HUP0100424A2 - Eljárás komplex DNS-metilezettség ujjlenyomatok előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát szövetek és sejttípusok jellemzésére,osztályozására és megkülönböztetésére, szövetek és sejtcsoportokviselkedésének előrejelzésére és kifejeződésükben megváltozott génekazonosítására szolgáló eljárás képezi, ahol egy kívánt szövetmintábólkinyert kezeletlen, elvágott vagy restrikciós endonukleázzal hasítottgenomiális DNS-ben a citozint - 5 metilcitozint azonban nem -önmagában ismert úton-módon hidrogénszulfit oldattal uracilláalakítják, az így kezelt genomiális DNS frakcióit megsokszorozzák vagynagyon rövid vagy degenerált oligonukleotidok, vagy olyanoligonukleotidok alkalmazásával, amelyek a hidrogénszulfitos kezeléselőtt az elhasított DNS végeihez ligált adapter oligonukleotidokkalkomplementerek, a megsokszorozott frakciókból a guaninban gazdag DNS-szálon megmaradó citozinoknak és/vagy a citozinban gazdag DNS-szálonlevő guaninoknak összesen olyan mennyiségét mutatják kihibridizációval vagy polimeráz láncreakcióval, hogy egy ilyenvizsgálatban keletkezett és automatikusan egy feldolgozó algoritmusraátvitt adatok az analizált sejt fenotípusára visszakövetkeztetésttegyenek lehetővé. Ó

Description

* S.B.G. & K.

70.413/PA Nemzetközi _v ' * .... .. .........

_ . Szabadalmi Iroda ‘ ... . · · · . .

H-1062 Budapest. Andrássy út 113. ·’ · < ··* ··* '··* ?

Telefon: 34-24-950, Fax: 34-84-323 ’· ‘ ‘ ^;

Eljárás komplex DNS-metilezettség ujjlenyomatok előállítására

1. A találmány által felölelt terület

A találmány tárgyát rákos megbetegedések megkülönböztető diagnózisára egy új lehetőséget adó eljárás képezi. Ez a több génnel öröklődő betegségek karcinogenezisének és patogenezisének mélyebb megértéséhez vezet. Az eljárás ígéri továbbá a betegségek keletkezésében részt vevő gének azonosítását. A sejtdifferenciálódás és a magasabb rendű szervezetek differenciálódása mindeddig lényegében nem tisztázott. A találmány ezen a téren is jelentős ismeret gyarapodást ígér.

A molekuláris biológiában az utóbbi években bekövetkezett módszertani fejlődéseket követően jól tanulmányozott területek maguk a gének, ezen gének átírása RNS-sé és az ezek révén szintetizálódó fehérjék. Az, hogy egy egyed fejlődése során mikor melyik gén kapcsolódik be és bizonyos sejtekben és szövetekben bizonyos gének aktiválódását és gátlását mi irányítja, összefügg a gén illetve a genom metilezettségének kiterjedésével és jellegével. Ennyiben kézenfekvő az a feltételezés, hogy patogén állapotok egyes gének vagy a genom megváltozott metilezettség-mintázatában nyilvánulnak meg.

A technika mai állása szerint létezik eljárás, amely lehetővé teszi egyes gének metilezettség-mintázatának vizsgálatát. Ennek a módszernek újabb fejlesztései lehetővé teszik kis kiindulási anyagmennyiségek analízisét, ahol azonban a mérési pontok összes száma még mindig az elméletileg legalább 10 mérési pont2 nak legfeljebb fele területén található. A találmány szerinti eljárás segítségével először vizsgálhatók tetszés szerinti genom darabok tetszés szerint sok mérési ponttal. Az eljárás ily módon lehetővé teszi mindenfajta genetikai betegség más módon meg nem határozható okainak azonosítását és lehetővé teszi új kezelési stratégiák kifejlesztését és cél fehérjék azonosítását új gyógyszerekhez .

2. A technika mai szintje

2.1. Sejt fenotípusok molekuláris analízisének jelenlegi technikáj a

A gének kifejeződése tanulmányozható RNS szinten és fehérje szinten. Elvben mindkét szint fontos fenotípusos paraméterekben jelenik meg. Kétdimenziós gél segítségével végzett fehérje vizsgálatok (McFarrel-féle eljárás) körülbelül 15 éve ismertek. Ezek segítségével egy analízisben bemutatható néhány ezer fehérje kromatográfiás helyzete. Ilyen elektroferogramokat már egész korán feldolgoztak illetve kiértékeltek az EDV segítségével is. A módszerek megbízhatósága elvben magas, de az RNS analízisen alapuló génkifejeződés modern módszereihez képest két ponton alul maradnak.

Mindenekelőtt a szabályozásban fontos fehérjék csekély menynyiségű sejtből történő kimutatása hiúsul meg az alkalmazott módszerek nagyon gyenge érzékenysége miatt. A nukleinsavakkal ellentétben ugyanis a fehérjék nem sokszorozhatok meg. Ezenkívül hatalmas komplexekről van szó, nem automatizálható és nagyon költséges eljárásokról. Az RNS analízis ezzel szemben jelentős előnyökkel rendelkezik. Ez a PCR alkalmazása következtében érzé kenyebb. Mindenekelőtt minden érdekesnek ígérkező RNS fajta azonnal, szekvenálással azonosítható.

Ismert szekvenciával rendelkező RNS-ek túlzott vagy túl gyenge kifejeződése a legtöbbször könnyen bizonyítható, de csak kivételes esetekben áll megbízhatóan összhangban az itt vita tárgyát képező alkalmazásokkal.

