CZ301108B6

CZ301108B6 - SP-C analogy

Info

Publication number: CZ301108B6
Application number: CZ20012876A
Authority: CZ
Inventors: Curstedt@Tore; Johansson@Jan; Jornvall@Hans; Robertson@Bengt; Ventura@Paolo
Original assignee: Chiesi Farmaceutici S. P. A.
Priority date: 1999-02-12
Filing date: 2000-02-09
Publication date: 2009-11-11
Also published as: ZA200106530B; SK286428B6; ITMI990275A1; IL144842A0; NO20013888L; CN1221570C; SK11442001A3; CZ20012876A3; US7053044B1; KR100645145B1; PL349785A1; AU3279300A; JP2002541062A; BG105764A; EA004058B1; NZ513451A; AR022578A1; CA2362507A1; ES2228473T3; CO5241361A1

Abstract

Rešení se týká vyrobených povrchove aktivních peptidu, které v kombinaci s vhodnými lipidy významne snižují povrchové napetí na rozhraní vzduch-kapalina a lze je v kombinaci s lipidy, SP-B nebo jeho úcinnými analogy nebo substituovanými SP-B deriváty použít k terapii syndromu dechové tísne a jiných onemocnení spojených s nedostatkem nebo dysfunkcí surfaktantu, plicních onemocnení (pneumonie, bronchitidy, astmatu, syndromu dechové tísne novorozencu vyvolaného aspirací mekonia) a také težkého zánetu stredního ucha.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká vyrobených povrchově aktivních peptidů. Vynález se týká SP-C analogů, které v kombinaci s vhodnými lipidy významně snižují povrchové napětí na rozhraní vzduch-kapalina.

Peptidové SP-C analogy podle současného vynálezu lze použít v kombinaci s lipidy, v kombinaio ci s SP-B nebo jeho účinnými analogy nebo substituovanými SP-B deriváty k přípravě surfaktantů vhodných k terapii syndromu dechové tísně (respirátory distress syndrom - RDS) a jiných onemocnění spojených s nedostatkem nebo dysfunkcí surfaktantů, plicních onemocnění (pneumonie, bronchitidy, astmatu, syndromu dechové tísně novorozenců vyvolaného aspirací mekonia) a také jiných onemocnění (těžkého zánětu středního ucha).

Dosavadní stav techniky

Plicní surfaktanty snižují povrchové napětí na rozhraní vzduch kapalina alveolámí výstelky a zabraňují kolapsu plic na konci výdechu. Nedostatek surfaktantu je běžným onemocněním nedonošených dětí a je příčinou syndromu dechové tísně (RDS), které lze úspěšně léčit podáním surfaktantů extrahovaných z plic zvířat (T. Fujiwara a B. Robertson (1992) B. Robertson, L. M. G. van Goide a B. Batenburg: Pulmonary Surfactant: From Molecular Biology to Clinical Practice Amsterdam, Elsevier, str. 561-592).

Hlavní součásti těchto přípravků obsahujících surfaktanty jsou fosfolipidy jako je 1,2-dipahnitoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DPPC), fosfatidylglycerol (PG) a hydrofobní povrchově aktivní proteiny B a C (SP-B a SP-C). Hydrofilní povrchově aktivní proteiny SP-A a SP-D jsou kolagenové lektiny C-typu (Ca²⁺-dependentní), které nejsou z důvodu extrakčních postupů za použití organických rozpouštědel v používaných přípravcích surfaktantů obsaženy, přestože jsou složkou primární reakce proti hostiteli.

Hydrofobní SP-B a SP-C peptidy tvoří pouze 1 až 2 % hmotností surfaktantů, přestože jejich působením dojde k výraznému zlepšení povrchové aktivity ve srovnání s čistými lipidovými přípravky (T. Curstedt a spol.: (1987) Eur. J. Biochem. 168, 255-262; A. Takahashi, T. Němoto a T. Fujiwara: (1994) Acta Paediatr. Jap. 36,613-618).

Byla zjištěna primární a sekundární struktura SP-B a SP-C a terciární struktura SP-C v roztoku (viz příloha).

SP-B sestává ze dvou stejných polypeptidových řetězců o 79 aminokyselinách, které jsou spojeny disulfidickým můstkem (T. Curstedt a spol: (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, 29852989; J. Johansson, T. Curstedt a H. Jčmvall (1991) Biochemistry 30,6917-6921). Každý monomemí řetězec má tři meziretězcové disulfidické můstky a nejméně Čtyři amfipatické helixy s jed45 nou polární a jednou nepolární částí, kterými je SP-B v interakci s dvěmi lipidovými dvojvrstvami, což vede k jejich těsné blízkosti (M. Andersson a spol. (1995), FEBS Lett. 362,328-332).

SP-C je lipoprotein skládající se z 35 zbytků aminokyselin v uspořádání α-helix domény mezi zbytky aminokyselin 9-34 (J. Johansson a spol., (1994), Biochemistry 33, 6 015-6 023). Tato spirála je složena převážně ze zbytků valylu a je uložena v lipidové dvojvrstvě a orientována paralelně s acylovými řetězci lipidu (Vandenbussche a spol., (1992), Eur. J. Biochem., 203,201— 209). Dvě palmitové skupiny jsou kovalentně vázané ke zbytkům cysteinu v pozici 5 a 6 na Nkonci peptidu (T. Curstedt a spol., (1990), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, 2985-2989). Dva pozitivně nabité zbytky, arginin a lisyn, v pozicích 11 a 12 jsou pravděpodobně v interakci s negativně nabitými hlavičkovými skupinami lipidové membrány, čímž zvyšují její pevnost.

- i CZ 301108 B6

Pevnost interakce mezi lipidem a peptidem se zmenšuje směrem k C-konci, neboť obsahuje pouze malé nebo hydrofobní zbytky, takže je tato část teoreticky ve fosfolipidové dvoj vrstvě pohyblivější. Z výzkumu vyplývá, že SP-C díky neobyčejně stabilní polyvalylové šroubovici („polyvalyl helix“) ovlivňuje tloušťku a proměnlivost okolních lipidů (J. Johansson a T. Curstedt (1997), Eur. J. Biochem. 244, 675-693).

