JP2000503660A

JP2000503660A - 皮膚の光老化を抑制する方法

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Publication number: JP2000503660A
Application number: JP9526224A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．ヴォルヒース，ジョン; ジェイ．フィッシャー，ゲーリー
Original assignee: ザユニバーシティオブミシガン
Priority date: 1996-01-19
Filing date: 1997-01-17
Publication date: 2000-03-28
Anticipated expiration: 2017-01-17
Also published as: AU1831797A; HUP9900655A1; LT4515B; WO1997025969A1; NZ330860A; NO983019D0; CA2241981A1; HK1018885A1; CO4770951A1; BR9707018A; LT98091A; EP0883398A4; MY119711A; AU701132B2; CN1211178A; AR005650A1; CA2241981C; SI9720015A; EP0883398A1; CZ291530B6

Abstract

(57)【要約】ＵＶＢ照射暴露のための損傷していない皮膚の光老化が、皮膚の中のＵＶＢ照射誘導ＭＭＰの活動、転写要因ＡＰ−１及びＮＦ−Ｂの一方又は両方、及びＧＴＰ結合蛋白質、または、ＡＰ−１を構成するｊｕｎ又はｆｏｓ蛋白質の活性化及び／又は産出に関わるキナーゼの少なくとも１つ、のうちの少なくとも１つを抑制する因子を処置すること、及びその様な暴露に先立ち抑制剤を局部的に処置することにより、抑制される。

Description

【発明の詳細な説明】皮膚の光老化を抑制する方法技術分野本発明は、光保護の分野にある。特に、本発明は、マトリックス・金属プロテイナーゼ（Matrix Metalloproteinase：ＭＭＰ）製造および／または活動の抑制剤を使う、損傷を受けていない皮膚の光老化を抑制するための方法に関する。背景光老化は、日光に対する繰り返された被曝の結果としての、皮膚の外見及び機能の変化を記述するために使用される用語である。日光の構成要素である紫外線（ＵＶ）、特に中間ＵＶ（ＵＶＢと呼ばれる、波長２９０−３２０nm）は、光老化を引き起こす主な動因である。光老化を引き起こすのに必要なＵＶＢの被曝量は現在のところ知られていない。紅斑や日焼けを引き起こすレベルでのＵＶＢに対する繰り返しの被曝は、しかしながら、普通、光老化と連想される。臨床的に、光老化は、肌荒れ、しわが寄る、斑の着色、土色になる、たるみ、毛細管拡張症、ほくろ、紫斑病、容易に傷がつくこと、萎縮、繊維症的デピグメントされた（depigmented）範囲、最終的に前悪性の及び悪性の腫瘍、によって特徴づけられる。光老化は、普通、顔、耳、頭の髪のはげた部分、首、と手のような、日光に習慣的に曝される皮膚に起こる。老齢でない皮膚の光老化の抑制と、すでに光老化した皮膚の手入れのための方法は、利用することができる。サンスクリーン（Sunscreens）は、日光に習慣的に曝される皮膚の範囲の光老化を抑制するために普通使われる。サンスクリーンは、ＵＶを、吸収、反射、あるいは、散乱させる、局所の調合剤である。いくつかは、酸化亜鉛、酸化チタニウム、粘土、フェリー塩化物のような不透明な微粒子の材料に基礎を置く。そのような調合剤は、目に見え、吸蔵するので、多くの人々は、これらの不透明な系統的論述を、美容に受け入れることができないと考える。他のサンスクリーンは、透明で、無色の、ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、フェノール（Oxybenzone）、二酸化安息香酸（dioxybenzone）、メチルヘキシル−桂皮酸（cinnamide）、及びブチルメソキシージベンゾイルメタン（butyl methoxydibenzoylmethane）、のような薬品を、それらが目に見える波長の光を吸収しないので、含有する。これらの透明なサンスクリーンは、美容に、受け入れられるかも知れいない一方で、それらは、比較的短命で、洗浄や発汗により除去されるという影響を受けやすい。加えて、すべてのサンスクリーンは、ビタミンDの製造を減少させる。リエガー（Rieger，Ｍ．Ｍ．）は、「Cosmetic and Toiletries」（1993年）１08の４３−５６頁において、皮膚のＵＶに誘導される老化において、反応性酸素種（ＲＯＳ）の役割を検討する。