DE19955349A1 - Verwendung von Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren zur Diagnose oder Behandlung von Hauterkrankungen sowie ihre Verwendung zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen - Google Patents

Abstract

Verwendung von Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren zur Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen und/oder der Wundheilung sowie ihre Verwendung zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren zur Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen und/oder der Wundheilung sowie ihre Verwendung zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung in Zusammenhang mit Erkrankungen von Hautzellen und bei der Wundheilung.

Wunden heilen im allgemeinen ohne therapeutischen Eingriff ab. Es gibt jedoch zahlreiche Erkrankungen, bei denen die Wundheilung eine Rolle spielt, wie z. B. Diabetes mellitus, arterielle Verschlußkrankheiten, Schuppenflechte (Psoriasis), Morbus Crohn, Epidermolysis bullosa, altersbedingte Hautveränderungen oder Innervationsstörungen. Wundheilungsstörungen führen zu einer verzögerten Wundheilung oder zu chronischen Wunden. Diese Störungen können durch die Art der Verwundung (z. B. großflächige Wunden, tiefgehende und mechanisch gedehnte Operationswunden, Verbrennungen, Trauma, Dekubitus), medikamentöse Behandlung der Patienten (z. B. mit Corticoiden) aber auch durch die Art der Erkrankung selber verursacht werden. So leiden z. B. 25% der Patienten mit Typ-II-Diabetes häufig an chronischen Ulzera ("diabetischer Fuß"), von denen etwa die Hälfte aufwendige stationäre Behandlungen erfordern und letztlich doch schlecht heilen. Der diabetische Fuß verursacht mehr Klinikaufenthalte als jede andere mit Diabetes assoziierte Komplikation. Die Zahl dieser Fälle bei Diabetes Typ I und II ist im Steigen begriffen und repräsentiert 2,5% aller Klinikeinweisungen. Zudem heilen Wunden mit zunehmendem Alter der Patienten schlechter. Oft ist auch eine Beschleunigung des natürlichen Wundheilungsprozesses wünschenswert, um z. B. die Gefahr von bakteriellen Infektionen oder die Liegezeiten der Patienten zu verringern.

Auch nach erfolgtem Wundverschluß kann es zu weiteren Störungen kommen. Während Wunden fötaler Haut ohne Narbenbildung heilen, kommt es nach Verletzungen in der Postnatalperiode stets zu Narbenbildungen, die oft ein großes kosmetisches Problem darstellen. Bei Patienten mit großflächigen Brandwunden kann zudem die Lebensqualität dramatisch beeinträchtigt werden, zumal vernarbter Haut auch die Anhangsgebilde, wie Haarfollikel, Schweiß- und Talgdrüsen fehlen. Bei entsprechender genetischer Disposition kann es auch zu Keloiden kommen, hypertrophischen Narben, die in die umgebende Haut einwuchern.

Der Vorgang der Wundheilung erfordert komplexe koordiniert ablaufende Wirkungen und Interaktionen verschiedener Zelltypen. Im Wundheilungsprozeß unterscheidet man folgende Schritte: die Blutgerinnung im Bereich der Wunde, die Rekrutierung von Entzündungszellen, die Reepithelialisierung, die Bildung von Granulationsgewebe sowie die Restrukturierung von Matrix. Die exakten Reaktionsmuster der beteiligten Zelltypen während der Phasen der Proliferation, der Migration, der Matrixsynthese und der Kontraktion sind, ebenso wie die Regulation von Genen wie z. B. Wachstumsfaktoren, Rezeptoren und Matrixproteinen, bislang wenig bekannt.

So sind bisher nur wenig zufriedenstellende Therapien entwickelt worden, um bei Wundheilungstörungen eingreifen zu können. Etablierte Therapieformen beschränken sich auf physikalische Unterstützung der Wundheilung (z. B. Verbände, Kompressen, Gele) oder der Transplantation von Hautgeweben, gezüchteten Hautzellen und/oder Matrixproteinen. In den letzten Jahren sind Wachstumsfaktoren zur Verbesserung der Wundheilung erprobt worden, ohne jedoch die konventionelle Therapie entscheidend zu verbessern. Auch die Diagnose von Wundheilungsstörungen beruht auf wenig aussagekräftigen optischen Analysen der Haut, da ein tieferes Verständnis der Genregulation während der Wundheilung bisher fehlt.

Auch für andere Störungen von regenerativen Prozessen sind bisher wenig zufriedenstellende Therapien entwickelt worden. Auch hier ist die Kenntnis der Genregulation vorteilhaft für die Entwicklung von Diagnostika und Therapien. Es ist gezeigt worden (Finch et al., 1997, Am. J. Pathol. 151: 1619-28; Werner, 1998, Cytokine Growth Factor Rev. 9: 153-165, Brauchle et al., 1996, Am. J. Pathol. 149: 521-9), daß wundheilungsrelevante Gene auch bei dermatologischen Erkrankungen, die auf Störungen der Regeneration der Haut beruhen, und allgemein bei regenerativen Prozessen eine entscheidende Rolle spielen. So spielt der Wachstumsfaktor KGF nicht nur eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Proliferation und Differenzierung von Keratinozyten während der Wundheilung, sondern ist auch ein wichtiger Faktor bei der Hyperproliferation der Keratinozyten bei der Schuppenflechte (Psoriasis) und Regenerationsprozessen im Darm (bei Morbus Crohn und ulcerativer colitis).

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Polypeptide und/oder diese kodierende Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen, die an Prozessen bei Erkrankungen in Säugetierzellen, insbesondere bei Erkrankungen von Hautzellen und/oder der Wundheilung beteiligt sind, und deren Verwendung die Diagnose und/oder Behandlung sowie die Identifizierung und Entwicklung, von in Zusammenhang mit diesen Erkrankungen wirksamen Pharmazeutika entscheidend verbessert.

Bei der Analyse der Genexpression während des Wundheilungsprozesses konnten überraschenderweise Gene identifiziert werden, die bisher nicht mit Diagnose, und/oder Behandlung von Erkrankungen oder bei der Wundheilung oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen in Verbindung gebracht wurden, deren Regulation aber für den Heilungsprozeß essentiell ist und die damit im kausalen Zusammenhang mit Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen stehen. Die Polypeptide dieser Gene gehören nicht zu den bisher bekannten Zielen für die Diagnose - wie beispielsweise der Indikation - und/oder der Behandlung - wie beispielsweise der Modulation - von Erkrankungen oder für die Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, so daß sich aus dieser Erfindung völlig neue Therapieansätze ergeben.

Die Aufgabe wird daher erfindungsgemäß durch die Verwendung eines oder mehrerer Polypeptide oder funktioneller Varianten davon oder Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, vorzugsweise mit mindestens 8 Aminosäuren, insbesondere mit mindestens 12 Aminosäuren gemäß einer der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 9 oder diese kodierende Nukleinsäuren, funktioneller Varianten davon oder Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, vorzugsweise mit mindestens 18 Nukleotiden, insbesondere mit mindestens 24 Nukleotiden zur Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen gelöst.

Die genauen biologischen Funktionen der erfindungsgemäßen Polypeptide der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 9 sind unbekannt. Bei den Untersuchungen im Rahmen dieser Erfindung konnte zum ersten Mal ein Zusammenhang der erfindungsgemäßen Polypeptide mit Erkrankungen, beispielsweise Hauterkrankungen, festgestellt werden. Die Accession Numbers der erfindungsgemäßen Polypeptidsequenzen und ihrer cDNAs sind in Fig. 4 aufgelistet.

Bei der Analyse der Genexpression während des Wundheilungsprozesses konnten weitere Gene identifiziert werden, deren bereits bekannte und beschriebene Funktionen bisher nicht mit Hauterkrankungen, beispielsweise bei einer gestörten Wundheilung, in Verbindung gebracht wurden, deren Regulation aber für den Wundheilungsprozeß essentiell ist und die damit erstmals in kausalen Zusammenhang mit Hauterkrankungen, beispielsweise bei einer gestörten Wundheilung, gebracht wurden. Die Polypeptide dieser Gene gehören nicht zu den bisher bekannten Zielen von Therapien von Hauterkrankungen und/oder der Wundheilung, so daß sich aus dieser Erfindung völlig neue Therapieansätze ergeben.

Die Aufgabe der Erfindung wird weiterhin durch die Verwendung eines Polypeptids oder funktioneller Varianten davon oder Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, vorzugsweise mit mindestens 8 Aminosäuren, insbesondere mit mindestens 12 Aminosäuren gemäß einer der SEQ ID Nr. 10 bis SEQ ID Nr. 50 und SEQ ID Nr. 55 bis SEQ ID Nr. 58 oder diese kodierende Nukleinsäuren, funktioneller Varianten davon oder Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, vorzugsweise mit mindestens 18 Nukleotiden, insbesondere mit mindestens 24 Nukleotiden zur Diagnose und/oder Behandlung, beispielsweise zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung, von Hauterkrankungen oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen gelöst.

Erfindungsgemäß können folgende Polypeptide verwendet werden:

• - Das Protein Calnexin aus Maus (SEQ ID Nr. 10) oder Mensch (SEQ ID Nr. 11), das in ruhenden und sich ausdifferenzierenden Zellen negativ reguliert wird (Honore et al., 1994, Electrophoresis 15: 482-90; Olsen et al., 1995, Electrophoresis 16: 2241-8).
• - Das CREB-binding protein (CBP) aus Maus (SEQ ID Nr. 12) oder Mensch (SEQ ID Nr. 13), welches - wie das in der US 5,658,784 beschriebene und eng verwandte Gen für p300 - als Coaktivator für eine Vielzahl von an der Wachstumskontrolle und Differenzierung beteiligten Transkriptionsfaktoren, wie zum Beispiel GATA-1, p53 und E2F beschrieben ist (Blobel et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2061-6).
• - Das mas Onkogen aus Maus (SEQ ID Nr. 14) oder Mensch (SEQ ID Nr. 15) (von 't Veer et al., 1988, Oncogene Res. 3: 247-54), das in der US 5,320,941 im Zusammenhang mit einem Verfahren zur Behandlung von Tumoren beschrieben wird.
• - Das aus der JP 3254680 bekannte acylamino acid-feleasing enzyme aus dem Menschen (SEQ ID Nr. 16), das in Tumorzellen aktiviert wird (Schoenberger et al., 1986, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 24: 375-8).
• - Das in akuten promyelozytischen Leukämiezellen identifizierte und an der Zellreifung beteiligte Protein JEM-1 aus dem Menschen (SEQ ID Nr. 17) (Tong et al., 1998, Leukemia 12: 1733-40).
• - Das Cardiac Ankyrin Repeat Protein (CARP/MARP) aus Maus (SEQ ID Nr. 18) oder Mensch (SEQ ID Nr. 19), das für die Entwicklung des Herzmuskels entscheidend ist (Zou et al., 1997, Development 124: 793-804).
• - Der Transkriptionsfaktor Checkpoint suppressor 1 (CHES1) aus dem Menschen (SEQ ID Nr. 20), der verschiedene Mutationen in S. cerevisiae in Zusammenhang mit der DNA-Reparatur suprimiert und für den eine Funktion bei der Zell-Zyklus- Kontrolle vermutet wird (Pati et al., 1997, Mol. Cell. Biol 17: 3037-46).
• - Das kleine GTP Bindeprotein RAB2 aus Maus (SEQ ID Nr. 21) oder Mensch (SEQ ID Nr. 22), das eine wichtige Rolle bei der Neuronalentwicklung spielt (Ayala et al., 1990, Neuron 4: 797-805).
• - Das Nukleoporin Nup98 aus dem Menschen (SEQ ID Nr. 23), für das eine Funktion bei akuter Myeolidleukämie (AML) beschrieben ist, und in funktionellem Zusammenhang mit CBP und p300 steht (Kasper et al., 1999, Mol. Cell. Biol. 19: 764-76).
• - Der Ribonuclease L Inhibitor (Mu-RLI) aus Maus (SEQ ID Nr. 24) oder Mensch (SEQ ID Nr. 25), der in Zusammenhang mit der Ribonuclease L eine wichtige Rolle bei der antiviralen und antiproliferativen Funktion von Interferonen spielt und gewebespezifisch reguliert wird (Benoit et al., 1998, Gene 209: 149-56). Zusätzlich zu den bisher bekannten Polypeptiden von Mensch (Bisbal et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 13308-17) und Maus (De Coignac et al., 1998, Gene 209: 149-­ 56) können auch die in dieser Arbeit erstmals erwähnten eng verwandten Polypeptide mit abweichender Sequenz verwendet werden (SEQ ID Nr. 27 und SEQ ID Nr. 26).
• - Die p68 Helikase aus Maus (SEQ ID Nr. 28) oder Mensch (SEQ ID Nr. 29), die als im Zellkern lokalisierte DNA oder RNA-Helikase beschrieben ist und an der für das Zellwachstum nötigen Replikation, Transkription oder RNA-Prozessierung beteiligt sein könnte (Ford et al., 1988, Nature 332: 736-8). Zusätzlich zu der bekannten Polypeptidvariante aus der Maus (SEQ ID Nr. 28) (Lemaire und Heinlein, 1993, Life Sci. 52: 917-26) kann auch das in dieser Arbeit erstmals erwähnte eng verwandte Polypeptid mit abweichender Sequenz verwendet werden (SEQ ID Nr. 30).
• - Das Keratin assoziierte Protein mKAP13 (auch PMG-1) aus der Maus (SEQ ID Nr. 31), dessen Transskript hautspezifisch in der keratogenen Zone der Cortikalzellen der Haarfollikel exprimiert wird und spezifisch für die Keratinisierung der cortikalen Zellage im Maushaar ist (Aoki et al., 1998, J. Invest. Dermatol. 111: 804-9). Zusätzlich zu dem bekannten Polypeptid aus der Maus kann auch das in dieser Arbeit erstmals erwähnte Polypeptid aus dem Menschen verwendet werden (Beispiel 7, SEQ ID Nr. 55).
• - Das ebenfalls in wachsenden Haarfollikeln exprimierte Protein PMG-2 aus der Maus (SEQ ID Nr. 32), das zusammen mit PMG-1 als an der Differenzierung aller Epithelzellen beteiligt beschrieben ist, die epidermalen Anhänge bilden (Kuhn et al., 1999, Mech. Dev 86: 193-196).
• - Das an der Apoptose beteiligte Protein MA-3 aus Maus (SEQ ID Nr. 33) oder Mensch (SEQ ID Nr. 34) (Shibahara et al., 1995, Gene 166: 297-301). Zusätzlich zu dem bekannten Polypeptid aus dem Menschen kann auch das in dieser Arbeit erhaltene Polypeptid aus dem Menschen verwendet werden (SEQ ID Nr. 58).
• - Das antiproliferative Protein BTG1 aus Maus (SEQ ID Nr. 35) oder Mensch (SEQ ID Nr. 36), für das eine hohe Expression in absterbenden Zellen und eine Funktion bei der Regulation des Zellstatus von fortgeschrittenen atherosklerotischen Läsionen beschrieben ist (Corjay et al., 1998, Lab. Invest. 78: 847-58).
• - Das in der Epidermis weit verbreitet exprimierte CD9 aus Maus (SEQ ID Nr. 37) oder Mensch (SEQ ID Nr. 38), das mit beta 1 Integrinen Komplexe bildet und für das eine Rolle bei der Regulation der Motilität und Differenzierung von Keratinozyten vermutet wird (Jones et al., 1996, Cell Adhes. Commun. 4: 297-305).
• - Die Stearoyl-CoA Desaturase (SCD1) aus Maus (SEQ ID Nr. 39) oder Mensch (SEQ ID Nr. 40), die durch den nuclear factor 1 (NF 1) reguliert wird und an der Differenzierung von Präadipocyten zu Adipocyten beteiligt ist (Singh und Ntambi, 1998, Biochim. Biophys. Acta 1398: 148-56).
• - Das an der fokalen Adhäsion von Fibroblasten beteiligte Protein Syndecan 4 (Ryudocan) aus Maus (SEQ ID Nr. 41) oder Mensch (SEQ ID Nr. 42), das als Transmembran-Adhäsionskomponente beschrieben ist (Woods und Couchman, 1994, Mol. Biol. Cell., 5: 183-92).
• - Das zu der Klasse der E2A basischen Helix-Loop-Helix Transkriptionsfaktoren gehörende Protein ALF 1 aus Maus (SEQ ID Nr. 43) oder Mensch (SEQ ID Nr. 44), das das Wachstum von Mausfibroblasten reguliert (Loveys et al., 1996, Nucleic. Acids Res. 24: 2813-20).
• - Die potentiell pränylierte Protein Tyrosinphosphatase (PRL) aus Maus (SEQ ID Nr. 45) oder Mensch (SEQ ID Nr. 46), die in Zusammenhang mit der Signaltransduktion in der sich regenerierenden Leber und dem Muskelwachstum insbesondere des Herzens beschrieben ist (Zeng et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 244: 421-7).
• - Nuclear factor (NF1-B) aus Maus (SEQ ID Nr. 47) oder Mensch (SEQ ID Nr. 48), der in Zusammenhang mit alternativem splicing beschrieben ist und dessen Funktion bei der Onkogenese in Huhn-Fibroblasten untersucht wurde (Schuur et al., 1995, Cell Growth Differ. 6: 219-27).
• - Die Cystein Proteinase Cathepsin Z aus Maus (SEQ ID Nr. 56) oder Mensch (SEQ ID Nr. 57), für die eine Teilnahme am Tumorwachstum vermutet wird (Santamaria et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 16818-23).
• - Weiterhin kann erfindungsgemäß die cDNA für den sogenannten Steroid Receptor Coaktivator aus Maus (SEQ ID Nr. 49) oder Mensch (SEQ ID Nr. 50) verwendet werden, dessen mRNA nicht translatiert wird und als RNA funktionell ist. Die Steroid Receptor Coaktivator wird als lediglich in Zusammenhang mit Steroidhormon-Rezeptoren aktiv beschrieben (Steroid Receptor Coaktivator: Lanz et al., 1999, Cell 97: 17-27). Ein Zusammenhang mit Hauterkrankungen war bisher unbekannt.