Přípravky surfaktantu získané z tkání zvířat mají mnoho nevýhod, především jejich omezené množství, pravděpodobnost přítomnosti infekčních agens a vyvolání imunologických reakcí. Byly provedeny pokusy o výrobu povrchově aktivních činidel především ze syntetických lipidů io a hydrofobních proteinů (J. Johansson a T. Curstedt (1997) Eur. J. Biochem, 244, 675-693;

J. Johansson a spol. (1996) Acta Paediatr. 85,642-646).

Předešlé práce ukázaly, že vyrobený SP-C peptid nelze uspořádat do a-helikální konformace jako je tomu u přirozeného peptidu, která je nutná k dosažení optimálního povrchového účinku (J. Johansson a spoL, (1995) Biochem. J. 307, 535-541), a tím také nedochází k interakci s povrchově aktivními lipidy,

Vyrobená SP-C analoga nevytváří konformaci jako přirozené peptidy a nevstupují do interakce s povrchově aktivními lipidy. K vyřešení tohoto problému se modifikovaly sekvence, například nahrazením všech valinových zbytků ve spirále přirozeného SP-C peptidu leucinem, který silně ovlivňuje vznik a—helikální konformace. Tento odpovídající transmembránový analog, SPC(Leu), má v kombinaci s hmotnostním poměrem DPPC:PG:PA = 68:22:9 dobré rozprostírám vlastnosti na rozhraní vzduchu a kapaliny. Během cyklické komprese povrchu se však prokázalo, že maximální hodnota povrchového napětí (Y_max) je významně vyšší než hodnota přirozených surfaktantu. Dále nebylo možné připravit lipido-peptidové směsi o vyšší koncentraci než 20 mg/ml, pravděpodobně díky vytváření peptidových oligomerů (G. Nilsson a spol. (1998), Eur. J. Biochem., 255,116-124).

Byla publikována zpráva o výrobě bioaktivních polyleucinových SP-C analogů různých délek (T. Takei a spol., (1996) Biol. Pharm. Bull. 19, 1 550-1 555). Tyto studie neinformují ani o samovolné oligomerizaci ani o přípravě vzorků s vysokou koncentrací lipidů.

Různé zveřejněné přihlášky se týkají problému výroby peptidových analogů přírodních povrchově aktivních peptidů s různými výsledky řešení. Mezi tyto přihlášky patří WO 93/21225,

EP 733645, WO 96/17872 (Tokyo Tanabe), které se týkají peptídového analoga přirozeného SPC, který se z podstatné části liší od přirozených peptidů v sekvenci N-konce.

Zveřejněné přihlášky WO 89/06657 a WO 92/22315 (Scripps Research Institute) se týkají SP-B analogů se střídajícími hydrofobními a hydrofilními zbytky aminokyselin. Mimo jiné se nárokuje peptid se střídajícími zbytky leucinu a lisynu (KL4).

Studie provedená A. Clercxem a spol. (Eur. J. Biochem 229, 465-72, 1995) se týká peptidů různých délek odpovídajících N-konci prasečího SP-C a hybridních peptidů odvozených od prasečího SP-C a bakteriorhodopsinu.

Studie provedená J. Johanssonem a spol. (Biochem. J. 307, 535: 41, 1995) se týká syntetických peptidů, které se liší od přirozeného prasečího SP-C substitucí některých aminokyselin.

Zveřejněné přihlášky WO 89/04326 (Califomia Biotechnology - Byk Golden) a WO 91/18015 (Califomia Technology - Scios Nova) se týkají SP-C analogů obsahující iniciální sekvenci Nkonce, ve které jsou dva cysteinové zbytky přirozeného SP-C nahrazeny dvěmi serotonínovými zbytky.

vz juiiuo do

Podstata vynálezu

Objevili jsme analoga SP-C peptidu následujících vlastností:

i. substituce valinových zbytků jinými neutrálními a hydrofobními zbytky, ii. substituce cysteinových zbytků serinovými zbytky, iii. nahrazení některých neutrálních zbytků aminokyselin rozměrnými nebo polárními zbytky, které významně snižují povrchové napětí.

Zjistili jsme, že pozitivní náboj daný přítomností polárních zbytků nebo prostorová zábrana roz15 měrnými substítuenty brání spontánní oligomerízaci.

Podstata současného vynálezu se týká SP-C analogů obecného vzorce I, (vyjádřený jednopísmenným označením aminokyselin):

FeGflPZZPVHLKRÍX^WXbBj^XeB^XdGALLMGL (1), kde:

X je aminokyselina ze skupiny I, L, Nle (norleucin),

B je aminokyselina ze skupiny K, W, F, Y, omithin,

Z je S, popřípadě vázaný esterovou vazbou s acylovou skupinou, obsahující 12 až 22 atomů uhlíku, a je celé číslo 1 až 19, b je celé číslo 1 až 19, c je celé číslo 1 až 21, d je celé číslo 0 až 20, a e je 0 nebo 1, f je 0 nebol, n je 0 nebo 1, m je0nebol, za předpokladu, že

- n + m > 0,

-f>e,

- (X_aB)_n(XbB)n(XcB)_mX_d je sekvence s obsahem nejvýš 22 aminokyselin, s výhodou 10 až 22 aminokyselin.

-3cz 301108 B6

Preferovanými peptidy obecného vzorce I jsou následující sekvence: (la) FGIPSSPVHLKRX4BX4BX4BXGALLMGL (lb) FGIPSSPVHLKRX₅BX₅BX₄GALLMGL (lc) FGIPSSPVHLKRX4BX11GALLMGL (ld) FG1PSSPVHLKRX₈BX₇GALLMGL ₅ (Ie) FGIPSSPVHLKRX11BX4GALLMGL

Preferujeme sekvence (Ia) - (le), kde B = lísyn nebo fenylalanin a X = leucin, izoleucin nebo norleucin.

