MX2007016045A - Variantes de subtilasa. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con variantes novedosas de subtilasa que presentan mejorias en relacion con la subtilasa de origen en una o mas propiedades que incluyen: desempeno de lavado, estabilidad termica, estabilidad al almacenamiento o actividad catalitica. Las variantes de la invencion son adecuadas para uso, por ejemplo, en composiciones limpiadoras o detergentes tales como composiciones detergentes de lavanderia y composiciones para el lavado de trastes, que incluyen composiciones para lavatrastes automatico.

Description

CAMPO DE LA IEWENCIOM i La presente invención se relaciona con variantes de I subtilasa novedosas que presentan alteraciones en relación i con la subtilasa de origen en una o más propiedades que incluyen; desempeño en el lavado, estabilidad térmica, estabilidad al almacenamiento y actividad catalítica. Las I varfantes de la invención son adecuadas para uso, por ejemplo, en composiciones limpiadoras o detergentes tales como composiciones detergentes de lavandería y composiciones de ¡lavado para trastes, que incluyen composiciones para lavado automático de trates . La presente invención también se relaciona con secuencias aisladas de ADN que codifican para las | variantes, vectores de expresión, células hospedadoras y métodos para producir y utilizar las variantes de la I invención. Además, la presente invención se relaciona con i composiciones limpiadoras y detergentes que comprenden las variantes de la invención.

ANTECEDENTES DE L ?NVEMCIOKÍ j En la industria de los detergentes, las enzimas se han I implementado en las formulaciones de lavado desde hace i más ¡de 30 años. Las enzimas utilizadas en las formulaciones comprenden proteasas, lipasas, amilasas, celulasas así como I I REF„sl883 é otras enzimas o mezclas de las mismas. Comercialmente, las enzfmas más importantes son las proteasas. Un número cada vez mayor de proteasas utilizadas com^rcialmente son variantes de proteínas manipuladas o proteasas de tipo natural que se encuentran de modo natural, por ejemplo Reíase , Alcalase™, Savinase™, Primase101, Eveílase™, Esperase10*, Ovozyme™, Coronase*®, Polarzyme™ y Kannase™ (Novoxymes A/S) , Maxatase™, Maxacal™, Maxapem1®, Properase™, Purafect , Purafect OxP™, F?2MR, F?3™, F?4MR y Purafect Prime™ (Genencor International, Inc.), BLAP X y BLAP S (Henkel) . Además, muchas de las variantes de proteasas se han idescrito en la técnica. Una lista extensa de variantes de proteasa de la técnica anterior se proporciona en el documento WO 99/27082. I ?o obstante, aunque se han descrito una gran cantidad de variantes de proteasa útiles, aún existe la necesidad de proteasas o variantes de proteasas mejoradas i nuevas para numerosos usos industriales tales como lavandería o limpieza de superficie dura. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar variantes de subtilasa ¡ mejoradas para dichos propósitos.

SUMARIO DE LA I?VEMCIOKf De esta manera, en un primer aspecto, la presente invención se relaciona con una variante de subtilasa que comprende una o más de las modificaciones que se incluyen en la tabla 1. Tabla 1. Modificaciones en las variantes de subtilasa Las variantes que se incluyen en la tabla 1 pre$entan actividad de proteasa y cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de subtilisina BPNÍ que se muestra en la figura 1 y la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 En un asegundo aspecto la presente invención se relaciona con un polinucleótido aislado que codifica para una variante de subtilasa de la invención. En un tercer aspecto, la presente invención se relaciona con un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado de la invención. En un cuarto aspecto, la presente invención se relaciona con una célula hospedadora microbiana transformada con el vector de expresión de la invención. En un quinto aspecto, la presente invención se relaciona con un método para elaborar una variante de subtilasa de acuerdo con la invención en donde un hospedador de acuerdo con la invención se cultiva bajo condiciones que llevan a la expresión y secreción de la variante, y se recupera la variante. En un sexto aspecto, la presente invención se relaciona con una composición limpiadora o detergente, preferiblemente una composición de lavandería o para el lavado de trastes, que comprende la variante de la invención. Respecto a la alineación y numeración, se hace referencia a la figura 1 la cual muestra la alineación entre la ¡subtilisina BPN' (a) (BASBPN) y la subtilisina 309 (b) i (BLßAVI) . Esta alineación en esta solicitud de patente se i utiliza como referencia para la numeración de los residuos.

I BEFINICXOS3ES I i Antes de presentar esta invención con mayor ¡ detalle, se definirán primero los siguientes términos y I convencionalismos. Para una descripción detallada de la i nomenclatura de aminoácidos y ácidos nucleicos nos referimos al documento WO 00/71691 comenzando en la página 5, por lo que i se le incorpora como referencia. i NOMENCLATURA Y CONVENCIONALISMOS PARA LA DESIGNACIÓN DE ¡ VARIANTES ¡ Al describir las diversas variantes de enzima subtilasa producidas o contempladas de acuerdo con la invención se han adaptado para facilidad de referencia las siguientes nomenclaturas y convencionalismos: un marco de refeírencia se define primero por alineación de la enzima aisljada o de origen con subtilisina BP?1 (BASBP?) . ¡ La alineación se puede obtener por la rutina GAP de el ¡paquete GCG versión 9.1 para numerar las variantes utilizando los siguientes parámetros: castigo por generación ¡ de separación = 8 y castigo por extensión de separación = 8 y todos los demás parámetros se mantienen en sus valores implícitos . t Otro método es utilizar alineaciones reconocidas conocidas entre subtilasas tales como la alineación indicada en el documento WO 91/00345. En la mayor parte de los casos las diferencias no serán de importancia alguna. De esta manera muchas de las supresiones e inserciones se definirán en relación con BASBPN (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1) . En la figura 1, la subtilisina 309 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2) tiene 6 supresiones en ias posiciones 36, 58, 158, 162, 163 y 164 en comparación con BASBPN. Estas supresiones están en la figura 1 indicadas por' asterírscos (*) . Para una descripción detallada de la nomenclatura o modificaciones introducidas en un polipéptido por manipulación genética hacemos referencia al documento WO 00/71691 página 7-12, incorporado en la presente como referencia. Proteasas : Las enzimas que separan los enlaces amid,a en sustratos proteínicos se clasifican como proteasas o (de manera intercambiable) peptidasas (véase Walsh,. 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms . W.H. Freeman and Company, San Francisco, capítulo 3). I Numeración de las posiciones/residuos de aminoácidos : Si no se menciona ninguna otra cosa, la numeración de los aminoácidos utilizada en la presente corresponde a la de la secuencia de la subtilasa BPN1 (BASBPN) . Para una descripción adicional de la secuedncia BPN' véase la figura 1, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 o Siezen et akl . , Protein Engng. 4(1991) 719-737. f Serinas proteasas : Una serina proteasa es una enzima el cual cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos y en ila cual existe un residuo serina esencial en el sitio activo (White, Handler and Smith, 1973, "Principies of Biochemistry" , Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, pp. 271-272) . Las serinas proteasas bacterianas tienen pesos moleculares en el intervalo de 20,000 a 45,000 daltons. Son inhibidas por fluorofosfato de diisopropilo. Hidrolizan i esteres terminales simples y son de actividad similar a la quipiiotripsina eucariótica, también una seria proteasa. Un térijiino más estrecho, proteasa alcalina, cubre un subgrupo, que refleja el pH elevado óptimo para algunas de las serinas proteasas, de pH 9.0 a 11.0 (para una revisión véase Priest I (19^7) Bacteriológica! Rev. 41 711-753). Subtilasas : Un subgrupo de las serinas proteasas dencjminado tentativamente subtilasas ha sido propuesto por Siezien et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 y Siezen et al., Protein Science 6 (1997) 501-523. Se definen por análisis de homología de más de 170 secuencias de aminoácidos de serinas proteasas previamente denominadas como proteasas similares a subtilisina. Una subtilisina se define con frecuencia previamente como una serina proteasa producida por bacterias gramnepositivas u hongos y de acuerdo con Siezen et al . ahora es un subgrupo de las subtilasas. Se han identificado una amplia variedad de subtilasas y se ha determinado la secuencia de aminoácidos de muchas de las subtilasas. Para una descripción más detallada de dichas sublilasas y sus secuencias de aminoácidos se hace referencia I a Siezen et al., (1997).

