばしば延長ループを含む。基質結合は、ＡドメインとＢドメインとの間の中 裂に限定されており、活性部位はさらに、分子のこの領域に関連すると考えられ ている。ＣａｌＡ結合部位は、ＡドメインとＢドメインとを分離する中裂内に位 置しており、この領域に安定性を付与すると考えられている。ここに開示されて いるＣａｌＢ結合部位は、ＡドメインおよびＣドメインの中間の領域に位置して いる。 本出願人によって、Bacillusα−アミラーゼ中にＣａｌＢ結合部位が発見され たことにより、性能が変性された、特に、安定性が変性された突然変異株α−ア ミラーゼを開発することができる。例えば、タンパク質構造を安定化させる一般 的な原則を、ＣａｌＢ部位の周りの領域に適用してもよい。さらに、ＣａｌＢ部 位でのカルシウムの結合を改良するように特に設計された方法を実施して、酵素 の安定性を増大させてもよい。好ましくは、そのような修飾は、ＣａｌＢ結合部 位に結合されるカルシウムの質量中心から15オングストローム以内、より好まし くは、ＣａｌＢ結合部位に結合されるカルシウムの質量中心から10オングストロ ーム以内にある。 α−アミラーゼ内の残基を、欠失または置換のためにここに確認する。したが って、ここに論じられる残基は、図４に示した成熟Bacillus licheniformisα− アミラーゼ配列に割り当てられた番号を参照するアミノ酸位置番号を意味する。 しかしながら、本発明は、Bacillus licheniformisの特に成熟α−アミラーゼの 突然変異に制限されず、Bacillus licheniformisα−アミラーゼ中の特定の同定 された残基に相当する位置でアミノ酸残基を含有する非Bacillus licheniformis 前駆体α−アミラーゼにまでに亘る。前駆体α−アミラーゼの残基は、Bacillus licheniformisα−アミラーゼ中の特定の残基またはその残基の特定の部分と相 同（すなわち、一次構造または三次構造のいずれかの位置に対応する）または相 似（すなわち、化学的または構造的に結合、反応または相互作用する同一または 同様の官能的能力を有する）のいずれかである場合、Bacillus licheniformisα −アミラーゼの残基と同等である。 一次構造との相同性を確立するために、前駆体α−アミラーゼのアミノ酸配列 を、Bacillus licheniformisα−アミラーゼの一次構造、そして特に、その配列 が知られている全てのα−アミラーゼにとって不変であることが知られている一 群の残基と直接的に比較する（例えば、図７を参照）。また、ブタの膵臓のα− アミラーゼ（Buisson等、EMBO Journal．6巻，3909-3916貞(1987)；Qian等、Bio chemistry，33巻，6284-6294頁(1994);Larson等、J.Mol.Biol.，235巻，1560-15 84頁(1994)）；Aspergillus oryzaeからのタカーアミラーゼA（Matsuura等、J.B iochem.(東京)，95巻，697-702頁(1984)）;およびA.nigerからの酸α−アミラー ゼ（Boel等、Biochemistry，29巻，624-6249頁(1990)）に関して報告された結晶 構造の三次構造分析により同等の残基を決定することもでき、前者の二つの構造 が同様であり、大麦に関してはα−アミラーゼである（Vallee等、J.Mol.Biol. ，236巻，368-371頁(1994)；Kadzioda、J.Mol.Biol.，239巻，104-121頁(1994) ）。予備的な研究がいくつか発表されているが（Suzuki等、J.Biochem.，108巻 ，379-381頁(1990)；Lee等、Arch.Biochem.Biophys，291巻，255-257頁(1991)； Chang 等、J.Mol.Biol.，229巻，235-238頁(1993)；Mizuno等、J.Mol.Biol.，234巻，1 282-1283頁(1993)）、Bacillus licheniformisα−アミラーゼに関しては、たっ た一つしか構造が発表されていない（Machius等、J.Mol.Biol．