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WO2014118318A1 - Composés agonistes du récepteur kiss1 et leur utilisation pour induire l'ovulation chez les mammifères - Google Patents

Composés agonistes du récepteur kiss1 et leur utilisation pour induire l'ovulation chez les mammifères Download PDF

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WO2014118318A1
WO2014118318A1 PCT/EP2014/051886 EP2014051886W WO2014118318A1 WO 2014118318 A1 WO2014118318 A1 WO 2014118318A1 EP 2014051886 W EP2014051886 W EP 2014051886W WO 2014118318 A1 WO2014118318 A1 WO 2014118318A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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peptide
peptide compound
compound
compound according
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2014/051886
Other languages
English (en)
Inventor
Massimiliano Beltramo
Vincent Aucagne
Alain CARATY
Agnès Delmas
Mathieu GALIBERT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority to US14/765,251 priority Critical patent/US9884891B2/en
Priority to BR112015018283A priority patent/BR112015018283A2/pt
Priority to EP14702555.5A priority patent/EP2951200A1/fr
Publication of WO2014118318A1 publication Critical patent/WO2014118318A1/fr
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Ceased legal-status Critical Current

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Definitions

  • the present invention is in the field of induction and synchronization of ovulation in mammals. More particularly, it relates to a peptide compound agonist of the KISS1 R receptor capable of inducing / synchronizing such ovulation, as well as the use of such a compound as a medicament, in particular for inducing this ovulation, and a veterinary composition and / or pharmaceutical container.
  • the compound according to the invention has applications in the field of animal husbandry, in particular with a view to programming breeding throughout the year, for example sheep, goats, or cattle. Although the latter species is not of the spawning type, dairy cows nevertheless show a decline in fertility and a KISS1 R receptor agonist could be used to restore better fertility.
  • the compound according to the invention also has applications in the therapeutic field, in particular for reducing the problems of infertility, and in particular in the human clinic for the treatment of reproductive pathologies, in particular in the context of the implementation of medically assisted procreation techniques.
  • this compound is the treatment of other pathologies, such as hypothalamic amenorrhea and delayed puberty, and all other pathologies that require an increase in the secretion of GnRH (for Gonadotropin Releasing Hormone) and gonadotropins.
  • GnRH for Gonadotropin Releasing Hormone
  • the estrogen hormones used are pollutants that are not easily degraded, accumulate in the soil and water, and pose a threat to human health.
  • the treatment of animals with such hormones also presents important constraints for the breeders, who are obliged to respect very strict specifications.
  • the methods currently used to induce ovulation in sheep provide for the implantation for 12 to 24 days of a vaginal sponge containing progesterone, combined with co-treatment with an injection. intramuscular serum gonadotropin PMSG at the time of removal of the sponge. Such treatment is binding to implement.
  • KISS1 R also called KISS1 receptor, or GPR54
  • GPR54 GeneBank accession number, for the human receptor: NM-032551 .4, Gl: 189163516
  • kisspeptides or kisspeptins
  • KISS1 Endogenous ligands, called kisspeptides (or kisspeptins)
  • KISS1 Endogenous ligands, called kisspeptides (or kisspeptins)
  • KISS1 GenBank accession number, for the human peptide: NM_002256.3, Gl: 1 16829963; NP_002247.3 , Gl: 16829964; for the murine peptide: AB666166.1, Gl: 384367966; BAM1 1250.1, Gl: 384367967; for the ovine peptide: AFW03832.1, Gl: 41 1 100741), which are neurotransmitters having the ability to to stimulate KISS1 R (Kotani et al.,
  • the abbreviation KISS1 R will be used to designate both the human receptor and the receptor of other species (indicated by the abbreviation Kissl r in the official nomenclature).
  • a complete list of synonyms used to designate the KISS1 R is available on the IUPHAR website.
  • the kisspeptide (kisspeptin) essentially responsible for the biological stimulation activity of KISS1 R is the decapeptide named kisspeptin-10, or KP10.
  • the sequences of the mouse-derived kisspeptin-10 (mKP10, of sequence SEQ ID NO: 1, in which the C-terminal end is modified by amidation) and of the human-derived kisspeptin-10 are known ( hKP10, of sequence SEQ ID NO: 2, in which the C-terminal end is modified by amidation).
  • the kisspeptin-10 derived from the ewe is in particular identical to mKP10.
  • KP10 induces a very powerful stimulatory effect on the release of hormones LH and FSH in mammals, this effect resulting from an increase in the secretion of GnRH (for Gonadotropin Releasing Hormone) (Caraty and Franceschini, 2008).
  • GnRH for Gonadotropin Releasing Hormone
  • KP10 administered to ewes intravenously at the end of the follicular phase, is capable of inducing a peak of LH which is followed, 21 hours later, by ovulations synchronized to the hour (Caraty et al., 2007).
  • KP10 Compared to steroid hormones, KP10 has the advantages of being very quickly eliminated from the body and easily destroyed in the natural environment, leaving only amino acids as residues. Moreover, it presents a mechanism of action, resulting in a triggering of the secretion of the hormone LH, hormone necessary for the induction of ovulation, completely different from that of current treatments, and allowing a more localized action and fine by avoiding unwanted side effects.
  • KP10 is rapidly degraded and excreted by the body, it has a limited duration of action.
  • the present inventors have therefore aimed to develop compounds derived from KP10 which have a prolonged and controlled duration of action in the body, while maintaining similar environmental degradability properties to those of KP10.
  • the invention also aims that these compounds are capable of effectively inducing ovulation in a female mammal, including in off-season, by a small number of administrations, in particular by a single injection.
  • a further object of the invention is that these compounds have a low cost of preparation.
  • peptide compound agonist KISS1 R selected from:
  • ⁇ [ ⁇ ] represents a 1,2,3-triazole-1,4-disubstituted group of formula (I):
  • Xaa1 represents Gly or Ala
  • Xaa2 represents Leu or a similar aliphatic ⁇ -amino acyl residue, such as Ile, Val, Ala (cPr), Nie or Nval
  • Xaa3 represents Arg, whose -NH 2 function is optionally substituted by a methyl group, or a positively-charged pos-like cc-amino acyl residue, such as Arg (asymme 2 ), Lys, optionally substituted, or Orn, where appropriate substituted
  • Xaa4 represents Tyr, Phe, Trp or a cc-amino acyl residue of similar aryl alanine type, such as 1 -, 2- or 3-naphthylalanine, 2- or 3-thienylalanine, 2- or 3-membered -furylalanine, 2-, 3- or 4-fluorophenylalanine, 2-, 3- or 4-chlorophenylalanine, 2-, 3- or 4-bromorophenylalanine, 2-,
  • the disubstituted 1,2,3-triazole ring is advantageously an inexpensive and easily accessible isostere, so that the process for synthesizing such a compound is advantageously inexpensive to implement.
  • This synthesis can also be easily achieved by conventional peptide synthesis techniques, for example solid phase in Fmoc / tBu strategy.
  • the peptide compound according to the invention advantageously has, with respect to KP10, a prolonged lifespan in the body, more particularly in the blood serum, while retaining a stimulating efficiency of KISS1 R that is as important, or even better, as well as minimal environmental remanence. It makes it possible in particular to significantly increase the blood level of the LH hormone in mammals, including during the anestrus period, by a limited number of administrations, moreover by a route of administration which is particularly compatible with use in breeding, in particular by means of a single injection, for example intramuscular or subcutaneous.
  • C-terminal region will be used to denote the region of the peptide compound of sequence SEQ ID NO: 3, and by the term “N-terminal region", the remaining region of the compound.
  • Xaa1 represents Gly
  • Xaa2 represents Leu
  • Xaa3 represents Arg, whose -NH 2 function is optionally substituted with a methyl group.
  • the peptide compound according to the invention may have a size of from 5 to 54 amino acids, preferably from 5 to 16 amino acids, more preferably from 7 to 12 amino acids, and preferably 9, 10 or 1 1 amino acids.
  • the peptide compound has one or more of the following characteristics:
  • N-terminal amine function is modified by substitution with a group chosen from linear alkanoyls, in particular C 1 -C 6, preferably C 2 -C, benzoyl groups and tetramethylguanidinium groups,
  • N-terminal amino function is replaced by an azide function, or by a 1,4-disubstituted 1,2,3-triazole group of formula (I);
  • At least one amino acid, more particularly the N-terminal region is linked to one or more polyalkylene glycol chains, preferably polyethylene glycol, and / or to one or more lipid chains, such as a palmitoyl group, and / or groups binding to serum albumin.
  • polyalkylene glycol chains preferably polyethylene glycol, and / or to one or more lipid chains, such as a palmitoyl group, and / or groups binding to serum albumin.
  • at least one amino acid is linked to a polyethylene glycol chain, linear or branched, of molecular weight between 5 and 40 kDa; at least the N-terminal amine functional group is substituted by an alkyl group, especially chosen from linear, preferably C 1 -C 6, alkyls, in particular by a methyl group, or by a benzyl group.
  • the peptide compound according to the invention can be cyclized, by any conventional cross-linking in itself between the side chains of two amino acids of its N-terminal region and / or its N-terminal amine function, in particular by formation of a amide, a triazole, an alkene, a disulfide bridge, a bis-thioether, etc.
  • the peptide compound is chosen from:
  • pseudo-peptide of sequence SEQ ID NO: 4 capable of binding KISS1 R
  • one or more modifications at the level of the N-terminal region in particular by addition, substitution, by a natural or non-natural amino acid, including D enantiomers, and / or deletion, of one or more acids amines, and / or by a modification of the N-terminus and / or of any functional group carried by the side chain of an amino acid, and / or by the replacement of a peptide bond by an isosteric bond, any in retaining the ability to bind KISS1 R.
  • the ability of peptide compounds to bind KISS1 R can be controlled in different ways. It may in particular be controlled by an in vivo test, by measuring the concentration of LH in ewe blood samples to which the test molecule has been injected, for example according to the protocol described hereinafter in the present description. An increase in this concentration, relative to an untreated control, indicates an ability of the analog to bind KISS1 R.
  • this ability can be controlled by in vitro test, by measuring the amount of intracellular calcium in a cell line expressing KISS1 R after incubation with the test molecule.
  • the stimulation of KISS1 R leads to the activation of two distinct intracellular pathways, which induce the increase of the intracellular concentration of calcium ions: by release of the intracellular stores, following the production of IP3, and by entry following the opening of the ion channels (for example TRPC) of the plasma membrane of the cell, calcium ions present in the extracellular medium.
  • An example of such a test, called calcium mobilization is described in detail hereinafter in the present description.
  • An increase in the amount of intracellular calcium, relative to an untreated control then testifies to the ability of the analog to bind KISS1 R.
  • Particular analogues of the pseudo-peptide of sequence SEQ ID NO: 4, in particular having a half-life in the blood serum greater than that of KP10, correspond to one or more of the following characteristics: at least one acid
  • the amine of Tyr1, Asn2 and Trp3 is substituted with a lysine, the amine function of which is preferably substituted by one or more groups selected from an alkanoyl group, in particular an acetyl group, a polyalkyleneglycol chain, preferably polyethylene glycol, and a chain.
  • lipid such as a palmitoyl group or other group allowing interaction with serum albumin; at least the amino acid Tyr1 is replaced by its enantiomer D.
  • Particular peptide compounds according to the invention are analogs of the pseudo-peptide of sequence SED ID NO: 4, differing from the latter but retaining a serine residue (Ser) two positions upstream of Xaa1, that is, in most cases, in position 5.
  • Ser serine residue
  • peptide compounds according to the invention have a threonine (Thr) residue at this position.
  • Particular peptide compounds according to the present invention are: H-Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-G (Tz) Leu-Arg-Tyr-NH 2 (SEQ ID NO: 5)
  • N-terminus is modified by acetylation
  • particularly advantageous peptide compounds according to the present invention are such that at least one amino acid is linked to a unit capable of binding to serum albumin. It has been observed by the present inventors that, surprisingly, such a characteristic has the effect of very significantly increasing the duration of action of the peptide compound in the body.
  • the unit capable of binding serum albumin is attached to an amino acid located in the N-terminal region of the peptide compound.
  • a ⁇ -glutamyl spacer group between the amino acid and a group capable of binding to serum albumin such as a hexadecanoyl group (also called palmityl)
  • increases the affinity of said group with serum albumin Kernudsen et al., 2000).
  • Any other motif capable of binding serum albumin may also be used in the context of the invention, for example a acide-carboxylate fatty acid (Zarandi et al., 2006), Albu-tag (Dumelin et al., 2008) or a cyclopeptide (Dennis et al., 2002, Angelini et al., 2012).
  • Examples of such units, and associated spacer arms for their binding to a residue of the peptide compound according to the invention are in particular TTDS- (y- (/ V-hexadecanoyl-Glu-OH)) or else 2- ( succinamido) -6- (4- (4-iodophenyl) butanamido) hexanoate.
  • TTDS- y- (/ V-hexadecanoyl-Glu-OH)
  • 2- ( succinamido) -6- (4- (4-iodophenyl) butanamido) hexanoate is an analogue of the pseudo-peptide of sequence SEQ ID NO: 4
  • a unit able to bind serum albumin is introduced at least at position 1, at position 2 and / or in position 3 of the peptide compound, that is to say at the level of Tyr1, Asn2 and / or Trp3, or residues which are analogous thereto.
  • the unit When the pattern capable of binding serum albumin is set at position 1, the unit is preferably attached to the N-terminal amino function.
  • the residue concerned for example the residue Asn2 or the residue Trp3
  • the residue concerned is preferably substituted by a lysine residue, on the chain. side of which is fixed the pattern capable of binding serum albumin.
  • Another aspect of the invention is the use of a peptide compound having one or more of the above-described characteristics as a medicament, and more particularly for inducing ovulation in a female mammal.
  • This mammal may especially be a farm animal such as a sheep, a goat, a bovine, a pig, an equine, etc., a pet, such as a dog or a cat, or, for example, a wild animal, as found in zoos and animal parks, etc. ; otherwise, this mammal can be a human being.
  • the invention relates to the use of such a peptide compound to stimulate KISS1 R, in order to increase the secretion of GnRH, and consequently to stimulate the release of LH and / or FSH hormones in a patient. mammal.
  • the peptide compound according to the invention may especially be used in the context of the treatment of pathological conditions resulting from low circulating levels of LH and FSH, for example pathological conditions resulting from insufficient pituitary stimulation. More generally, it can be used for the treatment of pathologies related to a reduction in the activity of the hypothalamic-pituitary-gonad axis, such as amenorrhea of hypothalamic origin or puberty delays.
  • peptide compound according to the invention are in particular the treatment of certain forms of cancer, sensitive to steroid hormones, or the delay of aging by stimulating the secretion of GnRH (Zhang et al., 2013).
  • the peptide compound according to the invention is preferably administered in the form of injection, which may for example be carried out intramuscularly, intravenously, subcutaneously, or intradermally.
  • the treatment may consist of a single injection of the compound to the mammal to be treated.
  • the administration can also be performed orally.
  • the dose of the peptide compound administered according to the invention may be between 1 ⁇ 9 and 1 mg, in particular between 1 ⁇ g and 250 ⁇ g, depending on the mammal and the molecular mass of the compound. For example, for an ewe, the administered dose may be about 10 ⁇ g.
  • the present invention relates to a veterinary or pharmaceutical composition, in particular for inducing ovulation in a female mammal, which contains a peptide compound corresponding to one or more of the above characteristics, in a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • composition is preferably in a form that can be administered intramuscularly, subcutaneously, intravenously or intradermally, or in an orally administrable form.
  • FIGS. 2a to 2i are graphs showing the fluorescence intensity, in arbitrary units, as a function of the concentration of compound, obtained in an intracellular calcium mobilization test showing the activation of KISS1 R by the compound, for the following compounds according to the invention: FIG.