Für keines dieser Polypeptide, deren kodierende Nukleinsäure oder der beschriebenen cDNA wurde bisher ein Zusammenhang mit Hauterkrankungen, beispielsweise bei einer gestörten Wundheilung, beschrieben oder nahegelegt. Es war daher unerwartet, daß diese Verbindungen erfindungsgemäß verwendet werden können. Die Accession Numbers der erfindungsgemäßen Polypeptide und ihrer cDNAs sind in Fig. 5 aufgeführt.

Bei der Analyse der Genexpression während des Wundheilungsprozesses konnten zusätzlich Gene identifiziert werden, deren bereits bekannte und beschriebene Funktionen bisher nicht mit der Wundheilung in Verbindung gebracht wurden, deren Regulation aber für den Wundheilungsprozeß essentiell ist und die damit erstmals in kausalen Zusammenhang mit der Wundheilung gebracht wurden. Die Polypeptide dieser Gene gehören nicht zu den bisher bekannten Zjelen von Therapien in Zusammenhang mit der krankhaften Veränderung der Wundheilung, so daß sich aus dieser Erfindung völlig neue Therapieansätze ergeben.

Die Aufgabe der Erfindung wird daher zusätzlich durch die Verwendung eines Polypeptids oder funktioneller Varianten davon oder Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, vorzugsweise mit mindestens 8 Aminosäuren, insbesondere mit mindestens 12 Aminosäuren gemäß einer der SEQ ID Nr. S 1 bis SEQ ID Nr. 54 oder dieses kodierende Nukleinsäure, funktioneller Varianten davon oder Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, vorzugsweise mit mindestens 18 Nukleotiden, insbesondere mit mindestens 24 Nukleotiden zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen oder zur Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung gelöst.

Erfindungsgemäß können folgende Polypeptide verwendet werden:

• - Die SR calcium ATPase (SERCA) der Maus (SEQ ID Nr. 51) oder des Menschen (SEQ ID Nr. 52), die in Zusammenhang mit dem Muskelwachstum des Herzens beschrieben ist (Baker et al., 1998, Nucleic Acids Res., 26: 1092-8). Weiterhin ist ein Zusammenhang von SERCA mit Darier's disease, einer Hautkrankheit beschrieben worden (Sakuntabhai et al., 1999, Nat. Genet. 21: 271-7).
• - Das bei entzündlicher Dermatose nach Läsionen der Haut exprimierte Protein Calgranulin (MRP8) der Maus (SEQ ID Nr. 53) oder des Menschen (SEQ ID Nr. 54), (Kelly et al., 1989, J. Pathol. 159: 17-21), dessen Beteiligung an der Wundheilung bisher auch unbekannt war.

Für keines dieser Polypeptide oder diese kodierende Nukleinsäuren wurde bisher ein Zusammenhang mit der Wundheilung beschrieben oder nahegelegt. Es war daher unerwartet, daß diese Polypeptide erfindungsgemäß verwendet werden können. Die Accession Numbers der erfindungsgemäßen Polypeptide und ihrer cDNAs sind in Fig. 6 aufgeführt.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können weiterhin dadurch gekennzeichnet sein, daß diese synthetisch hergestellt werden. So kann das gesamte Polypeptid oder Teile davon zum Beispiel mit Hilfe der klassischen Synthese (Merrifield- Technik) synthetisiert werden. Teile der erfindungsgemäßen Polypeptide eignen sich insbesondere zur Gewinnung von Antiseren, mit deren Hilfe geeignete Genexpressionsbanken durchsucht werden können, um so zu weiteren funktionellen Varianten des erfindungsgemäßen Polypeptids zu gelangen.

Unter dem Begriff "funktionelle Varianten" im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man Polypeptide, die funktionell mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden verwandt sind, d. h. während regenerativen Prozessen der Haut reguliert werden und/oder Strukturmerkmale der Polypeptide aufweisen. Beispiele funktioneller Varianten sind die entsprechenden Polypeptide, die aus anderen Organismen als dem Menschen bzw. der Maus, vorzugsweise aus nicht- menschlichen Säugetieren wie z. B. Affen, Schweinen und Ratten stammen. Andere Beispiele funktioneller Varianten sind Polypeptide, die durch unterschiedliche Allele des Gens, in verschiedenen Individuen oder in verschiedenen Organen eines Organismus kodiert werden (siehe Beispiel 6).

Im weiteren Sinne versteht man darunter auch Polypeptide, die eine Sequenzhomologie, insbesondere eine Sequenzidentität, von ca. 70%, vorzugsweise ca. 80%, insbesondere ca. 90%, vor allem ca. 95% zu dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß einer der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 58 und/oder anhand der DNA Sequenzen der öffentlich zugänglichen Datenbankeinträge der Liste in den Fig. 4 bis 6 aufweisen. Darunter zählen beispielsweise Polypeptide, die von einer Nukleinsäure kodiert werden, die aus nicht-wundheilungsspezifischen Gewebe, z. B. Embryonalgewebe, isoliert werden, jedoch nach Expression in einer an der Wundheilung beteiligten Zelle die bezeichneten Funktionen besitzen. Ferner zählen hierzu auch Deletionen oder Teile des Polypeptids im Bereich von ca. 1-60, vorzugsweise von ca. 1-30, insbesondere von ca. 1-15, vor allem von ca. 1-5 Aminosäuren. Beispielsweise kann die erste Aminosäure Methionin fehlen, ohne daß die Funktion des Polypeptids wesentlich verändert wird.

Bevorzugterweise handelt es sich bei den erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäuren um DNA oder RNA, vorzugsweise eine DNA, insbesondere eine doppelsträngige DNA. Weiterhin kann die Sequenz der Nukleinsäuren dadurch gekennzeichnet sein, daß sie mindestens ein Intron und/oder eine polyA-Sequenz aufweist. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können auch in Form ihrer antisense-Sequenz verwendet werden.

Für die Expression des betreffenden Gens ist im allgemeinen eine doppelsträngige DNA bevorzugt, wobei der für das Polypeptid kodierende DNA-Bereich besonders bevorzugt ist. Dieser Bereich beginnt mit dem ersten in einer Kozak Sequenz (Kozak, 1987, Nucleic. Acids Res. 15: 8125-48) liegenden Start-Codon (ATG) bis zum nächsten Stop-Codon (TAG, TGA bzw. TAA), das im gleichen Leseraster zum ATG liegt.

Eine weitere Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen ist die Konstruktion von anti-sense Oligonukleotiden (Zheng und Kemeny, 1995, Clin. Exp. Immunol. 100: 380-2; Nellen und Lichtenstein, 1993, Trends Biochem. Sci. 18: 419-23; Stein, 1992, Leukemia 6: 967-74) und/oder Ribozymen (Amarzguioui, et al. 1998, Cell. Mol. Life Sci. 54: 1175-202; Vaish, et al., 1998, Nucleic Acids Res. 26: 5237-42; Persidis, 1997, Nat. Biotechnol. 15: 921-2; Couture und Stinchcomb, 1996, Trends Genet. 12: 510^-5). Mit anti-sense Oligonukleotiden kann man die Stabilität der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verringern und/oder die Translation der erfindungsgemäßen Nukleinsäure inhibieren. So kann beispielsweise die Expression der entsprechenden Gene in Zellen sowohl in vivo als auch in vitro verringert werden. Oligonukleotide können sich daher als Therapeutikum eignen. Diese Strategie eignet sich beispielsweise auch für Haut, epidermale und dermale Zellen, insbesondere, wenn die antisense Oligonukleotide mit Liposomen komplexiert werden (Smyth et al., 1997, J. Invest. Dermatol. 108: 523-6; White et al., 1999, J. Invest. Dermatol. 112: 699-705; White et al., 1999, J. Invest. Dermatol. 112: 887-92). Für die Verwendung als Sonde oder als "antisense" Oligonukleotid ist eine einzelsträngige DNA oder RNA bevorzugt.

Weiterhin kann zur Durchführung der Erfindung eine Nukleinsäure verwendet werden, die synthetisch hergestellt worden ist. So kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure beispielsweise chemisch anhand der in den Fig. 4 bis 6 beschriebenen DNA Sequenzen und/oder anhand der in diesen Figuren ebenfalls beschriebenen Proteinsequenzen unter Heranziehen des genetischen Codes z. B. nach der Phosphotriester-Methode synthetisiert werden (siehe z. B. Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Revievs, 90, 543-584, No. 4).

Oligonukleotide werden in der Regel schnell durch Endo- oder Exonukleasen, insbesondere durch in der Zelle vorkommende DNasen und RNasen, abgebaut. Deshalb ist es vorteilhaft, die Nukleinsäure zu modifizieren, um sie gegen den Abbau zu stabilisieren, so daß über einen langen Zeitraum eine hohe Konzentration der Nukleinsäure in der Zelle beibehalten wird (Beigelman et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23: 3989-94; Dudycz, 1995, WO9511910; Macadam et al., 1998, WO9837240; Reese et al., 1997, WO9729116). Typischerweise kann eine solche Stabilisierung durch die Einführung von einer oder mehrerer Internukleotid-Phosphorgruppen oder durch die Einführung einer oder mehrerer Nicht-Phosphor-Internukleotide, erhalten werden.

