HUT66829A

HUT66829A - Analogs of piscine lhrh

Info

Publication number: HUT66829A
Application number: HU9301979A
Authority: HU
Inventors: Robert Vincent Fishleigh; Barry Robson
Original assignee: Proteus Molecular Design
Priority date: 1991-01-09
Filing date: 1992-01-08
Publication date: 1995-01-30
Also published as: GB2267496B; IS3802A; FI933138L; JPH06504537A; EP0566611A1; CA2100057A1; GB2267496A; AU1161792A; NZ241240A; FI933138A7; GB9314141D0; GB9100468D0; CN1063109A; KR930703444A; PT99991A; HU9301979D0; AU652611B2; WO1992012247A1; DK80993A; NO932491L

Description

A találmány tárgya a hal gonadotropin kibocsátó hormonnak (pGnRH), illetve némelykor hal luteinizáló hormonkibocsátó hormonnak (pLHRH) nevezett hal hormon analógok széles köre. A találmány elsősorban olyan pGnRH analógokra vonatkozik, amelyeket úgy állítunk elő, hogy a természetes pGnRH aminosav szekvencia C-végéhez egy cisztein- vagy tirozincsoportot tartalmazó rövid aminosav szekvenciát adunk úgy, hogy oldatban a konformáció lényegében változatlan maradjon, és így anti-pGnRH antitestek kialakítására és halak immunizálására alkalmas polipeptid konjugátját kapjuk.

Az ipari világban gyorsan terjednek a kereskedelmi célú halfarmok.

A legfontosabb haltenyésztők, elsősorban lazactenyésztők,

Nyugat-Európában, Észak- és Dél-Amerikában,

Kanadában és a Keleti-Tengerparton találhatók.

Az Amerikai

Egyesült Államokban például 1989-ben 185.000 t lazacot és majdnem ennyi törpeharcsát tenyésztettek. Norvégiában az atlanti-lazac fő nyugat-európai tenyésztő helyén pedig 1989/90ben 120.000 tonnát állítottak elő. Úgy számolnak, hogy a világpiacon a század végéig a lazacértékesítés évente 7,5 %-kal nő, és ez évente 2.000 millió angol font értékű forgalmat jelent. A tengeri süllő és nagy rombuszhal kereskedelmi fejlődése és hosszabb távon az óráási laposhal és tőkehal forgalom növekedése is várható, és míg a tengeri keszeg és tengeri süllő legfőbb tenyésztője jelenleg Európa, a pontyot Kelet-Európábán és Afrikában egyaránt tenyésztik.

A vízkultúrák egyik fontos szükséglete a halak szexuális érettségének szabályozása a következő jelenségek megakadályozása érdekében: a testi növekedés ivarmirigyekbe való átterjedése, ι húsminőség romlása, és a nem kívánt másodlagos nemi jellemzők kereskedelmi megjelenése. Ez különösen a lazacfélékre igaz, amelyeknél a koraérett fiatal lazacok (a fejlődés különböző fázisaiban) szexuális érése súlyos gazdasági károkat okozhat, mert a nem kereskedelmi méretű nemes lazac növekedését megállítják, a fiatal lazacokat rövid idő alatt kell begyűjteni, így piaci értékük csökken.

Ezenkívül kívánatos a haltenyésztő telepekről elszökött és a természetes gén állományú tavakban továbbélő halak termékenységének gátlása is.

A szexuálisan érett halak befogása logisztikai problémákat is felvet. Ezek a halak nem adhatók el; a halak bizonyos százaléka állandóan a többiek előtt válik éretté, különösen a hímek hajlamosak koraérettségre.

A szexuálisan érett és éretlen halak szétválogatása időigényes és költséges eljárás. Az érés megkezdése után mindegyik hal többé-kevésbé azonos időben és sebességgel érik, ami a begyűjtésüket rendkívül nehézzé teszi. így a halak érésének fázisokban való szabályozása egyértelműen nagyon kívánatos.

A koraérés miatt például a lazac ideális begyűjtési tömege gyakran nem érhető el, és ezért a begyűjtés az optimális tömegnél gyengébb állapotban történik. Az érés szabályozásával ez az állapot elkerülhető, és a méretoptimalizálás befejezését teszi lehetővé.

A szexuális érettség megakadályozására a leghatásosabb eljárás a steril haltenyésztés. Ezt azonban a szexuális dimorfizmust mutató populációknál a számos kísérlet ellenére sem sikerült még megvalósítani.

A halak szexuális érettségének szabályozására számos eljárást, köztük a sebészeti kasztrálást, triploidizációt és szexszabályozást (ez utóbbi kettő genetikus eljárás) ismerünk. A sebészeti kasztrációs kísérleteket az igen magas költségek és az eljárást követő trauma miatt abba kellett hagyni.

A triploidia olyan eljárás, amely három kromoszómakészlet megjelenését okozza, és így a triploid hím és nőstény halnál egyaránt sterilitást eredményez. A triploidia azonban számos hátránnyal is jár. Elsősorban az eljárás unalmas és időigényes, és hosszú ideig tart. A triploidiás kezelésnek alávetett tojásoknak a kezelés túléléséhez nagyon jó minőségűnek kell lenniük.

Az eljárás eredményeként halak ugyan teljesen életképesnek látszanak, azonban a túlélési hányad átlagosan 15-20 % veszteséget is magában foglal azáltal, hogy a triploid halak fejlődése az íváson kívül valamivel lassabb, mint a diploidoké. Az ívásig a hím és a nőstény triploidok fejlődése nagy mértékben különbözik abban, hogy míg a hímek majdnem normálisan fejlődnek és másodlagos szexuális jellemzőik is ennek megfelelőek, addig a nőstény triploidoknál a petefészek nem fejlődik ki számottevően, és a természetes ívási időszakban fiatal kinézetűek.

A mesterséges triploidia sikeres alkalmazása azt követeli, hogy egy kereskedelmileg nem gazdaságos csak nőstény eljárással kombinálják. A triploidok további hátránya, hogy az ugyanabban a tartályban nevelt diploidok növekedésével nem tudnak versenyezni, és triploid nőstények sem növekednek jobban, mint a termékeny diploid nőstények.