Az úgynevezett „differential displays módszer legjobb esetben a kifejeződés egy félkvantitatív vizsgálatát teszi lehetővé. A PCR-rel megsokszorozott kifejeződési termékeket gélelektroforézissel választják el. Az állítás megbízhatóságának a gélelektroforézis feloldóképessége szab határt. A módszer ezenkívül messze nem elég érzékeny és robosztus a rutin diagnosztikában való alkalmazáshoz [Liang, P. and Pardee, A.B., Science 257, 967-971].

Az erősen túlzottan vagy gyengén kifejeződő géneket gyakran szubtraktív (kivonó) technikákkal azonosítják. Ezeknél egy vizsgálandó sejt- vagy szövetfajta cDNS kiónjait szélesztik. Ezt hibridizáltatják egy összehasonlító anyag cDNS-ével. Kifejeződési mintázat így nem állapítható meg hitelesen.

Az amerikai „Human Genome Project egyik tevékenysége kifejeződött gének rendszeres szekvenálása. Az ebből adódó információk felhasználhatók olyan expressziós chip-ek építésére, amelyek egy sejt- vagy szövetfajta gyakorlatilag minden kifejeződött szekvenciájának vizsgálatát egyetlen kísérletben teszik lehetővé .

2.2. Rákos megbetegedések analízisének jelenlegi technikája

Rákos megbetegedés, tehát a sejtek elfajulásának kiváltó oka

·..· ·..· ·..· Γ mindig mutáció a génekben. Ezeknek a mutációknak az okozói lehetnek exogén hatások, de a sejtekben bekövetkező események is. Kevés kivételes esetben egyetlen egy mutáció - amely azután persze gyakran a genom nagyobb részét érinti (transzlokációk, deléciók) - vezet a sejtek elfajulásához, legtöbbször azonban mutációk láncolata különböző géneken az, amely együttesen a rosszindulatú betegség kiváltója. Ezek a DNS szintjén bekövetkezett események RNS és fehérje szinten tükröződnek. Itt nagy valószínűséggel sokszorosítás lép fel, mivel bizonyára sok esetben egy RNS mennyisége és milyensége befolyásolja egy másik RNS fajta szintézisének kiterjedését. Ez a megfelelő fehérjék megváltozott szintézis arányaihoz vezet, amely kisiklathatja az anyagcserét és ezáltal szabályozó és ellentétesen szabályozó mechanizmusokat indít el. Az eredmény az érintett sejteknek egy egészen specifikus (de messzemenően meghatározhatatlan) , jellegében és módjában megváltozott génkifejeződési mintázata, amely specifikus egy bizonyos rákféleségre és specifikus a rákféleség stádiumára és specifikus a karcinóma rosszindulatúságának fokozatára. Az ilyen jelenségek máig kimaradtak minden természettudományos megfigyelésből. Ugyanis nem volt lehetőség egy sejt génkifejezésének vagy anyagcseréjének összeségében történő vizsgálatára. A chiptechnológiával adódott először ilyen lehetőség [Schena, M. et al., Science 270, 467-470].

Amikor daganatok korai diagnózisának problémáját molekuláris síkon akarjuk megoldani, a mai napig - kevés kivételtől eltekintve - áthidalhatatlan nehézséggel szembesülünk: Mivel a legtöbb daganat esetében az okozati molekuláris eseményeket - azaz a kü ·· ·· ·· · ··?· lönböző mutációkat - csak töredékesen tekintik át, a gyógyászati vizsgálati anyagnál nem tudni, mit is kell keresni. Ez azt jelenti, hogy a polimeráz láncreakció hallatlanul nagy érzékenységét és specifitását nem tudjuk kihasználni. Kivételek például bizonyos béldaganatok, a Ewing-szarkóma és bizonyos leukémia változatok, amelyeket ténylegesen mindig egy pontosan körülírt mutációval definiálnak. Itt az egyetlen elfajult sejt milliónyi normális sejt között azonosítható. Kétségtelenül ezek között a látszólag egyértelműen definiált daganatcsoportok között is olyan magatartásbeli különbözőségek vannak, amelyekre következtetni kell, hogy további ismeretlen genetikai paraméterek (mint például az egyedek genetikai háttere is) fontos szerepet játszanak. Az immunológiai tumormarkerek segédanyagok, amelyek továbbra is csak egy szerény hozzájárulást jelentenek az egyéb szokásos diagnosztikai paraméterek mellett. Ezek arra szolgálhatnak, hogy gyanús sejteket előre kiválogassunk.

Elengedhetetlenül fontos szerepet játszik a hisztológia elfajult szövetek azonosításában, de nem a korai felismerésben.

Mivel a legtöbb daganat diagnosztikai célból molekuláris síkon nem elegendően körülírt, nincs is minden esetben lehetőség stádium szerinti felosztás vagy akár veszélyességi fok szerinti felosztás elvégzésére. Egy ilyen felosztás azonban nem nélkülözhető a kezelések jobb beállításához és mindenekelőtt hatásosabb új gyógyszerek és a génterápia fejlesztéséhez.