I Un subgrupo de las subtilasas, I-SI o subtilisinas "verdaderas" comprende las subtilisinas "clásicas" tales como la subtilisina 168 (BSS168) , subtilisina BPN' , subtilisina Carlsberg (ALCALASE™, Novozymes A/S) y la subtilisina DY (BSSDY) . i 1 Siezen et al., (supra) reconocen un subgrupo adicional de subtilasas, I-S2 de subtilisinas altamente alcalinas. Se describen a las proteasas del subgrupo I-S2 como subtilisinas altamente alcalinas y comprenden enzimas tal s como PB92 (BAALKP) (MAXACAL™. Genencor International Inc.), subtilisina 309 (SAVINASE™, Novozymes A/S), subtilisina 147 (BLS147) (ESPERASE™, Novozymes A/S) y elastasa alcalina YaB (BSEYAB) . "SAVINASE™" Savinase™ es comercializada por i Novozymes A/S. Es la subtilisina 309 de B . lentus y difiere de BAALKP solo una posición (N87S) . SAVINASE™ tiene la secµencia de aminoácidos denominada b) en la figura 1 y en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 2. I Subtilasa de origen: El término "subtilasa de origen" describe una subtilasa definida de acuerdo con Siezen et al. (1991 y 1997). Para detalles adicionales véase la I descripción de "subtilasas" anteriores. Una subtilasa de origen también puede ser una subtilasa aislada de una fuente natural, en donde se han realizado modificaciones I subsecuentes mientras se retienen la característica de una subtilasa. Además, una subtilasa de origen puede ser una subtilasa la cual ha sido preparada por la técnica de trastocado de AD?, tal como se describe por J.E. ?ess et al., ?ature Biotechnology, 17, 893-896 (1999) . De manera alternativa, el término "subtilasa de origen" se puede denominar "subtilasa natural". Modificaciones de una variante de subtilasa: El i término "modificaciones" (en singular y en plural) se utiliza en la presente para definir la inclusión de modificaciones quírtiicas de una subtilasa así como la manipulación genética del ' ADN que codifica para una subtilasa. Una o varias de las modificaciones pueden ser sustituciones de una o varias de las cadenas laterales de aminoácidos, sustituciones, supresiones y/o inserciones dentro o en uno o varios de los aminoácidos de interés . Variante de subtilasa: En el contexto de esta invención, el término o variante de subtilasa o subtilasa mutada significa una subtilasa que se ha producido por un organismo el cual expresa un gen mutante derivado de un microorganismo de origen el cual posee un gen original o parental y el cual produce una enzima de origen correspondiente, el gen de origen ha sido mutado con el fin de producir el gen mutante a partir del cual se produce la proteasa subtilasa mutada cuando se expresa en un hospedador I adecuado . i Secuencias homologas de subtilasas: La homología entre dos secuencias de aminoácidos en este contexto se describe por el parámetro "identidad". Con el fin de determinar el grado de identidad entre dos subtilasas se puede aplicar la rutina GAP de paquete GCG versión 9.1 (infra) utilizando los mismos ajustes. El resultado de la rutina es además de la alineación de aminoácidos, el cálculo I del "porcentaje de identidad" entre las dos secuencias. En basé en esta descripción, es habitual para una persona experta en la técnica identificar subtilasas homologas adecuadas las cuales se pueden modificar de acuerdo con la invención. Polinucleótido aislado: Cuando se aplica a un polinucleótido, el término "aislado" indica que el polinucleótido ha sido extraído de su medio genético natural y p?r lo tanto está libre de otras secuencias codificantes extrañas o no deseadas y está en una forma adecuada para uso dentro de sistemas de producción de proteínas manipulados genéticamente. Dichas moléculas aisladas son aquellas que se separan de su ambiente natural e incluyen ADNc y clones genómicos . Las moléculas de ADN aisladas de la presente invención están libres de otros genes con los cuales habitualmente están asociados, pero pueden incluir en regiones no traducidas 5 ' y 3 ' que se encuentren de manera natural tales como promotores y terminadores . La identificación de las regiones asociadas será evidente para una persona habitualmente experta en la técnica (véase, por ejemplo, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78, 1985). De manera alt rnativa, el término "un polinucleótido aislado" se puede denominar como "un polinucleótido clonado" . i Proteína aislada: Cuando se aplica a una proteína, el germino "aislado" indica que la proteína se ha separado de su ambiente natural. En una forma preferida, la proteína aislada está sustancialmente libre de otras proteínas, particularmente otras proteínas homologas (es decir, "impurezas homologas" (véase adelante)). Una proteína aislada es más de 10% pura, de manera preferible más de 20% pura y de manera más preferible más de 30% pura, determinada por SDS-PAGE.. Además, se prefiere proporcionar a la proteína en forma altamente purificada, es decir, más de 40% pura, más de 60% pura, más de 80% pura, de manera más preferible más de 95% pura y de manera mucho más preferible más de 99% pura, det rminada por SDS-PAGE. El término "proteína aislada" de manera alternativa se puede denominar como "proteína purificada" . Impurezas homologas: El término "impurezas hom Ilogas" significa una impureza (por ejemplo otro polípéptido diferente a la subtilasa de la invención) , el cual se origina de una célula homologa a partir de la cual se obtuvo originalmente la subtilasa de la invención. Obtenido a partir de: El término "obtenido a partir de" co o se utiliza en la presente en relación con una fuente microbiana específica, significa que el polinucleótido y/o subtilasa ha sido producida por la fuente específica o por una célula en la cual se ha insertado un gen de la fuente.

, Sustrato: El término "sustrato" se utiliza en relación con un sustrato para una proteasa debe interpretarse en su forma más amplia que comprende un compuesto que contiene por lo menos un enlace peptídico (amida) susceptible de hidrólisis por una subtilisina proteasa. i Producto : El término "producto" utilizado a este respecto con un producto derivado de una reacción enzimática de proteasa, en el contexto de la presente invención, se debe interpretar que incluye los productos de una reacción de hidrólisis que incolucra una subtilasa proteasa. Un producto puede ser un sustrato en una reacción de hidrólisis subsecuente.

Desempeño de lavado : En el presente contexto, el término "desempeño de lavado" se utiliza como la capacidad de una enzima para eliminar manchas proteináceas u orgánicas pre$entes en el objeto que se va a limpiar durante, por ejemplo, el lavado o el limpiado de una superficie dura.

Véa$e también la prueba de desempeño de lavado en el ejemplo 3 e? la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURA i La figura 1 muestra una alineación entre subtilisina BPN' (a) y Savinase™ (b) utilizando la rutina GAP mencionada antes .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA IKFVEMCIOM La presente invención se relaciona con variantes de subtilasa novedosas que presentan alteraciones en relación con la subtilasa de origen en una o más propiedades que incluyen: desempeño de lavado, estabilidad térmica, estabilidad al almacenamiento o actividad catalítica. Las variantes, las cuales se contemplan como parte de la invención son variantes tales en donde, cuando se comparan con la subtilasa natural, se han modificado uno o más residuos aminoácidos por sustitución, supresión o inserción. Las variantes de la presente invención comprenden una o más de las modificaciones que se incluyen en la tabla 1.