246巻，545-549 頁(1995)）。しかしながら、何人かの研究者により、グルカナーゼ間（MacGrego r等、Biochem.J.，259巻，145-152頁(1989)）およびα−アミラーゼ並びに他の デンプン代謝酵素（Jaspersen、J.Prot.Chem．12巻，791-805頁(1993)；MacGreg or、Starke，45巻，232-237頁(1993)）内の通常の超二次構造；およびα−アミ ラーゼと類似の超二次構造を有する酵素間での配列の類似性（Janecek、FEBS Le tters，316巻，23-26頁(1993)；Janecek等、J.Prot.Chem.，12巻，509-514頁(19 93)）が予測された。Bacillus stearothermophilus酵素の構造が、タカーアミラ ーゼＡの構造上でモデル化された（Holm等、Protein Engineering，3巻，181-19 1頁(1990)）。図７に示した四つの高度に保存された領域は、Bacillus lichenif ormis番号付けシステムの元でHis+105；Arg+229；Asp+231；His+235；Glu+261お よびAsp+328を含む、活性部位の一部であると考えられている多くの残基（Matsu ura等、J.Biochem.(東京)，95巻，697-702頁(1984)；Buisson等、EMBO Journal ，6巻，3909-3916頁(1987)；Vihinen等、J.Biochem.，107巻，267-272頁(1990) ）を含んでいる。 ＣａｌＢ結合部位を含むα−アミラーゼポリペプチ鎖の断片は、残基290-309 、339-347、402-411、426-436および472-477を含有している。これらのポリペプ チド断片は、ＣａｌＢ結合部位を含んでいる。したがって、これらの領域におけ る領域特異的無作為突然変異によって、この部位でのカルシウムの結合性の変調 によりα−アミラーゼの安定性を変調する変異株が産生されることが予期される 。 付加的なさらなる特異的な方法を以下に提供する： （１）主鎖を広げるエントロピーを増大させることにより、酵素に安定性を与 えられる。例えば、ループ構造中において、αらせんのＮ末端で逆回転の位置２ にプロリン残基を導入して、広げるエントロピーを増大させることによりタンパ ク質を著しく安定化できる（例えば、Watanabe等、Eur.J.Biochem.，226巻，277 -283頁(1994)を参照のこと）。同様に、グリシン残基は、β炭素を有さず、した がって、多くの他の残基よりもバックボーンの構造自由度が著しく大きい。この ために、結果として、安定性が弱く、柔軟性が高くなる。Bacillus licheniform is 中のG299、G410、G433、G474、G475と同等の一つ以上の残基でのグリシンの、好 ましくはアラニンとの置換により、柔軟性が減少し、安定性が改良される。さら に、外部ループを短くすることにより、安定性を改良できる。好過温菌により産 生されたタンパク質は、それらの中温菌の相同体よりも短い外部ループを有して いることが分かった（例えば、Russel等、Current Opinions in Biotechnology ，6巻，370-374頁(1995)を参照のこと）。ジスルフィド結合の導入もまた、互い に関して個別の三次構造を安定化させるのに効果的である。G301で修飾を行うと 、グリシンの構造変動性を制限または改良することにより290-309での断片の安 定性を変性できる。特に、この残基でのアスパラギン酸またはプロリンの置換が 考えられる。別の残基との置換によるG474での修飾によって、Ｃβを導入するこ とにより、したがって、その構造の自由度を低下させることにより、安定性を増 大できる。 （2）側鎖の疎水性を増大させることにより内部空間を減少させると、酵素の 安定性を変性できる。内部空間の数と容積を減少させると、疎水性相互作用を最 大限にし、詰込み欠陥を減少させることにより酵素の安定性が増大する（例えば 、Matthews、Ann.Rev.Biochem.