  • FIG. 3 shows the concentration of LH measured in blood samples taken from ewes during the anoestrus period, at different times before and after the intravenous administration of physiological solutions containing respectively 5 nmol / ew of the compounds Comp.
  • FIG. 4 shows the concentration of LH measured in blood samples taken from oestrus ewes, at different times before and after the intravenous administration of physiological saline containing respectively 5 nmol / ewe of the comparative compound Comp. 1, compounds according to the invention C1, C4 and C6, and physiological solution alone (T), the moment of administration being indicated by an arrow in the figure; said concentration of LH being expressed as a percentage with respect to the maximum concentration of LH measured after injection of 5 nmol / ew of Comp.1 taken as reference (% of the maximum stimulation of Comp.1);
  • FIGS. 5a to 5i are graphs showing the fluorescence intensity, in arbitrary units, as a function of the concentration of compound, obtained in an intracellular calcium mobilization test showing the activation of KISS1 R by the compound, for the following compounds according to the invention: FIG. 5a, compound C8; Figure 5b, compound C9; Figure 5c, compound C10; Figure 5d, compound C1 1; Figure 5e, compound C12; Figure 5f, compound C13; Figure 5g, compound C14; Figure 5h, compound C15; Figure 5i, compound C16; and, in all the figures, for the comparative compound Comp.1;
  • FIGS. 6a to 6d show the concentration of LH measured in blood samples taken from ewes during the anoestrus period, at different times before and after the intravenous administration of physiological solutions containing respectively 5 nmol / ewe of the compounds: Figure 6a, Comp.1; Figure 6b, Comp.3; Figure 6c, C1; Figure 6d, C2;
  • FIG. 7 is a histogram showing the area under the curve (AUC) calculated for each curve of FIGS. 6a to 6d;
  • FIGS. 8a and 8b show the concentration of LH measured in blood samples taken from ewes during the anoestrus period, at different times before and after the intravenous administration of physiological solutions respectively containing the compounds according to the invention: Figure 8a, C2; Figure 8b, C8, in concentrations of 1 nmol / ewe, 5 nmol / ewe and 15 nmol / ewe;
  • FIGS. 9a and 9b are histograms showing the area under the curve (AUC) calculated for each of the curves respectively of FIGS. 8a and 8b;
  • FIG. 10 shows the concentration of LH measured in blood samples taken from sheep during the oestrus period, at different times before and after the injection of a physiological solution containing the compound according to the invention C8 at a concentration 15 nmol / ewe, on the one hand, intravenously (iv), and on the other hand, intramuscularly (im).
  • the peptide syntheses are carried out on solid phase in Fmoc / iBu strategy, at a scale of 0.1 mmol.
  • the solid support used is a ChemMatrix® resin functionalized by a Rink amide arm.
  • Deprotection of the Fmoc group is carried out using a 20% solution of piperidine in NMP.
  • the protective groups of the side chains used are Arg (Pbf), Arg (Me, Pbf), Asn (Trt), Ser (iBu), Trp (Boc), Tyr (iBu), Hyp (iBu), Thr (Bu).
  • 1,4-disubstituted, 1,2-triazole, 1,2-triazole ( ⁇ // [4- (1,2,3-triazol-1-yl)], abbreviated ⁇ [ ⁇ ]) pseudopeptide linkages are formed by copper (I) catalysed cycloaddition between an alkyne and an azide (CuAAC), in solution (route A) or on a solid support (route B), according to the general reaction schemes below:
  • the formation of the first triazole is carried out on a solid support by cycloaddition with a / V-Fmoc-amino alkyne.
  • the Fmoc group is then deprotected under standard conditions, then the amine is converted to azide with the aid of a diazo transfer reagent
  • the formation of the second triazole is then carried out by cycloaddition with a ⁇ -Fmoc ⁇ -amino alkyne, according to the general reaction scheme below ( track C): way (C)
  • the crude triazolopeptide is finally released from the resin with a solution of TFA / H 2 0 // Pr 3 SiH / phenol, 87.5 / 5 / 2.5 / 5 for 2 h.
  • the peptide is precipitated in cold Et 2 0, centrifuged and then washed 3 times with Et 2 0.
  • the pure triazolopeptide is analyzed by HPLC (using either a Nucleosil C1 8 300 ⁇ , 5 ⁇ , 4.6 ⁇ 250 mm, 1 mL / min column, or a Chromolith HighResolution RP-1.8 column, 4.6 ⁇ 100 mm. , 3mL / min) and MALDI-TOF mass spectrometry (matrix: cc-cyano-4-hydroxy cinnamic acid, instrument: Ultraflex, Bruker Daltonics, Germany).
  • HPLC using either a Nucleosil C1 8 300 ⁇ , 5 ⁇ , 4.6 ⁇ 250 mm, 1 mL / min column, or a Chromolith HighResolution RP-1.8 column, 4.6 ⁇ 100 mm. , 3mL / min
  • MALDI-TOF mass spectrometry matrix: cc-cyano-4-hydroxy cinnamic acid, instrument: Ultraflex, Bruker Daltonics, Germany.
  • the aqueous phase is acidified with an aqueous solution of 6M HCl to pH 2, then extracted with AcOEt (4 x 50 ml).
  • the organic phases are combined, dried over MgSO 4 and then concentrated on a rotary evaporator.
  • the product (5) is obtained as a pale green solid (3.01 g, 6.9 mmol, 98%), and is used as an automated SPPS building block without additional purification step.
  • 1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ) ⁇ 7.79 - 7.72 (m, 3H), 7.59 - 7.50 (m,
  • the alkyne compound (0.4 mmol, 4 eq.) And CuBr (Me 2 S) (82 mg, 0.4 mmol, 4 eq.) are dissolved in 10 ml of NMP under an atmosphere of argon. After addition of iPr 2 Net (70 ⁇ l, 0.4 mmol, 4 eq.), The solution is aspirated into a syringe provided with a sintered polypropylene, and containing the resin bearing the azide peptide (0.1 mmol). The reaction medium is stirred for 2 hours at room temperature.
  • the resin is then washed successively with NMP (3 x 2 min), CH 2 Cl 2 (2 x 2 min), 1 M pyridinium chloride in CH 2 Cl 2 / MeOH 95: 5 (2 x 2 min). ), CH 2 Cl 2 (2 x 2 min) then DMF (2 x 2 min).
  • NMP 3 x 2 min
  • DMF 2 x 2 min
  • the continuation of the elongation is carried out by standard SPPS.
  • the resin bearing the modified peptide provided with an unprotected N-terminal amino function (50 ⁇ ) is coupled after the automated SPPS elongation with Fmoc-Glu-OiBu (10 equivalents).
  • protected amino acid 9.5 equivalents of HCTU and 20 equivalents of di-isopropylethylamine in NMP.
  • Deprotection of the group Fmoc is performed using a solution of 20% piperidine in NMP.
  • the hexadecanoic acid is then coupled (10 equivalents of acid, 9.5 equivalents of HCTU and 20 equivalents of di-isopropylethylamine in a NMP / CH 2 CI 2 1: 4 mixture).
  • the crude Y- (/ V-hexadecanoyl-L-glutamyl) -triazolopeptide is finally released from the resin with 5 ml of a solution of TFA / H 2 0 // Pr 3 Si H / phenol, 87.5 / 5/2, 5/5 for 2 hours.
  • the resin is rinsed with TFA (2x5mL for 5 min), and the filtrates are concentrated at room temperature using a rotary evaporator to a volume of about 1 mL.
  • the peptide is precipitated by dilution with 40 mL Et 2 0 precooled to -80 ° C, then centrifuged and washed 2 times with Et 2 0. It is then purified and analyzed according to standard protocols.
  • a derivative of Fmoc-L-lysine provided with a Dde group on its side chain, Fmoc-Lys (Dde) -OH is introduced at position 2 or 3 during the SPPS.
  • the resin bearing the modified peptide provided with an amine N-Dde function (50 ⁇ ) is treated with 10 ml of a 2% hydrazine solution in NMP (2 ⁇ 5 min) to remove the Dde group, then the resin carrying the modified peptide provided with an unprotected amine function (50 ⁇ ) is treated according to a protocol identical to that used for the introduction of the modification in position 1.
  • the peptide compound Comp.1, of sequence SEQ ID NO: 1: H-Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-Gly-Leu-Arg-Tyr-NH 2 , of chemical formula: is prepared by standard SPPS.
  • the peptide compound C1 of sequence SEQ ID NO: 5: H-Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-Gly ⁇ [Tz] Leu-Arg-Tyr-NH2, of chemical formula:
  • Peptide compound C2 of sequence SEQ ID NO: 6: Ac-Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-G ⁇ [Tz] Leu-Arg-Tyr-NH 2 , of Chemical Formula:
  • Peptide compound C3 of sequence SEQ ID NO: 7: Ac-Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-Gly ⁇ [Tz] Leu-Arg (Me) -Tyr-NH2, of chemical formula:
  • Peptide compound C4 of sequence SEQ ID NO: 8:
  • the first triazole (Glyi /> [Tz] Leu) is formed according to route B, introducing the azide function by automated coupling of -azido acid (1).
  • the formation of triazole by CuAAC on a solid support is carried out with the alkyne (2), following the general procedure.
  • the second triazole (Phei> [Tz] Gly) is formed according to route C.
  • the resin is stirred for 1 hour with the transfer reagent of diazo 1 H-imidazole-1-sulfonyl azide.H 2 SO 4 (135 mg, 0.5 mmol, 5 eq), and K 2 CO 3 (140 mg, 1 mmol, 10 eq) dissolved in DMF / H 2 O (3/7, 3 mL).
  • the transfer reagent of diazo 1 H-imidazole-1-sulfonyl azide.H 2 SO 4 (135 mg, 0.5 mmol, 5 eq)
  • K 2 CO 3 140 mg, 1 mmol, 10 eq
  • the resulting supported azidopeptide is engaged in a solid supported CuAAC reaction with the alkyne (4), following the general procedure. The rest of the synthesis is done by classical SPPS.
  • the peptide compound C8 of sequence SEQ ID NO: 1 1:
  • the peptide compound C9 of sequence SEQ ID NO: 12: ⁇ - ( ⁇ / - ⁇ 3 ⁇ 3 ⁇ - ⁇ - ⁇ ) - ⁇ - ⁇ 5 ⁇ - ⁇ - ⁇ 5 ⁇ -8 ⁇ - ⁇ - ⁇ [ ⁇ ⁇ ] ⁇ - ⁇ 9- ⁇ - ⁇ 2 , wherein y - (/ V-hexadecanoyl-Glu-OH) represents a unit of formula (II) above is prepared according to route B, introducing the azide function by automated coupling of ⁇ -azido acid (1) .
  • the formation of triazole by CuAAC on a solid support is carried out with the alkyne (2), following the general procedure.
  • the continuation of the elongation synthesis is continued by standard SPPS, then the modification y - (/ V-hexadecanoyl-Glu-OH) is introduced following the general procedure for position 1.
  • the peptide compound C10 of sequence SEQ ID NO: 13: ⁇ - ( ⁇ / - ⁇ 3 ⁇ 3 ⁇ - ⁇ - ⁇ ) ⁇ - ⁇ 5 ⁇ - ⁇ - ⁇ 5 ⁇ -8 ⁇ - ⁇ ⁇ ⁇ - ⁇ [ ⁇ ⁇ ] ⁇ - ⁇ 9- ⁇ - ⁇ 2 , wherein y - (/ V-hexadecanoyl-Glu-OH) represents a unit of formula (II) above is prepared according to route B, introducing the azide function by automated coupling of -azido acid (1) .
  • the formation of triazole by CuAAC on a solid support is carried out with the alkyne (2), following the general procedure. Further synthesis is continued by conventional SPPS, and then the modification y - (/ V-hexadecanoyl-Glu-OH) is introduced following the general procedure for position 1.
  • the peptide compound C13 with the sequence SEQ ID NO: 16: ⁇ - ( ⁇ / - ⁇ 3 ⁇ 3 ⁇ - ⁇ - ⁇ ) ⁇ - ⁇ 5 ⁇ - ⁇ - ⁇ 5 ⁇ -8 ⁇ - ⁇ ⁇ ⁇ - ⁇ [ ⁇ ] ⁇ - ⁇ 9- ⁇ ⁇ ⁇ - ⁇ 2 , wherein y - (/ V-hexadecanoyl-Glu-OH) represents a unit of formula (II) above is prepared according to the B route, introducing the azide function by automated coupling of ⁇ -azido acid ( 1). The formation of triazole by CuAAC on a solid support is carried out with the alkyne (2), following the general procedure.
  • TTDS is a 1,13-diamino-4,7,10-trioxatridecanesuccinic acid spacer arm and TTDS- ( ⁇ - (/ V-hexadecanoyl-Glu-OH)) represents a unit of formula (III):
  • the resin bearing the modified peptide provided with an amino function N-Dde (50 ⁇ ) is treated with 10 mL of a 2% hydrazine solution in NMP (2 x 5 min) for remove the Dde group, then the resin bearing the modified peptide provided with an unprotected amino function (50 ⁇ ) is coupled with [1 - / V- (9-fluorenylmethoxycarbonyl) -1, 13-diamino-4 acid , 7,10-trioxatridecanesuccinamic acid (Fmoc-TTDS-OH, 3 equivalents, 3 equivalents of HATU (2- (7-aza-1 / - / - benzotriazol-1-yl) hexafluorophosphate -1, 1, 3 3-tetramethylaminium) and 6 equivalents of di-isopropylethylamine in NMP).
  • the Fmoc group is removed by treatment with a solution of 20% piperidine in NMP.
  • Fmoc-Glu-OiBu is then coupled (10 equivalents of protected amino acid, 9.5 equivalents of HCTU and 20 equivalents of di-isopropylethylamine in NMP).
  • Deprotection of the Fmoc group is carried out using a 20% solution of piperidine in NMP.
  • the hecadecanoic acid is then coupled (10 equivalents of acid, 9.5 equivalents of HCTU and 20 equivalents of di-isopropylethylamine in a NMP / CH 2 CI 2 1: 4 mixture).
  • the crude TTDS- [Y- (/ V-hexadecanoyl-L-glutamyl)] triazolopeptide is finally released from the resin with 5 mL of a solution of TFA / H 2 0 // Pr 3 SiH / phenol, 87.5 / 5 / 2.5 / 5 for 2 hours.
  • the resin is rinsed with TFA (2 x 5 mL for 5 min), and the filtrates are concentrated at room temperature using a rotary evaporator to a volume of about 1 mL.
  • the peptide is precipitated by dilution with 40 mL Et 2 0 previously cooled to - 80 ° C, then centrifuged and washed 2 times with Et 2 0. It is then purified and analyzed according to standard protocols.
  • Peptide compound C15 of sequence SEQ ID NO: 18:
  • the resin bearing the modified peptide provided with an amino function N-Dde (50 ⁇ ) is treated with 10 ml of a 2% hydrazine solution in NMP (2 x 5 min) to remove the Dde group, then the resin bearing the modified peptide provided with an unprotected amino function (50 ⁇ ) is treated with succinic anhydride (10 equivalents of anhydride and 20 equivalents of diisopropylethylamine in NMP).
  • HD-Lys (Boc) -OiBu is then coupled (10 equivalents of protected amino acid, 10 equivalents of PyAOP (7-Azabenzotriazol-1-yloxy) hexafluorophosphate tripyrrolidinophosphonium) and 20 equivalents of di-isopropylethylamine in NMP).
  • the crude triazolopeptide is finally released from the resin with 5 mL of a solution of TFA / H 2 0 // Pr 3 SiH / phenol, 87.5 / 5 / 2.5 / 5 for 2 h.