Las variantes incluidas en la tabla 1 representan actividad de proteasa y cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN ' que se muestra en la figura 1 y la SECUENCIA DE IDNfcTIFICACIÓN NÚMERO: 1. Una variante de subtilasa del primer aspecto de la invención puede ser una subtilasa de origen o natural i identificada y aislada de la naturaleza. Dicha subtilasa natural de origen se puede cribar específicamente por técnicas estándar conocidas en el arte. Una maneras preferida de realizar esto puede ser al i amplificar por PCR de manera específica regiones de interés de ADN conservado a partir de subtilasas de numerosos microorganismos diferentes, preferiblemente diferentes cepas de $acillus . ! Las subtilasas son un grupo de enzimas conservadas, en él sentido de que su AD? y secuencias de aminoácidos son homologas. En consecuencia, es posible construir cebadores i relativamente específicos que flanqueen a las secuencias polinucleotídicas de interés. Utilizando dichos cebadores de PCR para amplificar AD? de numerosos microorganismos diferentes, preferiblemente diferentes cepas de Bacillus seguido por secuenciado de AD? de dichos fragmentos amplificados por PCR, será posible identificar cepas las cuales producen variantes de subtilasa de la invención. Habiendo identificado la cepa y una secuencia parcial de ADN de dicha subtilasa de interés, es un trabajo sistemático para una persona experta en la técnica completar la clonación, expresión y purificación de dicha i subtilasa. No obstante, se considera que una variante de subtilasa de la invención es predominantemente una variante de una subtilasa de origen. Una variante de subtilasa adecuada para uso descritos en la presente se puede construir por técnicas convencionales conocidas en el arte por ejemplo mutagénesis dirigida a sitio/aleatoria o por trastocado de ADN de secuencias de subtilasa diferente. Véase la sección de "materiales y métodos" y el ejemplo 1 en la presente (véase adelante) para detalles adicionales. ' Como lo reconocerá una persona experta en la técnica, las variantes que se describen en la presente pueden comprender una o más modificaciones adicionales, en particular una o más sustituciones o inserciones adicionales. Además, las variantes descritas en la presente pueden abarcar mutaciones en más de solo una posición. Por ejemplo, la variante de acuerdo con la invención puede contener mutaciones en una posición, dos posiciones, tres posiciones o más de tres posiciones, como por ejemplo cuatro a ocho posiciones. Se prefiere que la subtilasa de origen pertenezca a lps subgrupos I-SI o I-S2, especialmente al grupo I-S2, tanto para enzimas de la naturaleza o a partir de la creación artificial de diversidad, y para el diseño y producción de variantes a partir de una subtilasa de origen. En relación con las variantes del subgrupo I-SI, se prefiere seleccionar una subtilasa de origen del subgrupo que consiste de BSS168 (BSSAS, BSAPRJ, BSAPRN, BMSAMP) , BASBP?, i BSSÜY, BLSCAR (BLKERA, BLSCAl , BLSCA2 , BLSCA3 ) , BSSPRC y BSSPRD o variantes funcionales de los mismos que hayan retenido la característica del subgrupo I-Sl. ' En relación con las variantes del subgrupo I-S2, se prefiere seleccionar una subtilasa de origen a partir del grupo que consiste de BSAPRQ, BLS147 (BSAPRM, BAH101), BLSAVI (BSl(SMK, BAALKP, BLSUBL) , BYSYAB, BAPB92, TVTHER y BSAPRS O variantes funcionales de los mismos que hayan retenido la característica del subgrupo I-S2. En particular, la subtilasa de origen es BLSAVI (Savinase™, ?OVOZYMES A/S) y una variante I de subtilasa preferida de la invención en consecuencia es una variante de Savinase™. La presente invención también abarca cualquiera de i I las variantes de subtilasas mencionadas antes en combinación con cualquier otra modificación de la secuencia de aminoácidos de la misma. Se consideran en especial, combinaciones con otras modificaciones conocidas en la técnica para proporcionar propiedades mejoradas para la enzima. La técnica describe numerosas variantes de subtilasa con1 propiedades mejoradas diferentes y muchas de estas se mencionan en la sección de "antecedentes de la invención" en la presente (véase antes) . Estas referencias se describen aquí como referencias para identificar una variante de subtilasa la cual ventajosamente se puede combinar con una variante de subtilasa descrita en la presente. Dichas combinaciones comprenden las posiciones: 2222 (mejora la estabilidad a la oxidación) , 218 (mejora la estabilidad térmica) , sustituciones en los sitios que unen Ca2+ que est bilizan la enzima, por ejemplo la posición 76 y muchas otras evidentes de la técnica anterior. ' En modalidades adicionales una variante de subtilasa descrita en la presente ventajosamente se puede combinar con una o más modificaciones en cualquiera de las posiciones: ¡ 27, 36, 56, 76, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 120, 123, 159, 167, 170, 206, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 y 274. Específicamente, se consideran apropiadas para combinación las siguientes modificaciones: BLSAVI, BLSUBL, I BSKSMK y BAALKP: K27R, *36D, S56P, N62D, V68A, N76D, S87N, G97N, S99SE, S101G, S103A, V104A, V104I, V104N, V104Y, S106A, H120D, H120N, ?123S, G159D, Y167A, R170S, R170L, A194P, ?2?4ü, V205I, Q206E, L217D, ?218S, ?218D, M222S, M222A, T224S, A232V, K235L, Q236H, Q245R, N248D, N252K y T274A. De manera adicional, presentan propieades mejoradas cualquiera de las modificaciones S101G+V104N, S87Ñ+S10G+V104N, K27R+V104Y+N123S+T274A, N76D+S103A+V104I, S99D+S101R+S103A+V104I+G1603, SET+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+V199M+V205I+L217D, S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+A194P+V199M+V205I+L217D, S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+V205I o N76D+V104A u t otras combinaciones de las modificaciones K27R, *36D, S56P, N62¿, V68A, N76D, S87N, G97N, S99SE, S101G, S103A, V104A, t V104I, V104N, V104Y, S106A, H120D, H120N, N123S , G159D, Y167A, R170S, R170L, A194P, ?204D, V205I, Q206E, L217D, ?218S, n218d, M222S, M222A, T224S, A232V, K235L, Q236H, Q245R, ?248D, ?252K y T274A en combinación con cualquier otra de una o más de las modificaciones mencionadas antes. Una variante interesante particular es una variante la cual, además de las modificaciones de acuerdo con la invención, contiene las siguientes sustituciones: S101G+S103A+V104I+G159D+A232V+Q236H+Q245R+?248D+?252K. Las variantes de subtilasa de uno o varios de los aspectos principales de la invención preferiblemente se combinan con una o más modificaciones en cualquiera de las posiciones 129, 131 y 194 preferiblemente como modificaciones i 129K, 131A y 194P y de manera más preferible como modificaciones P129K, P131H y A194P. Se espera que cualquiera de éstas modificaciones proporcione un nivel de expresión más alto de la variante de subtilasa en la producción de la misma. El desempeño de lavado de una variante seleccionada de la invención se puede probar en la prueba de desempeño de lavado descrita en el ejemplo 3 en este documento. La prueba i de desempeño de lavado se puede utilizar para determinar la capacidad de una variante, cuando se incorpora en una composición detergente estándar o comercial, para eliminar manchas proteináceas de un material textil estándar en combinación con un sistema de referencia, específicamente la subtilasa de origen o una subtilasa similar que presente un desempeño de lavado incluso mejor (incorporado en el mismo sistema detergente y probado bajo condiciones idénticas) . Las variantes de enzima de la presente solicitud se prueban utilizando el análisis de tensión mecánica automático (AMSA) . Con la prueba AMSA se puede examinar rápidamente el desempeño de lavado de una gran cantidad de volúmenes pequeños de soluciones de enzima-detergente. Utilizando esta prueba, se puede investigar inicialmente el desempeño de lavado de una variante seleccionada, el razonamiento es que si ' una variante seleccionada no muestra una mejoría sig?ificativa en la prueba en comparación con la subtilasa de origen, normalmente no es necesario llevar a cabo experimentos de prueba adicionales.

Por lo tanto, las variantes las cuales son particularmente interesantes para los propósitos descritos en la presente, son dichas variantes las cuales, cuando se prueban en una composición detrergente comercial tal como detergente de tipo US, uno tipo Asiático, uno tipo Europeo o un detergente de tipo Latinoamericano como se describe en la prueba de desempeño de lavado (ejemplo 3) , muestra un desempeño mejorado en comparación con la subtilasa de origen probada bajo condiciones idénticas. La mejoría en el desempeño de lavado se puede cuantificar al calcular el denominado valor de intensidad (Int) definido en el ejemplo 3, en este documento. ¡ Es evidente que se prefiere que la variante de la invención satisfaga los criterios anteriores en por lo menos el nivel más bajo establecido, de manera más preferible en el nivel más alto establecido.