Geeignete modifizierte Internukleotide sind in Uhlmann und Peymann (1990 Chem. Rev. 90, 544) zusammengefaßt (siehe auch Beigelman et al., 1995 Nucleic Acids Res. 23: 3989-94; Dudycz, 1995, WO 95/11910; Macadam et al., 1998, WO 98/37240; Reese et al., 1997, WO 97/29116). Modifizierte Internukleotid- Phosphatreste und/oder Nicht-Phosphorbrücken in einer Nukleinsäure, die bei einer der erfindungsgemäßen Verwendungen eingesetzt werden können, enthalten zum Beispiel Methylphosphonat, Phosphorothioat, Phosphoramidat, Phosphorodithioat, Phophatester, während Nicht-Phosphor-Internukleotid- Analoge, beispielsweise Siloxanbrücken, Carbonatbrücken, Carboxymethylester, Acetamidatbrücken und/oder Thioetherbrücken enthalten. Es ist auch beabsichtigt, daß diese Modifizierung die Haltbarkeit einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die bei einer der erfindungsgemäßen Verwendungen eingesetzt werden kann, verbessert.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zur Herstellung eines Vektors, vorzugsweise in Form eines shuttle Vektors, Phagemids, Cosmids, Expressionsvektors oder gentherapeutisch wirksamen Vektors verwendet. Weiterhin können unter der Verwendung der Nukleinsäuren knock-out Genkonstrukte oder Expressionskassetten hergestellt werden.

So kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einem Vektor vorzugsweise in einem Expressionsvektor oder gentherapeutisch wirksamen Vektor enthalten sein. Vorzugsweise enthält der gentherapeutisch wirksame Vektor wund- bzw. hautspezifische regulatorische Sequenzen, die funktionell mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verbunden sind.

Die Expressionsvektoren können prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren sein. Beispiele für prokaryotische Expressionsvektoren sind für die Expression in E coli z. B. die Vektoren pGEM oder pUC-Derivate und für eukaryotische Expressionsvektoren für die Expression in Saccharomyces cerevisiae z. B. die Vektoren p426Met25 oder p426GAL 1 (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768), für die Expression in Insektenzellen z. B. Baculovirus-Vektoren wie in EP-B1-0 127 839 oder EP-B1-0 549 721 offenbart, und für die Expression in Säugerzellen z. B. die Vektoren Rc/CMV und Rc/RSV oder SV40-Vektoren, welche alle allgemein erhältlich sind.

Im allgemeinen enthalten die Expressionsvektoren auch für die jeweilige Wirtszelle geeignete Promotoren, wie z. B. den trp-Promotor für die Expression in E. coli (siehe z. B. EP-B1-0 154 133), den Met 25, GAL 1 oder ADH₂-Promotor für die Expression in Hefen (Russel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674-2682; Mumberg, supra), den Baculovirus-Polyhedrin-Promotor, für die Expression in Insektenzellen (siehe z. 13. EP-B1-0 127 839). Für die Expression in Säugetierzellen sind beispielsweise Promotoren geeignet, die eine konstitutive, regulierbare, gewebsspezifische, zellzyklusspezifische oder metabolischspezifische Expression in eukaryotischen Zellen erlauben. Regulierbare Elemente gemäß der vorliegenden Erfindung sind Promotoren, Aktivatorsequenzen, Enhancer, Silencer und/oder Repressorsequenzen.

Beispiel für geeignete regulierbare Elemente, die konstitutive Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren, die von der RNA Polymerase III erkannt werden oder virale Promotoren, CMV-Enhancer, CMV-Promotor, SV40 Promotor oder LTR-Promotoren z. B. von MMTV (mouse mammary tumour virus; Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232) und weitere virale Promotor- und Aktivatorsequenzen, abgeleitet aus beispielsweise HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV oder HIV.

Beispiele für regulierbare Elemente, die regulierbare Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind der Tetracyclinoperator in Kombination mit einem entsprechenden Repressor (Gossen M. et al. (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20).

Vorzugsweise erfolgt die Expression von wundheilungsrelevanten Genen unter der Kontrolle von gewebespezifischen Promotoren, wobei hautspezifische Promotoren wie beispielsweise der humane K10 Promotor (Bailleul et al., 1990. Cell 62: 697-708), der humane K14 Promotor (Vassar et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1563-67) oder der bovine Cytokeratin IV Promotor (Fuchs et al., 1988; The biology of wool and hair (Hrsg.: G. E. Rogers, et al.), S. 287-309. Chapman und Hall, LondonlNew York) besonders zu bevorzugen sind.

Weitere Beispiele für regulierbare Elemente, die gewebsspezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancern von solchen Genen, die für Proteine kodieren, die nur in bestimmten Zelltypen exprimiert werden.

Beispiele für regulierbare Elemente, die zellzyklusspezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren folgender Gene: cdc25, Cyclin A, Cyclin E, cdc2, E2F, B-myb oder DHFR (Zwicker J. und Müller R. (1997) Trends Genet. 13, 3-6).

Beispiele für regulierbare Elemente, die metabolischspezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren, die durch Hypoxie, durch Glukosemangel, durch Phosphatkonzentration oder durch Hitzeschock reguliert werden.

Um die Einführung von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und damit die Expression des Polypeptids in einer eu- oder prokaryotischen Zelle durch Transfektion, Transformation oder Infektion zu ermöglichen, kann die Nukleinsäure als Plasmid, als Teil eines viralen oder nicht-viralen Vektors vorliegen. Als virale Vektoren eignen sich hierbei besonders: Baculoviren, Vakziniaviren, Adenoviren, adenoassoziierte Viren und Herpesviren. Als nicht­ virale Vektoren eignen sich hierbei besonders: Virosomen, Liposomen, kationische Lipide, oder poly-Lysin konjugierte DNA.

Beispiele von gentherapeutisch wirksamen Vektoren sind Virusvektoren, beispielsweise Adenovirusvektoren oder retroviralen Vektoren (Lindemann et al., 1997, Mol. Med. 3: 466-76; Springer et al., 1998, Mol. Cell. 2: 549-58). Eukaryotische Expressionsvektoren eignen sich in isolierter Form für die gentherapeutische Anwendung, da nackte DNA bei topischer Applikation in Hautzellen eindringen kann (Hengge et al., 1996, J. Clin. Invest. 97: 2911-6; Yu et al., 1999, J. Invest. Dermatol. 112: 370-5).

Gentherapeutisch wirksame Vektoren lassen sich auch dadurch erhalten, daß man die erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Liposomen komplexiert, da damit eine sehr hohe Transfektionseffizienz, insbesondere von Hautzellen, erreicht werden kann (Alexander und Akhurst, 1995, Hum. Mol. Genet. 4: 2279-85). Bei der Lipofektion werden kleine unilamellare Vesikel aus kationischen Lipiden durch Ultraschallbehandlung der Liposomensuspension herstellt. Die DNA wird ionisch auf der Oberfläche der Liposomen gebunden, und zwar in einem solchen Verhältnis, daß eine positive Nettoladung verbleibt und die Plasmid-DNA zu 100% von den Liposomen komplexiert wird. Neben den von Felgner et al. (1987, supra) eingesetzten Lipidmischungen DOTMA (1,2-Dioleyloxpropyl-3- trimethylammoniumbromid) und DPOE (Dioleoylphosphatidylethanolamin) wurden inzwischen zahlreiche neue Lipidformulierungen synthetisiert und auf ihre Effizienz der Transfektion verschiedener Zellinien getestet (Behr, J. P. et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6986; Felgner, J. H. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550-2561; Gao, X. & Huang, L. (1991), Biochim. Biophys. Acta 1189, 195-203). Beispiele der neuen Lipidformulierungen sind DOTAP N- [1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumethylsulfat oder DOGS (TRANSFECTAM; Dioctadecylamidoglycylspermin). Hilfsstoffe, die den Transfer von Nukleinsäuren in die Zelle erhöhen, können beispielsweise Proteine oder Peptide, die an DNA gebunden sind oder synthetische Peptid-DNA- Moleküle, die den Transport der Nukleinsäure in den Kern der Zelle ermöglichen, sein (Schwartz et al. (1999) Gene Therapy 6, 282; Brandén et al. (1999) Nature Biotech. 17, 784). Hilfsstoffe umfassen auch Moleküle, die die Freisetzung von Nukleinsäuren in das Cytoplasma der Zelle ermöglichen (Planck et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 12918; Kichler et al. (1997) Bioconj. Chem. 8, 213) oder beispielsweise Liposomen (Uhlmann und Peymann (1990) supra). Eine andere besonders geeignete Form von gentherapeutischen Vektoren läßt sich dadurch erhalten, daß man die erfindungsgemäße Nukleinsäure auf Goldpartikeln aufbringt und diese mit Hilfe der sogenannten "Gene Gun" in Gewebe, bevorzugt in die Haut, oder Zellen schießt (Wang et al., 1999, J. Invest. Dermatol., 112: 775-81, Tuting et al., 1998, J. Invest. Dermatol. 111: 183-8).

Eine weitere Form eines gentherapeutisch wirksamen Vektors läßt sich durch das Einbringen von "nackten" Expressionsvektoren in eine biokompatible Matrix, beispielsweise eine Kollagenmatrix, herstellen. Diese Matrix kann in Wunden eingebracht werden, um die einwandernden Zellen mit dem Expressionsvektor zu transfizieren und die erfindungsgemäßen Polypeptide in den Zellen zu exprimieren (Goldstein und Banadio, US 5,962,427).

Für die gentherapeutische Anwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist es auch von Vorteil, wenn der Teil der Nukleinsäure, der für das Polypeptid kodiert, ein oder mehrere nicht kodierende Sequenzen einschließlich Intronsequenzen, vorzugsweise zwischen Promotor und dem Startcodon des Polypeptids, und/oder eine polyA-Sequenz, insbesondere die natürlich vorkommende polyA-Sequenz oder eine SV40 Virus polyA-Sequenz, vor allem am 3'-Ende des Gens enthält, da hierdurch eine Stabilisierung der mRNA erreicht werden kann (Jackson, R. J. (1993) Cell 74, 9-14 und Palmiter, R. D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 478-482).

Knockout Genkonstrukte sind dem Fachmann zum Beispiel aus den US-Patenten 5,625,122; US 5,698,765; US 5,583,278 und US 5,750,825 bekannt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle, insbesondere eine Hautzelle, die mit einem erfindungsgemäßen Vektor oder einem knock-out Genkonstrukt transformiert ist. Wirtszellen können sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen sein, Beispiele für prokaryotische Wirtszellen sind E. coli und für eukaryotische Zellen Saccharomyces cerevisiae oder Insektenzellen.

Ein besonders bevorzugte transformierte Wirtszelle ist eine transgene embryonale nichtmenschliche Stammzelle, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie ein erfindungsgemäßes knock-out Genkonstrukt oder eine erfindungsgemäße Expressionskassette umfaßt. Verfahren zur Transformation von Wirtszellen und/oder Stammzellen sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen zum Beispiel Elektroporation oder Mikroinjektion.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein transgenes nichtmenschliches Säugetier, dessen Genom ein erfindungsgemäßes knock-out Genkonstrukt oder eine erfindungsgemäße Expressionskassette umfaßt. Transgene Tiere zeigen im allgemeinen eine gewebespezifisch erhöhte Expression der Nukleinsäuren und/oder Polypeptide und lassen sich zur Analyse von Wundheilungsstörungen verwenden. So weist beispielsweise eine Activin A transgene Maus eine verbesserte Wundheilung auf (Munz et al., 1999, EMBO J. 18: 5205-15) während eine transgene Maus mit dominant negativem KGF Rezeptor eine verzögerte Wundheilung aufweist (Werner et al., 1994, Science 266: 819-22).

Verfahren zur Herstellung von transgenen Tieren, insbesondere der Maus, sind dem Fachmann ebenfalls aus der DE 196 25 049 und den US 4,736,866; US 5,625,122; US 5,698,765; US 5,583,278 und US 5,750,825 bekannt und umfassen transgene Tiere, die beispielsweise über direkte Injektion von Expressionsvektoren (s.o.) in Embryonen oder Spermatozyten oder über die Transfektion von Expressionsvektoren in embryonaler Stammzellen erzeugt werden können (Polites und Pinkert: DNA Microinjection and Transgenic Animal Produktion, Seite 1 5 bis 68 in Pinkert, 1994: Transgenic animal technology: a laboratory handbook, Academic Press, London, UK; Houdebine, 1997, Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands; Doetschman: Gene Transfer in Embryonic Stern Cells, Seite 115 bis 146 in Pinkert, 1994, supra; Wood: Retrovirus-Mediated Gene Transfer, Seite 147 bis 176 in Pinkert, 1994, supra; Monastersky: Gene Transfere Technology: Alternative Techniques and Applications, Seite 177 bis 220 in Pinkert, 1994, supra).

Werden erfindungsgemäße Nukleinsäuren in sogenannte Targeting Vektoren intergriert (Pinkert, 1994, supra) können nach Transfektion von embryonalen Stammzellen und homologer Rekombination beispielsweise knock-out Mäuse generiert werden, die im allgemeinen als heterozygote Mäuse verringerte Expression der Nukleinsäure zeigen, während homozygote Mäuse keine Expression der Nukleinsäure mehr aufweisen. Auch die so erzeugten Tiere lassen sich zur Analyse von Wundheilungsstörungen verwenden. So weisen beispielsweise die eNOS- (Lee et al., 1999, Am. J. Physiol. 277: H1600-H1608), Nf-1 (Atit et al., 1999, J. Invest. Dermatol. 112: 835-42) und Osteopontin (Liaw et al., 1998, J. Clin. Invest. 101: 967-71) knock-out Mäuse eine verschlechterte Wundheilung auf. Auch hier ist eine gewebespezifische Reduktion der Expression wundheilungsrelevanter Gene, beispielsweise in hautspezifischen Zellen unter Verwendung des Cre-loxP Systems (stat3 knock-out, Sano et al., EMBO J 1999 18: 4657-68), besonders zu bevorzugen. So erzeugte transgene und knock-out Zellen oder Tiere lassen sich auch zum Screening und zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen bzw. gentherapeutisch aktiven Vektoren verwenden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids zur Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Behandlung bei der Wundheilung oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen in einer geeigneten Wirtszelle, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine erfindungsgemäße Nukleinsäure verwendet wird.