  • the resin is rinsed with TFA (2x5 mL for 5 minutes), and the filtrates are concentrated at room temperature using a rotary evaporator to a volume of about 1 mL.
  • the peptide is precipitated by dilution with 40 mL Et 2 0 previously cooled to 0 ° C, then centrifuged and washed 2 times with Et 2 0.
  • the peptide is finally coupled in solution with 4 - (- p-iodophenyl) butanoic acid (3 equivalents) activated in the form of its N-hydroxysuccinimide ester as described in the publication by Trussel et al., 2009.
  • the compound C15 thus obtained is then purified and analyzed according to the standard protocols.
  • the peptide compound C16 of sequence SEQ ID NO: 19: ⁇ - ⁇ - ⁇ 5 ( ⁇ 5000) - ⁇ - ⁇ 5 ⁇ -5 ⁇ - ⁇ - ⁇ [ ⁇ ⁇ ] ⁇ ⁇ - ⁇ - ⁇ 2 , in which PEG5000 represents a motif of formula: COCH 2 CH 2 NH (CH 2 CH 2 0) nMe with -85 ⁇ n ⁇ -130, with an average molecular weight of about 5000 g / mol, is prepared according to route B, by introducing the azide function by automated coupling of ⁇ -azido acid (1).
  • the formation of triazole by CuAAC on a solid support is carried out with the alkyne (2), following the general procedure.
  • the peptide (2 equivalents) is finally coupled in solution with a commercial polymer (IRIS Biotech Gmbh) with an average mass of about 5000 g / mol activated in the form of its ester of / V-hydroxysuccinimide (5 mM peptide in a 50mM HEPES buffer mixture pH 8.5 and MeCN 9: 1).
  • a commercial polymer IRIS Biotech Gmbh
  • the compound C16 thus obtained is then purified and analyzed according to the standard protocols.
  • each peptide compound to be analyzed and the internal calibrator (L-phenylalaninol) are dissolved in milliQ water (0.5 mM and 6.6 mM, respectively).
  • the commercial protease inhibitor cocktail (Sigma, P8340) is supplied in solution in DMSO.
  • Serum and stock solutions of peptide compounds are preheated to 39 ° C for 30 minutes.
  • Each solution of peptide compound (50 ⁇ , ie a final concentration in the serum of 50 ⁇ ) and the internal calibrant solution (25 ⁇ ) are mixed with 425 ⁇ . of serum and incubated at 39 ° C.
  • the monitoring of the kinetics of proteolytic degradation of the compounds is carried out by taking, at various given times, 75 ⁇ . of the solution, which are diluted with 150 ⁇ . of acetonitrile to precipitate the serum proteins.
  • the suspension obtained is centrifuged at 14,000 rpm for 10 min at 4 ° C. 100 ⁇ . supernatant are diluted in 900 ⁇ .
  • the value corresponding to 100% of intact peptide compound is obtained by mixing 420 ⁇ . of serum, 5 ⁇ . inhibitor cocktail and 25 ⁇ l of the phenylalaninol solution, followed by 50 ⁇ l. of peptide compound, then immediately treating the resulting solution according to the protocol described above. For all the compounds tested, the results obtained after 3 hours of incubation in the serum are shown in Table 1 below.
  • the cell line HEK293A (ATCC, American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA) was stably transfected with the receptor human KISS1 R (Genbank accession number: NM_032551)
  • pcDNA3.1 vector Invitrogen, Cergy Pontoise, France
  • the KISS1R receptor is coupled to Gq proteins and its activation produces an increase in intracellular calcium concentration.
  • HEK293A cells expressing the human KISS1 R receptor were seeded in a 96-well plate (clear plate black) at a concentration of 40,000 cells / well, and placed in an incubator at 37 ° C. After 48 hours, the medium was changed and the cells were incubated with Fluo-4NW fluorescent dye, as specified by the manufacturer (Molecular Probe). To avoid peptide-plastic adhesion, the compounds to be tested were prediluted in a so-called "non-binding" plate (Corning) at a concentration 20 times greater (20X) at the desired final concentration.
  • Serum albumin, or PEG enhances the stimulatory potency of the human KISS1 R peptide compounds, with the exception of the compound C1 1, which remains active however, although less, and the compound C16, which shows a power similar to the Comp.1 comparative compound.
  • the peptide compound to be tested was injected into the catheter at the desired dose (5 nmol / ewe), diluted in 1 ml of physiological saline solution. Heparin-containing saline (3 ml) was injected immediately after the peptide compound to rinse the catheter and bring all of the compound into the bloodstream of the animal.
  • a negative control (T) consisting of physiological solution alone has also been realized.
  • blood samples were taken at variable intervals between 10 min and 1 h, for a period of between 3 h and 30 h.
  • the tests were carried out on Ile de France ewes during the anestrus period, as indicated above with reference to the 1 st Experimentation (no treatment with progesterone).
  • a catheter was placed in the jugular vein of the animal.
  • the peptide compound to be tested was injected into the catheter at the desired dose (5 nmol / ewe), diluted in 1 ml of physiological saline solution.
  • FIGS. 6a to 6d The results obtained, in terms of LH concentration in each blood sample as a function of time, are shown in FIGS. 6a to 6d, respectively for compounds Comp.1, Comp.3, C1 and C2.
  • the arrow, showing the time "0" indicates the moment of the injection.
  • the duration of action of the compound concerned is symbolized by asterisks, the number of which is proportional to the duration of action of the compound.
  • C2 and C8 which differ in the presence, in C8, of a motif capable of binding serum albumin at the 2-position of the peptide compound.
  • the tests were performed on ewes Ile de France during the period of anoestrus, as indicated above in reference to the 1 st Experiment (without progesterone treatment).
  • a catheter was placed in the jugular vein of the animal.
  • the peptide compound to be tested was injected into the catheter at the desired dose, diluted in 1 ml of saline.
  • the following three doses were tested: 1 nmol / ew, 5 nmol / ew and 15 nmol / ew.
  • FIGS. 8a and 8b The results obtained, in terms of LH concentration in each blood sample as a function of time, for each injected dose, are shown in FIGS. 8a and 8b, respectively for compounds C2 and C8.
  • the arrow, showing the time "0" indicates the moment of the injection.
  • the compound according to the invention C8 differing from the compound C2 by the introduction of a pattern capable of binding serum albumin, has an action that is even more prolonged over time, and very significantly, that the compound C2, which has been shown above that it is itself much better than the Comp.1 and Comp.3 comparative compounds.
  • the area on the curve (AUC) was calculated.
  • the set of values obtained are shown in FIGS. 9a and 9b, respectively for the compounds C2 and C8. It is observed that the compound according to the invention C8 is even more active than the compound C2 as regards the secretion of LH.
  • the compound according to the invention C8 was injected, on the one hand intravenously, and on the other hand intramuscularly, to sheep of Ile de France breed in oestrus period.
  • the ewes were previously treated with a vaginal sponge containing 20 mg of fluorogestone acetate (Chronogest CR sponge, Intervet) to block the secretion of LH and simulate a luteal phase.
  • test compound Before and after the injection of the test compound, blood samples were taken at variable intervals between 10 minutes and 1 hour, for a period of 10 hours.

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Abstract

L'invention concerne un composé peptidique agoniste du KISS1R apte à induire l'ovulation chez un mammifère femelle, choisi parmi un pseudo-peptide de séquence C-terminale : -XaaΨ[Tz]Xaa2-Xaa3-Xaa4-NH2 (SEQ ID NO:3), où Ψ[Τz] représente un groupe 1,2,3-triazole-1,4-disubstitué remplaçant la liaison peptidique entre le résidu Xaa1 et le résidu Xaa2, Xaa1 représente Gly ou Ala, Xaa2 représente Leu ou un résidu α-amino acyle aliphatique analogue, Xaa3 représente Arg, Arg(Me), ou un résidu α-amino acyle chargé positivement analogue, Xaa4 représente Tyr, Phe, Trp ou un résidu α-amino acyle de type aryl alanine analogue; un analogue du pseudo-peptide de séquence SEQ ID NO:3 dans lequel la liaison amide peptidique entre Xaa2 et Xaa3 et/ou entre Xaa3 et Xaa4 est remplacée par une liaison isostère; ou un de leurs sels.

Description

COMPOSES AGONISTES DU RECEPTEUR KISS1 ET LEUR UTILISATION POUR INDUIRE
L'OVULATION CHEZ LES MAMMIFERES
La présente invention s'inscrit dans le domaine de l'induction et de la synchronisation de l'ovulation chez les mammifères. Plus particulièrement, elle concerne un composé peptidique agoniste du récepteur KISS1 R apte à induire / synchroniser une telle ovulation, ainsi que l'utilisation d'un tel composé en tant que médicament, notamment pour induire cette ovulation, et une composition vétérinaire et/ou pharmaceutique le contenant.
Le composé selon l'invention trouve en particulier des applications dans le domaine de l'élevage, notamment en vue de programmer la reproduction tout au long de l'année, par exemple des ovins, caprins, ou bovins. Bien que cette dernière espèce ne soit pas du type à reproduction saisonnée, les vaches laitières présentent néanmoins une baisse de fertilité et un agoniste du récepteur KISS1 R pourrait être utilisé pour rétablir une meilleure fertilité. Par ailleurs, le composé selon l'invention trouve également des applications dans le domaine thérapeutique, en particulier pour réduire les problèmes d'infertilité, et notamment en clinique humaine pour le traitement de pathologies de la reproduction, en particulier dans le cadre de la mise en œuvre des techniques de procréation médicalement assistée. D'autres applications de ce composé sont le traitement d'autres pathologies, telles que l'aménorrhée hypothalamique et les pubertés retardées, et toutes autres pathologies qui nécessitent une augmentation de la sécrétion de la GnRH (pour Gonadotropin Releasing Hormone) et des gonadotrophines.
Dans le domaine de l'élevage, la maîtrise de la reproduction est un enjeu important, en vue d'optimiser la disponibilité des produits, tels que la viande, le lait ou ses dérivés, tout au long de l'année. Par exemple, l'élevage ovin et caprin est soumis à de fortes variations saisonnières de productivité, du fait de la saisonnalité de la reproduction et du déroulement de la lactation. Les méthodes utilisées à l'heure actuelle pour induire l'ovulation à tout moment de la contre-saison et/ou pour synchroniser l'ovulation à l'intérieur des troupeaux s'appuient sur l'utilisation d'hormones stéroïdiennes, telles que la progestérone ou l'œstradiol, de la prostaglandine F2a et de la PMSG (pour Pregnant Mare Sérum Gonadotropin). Ces méthodes ne permettent cependant pas une maîtrise complète de l'ovulation. En outre, les hormones de type œstrogènes mises en œuvre sont des polluants qui ne sont pas facilement dégradés, qui s'accumulent dans la terre et les eaux, et qui présentent une menace pour la santé humaine. Le traitement des animaux par de telles hormones présente également des contraintes importantes pour les éleveurs, qui sont obligés de respecter un cahier des charges très strict. A titre d'exemple, les méthodes utilisées à l'heure actuelle pour induire l'ovulation chez la brebis prévoient l'implantation pendant 12 à 24 jours d'une éponge vaginale contenant de la progestérone, combinée avec un co-traitement par une injection intramusculaire de gonadotrophine sérique PMSG au moment du retrait de l'éponge. Un tel traitement s'avère contraignant à mettre en œuvre.
En clinique humaine, les traitements disponibles à l'heure actuelle pour la procréation médicale assistée présentent quant à eux certains effets secondaires non souhaitables, tels qu'une hyperstimulation ovarienne. Ces traitements utilisent également des hormones pour induire l'ovulation, et agissent donc soit au niveau de l'hypophyse, soit au niveau des gonades. Il en est de même pour les traitements destinés à soigner l'aménorrhée hypothalamique ou les pubertés retardées.
Il subsiste ainsi un besoin pour des traitements alternatifs, mettant en œuvre une molécule non stéroïdienne capable de déclencher / synchroniser l'ovulation tant chez les ruminants, de sorte à pouvoir programmer leur reproduction et leur production laitière tout au long de l'année, améliorer les rendements de l'insémination artificielle, optimiser la rentabilité des troupeaux, et réduire les problèmes d'infertilité dans les troupeaux, que chez les humains, pour induire la libération des gonadotrophines de façon plus naturelle que les traitements hormonaux actuels, en réduisant ainsi les risques de syndrome d'hyperstimulation ovarienne. La présente invention vise à remédier aux inconvénients des traitements proposés par l'art antérieur pour induire / synchroniser l'ovulation chez les mammifères femelles, notamment à ceux exposés ci-avant, en proposant un composé non stéroïdien qui permette de réaliser une telle induction / synchronisation de l'ovulation de manière efficace, qui présente une faible rémanence dans l'environnement, et des contraintes d'utilisation réduites.
A cet effet, les présents inventeurs se sont intéressés au système de neurotransmission formé par un récepteur, le KISS1 R, également nommé KISS1 receptor, ou GPR54 (N ° d'accession GenBank, pour le récepteur humain : NM_032551 .4, Gl :189163516), et ses ligands endogènes, nommés kisspeptides (ou kisspeptines), issus du clivage d'un peptide précurseur, le KISS1 (N ° d'accession GenBank, pour le peptide humain : NM_002256.3, Gl :1 16829963 ; NP_002247.3, Gl :1 16829964 ; pour le peptide murin : AB666166.1 , Gl :384367966 ; BAM1 1250.1 , Gl :384367967 ; pour le peptide ovin : AFW03832.1 , Gl :41 1 100741 ), qui sont des neurotransmetteurs présentant la capacité de stimuler le KISS1 R (Kotani et al., 201 1 ).
Dans la présente description, l'abréviation KISS1 R sera utilisée pour désigner tant le récepteur humain que le récepteur des autres espèces (indiqué par l'abréviation Kissl r dans la nomenclature officielle). Une liste complète des synonymes utilisés pour désigner le KISS1 R est notamment disponible sur le site internet de l'IUPHAR.
Plus particulièrement, le kisspeptide (kisspeptine) essentiellement responsable de l'activité biologique de stimulation du KISS1 R est le décapeptide nommé kisspeptine-10, ou KP10. On connaît notamment les séquences de la kisspeptine-10 dérivée de la souris (mKP10, de séquence SEQ ID NO:1 , dans laquelle l'extrémité C-terminale est modifiée par amidation) et de la kisspeptine-10 dérivée de l'humain (hKP10, de séquence SEQ ID NO:2, dans laquelle l'extrémité C-terminale est modifiée par amidation). La kisspeptine-10 dérivée de la brebis est notamment identique à la mKP10. L'activation du KISS1 R par ces ligands, et plus particulièrement par la
KP10, induit un effet stimulateur très puissant sur la libération des hormones LH et FSH chez les mammifères, cet effet résultant d'une augmentation de la sécrétion de la GnRH (pour Gonadotropin Releasing Hormone) (Caraty et Franceschini, 2008). Il a été montré notamment que la KP10, administrée aux brebis par voie intraveineuse en fin de phase folliculaire, est capable d'induire un pic de LH qui est suivi, 21 heures plus tard, par des ovulations synchronisées à l'heure près (Caraty et al., 2007). Il a également été démontré que pendant la période de repos sexuel (anoestrus saisonnier), une infusion prolongée de KP10 est capable de réactiver l'axe gonadotrope et d'induire l'ovulation (Sébert et al., 2010). Ces résultats ont ainsi démontré la faisabilité d'une maîtrise de l'ovulation des animaux d'élevage grâce à la stimulation du système KISS1 R/KP10. Le KISS1 R humain et celui de la brebis présentent en outre un très haut degré d'homologie, avec plus de 60 % d'identité, et les kisspeptides (kisspeptines) montrent une activité in vivo similaire chez les primates et les brebis (Seminara et al., 2006, Caraty et al., 2007), ce qui permet d'envisager une application en thérapie humaine.