ío Podstata vynálezu se především týká peptidů obecného vzorce (Ia) až (Ie) s následujícími sekvencemi:

FGIPSSPVHLKRLLILKLLLLKILLLKLGALLMGL

FGIPSSPVHLKRLLILLKLLLLIKLLILGALLMGL

FGIPSSPVHLKRLLILKLLLLLILLLILGALLMGL

FGIPSSPVHLKRLLILLLLLKLILLLILGALLMGL

FGIPSSPVHLKRLLILLLLLLLIKLLILGALLMGL [SP-C (LKS)], [SP-C (LKS) 1], [SP-C (LKS) 2], [SP-C (LKS) 3], [SP-C (LKS) 4],

FGIPSSPVHLKRLLILFLLLLFILLLFLGALLMGL [SP-C (LFS)J.

Podstata vynálezu se především týká analogů, kde serinové zbytky jsou spojeny kovalentní vazbou s acylovými skupinami obsahujícími 12 až 22 atomů uhlíku.

Peptidy obecného vzorce I lze vyrobit za použití metod syntézy nebo rekombinantním i technikami.

Dlouho používané metody syntézy peptidů jsou například popsány Schroederem a spol: The peptides, vol. 1, Academie Press, 1965; Bodanszkym a spol.: Peptide synthesis, Interscience Publisher, 1996; Baramy & Merrifield: The peptides; Anály sis. Synthesis, Biology, vol. 2, kap. 1, Academie Press, 1980, Mezi tyto metody patří syntéza na pevné fází, v roztoku, metody orga25 nické syntézy nebo jakákoli kombinace těchto metod.

S— nebo O- acylované peptidy se především vyrobily z neacylovaných peptidů působením acylchloridem v čisté kyselině trifluoroctové podle postupu Yousefí-Salakdeh a spol, Biochem. J.

1999, 343, 557-562. Po syntéze peptidů a jejich následném čištění se provedly biochemické a biofyzikální zkoušky popsané v příkladech provedení vynálezu.

.4.

VZJ JUI1UO υυ

Vliv peptidů na snížení povrchového napětí se hodnotil v jejich kombinaci s lipidy a fosfolipidy, SP-B, analogy SP-B nebo substituovanými SP-B peptidy. Peptidy se kombinovaly se směsí DPPC (l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholinu), PG (fosfatidyí-glycerolu) a PA (kyseliny palmitové) s nebo bez SP-B, jeho účinným analogem a polymyxiny.

Výsledky zkoušky povrchového napětí pulzující povrchové bubliny prokázaly, že peptidová analoga podle současného vynálezu snižují minimální a maximální hodnotu povrchového napětí během cyklické komprese povrchu (Y_mm a Υ^π) na hodnotu srovnatelnou s hodnotami surfaktantú získaných z přírodních zdrojů.

Přidání SP-B nebo jeho účinného analoga ke směsi peptidu / lipidofosfolipidů vedlo ke zlepšení výsledků. Zjistilo se, že polymyxiny, především polymyxin B, se chovají jako substituenty SP-B a po jejich přidání jsme dospěli ke stejným výsledkům srovnatelným s SP-B.

is Podstata současného vynálezu se za druhé týká vyrobeného surfaktantu obsahující jeden nebo více peptidů obecného vzorce I ve směsi lipidů a/nebo fosfolipídů a eventuálně SP-B, jeho účinným derivátem nebo polymyxiny. Vhodné lipidy/ fosfolipidy jsou vybrané ze skupiny stávající se z fosfatidylcholinů (především DPPC - l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholinu), fosfatidylglycerolu (PG), kyseliny palmitové (PA), triglycerolů, sfmgomyelinu.

Podstata současného vynálezu se především týká směsi surfaktantů obsahující peptid, ve kterém jsou řetězce palmitylu O-kovalentně vázané k serotoninovým zbytkům. Měřením pomocí zachycené bubliny se zjistilo, že směsi látek snižujících povrchové napětí obsahující dipalmitované formy vztažného peptidu (SP-C(Leu)) mají vyšší stabilitu povrchového filmu a vyšší zásobní množství lipidu spojeného s povrchem ve srovnání s odpovídajícím nepalmitovaným peptidem. Hodnota Ymm vzorků obsahujících 5% dipalmitovaného peptidu byly nižší než 1,5 mN/m a povrchová vrstva byla velmi stabilní, protože se povrchové napětí zvýšilo o méně než 0,5 mN/m během 10 minut při konstantním objemu bublin. Naproti tomu, hodnota Ymm nepalmitovaného peptidu byla přibližně 5 mN/m a povrchové vrstvy byly méně stabilní, což se projevilo častým zánikem bublin při nízkých hodnotách povrchového napětí. Po odstranění spodní vrstvy u vzorků obsahující nepalmitovaný peptid se po několika adsorpěních krocích ztratila schopnost dosáhnout téměř nulového stabilního povrchového napětí, zatímco s dipalmitovaným peptidem se kvalita povrchové vrstvy nezhoršila ani po více než 10 krocích expanze a začlenění zásobního materiálu odpovídajícímu více než dvěma monomolekulámím vrstvám. Zlepšení povrchové aktivity dipal35 mitovaných peptidů bylo také prokázáno měřením povrchového napětí pulzující bubliny.

Navíc bylo zjištěno, že přítomnost acylových skupin snižuje tendenci vytváření oligomerů. Jde o velmi důležitý poznatek výroby surfaktantů, neboť peptidová oligomerace znemožňovala přípravu směsi o vyšší koncentraci než 20 mg/ml (Nilsson a spol., Eur. J. Biochem. 1998, 255,

116-124).

Vyrobené povrchově aktivní látky lze připravit smícháním roztoků nebo suspenzí peptidů a lipidů a následným sušením směsi.

Sušené suspenze lze uvést do suspenze, disperze nebo podat jako takové pro terapii nedostatku surfaktantu.

Vyrobené surfaktanty lze nejvhodněji podat endotracheálně nebo aerosolem. V případě aerosolu jde o kombinaci malých částí surfaktantu s vhodným hnacím inertním plynem. Jinou formou podání je rozprašování nebo podání aerodisperze stabilních roztoků / suspenzí surfaktantu.