A halak nagymértékben dimorf jellegűek, azaz képesek hímből nősténnyé és fordítva átváltozni, és a nemi jelleg megváltozása szabályozható. Az egyneműség tenyésztési célok, például növekedési sebesség tekintetében előnyösebb lehet. A nagy rombuszhal és az angolna nőstény egyedei például sokkal gyorsabban nőnek, mint a hímek. A lazacféléknél a fiatal hímek és nőstények körülbelül azonos mértékben fejlődnek, de később a hímek fejlődése nem kívánt mértékben csökken. Éréskor a hímek növekedése befejeződik, elszineződnek, és agresszívvé válnak, és ezért mind élelmezési, mind sport célra elértéktelenődnek. A tenyésztett szivárvány pisztráng és atlanti lazacfajták éréskor történő tengervízbe helyezésekor sósvízhez való alkalmazkodáshoz szükséges átállásra nem képesek, ezért elpusztulnak. Alkalmazható olyan eljárás, amellyel az összes egyed nőstény populációvá való szexuális átalakítása mellett a haltáplálékhoz hormonokat adnak, így azonban ezek a halak emberi táplálkozásra alkalmatlanná válnak. A táplálkozásra szánt halak termékenységének szabályozására végzett további kísérletek, például a besugárzás, kemosterilizálás és hormon adagolás mindezidáig megbízhatatlan, gazdaságtalan vagy nem megfelelő eredménnyel járt.

Az emlősök esetében a szexuális érés szabályozására alkalmazott imunológiai eljárások eredményesebbek. Az emberi hormonális és immunológiai válaszra vonatkozó tanulmányok azonban a halfiziológia tekintetében nem nyújtanak megfelelő alapot. A halak hidegvérűek, és immunrendszerük különböző körülmények között változik. A halaknál a hőmérséklet az immunrendszer egyik fontos befolyásoló jellemzője, és a fiziológiás tartományon belüli hőmérsékletnövekedés magasabb immunválaszt eredményez. A fiziológiásán alacsonyabb hőmérséklet visszatartja az antitestképződés sebességét, gátolhatja a különösen érzékeny T-limfocitákat tartalmazó immunmemória létrejöttét.

Ezenkívül a hormonok által befolyásolt immunrendszer szezonálisan is változhat. A hormonszintet pedig a kezelésből adódó sztressz, a halak szállítása vagy a például oxigénhiányból adódó rossz vízminőség befolyásolja. A kétéves korszak és szexuális érés - mindkettő alapvető hormonális változás - alatt a halak a limfociták számának csökkenése miatt a betegségekre sokkal érzékenyebbek.

Emellett a halakban csak egyfajta antitest molekula, az IgM képződik, az emlősöknél pedig öt antitestet ismerünk.

A halak endokrinrendszere is különbözik az emlősökétől. Például a hal gonadotropin-kibocsátó hormon, amely a lazacfélékben, mint például lazacban és pisztrángban képződik, szekvenciája a következő:

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (Sherwood és mtsai, 1983: Characterisation of a teleost GnRH, PNAS USA 80: 2794-2798), ez az emlős LHRH-hoz képest a 7. és 8. helyzetben mutat különbséget.

Munkánk során olyan hal GnRH analógokat találtunk, amelyek egy megfelelő hordozó molekulához kapcsolódva halak immunizálására alkalmazhatók úgy, hogy az immunogén keresztreakciók ellen nagy affinitással fellépő antitestek semlegesítik az endogén GnRH-t.

A találmány egyik tárgya egy olyan pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z aminosav szekvenciát tartalmazó hal GnRH, amelyben

W jelentése Gly- vagy D-aminosavcsoport ;

X jelentése egy kötés vagy egy vagy több egymástól független jelentésű aminosavcsoport;

Y jelentése Cys- vagy Tyr-csoport vagy nincs jelen és

Z nincs jelen vagy jelentése egy vagy több, egymástól független jelentésű aminosavcsoport vagy egy folytonos vagy olyan nem folytonos peptidlánc, amelyben az egy vagy több folytonossági hiány α-aminosavtól eltérő polifunkcionális kapcsolócsoport vagy egy retro-inverz aminosavcsoport, azzal a feltétellel, hogy ha W jelentése Gly-csoport és X és Y hiányzik, a Z jelenlévő csoport. A W-helyzetű csoport előnyösen olyan Gly-csoport, amely ebben a csoportban természetesen előfordul, és az Y-helyzetű csoport előnyösen Cys-csoport, mert ez a hordozó fehérjéhez specifikusabban és egyszerűbben kapcsolható, mint a C-végű Tyr-csoport.

Az az előnyös, ha X jelentése viszonylag kis számú csoport, például 1-15, előnyösen 1-8, még előnyösebben 1-3 csoport, és a legelőnyösebben csak egy csoport. Az X-helyzetben ugyan egy vagy több bármilyen aminosavcsoport lehet, azonban a legelőnyösebben ilyen csoport a Gly. Az X-helyzetben természetesen egyéb aminosavcsoportok, előnyösen rövid oldalláncú csoportok, mint például Alá-, Ser-, Asn- és Val-csoportok is lehetnek, és az ebben a helyzetben lévő bármelyik aminosavcsoport a találmány tárgyához tartozik.

Azt is meg kell jegyezni, hogy ha az X-helyzetben egynél több csoport van, ezek jelentése egymástól eltérő is lehet, lásd például a következő analógban: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Ala-Y-Z. Természetesen az X-helyzetben aminosavcsoportot nem tartalmazó pGnRH is a találmány terjedelméhez tartozik.

A találmány szerinti előnyös pGnRH a Z-helyzetben nem tartalmaz aminosavcsoportot, és különösen előnyös találmány szerinti analóg a következő szekvenciát tartalmazza:

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Cys.

Munkánk során azonban azt tapasztaltuk, hogy további aminosavcsoportok Z-helyzetbe való beültetése a molekula többi részére általában nem nyújt további szerkezeti előnyöket. Az ilyen bővítés esetén a találmány szerint úgy járunk el, hogy egy vagy több olyan fehérje szekvenciát építünk be, amely T-sejt epitop hatással bír. Például az olyan 1-2-3-4 általános képletű szekvencia minosav szegmense, amelyben 1 jelentése Gly- vagy töltött aminosavcsoport, például Lys,

His, Arg, Asp vagy Glu, jelentése hidrofób aminosavcsoport, például Ile, Leu, Val,

Met, Tyr, Phe, Trp, Alá, jelentése hidrofób aminosavcsoport (a fentiekben meghatározottak szerint), vagy nem töltött poláris aminosav -csoport, például Asn, Ser, Thr, Pro, Gin, Gly, és jelentése poláris aminosavcsoport, például Lys, Arg, His, Glu, Asp, Asn, Gin, Ser, Thr, Pro, bizonyos esetekben T-sejt epitopként viselkedik (Rothbard, J.B. and Taylor, W. R. (1988)).