Das Polypeptid wird beispielsweise durch Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einem geeigneten Expressionssystem, wie oben bereits beschrieben, nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden hergestellt. Als Wirtszellen eignen sich beispielsweise die E. coli Stämme DHS, HB101 oder BL21, der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae, die Insektenzellinie Lepidopteran, z. B. von Spodoptera frugiperda, oder die tierischen Zellen COS, Vero, 293, HaCaT, und HeLa, die alle allgemein erhältlich sind.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins zur Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Behandlung bei der Wundheilung oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen in einer geeigneten Wirtszelle, bei dem eine erfindungsgemäße Nukleinsäure verwendet wird.

Hergestellt werden hierbei Fusionsproteine, die die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Polypeptide enthalten, wobei die Fusionsproteine selbst bereits die Funktion eines Polypeptids der Erfindung aufweisen oder erst nach Abspaltung des Fusionsanteils die spezifische Funktion funktionell aktiv sind. Vor allem zählen hierzu Fusionsproteine mit einem Anteil von ca. 1-200, vorzugsweise ca. 1-150, insbesondere ca. 1-100, vor allem ca. 1-50 fremden Aminosäuren. Beispiele solcher Peptidsequenzen sind prokaryotische Peptidsequenzen, die z. B. aus der Galactosidase von E coli abgeleitet sein können. Weiterhin können auch virale Peptidsequenzen, wie zum Beispiel vom Bakteriophagen M13 verwendet werden, um so Fusionsproteine für das dem Fachmann bekannte "phage display"-Verfahren zu erzeugen.

Zur Aufreinigung der erfindungsgemäßen Proteine kann ein weiteres/weiterer Polypeptid("tag") angefügt sein. Erfindungsgemäße Protein-tags erlauben beispielsweise die hochaffine Absorption an eine Matrix, stringentes Waschen mit geeigneten Puffern, ohne den Komplex in nennenswertem Maße zu eluieren und anschließend gezielte Elution des absorbierten Komplexes. Beispiele der dem Fachmann bekannten Protein-tags sind ein (His)6-tag, ein Myc-tag, eine FLAG­ tag, ein Hämagluteinin-tag, Glutathion-Transferase (GST)-tag, Intein mit einem Affinitäts-Chintin-binding-tag oder Maltose-binding protein (MBP)-tag. Diese Protein-tags können sich N-, C-terminal und/oder intern befinden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, vorzugsweise eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers zur Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Behandlung bei der Wundheilung oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, bei dem ein Polypeptid oder funktionelle Äquivalente davon oder Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, vorzugsweise mit mindestens 8 Aminosäuren, insbesondere mit mindestens 12 Aminosäuren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird.

Das Verfahren erfolgt nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden durch Immunisieren eines Säugetiers, beispielsweise eines Kaninchens, mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid oder den genannten Teilen davon, gegebenenfalls in Anwesenheit von z. B. Freunds Adjuvant und/oder Aluminiumhydroxidgelen (siehe z. B. Diamond, B. A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344-1349). Die im Tier aufgrund einer immunologischen Reaktion entstandenen polyklonalen Antikörper lassen sich anschließend nach allgemein bekannten Methoden leicht aus dem Blut isolieren und z. B. über Säulenchromatographie reinigen. Monoklonale Antikörper können beispielsweise nach der bekannten Methode von Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299) hergestellt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper zur Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Behandlung bei der Wundheilung oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, der gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid gerichtet ist und mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden spezifisch reagiert, wobei die oben genannten Teile des Polypeptids entweder selbst immunogen sind oder durch Kopplung an geeignete Träger, wie z. B. bovines Serumalbumin, immunogen gemacht bzw. in ihrer Immunogenität gesteigert werden können. Dieser Antikörper ist entweder polyklonal oder monoklonal, bevorzugt ist ein monoklonaler Antikörper. Unter dem Begriff Antikörper versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung auch gentechnisch hergestellte und gegebenenfalls modifizierte Antikörper bzw. antigenbindende Teile davon, wie z. B. chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, multifunktionelle Antikörper, bi- oder oligospezifische Antikörper, einzelsträngige Antikörper, F(ab)- oder F(ab)₂-Fragmente (siehe z. B. EP-B1-0 368 684, US 4,816,567, US 4,816,397, WO 88/01649, WO 93/06213, WO 98/24884).

Die erfindungsgemäßen Antikörper können zur Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Behandlung bei der Wundheilung oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen verwendet werden.

So kann beispielsweise die lokale Injektion von monoklonalen Antikörpern gegen TGF beta 1 im Tiermodell die Wundheilung verbessern (Ernst et al., 1996, Gut 39: 172-5).

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen und/oder Erkrankungen bei der Wundheilung, bei dem mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens ein Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen kombiniert wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein nach diesem Verfahren hergestelltes Arzneimittel zur Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen und/oder Erkrankungen bei der Wundheilung, das mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens einen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, enthält. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung dieses Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen und/oder Erkrankungen bei der Wundheilung.

Die Therapie der Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen und/oder Erkrankungen bei der Wundheilung kann auf herkömmliche Weise, z. B. durch Verbände, Pflaster, Kompressen oder Gele erfolgen, die die erfindungsgemäßen Arzneimittel enthalten. So ist es möglich, die geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe, wie z. B. physiologische Kochsalzlösung, entmineralisiertes Wasser, Stabilisatoren, Proteinaseinhibitoren, Gelformulierungen, wie z. B. weiße Vaseline, dünnflüssiges Paraffin und/oder gelbes Wachs, etc., enthaltenden Arzneimittel topisch und lokal zu verabreichen, um die Wundheilung sofort und unmittelbar zu beeinflussen. Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Arzneimittel kann weiterhin gegebenenfalls in Form von Liposomenkomplexen bzw. Goldpartikelkomplexen ebenfalls topisch und lokal im Bereich der Wunde erfolgen. Weiterhin kann die Behandlung mittels eines transdermalen therapeutischen Systems (TTS) erfolgen, das eine zeitlich gesteuerte Abgabe der erfindungsgemäßen Arzneimittel ermöglicht. Die Behandlung mittels der erfindungsgemäßen Arzneimittel kann aber auch über orale Dosierungsformen, wie z. B. Tabletten oder Kapseln, über die Schleimhäute, zum Beispiel der Nase oder der Mundhöhle, oder in Form von unter die Haut implantierten Dispositorien erfolgen. TTS sind zum Beispiel aus den EP 0 944 398 A1, EP 0 916 336 A1, EP 0 889 723 A1 oder EP 0 852 493 A1 bekannt.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Erkrankungen bei der Wundheilung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens ein Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, verwendet wird.

Beispielsweise kann gemäß der vorliegenden Erfindung anhand einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure ein Diagnostikum auf der Basis der Polymerasekettenreaktion (Beispiel 5, PCR-Diagnostik, z. B. gemäß EP 0 200 362) oder eines RNase-Protection-Assays, wie in Beispiel 4 näher dargestellt, hergestellt werden. Diese Tests beruhen auf der spezifischen Hybridisierung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit dem komplementären Gegenstrang, üblicherweise der entsprechenden mRNA. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann hierbei auch modifiziert sein, wie z. B. in EP 0 063 879 beschrieben. Vorzugsweise wird ein erfindungsgemäßes DNA-Fragment mittels geeigneter Reagenzien, z. B. radioaktiv mit α-P³²-dCTP oder nicht-radioaktiv mit Biotin oder Digoxigenin, nach allgemein bekannten Methoden markiert und mit isolierter RNA, die vorzugsweise vorher an geeignete Membranen aus z. B. Cellulose oder Nylon gebunden wurde, inkubiert. Bei gleicher Menge an untersuchter RNA aus jeder Gewebeprobe kann somit die Menge an mRNA bestimmt werden, die spezifisch durch die Sonde markiert wurde. Alternativ kann die Bestimmung an mRNA auch in Gewebeschnitten mit Hilfe der in situ Hybridisierung (siehe z. B. Werner et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6896-900) erfolgen.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Diagnostikums kann somit auch eine Gewebeprobe in vitro auf die Expressionsstärke des korrespondierenden Gens spezifisch gemessen werden, um eine mögliche Wundheilungsstörung oder dermatologische Erkrankungen sicher diagnostizieren zu können (Beispiele 4 und 5). Insbesondere eignet sich ein solches Verfahren zur frühzeitigen Prognose von Störungen. Dies ermöglicht einen präventiven Therapieeinsatz und die Analyse von Prädispositionen. So ist die Expression des Gens spi2 schon im nicht verwundeten Zustand in der intakten Haut verringert, die nach Verwundung Wundheilungsstörungen aufwies. Die Expression des Gens spi2 ermöglicht daher eine Voraussage der Wundheilungsstörung noch im intakten Gewebe.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Diagnostikum zur Diagnose von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Erkrankungen bei der Wundheilung, das mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens einen Antikörper gemäß der Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, umfaßt.

Ein weiteres erfindungsgemäßes Diagnostikum enthält das erfindungsgemäße Polypeptid bzw. die oben näher beschriebenen immunogenen Teile davon. Das Polypeptid bzw. die Teile davon, die vorzugsweise an eine Festphase, z. B. aus Nitrocellulose oder Nylon, gebunden sind, können beispielsweise mit der zu untersuchenden Körperflüssigkeit, z. B. Wundsekret, in vitro in Berührung gebracht werden, um so beispielsweise mit Autoimmunantikörper reagieren zu können. Der Antikörper-Peptid-Komplex kann anschließend beispielsweise anhand markierter Antihuman-IgG- oder Antihuman-IgM-Antikörper nachgewiesen werden. Bei der Markierung handelt es sich beispielsweise um ein Enzym, wie Peroxidase, das eine Farbreaktion katalysiert. Die Anwesenheit und die Menge an anwesenden Autoimmunantikörper kann somit über die Farbreaktion leicht und schnell nachgewiesen werden.

Ein anderes Diagnostikum enthält die erfindungsgemäßen Antikörper selbst. Mit Hilfe dieser Antikörper kann beispielsweise eine Gewebeprobe leicht und schnell dahingehend untersucht werden, ob das betreffende Polypeptid in einer erhöhten Menge vorhanden ist, um dadurch einen Hinweis auf eine mögliche Wundheilungsstöning zu erhalten. In diesem Fall sind die erfindungsgemäßen Antikörper beispielsweise mit einem Enzym, wie oben bereits beschrieben, markiert. Der spezifische Antikörper-Peptid-Komplex kann dadurch leicht und ebenso schnell über eine enzymatische Farbreaktion nachgewiesen werden.

Ein weiteres erfindungsgemäßes Diagnostikum umfaßt eine Sonde, vorzugsweise eine DNA-Sonde, und/oder Primer. Dies eröffnet eine weitere Möglichkeit, die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, zum Beispiel durch die Isolierung aus einer geeigneten Genbank, beispielsweise aus einer wundspezifischen Genbank, anhand einer geeigneten Sonde zu erhalten (siehe z. B. J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2^nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY Kapitel 8 Seite 8.1 bis 8.81, Kapitel 9 Seite 9.47 bis 9.58 und Kapitel 10 Seite 10.1 bis 10.67).

Als Sonde eignen sich beispielsweise DNA- oder RNA-Fragmente mit einer Länge von ca. 100-1000 Nukleotiden, vorzugsweise mit einer Länge von ca. 200-500 Nukleotiden, insbesondere mit einer Länge von ca. 300-400 Nukleotiden deren Sequenz aus den Polypeptiden gemäß den SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 58 des Sequenzprotokolls und/oder anhand der cDNA Sequenzen der in den Fig. 4 bis 6 angegebenen Datenbankeinträge abgeleitet werden kann (siehe auch Beispiel 4).

Alternativ können anhand der abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen Oligonukleotide synthetisiert werden, die sich als Primer für eine Polymerase Kettenreaktion eignen. Mit diesen kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder Teile dieser aus cDNA, beispielsweise wundspezifischer cDNA, amplifziert und isoliert werden (Beispiele 5 und 6). Als Primer eignen sich beispielsweise DNA- Fragmente mit einer Länge von ca. 10-100 Nukleotiden, vorzugsweise mit einer Länge von ca. 15 bis 50 Nukleotiden, insbesondere mit einer Länge von 20-30 Nukleotiden deren Sequenz aus den Polypeptiden gemäß den SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 58 des Sequenzprotokolls und/oder anhand der cDNA Sequenzen der in den Fig. 4 bis 6 angegebenen Datenbankeinträge abgeleitet werden kann (Beispiel 4).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Tests zur Auffindung funktioneller Interaktoren in Zusammenhang mit Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Behandlung bei der Wundheilung, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptids oder mindestens ein Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, zur Herstellung des Tests verwendet wird.

Unter dem Begriff "funktionelle Interaktoren" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind alle diejenigen Moleküle, Verbindungen und/oder Zusammensetzungen und Stoffgemische zu verstehen, die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Polypeptiden oder Antikörpern, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, unter geeigneten Bedingungen in Wechselwirkung treten können. Mögliche Interaktoren sind einfache chemische organische oder anorganische Moleküle oder Verbindungen, können aber auch Peptide, Proteine oder Komplexe davon umfassen. Die funktionellen Interaktoren können aufgrund ihrer Wechselwirkung die Funktion(en) der Nukleinsäuren, Polypeptide oder Antikörper in vivo oder in vitro beeinflussen oder auch nur an die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Polypeptide oder Antikörper binden oder mit ihnen andere Wechselwirkungen kovalenter oder nicht-kovalenter Weise eingehen.