Podstata současného vynálezu se týká použití popsaných peptidů k výrobě činidel s povrchovým účinkem pro použití ve všech případech nedostatku surfaktantu dospělých i novorozenců nebo dysfunkcí, plicních onemocnění s tím souvisejících (pneumonií, bronchitid, astmatu, dechové tís55 ně novorozenců způsobené aspiraci mekonia) a jiných onemocnění (těžký zánět středního ucha).

-5Činidlo s povrchovým účinkem je především vhodné podat endotracheálně k léčbě syndromu dechové tísně, ke kterému především dochází u nedonošených dětí.

cz 501108 B6

Přehled obrázků na výkresech obr. 1: Sekvence aminokyselin a helikální konformace SP-C ajejich analogů io Sekvence lidského SP-C byla zveřejněna J. Johanssonem a spol. (1988), FEBS Lett. 232, 61-64 a SP-C(Leu) byla určena G. Nilssonem a spol. (1998), Eur. J. Biochem., 255, 116-124. Struktura SP-C(LKS) byla založena na primární struktuře SP-C, kde všechny valinové zbytky v pozicích 16-28 kromě pozice 17 byly nahrazeny leucinovými zbytky, v pozicích 17, 22 a 27 byly vloženy lisynové zbytky a palmitované cysteinové zbytky v pozicích 5 a 6 byly nahrazeny serotonínem.

obr. 2: Rozšiřování povrchu vlivem vyrobených surfaktantů

Kinetika rozšiřování povrchu 3 % hmotnostních SP-C(LKS) (plná křivka spojující plné čtverečky) a 3 % hmotnostních SP-C(LKS) s přidáním 2 % hmotnostních SP-B (prázdné trojúhelníky spojené přerušovanou křivkou). Všechny vzorky se zkoumaly při koncentraci 10 mg/ml DPPC/PG v poměru 7:3 hmotnostních ve 150mmol/l chloridu sodného. Měření probíhalo za použití Wilhelmovy váhy a každý údaj diagramu byl průměrem třech rozdílných měření.

obr. 3: Výsledky zkoušek in vivo

Plicní a thorakální kompliance pěti nedonošených novorozených králíků (gestační věk: 27 dní) ventilovaných standardizovaným dechovým objemem 8-10 ml/kg a bez použití ventilačního režimu pozitivního tlaku na konci výdechu (positive end-expiratory pressure PEEP). Kompliance se u léčených zvířat významně zlepšila. Přidání polymyxinu B (PxB) vedlo ke zvýšení účinku vyro30 bených surfaktantů. Koncentrace fosfolipidů byla 40 mg/ml a byla stejná ve všech přípravcích surfaktantů.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Syntéza peptidu a čištění

Analog SP-C, SP-C(LKS) (obr. 1) se vyrobil syntézou na pevné fázi za použití terc-butyloxykarbonylu (S. Β. H. Kent (1988), Annu. Rev. Biochem., 57, 957-989) na zařízení Applied Biosystem 430A. Štěpení vazby pryskyřice a peptidu a odstranění vedlejších řetězců se provedlo při teplotě 0°C v systému rozpouštědel stávajícího se z bezvodého fluorovodíku, metoxybenzenu a dimetylsulfidu v poměru objemů 10:1:1 během 1,5 hodiny. Ochranné skupiny a přebytek materiálu se odstranily opakovanou extrakcí diethyletherem, Peptid se následně extrahoval z pryskyřice směsí dichlormethanu a kyseliny trifluoroctové v poměru objemů 3:1 a následným odpařováním v rotační odpařovačce. Surový peptidový extrakt se v koncentraci 100 mg/ml rozpustil ve směsi chloroformu a methanolu v poměru objemů 1:1 obsahující 5 % vody. Podíl o hmotnosti

10 mg se umístil na kolonu Sephadex LH-60 (40 x 1 cm) ve stejném rozpouštědle (T. Curstedt a spol. (1987), Eur J. Biochem. 168, 255-262). Frakce o objemu 2,5 ml se sebraly a stanovily se hodnoty absorbance při 214 a 280 nm. Identifikace a kvantifikace se provedla analýzou aminokyselin.

-6vl υυιινσ uu

K následné acylaci se sušilo obvykle přibližně 5 mg čištěného peptidu, rozpustil se ve 100 μί destilované kyseliny trifluoroctové a přidalo se 10 až 20 ekvivalentů (vzhledem k peptidu) acyíchloridu. Po deseti minutách se reakce ukončila přidáním 1,9 ml 80% vodného roztoku ethanolu.

Čištění acylpeptidů se provedlo chromatografií na Lipidex 5000 při elucí směsí ethylenchloridu a methanolu v poměru objemů 1:4, a následně HPLC v reverzní fázi na fázi C18 při eluci lineárním gradientem systému rozpouštědel od směsi 2-propanolu a 0,1 % roztoku kyseliny trifluoroctové do směsi 60% vodného roztoku methanolu a 0,1 % roztoku kyseliny trifluoroctové nebo směsi 75% vodného roztoku ethanolu a 0,1 % roztoku kyseliny trifluoroctové.

Příklad 2

Určení biochemických vlastností

Čistota peptidu se kontrolovala modifikací elektroforézy na po lyakiy lovém gelu za použití dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) (Phastsystém, Pharmacia, Švédsko) a vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s obrácenými fázemi (HPLC) na fázi C18 a elucí lineárním gradientem systému rozpouštědel směsi 60% vodného roztoku methanolu a 0,1% kyseliny trifluoroctové a směsi izopropanolu a 0,1 % roztoku kyseliny trifluoroctové (M. Gustafsson a spol., (1997),

Biochem. 1326,799-806).

Stanovení hmotnostního spektra se provedlo metodou hmotnostní spektrometrie MALD1-TOF (matrix-assisted laser desorption ionisation -time-of-flight) na zařízení Lasermat 200, Finnigan MAT při kalibraci vazoaktivním intestinálním peptidem (M_r 3326,8).