Hasonló szegmens lehet az 1'-2¹-3'-4'-5¹ szekvencia, amelyben 1' jelentése azonos az 1 jelentésénél fentiekben meghatározottakkal, 2' jelentése a 2 jelentésénél fentiekben meghatározottakkal, a 3' és 4’ jelentése azonos a 3 jelentésénél fentiekben meghatározottakkal, és 5' jelentése a 4 jelentésénél fentiekben meghatározottakkal.

Mindkét vegyület a következő olyan általános képlettel jellemezhető pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-S-T-S·, amelyben

T jelentése egy olyan peptid szekvencia szegmens, amely egy vagy több (előnyösen kevesebb, mint 5) T-sejt epitopot tartalmaz, amely lehet a fentiekben meghatározott típusú vagy attól eltérő szerkezetű és bármilyen hosszúságú és összetételű szegmenssel elválasztható;

S és S' jelentése (amelyek egyike adott esetben elhagyható) bármilyen hosszúságú és összetételű kitöltő (spacer) szegmens.

Az S hosszában legalább 5 aminosavcsoportot tartalmaz, amelyek lehetnek például a következő csoportok: Gly, Alá, Pro, Asn, Thr, Ser vagy polifunkcionális kapcsoló csoportok, például α-aminosavaktől eltérő aminosavak.

Az S' előnyösen kevesebb, mint 10 aminosavcsoportból áll és polifunkcionális kapcsoló csoportokat, mint például α-aminosavaktól eltérő aminosavakat tartalmazhat.

Az S' csoportok előnyösen az S jelentését képező, fentiekben ismertetett csoportok. Az S' lehet például teljes fehérje, és így elkerülhető a hordozó fehérjéhez való kapcsolás.

Meg kell jegyezni, hogy a Z csoport hiánya esetén a fentiekben ismertetett T-sejt epitópok építhetők be az X-helyzetbe.

A találmány tárgyához tartoznak továbbá az olyan alapanalógok is, amelyekben a Z jelentése un. retroinverzo aminosavcsoport, azaz egy aminosavcsoportnak megfelelő funkciós csoportot tartalmazó bifunkciós aminocsoport.

A találmány szerinti retro-inverz aminosavcsoportot tartalmazó analóg például egy olyan (I) általános képletű vegyület , amelyben

R jelentése bármilyen funkciós csoport, előnyösen Gly-csoport, és

Al és A2 jelentése egyaránt egy olyan találmány szerinti analóg másolata (de azzal nem szükségszerűen megegyező), amely a C-végével kapcsolódik.

Különösen előnyös az olyan találmány szerinti analóg, amelyben az Al vagy A2 csoport Y-helyzetében lévő Tyr vagy Cys-csoport bármilyen olyan típusú aminosawal helyettesíthető, amely eltér a másik másolat megfelelő helyzetében lévő csoporttól, vagy alternatív módon el is hagyható. A dimer kapcsolása így a csoport Y-helyzetében lévő egyik vagy másik oldalláncán (vagy mindkettőn) keresztül hozható létre. Az Al és/vagy A2 lehet természetes pGnRH is, és a retro-inverz aminosav R csoportja lehet Cys- vagy Tyr-csoport. A T-sejt epitópok a fentieknek megfelelően adott esetben a Z szegmens részét is képezhetik.

Az analóg olyan A1-B-A2 (II) általános képletű vegyület is lehet, amelyben

B jelentése egy retro-inverz aminosavcsoport; és

Αχ és A₂ jelentése egymástól független, és a következő aminosav szekvenciával jellemezhető: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z', a képletben W, X és Y jelentése azonos a fentiekben meghatározottakkal, és Z' jelentése azonos a Z jelentésénél fentiekben meghatározottakkal, azzal a különbséggel, hogy nem tartalmaz retro-inverz aminosavcsoportot.

A peptidek retro-inverz módosítása magában foglalja egy vagy több peptidkötés megfordítását olyan analógok létrehozására, amelyek az enzimatikus degradációnak az eredeti molekulánál jobban ellenállnak, és olyan kényelmes eljárást kínálnak, amely segítségével közepestől nagy mértékig terjedően immunogén, nagy koncentrációjú epitopot tartalmazó elágazó immunogének állíthatók elő.

Ezek a vegyületek a nagy jelentőséggel bírnak rövidláncú biológiailag aktív peptidek retro-inverz analógjainak ipari méretű oldatfázisú előállítása során.

A találmány másik tárgya eljárás olyan hal GnRH analóg előállításása során., amely a következő aminosav szekvenciával jellemezhető:

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z, ahol a képletben

W jelentése Gly- vagy D-aminosavcsoport ;

X jelentése egy kötés vagy egy vagy több egymástól független aminosavcsoport;

Y jelentése Cys- vagy Tyr-csoport vagy nincs jelen és

Z nincs jelen vagy jelentése egy vagy több, egymástól független jelentésű aminosavcsoport vagy egy folytonos vagy olyan nem folytonos peptidlánc, amelyben az egy vagy több folytonossági hiány α-aminosavtól eltérő polifunkcionális kapcsolőcsoport vagy egy retro-inverz aminosavcsoport, azzal a feltétellel, hogy ha W jelentése Gly-csoport és X és Y hiányzik, a Z jelenlévő csoport.

Az eljárás során a szakterületen ismert kémiai, biológiai és/vagy rekombinációs eljárással a csoportokat összekapcsoljuk, és az analógot elválasztjuk.