ELABORACIÓN DE UNA VARIANTE DE SUBTILASA Se conocen bien en la técnica muchos métodos para clonar una subtilasa y para introducir sustituciones, supresiones o inserciones en genes (por ejemplo genes para subtilasa) . En general se pueden utilizar procedimientos estándar o convencionales para la clonación de genes e introducción de mutaciones (aleatoria y/o dirigida a sitio) dentro de dichos genes con el fin de obtener una variante de subtilasa de la invención. Para una descripción adicional de las técnicas adecuadas se hace referencia al ejemplo 1 en la presente (véase más adelante) y (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (EDS.) "Cuírrent protocols in Molecular Biology" . John Wiley and SonS, 1995; Harwood, C. R. , and Cutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus ", John Wiley and i Sons, 1990) así como la WO 96/34946. Además se puede construir una variante de subtilasa por i técnicas estándar para creación artificial de diversidad, por ejemplo mediante trastocado de ADN de diferentes genes de subtilasa (WO 95/22625; Stemmer WPC, Nature 370:389-91 (1994) ) . El trastocado de ADN de, por ejemplo, el gen que codifica para Savinase™ con una o más secuencias parciales de subtilasa identificados en la naturaleza posteriormente serán crivadas para variantes mejoradas de funcionamiento de lavado lo que proporciona variantes de subtilasa adecuadas para el propósito jue se describe en la presente.

VECTORES DE EXPRESIÓN Un vector de expresión recombinante que comprende una construcción de ADN que codifica para la enzima de la invención puede ser cualquier vector que convenientemente se pueda someter a procedimientos de ADN recombinante. La selección del vector con frecuencia dependerá de la célula hosbedadora en la cual se va a introducir. De esta manera, el vector puede ser un vector que se replique de manera autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido. De manera alternativa, el vector puede ser uno que cuando se introduce en una célula hospedadora se integre en I el genoma de la célula hospedadora en parte o en su totalidad y se replique junto con uno o más de los cromosomas en los cuales se ha integrado. El vector preferiblemente es un vector de expresión en el cual la secuencia de ADN que codifica para la enzima de la invención se une operablemente a segmentos adicionales necesarios para transcripción del ADN. En general, el vector de expresión se deriva de ADN plasmídico o viral o puede contener elementos de los dos. El término "unido operablemente" indica que los segmentos se distribuyen de manera que funcionen de manera concertada para el propósito que, se desea, por ejemplo la transcripción se inicia en un proínotor y avanza a través de la secuencia de ADN que codifica para la enzima. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad trancripcional en la célula hospedadora de ^elección y se puede derivar de genes que codifiquen para proteínas homologas o heterDlogas a la célula hospedadora. El ejemplo de promotores adecuados para uso en células hospedadoras bacterianas incluye el promotor del gen para amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophillus , el i gen ¡para a-amilasa de Baci. lus licheniformis, el gen para a-amilasa de Bacillus amiloliquefaciens, el gen para proteasa alcalina de Bacillus subti lis o el gen para xilosidasa de Bacíllus pumilus o los promotores de fago ? PR o PL o los i proi?otores lac, trp o tac de E. coli . La secuencia de ADN que codifica para la enzima de la invención si es necesario también puede estar conectada operablemente a un terminador adecuado . ! El vector recombinante de la invención puede comprender además una secuencia de ADN que habilite al vector para replicarse en la célula hospedadora en cuestión. El vector también puede comprender un marcador seleccionable, por ejemplo el gen cuyo producto complementa un defecto en la célula hospedadora o un gen que codifique para resistencia, por ejemplo, a antibióticos como kanamicina, cloramfenicol, eritromicina, tetraciclina, espectinomicina o similares o resistencia a metales pesados o herbicidas. ¡ 1 Para dirigir una enzima de la presente invención en una vía secretora de las células hospedadoras se puede proporcionar en el vector recombinante una secuencia de señal secretora (también conocida como una secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre) . La secuencia de la señal secretora se une a la secuencia de ADN que codifica para la enzima en el marco de lectura correcto. Las secuencias de señal secretora comúnmente se colocan 5 ' respecto a la secuencia de ADN que codifica para la enzima. La secuencia de señal secretora puede ser aquella que normalmente se i relaciona con la enzima o puede ser de un gen que codifique para otra proteína secretada. Los procedimientos utilizados para ligar las secuencias de ADN que codifican para la presente enzima, el proiotor y opcionalmente el terminador y/o la secuencia de señal secretora, respectivamente o para ensamblar estas secµencias por esquemas de amplificación por PCR adecuados e insertarlos en los vectores adecuados que contienen la infirmación necesaria para replicación o integración son bien conocidos por las personas expertas en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al . , op . ci t . ) . I CÉLULA HOSPEDADORA La secuencia de ADN que codifica para la presente enzima introducida en la célula hospedadora puede ser homologa o heteróloga al hospedador en cuestión. Si es homologa a la célula hospedadora, se puede producir por la célula hospedadora en la naturaleza, y típicamente se conectará operablemente a otra secuencia promotora o si es aplicable, a otra secuencia de señal secretora y/o secuencia terilninadora diferente a la de su ambiente natural. Se pretende que el término "homólogo" incluye una secuencia de ADN que codifica para una enzima natural para el organismo hospedador en cuestión. Se pretende que el término "heterólogo" incluye una secuencia de AD? que no se expresa por la célula hospedadora en la naturaleza. De esta manera, la Secuencia de AD? puede ser de otro organismo o puede ser una 'secuencia sintética. La célula hospedadora en la cual se introduce la construcción de ADN o el vector recombinante de la invención pue?e ser cualquier célula que sea capaz de producir la presente enzima e incluye bacterias, lavadoras, hongos y células eucarióticas superiores que incluyen plantas. ¡ Los ejemplos de células hospedadoras bacterianas las ' cuales, cuando se cultiva, son capaces de producir la enzima de la invención son bacterias grampositivas tales como las cepas de Bacill us, tales como las cepas de B . subtilis, B . licheniformis, B. lentus, B . brevis, B. stearothermophil us , B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B . megaterium o B. thi?ingiensis o cepas de Streptomyces, tales S. lividans o S. murinus tales como como bacterias gramnegativas tales como Escherichia coli .

La transformación de la bacteria se puede llevar a cabo por transformación por protoplastos, electroporación, conjugación o mediante el uso de células competentes de una manera conocida por si misma (véase Sambrook et al., supra) . Cuando se expresa la enzima en bacterias tales como E. coli , la enzima puede ser retenida en el citoplasma, típicamente como granulos insolubles (conocidos como cuerpos de inclusión) o se puede dirigir al espacio periplásmico por una' secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células se lisan y los granulos se recuperan y desnaturalizan después de lo cual se renaturaliza la enzima al diluir el agente densaturalizante. En el último caso, la enzima se puede recuperar del espacio periplásmico al romper las células, por ejemplo por sonicación o choque osmótico para liberar el contenido del espacio periplásmico y recuperar la enzima. Cuando se expresa la enzima en bacterias grampositivas tales como las cepas Bacillus o Streptomyces , la enzima puede ser retenida en el citoplasma o se puede dirigir al medio celular por una secuencia de secreción bacteriana. En este último caso se puede recuperar la enzima del medio como se describe en lo siguiente. ¡ MÉTODO PARA PRODUCIR UNA VARIANTE DE SUBTILASA La presente invención proporciona un método para elaborar una enzima aislada de acuerdo con la invención en donde se cultiva una célula hospedadora adecuada, la cual ha sidp transformada con una secuencia de ADN que codifica para la enzima, bajo condiciones que permiten la producción de la enzima y se recupera del cultivo la enzima resultante. Cuando se transforma un vector de expresión que comprende la secuencia de ADN que codifica para le enzima en una célula hospedadora heteróloga, es posible permitir la producción recombinante heteróloga de la enzima de la invención. De esta manera, es posible elaborar una composición de subtilasa altamente purificada, caracterizada por estar libre de impurezas homologas. El medio utilizado para cultivar las células hospedadoras transformadas puede ser cualquier medio convencional adecuado para el crecimiento de las células hosjbedadoras en cuestión. La subtilasa expresada convenientemente se puede secretar al medio de cultivo y se puede recuperar del mismo por procedimientos bien conocidos que incluyen separación de las células del medio por centrifugación o filtración, precipitación de componentes proteináceos del medio mediante una sal tal como sulfato de amo io, seguido por procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o similares.