この記事は、皮膚に対する知られている酸化防止剤の局所の適用が、皮膚の中のＲＯＳの存在を減少させ、その結果、光損傷を減少させることができることを報告する。レチノイド（Retinoids）は、太陽で損害を与えられた皮膚における光老化を阻止するために使われた。米国特許Ｎｏ．4,877,805は、光老化の過程を減速させるための、干渉療法としての、光老化した皮膚の処置を記述する。この特許は、老化の結果が出現するまでに、そのような処置を開始するに当たり小さなポイントがあることを示す。これに関して、本出願人は、損傷を受けていない皮膚の光老化を妨ぐためにレチノイドの使用を提案するような技術について全く知らない。ＭＭＰは、結合組織の生理学及び病理学上の破壊における主要な役割を演じる酵素の一群である。１０を超える一群の要素が、確認されている。それらは、共通の名前によってだけではなく、数字によって（ＭＭＰ−１，ＭＭＰ−２，など）呼ばれる。それらは、いくつかの構造及び機能の特徴を共用するが、それらの組織基質の特異性において相違するように見える。それらは、コラーゲン・タイプI、II、III、VII、VIII、IX、およびゼラチンを滅成する間質性のコラーゲナーゼ（ＭＭＰ−１）及びＰＭＮ−コラーゲナーゼ（ＭＭＰ−８）；コラーゲン・タイプIV、V、VII、X、XI、ゼラチン、エラスチン、およびファイブロネクチン（fibronection）を滅成する７２ｋＤａ（ＭＭＰ−２）および９２ｋＤａ（ＭＭＰ −９）タイプＩＶコラーゲナーゼ／ゼラチナーゼ（gelatinases）；ファイブロネクチン、ＰＧの核（core）蛋白質、コラーゲン・タイプIV、V、IX、およびX、ラミニン（laminin）およびエラスチンを滅成するストロメリシン−１（stromel ysin-1）（ＭＭＰ−３）、ストロメリシン−２（stromelysin-2）（ＭＭＰ−１０）及びストロメリシン−３（stromelysin-3）（ＭＭＰ−３）；コラーゲン・タイプIV、ゼラチン、ラミニン、ファイブロネクチンおよびＰＧの核蛋白質を滅成するＰＵＭＰ−１（ＭＭＰ−７）；そしてエラスチン及びファイブロネクチンを滅成するメタロエラスターゼ（metalloelastase）（ＭＭＰ−１２）、を含む。ＭＭＰ遺伝子の遺伝子蛋白質合成は、転写の要素ＡＰ−１及びＮＦ−Ｂによって誘導される。エンジェル（Angel,Ｐ．）等による、「Ｃｅｌｌ」（1987年）49 の７２９−７３９頁、および、佐藤（Sato，Ｈ．）とセイキ（Seiki，Ｍ.）による、「Oncogene」（1993年）8の３９５−４０５頁。ＡＰ−１とＮＦ−Ｂの活動性は、サイトカイン（cytokine）（例えば、インターロイキン（interlukins）ＩＬ−１、ＩＬ−６、及びＴＮＦα）、成長要素（ＴＧＦα、ｂＦＧＦ）、及び、オキシダント、熱、紫外線照射のような環境ストレス、によって調停される。ＡＰ−１を構成する、ｊｕｎ蛋白質（Ｃ−ｊｕｎ、ｊｕｎ−Ｂ、および、ｊｕｎ −Ｄ）およびｆｏｓ蛋白質（Ｃ−ｆｏｓ、ｆｏｓ−Ｂ、ｆｒａ−１、及び、ｆｒａ−２）の、ＡＰ−１の誘導および製造は、多数の分子（例えば、ＲＡＣ、ＣＤＣ４２、ＭＥＫＫ、ＪＮＫＫ、ＪＮＫ、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ、及び、ＥＲＫ）によって調停される。ＡＰ−１とＮＦ−Ｂは、ＵＶ光に曝された哺乳類の細胞の中で、活性化されることが知られている。デバリー（Devary，Ｙ．）等による、「Sience」（1993年）261の１４４２−１４４５頁。ウラスケク（Wlaschek，Ｍ．）は、「Photochemistry and Photobiology」（1994年）、５９（５）の５５０−５５６頁において、繊維母細胞のＵＶＡ照射が、ＩＬ−１、ＩＬ−６調停されたＭＭＰ−１の誘導に終わること、及び、そのような誘導が、光老化におけるコラーゲンの損失に寄与すること、をまた報告する。ＭＭＰの抑制剤、または、遺伝子蛋白質合成に影響を与える転写要素が、また知られている。ヒル（Hill，Ｐ．Ａ．）等は、「Biochem J」（1995年）３０８の１６７−１７５頁に、二つのＭＭＰ抑制剤、ＣＴ１１６６とＲＯ３１−７４６７を開示する。ゴウラヴァラム（Gowravaram，Ｍ．Ｒ．）らは、「J Med Chem」（1995年）３８の２５７０−２５８１頁において、ＭＭＰを抑制する一連のヒドロキサマト（hydroxamate）の発展について述べており、ＭＭＰの抑制剤として知られるメルカプタン、ホスホン酸塩（phosphonate）、ホスフィン酸塩（phosp hinate）、ホスホルアミデイト（hosphoramidate）、およびＮ−Ｎ-カルボキシ −アルキルについて、言及している。この論文は、ＭＭＰ抑制剤が、ＭＭＰの特異性ポケットの部分集合を拘束する、亜鉛とペプチドの破片をキレート化する一部分を含むことを示す。ホッジソン（Hodgson，Ｊ．）