A találmány szerinti analógok standard peptidszintézis eljárásokkal állíthatók elő, például szilárd fázisú peptidszintézist ismertet (SPPS) Merrifield 1963-ban (J. Am. Chem. Soc. 85, 2149). Ebben az eljárásban egy növekvő peptidláncot C-végén keresztül kovalensen kötünk egy oldhatatlan szilárd hordozóhoz. A szintézis kivitelezését úgy végezzük, hogy a kívánt sorrendben egymás után adagoljuk az aminosavakat. Az oldat-szintézisekben szükséges tisztítási lépések ebben az esetben egy egyszerű mosási műveletre csökkennek, mert a reakció melléktermékei és bomlástermékek a reakcióelegyben feloldódnak. Az SPPS-eljárás előnye a sebesség, a viszonylag egyszerű megvalósítás és az a tény, hogy az eljárás részben vagy teljesen automatizálható. Az SPPS-eljárással néhányszor tíz g peptid állítható elő.

A Merrifield által 1963-ban kifejlesztett SPPS-eljárás röviden a következő négy lépéssel jellemezhető:

(A) egy elsődlegesen védett aminosavat egy, az egész szintézis során stabilan maradó kovalens kötésen keresztül a szilárd hordozóhoz kapcsoljuk;

(B) a kötött csoport egy szabad aminosavcsoportját védelemmentesítéssel regeneráljuk olyan körülmények között, amelyben az oldallánc funkciós csoportok mindegyike stabil marad;

(C) a következő védett aminosavcsoportot kondenzációval az elsőhöz kapcsoljuk, amelynek eredményeként aminkötés képződik és a (B) és (C) lépéseket a szintézis befejeződéséig ismételjük;

(C) a peptidet a szintézis végén felszabadítjuk a szilárd hordozóról, és az aminosav oldallánc védőcsoportok mindegyikét eltávolítjuk.

Az irodalomban számos aminosav védőcsoportot ismertetnek. Jelenleg azonban ezek közül csak két kombinációt alkalmaznak. Az első a terc-butoxi-karbonil(Boc)/benzil-csoport kombináció, amelyet Merrifield 1963 óta használ, és amely máig is a legszélesebb körben alkalmazott. Mostanában terjedt el a

Sheppard és mtsai által kifejlesztett és növekvő mértékben alkalmazott rendszer,

33, 9, 1986 fluorenil-metoxi-karbonil(Fmoc)/terc-butil-csoport amelyet a Science Tools, The LKB Instrument Journal irodalmi helyen ismertetnek.

További ilyen példa az Arsady és mtsai által kifejlesztett szilárdfázisú gyantát alkalmazó Fmoc-poliamid eljárás (J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1., 529-537, 1981, valamint az egyedi aminosavcsoportok védelmére alkalmazott fluorenil-metoxi-karbonil (Fmoc)-csoportot (J. Chem. Soc. Perkin Trans. L 6573, 1983) és a 9-fluorenil-metoxi-karbonil (Fmoc) csoportot (Atherton E és mtsai J. Chem. Soc. Chem. Comm. 165 (1985) alkalmazó eljárás.

A találmány tárgyához tartoznak az olyan DNS és RNS molekulák is, amelyek a genetikus kódon keresztül a leírásban ismertetett peptid analóg bármelyikét kódolják. Ezek a DNS molekulák megfelelő mikrobiológiai vagy eukariotikus sejt tenyészetben a találmány szerinti analógok előállítására alkalmazható rendszer kifejezésére használhatók. Ilyen rendszerekben hasonló molekulákat állítottak elő, melyek ismertetését megtaláljuk például a 85307311.2 számú európai szabadalmi bejelentésben.

Megjegyezzük, hogy a retro-inverz aminosav-származékokat tartalmazó analógok ezzel a rendszerrel közvetlenül nem állíthatók elő. Az alapanalógok azonban előállíthatok, majd tisztíthatok, és standard peptid/szerves kémiai eljárással kémiailag a retro-inverz aminosavakhoz köthetők.

Mostanában egy olyan gyakorlati és kényelmes eljárást ismertetnek, amelyben a retro-inverz peptideket poliamid típusú gyantán megvalósított szilárd fázisú szintézissel állítják elő [Gazerro, Η., Pinori, M. and Verdini, A.S. (1990): A new generál procedure fór the solid-phase synthesis of retro-inverso peptides, Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis, szerkesztő Roger Epton, SPCC Ltd., Birmingham, NagyBritannia].

A hordozóhoz kötött analóg molekula előnyösen egy analógkonjugátot eredményez. Hordozóként bármilyen kis- vagy makromolekuláris hordozó alkalmazható, de a legelőnyösebb hagyományos hordozó anyagok a következők:

- kulcslyuk csiga haemocianin (keyhole limpet haemocyanin = KLH);

- borjúszérum albumin (Bovine serum albumin = BSA);

- csirke gammaglobulin (chicken gammaglobulin = CGG);

- tetanus toxoid (TT);

- diftéria toxoid (DPT);

- tuberkulin tisztított fehérje származéka (purified protein derivative = PPD);

- muramii dipeptid (MDP);

- szójabab tripszin inhibitor (STI) ; és

- kolera toxin vagy B-alegysége.

Megjegyezzük, hogy a BCC vakcinával végzett feltöltés a PPD esetén előnyös lehet, (Lachmann, P. és mtsai, 1986, Synthetic Peptides as Antigens, Ciba Foundation Symposium 119, 25-40. oldalak).

Halak autoimmunizálására különösen előnyös LHRH analóg hordozók a következő mikroorganizmusok vagy makromolekuláris antigének, amelyek emiatt a halvakcinák komponensei is: Aeromonas salmonicida (furunkulozis), Yersinia ruckeri (ERM) és egy Vibrio anguillarium és Vibrio ordalii (vibriozis) elegy.

A Gram-negatív nem mozgékony Aeromonas salmonicida baktérium által okozott furunkolózis elleni védekezésre mostanában a következő alaptípusú vakcinát vizsgálták:

- teljesen elpusztított vagy elroncsolt sejtek (bakterinek) ;

- extracelluláris sejttermékek (extra cellular products = = ECP) és ECP toxoidok;

- teljesen elpusztított sejtek ECP-vel kombinálva;

- gyengített élő vakcinák; és

- tisztított antigének.

A hiperimmun szérum mellett passzív védelemként bizonyos halfélékben és emlősökben termelődött antigének is alkalmazhatók.