，62巻，139-160頁(1993)；Burley等、Science， 229巻，23-29頁(1985)；Zuber、Biophys.Chem.，29巻，171-179頁(1988)；Kelli s等、Nature，333巻，784-786頁(1988)を参照のこと）。好温菌からの多量体タ ンパク質はしばしば、それらの中温菌のタンパク質よりも、表面相補性の大きい 、疎水性の大きいサブユニット界面を有している（Russel等、前出）。この原則 は、単量体タンパク質のドメイン界面に適用できると本出願人により考えられて いる。疎水性を増大させることにより安定性を改良できる特定の置換としては、 リシン対アルギニン、セリン対アラニンおよびスレオニン対アラニンが挙げられ る(Russel等、前出）。アラニンまたはプロリンに対する置換による修飾をG301 で行うと、側鎖のサイズが増大し、その結果、空間が減少して、詰込みが良好に なり、疎水性が増大する。さらに、ＣａｌＢ結合領域におけるドメインＡとドメ インＣとの間の界面の空間が、Y302、M304、L307、F343、L427およびI428により 境界がなされる。空間のサイズを減少させ、疎水性を増大させ、ＡドメインとＣ ドメインとの界面の相補性を改良する置換によって、酵素の安定性が改良される 。特に、 フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシンおよびイソロイシンの うちのいずれかから選択される異なる残基による、これらの位置での特定の残基 の置換を行うと、性能を改良できる。有用であると思われる追加の置換は、V409 およびF403であり、好ましくは、V409での置換は、イソロイシンまたはロイシン からなり、F403での置換は、チロシンまたはトリプトファンからなる。 （3）剛性二次構造、すなわち、αらせんおよびβ回転における電荷を相殺す ることにより、安定性を改良できる。例えば、らせんＮ末端の部分的な正の電荷 を、アスパラギン酸の負の電荷で中和することにより、この構造の安定性を改良 できる（例えば、Erikssono等、Science，255巻，178-783頁(1992)を参照のこと ）。同様に、らせんＣ末端の部分的な負の電荷を正の電荷で中和すると、安定性 を改良できる。β回転のペプチドＮ末端と相互作用しないように、正の電荷を除 去することは、三次構造に安定性を与えるのに効果的なはずである。正ではなく 荷電された残基によりH405を置換すると、405-408番のD407のアミド窒素と相互 作用しないように、望ましくない正の電荷を除去できる。 （4）塩橋および水素結合を導入して、三次構造を安定化することも効果的で ある。例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸とリシン、アルギニンまたは ヒスチジンとの間のイオン対相互作用により、強い安定化効果が導入され、この 導入を用いて、異なる三次構造要素が取り付けられ、その結果、熱安定性を改良 できる。さらに、荷電された残基／荷電されていない残基の水素結合の数、およ び水素結合の数が増加することによって、熱安定性が改良される（例えば、Tann er等、Biochemistry，35巻，2597-2609頁を参照のこと）。H405をアスパラギン 酸、アスパラギン、グルタミン酸またはグルタミンで置換すると、D407のバック ボーンのアミドにより水素結合が導入され、したがって、405-408番を安定化さ せる。K436をアルギニンで置換すると、D404との塩橋が改良され、I408のバック ボーンカルボニルにＨ結合が導入される。 （5）一般的に、易熱性残基を避けると、熱安定性が増大する。例えば、アス パラギンおよびグルタミンは脱アミノ化し易く、システインは高温で酸化し易い 。感受性位置におけるこれらの残基の数を減少させると、熱安定性が改良される （Russel等、前出）。グルタミンまたはシステイン以外の残基によりQ291、Q298 、 N309、Q340またはN473で置換または欠失を行うと、易熱性残基を避けることによ り安定性が増大する。 （6）カルシウムイオンに対するタンパク質からの第六のリガンドを導入する ことにより、結合したカルシウム、すなわち、酵素の安定性を改良できる。