APL^C CSONES DETERGENTES i La enzima de la invención se puede agregar y por lo tanto se puede volver un componente de una composición detergente. La composición detergente de la invención se puede formular, por ejemplo, como una composición detergente i para lavado a mano o en máquina que incluye una composición I aditiva de lavandería adecuada para el tratamiento previo de las ¡ telas manchadas y una composición suavizante de telas formular como una operaciones caseras duras o se puede trastes tanto manual comoi en maquina. I i En un aspecto específico, la invención proporciona un i aditivo detergente que comprende la enzima de la invención. El aditivo detergente así como la composición detergente puede comprender una o más enzimas adicionales I tales como una proteasa, una lipasa, una cutinasa, una ami^asa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectilasa, una i mananasa, una arabinasa, una galactanaea, una xilanasa, una oxidasa, por ejemplo una lacasa y/o una peroxidasa. ¡ En general, las propiedades de una o varias de las enzimas seleccionadas pueden ser compatibles con el detergente seleccionado (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc) , y una o varias de las enzimas deben estar presentes en cantidades eficaces . Proteasas : Las proteasas adecuadas incluyen aquéllas de origen animal, vegetal o microbiano. Preferntemente las de origen microbiano. Se incluyen mutantes modificados únicamente o manipulados por proteínas. La proteasa puede ser una serina proteasa o una metaloproteasa, preferiblemente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa similar a tripsina. Los ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas, especialmente aquellas derivadas de Bacill us, por ejemplo subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en el documento WO 89/06279). Los ejemplos de protieasas similares a tripsina son tripsina (por ejemplo de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrita en los documentos WO 89/06270 y WO 94/25583. i Los ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en los documentos WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 y WO 98/34946, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 68, 76, 87, 97, 101, 104, 106, 120, 123, 167, 170, 194, ! 206, 218, 222, 224, 232, 235, 245, 252 y 274. Las enzimas de proteasa utilizadas • comercialmente preferidas incluyen Reíase™, Alcalase™, Savinase™, Primase™, Everlase™, Esperase™, Ovozyme™, Coronase™, Polarzyme™ y Kannase™ (Novozymes A/S) , Maxatase™, Maxacal™, Maxapem™, Properase™, Purafect™, Purafect OxP™, FN2™, FN3™, FN4™ y Purafect Prime™ (Genencor International, Inc.), BLAP X y BLAP S (Henkel) . Lipasas : Las lipasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o micótico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o manipulados por proteínas. Los ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (siiíómino, Thermomyces) , por ejemplo H. lanuginosa) , como se describe en EP 258 068 y EP 305 216 o a partir de H. ins?lens, como se describe en WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, por ejemplo P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp . cepa SD 705 (WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), una lipasa de Bacillus, por ejemplo B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-+360), B . Stearothermophilus (JP 64/744992) o B. pumilus (WO 91/16422). Otros ejemplos son variantes de lipasa tales como los descritos en los documentos WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407225, EP 260105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y ¡WO 97/07202. Las enzimas de lipasa utilizadas comercialmente preferidas incluye Lipolase™, Lipolase Ultra™ y Lipex™ (Novozymes A/S) .

Amilasas: Las amilasa adecuadas (a y/o ß) incluyen aquéllas de origen bacteriano o micótico. Se incluyen imitantes modificados químicamente o manipulados por proteínas. Las amilasas incluyen, por ejemplo, a-amilasas, obtenidas de Bacillus, por ejemplo una cepa especial de B . licheniformis descrita con mayor detalle en el documento GB 1,236,339. Los ejemplos de amilasas útiles son variantes descritas en los documentos WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 y 444. Las amilasas utilizadas comercialmente sin Duramyl™, Termamyl™, Stainzyme™, Fungamyl™ y BAN™ (?ovozy es A/S), Rapidase™, Purastar™ y Purastar OxAm™ (de Genencor International Inc.). Celulasas: Las celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o micótico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o manipulados por proteínas . Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo las células micóticas producidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en los documentos US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 y WO 89/09259. Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que tienen precaución para el color y beneficios de mantenimiento de blancura. Los ejemplos de dichas celulasas son las celulasas descritas en los documentos EP 0 495 257, i EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos de variantes de celulasa son los que se describen en los documentos WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US i 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00299. Las celulasas utilizadas comercialmente incluyen Renozyme™, Cellyzyme™ y Carezyme™ (Novozymes A/S) , Clazinase™, y Pudarax HA™ {Genencor Int. Inc.) y KAC-500(B)™ (Kao Corporation) . Peroxisadas/oxidasas : Las peroxidass/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen vegetal, bacteriano o micótico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o manipulados por proteínas. Los ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, por ejemplo de C. cirzereus y variantes de los mismos, tales como aquellos descritos en WO 93/24618, WO 95/10602 y WO 98/15257. Las peroxidasas utilizadas comercialmente incluyen Guardzyme™ (Novozymes AI S ) . Hemicelulasas : Las hemicelulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o micótico. Se incluyen los mutaintes modificados químicamente o manipulados por proteínas. Las hemicelulasas adecuadas incluyen mananasa, liquenasa, xilanasa, arabinasa, galactanasa acetilxilanoesterasa, glucuronidasa, ácido ferúlico esterasa, ácido cumárico esterasa y arabinofuranosidasa como se describen en el documento WO 95/35362. Las mananasas adecuadas se describen en WO 99/64619. Se pueden incluir en la composición detergente una o más enzimas detergentes al agregar aditivos separados que I contengan una o más enzimas o al agregar un aditivo combinado que comprende la totalidad de estas enzimas. Se puede formular un aditivo detergente de la invención, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, por ejemplo, un granulado, un líquido, una suspensión, etc. Las formulaciones aditivas detergentes preferidas son granulados, en particular granulados que no generan polvo fino, líquidos, en particular líqqidos estabilizados o suspensiones. Los granulados que no producen polvo fino se pueden producir, por ejemplo, como se describe en los documentos US 4,106,991 y 4,661,452 y opcionalmente se pueden recubrir por métodos conocidos en la técnica. Los ejemplos de materiales de recubrimiento cerosos son productos de poli (óxido de I etileno) , polietilenglicol, PEG) con pesos molares medios de 1,000 a 20,000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los ,cuales el alcohol contiene de 2 a 20 átomos de carbono y en los cuales existen 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos y monoglicéridos y diglicéridos y triglicéridos de ácidos grasos. Los ejemplos de materiales de recubrimiento formadores de película adecuados para aplicación por técnicas del lecho fluido se proporcionan en el documento GB 1483591. Las preparaciones de enzima líquida se pueden estabilizar, por ejemplo, al agregar un poliol tal como propilenglicol, una azúcar o un alcohol de azú ar, ácido láctico o ácido bórico de acuerdo con métodos establecidos. Las enzimas protegidas se pueden preparar de acuerdo con el método que se describe en el documento EP 238,216. La composición detergente de la invención puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo, una barra, un Comprimido, un polvo, un granulo, una pasta, un gel o un I líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, que típicamente contiene hasta 70% de agua y 0-30% de solvente orgánico, o no acuoso. La composición detergente comprende uno o más tensioactivos los cuales pueden ser no iónicos que incluyen semipolares y/o aniónicos y/o catiónicos y/o switeriónicos. Típicamente, los tensioactivos están presentes en una concentración desde 0.1% hasta 60% en peso. Cuando se incluyen en la presente, el detergente habitualmente contendrá desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 40% de un tensioactivo aniónico tal como sulfonato de alquilbenceno lineal, sulfonato de a-olefina, sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso) , etoxisulfato de alcohol, alcanosulfonato secundario, éster metílico de áci<jlo graso a-sulfo, ácido alquilsuccínico o alquenilsuccínico o jabón. i Cuando se incluye en la presente, el detergente habitualmente contendrá desde aproximadamente 0.2% hasta aprpxima amente 40% de un tensioactivo no iónico tal como un etoxilado de alcohol, etoxilado de nonilfenol, alqüilpoliglucósido, óxido de alquildimetilamina, monóetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, amida de ácido graso de polihidroxialquilo o derivado de N-acilo y N-alquilo de glucosamina ("glucamida"). El detergente puede contener 0-65% de un mejorador de detergente para detergente o un agente formador de complejo tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilo triacético, ácido etilendiaminotetraacético, ácido diebilentriaminopentaacético, ácido alquilsuccínico o I alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (por ejemplo SKS-6 de Hoechst) . El detergente puede comprender uno o más polímeros.