Die Erfindung umfaßt weiterhin einen erfindungsgemäß hergestellten Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren in Zusammenhang mit Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Behandlung bei der Wundheilung, der mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens einen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, umfaßt.

Ein geeignetes System läßt sich beispielsweise durch die stabile Transformation von epidermalen bzw. dermalen Zellen mit Expressionsvektoren, die selektierbare Markergene und die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten, herstellen. Bei diesem Verfahren wird die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in den Zellen so verändert, daß sie der pathologisch gestörten Expression in vivo entspricht. Auch anti-sense Oligonukleotide, die die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten, können zu diesem Zweck eingesetzt werden. Von besonderem Vorteil für diese Systeme ist es daher, das Expressionsverhalten der Gene bei gestörten regenerativen Prozessen, wie in dieser Anmeldung offengelegt, zu kennen. Oft kann so das pathologische Verhalten der Zellen in vitro nachgeahmt werden und es können Substanzen gesucht werden, die das normale Verhalten der Zellen wieder herstellen und die ein therapeutisches Potential besitzen.

Für diese Testsysteme eignen sich z. B. HaCaT-Zellen, die allgemein erhältlich sind, und der Expressionsvektor pCMV4 (Anderson et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 8222-9). Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann dabei sowohl in sense als auch in anti-sense Orientierung in die Expressionsvektoren integriert werden, so daß die funktionelle Konzentration an mRNA der entsprechenden Gene in den Zellen entweder erhöht, oder durch Hybridisierung mit der antisense-RNA erniedrigt wird. Nach der Transformation und Selektion stabiler Transformanden zeigen die Zellen in Kultur im allgemeinen ein verändertes Proliferations-, Migrations, und/oder Differenzierungsverhalten im Vergleich zu Kontrollzellen. Dieses Verhalten in vitro ist häufig mit der Funktion der entsprechenden Gene bei regenerativen Prozessen im Organismus korreliert (Yu et al., 1997, Arch. Dermatol. Res. 289: 352-9; Mils er al., 1997, Oncogene 14: 15555-61; Charvat et al., 1998, Exp Dermatol 7: 184-90; Mythily et al., 1999, J. Gen. Virol. 80: 1707- 13; Werner, 1998, Cytokine Growth Factor Rev. 9: 153-65) und läßt sich mit einfachen und schnell durchzuführenden Tests nachweisen, so daß man darauf basierend Testsysteme für pharmakologisch aktive Substanzen aufbauen kann. So läßt sich das Proliferationsverhalten von Zellen sehr schnell durch z. B. den Einbau von markierten Nukleotiden in die DNA der Zellen (siehe z. B. de Fries und Mitsuhashi, 1995, J. Clin. Lab. Anal. 9: 89-95; Perros und Weightman, 1991, Cell Prolif. 24: 517-23; Savino und Dardenne, 1985, J. Immunol. Methods 85: 221-6), durch Anfärbung der Zellen mit spezifischen Farbstoffen (Schulz et al., 1994, J. Immunol. Methods 167: 1-13) oder über immunologische Verfahren (Frahm et al., 1998, J. Immunol. Methods 211: 43-50) nachweisen. Die Migration läßt sich einfach durch den "Migration Index" Test (Charvat et al., supra) und vergleichbare Testsysteme (Benestad et al., 1987, Cell Tissue Kinet. 20: 109-19, Junger et al., 1993, J. Immunol. Methods 160: 73-9) nachweisen. Als Differenzierungsmarker eignen sich z. B. Keratin 6, 10 und 14 sowie Loricrin und Involucrin (Rosenthal et al., 1992, J, Invest, Dermatol, 98: 343-50), deren Expression z. B. über allgemein erhältliche Antikörper leicht nachzuweisen ist.

Ein anderes geeignetes Testsystem basiert auf der Identifikation funktioneller Interaktionen mit dem sogenannten "Two-Hybrid System" (Fields und Sternglanz, 1994, Trends in Genetics, 10, 286-292; Colas und Brent, 1998 TIBTECH, 16, 355-363). Bei diesem Test werden Zellen mit Expressionsvektoren transformiert, die Fusionsproteine aus dem erfindungsgemäßen Polypeptid und einer DNA- Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors wie beispielsweise Gal4 oder LexA exprimieren. Die transformierten Zellen enthalten außerdem ein Reportergen, dessen Promotor Bindungsstellen für die entsprechende DNA Bindungsdomäne enthalten. Durch Transformation eines weiteren Expressionsvektors, der ein zweites Fusionsprotein aus einem bekannten bzw. unbekannten Polypeptid mit einer Aktivierungsdomäne, beispielsweise von Gal4 oder Herpes Virus VP16, exprimiert, kann die Expression des Reportergens stark gesteigert werden, wenn das zweite Fusionsprotein mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid funktionell interagiert. Diese Expressionssteigerung kann man ausnutzen, um neue Interaktoren zu identifizieren, beispielsweise indem man zur Konstruktion des zweiten Fusionsproteins eine cDNA-Bibliothek aus sich regenerierenden Gewebe herstellt. Zudem läßt sich dieses Testsystem zum Screening von Substanzen ausnutzen, die eine Interaktion zwischen dem erfindungsgemäßen Polypeptid und einem funktionellen Interaktor inhibieren. Solche Substanzen verringern die Expression des Reportergens in Zellen, die Fusionsproteine des erfindungsgemäßen Polypeptids und des Intreraktors exprimieren (Vidal und Endoh, 1999, Trends in Biotechnology, 17: 374-81). So lassen sich schnell neue Wirkstoffe identifizieren, die zur Therapie von Störungen regenerativer Prozesse eingesetzt werden können.

Funktionelle Interaktoren der erfindungsgemäßen Polypeptide können auch Nukleinsäuren sein, die über Selektionsverfahren, wie beispielsweise SELEX (siehe Jayasena, 1999, Clin. Chem. 45: 1628-50; Klug und Famulok, 1994, M. Mol. Biol. Rep. 20: 97-107; Toole et al., 1996, US 5582981) isoliert werden. Im SELEX-Verfahren werden typischerweise aus einem großen Pool unterschiedlicher, einzelsträngige RNA Moleküle durch wiederholte Amplifikation und Selektion diejenigen Moleküle isoliert, die an ein Polypeptide mit hoher Affinität binden (Aptamere). Aptamere können auch in ihrer spiegelbildlichen Form, beispielsweise als L-Ribonukleotid, synthetisiert und selektioniert werden (Nolte et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14: 1116-9; Klussmann et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14: 1112-5). So isolierte Formen haben den Vorteil, das sie nicht von natürlich vorkommenden Ribonukleasen abgebaut werden und daher größere Stabilität besitzen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang mit Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Erkrankungen bei der Wundheilung, bei dem mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens ein Antikörper oder Antikörperfragment gemäß der Erfindung zur Herstellung verwendet wird.

Verfahren zur Herstellung von solchen Arrays sind zum Beispiel aus der US 5,744,305 mittels Festphasenchemie und photolabilen Schutzgruppen bekannt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein auf einem Trägermaterial fixiertes Array zur Analyse in Zusammenhang mit Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Erkrankungen bei der Wundheilung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es mindestens eine Nukleinsäure und/oder mindestens ein Polypeptid und/oder oder mindestens einen Antikörper oder Antikörperfragment gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung umfaßt einen DNA-Chip und/oder Protein-Chip zur Analyse in Zusammenhang mit Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Erkrankungen bei der Wundheilung, der mindestens eine Nukleinsäure und/oder mindestens ein Polypeptid und/oder oder mindestens einen Antikörper oder Antikörperfragment gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt. DNA-Chips sind zum Beispiel aus der US 5,837,832 bekannt.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Arzneimittel zur Indikation und Therapie, das eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid und gegebenenfalls geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe enthält und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Arzneimittels zur Behandlung von dermatologischen Erkrankungen, insbesondere von Wundheilungsstörungen, bei dem eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert wird.

Für die gentherapeutische Anwendung beim Menschen ist vor allem ein Arzneimittel geeignet, das die erfindungsgemäße Nukleinsäure in nackter Form oder in Form eines der oben beschriebenen gentherapeutisch wirksamen Vektoren oder in mit Liposomen bzw. Goldpartikeln komplexierter Form enthält. Der pharmazeutische Träger ist beispielsweise eine physiologische Pufferlösung, vorzugsweise mit einem pH von ca. 6,0-8,0, vorzugsweise von ca. 6,8-7,8. Insbesondere von ca. 7,4 und/oder einer Osmolarität von ca. 200-400 milliosmol/Liter, vorzugsweise von ca. 290-310 milliosmol/Liter. Zusätzlich kann der pharmazeutische Träger geeignete Stabilisatoren, wie z. B. Nukleaseinhibitoren, vorzugsweise Komplexbildner wie EDTA und/oder andere dem Fachmann bekannte Hilfsstoffe enthalten.

Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure gegebenenfalls in Form der oben näher beschriebenen. Virusvektoren oder als Liposomenkomplexe bzw. Goldpartikelkomplex erfolgt üblicherweise topisch und lokal im Bereich der Wunde. Es ist auch möglich, das Polypeptid selbst mit geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffen, wie z. B. physiologische Kochsalzlösung, entmineralisiertes Wasser, Stabilisatoren, Proteinaseinhibitoren, Gelformulierungen, wie z. B. weiße Vaseline, dünnflüssiges Paraffin und/oder gelbes Wachs, etc., zu verabreichen, um die Wundheilung sofort und unmittelbar zu beeinflussen.

Die Nukleinsäuren der erfindungsgemäßen Polypeptide wurden aus cDNA Bibliotheken isoliert, die aus intakter und verwundeter Haut hergestellt wurden. Dabei wurden die cDNAs ausgewählt, die unterschiedliche Häufigkeiten in gut heilenden im Vergleich zu schlecht heilenden Wunden aufwiesen (Beispiel 1). Dies geschah beispielsweise mit Hilfe von subtraktiver Hybridisierung (Diatchenko et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 6025-30) und, /oder mit dem vergleichenden Auszählen von Klonen in cDNA Bibliotheken mittels Sequenzierung ("ESTs", Adams et al., 1992, Nature 355, 632-4; Adams et al., 1991, Science 252, 1651-6). Die so ausgewählten cDNAs entstammen Genen, die bei Wundheilungsstörungen entweder stärker oder schwächer exprimiert werden als bei normal verlaufender Wundheilung.

Allgemein ist die Analyse von differentiell exprimierten Genen in Geweben mit deutlich mehr Fehlern in Form von falsch positiven Klone behaftet, als bei der Analyse von Zellkultursystemen. Da bei der Wundheilung eine Vielzahl von verschiedenen Zelltypen beteiligt sind, deren Zusammensetzung und deren Genexpressionsmuster sich während des gesamten Wundheilungsprozesses ständig ändert, ergibt sich hier bei der Analyse von differentiell exprimierten Genen eine besonders niedrige Trefferquote. Diese kann nicht durch die Verwendung eines definierten Zellkultursystems umgangen werden, da ein solches auf Grund der Komplexität der Wundheilung nicht zur Verfügung steht. Zudem gibt es enorme Variabilitäten des Wundzustands zum Zeitpunkt einer möglichen Biopsie des Patienten beim Erstkontakt mit dem Arzt.

Daher wurde zur Identifikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ein Tiermodell verwendet. Es wurden BALB/c Mäuse verwundet und zu verschiedenen Zeitpunkten Wundbiopsien entnommen. Dieses Verfahren hat den Vorteil, das sich die Randbedingungen wie genetischer Hintergrund, Art der Wunde, Zeitpunkt der Biopsie etc. exakt kontrollieren lassen und so erst eine reproduzierbare Analyse der Genexpression erlauben. Selbst unter den definierten Maus-Bedingungen ergeben sich weitere methodische Probleme wie Redundanz der analysierten Klone und Unterrepräsentation von schwach exprimierten Genen, die die Identifikation von relevanten Genen erschweren.

Bei der vorliegenden Analyse der Genexpression wurden während des Wundheilungsprozesses neben Genen, deren Funktion bisher gänzlich unbekannt war, auch Gene identifiziert, die bisher nicht mit Wundheilungsstörungen in Verbindung gebracht wurden. Von einigen der bekannten Genen wurden weiterhin neuartige Varianten mit Sequenzen identifiziert, die signifikant von den bisher veröffentlichten und/oder patentierten Sequenzen abweichen.

Von dem bisher nicht mit Wundheilungsstörungen in Zusammenhang gebrachten Teil der identifizierten Gene war bisher bekannt, daß sie eine Funktion bei der Proliferation (NF1-B: Schuur et al., 1995, Cell Growth Differ. 6: 219-27; potentially prenylated protein tyrosin phoshatase: Zeng et al., 1998, 244: 421-7; mas onkogene: von 't Veer et al., 1988, Oncogene Res. 3: 247-54; CBP: Blobel et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2061-6; BTG1: Rouault et al., 1992, EMBO J. 11: 1663-70; Acylamino acid-releasing enzyme: Schoenberger et al., 1986, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 24: 375-8; ALFI: Loveys et al., 1996, Nucleic. Acids Res. 24: 2813-20, p68 RNA Helicase: Ford et al., 1988, Nature 332: 736-8, Nup98: Kasper et al., 1999, Mol. Cell. Biol. 19: 764-76; Ribonuclease L Inhibitor: Benoit et al., 1998, Gene 209: 149-56; Cathepsin Z: Santamaria et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 16818-23) Zell-Zyklus-Kontrolle (Checkpoint suppressor 1: Pat et al., 1997, Mol. Cell. Biol 17: 3037-46), Zell-Migration (Ryoducan: Woods und Couchman, 1994, Mol. Biol. Cell 5: 1183-92), Differenzierung (mKAP13: Aoki et al., 1998, J. Invest. Dermatol. 111: 804-9; pmg-2: Kuhn et al., 1999, Mech. Dev 86: 193-196, Calnexin: Olsen et al., 1995, Electrophoresis 16: 2241-8, JEM-1: Tong et al., 1998, Leukemia 12: 1733-40; CD9: Jones et al., 1996, Cell Adhes. Commun. 4: 297-305; rab2: Ayala et al., 1990, Neuron 4: 797-805; Stearoyl-CoA Desaturase: Singh und Ntambi, 1998, Biochim. Biophys. Acta 1398: 148-56; Cardiac Ankyrin Repeat Protein: Zou et al., 1997, Development 124: 793-804) und/oder Apoptose (MA-3: Shibahara et al., 1995, Gene 166: 297-301) haben. Diese Gene wurden bisher jedoch nicht mit Wundheilung in Verbindung gebracht (Fig. 6).