2.3. A technika mai állása a kutatásban a magasabbrendű szervezetek sejtjei lehetőség szerinti stabil állapotainak számát, fajtáját és tulajdonságait tekintve

·..· ·..· ·..· : ··?·

Az utóbbi időben nő az olyan utalások száma, hogy kompelx szabályozó rendszerek (amelyekre egy kiemelt példa a sejtek irányítása) — egy kritikus minimális komplexitás fölött és egy kritikus maximális konnektivitás (azon komponensek átlagos száma, amelyekkel egy kívánt komponens kapcsolva van) alatt szabadon mozogva — csupán korlátozott számú stabil állapotban képesek létezni [Kauffman, S.A., Origins of Order, Oxford University Press (1993)] . Ebben az összefüggésben az állapot szó az általános jelenség számára a választás fogalmaként értendő. Sejtekkel, mint biológiai szabályozó rendszerekkel összefüggésben beszélhetünk a differenciálódás állapotáról vagy sejttípusról is. Jóllehet semmi ilyen összefüggést, még csak biológiai rendszerekre a lehetséges állapotok korlátozását sem bizonyították, a gyakorlati implikációk beláthatatlanul fontosak lennének: Ha egy szervezet sejtjeinek állandó információ-tartalma (de facto messzemenően ez az eset egy fajon belül) mellett stabil állapotoknak csupán korlátozott száma lenne adott, úgy valószínű lenne, hogy elfajult sejtek is csak ezen állapotok egyikében vagy a lehetséges állapotok közötti átmenetben létezhetnének. Egyelőre nincs lehetőség ezen állapotok molekuláris definíciójára. Az egyes állapotok és a sejtek viselkedése közötti összefüggés felállítása a technika mai szintjén alig megvalósítható. Egy ilyen analízis azonban betegségek diagnosztikájához és előrejelzéséhez döntő hozzájárulást nyújthatna. Sőt, talán lehetőség lenne a megbetegedett sejtek lehetséges állapotai és a leginkább megfelelő terápia közötti összefüggés felállítására. Továbbá egy ilyen módszer valószínűleg döntően befolyásolhatná egy kezelés időpontjának a megvá

·..· ·..· ; ··»· lasztását. Ha például azt találnánk, hogy egy daganat sejtjei lehetséges állapotok közötti átmenetben találhatók, úgy feltételezhetnénk, hogy sejtek ilyen populációja a kezelés során előálló szelekciós nyomás hatására engedékenyebbé válna és ezáltal könnyebben megmenekülhetne. Egy sejtpopuláció ilyen esemény során, ilyen átmeneti állapotokban lényegesen megnövekedett flexibilitással rendelkezik és könnyen egy olyan lehetséges stabil állapotba kényszeríthető, amelyben elveszne a szelekciós nyomás, tehát a kezelés hatástalan lenne. Egy olyan eljárás, amely sejteket és sejtcsoportokat állapotok szerint osztályozni tudna, hozzájárulna az ilyen problémák felismeréséhez, megértéséhez és adott esetben megoldásához. A technika mai szintjén nincs lehetőség annak megállapítására, vajon a sejteknek csak korlátozott számú állapota van-e. Ebből következik, hogy nincs lehetőség sejtek csoportjainak egy absztrakt kritérium szerint történő megkülönböztetésére és ezen állapotok alapján a sejtek bizonyos viselkedésének az előrejelzésére.

2.4. Örökletes betegségek

Az emberi genom genetikai térképe ma 2500 úgynevezett mikroszatellitából áll. Ezt az eszközkészletet veszik igénybe gének legtöbbször a meghibásodás esetén genetikai betegséget okozók másolatainak kapcsolási analízissel (Kopplungsanalyse) történő lokalizálásához és ahhoz kapcsolódó azonosításához. A gyakori, súlyos és egyetlen hibás gén által okozott genetikai betegségek ily módon a genetikusok szemszögéből tisztázottak. Elvileg a több gén által okozott betegségek is megérthetők ezen a módon. A több gén által okozott betegségek közül sok nagyon gyakori, any8 ............... ·· ·· · *♦ · * **t* nyira gyakori, hogy az úgynevezett népbetegségek körébe tartozik. Asztma és diabetes ilyenre példa. Sok rákbetegség fajta szintén idetartozik. A fentiekben vázolt kapcsolási analízis stratégia alkalmazása szintén hatalmas kezdeti sikereket hozott. Fontos több génes megbetegedések - mint diabetes, skizofrénia, aterioszklerózis, zsírkor - számos kiváltó génjét megtalálták már. A tulajdonképpeni molekuláris biológiai labortechnikák mellett ezen betegségek genetikai feltárásának döntő feltétele, hogy viszonylag nagy számban állnak rendelkezésre a mindenkori betegségben szenvedő betegek és rokonok. Az utóbbi két évben meg kellett állapítanunk, hogy az eredetileg a több génes betegségek kapcsolási analíziséhez felvett néhány száz beteg nagy valószínűséggel egy nagyságrenddel alábecsült. Ez minden esetben akkor érvényes, ha az okozó gének spektrumának teljes tisztázásáról van szó. Mivel egy ilyen kapcsolási analízis teljesítésének gyakorlati munkája rendkívül nagy kiterjedésű, a több génes betegségek analízisében csak nagyon lassú lépésekben történő előrehaladással számolhatunk. Mivel éppen ezek a betegségek rendkívül nagy szociális és gazdasági jelentőséggel bírnak, folyamatban van alternatív stratégiák keresése.