Par rapport aux hormones stéroïdiennes, la KP10 présente notamment les avantages d'être très rapidement éliminée de l'organisme et facilement détruite dans le milieu naturel, pour ne laisser que des acides aminés comme résidus. Par ailleurs, elle présente un mécanisme d'action, résultant en un déclenchement de la sécrétion de l'hormone LH, hormone nécessaire à l'induction de l'ovulation, complètement différent de celui des traitements actuels, et permettant une action plus localisée et fine en évitant les effets secondaires indésirables.
Cependant, la KP10 étant rapidement dégradée et excrétée par l'organisme, elle présente une durée d'action limitée. Les présents inventeurs ont donc visé à développer des composés dérivés de la KP10 qui présentent une durée d'action prolongée et maîtrisée dans l'organisme, tout en conservant des propriétés de dégradabilité dans l'environnement similaires à celles de la KP10. L'invention vise également à ce que ces composés soient capables d'induire efficacement l'ovulation chez un mammifère femelle, y compris en contre-saison, par un faible nombre d'administrations, notamment par une injection unique. Un objectif supplémentaire de l'invention est que ces composés présentent un faible coût de préparation.
Il a maintenant été découvert par les présents inventeurs que de tels résultats avantageux sont atteints par des composés peptidiques particuliers dans lesquels, notamment, une liaison peptidique entre un résidu glycine et le résidu adjacent, situés dans une région proche de l'extrémité C-terminale du composé, est remplacée par un noyau 1 ,2,3-triazole disubstitué. Dans la présente description, les positions des acides aminés dans les peptides sont définies de manière classique en elle-même, la numérotation débutant au niveau de l'extrémité N-terminale du peptide, figurant à gauche dans toutes les séquences, alors que l'extrémité C-terminale figure quant à elle à droite.
Ainsi, il est proposé par la présente invention un composé peptidique agoniste du KISS1 R, choisi parmi :
- un pseudo-peptide, apte à lier le KISS1 R, présentant la séquence C- terminale :
-Xaa [Tz]Xaa2-Xaa3-Xaa4-NH2 (SEQ ID NO:3)
Ψ[Τζ] représente un groupe 1 ,2,3-triazole-1 ,4-disubstitué de formule (I) :
Figure imgf000006_0001
remplaçant la liaison peptidique entre le résidu Xaa1 et le résidu Xaa2, l'extrémité C-terminale, au niveau du résidu Xaa4, est modifiée par amidation,
Xaa1 représente Gly ou Ala,
Xaa2 représente Leu ou un résidu cc-amino acyle aliphatique analogue, tel que Ile, Val, Ala(cPr), Nie ou Nval, Xaa3 représente Arg, dont la fonction -NH2 est le cas échéant substituée par un groupe méthyle, ou un résidu cc-amino acyle chargé positivement analogue, tel que Arg(asymMe2), Lys, le cas échéant substituée, ou Orn, le cas échéant substitué, Xaa4 représente Tyr, Phe, Trp ou un résidu cc-amino acyle de type aryl alanine analogue, tel que la 1 -, 2- ou 3- naphtylalanine, la 2- ou 3-thiénylalanine, la 2- ou 3-furylalanine, la 2-, 3- ou 4-fluorophénylalanine, la 2-, 3- ou 4- chlorophénylalanine, la 2-, 3- ou 4-bromorophénylalanine, la 2-, 3- ou 4-cyanophénylalanine, la 2-, 3- ou 4-iodophénylalanine, la 2-, 3- ou 4-méthylphénylalanine ou la 2-, 3- ou 4- trifluorométhylphénylalanine,
- un analogue du pseudo-peptide de séquence SEQ ID NO:3 dans lequel la liaison amide peptidique entre Xaa2 et Xaa3 et/ou entre Xaa3 et Xaa4 est remplacée par une liaison isostère,
- ou un de leurs sels.
Le noyau 1 ,2,3-triazole disubstitué constitue avantageusement un isostère peu onéreux et facilement accessible, si bien que le procédé de synthèse d'un tel composé est avantageusement peu coûteux à mettre en œuvre. Cette synthèse peut en outre être réalisée facilement, par les techniques classiques de synthèse peptidique, par exemple sur phase solide en stratégie Fmoc/tBu.
Le composé peptidique conforme à l'invention présente avantageusement, par rapport au KP10, une durée de vie prolongée dans l'organisme, plus particulièrement dans le sérum sanguin, tout en conservant une efficacité de stimulation du KISS1 R aussi importante, voire meilleure, ainsi qu'une rémanence environnementale minime. Il permet notamment d'augmenter de manière significative le niveau sanguin de l'hormone LH chez les mammifères, y compris en période d'anoestrus, par un nombre limité d'administrations, qui plus est par une voie d'administration qui est notamment compatible avec une utilisation en élevage, en particulier au moyen d'une seule injection, par exemple intramusculaire ou sous-cutanée.
Dans la présente description, on désignera par l'expression région C- terminale, la région du composé peptidique de séquence SEQ ID NO:3, et par l'expression région N-terminale, la région restante du composé.
Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, Xaa1 représente Gly, Xaa2 représente Leu et Xaa3 représente Arg, dont la fonction -NH2 est le cas échéant substituée par un groupe méthyle.
Le composé peptidique selon l'invention peut présenter une taille de 5 à 54 acides aminés, de préférence de 5 à 16 acides aminés, de préférence encore de 7 à 12 acides aminés, et préférentiellement 9, 10 ou 1 1 acides aminés.
Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, particulièrement avantageux en termes de longueur de demi-vie dans le sérum sanguin, le composé peptidique répond à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-après :
- au moins la fonction aminé N-terminale est modifiée par substitution par un groupe choisi parmi les alcanoyles linéaires, en particulier en C1 -C6, de préférence en C2, un groupement benzoyle et un groupement tétraméthylguanidinium,
- au moins la fonction aminé N-terminale est remplacée par une fonction azoture, ou par un groupe 1 ,2,3-triazole 1 ,4-disubstitué de formule (I) ;
- au moins un acide aminé, plus particulièrement de la région N- terminale, est lié à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol, de préférence polyéthylène glycol, et/ou à une ou plusieurs chaînes lipidiques, telles qu'un groupe palmitoyle, et/ou groupements se liant à l'albumine sérique. De telles modifications permettent avantageusement d'augmenter la demi-vie du composé peptidique dans l'organisme. Dans des modes de réalisation particuliers, au moins un acide aminé est lié à une chaîne polyéthylène glycol, linéaire ou ramifiée, de poids moléculaire compris entre 5 et 40 kDa ; - au moins la fonction amine N-terminale est substituée par un groupe alkyle, notamment choisi parmi les alkyles linéaires, de préférence en C1 -C6, en particulier par un groupe méthyle, ou par un groupe benzyle.
Le composé peptidique selon l'invention peut être cyclisé, par toute liaison croisée classique en elle-même entre les chaînes latérales de deux acides aminés de sa région N-terminale et/ou sa fonction amine N-terminale, notamment par formation d'un amide, d'un triazole, d'un alcène, d'un pont disulfure, d'un bis-thioéther, etc.
Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, le composé peptidique est choisi parmi :
- un pseudo-peptide de séquence :
H-Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-Xaa [Tz]Xaa2-Xaa3-Xaa4-NH2 (SEQ ID NO:4) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 où Ψ[Τζ], Xaa1 , Xaa2, Xaa3 et Xaa4 sont tels que définis précédemment, et l'extrémité C-terminale, au niveau du résidu Xaa4, est modifiée par amidation,
- un analogue dudit pseudo-peptide de séquence SEQ ID NO:4 apte à lier le KISS1 R, - ou un de leurs sels.
Par analogue du pseudo-peptide de séquence SEQ ID NO:4 apte à lier le KISS1 R, on entend tout pseudo-peptide présentant la séquence C- terminale SEQ ID NO:3, et dont la séquence se distingue de la séquence SEQ ID NO:4 par une ou plusieurs modifications au niveau de la région N- terminale, notamment par une addition, substitution, par un acide aminé naturel ou non-naturel, y compris des énantiomères D, et/ou délétion, d'un ou plusieurs acides aminés, et/ou par une modification de l'extrémité N-terminale et/ou de tout groupement fonctionnel porté par la chaîne latérale d'un acide aminé, et/ou par le remplacement d'une liaison peptidique par une liaison isostère, tout en conservant l'aptitude à lier le KISS1 R.
L'aptitude des composés peptidiques à lier le KISS1 R peut être contrôlée de différentes manières. Elle peut notamment être contrôlée par un test in vivo, par mesure de la concentration en LH dans des échantillons de sang de brebis auxquelles a préalablement été injectée la molécule à tester, par exemple selon le protocole décrit ci-après dans la présente description. Une augmentation de cette concentration, par rapport à un témoin non traité, témoigne d'une aptitude de l'analogue à lier le KISS1 R.
Par ailleurs, cette aptitude peut être contrôlée par test in vitro, par mesure de la quantité de calcium intracellulaire dans une lignée cellulaire exprimant le KISS1 R après incubation avec la molécule à tester. En effet, la stimulation du KISS1 R conduit à l'activation de deux voies intracellulaires distinctes, qui induisent l'augmentation de la concentration intracellulaire d'ions calcium : par libération des réserves intracellulaires, suite à la production d'IP3, et par entrée, suite à l'ouverture des canaux ioniques (par exemple TRPC) de la membrane plasmatique de la cellule, d'ions calcium présents dans le milieu extracellulaire. Un exemple d'un tel test, dit de mobilisation du calcium, est décrit de manière détaillée ci-après dans la présente description. Une augmentation de la quantité de calcium intracellulaire, par rapport à un témoin non traité, témoigne alors de l'aptitude de l'analogue à lier le KISS1 R.
Des analogues particuliers du pseudo-peptide de séquence SEQ ID NO:4, présentant notamment une demi-vie dans le sérum sanguin supérieure à celle de la KP10, répondent à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-après : - au moins un acide aminé parmi Tyr1 , Asn2 et Trp3 est substitué par une lysine, dont la fonction aminé est de préférence substituée par un ou plusieurs groupes choisis parmi un groupe alcanoyle, en particulier un groupe acétyle, une chaîne polyalkylèneglycol, de préférence polyéthylène glycol, et une chaîne lipidique, telle qu'un groupe palmitoyle ou un autre groupement permettant une interaction avec l'albumine sérique ; - au moins l'acide aminé Tyr1 est remplacé par son énantiomère D.
Des composés peptidiques particuliers selon l'invention sont des analogues du pseudo-peptide de séquence SED ID NO:4, différant de ce dernier mais conservant un résidu sérine (Ser) deux positions en amont de Xaa1 , soit, dans la plupart des cas, en position 5.
D'autres composés peptidiques selon l'invention présentent un résidu thréonine (Thr) à cette position.
Des composés peptidiques particuliers conformes à la présente invention répondent aux séquences : H-Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-G^[Tz]Leu-Arg-Tyr-NH2 (SEQ ID NO:5)
dans laquelle l'extrémité C-terminale est modifiée par amidation et la liaison peptidique entre la glycine en position 7 et la leucine en position 8 est substituée par un groupe 1 ,2,3-triazole 1 ,4-disubstitué,
Ac-Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-G^[Tz]Leu-Arg-Tyr-NH2 (SEQ ID NO:6)
dans laquelle, outre l'amidation à l'extrémité C-terminale et la substitution de la liaison peptidique entre la glycine et la leucine par un groupe 1 ,2,3-triazole 1 ,4-disubstitué, l'extrémité N-terminale est modifiée par acétylation,
Ac-Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-GlyΨ[Tz]Leu-Arg(Me)-Tyr-NH2 (SEQ ID NO:7) dans laquelle, outre l'amidation à l'extrémité C-terminale et la substitution de la liaison peptidique entre la glycine et la leucine par un groupe 1 ,2,3-triazole 1 ,4-disubstitué, l'extrémité N-terminale est modifiée par acétylation et le résidu arginine en position 9 est modifié par méthylation, Ac-Tyr-Asn-Lys(Ac)-Asn-Ser-Phe-GlyΨ[Tz]Leu-Arg(Me)-Tyr-NH2 (SEQ ID NO:8) dans laquelle, outre l'amidation à l'extrémité C-terminale et la substitution de la liaison peptidique entre la glycine et la leucine par un groupe 1 ,2,3- triazole 1 ,4-disubstitué, l'extrémité N-terminale est modifiée par acétylation, le résidu arginine en position 9 est modifié par méthylation et le résidu lysine en position 3 est modifié par acétylation,
Αο-ΤγΓ-Α8η-ΤΓρ-Α8Π-8ΘΓ-ΡΙΐΘΨ|Τζ]ΟΙγΨ[Τζ]ίΘυ-ΑΓ9-ΤγΓ-ΝΗ2 (SEQ ID NO:9) dans laquelle, outre l'amidation à l'extrémité C-terminale et la substitution de la liaison peptidique entre la glycine et la leucine par un groupe 1 ,2,3-triazole 1 ,4-disubstitué, l'extrémité N-terminale est modifiée par acétylation et la liaison peptidique entre la phénylalanine en position 6 et la glycine en position 7 est également substituée par un groupe 1 ,2,3-triazole 1 ,4-disubstitué.
En particulier, comme exposé ci-avant, des composés peptidiques particulièrement avantageux selon la présente invention sont tels qu'au moins un acide aminé est lié à un motif apte à se lier à l'albumine sérique. Il a été observé par les présents inventeurs que, de manière surprenante, une telle caractéristique a pour effet d'augmenter de manière très significative la durée d'action du composé peptidique dans l'organisme. Préférentiellement, le motif apte à se lier à l'albumine sérique est fixé sur un acide aminé situé dans la région N-terminale du composé peptidique.
Un exemple d'un tel motif est un groupe y-(/V-hexadécanoyl-L- glutamyle), également nommé Y-(/V-hexadécanoyl-Glu-OH). Il est notamment connu de l'art antérieur que la mise en œuvre d'un groupe espaceur γ-glutamyle, entre l'acide aminé et un groupement apte à se lier à l'albumine sérique, tel qu'un groupe hexadécanoyle (également nommé palmityle), augmente l'affinité dudit groupement avec l'albumine sérique (Knudsen et al., 2000). Tout autre motif apte à se lier à l'albumine sérique, connu en lui-même de l'homme du métier, peut également être mis en œuvre dans le cadre de l'invention, comme par exemple un acide gras ω-carboxylate (Zarandi et al., 2006), l'Albu-tag (Dumelin et al., 2008) ou un cyclopeptide (Dennis et al., 2002, Angelini et al., 2012). Des exemples de tels motifs, et des bras espaceur associés pour leur liaison à un résidu du composé peptidique selon l'invention, sont notamment le TTDS-(y-(/V-hexadécanoyl-Glu-OH)) ou encore le 2- (succinamido)-6-(4-(4-iodophényl)butanamido)hexanoate. Lorsque le composé peptidique selon l'invention est un analogue du pseudo-peptide de séquence SEQ ID NO:4, de préférence, un motif apte à se lier à l'albumine sérique est introduit au moins en position 1 , en position 2 et/ou en position 3 du composé peptidique, c'est-à-dire au niveau de Tyr1 , Asn2 et/ou Trp3, ou des résidus qui leur sont analogues. Lorsque le motif apte à se lier à l'albumine sérique est fixé en position 1 , le motif est de préférence fixé sur la fonction aminé N-terminale. Lorsque le motif apte à se lier à l'albumine sérique est fixé en position 2 ou 3 du composé peptidique, le résidu concerné, par exemple le résidu Asn2, respectivement le résidu Trp3, est de préférence substitué par un résidu lysine, sur la chaîne latérale duquel est fixé le motif apte à se lier à l'albumine sérique.