は、「Biotechnology」（ 1995年）１３の５５４−５５７頁において、ガラージン（Galardin）、バチマスタット（Batimastat）、およびマリマスタット（Marimastat）を含む、いくつかのＭＭＰ抑制剤の臨床の状態を再検討する。他のＭＭＰ抑制剤は、ブタンジアミド（butanediamide）（コンウェイ（Conway，Ｊ．Ｇ．）等、「J Exp Med」（19 95年）１８２の４４９−４５７頁）、ＴＩＭＰｓ（マウチ（Mauch，Ｃ．）等、「Arch DematolRes」（1994年）２８７の１０７−１１４頁）、及び、レチノイド（ファンジュル（Fanjul，Ａ．）等、「Nature」（1994年）３７２の１０７− １１１頁；ニコルソン（Nicholson，Ｒ．Ｃ．）等、「EMBO Journal」（1990年）９(13)の４４４３−４４５４頁;及びバイリー（Bailly，Ｃ．）等、「J Inves ig Derm」（1990年）９４（１）の４７−５１頁）を含む。発明の開示本発明は、出願人の、ＵＶＢの曝露は、曝された皮膚において、急速にＡＰ− １及びＮＦ−Ｂを増加させ、ＭＭＰの誘導を導くことの発見に基礎を置く。ＵＶＢの曝露から生じるＭＭＰの高められたレベルは、皮膚における結合性組織を悪化させる。そのような損傷は、もし不完全に修復されたなら、ＵＶＢ曝露の繰り返しにより蓄積される太陽傷になり、また、光老化の原因となる。従って、出願人は、ＵＶＢへの皮膚の露出のために、ＵＶＢ誘導ＭＭＰｓの誘導及び／又は活動性を抑制するために十分な量の被爆に先立ち、人にＵＶＢ誘導ＭＭＰの抑制剤を与えることにより、ダメージを受けていない人間の皮膚の光老化を抑制する。意外にも、これは、紅斑を引き起こす線量のみならず紅斑点を引き起こす線量以下のＵＶＢの線量で、発生する。本発明の他の様相は、繰り返しのＵＶＢ曝露のために、ダメージを受けていない皮膚の光老化を防ぐために、薬剤の製造において、ＵＶＢ誘導ＭＭＰの誘導又は活動性の抑制剤の使用にある。図面の簡単な説明図面において、図１は、ＵＶＢがＭＭＰの生産を誘導する筋道を示すフローチャートである。図２ａ−ｄ，３ａ−ｂ，４ａ−ｄ，及び５ａ−ｅは、実施例において記述された試験結果のグラフである。発明を実施するための形態本発明は、損傷を与えられていない人間の皮膚、即ち、光老化の結果を示さない皮膚、の光老化を抑制（即ち、減少させるか、防止する）するために利用される。この発明による処理は、典型的に、日々の生活で習慣的に太陽に曝される、頭、首、手、及び腕のような皮膚に対し、そのような皮膚が光老化の証拠となる信号を示すまえに、実行されるべきである。紅斑の原因となる線量以下の線量のＵＶＢへの繰り返しの曝露は、光老化を引き起こし得るので、本発明は、そのような低い線量の曝露を条件として、皮膚に実行されるべきである。この点について、多くの平均的な皮膚を持つ人々では、３０−５０mJ／cm²の範囲のＵＶＢの線量が、紅斑の原因となる。従って、本発明は、この範囲（典型的には、数分の日光の曝露に相当する約５mJ／cm²以上）以下の線量に曝された皮膚の光老化を抑制するだろう。光老化は、皮膚の細胞外の細胞間質のＵＶＢに誘導されるＭＭＰによる悪化を防ぐことによって、本発明にしたがって、抑制されるか防止される。これは、日光に曝されるべき皮膚にＭＭＰ抑制剤を与えることにより遂行される。この点に関し、「ＭＭＰ抑制剤」なる語は、そのような皮膚におけるＵＶＢ誘導されるＭＭＰの表出を、直接あるいは間接に防止する（即ち、著しく減少させるか、あるいは排除する）か、そのようなＭＭＰの酵素の活動を防止する、それらの薬剤を指す。「間接的な防止」は、転写要因ＡＰ−１とＮＦ−Ｂ、及び／又は、ＵＶＢ誘導されるＭＭＰｓの表出を減少又は排除する方法で、皮膚におけるｊｕｎとｆｏｓの蛋白質誘導を引き起こす３キナーゼカスケードに含まれる１またはそれ以上の分子の、一方又は両方との相互作用を意味する。図１は、ＵＶＢ誘導されるＭＭＰの表出の経路を図示する。図１に示されるように、ＵＶＢへの曝露は、サイトカイン（cytokines）と成長要因を交互に誘導するＡＰ−１及びＮＦ−Ｂの活動を刺激する反応性酸素中間生成物（ReactiveOx ygen Intermediates：ＲＯＩ）を発生する。それらサイトカイン及び要因とそれらの受容体との相互作用は、少ないＧＴＰ（グアノシン５′−二リン酸）結合蛋白質ＲＡＣ／ＣＤＣ４２及びＲＡＳを引き起こす。それらの蛋白質は、ＡＰ− １を形成するｊｕｎ及びｆｏｓ蛋白質の製造のための主要部である３キナーゼカスケードを活性化する。ＡＰ−１は、あるＭＭＰの表出を誘導する。光老化を抑制する薬品は、ＭＭＰ、転写要因ＡＰ−１及びＮＦ−Ｂ、及び／又は、１又はそれ以上の図１に示される３キナーゼカスケードに含まれる分子、に作用する。アスピリンとＥ５５１０（Fujimori、Ｔ．