ITMI990275A1

ITMI990275A1 - Peptidi sintetici aventi la capacita' di diminuire la tensione superficiale e loro impiego nella preparazione di un surfattante artificiale

Info

Publication number: ITMI990275A1
Application number: IT1999MI000275A
Authority: IT
Original assignee: Chiesi Farma Spa
Priority date: 1999-02-12
Filing date: 1999-02-12
Publication date: 2000-08-12
Also published as: TR200102308T2; MA25381A1; EP1151008A1; SK11442001A3; SK286428B6; JP2002541062A; AU758735B2; HUP0200141A3; BG105764A; NZ513451A; NO20013888D0; CA2362507C; PL349785A1; IL144842A0; EA200100749A1; UA72751C2; CZ301108B6; PT1151008E; PL201084B1; HK1042500A1

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo:

"PEPTIDI SINTETICI AVENTI LA CAPACITA’ DI DIMINUIRE LA TENSIONE SUPERFICIALE E LORO IMPIEGO NELLA PREPARAZIONE DI UN SURFATTANTE ARTIFICIALE”

La presente invenzione si riferisce a nuovi peptidi artificiali con proprietà tensioattive. In particolare, l’invenzione si riferisce ad analoghi della proteina SP-C del surfattante che, una volta combinati con opportuni lipidi, sono particolarmente efficaci nel ridurre la tensione superficiale al'interfaccia aria-liquido.

Pertanto, i peptidi del’invenzione possono essere usati in combinazione con lipidi, ed eventualmente in combinazione con la proteina SP-B o con SP-B analoghi o con polimixine, per la preparazione di surfattanti artificiali utili nel trattamento della sindrome da distress respiratorio (RDS) e di altre malattie associate a disfunzioni del surfattante polmonare.

Background dell’invenzione

Il surfattante polmonare riduce la tensione superficiale alFinterfaccia aria-liquido della parete interna degli alveoli, prevenendo così il collasso dei polmoni al termine dell’espirazione. La carenza di surfattante è una disfunzione comune nei neonati prematuri ed è l’origine di una patologia chiamata RDS, che può essere efficacemente trattata con surfattanti naturali estratti dai polmoni animali (1). I principali costituenti di queste preparazioni di surfattante sono fosfolipidi come l,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), fosfatidilglicerolo (PG) e le proteine idrofobiche del surfattante B e C (SP-B e SP-C). Le proteine idrofile del surfattante SP-A e SP-D, che sono ledine collagene di tipo C (Ca<2+>-dipendenti) e che si pensa agiscano principalmente nel sistema di difesa dell’ organismo, non sono normalmente contenute nelle preparazioni di surfattante in conseguenza delle procedure di estrazione con solvente organico impiegate.

SP-B e SP-C costituiscono solo circa l 1-2% in peso del surfattante, ma sono in grado di migliorare notevolmente le proprietà tensioattive, rispetto a preparazioni lipidiche pure (2,3). Le strutture primaria e secondaria di SP-B e SP-C e una struttura terziaria di SP-C in soluzione sono note (4). SP-B è costituita da due catene polipeptidiche identiche di 79 amminoacidi, connesse da un ponte disolfuro intermolecolare (5,6). Ciascuna catena monomerica possiede tre ponti disolfuro intramolecolari e si avvolge a formare almeno quattro eliche antipatiche con una superficie polare e una non polare attraverso le quali SP-B può interagire con due doppi strati lipidici in modo da portarli in stretta vicinanza (7). SP-C è una lipoproteina composta da 35 residui amminoacidici con un dominio ad α-elica tra i residui 9-34 (8). L’elica è costituita principalmente da residui di vaiina e viene incorporata in un doppio strato lipidico orientata parallelamente alle catene aciliche lipidiche (9). Due gruppi palmitoilici sono legati covalentemente ai residui di cisteina in posizione 5 e 6 nella parte N-terminale del peptide (5). I due residui di arginina e lisina, nelle posizioni 11 e 12, carichi positivamente, verosimilmente interagiscono con i gruppi di testa carichi negativamente della membrana lipidica, aumentando così la sua rigidità. La rigidità dell’interazione lipide-peptide può diminuire verso l’estremità C-terminale, dove sono presenti solo residui piccoli o non polari, rendendo questa parte potenzialmente più mobile in un doppio strato fosfolipidico. Si pensa che SP-C possa influenzare lo spessore e la fluidità dei lipidi circostanti attraverso l’elica estremamente stabile di polivalina (4).