Zusätzlich zu den bekannten Polypeptiden von Mensch (Bisbal et al. " 1995, J. Biol. Chem. 270: 13308-17) und Maus (De Coignac et al., 1998, Gene 209: 149-­ 56) Ribonuklease L Inhibitor und Maus p68 RNA Helikase (Lemaire und Heinlein, 1993, Life Sci. 52: 917-26) wurden eng verwandte Polypeptide mit signifikant abweichender Sequenz identifiziert. Von dem bekannten Maus mKAP13 Polypeptid (Aoki et al., 1998, J. Invest. Dermatol. 111, 804-9) wurde erstmals die Sequenz des entsprechenden Polypeptids des Menschen identifiziert (Beispiel 7).

Die Polypeptide dieser Gene gehören nicht zu den bisher bekannten Zielen von Therapien von Wundheilungsstörungen, so daß sich aus dieser Erfindung völlig neue Therapieansätze ergeben. Von den restlichen identifizierten Genen existiert noch keine Funktionsbeschreibung (Fig. 4). Zudem konnte ein Gen gefunden werden, dessen mRNA nicht translatiert wird und als RNA funktionell ist (Steroid Receptor Coaktivator: Lanz et al., 1999, Cell 97: 17-27).

Nach der primären Identifikation der Gene ist es notwendig, die wundheilungsspezifische Expression durch eine weitere Methode zu bestätigen. Dies erfolgte mit Hilfe von sogenannten "Reverse Northern Blots", "RNase Protection Assays" oder "TaqMan Assays". Mit diesen Methoden wurde die Menge an mRNA in Gewebeextrakten aus verschiedenen Wundheilungszuständen bestimmt. So wurde beispielsweise die wundspezifische Expression der Klone in einer subtraktiven cDNA Bibliothek mit Hilfe eines "Reverse Northern Blots" ermittelt (Beispiel 2). Es zeigte sich, das ca. 20% aller Klone in den Bibliotheken unterschiedliche Signale mit Hybridisierungssonden aus Wund-cDNA im Vergleich zu Sonden aus intakter Haut zeigten (Fig. 1). Nach der Identifikation der Klone wurden diese teilweise sequenziert, redundante Klone aussortiert, und die Sequenz mit Sequenz-Datenbanken mit dem Ziel abgeglichen, Vollängen Sequenzen der Maus-Gene und der menschlichen Gene zu identifizieren (Beispiel 3). Die Sequenzierung und Redundanzanalyse der positiven Klonen ergab, daß mehr als 75% der Klone mehrfach vorhanden waren und somit nur ca. 5% aller Ausgangsklone weiter verwendet werden konnten. Eine Minderheit von diesen wundspezifischen Genen zeigte wiederum eine verminderte Expression in schlecht heilenden Wunden. Von diesen konnte bei ca. 50% die differentielle Expression im "RNase Protection Assay" bzw. "TaqMan Assay" bestätigt werden (Beispiele 4 und 5). So zeigte sich, daß das als Markergen verwendete Gen spi2 ca. 10-fach stärker in Wundgewebe exprimiert wurde im Vergleich zu intakter Haut. Auch ergab sich, daß die Expression des Gens in schlecht heilenden Wunden von Dexamethason behandelten und von alten Tieren ca. 2-fach schwächer war, als in normal gut heilenden Wunden von Kontrolltieren (Fig. 2).

Zur Überprüfung bzw. Generierung von Vollängen cDNA Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren wurden Vollängen-Klone mit Hilfe von Kolonie-Hybridisierung (Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Kapitel 8-10) und/oder PCR basierten Methoden ("RACE", Frohman et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002, Chenchik et al., 1996, in A Laboratory Guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis, Ed. Krieg, Wiley-Liss, Seiten 272-321; "LDPCR", Barnes, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2216-20) sowohl für die Maus-Gene als auch für die menschlichen Gene generiert und die Sequenz diese Klone bestimmt (Beispiel 6).

Der Begriff "kodierende Nukleinsäure" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die für ein isolierbares bioaktives erfindungsgemäßes Polypeptid oder einen Precursor kodiert. Das Polypeptid kann durch eine Sequenz in voller Länge oder jeden Teil der kodierenden Sequenz kodiert werden, solange die spezifische, beispielsweise enzymatische Aktivität erhalten bleibt.

Es ist bekannt, daß kleine Veränderungen in der Sequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren vorhanden sein können, zum Beispiel durch die Degenerierung des genetischen Codes, oder daß nicht translatierte Sequenzen am 5' und/oder 3'-Ende der Nukleinsäure angehängt sein können, ohne daß dessen Aktivität wesentlich verändert wird. Diese Erfindung umfaßt deshalb auch sogenannte "funktionale Varianten" der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.

Mit dem Begriff "funktionelle Varianten" sind alle DNA-Sequenzen bezeichnet, die komplementär zu einer DNA-Sequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit der Referenzsequenz hybridisieren und eine zu dem entsprechenden erfindungsgemäßen Polypeptid ähnliche Aktivität aufweisen.

Unter "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung bei 60°C in 2,5 × SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.

Unter dem Begriff "funktionelle Varianten" im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man Polypeptide, die funktionell mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden verwandt sind, d. h. während regenerativen Prozessen, der Haut, reguliert werden und/oder Strukturmerkmale der Polypeptide aufweisen. Beispiele funktioneller Varianten sind die entsprechenden Polypeptide, die aus anderen Organismen als dem Menschen bzw. der Maus, vorzugsweise aus nicht- menschlichen Säugetieren wie z. B. Affen, Schweinen und Ratten stammen. Andere Beispiele funktioneller Varianten sind Polypeptide, die durch unterschiedliche Allele des Gens, in verschiedenen Individuen oder in verschiedenen Organen eines Organismus kodiert werden (siehe Beispiel 6).

Im weiteren Sinne versteht man darunter auch Polypeptide, die eine Sequenzhomologie, insbesondere eine Sequenzidentität, von ca. 70%, vorzugsweise ca. 80%, insbesondere ca. 90%, vor allem ca. 95% zu dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß einer der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 58 und/oder anhand der DNA Sequenzen der öffentlich zugänglichen Datenbankeinträge der Liste in den Fig. 4 bis 6 aufweisen. Darunter zählen beispielsweise Polypeptide, die von einer Nukleinsäure kodiert werden, die aus nicht-wundheilungsspezifischen Gewebe, z. B. Embryonalgewebe, isoliert wird, jedoch nach Expression in einer an der Wundheilung beteiligten Zelle die bezeichneten Funktionen besitzen. Ferner zählen hierzu auch Deletionen oder Teile des Polypeptids im Bereich von ca. 1-60, vorzugsweise von ca. 1-30, insbesondere von ca. 1-15, vor allem von ca. 1-5 Aminosäuren. Beispielsweise kann die erste Aminosäure Methionin fehlen, ohne daß die Funktion des Polypeptids wesentlich verändert wird.

Die Erfindung soll nun im folgenden anhand der Figuren und Beispiele weiter verdeutlicht werden, ohne daß die Erfindung hierauf eingeschränkt wird.

Beschreibung der Tabellen, Figuren und Sequenzen

Fig. 1 Autoradiogramme von Hybridisierungen von Membranen mit gleichem Muster von aufgebrachten cDNA-Fragmenten mit vier verschiedenen Sonden. Die cDNA Fragmente entstammten alle einer wundspezifischen, subtraktiven cDNA-Bibliothek, die für solche cDNAs angereichert war, die in Wundgewebe stärker im Vergleich zur intakten Haut exprimiert wurden. Alle Sonden wurden aus cDNAs hergestellt, die aus subtraktiven Hybridisierungen stammten. A: wundspezifische Sonde (Subtraktion Wunde versus intakte Haut), B: hautspezifische Sonde (Subtraktion intakte Haut versus Wunde), C: Sonde spezifisch für gut heilende Wunden (Subtraktion Wunde Kontrolltiere versus Wunde Dexamethason behandelte Tiere), D: Sonde spezifisch für schlecht heilende Wunden (Subtraktion Wunde Dexamethason behandelte Tiere versus Wunde Kontrolltiere).

Fig. 2 Tabellarische Aufstellung der veränderten Expression verschiedener wundheilungsrelevanter Gene

Fig. 3 Teil der cDNA-Sequenz des Markergens spi2 (SEQ ID Nr. 61). Die Sequenz ist die Konsensussequenz von zwei Sequenzierungen von Klonen, die in der wundspezifischen, subtraktiven cDNA-Bibliothek enthalten waren. Vektor- und Primersequenzen der cDNA Synthese wurden entfernt, so daß nur die Sequenzen der Inserts für die Konsensussequenz berücksichtigt wurden. Die Qualität der Sequenzanalyse (<10% Fehler) erlaubt nur die Identifikation der Vollängen cDNA, läßt aber keinen exakte Feststellung der Sequenz der Inserts zu. Die Position der Erkennungsstelle der Restriktionsendonuklease HindIII, die zur Linearisierung des Plasmids bei der Herstellung der Sonde für den RNAse Protection Assay diente, ist unterstrichen.

Fig. 4 Tabellarische Übersicht über die bei der Analyse der Genexpression während des Wundheilungsprozesses identifizierten Polypeptidsequenzen mit unbekannter biologischer Funktion und ihre cDNAs und Accession Numbers.

Fig. 5 Tabellarische Übersicht über die bei der Analyse der Genexpression während des Wundheilungsprozesses identifizierten Polypeptidsequenzen mit bereits bekannten und beschriebenen Funktionen und ihre cDNAs und Accession Numbers.

Fig. 6 Tabellarische Übersicht über die bei der Analyse der Genexpression während des Wundheilungsprozesses zusätzlich identifizierten Polypeptidsequenzen mit bereits bekannten und beschriebenen Funktionen und ihre cDNAs und Accession Numbers.

Fig. 7 Vollängensequenz der spi2-cDNA (SEQ ID Nr. 62, EMBL Datenbankeintrag MMSPI201, Accession No. M64086). Die Sequenz der in der wundspezifischen cDNA-Bibliothek enthaltenen Nukleinsäuren ist unterstrichen (Vergleiche Fig. 3, komplementäre Sequenz). Der kodierende Bereich (fett) der cDNA geht vom Startcodon (ATG) an Position 61 bis zum Stopcodon (TGA) an Position 1317. Die Position der Primer für die quantitative RTPCR (Beispiel 5) im kodierenden Bereich ist unterstrichen.

Fig. 8 Quantitative RTPCR von spi2. Die Anzahl von Zyklen bis zum Erreichen des Fluoreszensschwellenwerts (Ct) für jeweils drei unabhängige Messungen sowie der Mittelwert (Ct Mittel), die Differenz der Ct Werte von GAPDH und spi2 (ΔCt), die daraus errechnete Abundanz von spi2 relativ zu GAPDH und die relative Induktion von spi2 relative zur intakten Haut von Kontrolltieren ist dargestellt.

Fig. 9 Teilsequenz der Maus-cDNA von GAPDH (SEQ ID Nr. 63), als Referenzsequenz, beim RNAse Protection Assay verwendet.

Fig. 10 RNase Protection Assay von spi2 mit RNA verschiedener Wundheilungszustände. Radioaktiv markierte Sonden von GAPDH (Spur 1: intakte Sonde) und spi2 (Spur2: intakte Sonde) wurde mit Gesamt-RNA, gewonnen aus intakter Haut (Spuren 3, 5 und 7) oder aus Wunden (Spur 4, 6, und 8) von Kontrollmäusen (Spuren 3 und 4), von Dexamethason behandelten Mäusen (Spuren 5 und 6) oder von alten Mäusen (Spuren 7 und 8) hybridisiert und nach RNase Behandlung gelelektrophoretisch aufgetrennt. In jeder Spur wurde die Signalintensitäten der Spi2 Signale mit den Signalen der GAPDH Sonde normalisiert. Die relativen Intensitäten in Bezug auf intakte Haut von Kontrolltieren sind Spur 3: 1,0; Spur4: 13,28; Spur 5: 0,84; Spur 6: 7,72; Spur 7: 0,54; Spur 8: 5,2.

Fig. 11 Korrektur der Sequenz von spi2 (SEQ ID Nr. 64). Die Primer der PCR sind fett dargestellt, Abweichungen von der veröffentlichten Datenbanksequenz sind unterstrichen.

Fig. 12 Vergleich der ermittelten Aminosäuresequenz von spi2 (Human.pro und Maus.pro) mit den veröffentlichten Aminosäuresequenzen der ensprechenden Datenbankeinträge (ITHUC.pro und JH0494.pro). Abweichungen zur hier ermittelten humanen Sequenz sind umrahmt.

SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 58 zeigen die erfindungsgemäßen Polypeptid- oder cDNA-Sequenzen aus Mensch oder Maus.

SEQ ID Nr. 59 bis SEQ ID Nr. 64 zeigen Polypeptid- und cDNA-Sequenzen der Markergene spi2 und GADPH.