Un autre aspect de l'invention est l'utilisation d'un composé peptidique répondant à l'une ou plusieurs de caractéristiques décrites ci-avant en tant que médicament, et plus particulièrement pour induire l'ovulation chez un mammifère femelle. Ce mammifère peut notamment être un animal d'élevage tel qu'un ovin, un caprin, un bovin, un porcin, un équin, etc., un animal de compagnie, tel qu'un chien ou un chat, ou encore, par exemple un animal sauvage, tel qu'on en rencontre dans les zoos et les parcs animaliers, etc. ; autrement, ce mammifère peut être un être humain. Plus généralement, l'invention concerne l'utilisation d'un tel composé peptidique pour stimuler le KISS1 R, en vue d'augmenter la sécrétion de GnRH, et par voie de conséquence pour stimuler la libération des hormones LH et/ou FSH chez un mammifère.
Le composé peptidique selon l'invention peut notamment être utilisé dans le cadre du traitement d'états pathologiques résultant de faibles niveaux circulants de LH et FSH, par exemple d'états pathologiques résultant d'une stimulation hypophysaire insuffisante. Plus généralement, il peut être utilisé pour le traitement de pathologies liées à une réduction de l'activité de l'axe hypothalamo-hypophyse-gonade, telles que l'aménorrhée d'origine hypothalamique ou les retards de puberté.
D'autres applications du composé peptidique selon l'invention sont notamment le traitement de certaines formes de cancer, sensibles aux hormones stéroïdiennes, ou encore le retardement du vieillissement par stimulation de la sécrétion de la GnRH (Zhang et al., 2013).
Le composé peptidique selon l'invention est de préférence administré sous la forme d'injection, celle-ci pouvant par exemple être réalisée par voie intramusculaire, intraveineuse, sous-cutanée, ou intradermique. Par exemple, le traitement peut consister en une unique injection du composé au mammifère à traiter.
L'administration peut également être réalisée par voie orale. La dose du composé peptidique administrée selon l'invention peut être comprise entre 1 μ9 et 1 mg, notamment entre 1 μg et 250 μg, en fonction du mammifère et de la masse moléculaire du composé. Par exemple, pour une brebis, la dose administrée peut être d'environ 10 μg.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne une composition vétérinaire ou pharmaceutique, notamment pour induire l'ovulation chez un mammifère femelle, qui contient un composé peptidique répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Cette composition se présente de préférence sous une forme administrable par voie intramusculaire, sous-cutanée, intraveineuse ou intradermique, ou sous forme administrable par voie orale.
Les caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en œuvre ci-après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l'invention, avec l'appui des figures 1 à 10, dans lesquelles :
- la figure 1 est un graphe montrant, en fonction du temps, la quantité de peptide restant intact après incubation à 39 °C dans du sérum ovin, pour le composé peptidique C2 conforme à l'invention et pour les composés comparatifs Comp.1 et Comp.3, cette quantité étant exprimée en % de l'aire du pic HPLC au temps t=0 ; - les figures 2a à 2i sont des graphes montrant l'intensité de fluorescence, en unités arbitraires, en fonction de la concentration en composé, obtenue dans un test de mobilisation du calcium intracellulaire témoignant de l'activation du KISS1 R par le composé, pour les composés conformes à l'invention suivants : figure 2a, composé C1 ; figure 2b, composé C2 ; figure 2c, composé C3 ; figure 2d, composé C4 ; figure 2e, composé C5 ; figure 2f, composé C6 ; figure 2g, composé C7 ; pour le composé comparatif Comp.2 sur la figure 2h ; pour le composé comparatif Comp.3 sur la figure 2i ; et, sur toutes les figures, le composé comparatif Comp.1 ; - la figure 3 montre la concentration de LH mesurée dans des échantillons sanguins prélevés chez des brebis en période d'anoestrus, à différents temps avant et après l'administration par voie intraveineuse de solutions physiologiques contenant respectivement 5 nmoles /brebis des composés Comp.1 ou Comp.3, et de solution physiologique seule (T), le moment de l'administration étant indiqué par une flèche sur la figure ; ladite concentration de LH étant exprimée en pourcentage par rapport à la concentration maximale de LH mesurée après injection de 5 nmoles/brebis de Comp.1 prise comme référence (% de la stimulation maximale de Comp.1 ) ;
- la figure 4 montre la concentration de LH mesurée dans des échantillons sanguins prélevés chez des brebis en période d'œstrus, à différents temps avant et après l'administration par voie intraveineuse de solution physiologique contenant respectivement 5 nmoles /brebis du composé comparatif Comp.1 , des composés conformes à l'invention C1 , C4 et C6, et de solution physiologique seule (T), le moment de l'administration étant indiqué par une flèche sur la figure ; ladite concentration de LH étant exprimée en pourcentage par rapport à la concentration maximale de LH mesurée après injection de 5 nmoles/brebis de Comp.1 prise comme référence (% de la stimulation maximale de Comp.1 ) ;
- les figures 5a à 5i sont des graphes montrant l'intensité de fluorescence, en unités arbitraires, en fonction de la concentration en composé, obtenue dans un test de mobilisation du calcium intracellulaire témoignant de l'activation du KISS1 R par le composé, pour les composés conformes à l'invention suivants : figure 5a, composé C8 ; figure 5b, composé C9 ; figure 5c, composé C10 ; figure 5d, composé C1 1 ; figure 5e, composé C12 ; figure 5f, composé C13 ; figure 5g, composé C14 ; figure 5h, composé C15 ; figure 5i, composé C16 ; et, sur toutes les figures, pour le composé comparatif Comp.1 ;
- les figures 6a à 6d montrent la concentration de LH mesurée dans des échantillons sanguins prélevés chez des brebis en période d'anoestrus, à différents temps avant et après l'administration par voie intraveineuse de solutions physiologiques contenant respectivement 5 nmoles/brebis des composés : figure 6a, Comp.1 ; figure 6b, Comp.3 ; figure 6c, C1 ; figure 6d, C2 ;
- la figure 7 est un histogramme montrant l'aire sous la courbe (AUC) calculée pour chaque courbe des figures 6a à 6d ;
- les figures 8a et 8b montrent la concentration de LH mesurée dans des échantillons sanguins prélevés chez des brebis en période d'anoestrus, à différents temps avant et après l'administration par voie intraveineuse de solutions physiologiques contenant respectivement les composés selon l'invention : figure 8a, C2 ; figure 8b, C8, dans des concentrations de 1 nmol/brebis, 5 nmol/brebis et 15 nmol/brebis ; - les figures 9a et 9b sont des histogrammes montrant l'aire sous la courbe (AUC) calculée pour chacune des courbes respectivement des figures 8a et 8b ;
- et la figure 10 montre la concentration de LH mesurée dans des échantillons sanguins prélevés chez des brebis en période d'œstrus, à différents temps avant et après l'injection d'une solution physiologique contenant le composé selon l'invention C8 à une concentration de 15 nmol/brebis, d'une part, par voie intraveineuse (iv), et d'autre part, par voie intramusculaire (im).
EXEMPLE 1 - Synthèse de composés peptidiques conformes à l'invention
1 .1 / Mode opératoire général
Les synthèses peptidiques sont effectuées sur phase solide en stratégie Fmoc/iBu, à une échelle de 0, 1 mmol. Le support solide utilisé est une résine ChemMatrix® fonctionnalisée par un bras Rink amide.
L'élongation automatisée des peptides est effectuée à l'aide du synthétiseur 433A d'Applied Biosystem. Le programme de synthèse standard Fastmoc® fourni par le constructeur est utilisé avec un simple couplage suivi d'une étape d'acétylation à l'anhydride acétique après chaque couplage. Les couplages sont réalisés en utilisant 1 0 équivalents d'acide aminé protégé, 9,5 équivalents d'HCTU (hexafluorophosphate de 2-(6-chloro-1 /-/-benzotriazole-1 - yl)-1 , 1 ,3,3-tetraméthylaminium) et 20 équivalents de di-isopropyléthylamine dans de la /V-méthyl-2-pyrrolidone (NMP). La déprotection du groupement Fmoc est réalisée à l'aide d'une solution de 20 % de pipéridine dans de la NMP. Les groupements protecteurs des chaînes latérales utilisés sont Arg(Pbf), Arg(Me, Pbf), Asn(Trt), Ser(iBu), Trp(Boc), Tyr(iBu), Hyp(iBu), Thr (Bu).
Les liaisons pseudo-peptidiques de type 1 ,2,3-triazole 1 ,4-disubstitués (<//[4-(1 ,2,3-triazol-1 -yl)], abrégé ψ[Τζ]) sont formées par cycloaddition catalysée par le cuivre (I) entre un alcyne et un azoture (CuAAC), en solution (voie A) ou sur support solide (voie B), selon les schémas réactionnels généraux ci-après :
Figure imgf000018_0001
Dans le cas de l'introduction de plusieurs liaisons ( [Tz] consécutives, la formation du premier triazole est effectuée sur support solide par cycloaddition avec un /V-Fmoc -amino alcyne. Le groupement Fmoc est ensuite déprotégé dans des conditions standard, puis l'amine est transformée en azoture à l'aide d'un réactif de transfert de diazo. La formation du second triazole est ensuite effectuée par cycloaddition avec un /V-Fmoc a-amino alcyne, selon le schéma réactionnel général ci-après (voie C) :
Figure imgf000019_0001
voie (C)
Le triazolopeptide brut est finalement libéré de la résine avec une solution de TFA/H20//Pr3SiH/phénol, 87,5/5/2,5/5 pendant 2 h. Le peptide est précipité dans Et20 froid, centrifugé puis lavé 3 fois avec Et20.
Il est ensuite purifié par RP-HPLC (colonne nucleosil C1 8 300 À, 5μιτι, 1 0*250 mm, 3mL/min, éluant A = H20 + 0, 1 % TFA, éluant B = CH3CN + 0, 1 % TFA).
Le triazolopeptide pur est analysé par HPLC (en utilisant soit une colonne Nucleosil C1 8 300 À, 5μιη, 4,6 x 250 mm, 1 mL/min, soit une colonne Chromolith HighResolution RP-1 8, 4,6 x 1 00 mm, 3mL/min) et spectrométrie de masse MALDI-TOF (matrice : acide cc-cyano-4-hydroxy cinnamique, instrument : Ultraflex, Bruker Daltonics, Germany). Lorsque rien n'est précisé dans la description, les valeurs théoriques et expérimentales données correspondent à l'ion monoisotopique.
1 .21 Intermédiaires de synthèse
- Acide (S)-2-azido-4-méthylpentanoïque (1 ) :
Figure imgf000020_0001
Ce composé est synthétisé en suivant le protocole décrit dans Goddard-Borger et Stick, 2007.
- /V-Fmoc-prop-2-ynylamine (2) :
Figure imgf000020_0002
Ce composé est synthétisé en suivant le protocole décrit dans Pokorski et al., 2007.
- (S)-1 -phénylbut-3-yn-2-amine (3) :
Figure imgf000020_0003
Ce composé est synthétisé en suivant le protocole décrit dans Reginato et al., 1996.
- N-Fmoc-(S)-1 -phenylbut-3-yn-2-amine (4) :
Figure imgf000020_0004
La (S)-1-phenylbut-3-yn-2-amine (3) (1,45 g, 10 mmol, 1 éq.) et NaHC03 (1,3 g, 15 mmol, 1,5 éq.) sont dissous dans un mélange CH3CN/H20 (1:1, 50 ml). Après ajout de Fmoc-OSu (3,71 g, 11 mmol, 1,1 éq.), la solution est agitée pendant 16 h à température ambiante. Le milieu réactionnel est ensuite dilué par 100 ml d'AcOEt. La phase organique est lavée avec une solution aqueuse de NaHC03 1M (2 x 20 ml) puis séchée sur MgS04 et concentrée sous pression réduite. Le résidu obtenu est ensuite purifié par chromatographie flash pour obtenir le composé (4) sous la forme d'un solide blanc (3,2 g, 8,8 mmol, 88 %). 1H RMN (500 MHz, CDCI3) δ = 7.78 (d, J=7.6 Hz, 2H), 7.64 - 7.53 (m,
2H), 7.42 (t, J=7.5, 2H), 7.36 - 7.23 (m, 9H), 5.01 - 4.95 (m, 1H), 4.81 - 4.75 (m, 1 H), 4.52 - 4.43 (m, 1 H), 4.42 - 4.35 (m, 1 H), 4.25 - 4.19 (m, 1 H), 3.07 - 2.94 (m, 2H), 2.32 (d, J=2.4 Hz, 1H).
13C RMN (125 MHz, CDCI3) δ = 155.39, 144.01, 141.55, 136.20, 130.04, 128.60, 127.95, 127.28, 125.28, 125.21, 120.22, 82.52, 72.88, 67.12, 47.43, 44.51, 41.68.
1.31 Formation du triazole par CuAAC en solution
Fmoc-Gly<//[Tz]Leu-OH (5) :
Figure imgf000021_0001
L'acide (S)-2-azido-4-méthylpentanoïque (1) (1,1 g, 7 mmol, 1 éq) et la
/V-Fmoc-prop-2-ynylamine (2) (2,0 g, 7,35 mmol, 1,05 éq) sont dissous dans un mélange DMF/iBuOH/H20 (5:4:1, 36 ml) sous une atmosphère d'argon. Après ajout de /Pr2Net (1,2 ml, 7 mmol, 1 éq) suivi de CuBr(Me2S) (144 mg, 0,7 mmol, 0,1 éq), le milieu réactionnel est agité pendant 20 min à température ambiante. La solution est ensuite diluée par 150 ml d'une solution aqueuse de NaHC031 M puis lavée avec Et20 (2 x 20 ml). La phase aqueuse est acidifiée avec une solution aqueuse d'HCI 6 M jusqu'à pH 2, puis extraite avec AcOEt (4 x 50 ml). Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgS04 puis concentrées à l'évaporateur rotatif. Le produit (5) est obtenu sous la forme d'un solide vert pâle (3,01 g, 6,9 mmol, 98 %), et est utilisé comme building block de SPPS automatisée sans étape de purification supplémentaire. 1 H RMN (500 MHz, CDCI3) δ = 7.79 - 7.72 (m, 3H), 7.59 - 7.50 (m,
2H), 7.44 - 7.35 (m, 2H), 7.35 - 7.21 (m, 2H), 5.72 - 5.68 (s, 1 H), 5.49 - 5.43 (m, 1 H), 4.57 - 4.43 (m, 3H), 4.39 - 4.34 (m,1 H), 4.22 - 4.16 (m, 1 H), 2.15 - 1 .98 (m, 2H), 1 .41 - 1 .32 (m, 1 H), 0.96 (d, J=6.4 Hz, 3H), 0.90 (d, J=6.6 Hz, 3H). 13C RMN (125 MHz, CDCI3) δ = 171 .76, 156.89, 143.96, 143.80,
141 .46, 127.92, 127.26, 125.32, 125.07, 120.18, 67.40, 47.25, 41 .58, 41 .45, 36.14, 24.93, 22.80, 21 .45.
1 .4/ Formation du triazole par CuAAC sur support solide
Selon le mode de synthèse général mis en œuvre, le composé alcyne (0.4 mmol, 4 éq.) et CuBr(Me2S) (82 mg, 0.4 mmol, 4 éq.) sont dissous dans 10 ml de NMP sous atmosphère d'argon. Après addition de iPr2Net (70 μΙ, 0,4 mmol, 4 éq.), la solution est aspirée dans une seringue munie d'un fritté en polypropylène, et contenant la résine portant le peptide azoture (0,1 mmol). Le milieu réactionnel est agité pendant 2 h à température ambiante. La résine est ensuite lavée successivement avec de la NMP (3 x 2 min), du CH2CI2 (2 x 2 min), du chlorure de pyridinium 1 M dans CH2CI2/MeOH 95:5 (2 x 2 min), du CH2CI2 (2 x 2 min) puis du DMF (2 x 2 min). La suite de l'élongation est effectuée par SPPS standard.