Stato dell’arte

Poiché le preparazioni di surfattante ottenute da tessuto animale presentano alcuni svantaggi, come la loro limitata disponibilità, l’eventuale presenza di agenti infettivi e la possibilità di induzione di reazioni immunitarie, sono stati fatti dei tentativi di preparare surfattanti àrtifìciali (4, 10), solitamente a partire da lipidi sintetici e proteine idrofobiche.

Studi precedenti hanno dimostrato che la SP-C sintetica difficilmente si ‘ripiega’ nella conformazione ad α-elica necessaria per avere proprietà tensioattive ottimali (11).

Di conseguenza, SP-C sintetici e analoghi di SP-C non si ripiegano come il peptide nativo, e non interagiscono propriamente con i lipidi del surfattante. Per ovviare a questo problema, sono stati intrapresi diversi tentativi per modificare la sequenza, per esempio sostituendo tutti i residui di Val dell’elica nella SP-C nativa con Leu, che favorisce notevolmente la conformazione ad α-elica. Il corrispondente analogo "transmembranoso", SP-C(Leu), ha mostrato un’eccellente diffusione all’ interfacci a aria-liquido quando combinato con DPPC:PG:acido palmitico(PA) in rapporti 68:22:9 p/p/p. Tuttavia, il valore di ymax (tensione massima superficiale durante compressione ciclica della superficie) era significativamente più alto di quello del surfattante naturale. Non è stato inoltre possibile preparare miscele lipidepeptide a concentrazioni superiori a circa 20 mg/ml, probabilmente a causa della formazione di oligomeri peptidici (12). Altri autori hanno sintetizzato analoghi bioattivi di SP-C costituiti da polileucine di varia lunghezza. In questi studi non sono stati riportati né oligomerizzazione né problemi nell’allestimento di preparazioni con elevata concentrazione di lipidi.

In varie pubblicazioni viene affrontato il problema di sintetizzare analoghi peptidici dei peptidi del surfattante naturale, e vengono fomite diverse soluzioni. Tra queste pubblicazioni, W093/21225, EP 0 733 645, W096/17872, a nome Tokyo Tanabe, descrivono analoghi peptidici della SP-C naturale, che in generale differiscono dal peptide naturale per la sequenza N.-terminale.

Le domande di brevetto a nome Scripps Research Institute WO89/06657 e W092/22315 descrivono analoghi della SP-B con residui amminoacidici idrofobici e idrofilici alternati.

Clercx A. et al., Eur. J. Biochem. 229, 465-72, 1995, descrivono peptidi di varie lunghezze corrispondenti alla sequenza N-terminale della SP-C del maiale e un peptide ibrido derivato dalla SP-C suina e da batteriorodopsina.

Johansson J. Et al., Biochem. J. 307, 535:41, 1995, descrivono peptidi sintetici che differiscono dalla SP-C suina naturale per sostituzione di alcuni amminoacidi.

WO89/04326 a nome California Biotechnology - Byk Gulden, e WO91/18015 a nome California Biotechnology Scios Nova, descrivono analoghi della SP-C contenenti una sequenza N-terminale iniziale in cui le due Cys di SP-C naturale vengono sostituite da due Ser.

Descrizione del'invenzione

E’ stato ora trovato che sostituendo residui di amminoacidi neutri con residui polari o ingombranti, residui di Val con altri residui neutri e idrofobici, residui di Cys con Ser, si ottiene un analogo di SP-C con proprietà particolarmente favorevoli di riduzione della tensione superficiale.

