JP2002518033A

JP2002518033A - 農場動物の成長促進のための合成ソマトスタチン免疫原

Info

Publication number: JP2002518033A
Application number: JP2000555636A
Authority: JP
Inventors: イーワン，チャン
Original assignee: ユナイティドバイオメディカルインコーポレイティド
Priority date: 1998-06-20
Filing date: 1999-06-21
Publication date: 2002-06-25
Also published as: CA2329755A1; AU4826799A; WO1999066950A1; EP1087784A1; BR9911388A; CN1311688A

Abstract

(57)【要約】本発明はヘルパーＴ細胞エピトープ及び任意的にその他の免疫刺激配列に共有結合したソマトスタチン又はソマトスタチンと相同な配列を含んで成るペプチドを提供する。本発明はソマトスタチンに特異的な高力価ポリクローナル抗体の哺乳動物における産生を誘導する免疫原としてのかかるペプチドの利用を提供する。これらのペプチドは哺乳動物のソマトスタチンレベルを下げ、それ故成長速度及び飼料利用効率を高めるのに有用であると期待される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は農場動物の成長促進のための免疫原として有用なペプチド組成物に関
する。本発明の組成物の免疫原ペプチドは多重クラスII ＭＨＣ結合モチーフを
含んで成り、且つＣ又はＮ末端のいずれかにソマトスタチンを有するヘルパーＴ
細胞エピトープ（Ｔｈ）を含む。このペプチドは任意的に一般の免疫刺激因子と
して作用するインバシンドメインを含む。このヘルパーＴ細胞エピトープ及びイ
ンバシンドメインはソマトスタチン自己ペプチドに対する免疫応答を可能にする
。

【０００２】発明の背景成長に関与するニューロ−エンドクリン及びホルモン因子の近年の理解は、バ
イオテクノロジーの急速な進歩と一緒になって様々な農場動物種の成長速度の向
上のための潜在的な道筋を供している。免疫中和を介する成長ホルモンの調節作
用を改変して動物の成長を促進するための方法は成長促進剤としての抗生物質、
アナボリックステロイド及び成長ホルモンを利用する現行の方法に対する価値あ
る代替方法である。農場動物へのこの抗生物質の適用は所定の病原細菌種におけ
る抗生物質耐性菌の選択のための原動力となっており、そしてヒト感染性疾患の
抑制において有害な結果をもたらしている（Witte, Science, 1998 ; 279 : 996
）、アナボリックステロイドの適用は農場動物の成長を促進するが、消費者の間
では一般的でない。ステロイドの使用は法律及び公益的な見地の双方によりヨー
ロッパで規制されている（Buttery and Dawson, Proc Nutr Soc, 1990 ; 49 : 4
59）。組換ＤＮＡ技術は動物への直接投与用の代謝ホルモンの大量生産を可能に
した。かかる適用は成長を促進できる。しかしながら、ソマトスタチンを動物の
機能の改善のための手段として用いるなら、それはとるべき工程の一つにすぎな
い。

【０００３】主たるソマトトロピンホルモンはソマトトロピン（成長ホルモンＧＨ）、ソマ
トメジン−Ｃ（インスリン様成長因子１、ＩＧＩ−１）、ソマトクリニン（ＧＨ
放出因子、ＧＲＦ）及びソマトスタチン（ＧＨ放出阻害因子）である。ソマトト
ロピンホルモンについての主たる潜在的な用途は成長及び哺乳にあるが、これら
の事象のホルモン調節は多種多様なホルモン間の複雑な相互作用を頼りとする（
Spencer, Livest Prod Sci, 1985, 12 :31）。従って、単一のホルモンの単純な
利用は生産性を高めるには十分ではないことがある。

【０００４】ＧＨは二通りの役割を果たすようである。それは筋タンパク質合成の増大を刺
激するポジティブな効果と、その脂肪を分解する能力による潜在的な異化作用効
果を有する（全てではないにしてもほとんどがＩＧＦ−１により媒介される）。
総合的な効果は屠殺体の赤味の増大及び屠殺体脂肪の減少、往々にして成長の増
大、並びに常として、食品転換効率の向上である（Buttery and Dawson, Proc N
utr Soc, 1990 ; 49:459；及びSpencer, Reprod Nutr Develop, 1987 ; 27 (2B)
:581 ）。

【０００５】ＧＨ投与の成長に対する効果は実際の使用においては信頼性を欠くものである
。おそらくはそれは、外性ホルモンの投与は様々なホルモン間での鋭敏な相互関
係を無視し、また血漿レベルの上昇がレセプター集団に与える考えられる効果を
無視しているからであろう。ＧＨの有効な適用は、ホルモンの連続的且つ生理学
的に有効な血清レベルを供するには、頻繁な注射を必要とする。これはこのよう
なバランスのとれた関係をくずす危険性を高め、有害な作用を及ぼしてしまう。

【０００６】従って、成長ホルモンの純粋な調製品を組換ＤＮＡ技術により大量に作ること
ができるにもかかわらず、この技術は成長に所望される効果のために必要とされ
る輸送のための調節のされたメカニズムを供するものではない。更に、食用動物
における組換成長ホルモンの利用は（最近では、乳牛）幅広い消費者の反対及び
規制障壁をもたらしている。反すう動物及びその他の農場動物における赤味の蓄
積を促進する成長ホルモンの利用はヨーロッパ経済協同体内での規制承認を受け
ていない。この規制及び政治的な問題は農場動物種の成長を促進するためのＩＧ
Ｆ−１又はＧＲＦの適用と類似する。

【０００７】成長刺激ホルモンのレベルを高める代替法として、内因性成長阻害剤を除去す
ることが同等、又はそれ以上に有効であることが示されうる。全身成長の主たる
阻害剤はソマトスタチンである。ソマトスタチンは１４個のアミノ酸の環式ペプ
チドであり、そしてその構造は種間で保存されている。それは９２個のアミノ酸
プロソマトスタチン分子として合成され、それからソマトスタチン自体を含む６
種のペプチド及び２８個のアミノ酸形態のソマトスタチンが誘導されることが知
られている（Reichlin, J Lab Clin Med, 1987 ; 109 : 320）。ソマトスタチン
は数多くの胃腸ホルモンの放出を阻害し、またＧＨ、インスリン、甲状腺ホルモ
ンの放出を阻害し、それ故動物が栄養素を吸収する能力、及びしかる後のこのよ
うな栄養素を組織成長へと誘導する能力を阻害する。

【０００８】ソマトスタチンアンタゴニストの利用はラットの成長を刺激することが認めら
れているが（Spencer ら、Life Sci, 1985, 37 : 27 ）、この種の処置はＧＨ、
ＩＧＦ−１及びＧＲＦの毎日の注射が必要とされるという欠点にも悩まされる。
実際の代替法はソマトスタチンの免疫中和を誘導する免疫応答の利用である。成
長を促進するための免疫系の利用はホルモン又は合成ステロイドの直接投与より
は消費者及び規制局に受け入れられ易いであろう。ワクチンによるソマトスタチ
ンの免疫中和はSpencer らによりヒツジでまず開拓された（Livest Prod Sci, 1
983, 10 : 469 ）。

【０００９】双生Ｓｔ．Ｋｉｄａ子羊を利用する過去の研究において、ソマトスタチンに対
して活性な免疫はコントロール子羊の成長率の１７６％で成長する処置子羊をも
たらしている（Spencer ら、Anim Prod., 1981, 32 : 376）。その後の研究はこ
の数値を再現できず、１５〜２０％の成長率の改善がより一般的である。ソマト
スタチン分子は全ての農場動物種において同じであり、そしてソマトスタチンに
対する活性免疫が商業的に重要なヒツジ（Spencer ら、Livest Prod Sci, 1983,
10 : 25 ; Laarveld ら、Can J Anim Sci, 1986, 66 : 77 ）、ウシ（Lawrence
ら、J Anim Sci, 1986, 63 : (Suppl) 215）、ブタ及びニワトリ（Spencer ら、 Dom Anim Endocr , 1986, 3 : 55 ）の品種の成長を刺激しうることが示されてい
る。農場動物についてのソマトスタチンに対する有効な免疫を証明する有効な実
施例の概要を表１に示す。