Los ejemplos son carboximetilcelulosa, t poli (vinilpirrolidona) , poli (etilenglicol) , poli (alcohol vinílico), poli (N-óxido de vinilpiridina), poli1 (vinilimidazol) , policarboxilatos tales como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico y copólímeros de metacrilato de laurilo/ácido acrílico. El detergente puede contener un sistema blanqueador el cual puede comprender una fuente de H202 tal como un perborato o percarbonato el cual se puede combinar con un activador de blanqueador formador de perácido tal como tetraacetiletilendiamina u oxibencensulfonato de nonanoilo. De manera alternativa el sistema blanqueador puede comprender peroxiácido por ejemplo del tipo amida, imida o sulfona. i 1 Una o varias de las enzimas de la composición detergente de la invención se pueden estabilizar utilizando agentes estabilizantes convencionales, por ejemplo un poliol tal' como propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico o un derivado de ácido bórico, por ejemplo un éster de borato aromático o un derivado de ácido fenilborónico tal como ácido 4-for ilborónico y la composición se puede formular como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 92/19709 y WO 92/19708. I i ' El detergente también puede contener otros ingredientes detergentes convencionales tales como, por ejemplo, acondicionadores de telas que incluyen arcillas, refuerzos de espuma, supresores de lodos, agentes anticorrosivos, agentes para suspender la mugre, agentes que evitan la redeposición de mugre, colorantes, bactericidas, abrillantadores ópticos, hidrotrópos, inhibidores de óxido o perfumes . Actualmente se contempla que en las composiciones detergentes se pueda agregar cualquier enzima, en particular la enzima de la invención en una cantidad que corresponde a 0.0^.-100 mg de la proteína de enzima por litro de licor de I lavado, preferiblemente 0.05-5 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado, en particular 0.1-1 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado. i Las variaciones de las condiciones locales y regionales tales como dureza de agua y temperatura de lavado se adaptan a las composiciones detergentes regionales. Los ejemplos 1 y 2 de detergentes proporcionan intervalos para la composición de un detergente típico para Latinoamérica y un detergente en polvo típico para Europa, respectivamente.

Ejemplo de Detergente 1. Composición detergente típica para América Latina Ejemplo de Detergente 2. Composición detergente en polvo típica para Europa OTRAS APLICACIONES Las variantes de subtilasa de la presente invención se pueden utilizar en el procesamiento de alimentos, especialmente en el campo de productos lácteos tales como leche, crema y queso, pero también en el procesamiento de carrte y vegetales. Las variantes de subtilasa de la presente invención también se pueden utilizar para el procesamiento de pienso para ganado, aves de corral y cerdos y especialmente para alimento para mascotas. Además, las variantes de subtilasa de la invención se pueden utilizar para el tratamiento de pieles. Las variantes de subtilasa de la invención también se pueden utilizar en procedimientos para descontaminar instrumentos, superficies y otros materiales en hospitales, clínicas y plantas de procesamiento de carne, etc», con el fin de descomponer priones u otros agentes infecciosos .

MATERIALES Y MÉTODOS Métodos para producir una variante d© proteasa La presente invención proporciona un método para producir una enzima aislada de acuerdo con la invención en donde una célula hospedadora adecuada, la cual ha sido transformada con una secuencia de ADN <que codifica para la enzima se cultiva bajo condiciones que permiten la producción de la enzima y la enzima resultante se recupera del cultivo. Cuando un vector de expresión que comprende una secuencia de AD? que codifica para la enzima se transforma en una célula hospedadora heteróloga, es posible habilitar la producción recombinante heteróloga de la enzima de la invención. De esta manera, es posible elaborar una composición de RP-II proteasa altamente purificada, I caracterizada por estar libre de impurezas homologas. El medio utilizado para cultivar las células hospedadoras transformadas puede ser cualquier medio convencional adecuado para el crecimiento de las células hospedadoras en cuestión. La variante de subtilasa expresada se 'puede secretar convenientemente en el medio de cultivo y I se puede recuperar del mismo por procedimientos bien conocidos que incluyen separación de las células del medio como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afip-idad o similar. í Actividad Proteol tica La actividad de la enzima se puede medir utilizando un ¡ análisis de PNA utilizando succinil-alanina-alanina-proJLina-ácido glutámico-paranitroanilina como un sustrato. El principio del análisis PNA se describe en Journal of American Oil¡ ! Chemists Society, Rothgeb, T.M., Goodlander, B.D., i Garrison, P.H., and Smith, L.A., (1988). el^s j Se obtienen piezas textiles estándar de EMPA St.

Gallen Lerchfeldstrasse 5, CH-9014 St. Gallen, Suiza o de CFTJ Center For Testmaterials, Vlaardingen, Países Bajos. Son ¡ especialmente importantes EMPA 116 (tela de algodón manchada con¡ sangre, leche y tinta) , EMPA 117 (tela de poliéster/algodón manchada con sangre, leche y tinta) , C-03 (tela de algodón manchada con chocolate, leche y hollín), C-05 ¡(tela de algodón manchada con sangre, leche y tinta) y C-10 (tela de algodón manchada con leche, aceite y pigmento) .

Condiciones de lavado *°dH: ajustado al agregar CaCl2*2H20, MgCl2*6H20 y NaHC03 a agua Milli-Q i Detergentes Las enzimas de la invención se pueden probar en formulaciones detergentes descritas en el doc mento WO 97/07202 o en los ejemplos detergentes anteriores. Además, se pueden realizar pruebas en formulaciones detergentes adquiridas de wfk testgewebe GmbH (Alemania) o un proveedor similar o en detergentes comerciales. Lista de detergentes de prueba de wfk testgewebe I ° IEC 60456 detergente de base tipo A* ° IEC 60456 detergente de base tipo B ° IEC 60456 detergente tipo C ° Detergente de referencia ECE con fosfato (19^7) o Detergente de referencia ECE sin fosfato (1908) ° Detergente estándar AHAM EU ECOLABEL (detergentes) detergente de uso ligero EU ECOLABEL (detergentes) PVP No obstante, también se puede utilizar en el análisis de lavado uno de los siguientes detergentes i comerciales, por ejemplo Ariel HDP, P&G, México; Orno Multi Acao HDP, Unilever Brazil; Breeze HDP, Unilever, Tailandia; Diao Pal, Nice, China; Tide HDL, P&G, Estados Unidos, Wisk HDL, Unilever, Estados Unidos; TOP HDP, Lion, Japón, Attack HDP, Kao, Japón; Ariel Regular HDP, P&G, Europa; Ariel Compact HDPC, P&G, Europa; Persil Megaperls, Henkel, Alemania y Persil, Unilever Reino Unido. 1 Además, también se puede utilizar una extensión de marca o una versión de color/compacta del detergente especificado en lo anterior. Si el detergente contiene enzimas, el detergente debe ser inactivado antes de su uso con el fin de eliminar la actividad de enzima presente de antemano en el detergente. Esto se realiza al i cal entar una soluc i ón concentrada de detergente a 85 °C durante 5 minutos en un horno de microondas . La concentraci ón de la s oluci ón concentrada de detergente que se va a inact ivar en el horno de mi croondas es de 4 - 20 g / l .

Análisie de Tensión ¡Mecánica Automático '' El análisis de tensión mecánico automático (AMSA) se describe en el ej emplo 3 a continuación.

Análisis de Mi ni lavado ; El análisis de funcionamiento de lavado a escala de mililitros se lleva a cabo baj o las siguientes condiciones : ' Después de lavar la pieza de tela se enjuaga en i agua corriente y se seca al aire y la remisión (R) del material de prueba se mide a 460 nm utilizando un espectrofotómetro Zeiss MCS 1521 VIS. Las mediciones se realizan de acuerdo con el protocolo del fabricante. El funcionamiento de las variantes nuevas se compara con el funcionamiento de Savinase al calcular el desempeño relativo : RP = (Rvariante ~ RßLACo) / (^SAVI?ASE ~ RBLA?CO) - Se considera una variante que presenta un desempeño de lavado mejorado, si funciona mejor que la referencia en por¡ lo menos una composición detergente. 1 CONSTRUCCIÓN DE EXPRESIÓN DE VARIANTES DE ENZIMA: MUT&GENESIS DIRIGIDA A SITIO Las variantes dirigidas a sitio de subtilisina 309 (Savinase™) de la invención comprenden inserciones/supresiores/sustituciones específicas que se elaboran por clonación adicional de fragmentos de ADN (Saambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición., Col Spring Harbor, 1989) producido por PCR con oligonucleótidos que contienen las mutaciones deseadas. Brevemente, se utiliza como plantilla en la reacción de PCR ADN plasmídico pSX222 (vector lanzadera de E. coliB. subtilis que incluye un marcador de selección apropiado, orígenes de replicación para Bacillus y E. coli , sitios de digestión, etc., descritos en WO 96/34946) que presentan la subtilisina 309 wt o un gen para una variante de subtilisina 309. En una primera PCR se utiliza un oligonucleótido que contiene la mutación deseada (antisentido) y oligonucleótido opuesto adecuado (directo) .