L’invenzione fornisce analoghi della SP-C che hanno la seguente formula generale (I), usando per gli amminoacidi il codice ad una lettera:

(I)

in cui:

X è un amminoacido scelto dal gruppo comprendente V, I, L, Nle (norleucina);

B è un amminoacido scelto dal gruppo comprendente Ornitina, K, I, W, F, Y, Q, N;

Z è un amminoacido scelto dal gruppo comprendente S, C, F o residui di S o C sostituiti con gruppi acilici contenenti 12-22 atomi di carbonio legati alla catena laterale rispettivamente attraverso legami estere o tioestere;

a è un numero intero da 1 a 19;

b è un numero intero da 1 a 19;

c è un numero intero da 1 a 21 ;

d è un numero intero da 0 a 20;

e è 0 o 1;

f è 0 o 1;

n è 0 o 1;

m è 0 o 1,

con le condizioni:

n+m > 0;

è una sequenza avente in totale 22 amminoacidi,

preferibilmente da 10 a 22.

Peptidi preferiti di formula (I) hanno le seguenti sequenze:

in cui la serina può essere eventualmente acilata, ad esempio con palmitoile.

Tra le sequenze (Ia)-(Ie), quelle con B ono preferite.

Secondo le realizzazioni preferite dell'invenzione, i peptidi di formula (Ia)-(Ie) hanno rispettivamente le seguenti sequenze:

in cui la serina può essere eventualmente acilata, ad esempio con palmitoile.

I peptidi di formula (I) possono essere preparati usando tecniche convenzionali di sintesi peptidica.

Tali tecniche sono descritte per esempio in Schroeder et al., “The peptides”, voi. 1, Academic Press, 1965; Bodanszky et al., "Peptide synthesis", Interscience Publisher, 1996; Baramy & Merrifield, "The peptides; Analysis, Synthesis, Biology", voi. 2, cap. 1, Academic Press, 1980, e comprendono la sintesi peptidica in fase solida, in soluzione, metodi di sintesi di chimica organica, o qualsiasi loro combinazione.

I peptidi acilati sono preferibilmente sintetizzati per trattamento dei peptidi con un cloruro acilico in acido trifluoroacetico puro per 10 min a temperatura ambiente, dopodiché la reazione viene fermata per aggiunta di etanolo acquoso all’80% (E. Salakdeh-Yousefi, J. Johansson and R. Stròmberg, in corso di pubblicazione).

I peptidi dell’ invenzione possono essere vantaggiosamente preparati anche con tecniche di biotecnologia.

Dopo sintesi e purificazione, i peptidi sintetici vengono caratterizzati dal punto di vista biochimico e biofisico, come riportato nel seguito.

L’attività dei peptidi dell’invenzione nel ridurre la tensione superficiale è stata valutata in combinazione con lipidi, fosfolipidi, SP-B, analoghi di SP-B o polimixine. In particolare i peptidi sono stati combinati con DPPC/PG/PA con o senza SP-B, analoghi di SP-B o polimixine.

I risultati delle misure di attività tensioattiva con il surfattometro a bolla-pulsante chiaramente mostrano che i peptidi sintetici della presente invenzione sono in grado di diminuire considerevolmente la tensione superficiale minima e massima (ymin, ymax) durante la compressione ciclica della superficie fino a valori comparabili a quelli ottenuti usando surfattanti di origine naturale.

L’aggiunta di SP-B o polimixina B alla miscela peptide/lipidi e/o fosfolipidi ha fornito risultati particolarmente favorevoli.

Un secondo aspetto dell’invenzione riguarda l’uso in un surfattante artificiale di polimixine, in particolare polimixina B, in qualità di analoghi della SP-B, insieme a uno o più peptidi di formula (I), lipidi e/o fosfolipidi. Lipidi/fosfolipidi adatti possono essere scelti dal gruppo che comprende DPPC, altre fosfatidilcoline, PG, PA, triacilgliceroli e sfìngomielina.

Il surfattante può essere preparato miscelando soluzioni o sospensioni di peptidi e lipidi e per successivo essiccaménto della miscela. All’occorrenza la miscela essiccata può essere risospesa, dispersa o somministrata come tale in soggetti che necessitano di un trattaménto per carenza di surfattante.