2.5. DNS-chip technika

Minden fejlesztés között kétségtelenül az Affimetrix elve (például az U.S.P. 5,593,839, 5,999,695, vagy 5,631,734 számú szabadalmi iratok) jutott a legmesszebbre. De számos más cég és kutatóprogram is előállított speciális alkalmazásokhoz különböző tulajdonságú DNS-chip-eket (például az U.S.P. 5,667,667,

5,525,464 vagy 5,492,806 számú szabadalmi iratok) [ Goffeau, A.,

*..· *~· .· ··;·

Nature 385, 202-203; Weiler, J. and Hoheisel, J., Anal. Biochem. 243, 218-227; Chee, M. et al., Science 274, 610-614] . A legújabb közlemények már egy kereskedelemben hozzáférhető HIV-chip-ről tudósítanak, amely a teljes HÍV genom vizsgálatát lehetővé teszi. 400000 oligonukleotid hosszúságig fluoreszcens jelölésű PCR termékekkel hibridizálják a vizsgálandó próbát. A szignálok kiértékelése CCD kamerák segítségével történik. Az ilyen rendszerek már régóta ismert allélspecifikus hibridizációra való hajlamát használják ki. Ez azt jelenti: Csak ott marad szignál a hibridizációs és mosási műveletek végén, ahol a próba teljesen komplementer egy rögzített oligonukleotiddal. Ismert génszekvenciának mutációkra történő vizsgálata sikerül, mert a teljes szekvenciának nemcsak minden részterülete oligonukleotid szekvenciák formájában a mátrixon található, hanem mert ez minden, a normális szekvenciától való lehetséges eltérést is igazol. A chip-eljárás hatékonysága részben abból ered, hogy két egyszerű munkalépéssel, nevezetesen a hibridizációval és a mosással, megkapjuk gének vagy génfajták másolatának szekvencia információj át.

2.6. A hosszúság mérésének analízis módszerei

A találmány szerinti eljárások néhány megvalósítási formája a művelet végén megkövetel egy extrém gyors és pontos tömegmeghatározást. Mivel minden tízezredik adatponthoz fragmentumhosszúság mérést kell végezni, különösen nagyhatékonyságú mérőrendszerre van szükség. Ehhez a technika mai állásának megfelelően automatikus szekvenáló készülékek (U.S.P. 4,811,218 számú szabadalmi irat), kapillár-elektroforézis [például Woolley, A.T.

et al., Anal. Chem.68, 4081-4086] , MALDI-TOF [Siegert, C.W. et al., Anal. Biochem. 253, 55-65] és kémiai jelzésekkel való felbontások (WO 95/04160 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés) jöhetnek szóba. A technika mai szintjén ezek - még ha jelentős módosításokkal és a találmány szerinti eljárás újszerű logikájába történő beleképzeléssel is - hatékonyan megvalósíthatók.

2.6.1. Tömegspektrometriás eljárás

Rövid DNS szekvenciák tömege MALDI-TOF tömegspektrométer segítségével precízen vizsgálható. Továbbá létezik egy olyan eljárás, amely ezt az analízis módszert primer extenziós reakciókkal kombinálja. Ezeknél például specifikus ^szekvenciával rendelkező oligonukleotidot DNS próbával hibridizáltatnak és reakciónként a négy nukleotid közül csak egyet adnak hoizá. A nukleotidok közül amelyik a hibridizációt követően egy polimeráz segítségével az oligonukleotid 3' -végére fölkerül, lehetővé teszi az oligonukleotid 3'-vége mögötti bázis azonosítását. Többek között létezik ennek a módszernek egy olyan változata, amely lehetővé teszi olyan ismétlődő szekvencia hosszúságának a meghatározását, amely a négy lehetséges bázis közül csak kettőt tartalmaz. Ehhez az előforduló bázisokkal komplementer természetes nukleotidokat és egy vagy mindkét további, oly módon módosított nukleotidot adnak a polimeráz reakcióhoz terminátorként, hogy az ismétlődő szekvencia mögött a reakció megszűnjön. A terminátorok normális esetben ddNTP-k. A hosszúságmérésből azután levezethető az ismétlődő szekvencia hosszúsága.

·· ·« · · * *

2.7. Metilezettség analízis

A genomiális citozin bázis 5'-metilcitozinná történő módosulása mai napig a legfontosabb és legjobban tanulmányozott epigenetikus paraméter. Mégis a mai napig alig van módszer, amely felderítené sejtek és egyedek átfogó genotípusait, de még összehasonlítható toldalékok sincsenek nagy tömegben epigenotípusos információk rendszerezésére és kiértékelésére.

Elvében három különböző módszer létezik egy citozin 5-metil státuszának meghatározására a szekvenciában.

Az első elvi módszer restrikciós endonukleázok (RE) használatán alapul, amelyek érzékenyek a metilezettségre. A restrikciós endonukleázok azzal tűnnek ki, hogy meghatározott DNS szekvenciába - legtöbbször 4 és 8 bázis hosszúság között - a DNS-be hasítást visznek be. Ilyen hasítások helyzete azután meghatározható gélelektroforézissel, membránra történő felvitelt követő hibridizációval. A metilezettségre való érzékenység azt jelenti, hogy a felismerési szekvenciában bizonyos bázisoknak nemmetílezett állapotban kell lenniük ahhoz, hogy a hasítás bekövetkezzen. Restrikciós hasítás és gélelektroforézis után a sávok mintázata a DNS metilezettség-mintázata szerint megváltozik. Kétségtelenül a legtöbb metilezhető CpG a restrikciós enzimek felismerési szekvenciáján kívül esik, tehát nem vizsgálható.

Ezeknek a módszereknek az érzékenysége nagyon alacsony [Bird, A.P., Southern, E.M., J. Mól. Bioi. 118, 27-47]. Egy változat PCR-t kombinál ezzel a módszerrel; a felismerési szekvencia két oldalán fekvő két primerrel végzett amplifikáció (sokszorozás) egy hasítás után csak akkor következik be, ha a felis12 • ♦ · * · * · %.· · .· ·τ mérési szekvencia metilezett. Az érzékenység ebben az esetben elméletileg a célszekvencia egyetlen molekulájára emelkedik, persze nagy ráfordítással csupán egyedi helyzetek vizsgálhatók [Shemer, R. et al. , PNAS 93, 6371-6376].