等によって、「Jpn J Pharmacol」（199 1年）、５５（１）、８１−９１頁に記述されている）は、ＮＦ−Ｂの活性化を阻止する。Ｂ−５８１のようなファルネシル転移酵素抑制剤（Garcia、Ａ．Ｍ．等によって、「J Biol Chem」（1993年）２６８（２５）の18415−18418頁に記述されている）、ＢＺＡ−５Ｂ（Dalton、Ｍ．Ｂ．によって「Cancer Res」（19 95年）、５５（１５）の３２９５−３３０４頁に記述されている）、；ファルネシルアセテート、および、（α−ヒドロキシファルネシル（hydroxyfarnesyl））燐酸は、ゲラニルゲラニル転移酵素（geranyl geranyltransferase）抑制剤と、リソフィリン（lisofylline）が、ＪＮＫカスケードの活性化を妨げるのに対し、ＲＡＳに作用して、ＥＲＫカスケードの活性化を妨げる。ＳＢ２０２１９０（Lee、Ｊ．Ｃ．等によって、「Nature」（1994年）３７２の７３９−７４６頁に記述されている）やＰＤ９８０５９（Dudley、Ｄ．Ｔ．等により、「ＰＮＡＳ」（ＵＳＡ）（1995年）92の７６８６−７６８９頁に記述されている）のような化合物は、カスケードの中で、特定のキナーゼを抑制する。Fanjul等によって、（「 Nature」（1994年）３７２の１０４−１１０頁に）記述されているようなＡＰ− １拮抗作用のための特効薬である、米国特許Ｎｏ．4,877,805に開示されているようなレチノイド及び解離しているレチノイド、グルココルチコイド（glucocort icoid）、及びビタミンＤ３は、ＡＰ−１を標的とする。他のレチノイド、加えてレチノールは、ＥＰ 379367 Ａ２に開示されているように、自然及び同調の類似体のビタミンＡ（レチノール）、ビタミンＡアルデヒド（レチナール（reti nal））、ビタミンＡ酸（レチノイン（retinoic）酸、すべての変形及び１３のｃｉｓレチノイン酸を含む）、及びその他、を含む。最後に、ＭＭＰｓは、ＢＢ２２８４（Gearig Ａ．Ｊ．Ｈ．らにより「Nature」（1994年）３７０の５５５ −５５７頁に記述されている）、ＧＩ１２９４７１（McGeehan Ｇ．Ｍ．等により、「Nature」（1994年）３７０の５５８−５６１頁に記述されている）、ＴＩＭＰＳ、ガラージン、バチマスタット、マリマスタット、ヒドロキサマト，その他知られている抑制剤、によって抑制されるだろう。 1又はそれ以上のこれらＭＭＰ抑制剤は、むしろ、日光に曝されなければならない皮膚に局部的に施される。そのような投与のために、通常それらは、クリーム、ジェル、軟膏、スプレー、あるいはローションのような明確な形にされる。従来の、薬理学及び化粧に受け入れられる手段は、抑制剤を明確な形にするために使用されるだろう。そのような手段の例は、米国特許Ｎｏ．4,877,805及びＥＰＡＰｕｂ．Ｎｏ．0586106 Ａ１に記述されている。示されているように、１又はそれ以上の抑制剤が、与えられたフォーミュレイション（formulation）の中に存在しているだろう。例えば、皮膚のＭＭＰの崩壊をの結果に含まれる2 又はそれ以上の異なる分子に作用する抑制剤の組み合せが使用される。フォーミュレイションは、また、緩和剤、皮膚浸透強化剤、色素剤、及び香料のような添加物を含むだろう。さらに、フォーミュレイションは、皮膚に対する抑制剤の確認された解放を供給する吸収性微粒子（例えば重合体の玉）のような成分を含むだろう。フォーミュレイションにおける抑制剤の重量濃度は、通常、０．０１％から１０％、より普通には、０．１％から１％であろう。標準的には、フォーミュレイションの約５０mgが、皮膚の１cm²毎に、適用される。抑制剤は、日光に曝されるまえの損傷を受けていない皮膚にむしろ適用される。適用管理（すなわち、毎日、毎週、その他）は、主として抑制剤の寿命（例えば、代謝、皮膚の中の半生）と、それらの行動の的となる分子とに依存する。また、それは、入浴、発汗、および、日光への被曝の範囲によって影響される。通常、それらは日々適用されるだろう。本発明は、以下の例のより更に説明される。これらの例は、どのような意味においても、本発明を、制限するものではない。実施例ＵＶＢ誘導される光老化の分子基礎の決定ＭＭＰの高ＵＶＢ線量誘導ＵＶＢ曝露に続く、ＭＭＰ−1，ＭＭＰ−3，ＭＭＰ−9、ＭＭＰ−2 ｍＲＮＡ，蛋白質、及び、酵素の活動レベルにおける変化の時間経過は、以下のように決定された。被験者は、軽い日焼けのための光に当たる大人のコーカソイド人種（ほぼ、同数の男女）であった。各被験者のための、かろうじて知覚できる皮膚が赤くなる（最小の紅斑線量、または「ＭＥＤ」）のを引き起こすのに必要なＵＶＢ線量は、２４時間の照射の後、決定された。すべての被験者のための、１ＭＥＤは、３０−５０ｍＪ／cm²の範囲とされた。