Sekundární struktura peptidu se hodnotila spektroskopií cirkulámího dichroismu (CD) za použití zařízení Jasco-720 Jasco, Japonsko. Po rozpuštění v trifluorethanolu (TFE) se spektrum zaznamenávalo od 260 do 184 nm při rychlosti snímače 20 nm/min a při rozlišení 2 data body/nm, Výpočtem se zjistila reziduální molární eliptičnost vyjádřená v jednotkách kde gxcm²/dmol.

Podle hodnot molární eliptičnosti při 208 a 220 nm se zjistil obsah helikální struktury (C. J. Barrow a spol., (1992), J. Mol. Biol. 225,1075-1093).

Spektrum CD spektroskopie analoga SP-C(LKS) odpovídalo spektru typickému pro a—helikální peptidy. Z hodnot 208 nm a 220 nm minima se vypočítal obsah α-helikálních struktur, který byl přibližně 75%. Sekundární struktura zůstala stabilní během postupného ředění vodou do 12% trifluorethanolu (TFE), přičemž peptid byl uveden do roztoku v čistém trifluorethanolu (TFE).

Metodou SDS-PAGE analoga SP-C(LKS) se prokázala přítomnost jednoduché vazby obdobné přirozenému SP-C, zatímco analog SP-C(Leu), kde v helikální části chybí lisyn, tvořil oligome40 ry. Na rozdíl od naší zkušenosti, že směsi SP-C(Leu) a lipidu je obtížné rozpustit ve vyšší koncentraci než 20 mg/1 (G. Nilsson, a spol., (1998), Eur. J. Biochem., 255, 116-124), bylo možné vytvořit směs SP-C(LKS) a lipidu s koncentrací lipidu 80 mg/1 a poměrem polypeptidů a lipidu = 0,03.

Příklad 3

Příprava směsí peptidu a lipidu

DPPC, PA a PG jsme získali od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Lipidy se rozpustily ve směsi chloroformu a methanolu v poměru objemů 98:2 a používaly se ve směsích DPPC:PG:PA v poměru hmotností 68:22:9 nebo DPPC:PG v poměru hmotností 7:3. Přípravky surfaktantů se připravily přidáním SP-C(LKS) samotného nebo SP-<(LKS) a SP-B do každé směsi lipidů v celkovém poměru hmotností polypeptidů a lipidu 0 až 0,05. Směsi se odpařovaly v atmosféře dusíku a uvedly se do suspenze v 150 mmol/1 chloridu sodného nebo v 10 mmol/1 pufru Hepes

-7CZ 301108 B6 (ρΗ 6,9), obsahujícího 140 mmol/1 chloridu sodného a 2,0 mmol/1 chloridu vápenatého pri koncentraci lipidů v rozmezí 10 až 80 mg/ml. K dosažení homogenní suspenze se směs několikrát zmrazila a soníkovala (50 W, 48 kHz). V některých případech se výsledná suspenze inkubovala 1 hodinu pri teplotě 45 °C.

Přípravky surfaktantu se uvedly do suspenze ve 150 mmol/1 chloridu sodného (pH 3,5-5,5). Nižší pH hodnoty (3,5-4,5) se zjistily v přípravcích obsahujících SP-B, neboť nativní SP-B se čistily okyselenými organickými rozpouštědly (T. Curstedt a spol., (1987), Eur. J. Biochem., 168, 255262), a bylo možné, že v přípravku zůstala malá příměs kyseliny. Hodnoty blízké fyziologickému io pH se získaly uvedením přípravku surfaktantu do suspenze v Hepes pufru (pH 6,9), obsahujícího

140 mmol/1 chloridu sodného a 2 mmol/1 chloridu vápenatého (tabulka 1). Hodnoty Y_max nebo

Ymiti byly stejné ve srovnání se směsí DPPC:PG v poměru hmotností 7:3 jako směsi lipidů a odpovídajících přípravků v chloridu sodném bez pufru. Pokud však byla ve směsi lipidů přítomna kyselina palmitová (PA), pak hodnoty Υ^ nebo Y_min byly při vyšším pH zvýšené (tabulka 1 a 2).

Tabulka 1: Povrchová aktivita vyrobených surfaktantů ve fyziologickém roztoku chloridu sodného

Měření se provedlo přímo po přípravě vzorků nebo po 1 hodině inkubace při teplotě 45 °C. Koncentrace fosfolipidů byla 10 mg/ml ve 150 mmol/1 chloridu sodného. Hodnoty se zaznamenávaly v různých časových intervalech měřením povrchového napětí pulzující bubliny při teplotě 37 °C, 50% kompresi povrchu a pri frekvenci 40 otáček za minutu. Uvedené hodnoty jsou průměrem (směrodatná odchylka) 3 až 5 měření. Zkratky jsou vysvětleny v textu.

o

CL OUUUO BO

Povrchové napětí (mN/m)

5 min

X β ε >

41(0)

41(1)

S 8

25(2)

χ^ γμ cí

42(3)

33(1)

x-S Τ’ 'χ-* (0 (0

χ—χ V“ V-X τ- <0

34(2)

Ymin

Τ— V

V

Τ· V

Χ~\ ΙΟ σ>

Χ*\ ’Τ CO

ΟΙ

1(0)

V

3(1)

1 min

X (0 ε >-

41(1)

τ- *^χ Τ-

3 η

οΓ 3

S ΟΙ

39(5)

δ τ· (0

33(2)

$ to οι

29(2)

£ ε >

Ύ— V

τ- V

V

τ— V

X

Χ“Χ tO α

r- ΟΙ

Χ~ν Τ— χ-χ T“

XS &

δ

(0 lO O-

X β ε >

41(1)

χ“χ & tO <ο

ΧΚ 'Τ (0

δ 0) fO

35(5)

χ-** •χζ CO

29(3)

24(4)

29(1)