SEQ ID Nr. 65 bis SEQ ID Nr. 74 zeigen DNA-Sequenzen von Oligonukleotiden, die für die Versuche der vorliegenden Erfindung verwendet wurden.

Beispiele Beispiel 1 Herstellung von cDNA-Bibliotheken mittels subtraktiver Hybridisierung

Aus intakter Haut und aus Wundgewebe (Verwundung am Rücken 1 Tag vor Gewebeentnahme durch Scherenschnitt) von Balb/c Mäusen wurde durch Standardmethoden (Chomczynski und Sacchi, 1987, Anal. Biochem. 462: 156-­ 159, Chomczynski und Mackey, 1995, Anal. Biochem. 225: 163-164) Gesamt- RNA isoliert. Die RNAs wurden dann mit Hilfe einer reversen Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Die cDNA Synthese erfolgte mit dem "SMART PCR cDNA Synthesis Kit" der Firma Clontech Laboratories GmbH, Heidelberg, nach Anweisungen des entsprechenden Manuals. Um diejenigen cDNAs zu identifizieren, die mit unterschiedlicher Häufigkeit in den beiden cDNA Pools vorkamen, wurde eine subtraktive Hybridisierung (Diatchenko et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 6025-30) durchgeführt. Dies erfolgte mit dem "PCR- Select cDNA Subtraction Kit" der Firma Clontech Laboratories GmbH, Heidelberg, nach Anweisungen des entsprechenden Manuals, wobei die Abtrennung überschüssiger Oligonukleotide nach der cDNA Synthese über Agarose-Gelelekrophorese erfolgte. Die resultierenden cDNA Fragmente wurden mittels T/A- Klonierung in den Vektor pT-Adv (Clontech Laboratories GmbH) integriert und mittels Elektroporation in E. coli (SURE electroporation-competent cells, Firma Stratagene) transformiert. Es wurden zwei cDNA Bibliotheken angelegt, wobei eine angereichert für cDNA Fragmente war, die im Wundgewebe im Vergleich zu intakter Haut stärker exprimiert sind ("wundspezifische cDNA Bibliothek"), während die andere angereichert war an cDNA Fragmenten, die in intakter Haut im Vergleich zu Wundgewebe stärker exprimiert sind ("hautspezifische cDNA Bibliothek").

Beispiel 2 Identifizierung von wundheilungsregulierten cDNA-Fragmenten

Um diejenigen Klone der beiden cDNA-Bibliotheken im Beispiel 1 zu identifizieren, die wundheilungsrelevante cDNA-Fragmente enthielten, wurde die Expression der entsprechenden cDNAs in intakter und verwundeter Haut sowie in gut und schlecht heilenden Wunden im "Reverse Northern Blot" analysiert. Hier werden die cDNA-Fragmente auf Membranen in Form von Arrays von vielen verschiedenen cDNAs fixiert, und mit einem komplexen Gemisch radioaktiv markierter cDNA hybridisiert (Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, kapitel 9 Seite 9.47 bis 9.58 und kapitel 10 Seite 10.38 bis 10.50; Anderson and Young: Quantitative filter hybridisation; in: Nucleic Acids Hybridisation, A Practical Approach, 1985, Eds. Hames and Higgins, IRL Press Ltd.; Oxford, Kapitel 4, Seite 73 bis 112).

Um geeignete Membranen für die Analyse herzustellen, wurden aus jeder Bibliothek 1536 Klone isoliert und mittels Polymerase Ketten Reaktion die cDNA-Insertionen amplifiziert. Je 2 µl Suspensionkultur der Klone wurden in 40 µl TE Puffer (10 mM Tris-HCl, lmM EDTA, pH = 8.0) für 1 Minute bei 96°C lysiert und eine 20 µl PCR-Reaktion ("Advantage cDNA Polymerase Mix Kit" der Firma Clontech) mit 1 µl Lysat angeimpft. Die Amplifikation erfolgte in 35 PCR Zyklen (1 min 96°C gefolgt von 35 Zyklen 2-Stufen-PCR: 96°C/30" und 68°C/3') mit universellen Primern (TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT (SEQ ID Nr. 65) und AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT (SEQ ID Nr. 66)), die im "PCR-Select cDNA Subtraction Kit" zur Gewinnung der cDNA Fragmente verwendet werden und somit alle cDNA Insertionen umschließen. 5 µl PCR- Reaktion wurde in 384 well Mikrotiterplatten mit 35 µl Puffer (1.16 M NaCl, 20 mM Tris, pH = 7.5, 0.001% Bromphenolblau) versetzt und mit dem Nung 384 Pin Replikator unter Verwendung des Nung Replicator Systems (Nung GmbH & CO. KG, Wiesbaden) in 20 Wiederholungen auf Qiabrane Membranen (Qiagen, Hilden) aufgestempelt. Die Membranen wurden mit 0,4 M NaOH für 30 Minuten zur Denaturierung der DNA inkubiert und mit 1 M Tris -HCl, pH 7,5 für 3 Minuten neutralisiert. Die DNA wurde anschließend durch UV-Bestrahlung (120 mJ/cm²) gefolgt von Backen für 30 min bei 80°C fixiert.

Zur Herstellung geeigneter Hybridisierungssonden wurden RNA aus intakter und verwundeter Haut (siehe oben) sowie aus gut und schlecht heilenden Wundgewebe isoliert. Um Gewebe von Mäuse mit schlecht heilenden Wunden zu gewinnen, wurden BALB/c Mäuse vor der Verwundung mit Dexamethason (Injektion von 0,5 mg Dexamethason in isotonischer Salzlösung pro kg Körpergewicht zwei mal pro Tag für 5 Tage) behandelt bzw. alte Mäuse (12 Monate) verwundet. Die RNA aus Wundgewebe dieser Tiere sowie aus Kontrollen wurde wie oben beschrieben isoliert und jeweils cDNA synthetisiert. Danach wurden wie oben beschrieben zwei subtraktive Hybridisierungen (cDNA aus Dexamethason behandelten Tieren versus cDNA aus Kontrolltieren und umgekehrt) durchgeführt. Dies erfolgte wie oben beschrieben mit dem "PCR- Select cDNA Subtraction Kit". Diese subtrahierten cDNAs sowie die oben beschriebenen subtraktiven cDNAs (intakte Haut versus Wunde und umgekehrt) wurde mit der Restriktionsendonuklease RsaI behandelt und über Agarosegelelektrophorese gereinigt (Sambrook et al., supra, Kapitel 6, seite 6.1 bis 6.35), um die cDNA- Synthese- und Amplifikationsprimer (siehe Manual "PCR-Select cDNA Subtraction Kit", Clonetech) abzutrennen. Die cDNAs wurde dann mit der "random-hexamer priming" Methode (Feinberg und Vogelstein, 1983, Anal. Biochem. 132: 6-13) radioaktiv markiert, um Hybridisierungssonden herzustellen.

Die Membran wurde für 30 min bei 65°C in 25 ml Hybridisierungslösung vorinkubiert (25 mM Natriumphosphat, pH = 7,5, 125 mM NaCl, 7% SDS). Die Hybridisierungssonde wurde 10 min bei 100°C denaturiert, anschließend auf Eis abgekühlt, ca. 100 CPM pro ml zur Hybridisierungslösung gegeben und die Hybridisierung für 16 Stunden bei 65°C im Hybridisierungsofen durchgeführt. Danach wurde die Membran zweimal für 10 min mit der Hybridisierungslösung ohne Sonde bei 65°C gewaschen. Anschließend wurde die Membran mehrfach für jeweils 10 min in Waschlösung (2,5 mM Natriumphosphat, pH = 7,5, 12,5 mM NaCl, 0,7% SDS) bei 65°C gewaschen, bis in der abgegossenen Lösung keine Aktivität mehr nachgewiesen werden konnte. Die radioaktiven Signale wurden mit einem Phosphoimager (BioRad, Quantitiy One®) ausgewertet (Fig. 1). Danach wurden diejenigen cDNAs ausgewählt, die mit den verschiedenen Sonden unterschiedliche Signalintensitäten ergaben. Von den entsprechenden Klonen wurden nach Standardmethoden (Sambrook et al., supra) Plasrpid-DNA Präparationen angefertigt und die DNA Sequenz der Inserts analysiert. Fig. 1 zeigt eine Übersicht über die Expressionsmuster verschiedener Gene, die durch diese Methode ermittelt werden konnten.

Beispiel 3 Analyse von wundheilungsrelevanten cDNA Sequenzen

Die cDNA Sequenz der Inserts aus Beispiel 2 wurden mit dem Programm SeqMan 4.01 der Firma DNAStar Inc. (GATC GmbH, Konstanz) auf Redundanz analysiert und nicht redundante Sequenzen wurden mit dem Programm BLAST 2.0 (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-402) mit der aktuellen EMBL- (Stoesser et al., 1999, Nucleic Acids Res., 27: 18-24), TREMBL- (Bairoch und Apweiler, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 31-26) und PIR- (George et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24: 17-20) und/oder GenBank- (Benson et al., 1999, Nucleic. Acids Res. 27: 12-7) Datenbank verglichen. Dabei stellte sich heraus, daß einige wundheilungsrelevante cDNA-Sequenzen von bekannten Genen stammen, die bisher aber noch nicht mit regenerativen Prozessen in Verbindung gebracht wurden.

So konnte das Gen spi2 als wundheilungsrelevantes Gen identifiziert werden. In Fig. 3 ist die Ausgangssequenz dargestellt, die zweimal in der wundspezifischen cDNA Bibliothek (s.o.) vorhanden war, in Fig. 7 die Vollängensequenz von spi2 aus der EMBL Datenbank (Eintrag MMSPI201, Accession No. M64086 (SEQ ID Nr. 60), die mit hoher Signifikanz (BLAST Score = 883) mit der Ausgangssequenz übereinstimmt. Ein Vergleich der 22045 00070 552 001000280000000200012000285912193400040 0002019955349 00004 21926 beiden Sequenzen zeigt, das die Ausgangssequenz das 3'-Ende der spi2-cDNA enthält (unterstrichene Sequenz in Fig. 7). Die Spi2 spi2-cDNA codiert für das Protein "alpha-1- antichymotrypsin-like protein EB22/4" (PIR: JH0494), dessen funktionelle Variante im Mensch "alphal-antichymotrypsin" ist (Datenbankeinträge: Protein: PIR: E55627, cDNA: EMBL: K01500 (SEQ ID Nr. 71)). Die funktionellen Varianten des Proteins in Maus und Mensch haben ca. 60% Sequenzhomologie. Entsprechende Analysen wurden mit allen anderen ermittelten cDNA Fragmenten durchgeführt und eine Liste der gefundenen Datenbankeinträge erstellt (Fig. 4 bis 6).

Beispiel 4 Verifikation des Expressionsmusters wundheilungsrelevanter cDNAs mittels "RNAse Protection Assays"

Die differentielle Expression der Gene wurde mit Hilfe des "RNAse Protection Assays" verifiziert. Der Test wurde wie in der Literatur beschrieben durchgeführt (Sambrook et al., supra Kapitel 7, Seite 7.71 bis 7.78; Werner et al., 1992; Growth Factors and Receptors: A Practical Approach 175-197, Werner, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6896-6900). Es wurde in vitro transkribierte und radioaktiv markierte Gegenstrang RNA der isolierten Klone als Hybridisierungssonde eingesetzt. Als interne Kontrolle diente eine Gegenstrang RNA Sonde der murinen GAPDH-cDNA (Länge des Transkripts ohne Vektorsequenz: 120 Basenpaare, Fig. 9), kloniert in pBluescript II KS (+) (Stratagene) mit Hilfe der Restriktionsendonukleasen XbaI und HindII. Dieses Plasmid wurde vor der Transkription mit XhoI linearisiert. Die Plasmide der klonierten cDNA-Fragmeten der identifizierten cDNAs wurden ebenfalls vor der Transkription mit Restriktionsendonukleasen linearisiert. So wurde beispielsweise der spi2 Klon mit HindIII linearisiert (Länge des Transkripts ohne Vektorsequenz: 322 Basenpaare, Fig. 7). Die Transkriptionen wurde mit T7 Polymerase (Roche Diagnostics, Mannheim) in Gegenwart von 32P-UTP (35µCl/Ansatz) (Amersham, Braunschweig) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Nach einem DNase Verdau (Boehringer, 40U/Ansatz) wurden die nicht eingebauten Nukleotide mit Hilfe einer Säulenchromatographie (Pharmacia, Microspin Combi-Pack S200) nach Angaben des Herstellers entfernt und die Sonden durch eine Gelelektrophorese und Elution aufgereinigt (Sambrook et al., supra, Kapitel 6, Seite 6.36 bis 6.48). Für die Hybridisierungsreaktion wurden je ca. 105 CPM des markierten Transskripts eingesetzt. 20 µg Gesamt-RNA wurden hierfür mit entsprechenden Mengen Transkript (spezifische Probe spi2 und interne Kontrolle GAPDH) gefällt, in 30 µl Hybridisierungspuffer (80% entionisiertes Formamid, 400 mM NaCl, 40 mM Pipes pH 4,6, 1 mM EDTA) aufgenommen und über Nacht bei 42°C hybridisiert. Anschließend wurde ein RNase T1 Verdau (Boehringer, 200 U/Ansatz) durchgeführt. Nach Inaktivierung der RNase durch Proteinase K Verdau (Boehringer, 44 µg/Ansatz) und einer Phenolextraktion wurden die Proben mit Isopropanol nach Standardmethoden (Sambrook et al., supra) präzipitiert. Die Proben wurden anschließend gelektrophoretisch auf einem denaturierendem 5% Acrylamidgel (6M Harnstoff) aufgetrennt. Das Gel wurde getrocknet und die radioaktiven Signale mit einem Phosphoimager (BioRad, Quantitiy One®) ausgewertet (Fig. 10).