被験者の尻は、４つのＦ３６Ｔ１２・ＥＲＥ−ＶＨＯ・ＵＶＢ管を含むウルトラライト・パネライト・ランプにより、２ＭＥＤのＵＶＢに照らされた。照射の強度は、ＩＬ４４３光線療法放射計とＳＥＤ／ＵＶＢ／Ｗ光検出器により監視された。光源から４８cmで測定されたＵＶＢ出力は、０．５mW／cm²だった。各被験者について、照射から８，１６，２４，４８、及び７２時間後に、ケラトメ（keratome）により４つの場所（１つは、非照射、３つは照射された場所）から皮膚が採取された。組織は、即座に冷凍され、すべてのＲＮＡは、分離され、Fisher，Ｇ．Ｊ．等により、「J Invest Dermatol」（1991年）９６の６９９−７０７に記述されたようなノーザン・ブロット（Nort hern blot）により分析された。バンドの強度は、燐光体イメージャー（Phospho r Imager）によって測定された。ＭＭＰ複写のための値は、制御遺伝子３６Ｂ４のために、それらに標準化された。これらのテストの結果は、図２ａ（ＭＭＰ− １）、図２ｂ（ＭＭＰ−３）、図２ｃ（ＭＭＰ−９）および、図２ｄ（ＭＭＰ− −２）に示される。結果は、平均＋ＳＥＭ（８，１６，４８及び７２時間の場合、ｎ＝６、ＵＶＢ制御なし及び２４時間の場合、ｎ＝１７）であり、非照射の皮膚に対する標準化された値のフォールドインクリース（fold increase）のように与えられる。図に示されたバンドは、いくつかの人間からの合成物です図２ａ乃至ｄに示されるように、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３，及びＮＮＰ−９ｍＲＮＡｓの誘導は、１６から２４時間の範囲で最高（６−６０フォールド）で、４８から７２時間の範囲で、ベースライン近くに戻った。ＭＭＰ−２ｍＲＮＡは、検出可能であったが、２４時間の照射後、唯−１．６フォールドに高められた。ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−９蛋白質の誘導、及び２ＭＥＤＵＶＢによる活動の時間経過は、それらのｍＲＮＡｓのために観測されるそれらと平行に進んだ。ＭＭＰ−２蛋白質も活動もどちらも誘導されなかった。ＭＭＰ−３（ストロメリシンＩ）の特定のプローブでのＵＶＢ処理された皮膚のノーザン分析は、全長さ（full-length）のＭＭＰ−３のプローブで選られた結果とまったく同一の結果を生じ（図２ｂ）、一方、ＭＭＰ−１０（ストロメリシンＩＩ）の特定のプローブで雑種を作らせること（hybridization）は、まったく信号を生じなかった。これは、ストロメリシンの中で、ＵＶＢが、ストロメリシンＩを主に誘導することを示す。ＭＭＰの低ＵＶＢ誘導上述したように、被験者は、０．０１から２ＭＥＤまに及ぶＵＶＢ線量に曝された。全厚さの皮膚のサンプル（６mm円柱）が、照射後２４時間後に処理又は非処理の場所から得られた。サンプルは、２０mMのトリ（Tris）ＨＣＬ（ｐＨ７．６）及び５mMのＣａＣｌ₂の中で均質化され、１０分間３０００ｘｇで遠心分離機により分離された。表面に浮いているものは、ウエスタンブロット（Westernb lot）（１００μｇ／レーン）によって、化学ルミネッセンスを使って、ＭＭＰ- 1及びＭＭＰ-９蛋白質を測定するために使用され、Ｈｕ，Ｃ．Ｌ．等による「An al Biochem」（1978年）８８の６３８−６４３にしたがって、３Ｈ微小繊維のコラーゲン（１００μｇ／分析物）の加水分解により活動状況を測定するために使用され、Hibbs,Ｍ．Ｓ．等による「J Biol Chem」（1985年）２６０の２４９３ −２５００にしたがって、ゼラチンジモグラフィ（zymography）（２０μｇ／分析物）を測定するために使用される。使用されたＭＭＰ−２及びＭＭＰ抗体は、それぞれ、Werb，Ｚ．等により、「J Cell Biol」（1989年）１０９の８７７− ８９９頁と、Murphy,Ｇ．等による「Biochem J」（1989年）２５８の４６３−４７２頁に、記述されている。これらの試験の結果は、図３ａ及びｂに示されている。図３ａにおいて、ＭＭＰ−２蛋白質の値は、白抜きのバーによって示されているのに対して、ＭＭＰ−２の活動の値は、ハッチングされたバーによって示される。図３ａの差し込み図は、2つの被験者からのウエスタンブロット（Western b lots）の典型を示す。より大きい５４ＫＤａバンドは、傷ついていないＭＭＰ− ２であり、より小さい４５ＫＤａバンドは、ＭＭＰ−２の蛋白質加水分解の処理され、活性化された形である。図３ｂにおいて、ＭＭＰ−９蛋白質の値は、白抜きのバーで示され、ＭＭＰ− ９の活動の値は、ハッチングされたバーで示される。図３ｂの差し込み図は、ウエスタンブロットの典型（左のパネル）とジモグラム（zymogram）（右のパネル）を示す。ジモグラム上の多重バンドは、ＭＭＰ−９の蛋白質加水分解処理された活動の形に、蛋白質加水分解処理される。