C ε >

τ- V

V

τ- V

ΟΙ

(Ο CO

** 'Μ-* ΟΙ

δ to

τ- V

3 ’Τ

Teplota

J 5 3 £ 2

□ ϊο '’Τ

I

§

I

ϋ ο ιο

ο ^β$

1

45°C

Přípravek surfaktantu

Fosfolipidy

< ÚL δ α δ 0. 0- □

DPPC/PG/PA

< ÉL δ α. £ 0. ο

DPPC/PG/PA

Ο CL δ ο_ ο_ Q

DPPC/PG

Od/OddO

φ I d. £ « 5 £

1

ΟΙ

1

οι

Τ-

ιη ο

§ S CL # ω

CO

η

<ο

<0

<Ό

to

η

-9CZ 301108 B6

Tabulka 2: Povrchová aktivita vyrobených surfaktantu v pufrovaném solném roztoku

Hodnotily se vzorky obsahující fosfolipidy v koncentraci 10 mg/ml v Hepes pufru (pH 6,9) s s obsahem 140 mmol/1 chloridu sodného a 2,0 mmol/1 chloridu vápenatého. Údaje se zaznamenávaly v různých časových intervalech měřením povrchového napětí pulzující bubliny při teplotě °C, 50% kompresi povrchu a při frekvenci 40 otáček za minutu. Hodnoty jsou průměrem (směrodatná odchylka) 3 až 5 měření. Zkratky jsou vysvětleny v textu.

přípravek surfaktantu	povrchové napětí (mN/m)
SP-C (LKS) % hmotn.	SP-B %hmotn	Fosfolipidy	7,5 s	1 min	5 min
Ymln	Ymax	Ymin	Ymax	Ymin	Ymax
3	-	DPPC/PG/PA	4(1)	44(2)	5(2)	47(2)	7(2)	50(1)
3	2	DPPC/PG/PA	3(3)	38(3)	4(4)	40(2)	3(3)	44(2)
3	-	DPPC/PG	15(3)		16(2)	42(3)	13(3)	44(3)
3	2	DPPC/PG	39(4) 2(2)	26(3)	1(1)	29(3)	<1	35(1)

Příklad 4

Příprava směsi fosfolipidů, SP-C(LKS) a polymyxinu B

DPPC a PG byly získány od Sigma Chemical CO. (St. Louis, MO). Fosfolipidy se rozpustily ve směsi chloroformu a methanolu v poměru objemů 98:2 a používaly se ve směsích DPPC;PG v poměru hmotností 7:3 nebo DPPC:PG v poměru hmotností 7:3. Přípravky surfaktantů se připra20 vily přidáním SP-C(LKS) do každé směsi lipidů v celkovém poměru hmotnosti polypeptidu a lipidu 0,03. Směsi se odpařovaly v atmosféře dusíku a uvedly se do suspenze v 10 mmol/1 pufru Hepes (pH 6,9), obsahujícího 140 mmol/1 chloridu sodného a 2,0 mmol/1 chloridu vápenatého, nebo ve stejném pufru obsahujícím 0,01 % polymyxinu B (PxB) (Sigma Chemical CO., st. Luois, MO). K dosažení homogenní suspenze se směs několikrát zmrazila a sonikovala (50 W, 48 kHz).

Výsledná koncentrace fosfolipidů obou přípravků byla 10 mg/ml. Přidáním polymyxinu B (PxB) došlo ke snížení obou hodnot Y_max nebo Y_min (tabulka 3).

- in _

Tabulka 3: Povrchová aktivita vyrobených surfaktantu ve směsi s polymyxinem B a bez něj

JVIÍW ου

Přípravek surfaktantu	Povrchové napétí (mN/m)
SP-C (LKS) %hmotn.	PxB %hmotn.	Fosfolipidy	7,5 s	1 min	5 min
Ymin	Ymax	Ymin	Ymax	Ymin	Ymax
3	—	DPPC/PG	15(3)	39(4)	16(2)	42(3)	13(3)	44(3)
3	1	DPPC/PG	3(2)	29(3)	2(2)	31(4)	1(1)	34(2)

Příklad 5

Bioťyzikální vlastnosti

Kinetika rozšiřování povrchu se měřila při teplotě 34 až 37 °C metodou podle Wilhelmy („Wilhelmy plate method“) (Biegler, Vienna, Austria). Povrchové napětí se měřilo 10 minut za použití desky platiny spojené s tenzometrem a ponořené na 1 mm do spodní fáze sestávající z 20 ml chloridu sodného o koncentraci 150 mmol/l v teflonové nádobě. Do spodní fáze se po kapkách přidávala suspenze odpovídající množství 1 mg fosfolipidů, a to 4 cm od desky platiny.

Měřením kinetiky rozšiřování povrchu přípravky surfaktantů sestávající z 3 % hmotnostních analoga SP-C(LKS) ve směsi DPPC:PG v poměru hmotností 7:3 za použití Wilhelmovy váhy se prokázalo rychlé rozšiřování s povrchovým napětím 28 mN/m po 3 s (obr. 2). Rozšiřování bylo pomalejší při koncentraci 1 % hmotnostní analoga SP-C(LKS) ve stejné směsi fosfolipidů (měření není uvedeno). Po přidání 2 % hmotnostních SP-B nedošlo k významné změně rychlosti rozšiřování nebo rovnovážné hodnoty povrchového napětí (obr. 2). K žádnému zlepšení nedošlo ani po inkubaci směsi 1 hodinu při teplotě 45 °C (měření není uvedeno). K obdobným výsledkům se dospělo při měření přípravku surfaktantu obsahujícího směs DPPC:PG:PA v poměru hmotností

68:22:9 jako směs fosfolipidů.

Dynamické povrchového napětí se měří surfaktometricky metodou pulzující bubliny (Surfactometer International, Toronto, Kanada) při teplotě 37 °C během 50% cyklické komprese povrchu bubliny a frekvenci 40 otáček za minutu. Každé měření trvalo 5 minut a provedlo se při koncent30 raci lipidů 10 mg/ml. Tlakové gradienty napříč stěnou bubliny, které byly použity k výpočtu povrchového napětí při minimální (Y_min) a maximální (Y_max) velikosti bubliny, se měřily v určitých časových intervalech.