H406 のアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸またはグルタミンによる置換を 行うと、カルシウム結合性が増大する。 （7）CａｌＢにおいてカルシウムに対する存在するリガンドを安定化すること によっても、結合したカルシウム、したがって、酵素の安定性が増大する。例え ば、M304をフェニルアラニンまたはチロシンと置換して、芳香族側鎖／アスパラ ギン酸側鎖の安定化が導入される。ここでは、カルボキシレートの酸素が好まし くは、ベンジル環に関連する部分的な正の電荷と相互作用して、D407およびD403 の安定性を増大させる、H405をフェニルアラニンまたはチロシンにより置換して 、D407の近くに疎水性基を導入すると、D407側鎖のＣ−ｂ原子およびＣ−ｇ原子 との好ましいファンデルワールス相互作用の形成により、D407の安定性が増大す る。G300でフェニルアラニンにより置換を行うと、Q291への側鎖Ｈ結合が除去さ れる。 （8）カルシウムリガンドのいずれかの電気陰性度を増大させることにより、 カルシウム結合を改良できる。例えば、M304をフェニルアラニンまたはチロシン で置換すると、溶剤からの遮蔽が改良されることによりD407およびD430の電気陰 性度が増大し、それによって、カルシウム結合が改良される。 （9）カルシウム結合を妨害するかもしれないカルシウムイオンの近傍にある 正の電荷を除去することも同様に、カルシウム結合部位の安定性を改良するはず である。例えば、結合カルシウムの直近にあるH405またはH406を置換すると、正 に荷電したカルシウムイオンとの望ましくない電荷と電荷の相互作用を生じ、負 に荷電されたカルシウムリガンドとの競合する電荷と電荷の相互作用を有する正 の電荷が生じる。したがって、適切な正に荷電されていない残基により置換を行 うと、カルシウム結合性およびタンパク質安定性が増大する。 （10）近傍に負に荷電した残基を導入することによってＣａｌＢ結合部位を安 定化しても、その部位でのカルシウムイオンの結合を改良できる（例えば、Pant oliano等、Biochemistry，27巻，83181-8317頁(1988)；Bryan、Stability of Pr otein Pharmaceuticals Part B:In vitro Pathways for Degradationand Strate gies for Protein Stabilization（Ahern & Manning，Eds.)，147-181頁(1992); Fagain、Biochim.Biophys.Acta，1252巻，1-14頁(1995)を参照のこと）。例えば 、負に荷電したアスパラギン酸またはグルタミン酸によりQ291、Q298、N309、Q3 04、H405、H406、N473および／またはG474の置換を行うと、カルシウム区域内の 正味の負の電荷が増大し、カルシウム結合性、すなわち、酵素安定性が増大する 。 本発明によるα−アミラーゼは、α−アミラーゼが通常用いられている様々な 用途に有用な望ましい子期せぬ結果を提供する、変更された特徴を示す。例えば 、改良された熱安定性、改良されたｐＨ安定性および／または改良された酸化安 定性を含む、低ｐＨでの変更された特徴を示す、本発明によるα−アミラーゼは 、デンプンの低ｐＨ液化において有用である。向上した熱安定性は、それらを含 む製品の保存寿命を延長させるのに有用である。向上した酸化安定性または改良 された性能は、洗浄製品において、そして、そのような洗浄製品中に使用される 漂白剤、過ホウ酸塩、過炭酸塩または過酸の存在下でのα−アミラーゼの保存寿 命を延長させるのに特に望ましい。それにもかかわらず、デンプン分解活性の急 速で効率的な停止を必要とする工業工程においては、減少した熱安定性または酸 化安定性が有用であるかもしれない。さらに、減少した必要条件またはカルシウ ムに関する強い結合性は、洗浄剤中に一般的に見られる金属イオン封鎖成分、す なわち、ビルダーの存在下で有利である。 本発明のα−アミラーゼは、デンプン処理において、特にデンプンの液化にお いて特に有用である。