A második változat a teljes DNS részleges kémiai hasításán alapul egy Maxam-Gilbert-féle szekvenáló reakció példája szerint, az így keletkezett végekhez adapterek ligációjával, generikus primerekkel történő sokszorosítással és gélelektroforézises felbontással. Ezzel az eljárással ezer bázispárnál kisebb nagyságú, meghatározott területek vizsgálhatók. Az eljárás azonban olyan bonyolult és megbízhatatlan, hogy gyakorlatilag már nem használják [Ward, C. et al., J. Biol. Chem. 265, 3030-3033].

DNS-nek 5-metilcitozinra történő vizsgálatára egy új módszer a hidrogénszulfit és citozin specifikus reakcióján alapul. Ez a megfelelő körülmények között uracilra változik, amely bázispárosodási sajátsága révén timinnek, tehát egy másik bázisnak felel meg. Az 5-metilcitozin nem módosul. Ezáltal az eredeti DNS-t úgy változtatják meg, hogy a metilcitozin - amely eredetileg hibridizációs viselkedésében citozintól nem különböztethető meg - most „normális molekuláris biológiai technikákkal kimutatható lesz. Mindezek a technikák a bázispárosodáson alapulnak, amely így teljes mértékben kihasználható. A technika mai szintjén, ami az érzékenységet érinti, egy olyan eljárással definiálható, amely a vizsgálandó DNS-t agaróz-mátrixba zárja, ezáltal megakadályozza a DNS diffúzióját és renaturálódását (hidrogénszulfit csak egyszálú DNS-sel lép reakcióba) és minden kicsapási és tisztítási *· »· *·· * * ·* lépést gyors dialízissel helyettesít [Ölek, A. et al., Nucl. Acids Res. 24, 5064-5066]. Ezzel a módszerrel egyedi sejtek vizsgálhatók, amely a módszer erősségét szemlélteti. Mindenesetre eddig csak körülbelül 3000 bázispár hosszúságig terjedő egyedi régiókat vizsgáltak, sejtek teljes vizsgálata lehetséges metilezési események ezreire nem lehetséges. Azonkívül ez az eljárás csekély mennyiségű próbából származó nagyon kis fragmentumokat sem képes megbízhatóan analizálni. Ezek a mátrixon keresztüli diffúzió védelme ellenére elvesznek.

2.8. A hidrogénszulfit-technika alkalmazása a technika mai állása szerint

A hidrogénszulfit-technikát eddig — kevés kivételtől eltekintve —csak a kutatásban alkalmazták [ Zeschnigk, M. et al. , Eur. J. Hum. Gen. 5, 94-98; Kubota, T. et al., Nat. Genet. 16, 16-17] . Ismert gén specifikus rövid darabjait azonban mind gyakrabban hidrogénszulfit kezelést követően megsokszorozzák és vagy teljes egészében szekvenálják [Ölek, A. and Walter, J., Nat. Genet. 17, 275-27 6] , vagy egyedi citozin helyeket „primer extenziós reakcióval [ Gonzalgo, M.L. and Jones, P.A., Nucl. Acids Res. 2_5, 2529-2531] vagy enzimes hasítással [Xiong, Z. and Laird, P.W., Nucl. Acids Res. 25, 2532-2534] . Az összes fenti publikáció 1997-ből való. Komplex metilezettség-mintázat komplex genetikai betegségek fenotípusos adataival való korrelációba állításának, de még kevésbé egy kiértékelő algoritmus — mint például egy neuronokból álló hálózat — segítségével történő kiértékelésének elgondolását ezideig nem említik az irodalomban és a technika mai állása szerint metodikailag nem is kivitelezhető.

.... „ ..... .

* · · *4 »

·.,·‘ J*

3. A találmány kitűzött feladata és annak megoldása

Összefoglalva, a technika mai szintje olyan gyengeségeket mutat, amelyeket a találmány szerinti eljárás megold.

A feladatot úgy oldjuk meg, hogy rendelkezésre bocsátunk egy szövetek és sejttípusok jellemzésére, osztályozására és megkülönböztetésére szolgáló eljárást, szövetek és sejtcsoportok viselkedésének előrejelzésére és kifejeződésükben megváltozott gének azonosítására, ahol egy kívánt szövetmintából kinyert kezeletlen, elvágott vagy restrikciós endonukleázzal hasított genomiális DNS-ben a citozint — 5 metilcitozint azonban nem — önmagában ismert útonmódon hidrogénszulfit oldattal uracillá alakítjuk, az így kezelt genomiális DNS frakcióit megsokszorozzuk vagy nagyon rövid vagy degenerált oligonukleotidok, vagy olyan oligonukleotidok alkalmazásával, amelyek a hidrogénszulfitos kezelés előtt az elhasított DNS végeihez ligáit adapter oligonukleotidokkal komplementerek, a megsokszorozott frakciókból a guaninban gazdag DNS szálon megmaradó citozinoknak és/vagy a citozinban gazdag DNS szálon levő guaninoknak összesen olyan mennyiségét mutatjuk ki hibridizációval vagy polimeráz láncreakcióval, hogy egy ilyen vizsgálatban keletkezett és automatikusan egy feldolgozó algoritmusra átvitt adatok az analizált sejt fenotípusára visszakövetkeztetést tegyenek lehetővé.