1 .5/ Introduction de la modification Y-(A/-hexadécanoyl-L-qlutamyle) Modification sur le résidu N-terminal
Selon le mode de synthèse général mis en œuvre, la résine portant le peptide modifié muni d'une fonction aminé N-terminale non-protégée (50 μιτιοΙ) est couplée après l'élongation SPPS automatisée avec Fmoc-Glu-OiBu (10 équivalents d'acide aminé protégé, 9,5 équivalents d'HCTU et 20 équivalents de di-isopropyléthylamine dans de la NMP). La déprotection du groupement Fmoc est réalisée à l'aide d'une solution de 20 % de pipéridine dans de la NMP. L'acide hexadécanoïque est ensuite couplé (1 0 équivalents d'acide, 9,5 équivalents d'HCTU et 20 équivalents de di-isopropyléthylamine dans un mélange NMP/CH2CI2 1 :4). Le Y-(/V-hexadécanoyl-L-glutamyl)-triazolopeptide brut est finalement libéré de la résine avec 5 mL une solution de TFA/H20//Pr3Si H/phénol, 87,5/5/2,5/5 pendant 2 h. La résine est rincée avec du TFA (2x5mL pendant 5 min), et les filtrats sont concentrés à température ambiante à l'aide d'un évaporateur rotatif jusqu'à un volume d'environ 1 mL. Le peptide est précipité par dilution avec 40 mL Et20 préalablement refroidi à -80 °C, puis centrifugé et lavé 2 fois à Et20. Il est ensuite purifié et analysé selon les protocoles standards.
Modification sur la chaîne latérale du résidu en position 2 ou 3
Selon le mode de synthèse général mis en œuvre, un dérivé de la Fmoc-L-lysine munie d'un groupement Dde sur sa chaîne latérale, Fmoc- Lys(Dde)-OH, est introduit en position 2 ou 3 pendant la SPPS. Après la synthèse automatisée, la résine portant le peptide modifié muni d'une fonction amine N-Dde (50 μιτιοΙ) est traitée par 1 0 mL d'une solution hydrazine à 2% dans la NMP (2 x 5 min) pour éliminer le groupement Dde, puis la résine portant le peptide modifié muni d'une fonction amine non-protégée (50 μιτιοΙ) est traitée selon un protocole identique à celui utilisé pour l'introduction de la modification en position 1 .
1 .6/ Composé peptidique comparatif Comp.1 (mKP10)
Le composé peptidique Comp.1 , de séquence SEQ I D NO:1 : H-Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-Gly-Leu-Arg-Tyr-NH2, de formule chimique :
Figure imgf000024_0001
est préparé par SPPS standard.
HPLC (Nucleosil) : tR = 19,2 min (gradient : 20-40 % MeCN/H20
0,1 % TFA en 30 min) ; détection UV (λ= 280 nm) ; MS : m/z observée 1318,6 ([MH]+ calculée pour C63H8 N17015 = 1318,6).
1 .71 Composé peptidique Comp.2 (hKP10)
Le composé peptidique Comp.2, de séquence SEQ ID NO:2 :
H-Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-Gly-Leu-Arg-Phe-NH2,
de formule chimique :
Figure imgf000024_0002
est obtenu auprès du fournisseur Genecust (Dudelange, Luxembourg) 1 .8/ Composé peptidique Comp.3
Le composé peptidique Comp.3, de séquence SEQ ID NO:10 :
Ac-Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-Gly-Leu-Arg-Tyr-NH2,
correspondant à la mKP10 dans laquelle l'extrémité N-terminale est modifiée par acétylation, et de formule chimique :
Figure imgf000025_0001
est préparé par SPPS standard.
HPLC (Nucleosil) : tR = 21 ,9 min (gradient : 20-40 % MeCN/H20 +
0,1 % TFA en 30 min) ; détection UV (λ= 280 nm) ; MS : m/z observée = 1360,6 ([MH]+ calculée pour C6 H84N19014 = 1360,6).
1 .9/ Composé peptidique C1
Le composé peptidique C1 , de séquence SEQ ID NO:5 : H-Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-GlyΨ[Tz]Leu-Arg-Tyr-NH2, de formule chimique :
Figure imgf000025_0002
est préparé selon la voie B décrite ci-avant en introduisant la fonction azoture par couplage automatisé de -azido acide (1 ). La formation du triazole par CuAAC sur support solide est réalisée avec l'alcyne (2), en suivant le mode opératoire général.
HPLC (Nucleosil) : tR = 17,8 min (gradient : 20-40 % MeCN/H20 0,1 % TFA en 30 min) ; détection UV (λ= 276 nm) ; MS : m/z observée 1341 ,6 ([MH]+ calculée pour C64H84N19014 = 1341 ,6).
1 .10/ Composé peptidique C2
Le composé peptidique C2, de séquence SEQ ID NO:6 : Ac-Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-G^[Tz]Leu-Arg-Tyr-NH2, de formule chimique :
Figure imgf000026_0001
est préparé selon la voie B, en introduisant la fonction azoture par couplage automatisé de -azido acide (1 ). La formation du triazole par CuAAC sur support solide est réalisée avec l'alcyne (2), en suivant le mode opératoire général. Le reste de la synthèse est effectué par SPPS classique.
HPLC (Nucleosil) : tR = 20,5 min (gradient : 20-40 % MeCN/H20 + 0,1 % TFA en 30 min) ; détection UV (λ= 277 nm) ; MS : m/z observée = 1384,7 ([MH]+ calculée pour ΟββΗββΝυ δ = 1384,6).
1 .1 1/ Composé peptidique C3
Le composé peptidique C3, de séquence SEQ ID NO:7 : Ac-Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-GlyΨ[Tz]Leu-Arg(Me)-Tyr-NH2, de formule chimique :
Figure imgf000026_0002
est préparé par introduction du triazole selon la voie A, en utilisant le composé Fmoc-Glyi >[Tz]Leu-OH (5). HPLC (Nucleosil) : tR = 14,3 min (gradient : 25-40 % MeCN/H20 0,1 % TFA en 30 min) ; détection UV (λ= 280 nm) ; MS : m/z observée 1398,7 ([MH]+ calculée pour
Figure imgf000027_0001
= 1398,7).
1 .12/ Composé peptidique C4
Le composé peptidique C4, de séquence SEQ ID NO:8 :
Ac-Tyr-Asn-Lys(Ac)-Asn-Ser-Phe-GlyΨ[Tz]Leu-Arg(Me)-Tyr-NH2, de formule chimique :
Figure imgf000027_0002
est préparé par introduction du triazole selon la voie A, en utilisant le composé Fmoc-Glyi >[Tz]Leu-OH (5).
HPLC (Nucleosil) : tR = 12,9 min (gradient : 20-40 % MeCN/H20 + 0,1 % TFA en 30 min) ; détection UV (λ= 280 nm) ; MS : m/z observée = 1382,7 ([MH]+ calculée pour C6 H92N19Oi6 = 1382,7).
1 .13/ Composé peptidique C5 Le composé peptidique C5, de séquence SEQ ID NO:9 :
Ac-Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-PheΨ[Tz]GlyΨ[Tz]Leu-Arg-Tyr-NH2, de formule chimique :
Figure imgf000028_0001
est préparé de la façon suivante.
Le premier triazole (Glyi/>[Tz]Leu) est formé selon la voie B, en introduisant la fonction azoture par couplage automatisé de -azido acide (1 ). La formation du triazole par CuAAC sur support solide est réalisée avec l'alcyne (2), en suivant le mode opératoire général. Le second triazole (Phei >[Tz]Gly) est formé selon la voie C. Après déprotection du groupement Fmoc, la résine est agité pendant 1 h avec le réactif de transfert de diazo 1 H- imidazole-1 -sulfonyl azide.H2S04 (135 mg, 0,5 mmol, 5 éq.), et K2C03 (140 mg, 1 mmol, 10 éq.) dissous dans DMF/H20 (3/7, 3 ml). Après lavage de la résine, l'azidopeptide supporté résultant est engagé dans une réaction CuAAC sur support solide avec l'alcyne (4), en suivant le mode opératoire général. Le reste de la synthèse est effectué par SPPS classique.
HPLC (Nucleosil) : tR = 15,9 min (gradient : 25-40 % MeCN/H20 + 0,1 % TFA en 30 min) ; détection UV (λ= 280 nm) ; MS : m/z observée = 1408,7 ([MH]+ calculée pour C6oH8 N17013 = 1408,7).
1 .14/ Composé peptidique C6
Le composé peptidique C6, de séquence :
Ac-DTyr-DTrp-Asn-Thr-Phe-GlyΨ[Tz]Leu-Arg(Me)-Trp-NH2, de formule chimique :
Figure imgf000029_0001
est préparé par introduction du tnazole selon la voie A, en utilisant le composé Fmoc-Gly [Tz]Leu-OH (5).
HPLC (Nucleosil) : tR = 28,4 min (gradient : 20-40 % MeCN/H20 + 0,1 % TFA en 30 min) ; détection UV (λ= 280 nm) ; MS : m/z observée = 1321 ,7 ([MH]+ calculée pour
Figure imgf000029_0002
= 1321 ,7).
1 .15/ Composé peptidique C7
Le composé peptidique C7, de séquence :
Αο-θΤγΓ-Ηγρ-Α5η-ΤήΓ-Ρήβ-ΟΙγΨ[Τζ]ίβυ-ΑΓ9(Μβ)-ΤΓρ-ΝΗ2, de formule chimique :
Figure imgf000029_0003
est préparé par introduction du triazole selon la voie A décrite ci-avant, en utilisant le composé Fmoc-Glyi/>[Tz]Leu-OH (5).
HPLC (Nucleosil) : tR = 21 ,3 min (gradient : 20-40 % MeCN/H20 + 0,1 % TFA en 30 min) ; détection UV (λ= 280 nm) ; MS : m/z observée = 1248,6 ([MH]+ calculée pour C60H82N17O13 = 1248,6). 1 .16/ Composé peptidique C8
Le composé peptidique C8, de séquence SEQ ID NO:1 1 :
Αο-ΤγΓ-ίγ5(γ-(Λ/-ήθΧ3θΙέθ3ηογΙ-ΟΙυ-ΟΗ))-ΤΓρ-Α5η-8θΓ-Ρήθ-ΟΙγΨ[Τζ]ίθυ-ΑΓ9-ΤγΓ-ΝΗ dans lequel y-(/V-hexadécanoyl-Glu-OH) représente un motif formule (II) :
Figure imgf000030_0001
est préparé selon la voie B, en introduisant la fonction azoture par couplage automatisé de -azido acide (1 ). La formation du triazole par CuAAC sur support solide est réalisée avec l'alcyne (2), en suivant le mode opératoire général. La suite de l'élongation la synthèse est poursuivie par SPPS classique, puis la modification y-(/V-hexadécanoyl-Glu-OH) est introduite en suivant le mode opératoire général pour les positions 2/3.
HPLC (Nucleosil) : tR = 19,9 min (gradient : 45-75 % MeCN/H20 + 0,1 % TFA en 30 min) ; détection UV (λ= 280 nm) ; MS : m/z observée = 1766,0 ([MH]+ calculée pour C89H128N20O18 = 1766,0).
1 .17/ Composé peptidique C9
Le composé peptidique C9, de séquence SEQ ID NO:12 : γ-(Λ/-ήθΧ3άέθ3ηογΙ-ΟΙυ-ΟΗ)-ΤγΓ-Α5η-ΤΓρ-Α5η-8θΓ-Ρήθ-ΟΙγΨ[Τζ]ίθυ-ΑΓ9-ΤγΓ-ΝΗ2, dans lequel y-(/V-hexadécanoyl-Glu-OH) représente un motif de formule (II) ci-avant est préparé selon la voie B, en introduisant la fonction azoture par couplage automatisé de Γα-azido acide (1 ). La formation du triazole par CuAAC sur support solide est réalisée avec l'alcyne (2), en suivant le mode opératoire général. La suite de l'élongation la synthèse est poursuivie par SPPS classique, puis la modification y-(/V-hexadécanoyl-Glu-OH) est introduite en suivant le mode opératoire général pour la position 1 .
HPLC (Chromolith) : tR = 6,15 min (gradient : 20-40 % MeCN/H20 + 0,1 % TFA en 6 min) ; détection UV (λ= 280 nm) ; MS : m/z observée = 1710,0 ([MH]+ calculée pour CssH^ol c s = 1710,0).
1 .18/ Composé peptidique C10
Le composé peptidique C10, de séquence SEQ ID NO:13 : γ-(Λ/-ήθΧ3άέθ3ηογΙ-ΟΙυ-ΟΗ)ΤγΓ-Α5η-ΤΓρ-Α5η-8θΓ-Ρήθ-ΟΙγΨ[Τζ]ίθυ-ΑΓ9-ΤΓρ-ΝΗ2, dans lequel y-(/V-hexadécanoyl-Glu-OH) représente un motif de formule (II) ci-avant est préparé selon la voie B, en introduisant la fonction azoture par couplage automatisé de -azido acide (1 ). La formation du triazole par CuAAC sur support solide est réalisée avec l'alcyne (2), en suivant le mode opératoire général. La suite de l'élongation la synthèse est poursuivie par SPPS classique, puis la modification y-(/V-hexadécanoyl-Glu-OH) est introduite en suivant le mode opératoire général pour la position 1 .
HPLC (Chromolith) : tR = 4,3 min (gradient : 45-75 % MeCN/H20 + 0,1 % TFA en 6 min) ; détection UV (λ= 280 nm) ; MS : m/z observée = 1732,9 ([MH]+ calculée pour
Figure imgf000031_0001
= 1732,9).
1 .19/ Composé peptidique C1 1 Le composé peptidique C1 1 , de séquence SEQ ID NO:14 :
Αο-ΤγΓ-Α5η-ίγ5(γ-(Λ/-ήθΧ3θΙέθ3ηογΙ-ΟΙυ-ΟΗ))-Α5η-8θΓ-Ρήθ-ΟΙγΨ[Τζ]ίθυ-ΑΓ9-ΤγΓ-ΝΗ2, dans lequel y-(/V-hexadécanoyl-Glu-OH) représente un motif de formule (II) ci-avant est préparé selon la voie B, en introduisant la fonction azoture par couplage automatisé de Γα-azido acide (1 ). La formation du triazole par CuAAC sur support solide est réalisée avec l'alcyne (2), en suivant le mode opératoire général. La suite de l'élongation la synthèse est poursuivie par SPPS classique, puis la modification y-(/V-hexadécanoyl-Glu-OH) est introduite en suivant le mode opératoire général pour les positions 2/3. HPLC (Chromolith) : tR = 3,05 min (gradient : 45-75 % MeCN/H20 + 0,1 % TFA en 6 min) ; détection UV (λ= 280 nm) ; MS : m/z observée = 1693,9 ([MH]+ calculée pour C82Hi2 N2oOi9 = 1694,0).
1 .20/ Composé peptidique C12 Le composé peptidique C12, de séquence SEQ ID NO:15 : γ-(Λ/-ήθΧ3άέθ3ηογΙ-ΟΙυ-ΟΗ)ΤγΓ-Α5η-ΤΓρ-Α5η-8θΓ-Ρήθ-ΟΙγΨ[Τζ]ίθυ-ΑΓ9(Μθ)-ΤγΓ-ΝΗ2, dans lequel y-(/V-hexadécanoyl-Glu-OH) représente un motif de formule (II) ci-avant est préparé selon la voie B, en introduisant la fonction azoture par couplage automatisé de -azido acide (1 ). La formation du triazole par CuAAC sur support solide est réalisée avec l'alcyne (2), en suivant le mode opératoire général. La suite de l'élongation la synthèse est poursuivie par SPPS classique, puis la modification y-(/V-hexadécanoyl-Glu-OH) est introduite en suivant le mode opératoire général pour la position 1 .