Se la somministrazione è in forma di aerosol, sarà necessario combinare piccole particelle di surfattante con propellente inerte idoneo. Altre forme di somministrazione come la vaporizzazione o la nebulizzazione di soluzioni/sospensioni stabili di surfattante sono pure comprese nell’ambito dell’invenzione.

Secondo un ulteriore aspetto l’invenzione riguarda l’uso dei peptidi descritti e/o delle polimixine B nella preparazione di un surfattante da utilizzarsi in terapia in tutti i casi di carenza di surfattante o disfunzioni correlate. Tipicamente il surfattante verrà usato nel trattamento di RDS che colpisce frequentemente i neonati prematuri.

Esempi

I seguenti esempi illustrano l’invenzione in maggior dettaglio.

Esempio 1

Sintesi e purificazione del peptide

Un analogo di SP-C, SP-C(LKS) (Fig. 1) è stato sintetizzato a partire dai corrispondenti tertbutilossicarbonilderivati (13) utilizzando la tecnologia in fase solida in un’apparecchiatura Applied Biosystems 430A. La scissione del legame resina-peptide e la deprotezione delle catene laterali sono state condotte con acido fluoridrico anidro/ metossibenzene/dimetilsolfiiro 10:1 :1 (v/v/v) per 1,5 ore a 0°C. I gruppi protettori e gli “scavengers” (basi per neutralizzare l’acido fluoridrico) sono stati rimossi per estrazione ripetuta con dietiletere e il peptide è stato successivamente rimosso dalla resina con diclorometano/acido trifluoroacetico (TFA) 3:1 (v/v) seguito da evaporazione s.v. al rotavapor. L’estratto peptidico grezzo è stato ridisciolto ad una concentrazione di 100 mg/ml in cloroformio/metanolo 1: 1 (v/v) contenente il 5% di acqua. Un’aliquota di 10 mg è stata caricata su una colonna Sephadex LH-60 (40 x 1 cm) nello stesso solvente (2). Sono state raccolte frazioni di 2,5 mi e si sono misurate le assorbanze a 214 e 280 nm. L’identificazione e la determinazione quantitativa sono state effettuate via analisi amminoacidica.

Per l’acilazione, il peptide purificato (di solito circa 5 mg) viene essiccato, sciolto in TFA distillato (100 μl) e addizionato di un cloruro acilico (10-20 equivalenti rispetto al peptide). Dopo 10 minuti la reazione viene bloccata con etanolo acquoso all’ 80% (1,9 ml). I peptidi acilati vengono purificati per cromatografia su Lipidex 5000 eluendo con cloruro di etilene/metanolo 1:4 (v/v) seguita da purificazione su una colonna HPLC in fase inversa C18 usando un gradiente lineare a partire da una miscela di 2-propanolo/0,1% TFA fino ad una miscela di metanolo (acq.) 60% / TFA 0,1% o etanolo (acq.) 75% / TFA 0,1%.

Esempio 2

Caratterizzazione biochimica

La purezza del peptide è stata controllata via elettroforesi in gel di poliacrilammide e sodio dodecilsolfato (SDS) (PAGE) (Phast-system, Pharmacia, Svezia) e via HPLC in fase inversa usando una colonna CI 8 e un gradiente lineare da metanolo acquoso 60% / TFA a 0,1% e isopropanolo/TFA 0,1% (16).

Il peso molecolare è stato determinato via spettrometria di massa utilizzando uno strumento "matrix-assisted laser desorption ionisation-time-offlight (MALDI-TOF)" (Lasermat 2000, Finnigan MAT). Per la calibrazione è stato utilizzato un peptide intestinale vasoattivo di peso molecolare 3326.8.

La struttura secondaria del peptide è stata indagata via dicroismo circolare (CD) utilizzando uno spettropolarimetro Jasco-720 (Jasco, Giappone). Dopo solubilizzazione con trifluoroetanolo (TFE) gli spettri sono stati registrati da 260 a 184 nm con una velocità di scansione di 20 nm/min e una risoluzione di 2 punti/nm. La ellitticità molare residua è stata calcolata ed espressa in kdeg x cm2/dmol. Le ellitticità molari a 208 e 222 nm sono state utilizzate per stimare il contenuto di struttura a elica (17).