A találmány szerint előnyös, hogy fenotípusosan azonos vagy hasonló sejtekből vagy szövetekből származó DNS próbákra elvégzett több vagy sok ilyen kísérletnek ****»*^J _< ««« « .

*»> ·/· ?' ebből az analízisből nyert adatait tréning-fázisban egy neuron hálózaton vagy más kiértékelő algoritmusokon keresztül korrelációba állítja azoknak a sejteknek a fenotípusával, amelyeknek a DNS-ét vizsgáljuk, az ennél a tréning-fázisnál a kiértékelő algoritmusba a fenotípus és metilezettség-mintázat közötti összefüggésről felvett adatokat ahhoz használjuk fel, hogy egy ismeretlen eredetű DNS próba metilezettség-mintázatának rendszerezése által levezessük azoknak a sejteknek a fenotípusát, amelyeknek DNS-ét vizsgáljuk, vagy az ennél a tréning-fázisnál a kiértékelő algoritmusba egy ismert sejttípus DNS-ének metilezettség-mintázatáról felvett adatokat ahhoz használjuk fel, hogy olyan citozin helyeket azonosítsunk, amelyek a vizsgált DNS-ben a tréning-fázisban megállapított metilezettség-állapottól eltérnek.

A találmány szerint előnyös továbbá, hogy a DNS-t a hidrogénszulfitos kezelés előtt olyan restrikciós endonukleázokkal hasítjuk, melyeknek felismerési szekvenciájában a citozin 5' CpG-3' környezetben található és a DNS-t ezen felismerési szekvenciák közül csak azokban hasítják, amelyekben a citozin 5' CpG-3' környezetben, az 5' -helyzetben nem-metilezett állapotban fordul elő.

A találmány szerint előnyös továbbá, hogy mielőtt a genomiális DNS-t önmagában ismert úton-módon hidrogénszulfit oldattal módosítjuk, ezt a genomiális DNS-t restrikciós endonukleázzal hasítjuk, a keletkezett végeket ligációs reakcióval ismert, rövid és

kétszálú — adapternek is nevezett — DNS szekvenciákkal látjuk el, a hidrogénszulfittál kezelt adapterekkel komplementer oligonukleotidokat arra használjuk, hogy minden így keletkezett DNS fragmentumot vagy minden így keletkezett fragmentum összességéből szub-populációkat hidrogénszulfitos kezelést követően megsokszorozzunk.

Emellett előnyben részesítjük, hogy egy genomiális DNS próba hidrogénszulfit oldattal történő reakciója — citozinok uracilokká való átalakítása céljából, metilcitozinok egyidejű megtartásával — 0 °C és 100 °C közé eső reakció-hőmérséklet ciklikus változtatása mellett játszódik le.

Előnyben részesítjük azt is, hogy a hidrogénszulfitos kezelés előtt a DNS próbákat egy termosztálható, csak kis molekulákat átengedő porózus kapillárison vezetjük át, amelyben a hidrogénszulfitos kezelés következő reakciólépéseit, a reagensek odaés elvezetését dialízissel valósíthatjuk meg.

A találmány szerint előnyben részesítjük továbbá, hogy a hidrogénszulfitos kezelés előtt a DNS próbákat egy termosztálható, kis molekulák számára nem áteresztő kapillárison vezetjük át, amelyben a hidrogénszulfitos kezelés következő reakció lépéseit, a reagensek oda- és elvezetését hozzákapcsolt kapillárison keresztül valósíthatjuk meg.

Ezenkívül a találmány szerint előnyös, hogy a hidrogénszulfitos kezeléshez kapcsolódó polimeráz láncreakciókat ugyanabban a kapillárisban, mint a hidrogénszulfitos kezelést, vagy ehhez a kapillárishoz kapcsolódó kapillárisban, vagy ehhez a kapilláris17 ...............

• · · · · · · · hoz kapcsolt tartályban végezzük el.

Szintén előnyös, hogy egy kapillárisban, amelyben a hidrogénszulfittál kezelt DNS próbával polimeráz láncreakciót végzünk, a keletkezett fragmentum populáció hosszúság szerinti elválasztását is elvégezzük.

Továbbá előnyben részesítjük, hogy a hidrogénszulfit kicsapása révén attól egy kezelt DNS elválasztható.

A találmány szerint előnyben részesítjük továbbá, hogy a hidrogénszulfittál kezelt genomiális DNS próbák megsokszorozásához két osztályba tartozó oligonukleotidokat kombinálunk, ahol az első osztályba tartozó oligonukleotidok citozin bázist vagy annak analógját nem — kivéve 5' -CpG-3' környezetben nagyon csekély mennyiségben vagy az oligonukleotidnak csak a sokszorozás szempontjából lényegtelen területein — tartalmazzák, és ahol a második osztályba tartozó oligonukleotidok guanin bázist vagy annak analógját nem — kivéve 5' -CpG-3' környezetben nagyon csekély mennyiségben vagy csak a sokszorozás szempontjából lényegtelen, például az oligonukleotid 5'-régiójában — tartalmazzák és ahol mindkét osztálybeli oligonukleotidok vagy

a) olyan rövidek, hogy mindkét osztálynak csak egy-egy képviselőjével történő sokszorozásnál több, mint száz különböző fragmentum sokszorozódik, vagy

b) ezek az oligonukleotidok olyan sok úgynevezett degenerált helyet tartalmaznak, hogy mindkét osztálynak csak egy-egy képviselőjével történő sokszorozásnál több, mint száz különböző fragmentum sokszorozódik, vagy

c) mindkét osztálybeli oligonukleotidból olyan sok képvi

...............