A bélrendszeri eredetű ”vörösszáj (enteric redmouth = ERM) ellen, amelyet a Gram-negatív mozgékony Yersinia ruckeri baktérium okoz, is olyan sikeres vakcinát (vagy bakterint) állítottak elő, amely formalin-inaktivált teljes baktérium tenyészeteket tartalmaz.

Az északi féltekén jelenleg kereskedelmi forgalomban lévő vibriózis vakcinák a legközönségesebb V. anquillarium és V. ordalii fajták elegyei. Ezek a vakcinák olyan egyszerűen inaktivált tenyészetek, amelyek teljes sejteket és ECP-t tartaIma z nak.

A találmány további tárgya olyan vakcina, amely egy pGnRH analógot vagy analóg-konjugáltat, valamint egy állategészségügyileg elfogadható hordozót tartalmaz.

Ezek a vakcinák halak autoimmunizálására alkalmazhatók.

A találmány további tárgya olyan eljárás halak szexuális fejlődésének gátlására, amelyben a halaknak az endogén pGnRH biológiai hatásának lényeges csökkentésére elegendő mennyiségű anti-pGnRH antitest részt állítanak elő.

Az Y-helyzetben akár Cys-, akár Tyr-csoportot tartalmazó analógok konjugációja a szakirodalomból jól ismert reagensekkel és eljárásokkal végezhető. Például az Y-helyzetben Cys-csoportot tartalmazó hal GnRH analógok tio-éter-kötésen keresztül megvalósított konjugálására N-maleimido-butiril-oxiszukcinimidet (Calbiochem) alkalmaznak, amellyel az analógot a hordozó protein lizin oldalláncához kötik, az Y-helyzetben Tyr17 • «·«· 4·«4 «·«« ·« · « | « « « · ··« · «· · csoportot tartalmazó analógok konjugálására pedig N-(4diazofenil)-maleimiddel diazokötést alakíthatnak ki.

A peptidek és konjugátok megfelelő mértékű tisztítását a szakterületen jól ismert eljárásokkal, például nagynyomású folyadékkromatográfiás vagy nátrium-dodecil-szulfát-poli(akrilamid) gélelektroforézissei vagy gyors folyadékkromatográfiás eljárással végezhetjük.

A találmány szerinti peptid-hordozó konjugát felhasználási területei a következők lehetnek:

1) bármilyen állat immunizálása a későbbiekben specifikált felhasználási területeken alkalmazható anti-hal-GnRH-antitestek képződésének fokozására;

2) halak hal GnRH-ra való autoimmunizálása a

- szexuális fejlődésük lassítására, megállítására vagy visszafejlesztésére;

- termőképességük szabályozására, korlátozására vagy megszüntetésére;

- GnRH-függő hal daganatos betegségek kezelésére;

- hal fiziológiai állatkutatási kísérletek lefolytatására;

3) diagnosztizálószerként anti-hal-GnRH antitestek, például szérum mintákban való jelenlétének meghatározására.

Az analógok ellen képződött anti-hal-GnRH antitestek is a találmány tárgyköréhez tartoznak. Ezeket például a következő célra alkalmazhatjuk:

1) hal fiziológiai/immunológiai kutatási eszközként;

2) immunogénként anti-idiotipikus antitestek képződésének elősegítésére;

3) passzív immunizálásra a ···· ♦··£ * h· • f ·· •*·

- szexuális fejlődés lelassítására, megállítására vagy visszafejlesztésére;

- GnRH-függő hal daganat kezelésére;

- egyéb hal GnRH-tevékenységgel való beavatkozás (a passzív immunizálást a halakban vagy emlősökben kialakuló poliklonális, monoklonális és egyedi domain antitestek adagolásával végezzük), és

4) diagnosztizálószerként hal GnRH jelenlétének például szérummintákban való kimutatására.

Nyilvánvaló, hogy a fenti 2) pontan ismertetett antiidiotipikus antitestek is a találmány tárgyköréhez tartoznak.

A szintetikus polipeptidekhez specifikusan kötődő, találmány szerinti poliklonális és monoklonáis antitestek és ezek kiméra és hal-formáinak előállítási eljárását például a következő irodalmi helyeken ismertetik: Morrison és mtsai (1984) PNAS (USA) 81), 6851-6855; Riechmann és mtsai (1988) Natúré 332) 323-327, az egyedi domain antitestek előállítási eljárását pedig például Ward, E.S., Gussow, D., Griffiths, A.D., Jones, P. és Winter, G. : (1989) Natúré 341 544-546) irodalmi helyen ismertetik. Az előállítást valamilyen fentiekben ismertetett hagyományos eljárással végezhetjük, és az így kapott antitestek is a találmány tárgyköréhez tartoznak.

A szakemberek számára nyilvánvaló, hogy az anti-hal-GnRH antitestek vagy hal GnRH kimutatására számos immunovizsgálati eljárás, többek között a szendvics-vizsgálat, kompetitív és nem kompetitív vizsgálat, valamint a közvetlen és közvetett jelzés áll rendelkezésre. Az anti-hal GnRH antitestek kimutatására alkalmazott készlet előnyösen tartalmaz egy találmány szerinti • · · ·» ·

- 19 analógot, vagy analóg konjugátot, egy jelző anyagot és egy szilárd hordozót. Ehhez hasonlóan a hal GnRH kimutatására alkalmas készlet tartalmaz egy, a találmány szerinti analógot specifikusan kötő antitest vagy antigén fragmentet, egy jelző anyagot és egy szilárd hordozót.

A hal oltóanyag alkalmazása számos eljárással, például injektálással, szájon át vagy bemerítéssel történhet.

Az oltás kivitelezésére leghatásosabb eljárás az immunválasz nagyságának javítását elősegítő hatásjavító adalék alkalmazását is megengedő intraperitoneális injektálás. Hátránya, hogy altatást és stresszokozó kezelést igényel, és a kezelés nagyon munkaigényes. Azonban ismétlő fecskendőkkel és megfelelő berendezéssorozaton óránként 1000 hal is beoltható. A 15 g alatti tömegű halaknál azonban nem alkalmazható.