Surfaktometr pulzující bubliny směsi 3 % hmotnostních SP-C(LKS) ve směsi DPPC:PG:PA v poměru hmotností 68:22:9 vyhodnotil povrchové napětí při nejmenším průměru bubliny (YmJ na méně než 1 mN/m, zatímco při měření směsi 3 % hmotnostních SP-XD(LKS) ve směsi DPPC:PG v poměru hmotností 7:3 byla vypočítána hodnota = 9-14 mN/m (tabulka 1). Povrchové napětí při maximálním průměru bubliny je přibližně 40 mN/m v obou případech. Přidáním 2 % hmotnostních SP-B byly zjištěny hodnoty Y_max = 31-33 mN/m a Ymi_n - 0-2 mN/m v obou přípravcích lipidů. Tyto hodnoty jsou podobné hodnotám získaným při měření přípravků surfaktantů získaných z přírodních zdrojů (B. Robertson a spol. (1990), Prog. Respir. Res. 25, 237—

246). Inkubace přípravků 1 hodinu při teplotě 45 °C neměla významný účinek na povrchové napětí (tabulka 1). Snížení množství SP-B na 0,5 % hmotnostních ve směsi 3 % hmotnostních

-11 CZ 301108 B6

SP-C(LKS) ve směsi DPPC:PG v poměru hmotností 7:3 vedlo ke snížení Y_miíl, i když ani tyto výsledky nedosáhly statistické signifikance (tabulka 1). Přidání 2 % hmotnostních KL₄ (peptid se střídajícími zbytky leucinu a lisynu) (C. G. Cochrane a S. D. Revak (1991), Science 254, 566568) ke směsi 3 %hmotnostních SP-C(LKS) ve směsi DPPC:PG:PA v poměru hmotností 68:22:9 nesnížilo hodnotu Y_max, která zůstala relativně vysoká, 41 -42 mN/m.

Příklad 6 io Srovnání směsi obsahujících dipalmitované a nepalmitované peptidové analogy

Přípravky surfaktantů byly vyrobeny přidáním 3 % hmotnostních SP-C(Leu) nebo dipalmitovaného SP-C(Leu) do směsi DPPC:PG;PA v poměru hmotností 68:22:9. Směsi se odpařila v atmosféře dusíku a v koncentraci 10mg/l lipidů se znovu uvedly do suspenze v chloridu sodném s koncentrací 150 mmol/1. K vzorkům, ve kterých se použil také SP-B, se přidalo také 1 % hmotnostní polymyxinu B.

U směsí obsahujících dipalmitovaný SP-C(Leu) samotný nebo také polymyxínB, došlo k významnému zlepšení zejména ve sníženi hodnoty Y_max v 5 minutě a hodnoty Y_mj_n v kratších časových intervalech.

Tabulka 4: Povrchová aktivita

Povrchové napětí směsi se hodnotilo měřením povrchového napětí pulzující bubliny. Po dvou minutách ekvilibrace se hodnoty odečítaly v různých časových intervalech při teplotě 37 °C, 50% kompresi povrchu a frekvencí 40 otáček za minutu.

Přípravek surfaktantů	Povrchové napět! (mN/m)
SP-C (Leu) %hmotn.	Dípalm. SP-C(Leu) %hmotn.	PxB %hmotn.	7,5 s	1 min	5 min
Ymin	Ymax	Ymin	Ymax	Ymln	Ymax
1			11	39	6,2	39	2	42
1		1	3	37	3	38	0	40
	1	-	1	34	1	35	1	36
	1	1	0	29	0	34	0	35

Příklad 7

Zkoušky in vivo

Účinek terapie surfaktanty na mechanické vlastnosti plic nedonošených se hodnotil na 9 předčasně narozených králících (gestační věk 27 dní).

. i? CL UVHVU UV

Zvířata se tracheotomizovala po narození a pěti z nich se tracheální kanylou dvakrát podal v množství 2,5 ml/kg vyrobený surfaktant obsahující směs DPPC, PG a SP-C(LKS) samotnou nebo s poíymyxinem B v poměrech shora uvedených. Celková koncentrace fosfolipidů v exogenním přípravku surfaktantu byla 40 mg/ml.

Dvěma zvířatům jako negativní kontrole se endotracheálně nepodala žádná látka, zatímco dvěma zvířatům jako pozitivní kontrole se podala stejná dávka modifikovaných přirozených surfaktantů (Curosurf, Chiesi Farmaceutici Spa, Parma, Italy), zředěná na 40 mg/ml. Jedno zvíře bylo léčeno dávkou 2,5 ml/kg směsi DPPC a PG v roztoku chloridu sodného (koncentrace shora uvedená).

Všechna zvířata byla chována v pletysmografických boxech pri teplotě 37 °C a paralelně ventilována 60 minut 100% kyslíkem za použití ventilátoru Servo Ventilátor 900B (Siemens-Elema, Solná, Švédsko) frekvencí 40x minutu při 50% inspiračním čase. Dechové objemy se měřily pneumotachygrafem napojeným na pletysmografické boxy. Zvířata byla ventilována standardizo15 váným dechovým objemem 8 až 10 ml/kg pri vyřazení režimu pozitivního tlaku na konci výdechu (resp. při vyřazení režimu PEEP). Kompliance plic a hrudníku je dána poměrem mezi dechovým objemem a maximální inspiračním tlakem a je vyjádřena v ml/cm H₂O kg.

Ve srovnání s negativní kontrolou neléěených zvířat se hodnota kompliance významně zlepšila u zvířat léčených vyrobenými surfaktanty, především u zvířat léčených přípravkem surfaktantu obsahujícím polymyxin B. Je významné, že toto zlepšení bylo vyšší než po léčbě stejnou dávkou modifikovaného přirozeného surfaktantu (obr. 3).