【００１０】成長速度を刺激し、そして飼育期間の２０％の削減を図ることに加えて（Spen
cer, Reprod Nutr Develop, 1987, 27 (2B) : 581 ）、ソマトスタチンに対する
活性免疫は食品転換効率に対しても有利な効果を有する。より急速な成長による
飼料の節約に加えて、これらの動物は事実上成長期に飼料を、少なくともある程
度腸運動の変化の結果として（Fadalla ら、J Anim Sci, 1985, 61 : 234 ; Fai
chney ら、Can J Anim Sci, 1985, 64 (Suppl) 93 ）一層効率的に利用する（Sp
encer ら、Livest Prod Sci, 1983, 10 : 469 ）。この処置は屠殺組成物に対し
ては何ら著しい効果を有さない（Spencer ら、1983、後掲）が、同体重で屠殺さ
れたとき、処置動物の赤味が多いことが示されている。全ての実験をまとめると
、活性免疫は成長の促進のために強力で、安全で、且つ有効な手段であるようで
ある（Spencer, Dom Anim Endocr, 1986, 3 : 55）。

【００１１】論文において報告されているようにソマトスタチンのいくつかの免疫形態が設
計され、そして試験されている。例えば、ソマトスタチンは免疫能力を高めるた
めにタンパク質担体に接合されている。しかしながら、タンパク質担体は農場動
物における経済的な利用のためには高価でありすぎる。更に、ソマトスタチンに
よる有効な免疫はソマトスタチンと担体との間の接合部位の依存する。全てでは
ないにしてもほとんどのソマトスタチンタンパク質担体接合体はグルタルアルデ
ヒドにより調製され、ソマトスタチン及び担体タンパク質上に存在するリジン残
基間での架橋を採用する。１２量体機能性ループ内のカップリング残基に有用な
ソマトスタチン上の２個のリジンは天然ソマトスタチン構造の有意な損失及びか
かる接合体をワクチンとして使用した場合のソマトスタチンに対する交差反応性
の低下をもたらしうる。

【００１２】更に、ソマトスタチンに対するタンパク質連結は問題となり、なぜなら大半の
免疫応答はソマトスタチンよりは担体に対して特異的であり（担体分子の質量は
ソマトスタチンのそれよりもはるかに大きい）、ハプテン担体接合体による免疫
は往々にして担体誘導化免疫抑制を招くからである（schutzら、J. Immunol. 19
85, 135 : 2319）。従って、家畜用途に適切であり、安価でしかもソマトスタチ
ンに対する早期且つ強力な免疫応答を刺激できる免疫増強剤が切望されている。
この免疫増強剤は担体誘導化抑制を回避するものであるべきである。

【００１３】ソマトスタチン免疫原に関する合成ペプチドの免疫原性に影響を及ぼす重要な
ファクターはＴヘルパー細胞エピトープを介する免疫系へのその提示にある。従
来、それらは担体タンパク質により供与され、上記の欠点が付随する。これらは
組換ＤＮＡ発現系を介するハイブリドポリペプチドとしても供与されていること
がある（Riggs, US 4,812,554 ; US 4,563,424；及びXuら、Science in China (
Series B), 1994 ; 37 : 1234 ）。これらはまた標的ハプテンＢ細胞部位及び宿
主にとって適当なＴ−ヘルパーエピトープ（Ｔｈ）を含んで成る合成ペプチドに
よっても簡単且つ安価で供与されうる。かかるペプチドは抗体結合部位の他、ヘ
ルパーＴ−細胞レセプター及びクラスII ＭＨＣと反応し（Babbitt ら、Nature
, 1985, 317 : 359 ）、それ故標的抗体結合部位（標的部位）に対する厳格な部
位特異的抗体応答を刺激する。ソマトスタチンについての完全合成ペプチド免疫
原は担体コンジュゲート及び組換ポリペプチドと比べて下記の利点を有する。そ
の製品は品質管理のし易さに関し化学的に規定されており、それは安定であり、
めんどうな下流処理（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を必要
とせず、めんどうな生産ブラントを必要とせず、そして得られる免疫応答は部位
特異的であり、従ってエピトープ抑制の如き所望されない応答は回避される。

【００１４】合成ソマトスタチン免疫原の免疫原性は（１）ソマトスタチンを大半の集団が
応答性である選定のプロミスカス（雑然とした）Ｔｈ部位と組合せ；（２）ソマ
トスタチンをコンビナトリアル化学を通じてＴｈの大レパートリーと組合せ、こ
れにより集団の様々な免疫応答性に適合させ；そして（３）環化拘束（ｃｙｃｌ
ｉｃｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ）によりソマトスタチンの所望のコンホメーショ
ン特徴の安定化を図る、ことにより最適化できる。

【００１５】プロミスカスＴｈと称されるエピトープは効率的なＴ細胞ヘルプを誘導し、そ
して強い免疫原を供するようそれ自体は免疫原性の弱いＢ細胞エピトープと組合
されることができる。十分にデザインされたプロミスカスＴｈ／Ｂ細胞エピトー
プキメラペプチドはＴｈ応答を誘導することができ、そしてその結果の抗体は様
々なＭＨＣハプロタイプを発現する遺伝的に多様な集団のほとんどの構成員にお
いて応答性である。プロミスカスＴｈは麻疹Ｆタンパク質及びＢ型肝炎ウィルス
表層抗原等の潜在的な免疫原に由来する特定の配列により供与されうる。多くの
公知のプロミスカスＴｈはデカペプチドホルモンＬＨＲＨに対応する免疫原の弱
いペプチドを強化するのに有用であることが示されている（US 5,759,551）。

【００１６】強力なＴｈエピトープは長さ約１５〜３０個のアミノ酸残基のサイズの範囲に
あり、往々にして共通の構造的特徴を共有し、そして特定の特徴的な配列を含み
うる。例えば、共通の特徴は両親媒性ヘリックスであり、それはアルファーヘリ
ックス構造であり、そのヘリックスの一面を疎水性アミノ酸残基が占め、そして
帯電及び極性残基が外面を占めている（Cease ら、Proc Natl Acad Sci USA, 19
87 ; 84 : 4249-4253 ）。Ｔｈエピトープはよくその他の一次アミノ酸パターン
、例えばＧｌｙ、又は帯電残基、それに続く２〜３個の疎水性残基、更にそれに
続く帯電又は極性残基を含む。このパターンはいわゆるＲｏｔｈｂａｒｄ配列を
規定する。また、Ｔｈエピトープは往々にして１，４，５，８則に従い、それで
は正に帯電した残基の第４，５及び８位において疎水性残基が後続する。このよ
うな構造は全て一般的な疎水性の帯電及び極性アミノ酸から成るため、各構造は
単一のＴｈエピトープの中に同時に存在することができる（Partidosら、J Gen
Virol, 1991 ; 72 : 1293 ）。プロミスカスＴ細胞エピトープの全てではないに
してもほとんどが上記の周期の少なくともいずれかに当てはまる。これらの特徴
は、コンビナトリアルＴｈエピトープを含む理想的な人工Ｔｈ部位のデザインの
中に組込まれうる。コンビナトリアルＴｈ部位のデザインに関し、様々な位置及
び好適なアミノ酸のリストがＭＨＣ−結合モチーフに関して入手できる（Meiste
r ら、Vaccine, 1 1995 ; 13 : 581-591）；そして、コンビナトリアルＴｈを作
るための方法が組立合成抗原ライブラリー又はＳＳＡＬと称されるライブラリー
ペプチドについて開示されている（Wangら、WO95/11998）。かくして、１，４，
５，８則をコンビナトリアルＭＨＣ結合モチーフと共に、ＳＳＡＬの不変且つ縮
重の部位についての位置決め及びこのような部位の残基の選択に適用して、人工
Ｔｈに対する免疫応答性の範囲を大幅に拡大することができる（WO95/11998）。