Beispiel 5 Verifikation des Expressionsmusters wundheilungsrelevanter cDNAs mittels "real time quantitative RTPCR"

Eine weitere Verifikation der differentiellen Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren erfolgte über eine real-time RTPCR im ABl Prism 7700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems). Das Gerät war mit der ABI Prism 7200/7700 SDS-Software Version 1.6.3 (1998) ausgestattet. Der Nachweis von PCRs Produkten erfolgte während der Amplifikation der cDNA mit Hilfe des Farbstoffs SYBR Green 1, dessen Fluoreszenz durch Bindung an doppelsträngige DNA stark erhöht wird (Karlsen et al. 1995, J. Virol. Methods. 55: 153-6; Wittwer et al., 1997, BioTechniques 22: 130-8, Morrison et al., 1998, BioTechniques 24: 954-62). Basis für die Quantifizierung ist der PCR Zyklus ("threshold cycle", CT- Wert), der erreicht ist, wenn das Fluoreszenzsignal einen definierten Schwellenwert übersteigt. Die Auswertung erfolgt in über die A-CT-Methode (User Bulletin #2, Relative Quantitation of Gene Expression, PE Applied Biosystems, 1997). Die Abundanzen der cDNAs wurden relativ zu einer endogenen Referenz (GAPDH) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 dargestellt.

Gesamt-RNA wurde wie oben beschrieben aus Haut und Wundgewebe gewonnen und 1 µg Gesamt-RNA wurde mit dem TaqMan Reverse Transcription Reagents Kit (PE) nach den Empfehlungen des Herstellers (SYBR Green PCR and RT-PCR Reagents-Protokol, PE Applied Biosystems, 1998) in einem Thermocycler (GeneAmp PCR-System 9700, PE) revers transkribiert. Die Primer für die Amplifikation der Spi2 cDNA (spi2 spi2-Primer 1: CTGTCCTCTGCTTCCCAGATG (SEQ ID Nr. 67), spi2-Primer 2: TCCAGTTGTGTCCCATTGTCA (SEQ ID Nr. 68) und der Referenz (GAPDH- Primer 1: ATCAACGGGAAGCCCATCA (SEQ ID Nr. 69), GAPDH-Primer 2: GACATACTCAGCACCGGCCT (SEQ ID Nr. 70)) wurden anhand der erfindungsgemäßen Nukleinsäure und der bekannten Sequenz von GAPDH mit der Primer-Express-Software für Macintosh PPC Version 1.0 (PE Applied Biosystems, P/N 402089, 1998) ausgewählt). Für die PCR wurde das SYBR Green PCR Core Reagents Kit (4304886, PE Applied Biosystems) verwendet. Die Konzentration der Primer in der PCR wurde zunächst im Bereich von 50 nM bis 600 nM optimiert und die Spezifität der PCR durch Analyse der Länge der amplifizierten Produkte in einer Agarose-Gel Elekrophorese geprüft. Anschließend wurde mittels einer Verdünnungsreihe die Effizienz der PCR- Systeme ermittelt (User Bulletin #2, Relative Quantitation of Gene Expression, PE Applied Biosystems, 1997). Dabei ergab sich, das für beide cDNAs die Effizienz der Amplifikation bei 100% lag, d. h. bei jeder 1: 2 Verdünnung der cDNA wurde ein Zyklus mehr benötigt, um den Fluoreszensschwellenwert zu überschreiten.

Für die Quantifizierung wurden je Ansatz cDNA aus 10 ng revers transkribierter Gesamt-RNA in einem Gesamtvolumen von 25 µl amplifiziert. Die Laufbedingungen für die PCR entsprachen den Angaben des Herstellers (PE Applied Biosystems, SYBR Green PCR and RT-PCR Reagents Protocpl, 1998). Die Ct Werte wurden analysiert und die Abundanz von spi2 wurde berechnet. Auch mit dem zweiten Assay konnte die Induktion von spi2 in gut heilenden Wunde, die Reduktion der Induktion in schlecht heilenden Wunden Dexamethason behandelter Tiere und die Reduktion der Expression in intakter Haut von Dexamethason behandelten Tieren bestätigt werden. Die leichten Abweichungen der absoluten Werte sind auf die unterschiedlichen Testsysteme zurückzuführen.

Beispiel 6 Verifikation der Sequenz der cDNA von spi2

Um die cDNA Sequenz von spi2 zu verifizieren, wurden anhand der Datenbanksequenz Oligonukleotide synthetisiert (Primer 1: ACTGCAGAACACAGAAGATGGCTTTCATTG (SEQ ID Nr. 71), Primer 2: CCGGGAAGAAGCGTCAACACTTGGGGAGTT (SEQ ID Nr. 72)). Mit diesen Primern wurde mit Hilfe des "Advantage cDNA PCR Kit" startend von Maus Wund-cDNA (s.o.) der kodierende Bereich der cDNA von spi2 (Fig. 7) amplifiziert. Die PCR Reaktion wurde nach Angaben des Herstellers angesetzt und die Amplifikation erfolgte für 40 Zyklen (30" 94°C, 30" 64°C, 1,5' 72°C) wobei die Denaturierungszeit im ersten Zyklus auf 1,5 Minuten und die Synthesezeit im letzten Zyklus auf 6,5 Minuten ausgedehnt wurde. Das PCR Produkt (1309 bp) wurde über Agarose- Gelelektrophorese gereinigt (Sambrook et al., supra) und mit Hilfe des pCR2.1 TOPO Klonierungskits (Invitrogen) nach Anweisungen des Herstellers in den Vektor pCR2 kloniert. Die Sequenz von 3 unabhängigen Klonen wurde mit Standardmethoden analysiert und die Konsensussequenz mit Hilfe des Programms SeqMan2 (s.o.) bestimmt (Fig. 11). Dabei zeigte sich, das die hier bestimmte cDNA Sequenz in Wundgewebe leicht von der veröffentlichten Sequenz (Inglis et al., 1991, Gene 106: 213-20) abweicht, ebenso wie die kodierten Proteine beider Sequenzen (Fig. 12). Beide Polypeptide haben vergleichbare Homologiegrade von 60% zur menschlichen Sequenz, so daß davon ausgegangen werden kann, daß die Polypeptide funktionellen Varianten des Gens darstellen. Gründe für die Abweichung könnten in dem unterschiedlichen Ausgangsmaterial für die cDNA Synthese (Wundgewebe versus Kondrozyten Zellinie) oder in unterschiedlichen Allelen des Gens im Spender begründet liegen.

Beispiel 7 Klonierung des menschlichen Homologs zu mKAP13

Mit der veröffentlichten Proteinsequenz von mKAP13 (Aoki et al., 1998, J. Invest. Dermatol. 111, 804-9) wurden die menschliche EST-Datenbank GenBank dbest (Benson et al., supra) mit Hilfe des BLAST Programms (Altschil et al., supra) nach homologen Sequenzen durchsucht. Es fanden sich vier Sequenzeinträge (W76571, W72002, AA055832 und AA055833) die mit dem Maus mKAP13 und/oder mit den gefundenen ESTs Ähnlichkeiten aufwiesen. Aus den vier Sequenzen wurde mit Hilfe des Programms SeqMan die Konsensussequenz ermittelt und PCR Primer konstruiert (AACTCAGCTGAACTCACATCTCCCGTCAAC (SEQ ID Nr. 73) und GTCTGAAAGAACTAGCCTGTCCAGCCAGTA (SEQ ID Nr. 74). Mit diesen Primern wurde wie oben beschrieben (siehe Beispiel 6) mit Hilfe der PCR aus cDNA, die aus intakter menschlicher Haut gewonnen wurde (siehe Beispiel 1), das menschliche Homolog von mKAP 13 amplifiziert, kloniert und sequenziert (Fig. 12). Dabei ergab sich, daß durch die allgemein bekannte schlechte Qualität der EST Sequenzen, die tatsächliche Sequenz deutlich von der durch die EST- Assemblierung vorhergesagte Sequenz abwich, so daß die Auswahl der Primer sehr kritisch für den Erfolg der Klonierung war.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (32)

1. Verwendung mindestens eines Polypeptids oder funktioneller Varianten davon oder Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, vorzugsweise mit mindestens 8 Aminosäuren, insbesondere mit mindestens 12 Aminosäuren gemäß einer der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 9 oder dieses kodierende Nukleinsäuren, funktioneller Varianten davon oder Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, vorzugsweise mit mindestens 18 Nukleotiden, insbesondere mit mindestens 24 Nukleotiden zur Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen.

2. Verwendung mindestens eines Polypeptids oder funktioneller Varianten davon oder Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, vorzugsweise mit mindestens 8 Aminosäuren, insbesondere mit mindestens 12 Aminosäuren gemäß einer der SEQ ID Nr. 10 bis SEQ ID Nr. 50 und SEQ ID Nr. S5 bis SEQ ID Nr. 58 oder dieses kodierende Nukleinsäuren, funktioneller Varianten davon oder Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, vorzugsweise mit mindestens 18 Nukleotiden, insbesondere mit mindestens 24 Nukleotiden zur Diagnose und/oder Behandlung von Hauterkrankungen und/oder Behandlung bei der Wundheilung oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen.

3. Verwendung eines Polypeptids oder funktioneller Varianten davon oder Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, vorzugsweise mit mindestens 8 Aminosäuren, insbesondere mit mindestens 12 Aminosäuren gemäß einer der SEQ ID Nr. 51 bis SEQ ID Nr. 54 oder seiner kodierenden Nukleinsäure, funktioneller Varianten davon oder Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, vorzugsweise mit mindestens 18 Nukleotiden, insbesondere mit mindestens 24 Nukleotiden zur Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen.

4. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine DNA, insbesondere eine doppelsträngige DNA ist.

5. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz der Nukleinsäure mindestens ein Intron und/oder eine polyA-Sequenz aufweist.

6. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in Form ihrer antisense-Sequenz.

7. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure synthetisch hergestellt worden ist.

8. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid synthetisch hergestellt worden ist.

9. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid ein Fusionsprotein ist.

10. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Vektors, vorzugsweise in Form eines Plasmids, shuttle Vektors, Phagemids, Cosmids, Expressionsvektors oder gentherapeutisch wirksamen Vektors.

11. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines knock-out Genkonstrukts oder einer Expressionskassette.

12. Wirtszelle, transformiert mit einem Vektor oder einem knock-out Genkonstrukts nach einem der Ansprüche 10 oder 11.

13. Wirtszelle nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Hautzelle handelt.

14. Transgene embryonale nichtmenschliche Stammzelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein knock-out Genkonstrukt oder eine Expressionskassette nach Anspruch 11 enthält.

15. Verfahren zur Herstellung eines transgenen nichtmenschlichen Säugetiers, dadurch gekennzeichnet, daß eine embryonale nichtmenschliche Stammzelle nach Anspruch 14 zu einem transgenen nichtmenschlichen Säugetier regeneriert wird.

16. Transgenes nichtmenschliches Säugetier, dadurch gekennzeichnet, daß sein Genom ein knock-out Genkonstrukt oder eine Expressionskassette nach Anspruch 11 enthält.

17. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids zur Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Behandlung bei der Wundheilung oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen in einer geeigneten Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 7 exprimiert wird.

18. Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins zur Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Behandlung bei der Wundheilung oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen in einer geeigneten Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 7 exprimiert wird.

19. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, vorzugsweise eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers zur Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Behandlung bei der Wundheilung oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antikörper produzierender Organismus mit einem Polypeptid oder funktionelle Äquivalente davon oder Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, vorzugsweise mit mindestens 8 Aminosäuren, insbesondere mit mindestens 12 Aminosäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 8 oder 9 immunisiert wird.

20. Antikörper zur Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Behandlung bei der Wundheilung oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 8 oder 9 gerichtet ist.

21. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 20 zur Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Behandlung bei der Wundheilung oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen.

22. Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen und/oder Erkrankungen bei der Wundheilung, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens ein Antikörpers nach einem der vorgenannten Ansprüche zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen kombiniert wird.

23. Diagnostikum zur Diagnose von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen und/oder Erkrankungen bei der Wundheilung, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens einen Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, enthält.

24. Diagnostikum nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Sonde, vorzugsweise eine DNA-Sonde, enthält.

25. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen und/oder Erkrankungen bei der Wundheilung, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens ein Antikörpers nach einem der vorgenannten Ansprüche zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen kombiniert wird.

26. Arzneimittel zur Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen und/oder Erkrankungen bei der Wundheilung, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens einen Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, enthält.

27. Verwendung eines Arzneimittels nach Anspruch 26 zur Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen und/oder Erkrankungen bei der Wundheilung.

28. Verfahren zur Herstellung eines Tests zur Auffindung funktioneller Interaktoren in Zusammenhang mit Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen und/oder Erkrankungen bei der Wundheilung, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptids oder mindestens ein Antikörpers nach einem der vorgenannten Ansprüche zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen kombiniert wird.

29. Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren in Zusammenhang mit Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen und/oder Erkrankungen bei der Wundheilung, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens einen Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, enthält.

30. Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang mit Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Erkrankungen bei der Wundheilung, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens ein Antikörper oder Antikörperfragment nach einem der vorgenannten Ansprüche auf einem Trägermaterial fixiert wird.

31. Auf einem Trägermaterial fixiertes Array zur Analyse in Zusammenhang mit Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Erkrankungen bei der Wundheilung, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Nukleinsäure und/oder mindestens ein Polypeptid und/oder oder mindestens einen Antikörper oder Antikörperfragment nach einem der vorgenannten Ansprüche enthält.

32. DNA-Chip und/oder Protein-Chip zur Analyse in Zusammenhang mit Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Erkrankungen bei der Wundheilung, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Nukleinsäure und/oder mindestens ein Polypeptid und/oder oder mindestens einen Antikörper oder Antikörperfragment nach einem der vorgenannten Ansprüche enthält.