Le indagini di struttura secondaria di SP-C(LKS) via spettroscopia CD hanno mostrato uno spettro tipico di peptidi ad α-elica e un contenuto di aelica di circa 75%, stimato dai minimi a 208 nm e 222 nm. La struttura secondaria rimane stabile in seguito a graduali diluizioni con acqua fino al 12% di TFE a condizione che il peptide venga solubilizzato con TFE puro.

L’SDS-PAGE di SP-C(LKS) presenta una singola banda simile alla SP-C nativa mentre SP-C(Leu), a cui manca Lys nella parte elicoidale dà origine ad oligomeri. Contrariamente all’esperienza precedente con miscele di SP-C(Leu)/lipidi, che sono difficili da solubilizzare in concentrazioni maggiori di 20 mg/ml (12), è stato possibile fare una miscela SP-C(LKS)/lipide ad una concentrazione di lipide di 80 mg/ml e un rapporto polipeptide/lipide di 0,03.

Esempio 3

Preparazione di miscele peptìde/lipide

DPPC, PG e PA sono stati acquistati da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). I lipidi, disciolti in cloròformio/metanolo 98:2 (v/v), sono stati miscelati nelle proporzioni DPPC:PG:PA 68:22:9 (p/p/p) o DPPC/PG 7:3 (p/p). Le preparazioni di surfattante sono state allestite aggiungendo a ciascuna delle miscele lipidiche, SP-C(LKS) da solo o SP-C(LKS) e SP-B, in rapporti in peso totali di polipeptide/lipide di 0-0,05. Le miscele sono state evaporate sotto azoto e risospese in NaCl 150 mmol/l o in tampone Hepes 10 mmol/l a pH 6,9 contenente NaCl 140 mmol/l e CaCl2 2,0 mmol/l, in modo da avere una concentrazione di lipide di 10-80 mg/ml. Le sospensioni sono state ripetutamente congelate e sonicate (50 W, 48 kHz) fino ad omogeneità. In alcuni casi le sospensioni finali sono state incubate a 45°C per un’ora.

Le preparazioni di surfattante sospese in NaCl 150 mmol/1 hanno un pH' di 3. 5-5. 5. In preparazioni contenenti SP-B, sono stati osservati valori di pH inferiori, pari a 3. 5-4. 5. Dato che la SP-B naturale viene purificata usando solventi organici acidificati (2) piccole quantità di acido possono rimanere nelle preparazioni. Si è ottenuto un pH quasi fisiologico sospendendo la preparazione di surfattante in tampone Hepes a pH 6.9, contenente NaCl 140 mmol/1 e CaCl2 2 mmol/1. Rispetto alle corrispondenti preparazioni in soluzione fisiologica non tamponata non ci sono stati cambiamenti di ymax o Ymin quando è stata usata la miscela di lipidi DPPC/PG 7:3 (p/p). Tuttavia quando è stato incluso PA nella miscela lipidica, a valori di pH più elevati (preparazioni in tampone) si è osservato un aumento sia di che di (Tabelle 1 e 2).

Tabella 1 - Proprietà tensioattive di preparazioni di surfattante artificiale in soluzione fisiologica.

Le misure sono state effettuate direttamente dopo la preparazione dei campioni o dopo un’ora di incubazione a 45° C ad una concentrazione di 10 mg/ml di fosfolipidi in NaCl 150 mmol/l.

Le registrazioni sono state ottenute a tempi diversi con un surfattometro a bolla pulsante a 37°C e 50% di. compressione superficiale ad una frequenza di 40 cicli per minuto. I valori sono la media (in parentesi la deviazione standard SD) di 3-5 misurazioni. Le abbreviazioni sono definite nel testo.

Tabella 2 - Proprietà tensioattive di preparazioni di surfattante artificiale in tampone.