【００１７】ペプチド免疫原は一般にタンパク質よりもフレキシブルであり、そして任意の
好適な構造を含まない傾向にある。従って、環化拘束の導入によりペプチド免疫
原を安定化するのに有用である。適正に環化したペプチド免疫原は標的化エピト
ープのコンホメーションを擬帯及び保持でき、それ故真性分子上の部位に対して
交差反応性を有する抗体を誘導する（Moore, Synthetic Peptides A User's Gui
deの第２章、Grant 編、WH Freeman and Company : New York, 1992, pp.63-67
）。

【００１８】上記のペプチド工学及びペプチドデザイン要素、即ち、プロミスカスな強いＴ
ｈエピトープのデザイン、ＴｈＳＳＡＬコンビナトリアルペプチド、及び環化
拘束によりデザインされたペプチド免疫原は有効な合成ソマトスタチン免疫原の
基礎となる。かかるペプチドはその最適化された位置及び環化によるソマトスタ
チンの提示のため、並びに幅広く反応性なＴｈ応答のため、好適である。従って
、単独の又は一般の免疫増強因子、例えばインバシン（US 5,759,551）に連結さ
れたＴｈエピトープと、１２量体ループ構造内の機能性部位が途切れていない完
全な形態におけるソマトスタチン（標的抗原として）との特定の構造アレンジメ
ントを含むペプチドはソマトスタチンに対する抗体の生産の刺激において有用で
ある。

【００１９】発明の概要本発明の農場動物におけるソマトスタチンレベルの抑制、成長の促進及び飼料
転換効率の改善に結びつくソマトスタチンに対する抗体を誘導することのできる
合成ペプチドを含んで成る免疫原性ペプチド組成物に関する。詳しくは、本発明
のペプチドはカルボキシもしくはアミノ末端ソマトスタチン（ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：１）又はソマトスタチンのペプチド類似体に連結されたＴｈエピトープを有
する。任意的に、このペプチドは一般的な免疫刺激因子としてインバシンドメイ
ン（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を有する。これらのペプチドは免疫宿主の血清成
長ホルモンを高めて農場動物の日常の体重増加を促進することができる免疫原と
して有効である。

【００２０】本発明の別の観点は免疫学的に有効な量の本発明に係るペプチド組成物と１又
は複数種の医薬的に許容されるワクチン製剤とを、標的化ソマトスタチンに対す
る特異的な免疫治療用抗体が作製されるような用量についての説明書と一緒に含
んで成る抗原組成物を提供する。かかるペプチド組成物は農場動物における成長
促進のために有用である。

【００２１】本発明の更なる観点は哺乳動物の循環ソマトトロピンホルモンレベルを高める
ための方法に関連し、これはその哺乳動物に１又は複数種の本発明のペプチドを
当該ソマトスタチンに対して特異的な機能性抗体が誘導されるのに十分な時間及
び条件で投与することによる。

【００２２】本発明の更なる別の観点はヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープ、ソマトスタチ
ン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）又はソマトスタチンのペプチド類似体、免疫原性
ドメインと任意的な一般の免疫刺激性部位、例えばインバシンドメイン（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）とを分離するスペーサーを含む約３０〜約９０個のアミノ酸
の免疫原性合成ペプチドに関連する。このペプチド及びスペーサーのこれら３つ
の免疫原性ドメイン要素は、ペプチドハプテンの免疫反応性が実質的に保存され
るか、又はソマトスタチン自己ペプチドに対する免疫反応性が生起されうること
を条件に、任意の順序で共有結合されていてよい。

【００２３】発明の詳細な説明本発明はソマトスタチンに対する特異性を有する高力価のポリクローナル抗体
の作製のための新規のペプチド組成物に関する。このペプチド組成物の高度な部
位特異性は担体タンパク質上の無関係な部位に特異的な抗体の作製を最小限にす
る。従って、本発明は更に農場動物の成長促進のための有効な方法に関連する。

【００２４】ソマトスタチン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）は短い環化ペプチドホルモンであ
り、それ自体は非免疫原性であるが、自己抗原である。この短いペプチドは担体
タンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）への化学カッ
プリング又は組換ＤＮＡ発現を介する担体ポリペプチド、例えばＢ型肝炎表層抗
原への融合により免疫強化することができる。かかる「ソマトスタチン−担体」
ワクチンの主たる欠点はその組合せにより作製される抗体の大部分が担体タンパ
ク質又はポリペプチドに対して特異的であり、エピトープ抑制についての能力が
非機能性である抗体である点にある。本発明の免疫原は全体的に合成されたペプ
チドであり、それは無関係な抗体の生起を最少限にし、ソマトスタチンに対して
一層フォーカシングされた免疫応答を誘導する。しかしながら、ソマトスタチン
は非免疫原性Ｔ細胞依存性抗原であるため、それは免疫原性について外性Ｔｈエ
ピトープに完全に依存する。これらの共有結合型プロミスカスＴｈエピトープと
して本発明のペプチドについて供与される。本発明の免疫原は全て家畜の有効な
成長促進を供するよう部位特異的免疫反応性である。

【００２５】本発明のペプチドの態様としての特定の例を本発明において提供する。これら
の例は遺伝子的に多様な宿主集団において強力なソマトスタチン反応性抗体が作
製されるようソマトスタチンペプチドへの合成免疫刺激因子の連結を供する。こ
れらの抗体は、ソマトスタチンの機能の阻害を招き、その結果家畜の効率的な成
長促進をもたらす。

【００２６】活性免疫に関し、本明細書で言及する語「免疫原」とはソマトスタチンに対す
る抗体を誘導することができ、哺乳動物のソマトスタチンレベルの阻害又は抑制
を招くペプチド組成物を意味する。本発明のペプチド組成物にはプロミスカスヘ
ルパーＴ細胞エピトープ（Ｔｈエピトープ）を含むペプチドが含まれる。これら
のペプチドはスペーサー（例えばＧｌｙ−Ｇｌｙ）によりソマトスタチンペプチ
ドに対して共有結合しており、かくして標的ソマトスタチンペプチドのＮ又はＣ
末端のいずれかに隣接し、有効な抗体応答を誘導する。この免疫原は一般の免疫
刺激因子、例えば細菌エルジニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）種由来のインバシンタン
パク質のドメイン（Brett ら、Eur J Immunol. 1993, 23 : 1608-1614 （ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：２）も含んで成ってよい。インバシンドメインはスペーサーを介
してＴｈペプチドに付加されている。

【００２７】本発明のペプチドは下記の式により表わすことができる：Ｈ₂ Ｎ−（Ａ）_n −（ソマトスタチンペプチド）−（Ｂ）_o −（Ｔｈ）_m −Ｘ
又はＨ₂ Ｎ−（Ａ）_n −（Ｔｈ）_m −（Ｂ）_o −（ソマトスタチンペプチド）−Ｘ
（式中、Ｈ₂ ＮはペプチドコンジュゲートのＮ末端α−ＮＨ₂ であり、各Ａは独立してアミノ酸又は一般的免疫刺激性配列であり、各Ｂはアミノ酸、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ₂ ＳＣＨ₂ ＣＯ−、−ＮＨＣＨ（Ｘ）
ＣＨ₂ ＳＣＨ₂ ＣＯ（ε−Ｎ）Ｌｙｓ−、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ₂ Ｓ−スクシニ
ミジル（ε−Ｎ）Ｌｙｓ−、及び−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ₂ Ｓ−（スクシニミジル
）−から成る群から選択され、各Ｔｈは独立してヘルパーＴ細胞エピトープを構築するアミノ酸配列、又はそ
の免疫増強類似体又はセグメントであり、ソマトスタチンペプチドはソマトスタチンであるか、又はその交差反応性且つ
免疫学的機能性類似体であり、Ｘはアミノ酸α−ＣＯＯＨ又はα−ＣＯＮＨ₂ であり、ｎは１〜約１０であり、ｍは１〜約４であり、そしてｏは０〜約１０である）。