El fragmento de AD? resultante se utiliza como un oligonucleótido directo en una segunda PCR junto con un oligonucleótido antisentido adecuado. El fragmento de AD? resultante se digiere con enzimas de restricción adecuadas y se liga en un vector lanzadera adecuado de E. coli I Bacillus (por ejemplo pSX222) digerido con las mismas enzimas. El producto de ligación se transforma en E. coli competente y se siembra en placas sobre un agar sólido que contiene el marcador de selección apropiado. El ADN purificado de una colonia única se secuencia para confirmar la mutación designada. El AD? plasmídico se aisla de células de E. coli que tienen plásmidos que contienen genes para subtilisina 309 con la mutación designada y se transforman en una cepa de B. subtilis competente adecuado, por ejemplo B. subtilis DN1885: descrita en WO 01/16285 (por ejemplo, como se describe por Dubnau et al., 1971, J. Mol. Biol. 56, pp. 209+221) y se siembran en placas sobre un agar sólido que contiene un marcador de selección apropiado. El ADN plasmídico de las colonias solas de Bacillus que muestran actividad de proteasa se aislan y secuencían para confirmar la mutación designada. Las colonias de Bacillus que presentan el ADN plasmídico que incluye los genes para subtilisina 39 con las mutaciones deseadas se ferfnentan en matraces de agitación con deflectores en ün medio adecuado.

EJEMPLO 2 PURIFICACIÓN Y EVALUACIÓN Dü LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMA Después de la purificación por fermentación de variantes de subtilisina se lleva a cabo utilizando cromatografía de inducción de carga hidrofóbica (HCIC) y filtración al vacío subsecuente. Para retener la enzima, HCIC utiliza una matriz de celulosa a la cual se une 4-mercaptoetilpiridina (4-MEP) . Las esferas de la matriz de celulosa con tamaño de 80-100 µm se mezclan con un medio que contiene extractos de levadura y la B . subtilis transformada capaz de secretar las variantes de subtilisina y se incuba a pH 9.5 en microplacas Unifilter™. Dado que 4-MEP es hidrofóbico a pH > 7 y las variantes de subtilisina son hidrofóbicas a pH 9.5 se realiza una asociación hidrofóbica entre la enzima secretada y 4-MEP en ¡las esferas. Después de incubación, el medio y los residuos celulares se separan por filtración al vacío mientras las esferas y la enzima se mantienen en el filtro. Para eluir la enzima de las esferas el pH ahora se disminuye al lavar el filtro con un amortiguador de elución (pH 5) . De esta manera las enzimas se separan de las esferas y se pueden recuperar del amortiguador. i La concentración de las variantes de enzima subtilisina purificadas se determinan por titulación de sitio activo (AST) . La enzima purificada se incuba con un inhibidor de alta afinidad CI-2A a concentraciones diferentes para inhibir una cantidad variable de los sitios activos. La proteasa y el inhibidor se unen entre si en un inhibidor 1:1 y en consecuencia la concentración de la enzima se puede relacionar directamente con la concentración de inhibidor, a la ual toda la proteasa es inactiva. Para medir la actividad 1 de proteasa residual se agrega un sustrato (Suc-Ala-Ala. Pro- Phe+pNA 0.6 mM en amortiguador Tris/HCl) después de incubación con inhibidor y durante los siguientes 4 minutos se ' mide periódicamente el desarrollo del producto de degradación pNA (paranitrofenol) a 405 nm en un lector ELISA. Cada una de las variantes de la invención se incluyen en la tabla 1 en la presente y se purifica de acuerdo con el procedimiento anterior y posteriormente se determina la concentración de la enzima. Las concentraciones conocidas de las variantes de la tabla 1 se prueban para determinar el funcionamiento de lavado en detergente como se describe en lo siguiente. t EJEMPLO 3 DESEMPENO DE LAVADO DE LA COMPOSICIÓN DETERGENTE QUE COMPRENDE VARIANTES DE SUBTILASA ¡ Las variantes de enzima de la presente solicitud se prueba utilizando el análisis de tensión mecánica automáticos (AMSA) . Con la prueba AMSA se puede examinar el desempeño de lavado de una gran cantidad de soluciones de enzima-detergente de volumen pequeño. La placa AMSA tiene un número de ranuras para las soluciones de prueba y una tapa que aprieta firmemente un trozo de material textil que se va a lavar contra la totalidad de las aberturas de ranura. Durante 1 el tiempo de lavado, la placa, las soluciones de prueba, el material textil y la tapa se agitan vigorosamente para colocar a la solución de prueba en contacto con la tela y aplicar tensión mecánica. Para una descripción adicional véaáe el documento WO 02/42740, especialmente el párrafo "modalidades de método especial" en las páginas 23-24. El análisis se lleva a cabo bajo las condiciones experimentales especificadas en lo siguiente: Detergente Latinoamérica tipo HDP Dosificación de detergente 2.2 g/l Volumen de solución de 160 µl prueba pH Ajustado a pH 9.5-10.5 con NaHC03 Tiey:p< de lavado 14 minutos Tem ¡fcperatura 20°C Dureza del agua 9°dH* Concentración de enzima en 5 nM, 10 nM y 30 nM la solución de prueba Material de prueba C-19 23 * °dH : ajustado al agregar CaCl2 *2H20 ; MgCl2* 6H20 (Relación Ca2+ : Mg2+" = 2 : 1 ) a agua milli-Q . El detergente del tipo utilizado en latinoamérica latinoamérica está constituido de acuerdo con las regulaciones en Detergent ejemplo 1 en la página 16 en la presente. Después de lavar las piezas de tela se enjuagan en agua corriente y se secan al aire. ' Se mide el desempeño de la variante de enzima como la brillantez del color de las muestras textiles lavadas con esa variante de enzima específica. La brillantez también se puede expresar como la intensidad de la luz reflejada a partir de la muestra de tela cuando se ilumina con luz blanca. Cuando la tela se tiñe la intensidad de la luz reflejada es menor, que la de la tela limpia. Por lo tanto la intensidad de la luz reflejada se puede utilizar para medir el desempeño de lavado de una variante de enzima. ¡ Se realizan mediciones de color con un explorador de lecho plano profesional ( PFU DL2400pro) , el cual se utiliza para retener una imagen de las muestras de tela lavadas. Las exploraciones se realizan con una resolución de 200 ¡dpi con una salida de color de 24 bitios. Con el fin de obtener resultados precisos, el explorador se calibra con frecuencia con Kodak reflective IT8 target . Al valor extracto para la intensidad de luz a partir de las imágenes exploradas se utiliza una aplicación de programa diseñado especial (Novozymes Color Vector Analyzer) . El programa recupera los valores de pixeles de 24 bitios a partior de la imagen y los convierte en valores para rojo (r) , verde (g) y azul (b) . Se calcula el valor de intensidad (Int) al sumar los valores (r) , (g) y (b) juntos como vectores y después tomar la longitud del vector resultante: Int=^¡r2+g2+ b2. i El desempeño de lavado (p) de una variante se define como el valor de intensidad de luz de la superficie de la tela con la variante de la enzima: P = Int(v) , Los resultados se presentan en la tabla 2 en donde el desempeño se proporciona como el desempeño relativo de una variante nueva versus el desempeño de Savinase a una concentración de proteasa 10 nM RP eS ( PvARIANTE - PBLANCO ) / ( PsAVINASE ~ PßLANCO ) Tabla 2. Resultados de prueba de desmpeño de lavado con variantes de subtilasa en relación conl desempeño de Savinase EJEMPLO 4 DESEMPEÑO DE LAVADO DE LA COMPOSICIÓN DETERGENTE QUE COMPRENDE VARIANTES DE SUBTILASA El análisis de desempeño de lavado a escala de mililitros se lleva a cabo bajo las siguientes condiciones : Análisis de Minilavado Siátema de prueba vasos de precipitado de vidrio de 125 ml . La tela se sumerge en la solución de prueba. Se levanta y se hace 1 descender continuamente en la solución detergente, 50 1 veces por minuto. Muestra usada: EMPA 116 (2.5 cm x 7 cm) Volumen de solución de 50 ml 1 prueba Después de lavar la pieza de tela se enjuaga en agua corriente y se seca al aire y la remisión (R) del material de prueba se mide a 460 nm utilizando un espectrofotómetro Zeiss MCS 521 VIS. Las mediciones se realizan de acuerdo con el protocolo del fabricante. , Se compara el funcionamiento de las variantes nuevas con el funcionamiento de Savinase a una concentración de proteasa 10 nM al calcular el desempeño relativo: RP = ( PvARIANTE - PßLA CO ) / ( RsAVINASE ~ RßLA CO ) Una variante se considera que presenta desempeño de lavado mejorado, funciona mejor que la referencia en por lo menos una composición detergente.