バンド強度は、レーザー濃度測定によって測定された。結果は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝１０）として与えられる。図３ａ及びｂに示されるように、ＭＭＰ-２とＭＭＰ−９の蛋白質と活動は、線量によって決まり、両方のＭＭＰのために、蛋白質と活動における変化は、互いに反映した。ＭＭＰ−２は、試験されたＵＶＢのすべての線量によって誘導され、ＭＭＰ−９は、０．１ＭＥＤ以上の線量によって誘導された。誘導は、１ＭＥＤで最高で、０．１ＭＥＤでおよそ最高の半分であった。０．１ＭＥＤのＵＶＢは、知覚できるほど皮膚を赤くすることのない、夏の日光放射の２から３分に等しい。ＡＰ−１及びＮＦ−Ｂの低線量ＵＶＢの誘導上述したように、被験者は照射され、組織サンプルが採取された。核抽出物は、Fisher,Ｇ．Ｊ．等により「J Biol Chem」（1994年）２６９の２０６２９−２０６３５頁に記述されているように、サンプルから準備された。１０⁸個の細胞を含む生体組織片（およそ２００mg、濡れた重さ）の検査は、平均して、５００ μｇの核抽出蛋白質を生成した。電気泳動の流動性シフト分析（８μｇの核抽出蛋白質）は、³²Ｐと名づけられた、ＡＰ−１及びＮＦ−Ｂ一致を含む、ＤＮＡ精査を使って実行され、Fisher,Ｇ．Ｊ．等により、上記に記述されているように、ＤＮＡ結合の連続に変化させられた。超変化（supershifts）のための抗体は、サンタ・クルツ・バイオテクノロジーから得られた。ｊｕｎ及びｆｏｓの抗体は、それぞれ、すべてのｊｕｎ及びｆｏｓの族の要素に対して、ひろい反応性を持った。ＮＦ−Ｂ抗体は、ｐ６５／ＲｅｌＡのために独特（specific）であった。これらの分析の結果は、図４ａ，４ｂ，４ｃ，及び４ｄに示されている（ＮＳは、非独特な例を示す）。これらの図のための差し込み図は、合成物を遅らせたＡＰ−１及びＮＦ−Ｂの典型を示す。＋Ｃｏｍｐｅｔは、名づけられていないプローブの１００倍の超過の付加を示し、Ｍｕｔは、変化させられた³²Ｐのプローブを示す。図４ａは、照射されていない皮膚と、照射された（２ＭＥＤのＵＶＢの後、４時間）皮膚における、ＡＰ−１とＮＦ−Ｂの結合を表す。図４ａに示されるように、それらのＤＮＡ応答要素に対する両方の転写酵素の結合は、変化させられ、名づけられたプローブと、遅くされた合成物によって明示されるように，独特である。抗体の超変化は、特定のＡＰ−１及びＮＦ−Ｂの遅くされた合成物が、ｊｕｎ及びｆｏｓ蛋白質及びＲｅｌＡ蛋白質をそれぞれ含むＵＶＢ照射された皮膚からの抽出部で観測された、ということを明示した。図４ｂ及び４ｃは、２ＭＥＤＵＶＢによる、ＡＰ−１及びＮＦ−ＢのＤＮＡ結合の誘導の時間経過をそれぞれ示す。報告された結果は、平均±ＳＥＭ、ｎ＝９、である。図示のように、両方の要素の誘導は、１５分以内に現れた。図４ｄは、ＡＰ−１（白抜きのバーで示される）とＮＦ−Ｂ（斜めのハッチングされたバーで示す）の誘導の線量依存を示す。ＤＮＡの結合は、照射の後、３０分測定された。図示されるように、両方の要素の最大の誘導の半分は、ほぼ０ .１ＭＥＤで引き起こされ、最大の誘導は、１ＭＥＤで引き起こされた。これらの要素の誘導のためのＵＶＢ線量の依存性は、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の誘導のための上記に報告した、これら2つのＭＭＰにおける、ＵＶＢ誘導された増加要因における、これらの複写要因と一致する、それらと厳密に一致した。ＡＰ−１、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９のＵＶＢ誘導の抑制０．１％の全トランスレチノン酸（all-trans retinoic acid）（ｔ−ＲＡ）及びそのビークル（vehicle）（７０％エタノール及び３０％プロピレングリコール）、または、０．０５％のグルココルチコイド（ＧＣ）クロベタゾル（clo betasol）プロピオン塩酸及びそのビークル（白色ワセリンの中に２％プロピレングリコールと２％ソルビタン（sorbitan）セスキオリート（sesquioleate））は、Fisher,Ｇ．Ｊ．等による「J Invest Dermatol」（1991年）９６の６９９− ７０７頁に記述されているように、４８時間の間、被験者に適用（３００mgフォーミュレイション／６cm²の皮膚）された。処置された皮膚の場所は、そのとき、２ＭＥＤのＵＶＢが照射された。皮膚は、上述したように、ＡＰ−１測定のため曝露の後３０分、又は、ＭＭＰ測定のために曝露の後24時間で得られた。ＡＰ −１測定とＭＭＰ−１及びＭＭＰ−９の測定は、上述のように行われた。ｔ−ＲＡが、ＵＶＢで誘導された皮膚が赤くなることを変えたかどうかを決定するために、被験者は、０．１％のｔ−ＲＡとそのビークルとを24時間の間処置した。