【００２８】本発明のペプチド免疫原は約２０〜約１００アミノ酸残基、好ましくは約２５
〜約８０アミノ酸残基、そしてより好ましくは約２５〜約６５アミノ酸残基を含
んで成る。

【００２９】Ａがアミノ酸又は一般的免疫刺激性因子、例えばＩｎｖのとき、それは式に示
すようにペプチド免疫原のＮ末端に、又はＣ末端（図示せず）のいずれかに共有
結合していてよい。

【００３０】Ａがアミノ酸であるとき、それは任意の天然に存在しないアミノ酸又は任意の
天然に存在するアミノ酸であることができる。天然に存在しないアミノ酸は下記
のものを包含するが、これらに限定されない：β−アラニン、オルニチン、ノル
ロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ−アミノ酪酸、ホ
モセリン、シトルリン及びその他。天然に存在するアミノ酸は下記のものを包含
する：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グ
ルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リ
シン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプ
トファン、チロシン及びバリン。そのうえ、ｍが１超であり、そして２以上のＡ
がアミノ酸のとき、各アミノ酸は独立して同一であるか、あるいは異なることが
できる。

【００３１】Ａがインバシンドメインであるとき、それはエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）
種のインバシンタンパク質からの免疫刺激性エピトープである。この免疫刺激性
は、Ｔ細胞、特に活性化された免疫又は記憶Ｔ細胞上に存在するβ１インテグリ
ン分子と相互作用するこのインバシンドメインの能力から生ずる。β１インテグ
リンと相互作用することが見出されたインバシンドメインの特定の配列は、Bret
t 他（Eur. J. Immunol., 1993）により記載された。プロミスカスＴｈエピトー
プに対する結合についてのインバシンドメイン（Ｉｎｖ）の好ましい態様は、以
前に米国特許第５，７５９，５５１号（これは引用することによって本明細書の
一部とされる）に記載された。Ｉｎｖドメインは配列Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−
Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を有するか、ある
いは他のエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）種のインバシンタンパク質中の対応す
る領域からのその免疫刺激性相同体である。こうして、このような相同体は、免
疫刺激性を保持するかぎり、細菌株の品種に適合するために、アミノ酸残基の置
換、欠失又は挿入を含有することができる。

【００３２】１つの態様において、ｎは１でありかつＡはα−ＮＨ₂ である。別の態様にお
いて、ｎは４であり、かつＡは下記の順序において、インバシンドメイン（Ｉｎ
ｖ）、グリシン及びグリシンである。

【００３３】Ｂはスペーサーであり、前述の天然に存在するか、あるいは天然に存在しない
アミノ酸であることができるアミノ酸でありうる。各Ｂは独立して同一であるか
、あるいは異なる。Ｂのアミノ酸は、また、プロミスカスＴｈエピトープ及びソマトスタチンペプ
チド（例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１）及びその交差反応性及び機能的免疫学
的類似体の間にスペーサー、例えばＧｌｙ−Ｇｌｙを供することができる。Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙスペーサーは、、ＴｈエピトープをＢ細胞エピトープ、すなわち、ソ
マトスタチンペプチド及びその免疫学的類似体から分離することに加えて、Ｔｈ
エピトープをソマトスタチンペプチド及びその交差反応性及び機能的免疫学的類
似体と結合し、これによりＴｈ及び／又はＢ細胞の応答間の干渉を排除すること
によってつくられた任意の人工的二次構造を崩壊することができる。Ｂのアミノ
酸配列は、また、Ｔｈ及びＩｇＥドメインの分離を増強する柔軟なヒンジとして
作用するスペーサーを形成することができる。柔軟なヒンジを形成する配列の例
は、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域の中に見出される。柔軟なヒンジ配列はし
ばしばプロリンに富んでいる。１つの特に有効な柔軟なヒンジは配列Ｐｒｏ−Ｐ
ｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）により提供
され、ここでＸａａは任意のアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸である。Ｂの
アミノ酸により提供されるコンホメーションの分離は、提示されたペプチド免疫
原と適当なＴｈ細胞及びＢ細胞との間のいっそう効率よい相互作用を可能とし、
こうして、Ｔｈエピトープ及び抗体誘導エピトープ及びそれらの交差反応性及び
機能的免疫学的類似体に対する免疫応答を増強する。

【００３４】ＴｈはＴｈエピトープを含んでなるアミノ酸配列（自然又は非自然のアミノ酸
）である。Ｔｈエピトープは連続的又は非連続的エピトープから成ることができ
る。それゆえ、Ｔｈのすべてのアミノ酸が必ずしもエピトープの一部分である必
要はない。したがって、Ｔｈエピトープの類似体及びセグメントを包含するＴｈ
エピトープは、ソマトスタチンペプチド及びそれらの免疫学的類似体に対する免
疫応答を増強又は刺激することができる。免疫優性及びプロミスカスであるエピ
トープは、広く多様なＭＨＣ型を有する動物及びヒトの集団において高度にかつ
広く反応性である（Partidos他、1991；米国特許第 5,759,551号）。主題のペプ
チドのドメインは、約１０〜約５０アミノ酸、好ましくは約１０〜約３０アミノ
酸を有する。多数のＴｈエピトープが存在するとき（すなわち、ｍ≧２）、各Ｔ
ｈエピトープは独立して同一であるか、あるいは異なる。Ｔｈセグメントは、ソ
マトスタチンペプチド（例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１）及びその免疫学的類
似体に対する免疫応答を増強又は刺激するために十分であるＴｈエピトープの連
続的部分である。

【００３５】本発明のエピトープは、例えば、下記のものを包含するが、これらに限定され
ない：Ｂ型肝炎の表面及びコアの抗原ヘルパーＴ細胞エピトープ（ＨＢｓＴｈ
及びＨＢｃＴｈ）、百日咳トキシンヘルパーＴ細胞エピトープ（ＰｔＴｈ）
、破傷風トキシンヘルパーＴ細胞エピトープ（ＴＴＴｈ）、麻疹ウイルＦタン
パク質ヘルパーＴ細胞エピトープ（ＭＶ_F Ｔｈ）、トラコーマクラミジア（Ｃｈ
ｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）主要外膜タンパク質ヘルパーＴ細胞
エピトープ（ＣＴＴｈ）、ジフテリアトキシンヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｄ
ＴＴｈ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）サーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）ヘルパーＴ細
胞エピトープ（ＰＦＴｈ）、シストソマ・マンソニ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ
ｍａｎｓｏｎｉ）トリオースリン酸イソメラーゼヘルパーＴ細胞エピトープ（
ＳＭＴｈ）、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｔｒａｔヘル
パーＴ細胞エピトープ（ＴｒａＴＴｈ）。ここで選ばれた病原体に由来するＴ
ｈは米国特許第５，７５９，５５１号の中に配列番号２〜９及び４２〜５２とし
て列挙された；ＣＴＴｈＰ１１として、Stagg 他、Immunology, 1993 ; 79
: 1-9 に記載された；そしてＨＢｃペプチド５０〜６９として、Ferrari 他、J.
Clin. Invest., 1991 ; 88 : 214-222 に記載された（前記参考文献はすべては
引用することによって本明細書の一部とされる）。更に、Ｔｈエピトープは理想
的な人工Ｔｈ（例えばＳＥＱＩＤＮＯ：１４）及び人工ＳＳＡＬＴｈ（例
えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：７，３０，３１）を含む。ＳＳＡＬＴｈを含んで
成るペプチドは単一の固相ペプチド合成においてソマトスタチン及びその他の配
列とタンデムで同時に製造される。これらの部位は機能的免疫学的類似体を含む
。機能的Ｔｈ類似体は、これらのＴｈエピトープの任意の免疫増強類似体、交差
反応性類似体及びセグメントを包含する。機能的Ｔｈ類似体は、さらに、Ｔｈエ
ピトープ中に、ＴｈエピトープのＴｈ刺激機能を本質的に改変しない、１〜約１
０のアミノ酸残基の保存的置換、付加、欠失及び挿入を含む。