• · · · · · « · · · «· · · selőt alkalmazunk a sokszorozásnál, hogy több, mint száz különböző fragmentum sokszorozódik.

Adott esetben előnyösen előirányozzuk, hogy a kezelt és megsokszorozott DNS-t egymástól elválasztott tételekben polimeráz láncreakció céljából minden reakcióban különböző oligonukleotidokkal keverjük össze, amelyek 5' -végükön az adapterekhez vagy általánosan a hidrogénszulfittal kezelt oligonukleotid sokszorozásához komplementerek, amelyek 3' -végükön minden reakcióban különbözőek és amelyeknek változó 3' -végei az ismert adapter-szekvencia vagy oligonukleotid-szekvencia mögött kezdődnek és amelyeknek változó 3' -végei az ismert adapter-szekvencián keresztül két és tizenkét nukleotid között az ismeretlen templát DNS szekvenciába benyúlnak.

Másrészt emellett különösen előnyben részesítjük, hogy olyan reakciók, amelyekben polimeráz láncreakciót a hidrogénszulfittál kezelt DNS-sel komplementer oligonukleotidokkal indítunk, a három nukleotidon — dATP, dTTP és dCTP — és ezen három nukleotid analógjain kívül citozin bázissal komplementer nukleotid analógot tartalmaznak, amely a polimeráz segítségével történő beépülést követően minden további szálhosszabbítást megakadályoz, vagy egyáltalán nem tartalmaznak citozin bázissal komplementer nukleotidot vagy nukleotid analógot.

A találmány szerint emellett előnyben részesítjük továbbá, hogy olyan reakciók, amelyekben polimeráz láncreakciót a hidro

...............

• · · · · · • · ·· « · · · génszulfittal kezelt DNS komplementer DNS-ével komplementer oligonukleotidokkal indítunk, a három nukleotidon — dATP, dTTP és dGTP — és ezen három nukleotid analógjain kívül guanin bázissal komplementer nukleotid analógot tartalmaznak, amely a polimeráz segítségével történő beépülést követően minden további szálhosszabbítást megakadályoz, vagy egyáltalán nem tartalmaznak guanin bázissal komplementer nukleotidot vagy nukleotid analógot.

Egészen különösen előnyben részesítjük emellett, hogy a polimeráz láncreakció terminációja azokon a helyeken, amelyeken a DNS próba előzőleg metilcitozint tartalmazott, olyan terminátorokkal megy jól végbe, amelyek maguk is olyan úton-módon módosítottak, hogy lehetővé teszik a specifikusan terminált polimeráz reakciótermékek kimutatását.

Továbbá a találmány szerint előirányozzuk, hogy a különböző, az egyes reakciós tételek megfelelő kombinációjából eredményül kapott fragmentum keverékeket MALDI-TOF vagy más tömegspektrométer ionforrásának egyedi pontjaira visszük fel és az egyes reakciók fragmentum-összetételét az összes DNS fragmentum tömegének meghatározása révén állapítjuk meg.

Előnyben részesítjük továbbá, hogy a különböző, az egyes reakciós tételek megfelelő kombinációjából eredményül kapott fragmentum keverékeket gélelektroforézis egyedi pályáira visszük fel és az egyes reakciók fragmentum-összetételét az összes DNS fragmentum hosszúságának megmérésével határozzuk meg.

A találmány szerint előnyösen előirányozzuk, hogy a találmány szerint definiált oligonukleotidokat — amelyekkel a poll meráz láncreakciókat indítjuk — olyan, különböző szekvenciájú oligonukleotidonként különböző kémiai jelzésekkel (Markierungen) kapcsoljuk, hogy ezek kémiai és/vagy fizikai sajátságai a különböző jelzéseknek a használatos kromatográfiás vagy tömegspektrometriás eljárásokkal való kimutatását és megkülönböztetését tegyék lehetővé.

Ennél különösen előnyös, hogy a vizsgálandó, hidrogénszulfittál kezelt DNS első sokszorozási lépésben előállított fragmentum frakcióját egyidejűleg két vagy több, kémiailag eltérően jelzett oligonukleotiddal keverjük össze, ezeket az oligonukleotidokat egy reakció-összetételben a polimeráz láncreakció primereként használjuk fel, a fragmentumok előállott komplex keverékét első analitikai lépésben elektroforézissel történő, hosszúság szerinti felbontásnak vetjük alá és az elektroforézissel kapott fragmentum keverékek egyes hoszszúság szerinti frakcióit kromatográfiás vagy tömegspektrometriás analízisnek vetjük alá, amely minden hosszúság szerinti frakcióban detektálja az oligonukleotidokat jellemző kémiai jelzések (Markierungen) jelenlétét vagy hiányát.

A találmány szerint továbbá előirányozzuk, hogy felületre viszünk fel oligonukleotidokat, amelyek vagy citozin bázist vagy annak analógját nem — csak 5' -CpG-3' környezetben vagy csak próba DNS-sel való hibridizációhoz lényegtelen területeken — tartalmazzák, vagy guanin bázist nem — csak 5' -CpG-3' környezetben vagy csak próba DNS-sel való hibridizációhoz lényegtelen területeken — tartalmazzák.

Emellett a találmány szerint előnyben részesítjük, hogy a hidrogénszulfittal kezelt és a találmány szerint megsokszorozott próba DNS-t felületen rögzített oligonukleotidokkal hibridizáltatunk, amelyeket önmagában ismert úton-módon úgy rögzítettünk ehhez a felülethez, hogy a felület minden pontjáról tudható, melyik oligonukleotid-szekvencia található pontosan azon a ponton; a megsokszorozott próba DNS és a rögzített oligonukleotidok között akkor következik be hibridizáció illetve megfelelő mosási lépések után akkor marad meg, ha az oligonukleotidok és a próba DNSek a hibridizáció szempontjából lényeges területeken teljes mértékben egymás komplementerei.