HPLC (Chromolith) : tR = 3,8 min (gradient : 45-75 % MeCN/H20 + 0,1 % TFA en 6 min) ; détection UV (λ= 280 nm) ; MS : m/z observée = 1723,9 ([MH]+ calculée pour C86H122N20O18 = 1723,9).
1 .21/ Composé peptidique C13
Le composé peptidique C13, de séquence SEQ ID NO:16 : γ-(Λ/-ήθΧ3άέθ3ηογΙ-ΟΙυ-ΟΗ)ΤγΓ-Α5η-ΤΓρ-Α5η-8θΓ-Ρήθ-ΟΙγΨ[Τζ]ίθυ-ΑΓ9-Ρήθ-ΝΗ2, dans lequel y-(/V-hexadécanoyl-Glu-OH) représente un motif de formule (II) ci-avant est préparé selon la voie B, en introduisant la fonction azoture par couplage automatisé de Γα-azido acide (1 ). La formation du triazole par CuAAC sur support solide est réalisée avec l'alcyne (2), en suivant le mode opératoire général. La suite de l'élongation la synthèse est poursuivie par SPPS classique, puis la modification y-(/V-hexadécanoyl-Glu-OH) est introduite en suivant le mode opératoire général pour la position 1 . HPLC (Chromolith) : tR = 4,25 min (gradient : 45-75 % MeCN/H20 + 0,1 % TFA en 6 min) ; détection UV (λ= 280 nm) ; MS : m/z observée = 1693,9 ([MH]+ calculée pour C85H120N20O17 = 1693,9).
1 .22/ Composé peptidique C14 Le composé peptidique C14, de séquence SEQ ID NO:17 :
Αο-ΤγΓ-ίγ5(ΤΤ08-(γ-(Λ/-ήθΧ3θΙέθ3ηογΙ-ΟΙυ-ΟΗ)))-ΤΓρ-Α5η-8θΓ-Ρήθ-ΟΙγΨ[Τζ]ίθυ-ΑΓ9- Tyr-NH2,
dans lequel TTDS est un bras espaceur acide 1 ,13-diamino-4,7,10- trioxatridécan-succinique et TTDS-(y-(/V-hexadécanoyl-Glu-OH)) représente un motif de formule (III) :
Figure imgf000033_0001
est préparé selon la voie B, en introduisant la fonction azoture par couplage automatisé de -azido acide (1 ). La formation du triazole par CuAAC sur support solide est réalisée avec l'alcyne (2), en suivant le mode opératoire général. La suite de l'élongation est poursuivie par SPPS en utilisant Fmoc-Lys(Dde)-OH pour la position 2. Après la synthèse automatisée, la résine portant le peptide modifié muni d'une fonction aminé N-Dde (50 μιτιοΙ) est traitée par 10 mL d'une solution hydrazine à 2% dans la NMP (2 x 5 min) pour éliminer le groupement Dde, puis la résine portant le peptide modifié muni d'une fonction aminé non-protégée (50 μιτιοΙ) est couplée avec l'acide [1 -/V-(9- fluorénylméthoxycarbonyl)-1 ,13-diamino-4,7,10-trioxatridécan-succinamique (Fmoc-TTDS-OH, 3 équivalents, 3 équivalents d'HATU (hexafluorophosphate de 2-(7-aza-1 /-/-benzotriazole-1 -yl)-1 ,1 ,3,3-tetraméthylaminium) et 6 équivalents de di-isopropyléthylamine dans de la NMP). Le groupement Fmoc est éliminé par traitement avec une solution de 20 % de pipéridine dans de la NMP. Fmoc-Glu-OiBu est ensuite couplé (10 équivalents d'acide aminé protégé, 9,5 équivalents d'HCTU et 20 équivalents de di-isopropyléthylamine dans de la NMP). La déprotection du groupement Fmoc est réalisée à l'aide d'une solution de 20 % de pipéridine dans de la NMP. L'acide hécadécanoïque est ensuite couplé (10 équivalents d'acide, 9,5 équivalents d'HCTU et 20 équivalents de di-isopropyléthylamine dans un mélange NMP/CH2CI2 1 :4).
Le TTDS-[Y-(/V-hexadécanoyl-L-glutamyl)]-triazolopeptide brut est finalement libéré de la résine avec 5 mL une solution de TFA/H20//Pr3SiH/phénol, 87,5/5/2,5/5 pendant 2 h. La résine est rincée avec du TFA (2 x 5 mL pendant 5 min), et les filtrats sont concentrés à température ambiante à l'aide d'un évaporateur rotatif jusqu'à un volume d'environ 1 mL. Le peptide est précipité par dilution avec 40 mL Et20 préalablement refroidi à - 80 °C, puis centrifugé et lavé 2 fois à Et20. Il est ensuite purifié et analysé selon les protocoles standards.
HPLC (Chromolith) : tR = 3,65 min (gradient : 45-75 % MeCN/H20 + 0,1 % TFA en 6 min) ; détection UV (λ= 280 nm) ; MS : m/z observée = 2068,2 ([MH]+ calculée pour Cio3Hi5 N22023 = 2068,2). 1 .23/ Composé peptidique C15
Le composé peptidique C15, de séquence SEQ ID NO:18 :
Ac-Tyr-Lys[2-(succinamido)-6-(4-(4-iodophényl)butanamido)hexanoate]-Trp-Asn-Ser- Phe-G^TzJLeu-Arg-Tyr-NI-^,
dans lequel 2-(succinamido)-6-(4-(4-iodophényl)butanamido)hexanoate représente un motif de formule (IV) :
Figure imgf000035_0001
est préparé selon la voie B, en introduisant la fonction azoture par couplage automatisé de -azido acide (1 ). La formation du triazole par CuAAC sur support solide est réalisée avec l'alcyne (2), en suivant le mode opératoire général. La suite de l'élongation est poursuivie par SPPS en utilisant Fmoc-Lys(Dde)-OH pour la position 2. Après la synthèse automatisée, la résine portant le peptide modifié muni d'une fonction aminé N-Dde (50 μιτιοΙ) est traitée par 10 mL d'une solution hydrazine à 2% dans la NMP (2 x 5 min) pour éliminer le groupement Dde, puis la résine portant le peptide modifié muni d'une fonction aminé non-protégée (50 μιτιοΙ) est traité avec de l'anhydride succinique (10 équivalents d'anhydride et 20 équivalents de di- isopropyléthylamine dans de la NMP). H-D-Lys(Boc)-OiBu est ensuite couplé (10 équivalents d'acide aminé protégé, 10 équivalents de PyAOP (hexafluorophosphate de (7-Azabenzotriazol-1 -yloxy)tripyrrolidino- phosphonium) et 20 équivalents de di-isopropyléthylamine dans de la NMP). Le triazolopeptide brut est finalement libéré de la résine avec 5 mL une solution de TFA/H20//Pr3SiH/phénol, 87,5/5/2,5/5 pendant 2 h. La résine est rincée avec du TFA (2x5mL pendant 5 minute), et les filtrats sont concentrés à température ambiante à l'aide d'un évaporateur rotatif jusqu'à un volume d'environ 1 mL. Le peptide est précipité par dilution avec 40 mL Et20 préalablement refroidi à 0°C, puis centrifugé et lavé 2 fois à Et20.
Le peptide est enfin couplé en solution avec l'acide 4-(-p- iodophenyl)butanoïque (3 équivalents) activé sous la forme de son ester de N- hydroxysuccinimide comme décrit dans la publication de Trussel et al., 2009. Le composé C15 ainsi obtenu est ensuite purifié et analysé selon les protocoles standards.
HPLC (Chromolith) : tR = 4,85 min (gradient : 20-40 % MeCN/H20 + 0,1 % TFA en 6 min) ; détection UV (λ= 280 nm) ; MS : m/z observée = 1898,8 ([MH]+ calculée pour C88Hii6lN21019 = 1898,8).
1 .24/ Composé peptidique C16
Le composé peptidique C16, de séquence SEQ ID NO:19 : Αο-ΤγΓ-ίγ5(ΡΕΟ5000)-ΤΓρ-Α5η-5βΓ-Ρήβ-ΟΙγΨ[Τζ]ίβυ^-ΤγΓ-ΝΗ2, dans lequel PEG5000 représente un motif de formule: COCH2 CH2NH(CH2CH20)nMe avec -85 < n < -130, d'une masse moléculaire moyenne d'environ 5000 g/mol, est préparé selon la voie B, en introduisant la fonction azoture par couplage automatisé de Γα-azido acide (1 ). La formation du triazole par CuAAC sur support solide est réalisée avec l'alcyne (2), en suivant le mode opératoire général. La suite de l'élongation est poursuivie par SPPS en utilisant Fmoc-Lys(Boc)-OH pour la position 2. Après la synthèse automatisée, le triazolopeptide (50 μιτιοΙ) est finalement libéré de la résine avec 5 mL une solution de TFA/H20//Pr3Si H/phénol, 87,5/5/2,5/5 pendant 2 h. La résine est rincée avec du TFA (2 x 5 mL pendant 5 min), et les filtrats sont concentrés à température ambiante à l'aide d'un évaporateur rotatif jusqu'à un volume d'environ 1 mL. Le peptide est précipité par dilution avec 40 mL Et20 préalablement refroidi à -80 °C, puis centrifugé et lavé 2 fois à Et20.
Le peptide (2 équivalents) est enfin couplé en solution avec un polymère commercial (IRIS Biotech Gmbh) d'une masse moyenne d'environ 5000 g/mol activé sous la forme de son ester de /V-hydroxysuccinimide (5 mM peptide dans un mélange de tampon HEPES 50 mM pH 8.5 et de MeCN 9:1 ). Le composé C16 ainsi obtenu est ensuite purifié et analysé selon les protocoles standards.
HPLC (Nucleosil) : tR = 15-17 min (gradient : 35-55 % MeCN/H20 + 0,1 % TFA en 40 min) ; détection UV (λ= 280 nm) ; MS : m/z observée = 6182,2 ([MH]+ calculée pour n=106, C285H522N20Oi22 = 6182,4, masse moyenne, pas monoisotopique).
EXEMPLE 2 - Test de dégradation protéolytique des composés peptidiques dans du sérum ovin
Pour la réalisation de ce test, du sang a été collecté de la veine jugulaire de brebis de race Ile de France et centrifugé. Le surnageant (sérum) a été stocké à -20 °C jusqu'à l'utilisation.
La dégradation dans ce sérum des différents composés peptidiques conformes à l'invention et des composés peptidiques comparatifs est suivie au cours du temps. A cet effet, chaque composé peptidique à analyser et le calibrant interne (L-phénylalaninol) sont mis en solution dans de l'eau milliQ (0,5 mM et 6,6 mM, respectivement). Le cocktail d'inhibiteurs de protéases commercial (Sigma, réf. P8340) est fourni en solution dans le DMSO.
Le sérum et les solutions-mères de composés peptidiques sont préchauffés à 39 °C pendant 30 minutes. Chaque solution de composé peptidique (50 μί, soit une concentration finale dans le sérum de 50 μΜ) et la solution de calibrant interne (25 μί) sont mélangées à 425 μί. de sérum et incubées à 39 °C. Le suivi de la cinétique de dégradation protéolytique des composés est effectué en prélevant, à différents temps donnés, 75 μί. de la solution, qui sont dilués avec 150 μί. d'acétonitrile afin de précipiter les protéines du sérum. La suspension obtenue est centrifugée à 14000 tour/min pendant 10 min à 4 °C. 100 μί. du surnageant sont dilués dans 900 μί. d'une solution de TFA à 0,1 % dans l'eau, puis injectés en HPLC pour analyse (colonne : Chromolith® HighResolution RP-18 endcapped, 3 mL/min, gradient : 2-52 % MeCN/H20 + 0,1 % TFA en 5 min, détection UV, λ= 214 nm). La quantité de composé peptidique intact après incubation est déterminée par intégration de l'aire du pic, en utilisant le L-phénylalaninol comme calibrant interne. Elle est exprimée en % de l'aire du pic au temps t = 0.
La valeur correspondant à 100 % de composé peptidique intact est obtenue en mélangeant 420 μί. de sérum, 5 μί. du cocktail d'inhibiteurs et 25 μ\- de la solution de phénylalaninol, suivi de 50 μί. de composé peptidique, puis en traitant immédiatement la solution résultante selon le protocole décrit ci-dessus. Pour tous les composés testés, les résultats obtenus, après 3h d'incubation dans le sérum, sont montrés dans le tableau 1 ci-après.
Figure imgf000038_0001
Tableau 1 - Quantités des composés peptidiques intacts après 3 h d'incubation dans du sérum ovin, exprimées en % de l'aire du pic HPLC au temps t=0
Ces résultats démontrent que les composés conformes à l'invention C2 à C7 présentent tous une durée de vie dans le sérum ovin qui est très largement prolongée par rapport aux composés naturels comparatifs mKP10 (Comp.1 ) et hKP10 (Comp.2).
L'intérêt, en terme d'allongement de la demi-vie dans le sérum ovin, de la substitution par une liaison triazole de la liaison amide entre le résidu glycine et le résidu leucine est en outre clairement démontré par comparaison des cinétiques de dégradation dans le sérum obtenues pour le composé conforme à l'invention C2, et le composé comparatif Comp.3, dont les structures ne diffèrent que par la nature de ladite liaison. En particulier, ces composés sont tous deux munis d'un groupement /V-acétyle N-terminal. Ces cinétiques de dégradation protéolytique dans le sérum ovin sont illustrées sur la figure 1 . Il ressort clairement de cette figure que le composé peptidique conforme à l'invention C2 présente une durée de vie nettement prolongée en comparaison de celle du composé peptidique comparatif Comp.3.
EXEMPLE 3 - Tests de mobilisation du calcium intracellulaire 3.1 / Matériel et méthodes
Pour effectuer les tests in vitro de l'activité des composés peptidiques conformes à l'invention et des composés comparatifs, la lignée cellulaire HEK293A (ATCC, American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA) a été transfectée de façon stable avec le récepteur humain KISS1 R (numéro d'accession Genbank : NM_032551 ) Pour la transfection, a été utilisé le vecteur pcDNA3.1 (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), dans lequel la séquence du KISS1 R humain a été insérée avec un tag HA 5' en position 957- 2150 pb. La transfection et la sélection des clones ont été effectuées comme décrit en littérature (Mancini et al. 2009, et site internet d'Invitrogen). Le récepteur KISS1 R est couplé aux protéines Gq et son activation produit une augmentation de la concentration intracellulaire du calcium. Pour vérifier l'activité agoniste et mesurer l'EC5o des composés peptidiques selon l'invention, le protocole suivant a été mis en œuvre.
Les cellules HEK293A exprimant le récepteur KISS1 R humain ont été ensemencées dans une plaque 96 puits ^clear® black plate) à la concentration de 40 000 cellules/puits, et mises dans un incubateur à 37 °C. Après 48 heures, le milieu à été changé et les cellules ont été incubées avec le colorant fluorescent Fluo-4NW, suivant les indications du fabricant (Molecular Probe). Pour éviter l'adhésion du peptide au plastique les composés à tester ont été prédilués dans une plaque dite « non-binding » (Corning), à une concentration 20 fois supérieure (20X) à la concentration final désirée.