【００３６】下記の式（Ａ）_n −（Ｔｈ）_m −（Ｂ）_o −（ソマトスタチンペプチド）又は（Ａ）_n −（ソマトスタチンペプチド）−（Ｂ）_o −（Ｔｈ）_m により表わされる本発明の合成ペプチドはスペーサーＢを介してソマトスタチン
ペプチド及びその交差反応性及び機能的免疫学的類似体のＮ末端又はＣ末端のい
ずれかに共有結合されている。

【００３７】本発明によるソマトスタチンペプチド（例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１）の
交差反応性、免疫学的に機能的な類似体は、ペプチド類似体がソマトスタチンペ
プチドと交差反応性の免疫応答を誘発することができるかぎり、１〜約４アミノ
酸残基の保存的置換、付加、欠失、又は挿入をさらに含むことができる。保存的
置換、付加、及び挿入は、本明細書において定義した自然又は非自然のアミノ酸
を使用して達成することができる。

【００３８】本発明の好適なペプチド免疫原はソマトスタチンペプチド又はその交差反応性
及び機能的免疫学的類似体；スペーサー（例えばＧｌｙ−Ｇｌｙ）；Ｔｈエピト
ープ、即ちＨＢ_S Ｔｈ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５），ＨＢ_C Ｔｈ（ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：４），ＭＶ_F Ｔｈ（ＳＥＱＩＤＮＯＳ：２１，２９），ＰＴＴ
ｈ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６），ＴＴＴｈ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５），ＣＴ
Ｔｈ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７），ＤＴＴｈ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８
）、人工Ｔｈ（例えばＳＥＱＩＤＮＯＳ：７，１４，３０，３１）又はその
類似体；及び任意的にＩｎｖドメイン（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）又はその類似
体を含む。

【００３９】主題のペプチド免疫原と２又はそれ以上のＴｈエピトープとの混合物を含有す
るペプチド組成物は、より広い集団において免疫効率を増強することができ、こ
うして、ソマトスタチンペプチドに対する改良された免疫応答を提供することが
できる。

【００４０】本発明のペプチド免疫原は、当業者によく知られている化学的合成法により製
造することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Fields他、Chapter 3,
Synthetic Peptides : A User's Guide, Grant, W.H. 編、Freeman & Co., New
York, NY, 1992, p.77 。それゆえ、ｔ−Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ化学により保護さ
れたα−ＮＨ₂ を用いる固相合成の自動化メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌ
ｄ）技術に従い、例えば、アプライド・バイオシステムス（ＡｐｐｌｉｅｄＢ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ペプチド合成装置４３０Ａ又は４３１で側鎖保護されたア
ミノ酸を使用して、ペプチドを合成することができる。Ｔｈエピトープについて
のＳＳＡＬを含んで成るペプチド構築体の製造は所定の可変性位置においてのカ
ップリングのための代替アミノ酸の混合物の提供により達成できうる。

【００４１】所望のペプチド免疫原の組立てが完結した後、標準的手順に従い樹脂を処理し
て樹脂からペプチドを切断し、アミノ酸側鎖上の官能基を脱ブロックする。遊離
ペプチドを、例えば、ＨＰＬＣにより精製し、例えば、アミノ酸分析又は配列決
定により生化学的に特性決定する。ペプチドを精製し、特性決定する方法は当業
者によく知られている。

【００４２】主題の免疫原をまた重合することができる。重合は、日常的方法に従い、例え
ばグルタルアルデヒドをリシン残基の−ＮＨ₂ 基と反応させることによって達成
することができる。他の方法に従い、合成免疫原、例えば、「Ａ−Ｔｈ_m −スペ
ーサー−（ソマトスタチンペプチド）」又は「（ソマトスタチンペプチド）−ス
ペーサー−（Ｔｈ）_m −Ａ」を重合するか、あるいは合成免疫原「Ａ−Ｔｈ−ス
ペーサー（ソマトスタチンペプチド）」又は「（ソマトスタチンペプチド）−ス
ペーサー（Ｔｈ）_m −（Ａ）_n 」のＮ末端に付加した追加のシステインを利用す
ることによって、他の免疫原と共重合させることができる。また、分枝鎖状ポリ
−リシルコア樹脂上に直接的に所望のペプチド構築物を合成することによって、
分枝鎖状ポリマーとして、主題の免疫原を製造することができる（Wang他、Scie
nce, 1991 ; 254 : 285-288 ）。

【００４３】あるいは、より長い合成ペプチド免疫原をよく知られている組換えＤＮＡ技術
により合成することができる。ＤＮＡ工学に関する多数の標準的マニュアルは、
本発明のペプチドを製造する詳細なプロトコルを提供する。本発明のペプチドを
コードする遺伝子を構築するために、好ましくは遺伝子が発現される生物につい
て最適化されたコドンを使用して、アミノ酸配列を核酸配列に逆翻訳する。次に
、典型的にはペプチドをコードするオーバーラッピングオリゴヌクレオチド及び
必要な調節因子を合成することによって合成遺伝子を作る。合成遺伝子を適当な
ベクターの中に挿入し、組換え体を形成し、特性決定する。次いで選択した発現
系及び宿主に適当な条件下に、ペプチドを発現させる。標準的方法により、ペプ
チドを精製し、特性決定する。

【００４４】本発明のペプチド組成物の効能は実施例に詳細の通り、動物、例えばラットに
本発明のペプチド、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：８〜１３，１６〜２０，２２を
含んで成る免疫原組成物を注射し、次いでソマトスタチン及びその交差反応性且
つ機能的免疫学的相同体に対する体液免疫応答を追跡することにより確立できう
る。

【００４５】本発明の他の面は、薬学上許容されるデリバリーシステム中に免疫学的に有効
量の本発明の１又はそれ以上のペプチド免疫原を含んでなるペプチド組成物を提
供する。したがって、主題のペプチドは、アジュバント、薬学上許容される担体
、又はペプチド組成物において日常的に提供される他の成分を使用してペプチド
組成物として処方することができる。本発明において使用することができる成分
の例は、アジュバント又は乳化剤、例えば、明礬、不完全フロインドアジュバン
ト、リポシン、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、エマルシゲン、モノホスホリ
ル脂質Ａ（ＭＡＬ）、ＱＳ２１、ＩＳＡ５１、ＩＳＡ３５、ＩＳＡ２０６、及び
ＩＳＡ７２０、ならびに他の既知の有効なアジュバント及び乳化剤である。処方
物は、即時放出及び／又は持続放出、及び全身的免疫の誘導のために処方するこ
とができ、これらは、例えば、免疫原の捕捉又は微小粒子との同時投与により達
成することができる。このような処方物は当業者により容易に決定され、そして
このような処方物を製造し、保存し、滅菌する方法はこの分野において知られて
いる。本発明の免疫原は、任意の好都合な経路、例えば、皮下、経口、筋肉内、
又は他の非経口又は腸内経路により投与することができる。同様に、免疫原は、
単一の投与又は多数の投与として投与することができる。当業者は免疫化のスケ
ジュールを容易に決定する。