Le preparazioni sono state esaminate alla concentrazione di 10 mg/ml di fosfolipidi in 10 mmol/l di tampone Hepes (pH 6.9) contenente NaCl 140 mmol/l e CaCl2 2.0 mmol/l. Le registrazioni sono state ottenute con un surfattometro a bolla pulsante a 37°C e con una compressione della superficie del 50%, ad una frequenza di 40 cicli per minuto. I valori sono la media (in parentesi la deviazione standard SD) di 3-5 misurazioni.

Esempio 4

Preparazione di miscele di fosfolipidi con SP-C(LKS) e polimixina B DPPC e PG sono stati acquistati da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). I fosfolipidi, sciolti in cloroformio/metanolo 98:2 (v/v) sono stati miscelati nelle proporzioni DPPC/PG 7:3 (p/p). SP-C(LKS) è stato aggiunto alle miscele di fosfolipidi in modo da avere un rapporto totale in peso polipeptide/fosfolipide di 0,03. Le miscele sono state evaporate sotto azoto e risospese a temperatura ambiente in tampone Hepes 10 mmol/l, a pH 6.9, contenente NaCl 140 mmol/l e CaCl2 2,0 mmol/l o nello stesso tampone contenente 0,01% di polimixina B (PxB) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Le sospensioni sono state ripetutamente congelate e sonicate (50 W, 48 kHz) fino ad omogeneità. La concentrazione fosfolipidica finale per entrambe le preparazioni è stata di 10 mg/ml. L’aggiunta di PxB diminuisce γmax e fino a che si ottiene un’attività di superficie ottimale (Tabella 3).

Tabella 3 - Proprietà tensioattive di miscele di fosfolipidi con SP-C (LKS) e polimixina B

Le registrazioni sono state ottenute a tempi diversi con un surfattometro a bolla pulsante a 37°C e 50% di compressione di superficie, ad una frequenza di 40 cicli per minuto. I valori sono la media (+ deviazione standard SD) di 5-11 misurazioni. Le abbreviazioni sono definite nel testo.

Esempio 5

Caratterizzazione biofisica

Le cinetiche di diffusione superficiale sono state misurate a circa 34°C con una bilancia di Wilhelmy (Biegler, Vienna, Austria). La tensione superficiale è stata monitorata per 10 minuti usando una lamina di platino connessa a un estensimetro e inserita 1 mm in un'ipofase di 20 mi di NaCl 150 mmol/1 in un vassoio di teflon. Le sospensioni sono state aggiunte a gocce, in totale 1 mg di lipidi, sull’ipofase, a 4 cm dalla lamina di platino.

Le misure di cinetica di SP-C(LKS) 3% in peso in DPPC/PG, 7:3 (p/p), usando la bilancia di Wilhelmy, hanno mostrato una rapida diffusione con una tensione superficiale di 28 mN/m dopo 3 s (Fig. 2). La diffusione è stata sensibilmente più lenta usando 1% in peso di SP-C(LKS) nella stessa miscela lipidica. L’aggiunta di SP-B 2% in peso non ha cambiato significativamente la velocità di diffusione o la tensione superficiale di equilibrio (Fig. 2). Non si sono osservati miglioramenti dopo incubazione della miscela per 1 ora a 45° C. Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando una miscela di DPPC:PG:PA, 68:22:9 (p/p/p).

La tensione superficiale dinamica è stata registrata usando un surfattometro a bolla pulsante (Surfactometer International, Toronto, Canada) a 37°C durante compressione ciclica del 50% della superficie di bolla e a una frequenza di 40 cicli per minuto. Tutte le misure sono state effettuate sino a 5 min a una concentrazione lipidica di 10 mg/ml. Le pressioni sono state misurate a intervalli di tempo determinati e usate per calcolare le tensioni superficiali a grandezza di bolla minima (γ min) e màssima (γ max).

Nel surfattometro a bolla pulsante, dopo 1 minuto, SP-C(LKS) 3% in peso in DPPC:PG:PA, 68:22:9 (p/p/p) ha fornito un valore di ymin di meno di 1 mN/m mentre con SP-C(LKS) 3% in peso in DPPC:PG, 7:3 (p/p) si è osservato un ymin di 9-14 mN/m (Tabella 1).