A halak tömeges kezelésére minden méretű hal esetén a szájon át végzett adagolás a legmegfelelőbb, amely stresszhatást sem okoz. Azonban a belső korlátozások miatt nagymennyiségű oltóanyag szükséges, amely növeli a költségeket és az egyedi adagolást bizonytalanná teszi. A szájon át alkalmazható oltóanyagok hatásfoka alacsony, és ezért ezek alacsony vagy nem állandó szintű védelmet biztosítanak. A legtöbb szájon át való alkalmazást a vibriozis elleni oltóanyaggal végzik.

A közvetlen bemerítés [(direct immersion (Dl)] olyan előnyös eljárás, amely egyszerű és gyors, és az oltóanyag csak néhány percig érintkezik az állatokkal. Ez az eljárás ma már automatizált, és a vibriozis elleni és ERM oltáshoz fürdő és öblítő eljárást fejlesztettek ki, és egyszerűen egy tartályba öntött oltóanyaggal végezhető. Ez az eljárás ugyan az injektá*·· · »· ·

- 20 láshoz képest több oltóanyagot és hosszabb érintkezési időt (kb. egy óra) igényel, amely a víz oxigénezését és a halak stresszfigyelését teszi szükségessé, azonban munkaigénye kisebb.

Előnyös lehet az immunizálást olyan italkeverékkel végezni, amely

i) egy adott analógot egynél több hordozómolekulához kapcsolva; és/vagy ii) ugyanazon hordozómolekulához kapcsolva egynél több fajta analógot tartalmaz.

Ezen kívül bármilyen peptidanalóg, ezek konjugátjai, valamint az ezeket tartalmazó italkeverékek bármilyen megfelelő hatásjavítószerrel vagy szétosztó közeggel kombinálható, és ennek eredményeként az úgynevezett szuperkoktél italkeverék állítható elő.

Előnyös hatásjavító szerek és szétosztó közegek például a következő anyagok: aluminium-hidroxid (alum), mikrogyöngyök, liposzómák, micélliumok, nioszómák, ISCOMS-ok, Brauns lipoproteinek, valamint a mikrobiális hal oltóanyagok egész sejtjei vagy ezek összetevői.

A következő példákat a találmány részletesebb ismertetésére mutatjuk be.

1. példa

Egy találmány szerinti karboxi-bővített pGnRH-t állítunk elő standard szilárdfázisú eljárással.

A peptid gyantáról való lehasítását trifluor-ecetsav jelenlétében végezzük, majd a tisztítást gélszűréssel, ioncserélős kromatográfiás eljárással és fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással folytatjuk le. A peptidet MBS sel (m-maleimid-benzoil-N-hidroxi-szukcinimid-észterrel) különböző hordozókhoz kötjük.

A leírásban már ismertettük, hogy a csirke gammaglobulin (CGA) jól használható hordozó egyéb oltóanyagok szivárvány pisztrángnál való alkalmazásához. Az emlős kísérletekben kipróbált PPD-t is alkalmazzuk (bár előzőleg BCG-vel végzett immunizálás is szükséges).

A pGriRH analóg hordozóhoz való kapcsolását a peptid fehérjéhez viszonyított (30-40):1 mólarányában végezzük, és a szivárvány pisztrángot három különböző koncentrációjú intraperitoneális injektálással beoltjuk.

A létrejövő szérum antitestválaszt 10 héten át hetenként vizsgáljuk. A vizsgálatot torma peroxidáz (Horseradish Peroxidase, HRP) konjugált monoklonális anti-pisztráng lg alkalmazásával, enzim-immunvizsgálati eljárással (ELISA) végezzük.

Ebben a kísérletben néhány vizsgálatot úgy végzünk, hogy hordozóval preimmunizálunk vagy hatásjavító vagy gyorsító injekciót alkalmazunk az anti-pGnRH-antitestek optimális előállítási programjának meghatározására.

2. példa

Az 1. példában ismertetett optimális előállítási programot egy csoport potenciálisan érésben lévő pisztráng immunizálására alkalmazzuk.

Az 1. példában ismertetett eljárással vizsgáljuk az antitestválaszt, emellett mérjük a növekedési sebességet és a szexszteroidok (például tesztoszteron) képződését.

A halakat a kísérlet végén leöljük, az ivarmirigyeket eltávolítjuk, és a

(GSI) meghatározásához lemérjük. Az ivarmirigyeket ezután a későbbi fénymikroszkópos hisztológiai tanulmányozáshoz rögzítjük. Az immunizált halak GSI-je lényegesen jobb, mint a kezeletleneké.

3. példa

Érésben lévő szivárvány pisztráng immunizálás tuberkulin tisztított fehérjeszármazékhoz kapcsolt szalmonid gonadotropinkibocsátó hormonbővített analóg alkalmazásával (sGnRHa-PPD).

Eljárás

a) Az sGnRH-Gly-Cys PPD-hez való kapcsolása

1,008 mg/ml tuberkulin PPD-t és Evans Limited gyártmányú fenol konzerválószert egy éjszakán át benziolátos cellulózcsőben, 12 °C-on, 0,9 %-os nátrium-klorid vizes oldattal egy éjszakán át dializálunk a fenol eltávolítására. A PPD-t ezután

1,5 órán át poli(etilén-glikol) (PG 20000) alkalmazásával 4,032 mg/ml-re koncentráljuk. 2,5 ml 10,08 mg PPD-t tartalmazó oldatot szobahőmérsékleten, 1 órán át 1,08 mg N-7~-malimido

-butiril-oxi imid 5,04 μΐ dimetil-formamidban (DMF) készült oldatával keverünk. Az elegyet ezután G-25 MPD-10 Sephadex kolonnára adjuk, és 3,5 ml A pufferral (0,05 mol/1 NaH₂PO4,· 0,14 mol/1 NaCl, pH=7,0) eluáljuk. A PPD-re cseppenként 4,687 ml 3 mg/ml koncentrációjú, desztillált vízben oldott sGnRH-Gly-Cys-t majd A puffért (azaz 14,0616 mg sGnRHGly-Cys-t) adunk. Az oldatot szobahőmérsékleten nitrogén atmoszférában keverjük 2 órán át, és meghatározzuk a szabad tioltartalmat.

A konjugátot egy éjszakán át benziolátos cellulózcsőben 12 °C-on desztillált vízzel dializáljuk, majd a felhasználásig

-20 °C-on tároljuk.

b) Szabad tiol meghatározás

A konjugát szabad tioltartalmát 5,5'-ditiobisz-(2-nitro-benzoesav) (DTNB) és redukált glutation standardok alkalmazásával határozzuk meg.