【００４６】本発明のペプチド組成物は、有効量の１又はそれ以上の本発明のペプチド免疫
原と、薬学上許容される担体とを含有する。このような組成物は適当な投与単位
形態において一般に約０．５μｇ〜約１mgの免疫原／kg体重を含有する。多数の
投与量で導入するとき、組成物は好都合には適当量／投与単位形態に分割するこ
とができる。例えば、最初の投与量は、本発明のペプチド組成物として提供され
る、例えば、０．２〜２．５mg、好ましくは１mgの免疫原を注射により、好まし
くは筋肉内注射として投与し、次いで反復（ブースター）投与する。用量は、ワ
クチン及び療法の分野においてよく知られているように、動物の年齢、体重及び
一般的健康状態に依存するであろう。

【００４７】 O'Hagan 他（Vaccine, 1991 ; 9 : 768-771 ）が記載する生物分解性微小粒子
の中に又はその上に捕捉させるデリバリーにより、合成ソマトスタチンペプチド
免疫原に対する免疫応答を改良することができる。免疫原を生物分解性の微小粒
子の中にアジュバントの存在又は非存在下にカプセル化して、免疫応答を増強し
、そして持続したまたは周期的応答及び経口投与のための時間調節的放出を提供
することができる（O'Hagan 他、1991 ; Eldridge 他、Molec. Immunol., 1991
; 28 : 287-294）。特定のペプチド及びペプチド複合体の免疫原は、本発明を例示するために下記
の実施例において提供される。これらの実施例は例示のみを目的とし、本発明を
いかなる方法においても限定すると解釈すべきではない。

【００４８】実施例１ソマトスタチンペプチド構築体の合成のための典型的な方法表２及び３に挙げるペプチドは個別にＦｍｏｃ化学を利用してメリフィルド固
相合成技術により、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動化ペプチドシン
セサイザー（Ｍｏｄｅｌｓ４３０，４３１及び４３３Ａ）で合成した。構築し
た合成抗原ライブラリー（ＳＳＡＬ）、例えば「１，４，９ＰＡＬＩＮＤＲＯＭ
ＩＣ」（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）と称する人工Ｔｈを含んで成るペプチド構築
体の調製は化学カップリングのための所望のアミノ酸の混合物をこのデザインに
おいて特定した所定の位置に供することによって達成できる。所望のペプチドの
完全集成の後、トリフルオロ酢酸を利用する標準の手順に従って、樹脂を処理し
てその樹脂からこのペプチドを切断し、アミノ酸側鎖上の保護基を脱ブロッキン
グする。環式ペプチドの場合、切断したペプチドを１５％のＤＭＳＯ水溶液の中
に４８時間溶解しておき、システイン間でのジスルフィド間結合形成を促進させ
る。

【００４９】切断し、抽出し、そして洗浄したペプチドをＨＰＬＣにより精製し、そしてマ
ススペクトル及び逆相ＨＰＬＣにより特性決定した。

【００５０】ペプチドコードカラムの中で「ｂ」と表示したペプチドは標的抗原ペプチドと
して表示のＴｈ部位とタンデムで合成した。使用したＴｈ部位には、例えばＢ型
肝炎ウィルスからとったＨＢｒＴｈ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）及び「１，
４，９ＰＡＬＩＮＤＲＯＭＩＣ」と称する新規の人工Ｔｈ部位（ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：７）が挙げられる。「ｃ」と表示のペプチドはＩｎｖドメイン免疫刺激ペ
プチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）とタンデムで合成した「ｂ」構築体の変異体
である。「ｄ」と表示のペプチドは「ｂ」構築体の反転体（例えばソマトスタチ
ン−Ｔｈ）であり、そして「ｅ」と表示のペプチドは「ｃ」構築体の反転体であ
る（例えば、ソマトスタチン−Ｔｈ−Ｉｎｖ）。「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」及び「
ｅ」構築体は標的抗原部位をＴｈ部位から分離させるため及びＴｈをＩｎｖ免疫
刺激部位から分離させるためＧｌｙ−Ｇｌｙスペーサーを伴って合成した。

【００５１】実施例２ソマトスタチンペプチドの免疫原性の評価のための典型方法ソマトスタチンペプチド免疫原（例えば表２及び３に示すＳＥＱＩＤＮＯ
：８〜１３，１６〜２０，２２及び２４）を下記に概略する実験免疫プロトコー
ル及び免疫原性の決定のための血清学アッセイにより特定した４又は５匹のラッ
トのグループに基づき評価した。

【００５２】標準実験デザイン：免疫原：（１）個々のペプチド免疫原；又は（２）各実施例において特定した等モルのペプチド免疫原を含んで成る混合物。用量：何らかのことわりのない限り、一固の免疫当り０．５ml中１００μｇルート：何らかのことわりのない限り、筋肉内アジュバント：（１）フロインド完全アジュバント（ＣＦＡ）／不完全アジュバント（ＩＦＡ）；又は（２）０．４％のみょうばん（水酸化アルミニウム）；ＣＦＡ／ＩＦＡグループにはＣＦＡを０週目に与え、ＩＦＡをその後の週に与えた。みょうばんグループには全投与にわたって同一の製剤を与えた。投与スケジュール：０，２及び４週；０，３及び６週、又はその他の表示の通り。採血スケジュール：何らかのことわりのない限り、０，３，６及び８週種：Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットグループのサイズ：４又は５匹のラット／グループアッセイ：各免疫血清の抗ペプチド活性についての特異的ＥＬＩＳＡ。固相基質は環化ソマトスタチンペプチドとした（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）。

【００５３】血液を集め、そして血清へと処理し、そして標的抗原ペプチドによるＥＬＩＳ
Ａによる力価検定まで保存した。

【００５４】抗ソマトスタチン抗体活性はＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫収着アッセイ）により
、免疫収着体として環化ソマトスタチンペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）で
コーティングされた９６穴平底マイクロタイタープレートを用いて決定した。５
μｇ／mlの濃度のペプチド免疫原溶液のアリコート（１００μｌ）を３７℃で１
時間インキュベーションした。これらのプレートを３％のゼラチン／ＰＢＳ溶液
による３７℃で１時間の更なるインキュベーションによりブロッキングした。こ
のブロッキングを施したプレートを乾かし、そしてアッセイに用いた。サンプル
希釈バッファー中で１：１００の希釈率で出発し、その後１０倍系列希釈した試
験免疫血清のアリコート（１００μｌ）をペプチドコート化プレートに加えた。
これらのプレートを３７℃で１時間インキュベーションした。

【００５５】これらのプレートを０．０５％のＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）バッファー
で６回洗浄した。１００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼラベル化ヤギ抗種特
異的抗体をコンジュゲート希釈バッファー（０．５ＭのＮａＣｌ及び標準ヤギ血
清を含むリン酸バッファー）中に、適当な希釈率において加えた。これらのプレ
ートを３７℃で１時間インキュベーションし、そして前述の通りに洗浄した。Ｏ
−フェニレンジアミン基質溶液のアリコート（１００μｌ）を加えた。５〜１５
分間発色させ、それから５０μｌの２ＮのＨ₂ ＳＯ₄ を添加して酵素の色反応を
停止させた。各ウェルの内容物のＡ_492nm をプレーターリーダーで読んだ。ＥＬ
ＩＳＡ力価は吸収の線形回帰分析に基づき計算し、カットオフＡ_492nm は０．５
に設定しておいた。このカットオフ値は厳格であり、なぜなら各アッセイで流し
た希釈標準コントロールサンプルの値は０．１５未満だからである。

【００５６】ＴｈペプチドベースＥＬＩＳＡＴｈペプチドベースＥＬＩＳＡは抗原コーテ
ィング工程を除き本明細書に記載のソマトスタチンＥＬＩＳＡと本質的に同じよ
うにして実施し、ここではマイクロタイターウェルを対応のソマトスタチンワク
チン構築体（例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４及び１５を有するペプチド）に
由来する指定の個々のＴｈペプチドで５μｇ／mlにて３７℃で１ｈかけてコーテ
ィングした。