Après avoir mesuré la fluorescence basale, 5 μΙ de la solution 20X contenant le composé à tester ont été rajoutés dans chaque puits (contenant 95 μΙ) de façon à obtenir la concentration souhaitée. Les variations de fluorescence ont été enregistrées toutes les 7 secondes pendant 5-7 minutes avec un lecteur de plaque (PolarStar Optima, BMG Labtech). Des courbes activités-concentrations ont été générées en utilisant le logiciel GraphPad Prism 5, et l'EC5o de chaque composé a été calculée en ajustant la courbe à une sigmoïde.
3.2/ Composés C1 à C7 selon l'invention
Les courbes obtenues sont montrées sur les figures 2a à 2g, respectivement pour les composés conformes à l'invention C1 , C2, C3, C4, C5, C6 et C7, sur la figure 2h pour le composé comparatif Comp.2 et sur la figure 2i pour le composé comparatif Comp.3. Sur chacune de ces figures, la courbe obtenue pour le composé comparatif Comp.1 également représentée à titre de comparaison. Les résultats obtenus, en termes d'EC5o, sont montrés dans le tableau 2 ci-après.
Figure imgf000040_0001
Tableau 2 - Effet des composés peptidiques sur la mobilisation du calcium intracellulaire de cellules exprimant le KISS1 R humain Ces résultats montrent que l'insertion d'un hétérocycle 1 ,2,3-triazole disubstitué en remplacement de la liaison peptidique entre la glycine et la leucine, conformément à l'invention, augmente la puissance de stimulation du KISS1 R humain des composés peptidiques, à l'exception du composé C5, qui reste cependant actif, bien que de façon moindre.
3.3/ Composés C8 à C16 selon l'invention
Les courbes obtenues sont montrées sur les figures 5a à 5i, respectivement pour les composés conformes à l'invention C8, C9, C10, C1 1 , C12, C13, C14, C15 et C16. Sur chaque figure, il est également représenté la courbe correspondant au composé Comp.1 , qui a été testé en parallèle de chaque composé. Les résultats obtenus, en termes d'EC5o, sont montrés dans le tableau 3 ci-après.
Figure imgf000041_0001
Tableau 3 - Effet des composés peptidiques selon l'invention, modifiés par un motif apte à se lier à l'albumine sérique (C8 à C15) ou par un PEG (C16), sur la mobilisation du calcium intracellulaire de cellules exprimant le KISS1 R humain Ces résultats montrent que l'insertion d'un hétérocycle 1 ,2,3-triazole disubstitué en remplacement de la liaison peptidique entre la glycine et la leucine, associée à la présence sur le composé peptidique d'un motif apte à se lier à l'albumine sérique, ou au PEG, conformément à des modes de réalisation particuliers de la présente invention, augmente la puissance de stimulation du KISS1 R humain des composés peptidiques, à l'exception du composé C1 1 , qui reste cependant actif, bien que de façon moindre, et du composé C16, qui montre une puissance semblable au composé comparatif Comp.1 .
EXEMPLE 4 - Tests d'activité in vivo 4.1 / 1 ere Expérimentation
Dans cet exemple, ont été testés les composés conformes à l'invention C1 , C4 et C6 et le composé comparatif Comp.1 .
Les tests ont été effectués sur des brebis de race Ile de France soit en période d'anoestrus pour les composés comparatifs Comp.1 et Comp.3, soit en période d'œstrus pour le composé comparatif Comp.1 et pour les composés conformes à l'invention C1 , C4 et C6. Les brebis utilisées en période d'œstrus ont été préalablement traitées avec une éponge vaginale contenant 20 mg d'acétate de fluorogestone (Chronogest CR éponge, Intervet) pour bloquer la sécrétion de la LH et simuler une phase lutéale. Cinq jours après la pose de l'éponge (pour les animaux en période d'œstrus) ou le jour avant le test (pour les animaux en période d'anoestrus), un cathéter a été posé dans la veine jugulaire de l'animal. Le jour du test, le composé peptidique à tester a été injecté dans le cathéter, à la dose désirée (5 nmoles/brebis), dilué dans 1 ml de solution physiologique. Du sérum physiologique contenant de l'héparine (3 ml) a été injecté immédiatement après le composé peptidique pour rincer le cathéter et entraîner la totalité du composé dans la circulation sanguine de l'animal.
Un témoin négatif (T) constitué de solution physiologique seule a également été réalisé. Avant et suivant l'injection du composé à tester, des prélèvements de sang ont été effectues à des intervalles variables entre 10 min et 1 h, pendant une durée comprise entre 3 h et 30 h.
Les échantillons de sang ont été centrifugés, et le plasma stocké à - 20 °C jusqu'à son utilisation pour mesurer la concentration de LH, en suivant une méthode RIA décrite dans la littérature (Caraty et al., 2007).
Les résultats obtenus, en termes de concentration de LH dans chaque échantillon de sang, rapportée à la concentration maximale de LH mesurée après injection de 5 nmoles/brebis de Comp.1 (% de la stimulation maximale de Comp.1 ), en fonction du temps, sont montrés sur la figure 3 pour les composés Comp.1 et Comp.3 (brebis en période d'anoestrus) et sur la figure 4 pour les composés Comp.1 , C1 , C4 et C6 (brebis en période d'œstrus).
Il ressort clairement de ces figures que les composés conformes à l'invention C1 , C4 et C6 sont tous plus actifs que les composés comparatifs Comp.1 et Comp 3 en ce qui concerne l'augmentation de la concentration plasmatique de LH.
Plus particulièrement, on observe sur la figure 3 que le composé présentant une substitution en N-terminal (Comp 3), qui est plus puissant que Comp.1 (mKP10) in vitro, n'augmente, dans ce test in vivo, que de façon minimale l'efficacité et la durée de l'élévation de la concentration plasmatique de LH. Par contre, comme on peut l'observer sur la figure 4, l'introduction d'un motif triazole en remplacement de la liaison peptidique entre les résidus glycine et leucine, conformément à la présente invention, augmente de façon très importante non seulement la concentration plasmatique de LH, mais également la durée de cette augmentation.
4.2/ 2ème Expérimentation
Dans cet exemple, ont été testés les composés conformes à l'invention C1 et C2 et les composés comparatifs Comp.1 et Comp.3.
Les tests ont été effectués sur des brebis de race Ile de France en période d'anoestrus, de la manière indiquée ci-avant en référence à la 1 ere Expérimentation (sans aucun traitement à la progestérone). En particulier, pour tous les animaux, le jour avant le test, un cathéter a été posé dans la veine jugulaire de l'animal. Le jour du test, le composé peptidique à tester a été injecté dans le cathéter, à la dose désirée (5 nmoles/brebis), dilué dans 1 ml de solution physiologique.
Les résultats obtenus, en termes de concentration de LH dans chaque échantillon de sang en fonction du temps, sont montrés sur les figures 6a à 6d, respectivement pour les composés Comp.1 , Comp.3, C1 et C2. Sur ces figures, la flèche, montrant le temps « 0 », indique le moment de l'injection. La durée d'action du composé concernée est symbolisée par des astérisques, dont le nombre est proportionnel à la durée d'action du composé.
Il ressort clairement de ces figures que les composés conformes à l'invention C1 et C2 présentent une durée d'action qui est prolongée plus longuement dans le temps que les composés comparatifs Comp.1 et Comp.3, dont ils ne diffèrent respectivement que par le remplacement de la liaison peptidique entre les résidus glycine et leucine par la liaison 1 ,2,3-triazole-1 ,4- disubstitué.
Pour chacune des courbes obtenues, l'aire sur la courbe (AUC) a été calculée. L'ensemble des valeurs obtenues sont montrées sur la figure 7. On y observe que le composé selon l'invention C2 est significativement plus actif que les composés comparatifs en ce qui concerne l'augmentation totale de la concentration plasmatique de LH sur l'ensemble de la durée de l'expérimentation (9 heures).
4.3/ 3ème Expérimentation Dans cet exemple il a été testé les composés conformes à l'invention
C2 et C8, qui diffèrent par la présence, dans C8, d'un motif apte à se lier à l'albumine sérique en position 2 du composé peptidique.
Les tests ont été effectués sur des brebis de race Ile de France en période d'anoestrus, comme indiqué ci-avant en référence à la 1 ere Expérimentation (sans aucun traitement à la progestérone). En particulier, pour tous les animaux, le jour avant le test, un cathéter a été posé dans la veine jugulaire de l'animal. Le jour du test, le composé peptidique à tester a été injecté dans le cathéter, à la dose désirée, dilué dans 1 ml de solution physiologique. Pour chaque composé, les trois doses suivantes ont été testées : 1 nmole/brebis, 5 nmoles/brebis et 15 nmoles/brebis.
Les résultats obtenus, en termes de concentration de LH dans chaque échantillon de sang en fonction du temps, pour chaque dose injectée, sont montrés sur les figures 8a et 8b, respectivement pour les composés C2 et C8. Sur ces figures, la flèche, montrant le temps « 0 », indique le moment de l'injection.
Il ressort clairement de ces figures que le composé conforme à l'invention C8, différant du composé C2 par l'introduction d'un motif apte à se lier à l'albumine sérique, présente une action qui est plus prolongée encore dans le temps, et de manière très significative, que le composé C2, dont il a été démontré ci-avant qu'il est lui-même bien plus performant que les composés comparatifs Comp.1 et Comp.3.
Pour chacune des courbes obtenues, l'aire sur la courbe (AUC) a été calculée. L'ensemble des valeurs obtenues sont montrées sur les figures 9a et 9_b, respectivement pour les composés C2 et C8. On y observe que le composé selon l'invention C8 est plus actif encore que le composé C2 en ce qui concerne la sécrétion de LH.
4.4/ 4eme Expérimentation
Dans cet exemple, le composé conforme à l'invention C8 a été injecté, d'une part par voie intraveineuse, et d'autre part par voie intramusculaire, à des brebis de race Ile de France en période d'œstrus.
Les brebis ont été préalablement traitées avec une éponge vaginale contenant 20 mg d'acétate de fluorogestone (Chronogest CR éponge, Intervet) pour bloquer la sécrétion de la LH et simuler une phase lutéale.
Dans cette expérimentation, il a été choisi un temps de pose de l'éponge vaginale plus long par rapport à la 1 ere expérimentation, de sorte à mieux bloquer la pulsatilité endogène de la LH. Douze jours après la pose de l'éponge, un cathéter a été posé dans la veine jugulaire de certains des animaux. Le jour du test, le composé C8 a été injecté dans le cathéter, à la dose désirée (15 nmoles/brebis), dilué dans 1 ml de solution physiologique. Du sérum physiologique contenant de l'héparine (3 ml) a été injecté immédiatement après le composé peptidique pour rincer le cathéter et entraîner la totalité du composé dans la circulation sanguine de l'animal.
En parallèle, sur d'autres animaux, le même jour, il a été réalisé une injection intramusculaire, à la même dose (15 nmoles/brebis), dans les muscles des animaux situés entre le cou et l'épaule, comme pratiqué dans les élevages.
Avant et suivant l'injection du composé à tester, des prélèvements de sang ont été effectués à des intervalles variables entre 10 min et 1 h, pendant une durée de 10 h.
Les échantillons de sang ont été centrifugés, et le plasma stocké à -20 °C jusqu'à son utilisation pour mesurer la concentration de LH, en suivant la méthode RIA décrite dans la littérature (Caraty et al., 2007).
Les résultats obtenus, en termes de concentration de LH dans chaque échantillon de sang, sont montrés sur la figure 10. Sur cette figure, la flèche, montrant le temps « 0 », indique le moment des injections. Ces résultats montrent que le composé peptidique selon l'invention C8 est également efficace, in vivo, en injection intramusculaire, sur la sécrétion de LH dans le plasma.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Composé peptidique agoniste du récepteur KISS1 R, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi :
- un pseudo-peptide présentant la séquence C-terminale :
-Xaa [Tz]Xaa2-Xaa3-Xaa4-NH2 (SEQ ID NO:3) où Ψ[Τζ] représente un groupe 1 ,2,3-triazole-1 ,4-disubstitué de formule (I) :
Figure imgf000048_0001
remplaçant la liaison peptidique entre le résidu Xaa1 et le résidu Xaa2,
Xaa1 représente Gly ou Ala,
Xaa2 représente Leu ou un résidu cc-amino acyle aliphatique analogue,
Xaa3 représente Arg, dont la fonction -NH2 est le cas échéant substituée par un groupe méthyle, ou un résidu cc-amino acyle chargé positivement analogue,
Xaa4 représente Tyr, Phe, Trp ou un résidu cc-amino acyle de type aryl alanine analogue, un analogue du pseudo-peptide de séquence SEQ ID NO:3 dans lequel la liaison amide peptidique entre Xaa2 et Xaa3 et/ou entre Xaa3 et Xaa4 est remplacée par une liaison isostère, ou un de leurs sels.
2. Composé peptidique selon la revendication 1 , choisi parmi - un pseudo-peptide de séquence :
H-Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-Xaa [Tz]Xaa2-Xaa3-Xaa4-NH2 (SEQ ID NO:4) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
- un analogue dudit pseudo-peptide apte à lier le récepteur KISS1 R, - ou un de leurs sels.
3. Composé peptidique selon la revendication 2, consistant en un analogue dudit pseudo-peptide de séquence SEQ ID NO:4, dans lequel au moins un acide aminé parmi Tyr1 , Asn2 et Trp3 est substitué par une lysine, dont la fonction aminé est de préférence substituée par un ou plusieurs groupes choisis parmi un groupe alcanoyle, une chaîne polyalkylèneglycol, de préférence polyéthylène glycol, et une chaîne lipidique.
4. Composé peptidique selon l'une quelconque des revendications 2 à 3, consistant en un analogue dudit pseudo-peptide de séquence SEQ ID NO:4, dans lequel au moins l'acide aminé Tyr1 est remplacé par son énantiomère D.
5. Composé peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel au moins la fonction aminé N-terminale est modifiée par substitution par un groupe choisi parmi les alcanoyies linéaires, en particulier en C1 -C6, un groupement benzoyle et un groupement tétraméthylguanidinium.
6. Composé peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel au moins la fonction aminé N-terminale est remplacée par une fonction azoture ou par un groupe 1 ,2,3-triazole-1 ,4-disubstitué de formule (I).
7. Composé peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel au moins la fonction aminé N-terminale est substituée par un groupe alkyle, notamment choisi parmi les alkyles linéaires, de préférence en C1 -C6, ou par un groupe benzyle.
8. Composé peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel au moins un acide aminé est lié à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol, de préférence polyéthylène glycol, et/ou à une ou plusieurs chaînes lipidiques et/ou groupements se liant à l'albumine sérique.
9. Composé peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel au moins un acide aminé est lié à un motif apte à se lier à l'albumine sérique, notamment à un groupement y-(/V-hexadécanoyl-Glu-OH), ledit acide aminé étant de préférence situé dans la région N-terminale dudit composé peptidique.
10. Composé peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour son utilisation en tant que médicament.
11. Composé peptidique selon la revendication 10, pour son utilisation pour induire l'ovulation chez un mammifère.
12. Composé peptidique selon la revendication 10, pour son utilisation pour le traitement de pathologies liées à une réduction de l'activité de l'axe hypothalamo-hypophyse-gonade.
13. Composé peptidique selon la revendication 10, pour son utilisation pour le traitement de cancers sensibles aux hormones stéroïdiennes ou pour retarder le vieillissement,
14. Composé peptidique selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, qui est administré sous la forme d'injection.
15. Composition pharmaceutique ou vétérinaire, notamment pour induire l'ovulation chez un mammifère femelle, caractérisée en ce qu'elle contient un composé peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
16. Composition selon la revendication 15, se présentant sous une forme administrable par injection intramusculaire, sous-cutanée, intraveineuse ou intradermique, ou sous forme administrable par voie orale.
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