商業的に望ましい液化工程中に存在する条件は特徴的に、 改良された低ｐＨ性能、改良された熱安定性および改良された酸化安定性を示す α−アミラーゼを必要とする、低ｐＨ、高温および潜在的な酸化条件を含んでい る。したがって、液化に特に有用な本発明によるα−アミラーゼは、約６未満、 好ましくは約5.5未満、そしてより好ましくは約5.0から5.5までの間のｐＨで改 良された性能を示す。さらに、約80-120℃の間、そして好ましくは約100-110℃ の間の温度で向上した熱安定性、および酸化体の存在下での向上した安定性を示 す本発明によるα−アミラーゼは特に有用である。好ましくは、液化に用いられ る本 発明によるα−アミラーゼはさらに、位置M15、V128、H133、W138、N188、A209 および／またはM197のうちの一つ以上で欠失または置換を含んでいる。 本発明の別の実施の形態において、本発明によるα−アミラーゼを含む、液体 、ゲルまたは粒状のいずれかの形態にある洗浄剤組成物を提供する。そのような 洗浄剤組成物は、本発明のα−アミラーゼが、増大した熱安定性を有して、保存 寿命が改良された、または通常洗浄剤中に存在する漂白剤または過酸化合物に対 して改良された耐性を有するように増大した酸化安定性を有するα−アミラーゼ が添加されたことで特に有利になる。したがって、本発明によるα−アミラーゼ は、約6.5から約12.0までの間のｐＨを有する、既知の粉末、液体またはゲルの 洗浄剤中に好ましく配合してもよい。本発明の好ましい実施の形態はさらに、位 置M15、V128、H133、N188、A209および／またはM197のうちの一つ以上で欠失ま たは置換を含んでいる。本発明によるα−アミラーゼを含む洗浄剤組成物はさら に、この業界で一般的に知られているように、エンドグリコシダーゼ、セルラー ゼ、プロテアーゼ、リパーゼまたは他のアミラーゼ酵素、例えば、Bacillus ste arothermophilus由来のアミラーゼのような他の酵素を含んでいてもよい。 本発明によるα−アミラーゼとプロテアーゼ酵素との組合せを含む本発明の実 施の形態は好ましくは、米国再発行特許第34,606号に記載されているもののよう な酸化安定性プロテアーゼ並びにDURAZYM(Novo Nordisk)、MAXAPEN(Gistbrocade s)およびPURAFECT（登録商標）0xP(Genencor International，Inc.)のような市 販されている酵素を含んでいる。そのようなプロテアーゼ突然変異体（酸化安定 性プロテアーゼ）、特に、Bacillus amyloliquefaciens中のM222と同等の位置で メチオニンが置換された突然変異体を製造する方法が、米国再発行特許34,606号 に記載されている。 以下は、実施例として提示されたものであり、請求の範囲を限定するものとし て考えるべきではない。ここに用いられた省略形、特にアミノ酸に関する三文字 または一文字の表記は、Dale、J.W.,Molecular Genetics of Bacteria，John Wi ley & Sons，(1989)付表Ｂに記載されている。実験に基づく 実施例 Bacillus licheniformisα−アミラーゼ結晶の調製 200ｍＭのビストリスプロパンでｐＨ6.5に緩衝した1.6-1.8MのＬｉ₂ＳＯ₄、１ ｍＭのＣａＣｌ₂、50ｍＭのＮａＣｌから作製した１０μＬの懸滴中で結晶を成 長させた。この結晶は、7-14日で、細長い角柱として、約1.5ｍｍの最大寸法ま で成長する。その空間群は、Ｐ２₁２₁２₁であり、ａ＝118.3Å、ｂ＝119.0Åお よびｃ＝84.9Åである。非対称ユニット内に２分子あるとすると、マシューズ番 号(Matthews No.)（Matthews、J.,Mol.Biol.，33巻，409頁(1968)を参照のこと ）は、3.01である。これは、標準範囲内である。ＲＵ−２００Ｂ回転陽極型Ｘ線 発生器上に取り付けられた、グラファイトで単色化されたＣｕＫα光線を発生さ せるＲＡＸＩＳＩＩイメージプレート装置を用いて、データを記録した。