【００５７】実施例３様々な免疫刺激因子を含むソマトスタチン抗原ペプチドの免疫原性の研究表２に示すソマトスタチンペプチド免疫原は次式により表わされる本発明のペ
プチドの変異体を代表する：（Ａ）_n −（Ｔｈ）_m −（Ｂ）_o −（ソマトスタチンペプチド）又は（Ａ）_n −（ソマトスタチンペプチド）−（Ｂ）_o −（Ｔｈ）_m （式中、Ａはアミノ酸、αＮＨ₂ 又はＩｎｖであり（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）；Ａがアミノ酸又はＩｎｖのとき、それはＮ末端又はＣ末端に連結されていてよ
く；Ｂはグリシンであり；Ｔｈは外来病原体由来のヘルパーＴ細胞エピトープ、例えばＨＢ_C50-69Ｔｈ（
ＳＥＱＩＤＮＯ：４）、ＴＴ_615-631 Ｔｈ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）、Ｐ
Ｔ_149-176 Ｔｈ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）及び／又は人工Ｔｈ、例えば１，４
，９ＰＡＬＩＮＤＲＯＭＩＣＴｈ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）であり；ｎは１、ｍは１、そしてｏは２である）。

【００５８】とりわけこれらのペプチドを合成し、そして免疫血清を免疫原性の評価のため
に作製した。様々な形態及び配向のＴｈエピトープを含む表２に示すペプチドの
ほとんどが免疫宿主において高力価のソマトスタチン特異的抗体を誘導した。対
照的に、Ｔｈを欠くソマトスタチンペプチド（ｐ１３４８ａ，ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：１）は免疫原性を欠いた。しかしながら、所定のＴｈが他のものと比較して
好適であった。例えば、表２において、ＨＢ_C Ｔｈ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）
を有するｐ２１３４ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）、ＳＹＮＴｈ（１，２，３
）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）、人工Ｔｈ部位を有するｐ２３８４ｂ（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：２０）、及びＰＴ_149-176 Ｔｈ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）を有
するｐ２１３８ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）はＴＴＴｈ（ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：５）を有するｐ２１３５ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）よりも免疫原性で
あり、そしてこれらは全て免疫原性のほとんどないＣＴＡ８Ｔｈ（ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：２３）を有するｐ２１３６ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４）より好ま
しい。また、最適免疫原性のため、ソマトスタチン標的部位に対するＴｈ部位の
配向を特定しなくてはならない。ｐ２２５３ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）の
抗体応答のカイネチックをｐ２２５５ｄ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）のそれと
対比する。ソマトスタチンのＣ末端上に１，４，９ＰＡＬＩＮＤＲＯＭＩＣＴ
ｈ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）を配置するのが好ましい。ｐ１３４４ｂ（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１６）とｐ１３４９ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）の対比から
、ＭＶ_F258-277（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）についての最良の配置はソマトス
タチンのＮ末端上である。各Ｔｈ部位の選択及び配置は本発明の好適なペプチド
のために特定しなければならないことが明らかである。

【００５９】表３に示すソマトスタチンペプチドに関し、プロスミスカスＴｈエピトープを
含んで成るソマトスタチン構築体が既に免疫原性であると認められている場合、
Ｉｎｖの「Ｔｈ」構築体への付加はソマトスタチンペプチドの免疫原性を改善で
きうる。ｐ１３４４ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）とｐ１３４３ｃ（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１７）並びにｐ１３４６ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）とｐ１３
４５ｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）の免疫原性の対比はＩｎｖドメイン（ＳＥ
ＱＩＤＮＯ：２）のＴｈ構築体のＮ末端への付加が応答動物の比率、ソマト
スタチン特異的抗体の力価の強さ、及び抗体応答の寿命（＞３５週）の観点で免
疫原性を向上させることを示した。しかしながら、ｐ２１３４ｂ（ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：８）とｐ２１３４ｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５）及びｐ２１３４ｄ（
ＳＥＱＩＤＮＯ：２６）との免疫原性の比較は、特定のＴｈ部位との組合せ
では、Ｉｎｖは免疫刺激性でないことがあり、そしてＩｎｖとＨＢ_C Ｔｈ部位（
ＳＥＱＩＤＮＯ：４）との組合せに関してＮ末端上での特定の配向がＣ末端
配向よりも好適であることを示す。ｐ２１３５ｅの例に関し（ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：１３）、Ｃ末端上でのＩｎｖとＴＴ_615-631 Ｔｈ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５
）との組合せは有効な免疫原をもたらした。従って、Ｉｎｖの付加及びＴｈとＩ
ｎｖとの配向は本発明の好適なペプチドについて特定されなければならない。

【００６０】ソマトスタチンに対する強い部位特異的免疫原性を有する構築体に関し、免疫
刺激因子、例えば表３由来のｐ１３４３ｃのＩｎｖ−ＭＶＦ_258-277 Ｔｈ（ＳＥ
ＱＩＤＮＯ：１７）及びｐ１３４６ｂのＫＫＫ−ＨＢ_S19-32Ｔｈ−ＧＧ（Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ：１８）に特異的な抗体力価は＜１Ｌｏｇ₁₀であり、それに対
しソマトスタチンに関しては＞３Ｌｏｇ₁₀であった。従って、本発明の合成ペプ
チドにより作製された免疫応答はソマトスタチン標的部位に対してほとんどもっ
ぱら特異的であった。

【００６１】実施例４本発明の追加の抗原ペプチド次式により表わされる本発明のペプチドの変異体を代表するソマトスタチンペ
プチド抗原を合成し、そして免疫血清を作製した：（Ａ）_n −（Ｔｈ）_m −（Ｂ）_o −（ソマトスタチンペプチド）又は（Ａ）_n −（ソマトスタチンペプチド）−（Ｂ）_o −（Ｔｈ）_m （式中、Ｔｈは表４に示す任意の外来病原体由来のヘルパーＴ細胞エピトープであるか
、又は表５に示す任意の人工Ｔｈエピトープ由来のヘルパーＴ細胞エピトープで
あり；Ａはアミノ酸、αＮＨ₂ 又はインバシンドメインであり（ＳＥＱＩＤＮＯ
：２）；Ａがアミノ酸又はＩｎｖのとき、それはＮ末端又はＣ末端のいずれかで連結さ
れていてよく；Ｂはグリシンであり；ｎは１、ｍは１、そしてｏは２である）。