A vizsgálatot egy Ellman-féle, mikrolyukas lemezen végezzük, amelyen 50 mmol/l-es DTNB-t és 250 pl PBS-t (pH = 8) skálával ellátott pl mintához 2 pl 10 adunk, és 10 perc után, 405 nm-en mérjük az abszorpciót.

c) Szivárvány pisztráng és immunizációs rendszere

Különböző fagyasztó bélyegzők alkalmazásával egyenként megjelölünk 130 érésben lévő szivárvány pisztrángot (hosszúság: kb. 30 cm) . A halak hosszát és tömegét egyenként feljegyezzük, és az immunizáció előtt szérum antitest szint meghatározására mindegyikből 600 pl vért veszünk. A halak nemének meghatározására szérum szteroid szintet is mérünk.

A halakat két csoportra osztjuk, és az egyik csoportnak sGnRH-Gly-Cys-PPD-t a másik csoportnak sóoldatot adunk. Az alkalmazást Freud Complete Adjuvant (FCA) oldatban, intraperitoneálisan végezzük. A kezelt és a kontroll csoportot is hím és nősténycsoportokra osztjuk. A hímeket környezeti világítás mellett, környezeti hőmérsékleten tartjuk. A nőstényeket további két csoportra osztjuk, és ezek közül az egyiket környezeti világítás mellett, környezeti hőmérsékleten (ami 14 °C körül vagy kicsit alatta lévő hőmérséklet között ingadozik), a másikat környezeti megvilágítás mellett, 14 °C-on tartjuk.

Ez utóbbi halcsoportot a hőmérséklet anti-sGnRH-Gly-Cys antitest részarányra kifejtett hatásának és az ebből eredő hal érés eltérések vizsgálatára alkalmazzuk. Az egész kísérlet során folyamatosan, négy hetes intervallumban mérjük az egyenként megjelölt halak tömegét, méretét és vért veszünk tőlük.

Megmérjükaszérumanti-sGnRH-Gly-Cys antitesttartalmát (sGnRH-Gly-Cys-BSA alkalmazásával), és 17-B-ösztradiol és/vagy 11-ketotesztoszteron szteroid hormon tartalmát RIA alkalmazásával.

d) Szteroid elemzés

Az érésben lévő halak szérumának 17-B-ösztradiol (E2) és 11-ketotesztoszteron (11-KT) koncentrációját radioimmunvizsgálattal mérjük. Ebben a vizsgálatban radioaktívan jelzett szteroid korlátozott számú szteroidspecifikus antitesthez kötődik, és ezt a kölcsönhatást nem jelzett szteroid hozzáadásával részlegesen gátoljuk.

e) Anti-SGnRH-Gly-Cys ELISA optimalizálás

Borjú szérum albuminhoz [Bovine Serum Albumin = BSA] az ELISA-ban való alkalmazás céljából szalmonid GnRH-Gly-Cys-t kapcsolunk. 0,5 ml A jelű pufferben oldott 10 mg BSA-t és 5 μΐ DMF-ben oldott 1 mg GMBS-t elegyítünk, és végül 6,246 mg sGnRHGly-Cys-hez kapcsoljuk. Az ELISA vizsgálati eljárás lehetővé teszi, hogy az érési kísérletekben alkalmazandó anti-sGnRH-GlyCys ELISA-hoz a megfelelő sGnRH-Gly-Cys-BSA rétegkoncentrációt meghatározzuk.

Eredmények

i) Anti-SGnRH-Gly-Cys antitest részarány

Az 1. táblázatban ismertetett eredmények azt mutatják, hogy az anti-sGnRH-Gly-Cys antitest részarány az sGnRH-Gly-Cys-PPDvel végzett 8 hetes utóimmunizáció (20 M9 sGnRH-Gly-Cys/hal,

FCA-ban, i.p.) következtében a kontrolihoz képest jobban nő (hímek és nőstények).

1. táblázat

Átlagos anti-sGnRH-Glv-Cvs antitest titerek (lóg? ± SE)

	4 hetes utóimmu- 8 hetes utóimmu-
nizálás	nizálás
sGnRH-Gly-Cys-PPD csoport, n=65	1,42 ± 0,17	4,33 ± 0,37
kontroll	1,03 ± 0,02	1,20 ± 0,08
csoport, n=65

ii) Érésben lévő szivárvány pisztráng 17-B-ösztradiol szérumszintje: SGnRH-Gly-Cys-PPD-vel végzett immunizáció hatása

A 2. táblázatban ismertetett eredményekből látható, hogy a 4 hetes utóimmunizáció alatt az érésben lévő nőstény pisztrángok 17-B-ösztradiol-szintje a kezelt és kontroll csoportnál azonos sebességgel nőtt. A 8 hetes utóimmunizáció során a kontroll csoport 17-B-ösztradiol szintje ugyanolyan sebességgel nőtt, azonban az sGnRH-Gly-Cys-PDD-kezelt érésben lévő nőstények 17-β-ösztradiol-szintje lényegesen alacsonyabb, mint az érésben lévő kontroll nőstényeké (p<0,05:t-teszt).

1. táblázat

Átlagos anti-sGnRH-Glv-Cys antitest titerek (log^ ± SE) (hímek és nőstények).

2. táblázat

Érésben lévő szivárvány pisztrángok átlagos 17-B-ösztradiol-szintje (ng/ml ±SE) és az sGnRHa-PPD-vel végzett immunizáció hatása kezelt csoport kontroll immunizálás 4 előtt

7,35 ± 0,77 n=26

5,85 ± 0,39 n=23 hetes utóimmunizálás

16,85 ± 1,57 n=23

16,36 ± 1,33 n=21 hetes utóimmu nizálás

21,04 ± 2,29 n=2 3

28,38 ± 2,61 n=18 iii) Az antitest titerek és a szteroidszint korrelációja

Nyilvánvalóan látható, hogy az sGnRH-Gly-Cys-PPD-vel végzett immunizálás utáni antitest titerek növekedése az érésben lévő szivárvány pisztrángokban mért lényegesen alacsonyabb 17-B-ösztradiol szérumszint-növekedéssel korrelál. Az adatok azt mutatják, hogy a pGnRH-Gly-Cys-PPD a nőstény szivárvány pisztráng szexuális érésének kezdetét késleltetve fejti ki hatását.