処置された領域は、１０−８０mJ／cm²のＵＶＢに照射され、ミノルタ色度計（chr omamet er）により、24時間後に皮膚の赤くなることが決定された。これらの試験の結果は、図５ａ，５ｂ，５ｃ，５ｄ及び５ｅに示されている。図５ａは、ＡＰ−１の測定を報告する。図示されるように、予めＴ−ＲＡで処置した皮膚は、ＵＶＢ誘導されたＡＰ−１のＤＮＡ結合が、およそ７０％減少した。図５ｂ及び５ｃは、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−９の測定を報告する。図示されるように、ｔ−ＲＡのあらかじめの処置は、ＵＶＢ誘導されたＭＭＰ−１とＭＭＰ −９のｍＲＮＡｓ、蛋白質、及び活動を５０％から８０％減少させた。図５ｄは、皮膚が赤くなることに関するｔ−ＲＡのあらかじめの処置の効果についての試験を報告する。図示されるように、ｔ−ＲＡの吸収は、ＵＶＢの範囲（ｔ−ＲＡは、最大３５１nm、と重なり合うけれども、ｔ−ＲＡは、ＵＶＢ誘導された皮膚の赤くなることを減少させなかった。これは、ＡＰを与える（-land ）ＭＭＰ誘導における認められる減少が、ｔ−ＲＡによる吸収のためというよりもむしろ、特異性（specific）であることを示す。図５ｅは、ＧＣでの皮膚のあらかじめの処置の効果を報告する。図示されるように、ＧＣのあらかじめの処置は、ＭＭＰ−１とＭＭＰ−９の活動を、ｔ−ＲＡのあらかじめの処理から観測されたそれらに似た範囲に減少させる。上記の詳細な説明で参照された出版物は、これによって、明白に参照により併合された。

【手続補正書】【提出日】１９９９年２月５日（１９９９．２．５）【補正内容】 1)明細書第１０頁第９行の「ＭＭＰ−２」を「ＭＭＰ−１」と補正する。 2)明細書第１０頁第１４行の「ＭＭＰ−２」を「ＭＭＰ−１」と補正する。 3)明細書第１０頁第１５行の「ＭＭＰ−２」を「ＭＭＰ−１」と補正する。 4)明細書第１０頁１７〜１８行の「ＭＭＰ−２であり、」を「ＭＭＰ−１であり、」と補正する。 5)明細書第１０頁第１８行の「ＭＭＰ−２の」を「ＭＭＰ−１の」と補正する。 6)明細書第１０頁第２７行の「ＭＭＰ−２」を「ＭＭＰ−１」と補正する。 7)明細書第１１頁第１行の「ＭＭＰ−２」を「ＭＭＰ−１」と補正する。 8)明細書第１２頁１０行の「ＭＭＰ−２」を「ＭＭＰ−１」と補正する。 9)明細書第１２頁１３行の「ＭＭＰ−２」を「ＭＭＰ−１」と補正する。【手続補正書】【提出日】１９９９年２月２４日（１９９９．２．２４）【補正内容】 1)明細書第３頁第９行の「ＮＦ−Ｂ」を「ＮＦ−κＢ」と補正する。 2)明細書第３頁第１２行の「ＮＦ−Ｂ」を「ＮＦ−κＢ」と補正する。 3)明細書第３頁第２０行の「ＮＦ−Ｂ」を「ＮＦ−κＢ」と補正する。 4)明細書第４頁第２２行の「ＮＦ−Ｂ」を「ＮＦ−κＢ」と補正する。 5)明細書第６頁第４行の「ＮＦ−Ｂ」を「ＮＦ−κB」と補正する。 6)明細書第６頁第１０行の「ＮＦ−Ｂ」を「ＮＦ−κＢ」と補正する。 7)明細書第６頁第１６行の「ＮＦ−Ｂ」を「ＮＦ−κＢ」と補正する。 8)明細書第６頁第１９行の「ＮＦ−Ｂ」を「ＮＦ−κＢ」と補正する。 9)明細書第１１頁第６行の「ＮＦ−Ｂ」を「ＮＦ−κＢ」と補正する。 10)明細書第１１頁第１２行の「ＮＦ−Ｂ」を「ＮＦ−κＢ」と補正する。 11)明細書第１１頁第１７行の「ＮＦ−Ｂ」を「ＮＦ−κＢ」と補正する。 12)明細書第１１頁第２０行の「ＮＦ−Ｂ」を「ＮＦ−κＢ」と補正する。 13)明細書第１１頁第２４行の「ＮＦ−Ｂ」を「ＮＦ−κＢ」と補正する。 14)明細書第１１頁第２７行の「ＮＦ−Ｂ」を「ＮＦ−κＢ」と補正する。 15)明細書第１２頁第３行の「ＮＦ−Ｂ」を「ＮＦ−κＢ」と補正する。 16)明細書第１２頁第６行の「ＮＦ−Ｂ」を「ＮＦ−κＢ」と補正する。 17)明細書第１３頁第１１行の「最大３５１nm」を「最大波長３５１nm」と補正する。別紙のとおり (別紙) 請求の範囲１．人間の皮膚が紫外線Ｂ（ＵＶＢ）照射に曝されることで、光による損傷を受けていない人間の皮膚が光老化することを防ぐ方法において、（ａ）皮膚の中のＵＶＢ照射誘導ＭＭＰの活動、（ｂ）転写要因ＡＰ−１及びＮＦ−κＢの一方又は両方、及び（ｃ）ＧＴＰ結合蛋白質、または、ＡＰ−１を構成するｊｕｎ又はｆｏｓ蛋白質の活性化及び／又は産出に関わるキナーゼの少なくとも１つ、のうちの少なくとも１つの抑制剤を用意すること、及び、紫外線Ｂの照射に先立ち、ＵＶＢ誘導ＭＭＰの産出又は活性化、ＡＰ−１及びＮＦ−κＢの一方又は両方、または、ＧＴＰ結合蛋白質、または、ＡＰ−１を構成するｊｕｎ又はｆｏｓ蛋白質の活性化及び／又は産出に関わるキナーゼの少なくとも１つ、を抑制するのに十分な量の前記抑制剤を皮膚に局部的に与えることを特徴とする皮膚の光老化を抑制する方法。２．