La tensione superficiale al raggio di bolla massimo (ymax) era di circa 40 mN/m in entrambi i casi. L’aggiunta SP-B 2% in peso ha fornito valori di Ymax di 33-31 mN/m e ymin di 0-2 mN/m per entrambe le preparazioni lipidiche. Questi valori sono molto simili a quelli ottenuti con preparazioni surfattanti di origine naturale (19).

L'incubazione delle preparazioni a 45°C per un’ora non aveva effetto significativo sull’attività di superficie (Tabella 1). Diminuendo la quantità di SP-B a 0,5% in peso in SP-C(LKS) 3% in peso in DPPC:PG 7:3 (p/p), ymin tendeva a aumentare anche se i risultati non raggiungevano la significatività statistica (Tabella 1). Contrariamente a SP-B, l’aggiunta del peptide KL4, descritto in precedenza come analogo di SP-B (14) 2% in peso a SP-C(LKS) 3% in peso in DPPC:PG:PA 68:22:9 (p/p/p) non riduceva che rimaneva relativamente elevata ( 41-42 mN/m).

Esempio 6

L’effetto della terapia con surfattante sulle proprietà meccaniche di polmoni immaturi è stato valutato in 5 conigli neonati prematuri con un’età gestazionale di 27 giorni. Gli animali sono stati tracheotomizzati alla nascita e due di loro hanno ricevuto, attraverso la cannula tracheale, 2,5 ml/kg di surfattante artificiale contenente DPPC, PG e SP-C(LKS) con o senza polimixina B nelle proporzioni definite in precedenza. La concentrazione fosfolipidica totale del materiale surfattante esogeno era di 40 mg/ml. Un animale che serviva come controllo positivo è stato trattato con la stessa dose di surfattante naturale modificato disponibile in commercio (Curosurf®), diluito a 40 mg/ml. Un animale è stato trattato con una miscela di DPPC e PG in soluzione fisiologica (stesse concentrazioni) a una dose di 2,5 ml/kg. Un animale è stato mantenuto senza trattamento e serviva come controllo. Tutti gli animali sono stati mantenuti in box pietismografico termoregolato a 37°C e ventilati in parallelo per 60 min con ossigeno al 100% ad una frequenza di 40 atti respiratori/min e con tempo di inspirazione del 50% [Servo Ventilator 900B (Siemens-Elema, Solna, Svezia)]. I volumi tidalici sono stati misurati con un pneumotacografo collegato a ciascuna scatola pietismografica. Gli animali sono stati ventilati con una sequenza standardizzata di pressioni di insufflazione di picco (PIP): 35, 25 e 20 cm H20 (modificato da Berggren et al. 1985), con o senza una pressione di espirazione terminale positiva (PEEP) di 3 cm HzO. La compliance toraco-polmonare è stata calcolata come rapporto tra il volume tidalico e la differenza tra la pressione di insufflazione e quella di espirazione [PIP - PEEP] ed espressa come ml/cm H20.kg.

In confronto all’animale di controllo non trattato la compliance toracopolmonare era significativamente aumentata negli animali trattati con il surfattante artificiale, specialmente nell’animale che aveva ricevuto surfattante contenente polimixina B, anche se il miglioramento risultava inferiore a quello ottenuto dopo trattamento con una dose simile di surfattante naturale modificato. Il trattamento con fosfolipidi da soli non aveva effetto sulla compliance (Figura 3).

Breve descrizione delle figure

Fig. 1. Sequenze amminoacidiche e rappresentazione a “ruota elicoidale” di SP-C e suoi analoghi.

La sequenza di SP-C umana è tratta da (18) e quella di SP-C(Leu) da (12). SP-C(LKS) è basata sulla struttura primaria di SP-C ma tutti i residui Val alle posizioni 16-28 eccetto la posizione 17 vengono sostituiti da residui di Leu; residui di Lys sono stati introdotti alle posizioni 17, 22 e 27; Cys palmitoilate alle posizioni 5 e 6 sono state sostituite con Ser.