モレキ ュラーストラクチャー社(Molecular Structure Corp.)（テキサス州、ザウッド ランズ）によりその装置と一緒に供給されたソフトウェアを用いて、データを処 理して、データ量を圧縮した。異常拡散データで補足した多重同形置換（ＭＩＲ ）法（ＭＩＲＡＳ）、およびそれに続く密度補正を用いて、位相情報を決定した 。共晶析により調製したＳｍＣｌ₃誘導体を除いて、従来の浸漬法により重原子 誘導体を調製した。差分パターソンおよびクロスフェーズ差分フーリエ法を用い て、重原子の位置を決定した。優れた異常散乱データがＳｍＣｌ₃誘導体で得ら れ、これを正確な結合を求めるのに用いて、全ての重原子を共通の基点においた 。Ｘヘビー（Zhang等，Acta Crystallog．A，46巻，377頁(1990)）を用いて重原 子の位置を細分し、ＭＩＲＡＳ位相を計算した。位相をＳＱＵＡＳＨ（J．McRee ，J.，Mol．Graph.，10巻，44頁(1992)）を用いたソルベント平滑化によって改 善し、両分子の２次構造要素のほとんどを同定できる３．０Åマップを得た。モ デル構築、実空間細分および対称平均化はＸフィット（Zhang等，前出）を用い て行った。両分子の、α／βバレル・ドメインのβ鎖およびαらせんのＣα位置 、および全βドメインのＣ末端を同定した。Aspergillusのα−アミラーゼのＴ ＩＭバレル（ＰＤＢ登録：６ＴＡＡ）（Swift等，Acta Crystallog．B，47巻，5 35頁(1991)）を前記非対称単位の両分子の前記Ｃα痕にほぼ重ね合わせ、全非修 飾ドメインの実空間細分を用いて正確に位置を決めた。これにより、前記マップ の非結晶学的対称平均化に用いる、局所対称作用素を正確に決定することができ た。この結果、ドメイン Ｂを除いて、前記マップを大きく改善できた。この時点では、対称平均化された マップが作られたのは１つの分子だけであり、第２の分子については前記局所対 称作用素を用いて作成中であった。前記Ｃα位置を同定し、十分に細分された構 造のデータベース（Zhang等，前出；Jones等，EMBO，5巻，819頁(1986)）から引 き出した重ね合わせパラメータを用いて主鎖を構築した。ドメインＢでは、前記 マップのほとんどが解釈不能であり、残基１０５〜１１６および１３３〜１６９ のみが構築できた。側鎖密度が明らかでないことから、これらの残基に対してダ ミーのアラニンを構築した。この初期モデルを、１５〜３．０Åのデータ（Ｆ≧ ３σ）に対して、非結晶学的対称性制限を適用して、Ｘプロア（Brunger等，Act a Crystallog．A，42巻，140頁(1986)）を用いた、アニーリング徐冷プロトコル ・シミュレーション〔初期温度＝３０００Ｋ〕とこれに続く最小二乗細分化によ り、細分した。該モデルは、Ｒ因子０．２８に収束した。ＭＩＲＡＳおよびモデ ル位相をシグマＡ（Read，Acta Crystallog．A，42巻，140頁(1986)）を用いて 結合し、２．２Åマップを作成した。前記構造の残余部をかなりマニュアル調整 しながら失われた残基を構築し、次いで８．０〜２．２Åのデータ（Ｆ≧３σ） を用いて、アニーリング徐冷プロトコル・シミュレーション〔初期温度＝１００ ０Ｋ〕により細分した。このモデルはＲ因子０．２４５に収束した。続いて、制 限された等方Ｂ因子細分化により、Ｒ因子は０．２２５になった。位相の計算値 を用いてシグマＡ加重２ｆｏ−ｆｃおよびｆｏ−ｆｃマップをコンピュータで計 算して、誤りを検出し、またカルシウムイオンの位置を決めるのに用いた。未置 換晶の１．９Åデータを得るとすぐに、ｆｏ−ｆｃおよび２ｆｏ−ｆｃ差分マッ プを用いて、残りの誤りの位置をつきとめ、並んだ水分子を同定し、次いでパウ エル最小化および立体化学的に制限されたＢ因子細分化を行った。 現在のモデルのＲ因子は０．１９（１５〜１．９Å：Ｆ≧３σ）である。該モ デルは７９１４個の非水素原子を含み、６３０個の水の酸素原子および３個のカ ルシウム原子を含んでいる。本モデルは、理想結合長および結合角からのｒ．ｍ ．ｓ．偏差がそれぞれ０．０１２Åおよび１．３５”という、よい配置形状を示 している。