Claims

1. Hal GnRH analóg, azzal jellemezve, hogy aminosav-szekvenciája a pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z általános képlettel adható meg, amelyben

W jelentése Gly- vagy D-aminosavcsoport ;

Y jelentése Cys- vagy Tyr-csoport vagy nincs jelen és

Z nincs jelen vagy jelentése egy vagy több, egymástól független jelentésű aminosavcsoport vagy egy folytonos vagy olyan nem folytonos peptidlánc, amelyben az egy vagy több folytonossági hiány a-aminosavtól eltérő polifunkcionális kapcsolócsoport vagy egy retro-inverz aminosavcsoport, azzal a feltétellel, hogy ha W jelentése Gly-csoport, és X és Y hiányzik, a Z jelenlévő csoport.

2. Az 1. igénypont szerinti analóg, azzal jellemezve, hogy W jelentése Gly-csoport.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti analóg, azzal jellemezve, hogy Y jelentése Cys-csoport.

4. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti analóg, azzal jellemezve, hogy X jelentése egy vagy több glicincsoport.

5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti analóg, azzal jellemezve, hogy az X vagy Z legalább egy T-sejt epitópot tartalmaz.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti analóg, azzal jellemezve, hogy a Z egy retro-inverz aminosavcsoportot tartalmaz.

7. A 6. igénypont szerinti analóg, azzal jellemezve, hogy az Aj-B-A₂ általános képlettel adható meg, amelyben B jelentése egy retro-inverz aminosavcsoport; és A]_ és A₂jelentése egymástól független, és a következő aminosav szekvenciával jellemezhető:

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z;

a képletben W, X és Y jelentése azonos az 1. igénypontban meghatározottakkal, és Z' jelentése azonos a Z jelentésénél az 1. igénypontban meghatározottakkal, azzal a különbséggel, hogy nem tartalmaz retro-inverz aminosavcsoportot.

8. Az 1. igénypont szerinti analóg, azzal jellemezve, hogy a következő szekvenciával rendelkezik:

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Cys.

9. Az 1-8. igénypontok igénypontok bármelyike szerinti analóg, azzal jellemezve, hogy egy hordozó molekulához kapcsolt.

10. Oltóanyag, azzal jellemezve, hogy az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti analógot vagy a 9. igénypont szerinti analóg-konjugátot, valamint egy állategészségügyileg elfogadható segédanyagot tartalmaz.

11. Anti-hal GnRH-antitestek valamilyen mintában való kimutatására alkalmas készlet, azzal jellemezve, hogy az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti analógot vagy a 9. igénypont szerinti analóg-konjugátot, jelző anyagot és egy szilárd hordozót tartalmaz.

12. Eljárás a fenti 1-9. igénypontok bármelyike szerinti • « « analógot tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az analógokból halak szexuális fejlődésének lassítására, megállítására vagy visszafejlesztésére vagy érésének szabályozására alkalmas készítményt állítunk elő.

13. Eljárás olyan hal GnRH analóg előállítására, amely aminosav-szekvenciája a következő általános képlettel adható meg:

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z ahol a képletben W jelentése Gly- vagy D-aminosavcsoport ;

Y jelentése Cys- vagy Tyr-csoport vagy nincs jelen és

Z nincs jelen vagy jelentése egy vagy több, egymástól független jelentésű aminosavcsoport vagy egy folytonos vagy olyan nem folytonos peptidlánc, amelyben az egy vagy több folytonossági hiány α-aminosavtól eltérő polifunkcionális kapcsolócsoport vagy egy retro-inverz aminosavcsoport, azzal a feltétellel, hogy ha W jelentése Gly-csoport és X és Y hiányzik, a Z jelenlévő csoport, -csoport, és X és Y hiányzik, a Z jelenlévő csoport -, azzal jellemezve, hogy az eljárás során a szakterületen ismert kémiai, biológiai és/vagy rekombinációs eljárással a csoportokat összekapcsoljuk, és az analógokat elválasztjuk.

14. A fenti 1-5. igénypontok szerinti bármelyik analógot kódoló DNS, ahol az analóg egy folytonos peptidlánc.

15. Egy antigén- vagy antitestkötő fragment, azzal jellemezve, hogy az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti analóghoz « · specifikusan kötődik.

16. Hal GnRH valamilyen mintában való kimutatására alkalmas készlet, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy 15. igénypont szerinti antitest- vagy antigénkötő fragmentet, egy jelző anyagot és egy szilárd hordozót.

17. Eljárás a 15. igénypont szerinti antitest- vagy antigénkötő fragmentet tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a fragmentekből halak szexuális fejlődésének lassítására, megállítására vagy visszafejlesztésére vagy érésének szabályozására alkalmas készítményt állítunk elő.

18. Eljárás a 15. igénypont szerinti antitest- vagy antigénkötő fragment előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alanyt a fenti 1-8. igénypontok bármelyike szerinti analóggal vagy a 9. igénypont szerinti analóg-konjugáttal immunizálunk, és az antitestet vagy az azt termelő sejteket elválasztjuk.

19. Anti-idiotipusos antitestek, azzal jellemezve, hogy a

15. igénypont szerinti antitest- vagy antigénkötő fragmentre specifikusak.

20. Eljárás halak hal-GnRH-ra való immunizálására, amely szexuális fejlődésüket lassítja, megállítja vagy visszafejleszti vagy szexuális érésüket szabályozza, korlátozza vagy megszünteti, azzal jellemezve, hogy a halaknak hatásos mennyiségű 1-8. igénypont bármelyike szerinti analógot vagy egy

9. igénypont szerinti analóg-konjugátot adagolunk.

21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a halakat olyan vízbe merítjük, amely egy a fenti 1-8. igénypontok bármelyike szerinti analógot vagy egy 9. igénypont ·♦· ι

szerinti analóg-konjugátot vagy egy 15. igénypont szerinti antitest- vagy antigénkötő fragmentet tartalmaz.

22. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti analógot vagy a 15. igénypont szerinti antitest- vagy antigénkötő fragmentet szájon át alkalmazzuk.