Seznam sekvencí <110> Chiesi Farmaceutici spa < 120> Povrchově aktivní syntetické peptidy a jejich použití pro výrobu syntetických smáčedel <130> chiesi <140>

<141>

<150> MI99A000275 <151> 1999-02-12 <16O>6 <170> Patentln Ver. 2,1 <210> 1 <211> 35 <212> PRT <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: syntetický peptid

-13CZ 301108 B6 <400> 1

Phe Gly Ile pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Leu 15 10 ÍS

Lys Leu Leu Leu Leu Lys Ile Leu Leu Leu Lys Leu Gly Ala Leu Leu 20 25 30

Met Gly Leu 35 <210> 2 <211> 35 <212> PRT <213> Syntetická sekvence io <220>

<223> Popis syntetické sekvence: syntetický peptid <400> 2

Phe Gly Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Leu 15 10 15

Leu Lys Leu Leu Leu Leu Ile Lys Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu 20 25 30

Met Gly Leu 35 <210> 3 <211> 35 <212> PRT <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: syntetický peptid <400> 3

Phe Gly Ile Pro Ser Ser Pro Val His* Leu Lys Arg Leu Leu Ile Leu 15 10 15

Lys Leu Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Leu Zle Leu Gly Ala Leu Leu 20 25 30

Met Gly Leu

35

- 14.

vz. uviiua ου <210> 4 <211> 35 <212> PRT <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: syntetický peptid <400>4

Phe Gly Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Leu 15 10 15

Leu Leu Leu Leu Ly? Leu Ile Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu 20 25 30 ,₀ Met Gly Leu <210> 5 <211> 35 <212> PRT <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: syntetický peptid <400 5

Phe Gly Ile Pro Ser Ser- Pro Val His Leu Lys Arg' Leu Leu Ile Leu 15 10 15

Leu Leu Leu LeU Leu Leu Ile Lys Leu Leu Ile Leu* Gly Ala Leu Leu 20 25 30

Met Gly Leu <210>6 <211> 35 <212>PRT <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: syntetický peptid 30 <400 6

-15CZ 501108 B6

Phe Gly Xle pro Ser Ser Pro Val Hiá Leu Lys Arg Leu Leu lle Leu

5 10 -^s

Phe Leu Leu Leu Leu Phe H*e Leu Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu Leu

25 30

Met Gly Leu

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. SPC-analog obecného vzorce l

F_cGfíPZZPVHLKR(X_aB)_n(X_bB)_n(X_cB)_mX_dGALLMGL (I), kde

15 X je aminokyselina ze skupiny I, L, Nle (norieucin),

B je aminokyselina ze skupiny K, W, F, Y, omithin,

Z je S, popřípadě vázaný esterovou vazbou s acylovou skupinou, obsahující 12 až 22 atomů

20 uhlíku, a je celé číslo 1 až 19, b je celé číslo 1 až 19, c je celé číslo 1 až 21,

25 d je celé číslo 0 až 20, e je 0 nebol, f je 0 nebo 1, n je 0 nebo 1, m je 0 nebol, za předpokladu, že

- n + tn > 0,

35 -f>e,

- (X_;1B)_n(X_bB)_n(X_cB)_mXd je sekvence s obsahem nejvýš 22 aminokyselin, s výhodou 10 až 22 aminokyselin.

40
2, SP-C analog podle nároku 1, obecného vzorce Ia

FGIPSSPVHLKRX4BX4BX4BXGALLMGL (Ia).

- ΐή.

Vi tJUllUO DU
3. SP-C analog podle nároku 1, obecného vzorce Ib

FGIPSSPVHLKRX5BX5BX4GALLMGL (Ib).
4. SP-C analog podle nároku 1, obecného vzorce lc

FGIPSSPVHLKRX4BX1 iG ALLMGL (lc).

10 5. SP-C analog podle nároku 1, obecného vzorce Id

FGIPSSPVHLKRX₈BX₇GALLMGL (Id).

6. SP-C analog podle nároku 1, obecného vzorce le 15

FGIPSSPVHLKRX11BX4GALLMGL (le).

7. SP-C analog podle nároků 1 až 6, ve kterém jsou zbytky Ser acylovány, s výhodou palmitoylovými skupinami.

8. SPC-analog podle nároků 1 až 7, ve kterém B znamená lysin nebo fenylalanin a X znamená leucin, isoleucin nebo norleucin.

9. SP-C analog podle nároku 1 vybraný ze skupiny

SP-C (LKS): FGIPSSPVHLKRLLILKLLLLKILLLKLGALLMGL,

SP-C (LKS)_X: FGIPSSPVHLKRLLILLKLLLLKLLLILGALLMGL,

SP-C (LKS)₂: FGIPSSPVHLKRLLILKLLLLLILLLILGALLMGL,

SP-C (lks)₃: fgipsspvhlkrllilllllklilllilgallmgl,

SP-C (LKS) 4: FGIPSSPVHLKRLLILLLLLLLIKLLILGALLMGL,

SP-C (LFS): FGIPSSPVHLKRLLILFLLLLLFILLLFLGALLMGL.

10. Syntetický surfaktant, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden SP-C analog vzorce í podle nároku 1 ve směsi s lipidy a fosfolipidy.

11. Syntetický surfaktant podle nároku 10, vyznačující se tím, že směs lipidů a fosfolipidu obsahuje l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholin, fosfatidylglycerol a kyselinu palmitovou.

35 12. Syntetický surfaktant podle nároků 10 a 11, vyznačuj ící se tím, že dále obsahuje

SP-B nebo jeho účinný derivát nebo polymyxin.

13. Syntetický surfaktant podle nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že má formu roztoku, disperze, suspenze nebo suchého prášku.

14. Použití SPC-analogu podle nároků 1 až 7 pro výrobu plicního surfaktantu pro použití u všech stavů, způsobených nedostatkem plicních suríaktantů.

- 17CZ 301108 B6

15. Použití polymyxinu, s výhodou polymyxinu B pro výrobu syntetického surfaktantu podle nároku 12 pro použití k tečení všech případů, způsobených nedostatkem nebo dysfunkcí surfaktantů, souvisejících plicních onemocnění, jako jsou pneumonie, bronchitida, astma, syndrom
5 aspirace mekonia nebo serózní zánět středního ucha.

16. Použití podle nároků 14 a 15, při němž je syntetický surfaktant určen k léčení syndromu dechové nedostatečnosti (RDS - respirátory distress syndrom).