【００６２】

【表１】

【００６３】

【表２】

【００６４】

【表３】

【００６５】

【表４】

【００６６】

【表５】

【００６７】

【表６】

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１３年８月２日（２００１．８．２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １７１Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 14/655 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 16/28 Ａ６１Ｋ 37/02 19/00 37/36 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ソマトスタチンに共有結合したヘルパーＴ細胞エピトープ配
列（Ｔｈ）を含んで成るペプチドコンジュゲート又はその交差反応性且つ免疫学
的に機能性な類似体。
【請求項２】前記ペプチドコンジュゲートが次式により表わされる請求項
１記載のペプチドコンジュゲート：Ｈ₂ Ｎ−（Ａ）_n −（ソマトスタチンペプチド）−（Ｂ）_o −（Ｔｈ）_m −Ｘ
又はＨ₂ Ｎ−（Ａ）_n −（Ｔｈ）_m −（Ｂ）_o −（ソマトスタチンペプチド）−Ｘ
（式中、Ｈ₂ Ｎは当該ペプチドコンジュゲートのＮ末端α−ＮＨ₂ であり、各Ａは独立してアミノ酸又は一般的な免疫刺激配列であり、各Ｂはアミノ酸、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ₂ ＳＣＨ₂ ＣＯ−、 −ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ₂ ＳＣＨ₂ ＣＯ（ε−Ｎ）Ｌｙｓ−、 −ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ₂ Ｓ−スクシニミジル（ε−Ｎ）Ｌｙｓ−及び −ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ₂ Ｓ−（スクシニミジル）−から成る群から選ばれ；各Ｔｈは独立してヘルパーＴ細胞エピトープを含んで成るアミノ酸配列である
か、又はその免疫増強類似体もしくはセグメントであり；ソマトスタチンペプチドはソマトスタチン又はその交差反応性且つ免疫学的に
機能性な類似体であり；Ｘはアミノ酸α−ＣＯＯＨ又はα−ＣＯＮＨ₂ であり；ｎは１〜約１０であり；ｍは１〜約４であり；そしてｏは０〜約１０である）。
【請求項３】前記ペプチドコンジュゲートが次式により表わされる請求項
１記載のペプチドコンジュゲート：Ｈ₂ Ｎ−（ソマトスタチンペプチド）−（Ｂ）_o −（Ｔｈ）_m −（Ａ）_n −Ｘ
又はＨ₂ Ｎ−（Ｔｈ）_m −（Ｂ）_o −（ソマトスタチンペプチド）−（Ａ）_n −Ｘ
（式中、Ｈ₂ Ｎ−は当該ペプチドコンジュゲートのＮ末端α−ＮＨ₂ であり、各Ａは独立してアミノ酸又は一般的な免疫刺激配列であり、各Ｂはアミノ酸、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ₂ ＳＣＨ₂ ＣＯ−、 −ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ₂ ＳＣＨ₂ ＣＯ（ε−Ｎ）Ｌｙｓ−、 −ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ₂ Ｓ−スクシニミジル（ε−Ｎ）Ｌｙｓ−及び −ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ₂ Ｓ−（スクシニミジル）−から成る群から選ばれ；各Ｔｈは独立してヘルパーＴ細胞エピトープを含んで成るアミノ酸配列である
か、又はその免疫増強類似体もしくはセグメントであり；ソマトスタチンペプチドはソマトスタチン又はその交差反応性且つ免疫学的に
機能性な類似体であり；Ｘはアミノ酸α−ＣＯＯＨ又はα−ＣＯＮＨ₂ であり；ｎは１〜約１０であり；ｍは１〜約４であり；そしてｏは０〜約１０である）。
【請求項４】各Ｂが天然及び非天然アミノ酸から成る群から選ばれる、請
求項２又は３記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項５】前記ソマトスタチンペプチドがソマトスタチンである、請求
項１〜４のいずれか１項記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項６】前記ＴｈがＳＳＡＬエピトープである、請求項１〜４のいず
れか１項記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項７】前記ＴｈがＳＥＱＩＤＮＯ：４，ＳＥＱＩＤＮＯ：
５，ＳＥＱＩＤＮＯ：６，ＳＥＱＩＤＮＯ：７，ＳＥＱＩＤＮＯ：
１４，ＳＥＱＩＤＮＯ：１５，ＳＥＱＩＤＮＯ：２１，ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：２３，ＳＥＱＩＤＮＯ：２７，ＳＥＱＩＤＮＯ：２８，ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：２９，ＳＥＱＩＤＮＯ：３０及びＳＥＱＩＤＮＯ：３１か
ら成る群から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項記載
のペプチドコンジュゲート。
【請求項８】前記ペプチドコンジュゲートがＳＥＱＩＤＮＯ：８，Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ：９，ＳＥＱＩＤＮＯ：１０，ＳＥＱＩＤＮＯ：１１
，ＳＥＱＩＤＮＯ：１２，ＳＥＱＩＤＮＯ：１３，ＳＥＱＩＤＮＯ
：１６，ＳＥＱＩＤＮＯ：１７，ＳＥＱＩＤＮＯ：１８，ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：１９，ＳＥＱＩＤＮＯ：２０，ＳＥＱＩＤＮＯ：２２，ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：２４，ＳＥＱＩＤＮＯ：２５及びＳＥＱＩＤＮＯ：２６
から成る群から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項２記載のペプチドコンジ
ュゲート。
【請求項９】少なくとも一のＡがインバシンドメインである、請求項２又
は３記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１０】ｎが３であり、そして（Ａ）₃ が（インバシンドメイン）
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙである、請求項２記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１１】前記インバシンドメインがＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミ
ノ酸配列を有する、請求項９又は１０記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１２】約２５〜約９０個のアミノ酸の合成ペプチドであって、（ａ）インバシンドメイン、（ｂ）ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープ及び（ｃ）ソマトスタチン又はその交差反応性且つ免疫学的に機能性な類似体；のアミノ酸配列を含んで成る合成ペプチド。
【請求項１３】ＳＥＱＩＤＮＯ：１７，ＳＥＱＩＤＮＯ：１９及
びＳＥＱＩＤＮＯ：２５から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含んで成る
ペプチド。
【請求項１４】前記ペプチドが哺乳動物のソマトスタチンに対する免疫応
答を刺激する、請求項１〜１３のいずれか１項記載のペプチド又はペプチドコン
ジュゲート。
【請求項１５】前記ペプチドコンジュゲートによる哺乳動物の免疫が当該
哺乳動物のソマトスタチンレベルを低下させる、請求項１４記載のペプチド又は
ペプチドコンジュゲート。
【請求項１６】免疫学的に有効な量の請求項１〜１５のいずれか１項記載
のペプチド又はペプチドコンジュゲートと医薬的に許容される担体とを含んで成
る医薬組成物。
【請求項１７】前記免疫学的に有効な量が一回の投与当り体重１kgにつき
約０．５mg〜約１mgの前記ペプチド又はペプチドコンジュゲートである、請求項
１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】哺乳動物の抗−ソマトスタチン抗体産生を誘導するための
方法であって、当該哺乳動物に請求項１６又は１７記載の医薬組成物を投与する
ことを含んで成る方法。
【請求項１９】哺乳動物の成長速度を高めるための方法であって、当該哺
乳動物に請求項１６又は１７記載の医薬組成物を投与することを含んで成る方法
。
【請求項２０】哺乳動物の成長速度を高めるための方法であって、当該哺
乳動物にソマトスタチンレベルを低下させるのに十分な量の請求項１６又は１７
記載の医薬組成物を投与することを含んで成る方法。
【請求項２１】請求項１〜１５のいずれか１項記載のペプチド又はペプチ
ドコンジュゲートの２種以上の混合物を含んで成る組成物。
【請求項２２】免疫学的に有効な量の請求項２１記載の組成物と医薬的に
許容される担体とを含んで成る医薬組成物。
【請求項２３】前記組成物の前記免疫学的に有効な量が１回の投与当り体
重１kgにつき約０．５μｇ〜約１mgである、請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２４】哺乳動物の抗−ソマトスタチン抗体の産生を誘導するため
の方法であって、当該哺乳動物に請求項２２又は２３記載の医薬組成物を投与す
ることを含んで成る方法。
【請求項２５】哺乳動物の成長速度を高めるための方法であって、当該哺
乳動物に請求項２２又は２３記載の医薬組成物を投与することを含んで成る方法
。
【請求項２６】成長速度を高める方法であって、哺乳動物にソマトスタチ
ンレベルを低下するのに十分な量の請求項２２又は２３記載の医薬組成物を投与
することを含んで成る方法。
【請求項２７】請求項１〜１５のいずれか１項記載の２，４又は８個のペ
プチドコンジュゲート各々に共有結合したリジン、トリリジン又はペプタリジン
コアを含んで成る枝分れポリマー。
【請求項２８】二価架橋剤により架橋された請求項１〜３及び請求項５〜
１５のいずれか１項記載の１又は複数のペプチドコンジュゲートを含んで成るポ
リマー。
【請求項２９】ＳＥＱＩＤＮＯ：４，ＳＥＱＩＤＮＯ：５，ＳＥ
ＱＩＤＮＯ：６，ＳＥＱＩＤＮＯ：７，ＳＥＱＩＤＮＯ：１４，Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ：１５，ＳＥＱＩＤＮＯ：２１，ＳＥＱＩＤＮＯ：２
３，ＳＥＱＩＤＮＯ：２７，ＳＥＱＩＤＮＯ：２８，ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：２９，ＳＥＱＩＤＮＯ：３０及びＳＥＱＩＤＮＯ：３１から成る群
から選ばれるＴｈエピトープペプチド。