Fig. 2. Diffusione superficiale di preparazioni surfattanti sintetiche.

Cinetiche di diffusione dell’SP-C(LKS) 3% in peso (quadri ripieni, linea a puntini), e di 3% in peso SP-C(LKS) con aggiunta di SP-B 2% in peso (triangoli vuoti, linea tratteggiata). Tutte le preparazioni sono state esaminate ad una concentrazione di 10 mg/ml di DPPC/PG, 7:3 (p/p) in NaCl 150 mmol/1. Le registrazioni sono state ottenute con una bilancia di Wilhelmy e ciascun dato è la media di tre registrazioni diverse.

Fig. 3.

Compliance toraco-polmonare in 5 conigli neonati prematuri (età gestazionale di 27 giorni) ventilati con una pressione di insufflazione di picco di 25 cm H20. La compliance è significativamente migliorata nell’ animale trattato con surfattante naturale modificato (Curosurf) e moderatamente migliorata nei due animali che hanno ricevuto il surfattante artificiale basato su SP-C(LKS). L’aggiunta di polimixina B (PxB) appare aumentare l effetto del surfattante artificiale. La concentrazione di fosfolipidi è la stessa in tutti i gruppi di animali da esperimento, 40 mg/ml.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Analoghi di SP-C di formula generale (I), secondo il codice amminoacidico ad una lettera:

in cui: X è un amminoacido scelto dal gruppo comprendente V, I, L, Nle (norleucina); B è un amminoacido scelto dal gruppo comprendente Omitina, K, I, W, F, Y, Q, N; Z è un amminoacido scelto dal gruppo comprendente S, C, F o residui di S o C sostituiti con gruppi acilici contenenti 12-22 atomi di carbonio legati alla catena laterale rispettivamente attraverso legami estere o tioestere; a è un numero intero da 1 a 19; b è un numero intero da 1 a 19; c è un. numero intero da 1 a 21; d è un numero intero da 0 a 20; e è 0 o 1 ; f è 0 o 1; n è 0 o 1; m è 0 o 1, con le condizioni: n+m > 0; f> e;

preferibilmente da 10 a 22.
2. Analoghi di SP-C secondo la rivendicazione 1, di formula (la):
3. Analoghi di SP-C secondo la rivendicazione 1, di formula (Ib):
4. Analoghi di SP-C secondo la rivendicazione 1, di formula (le):
5. Analoghi di SP-C secondo la rivendicazione 1, di formula (Id):
6. Analoghi di SP-C secondo la rivendicazione 1, di formula (le):
7. Analoghi di SP-C secondo le rivendicazioni 1-6 in cui là serina è acilata, preferibilmente con palmitoile.
8. Analoghi di SP-C secondo le rivendicazioni 1-7, in cui B è lisina e X è leucina, isoleucina o norleucina.
9. Analoghi di SP-C secondo la rivendicazione 8, scelti dal gruppo che comprende:

in cui S è eventualmente acilata, preferibilmente con palmitoile.
10. Surfattante sintetico che comprende almeno un analogo di SP-C di formula (I) in miscela con lipidi e fosfolipidi.
11. Surfattante sintetico secondo la rivendicazione 10, in cui la miscela lipidi/fosfolipidi comprende DPPC, PG, PA.
12. Surfattante sintetico secondo le rivendicazioni 10-11, che inoltre comprende SP-B o un suo analogo attivo, o una polimixina.
13. Surfattante sintetico secondo le rivendicazioni 10-12, in forma di soluzione, dispersione, sospensione o polvere essiccata.
14. Uso di analoghi di SP-C delle rivendicazioni 1-7 per la preparazione di un surfattante artificiale da impiegare in terapia in tutti i casi di carenza o disfunzione del surfattante polmonare.
15. Uso di una polimixina e preferibilmente polimixina B per la preparazione di un surfattante artificiale come rivendicato nelle rivendicazioni 10-13, da impiegare in terapia in tutti i casi di carenza o disfunzione del surfattante polmonare.
16. Uso secondo le rivendicazioni 14 e 15, nella sindrome da distress respiratorio.