Calificación: Una calificación = 1 se proporciona para variantes con un desempeño de lavado mejorado igual a o mejor que de 1.1, Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la pres nte descripción de la invención.

Claims (14)

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una variante de subtilasa caracterizada porgue comprende una o más modificaciones que se seleccionan del grupo que consiste de: T143Y, Y167A R170S, A194P Y167A, R170S A194P, K251R YÍ67A, R170S A194P, S265K YÍ67A, R170S A194P, V244R S141E, Y167A R170S, A194P Y167A, R170S M175I Y167A, R170S A172T Y167A, R170S A174V, M175F Y167A, R170S A172V, A174V Y167A, R170S A172E Y167A, R170S M175L Y3,67A, R170S A174T YÍ67A, R170S A174T, M175L G53C, G61E A98S, S99D, G100S S9R, T22A, V68A, S99A, *99aD S9¡R, P14H, R19L, N62D G61P, *99aS N43S, N62D *$6aG, P131S, V203A, A228T N62D, A232C, Q236L, Q245N *96aA, A98T, R247K S$9D, S101R, S103A, V104I, G160S, A194P, L217D *6laD Né2D, S106A V68A, S106M, M184D S9R, A15T, *97aV, H120N A15M, A16P, *99aD *99aE, G160S, S163T, G195S, G211S, K237R, G258A, T260L G23S, *99aD, A194P, S242T, Q245R G100S, N173D A98T, Q137L, Y167A, R170S, M175L *98aA, S99D S9,9A, *99aD, V203A NÓ2D, K237R V11M, N76D, L126F, K251R S9F, A15L, A16P, T221, *98aA, S99D, R170H *96aA, *130aG, P131H E5¡4D, N62D *98aA, *98bS, S99G, S101T S$R, A15T, V68A, 179T, G102S, P131H, Q137H *100aA, *100bG, *100cS, *100dG V68A, Lllll *98aA, R170H, Q245R I35V, N62D, N183D, T224S *97aG, P131S, V203A, A228T S9R, R10K, P14Q, T22A, Y167A, R175S S^R, *22aL, S57A, G61E, *98aA, V139L, ?173S PÍ4T, ?18K, Y167A, R170S S9R, Q12E, P14Q, K27R, Y167A, R170S ?62D, R170L, ?é2D, R170S, Q245R Y167A, R170S, . A194P, K251R, S265K P14T, N18K, Y167A, R170S, A194P N62D, A151G, K237R N62D, A151G, Q245R N62D, A151G, K237R, Q245R S103A, V104I, G159D, A232V, Q236H, Q245R S9(R, A15T, T22A, V139L S9R, A15T, G61E, A85T, E89Q, P239L, Q245C S9R, A15T, V68A, H120N, Q245R N248R S9R, A15T, *22aL, B139L, N204D, Q245L N218S S9R, A15T, V68A, Q245R, N252K S9R, A15T, V68A, Q245R, H120N V$8A, S106A, H120N V68A, S106A, N252K A15T, V68A, S99G, Q245R, N261D S9R, V68A, S99G, Q245R, N261D V68A, S99G, Q245R, N261D S9R, A15T, V68A, S99G, N261D S9R, A15T, V68A, Q245R, N261D S9R, A15T, *22aL, V139L, S163G, N204D, Q245L Q245R, N252H i S9R, *22aL, G61E, *97aA, M119I, Q173H, N173S VÓ8A, S106A, T213A S9R, A15T, V68A, H120N, P131S, Q137H, Q245M S9R, A15T, V68A, 172F, S99G, Q245R, ?261D S9R, A15T, V68A, S99D, Q245R, N261D S9R, A15T, V68A, S99G, A194P, Q245R, N261D S9R, A15T, V68A, ?761, S99G, Q245R, N261D SSiR, A15T, V68A, S99G, A228V, Q245R, ?261D

2. La variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la subtilasa de origen pertenece al subgrupo I-SI.

3. La variante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la subtilasa de origen pertenece al subgrupo I-S2 y en donde el original preferiblemente es BLSAVI .

4. Una secuencia de ADN aislada caracterizada porgue codifica para una variante de subtilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Un vector de expresión caracterizado porque comprende la secuencia de ADN aislada de conformidad con la reivindicación 4.

6. Una célula hospedadora microbiana, caracterizada porque está transformada con el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 5,

7. Una célula hospedadora microbiana, de I conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque es una bacteria, preferiblemente un Bacillus , especialmente B. lentus.

8. Una célula hospedadora microbiana, de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque es un hongo o levadura, preferiblemente un hongo filamentoso, especialmente Aspergillus .

9. Un método para producir una variante de subtilasa de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque se define un hospedador en cualquiera de las reivindicaciones 6-8 que se cultiva bajo condiciones que llevan a la expresión y secreción de la variante y se recupera la variante.

10. Una composición limpiadora o detergente, preferiblemente una composición para el lavado de lavandería o de trastes, caracterizada porque comprende la variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. '

11. Una composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque comprende adicionalmente una celulasa, una lipasa, una amilasa, una cutinasa, una proteasa, una hemicelulasa, una esterasa, una lactasa, una glucoamilasa, una poligalacturonasa, una ß-galactosidasa, una ligninasa o una mezcla de los mismos. t

12. El uso de una variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en un detergente para lavado de ropa de y/o de trastes.

13. Una variante de subtilasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la variante comprende además una o más de las modificaciones K27R, *36D, S56P, N62D, V68A, N76D, S87N, G97N, S99SE, S101G, S101R, i S103A, V104A, V104I, V104?, V104Y, S106A, H120D, H120?, N123S, G159D, Y167A, R170S, R170L, A194P, N204D, V205I, Q206E, L217D, ?218S, ?218D, M222S, M222A, T224S, A232V, K235L, Q236H, Q245R, N248D, N252K y T274A, S101G+V104N, S87N+S101G+V104?, K27R+V104Y+?123S+T274A, ?76D+S103A+V104I , S99D+S101R+S103A+V104I+G160S, SETfV4l+S99D+Sl0lR+S103A+Vl04l+G160S+Vl99M+V205l+L217D, S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+A194P+V199M+V205I+L217D, S3T|V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+V205I o N76D+V104A.

14. Una variante de subtilasa de conformidad con la ¡reivindicación 1, caracterizada porque comprende las siguientes sustituciones: S101G+S103A+V104I+G159D+A232V+Q236H+Q245R+N248D+?252K. RESU EN DE ? SBEV MCICM La presente invención se relaciona con variantes nov dosas de subtilasa que presentan mejorías en relación con la subtilasa de origen en una o más propiedades que incluyen: desempeño de lavado, estabilidad térmica, estabilidad al almacenamiento o actividad catalítica. Las variantes de la invención son adecuadas para uso, por ejemplo, en composiciones limpiadoras o detergentes tales como composiciones detergentes de lavandería y composiciones para el lavado de trastes, que incluyen composiciones para lavátrastes automático.