φおよびψ角のラマチャンドロン・プロットは、残基１５０が許容領 域からかなりはずれたただ１つの非グリシン残基であることを示す。 B．licheniformis菌のα−アミラーゼは４８３個の残基を含む。現在のモデル では、２個のＮ末端残基および１個のＣ末端残基からなる最初の３個の残基が失 われている。また分子１の残基１８１〜１９５、および分子２の残基１８１〜１ ９３も失われている。本実験から導かれたデータを表１に与える。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:07） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ショー，アンドリュー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94304―1013 パロ アルト ペイジ ミ ル ロード 925 ジェネンコア インタ ーナショナル インコーポレーテッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ａドメイン、Ｃドメインおよびカルシウム結合部位を含むα−アミラーゼで あって、該カルシウム結合部位が、該Ａドメインおよび該Ｃドメインに関連し 、 該Ａドメインおよび／または該Ｃドメイン内のリガンド残基を含み、前記α− アミラーゼが、該カルシウム結合部位の特性を変性し、それによって、該α− アミラーゼの性能を変性するように修飾されていることを特徴とするα−アミ ラーゼ。 ２．前記α−アミラーゼに対する修飾が、該α−アミラーゼ内の一つ以上のアミ ノ酸残基を置換、付加または欠失する遺伝子修飾を含むことを特徴とする請求 の範囲第１項記載のα−アミラーゼ。 ３．前記α−アミラーゼがBacillusまたはその誘導体により産生されることを特 徴とする請求の範囲第２項記載のα−アミラーゼ。 ４．前記α−アミラーゼが、Bacillus licheniformis、Bacillus amyloliquefac iensまたはBacillus stearothermophilusもしくはそれらの誘導体により産生 さ れることを特徴とする請求の範囲第３項記載のα−アミラーゼ。 ５．前記遺伝子修飾が、Bacillus Iicheniformis内の位置290-309、339-347、40 2-411、426-436および／または472-477に相当する位置にあるアミノ酸残基の 置 換、付加または欠失を含むことを特徴とする請求の範囲第２項記載のα−アミ ラーゼ。 ６．前記遺伝子修飾が、Bacillus licheniformis内のQ291、Q298、G299、G301、 Y302、M304、L307、N309、Q340、F343、F403、H405、H406、D407、V409、G410 、 L427、1428、D430、G433、K436、N473、G474およびG475のうちの一つ以上での 置換を含むことを特徴とする請求の範囲第５項記載のα−アミラーゼ。 ７．請求の範囲第１項記載のα−アミラーゼを含む洗浄剤。 ８．請求の範囲第１項記載のα−アミラーゼを含むデンプン液化組成物。 ９．前記α−アミラーゼが、Bacillus licheniformis内のM15、V128、H133、W13 8、N188、A209および／またはM197に相当する一つ以上の残基の置換または欠 失 を含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載のα−アミラーゼ。 10．請求の範囲第１項記載のα−アミラーゼをデンプンの水溶液に加え、適切な 期間に亘り適切な条件下で保温し、該デンプンの水溶液を液化する各工程から なることを特徴とする方法。 11．請求の範囲第１項記載のα−アミラーゼをコード化するＤＮＡ。 12．請求の範囲第11項記載のＤＮＡが、該ＤＮＡを発現するのに用いられる発現 制限配列に操作可能に結合されていることを特徴とする発現ベクター。 13．請求の範囲第12項記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。 14．請求の範囲第11項記載のＤＮＡを宿主細胞中で発現および／または分泌する 方法。