前記皮膚が赤くなることを引き起こすのに必要な最小線量以下のＵＶＢの線量に曝されることによって誘導される光老化を抑制することを特徴とする請求項１の皮膚の光老化を抑制する方法。３．前記ＵＶＢ線量が、約５mJ／cm2以上であることを特徴とする請求項２の皮膚の光老化を抑制する方法。４．前記抑制剤が、ＡＰ−１及びＮＦ−κＢの少なくとも一方の活動を抑制することを特徴とする請求項１の皮膚の光老化を抑制する方法。５．前記抑制剤が、ＵＶＢ誘導ＭＭＰの活動を抑制することを特徴とする請求項１の皮膚の光老化を抑制する方法。６．前記抑制剤が、ＧＴＰ結合蛋白質、または、ｊｕｎ又はｆｏｓ蛋白質の主要なキナーゼを抑制することを特徴とする請求項１の皮膚の光老化を抑制する方法。７．前記抑制剤が、ＡＰ−１を抑制するレチノイド，グルココルチコイド、または、ビタミンＤ３であることを特徴とする請求項４の皮膚の光老化を抑制する方法。８．前記抑制剤が、ＮＦ−κＢを抑制するグルココルチコイド、アスピリン、または、Ｅ５５１０であることを特徴とする請求項４の皮膚の光老化を抑制する方法。９．前記抑制剤が、ＴＩＭＰ、ガラージン、バチマスタット、マリマスタット、又はヒドロキサマトであることを特徴とする請求項５の皮膚の光老化を抑制する方法。１０．前記抑制剤が、ファルネシル転移酵素抑制剤、ゲラニルゲラニル転移酵素抑制剤、ＳＢ２０２１９０，またはＰＤ９８０５９あることを特徴とする請求項６の皮膚の光老化を抑制する方法。１１．損傷を与えられていない人間の皮膚の光老化を抑制するための、薬剤の製造における、紫外線Ｂ照射誘導マトリックス・金属プロテイナーゼの抑制剤の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/203 Ａ６１Ｋ 31/20 ６０３ 31/573 31/57 ６０１ 31/593 31/59 ６０２ 45/00 45/00 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＴ，ＭＫ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＵＡ (72)発明者フィッシャー，ゲーリージェイ. アメリカ合衆国，ミシガン 48109―0528, アンアーバー，イーストキャサリン 1301，ルーム 6558，ビルディングクリースジＩ，デパートメントオブダーマトロジ，ザユニバーシティオブミシガン内

Claims

【特許請求の範囲】１．人間の皮膚が紫外線Ｂ（ＵＶＢ）照射に曝されることで、光による損傷を受けていない人間の皮膚が光老化することを防ぐ方法において、（ａ）皮膚の中のＵＶＢ照射誘導ＭＭＰの活動、（ｂ）転写要因ＡＰ−１及びＮＦ−Ｂの一方又は両方、及び（ｃ）ＧＴＰ結合蛋白質、または、ＡＰ−１を構成するｊｕｎ又はｆｏｓ蛋白質の活性化及び／又は産出に関わるキナーゼの少なくとも１つ、のうちの少なくとも１つの抑制剤を用意すること、及び、紫外線Ｂの照射に先立ち、ＵＶＢ誘導ＭＭＰの産出又は活性化、ＡＰ−１及びＮＦ−Ｂの一方又は両方、または、ＧＴＰ結合蛋白質、または、ＡＰ−１を構成するｊｕｎ又はｆｏｓ蛋白質の活性化及び／又は産出に関わるキナーゼの少なくとも１つ、を抑制するのに十分な量の前記抑制剤を皮膚に局部的に与えることを特徴とする皮膚の光老化を抑制する方法。２．前記皮膚が赤くなることを引き起こすのに必要な最小線量以下のＵＶＢの線量に曝されることによって誘導される光老化を抑制することを特徴とする請求項１の皮膚の光老化を抑制する方法。３．前記ＵＶＢ線量が、約５mJ／cm²以上であることを特徴とする請求項２の皮膚の光老化を抑制する方法。４．前記抑制剤が、ＡＰ−１及びＮＦ−Ｂの少なくとも一方の活動を抑制することを特徴とする請求項１の皮膚の光老化を抑制する方法。５．前記抑制剤が、ＵＶＢ誘導ＭＭＰの活動を抑制することを特徴とする請求項１の皮膚の光老化を抑制する方法。６．前記抑制剤が、ＧＴＰ結合蛋白質、または、ｊｕｎ又はｆｏｓ蛋白質の主要なキナーゼを抑制することを特徴とする請求項１の皮膚の光老化を抑制する方法。７．前記抑制剤が、ＡＰ−１を抑制するレチノイド，グルココルチコイド、または、ビタミンＤ３であることを特徴とする請求項４の皮膚の光老化を抑制する方法。８．前記抑制剤が、ＮＦ−Ｂを抑制するグルココルチコイド、アスピリン、または、Ｅ５５１０であることを特徴とする請求項４の皮膚の光老化を抑制する方法。９．前記抑制剤が、ＴＩＭＰ、ガラージン、バチマスタット、マリマスタット、又はヒドロキサマトであることを特徴とする請求項５の皮膚の光老化を抑制する方法。１０．前記抑制剤が、ファルネシル転移酵素抑制剤、ゲラニルゲラニル転移酵素抑制剤、ＳＢ２０２１９０，またはＰＤ９８０５９あることを特徴とする請求項６の皮膚の光老化を抑制する方法。１１．損傷を与えられていない人間の皮膚の光老化を抑制するための、薬剤の製造における、紫外線Ｂ照射誘導マトリックス・金属プロテイナーゼの抑制剤の使用。