A találmány további tárgyát képezi egy kit, amely a találmány szerint definiált komponensek közül legalább kettőt (például hidrogénszulfittal kezelt DNS sokszorozásához való oligonukleotidok és — a kimutatáshoz mátrixon rögzített oligonukleotidok kombinációját) a DNS-nek hidrogénszulfittal való kezeléséhez, e kezelt DNS sokszorozásához és azt követően egy emlős genom több, mint száz CpG dinukleotidjának metilezettségállapot felméréséhez — egyetlen reakcióban úgy kombinál, hogy egy rákbetegség klinikailag releváns diagnózisa felállítható legyen .

Az eljárás megoldja különösen nagy mennyiségű olyan paraméter meghatározásának feladatát, amelyek a sejtek viselkedésére nézve diagnosztikus jelentőségűek. Ezért a sejtek analízisére egy teljesen új elgondolást kell kidolgozni, ehhez egy teljesen új kiértékelő mechanizmust kapcsolni és továbbá az adatok rendszerezésére rendelkezésre bocsátani a technikai alapokat. Az eljárás először használja ki a citozin metilezettségének potenciális informativitását és rendelkezésre bocsátja az ehhez szükséges analitikai eljárásokat és ezekkel összekapcsolt kiértékelő algoritmusokat. Ezért a találmány szerinti eljárás arra szolgál, hogy kimutathatóvá tegyen örökletes hibák által érintett sejtek esetében olyan szekunder gén lókuszokat, amelyek a technika mai szintjén elvileg nem, vagy csak nagyon nehezen derithetők ki: Az eljárás kimutat olyan genetikailag megváltozott lókuszokat, amelyeknek (ennélfogva talán epi-) genetikai változásai a bázissorrendben nem okoznak valódi változásokat. A találmány szerinti eljárás ezen az úton új terápiás stratégiai célokat nyit meg. A találmány továbbá megoldja elfajult sejtek oly módon történő osztályozásának feladatát, hogy lényegesen több és pontosabb összefüggést találjunk (epi-)genotípus és fenotípus között, mint ami a technika mai állása szerint lehetséges. A találmány szerinti eljárás ezen túl lehetővé teszi elfajult sejtek valószínű jövőbeni viselkedésének és ilyen sejtek testen belülről vagy kívülről jövő stimulusokra adott reakciójának előrejelzését. Ez végső soron segítséget nyújt rákos megbetegedéseknél a legjobb terápia kiválasztásánál. Az eljárás lehetővé teszi továbbá daganatsejtek genetikai és/vagy biokémiai közösségeinek meghatározását, amelyek fenotípusosan hasonlóak, ám genotípusosan (amennyire a technika mai szintjén ez meghatározható) különbözőek. A feltételezés - amelyen az eljárásnak ez az igénye alapul — abból áll, hogy a legkülönbözőbb genotípusok nagyon hasonló epigenotípusokhoz és ezáltal nagyon hasonló fenotípusokhoz vezethetnek. Ezáltal a javasolt eljárásnak is módjában áll a daganatsejtek génkifejeződésében olyan változások kimutatása, amelyeket nem, vagy csak közvetetten a bázissorrend megváltozása okoz.

4. A feladat megoldásának részletes leírása a találmány szerinti eljáráson keresztül

A javasolt eljárás a vázolt feladatot innovatív úton-módon oldja meg a szakmában ismert különböző eljárások kombinációjával és javításával. Ezeknek az önmagukban ismert eljárásoknak bizonyos módosításai azt szolgálják, hogy ezeket az új kihívásokhoz oly módon illesszük hozzá, hogy egy merőben új összetett eljárás álljon elő, amelyet a következőkben előnyben részesített megvalósítási formák alapján és példákon keresztül fejtünk ki.

4.1. DNS próba előkezelése a hidrogénszulfit oldattal történő kezelés előtt

Alapvető eljárási lépések — mint például a szövet vagy sejt izolálások és az ezekből történő DNS kivonás — önmagukban ismert úton-módon történnek. A DNS extrakciója a további analízishez mindenesetre az előnyben részesített megvalósítási formáknál többnyire nagyon kis térfogatban történik, mint a tulajdonképpeni hidrogénszulfitos kezelés maga, egy réteg olajban, amely megakadályozza a külvilággal való érintkezést. Ez arra szolgál, hogy a DNS veszteséget olyan csekély értéken tartsuk, hogy a legkisebb kiindulási anyagmennyiségeknél· is szavatoljuk a repro dukálható eredményt. A DNS extrakciója sejtekből vagy szövetekből közvetlenül is történhet az alábbiakban leirt kapillárisban, amelyben azután az összes következő reakció elvégezhető. Az extrakciós térfogat korlátozása mindenesetre nem szükséges alkotórésze a javasolt eljárásnak.

A kivont DNS most már alávethető kezeletlenül a hidrogénszulfitos kezelésnek, elvágható vagy restrikciós endonukleázokkal specifikusan hasítható.

A találmány szerinti eljárás ezen a ponton két különböző eljárás változatra osztható. Az egyik változat, amelyen belül az egyes metilcitozin helyek legvégső kimutatását oligonukleotidokkal történő hibridizációval végezzük, ennél a pontnál normális esetben nem igényli a DNS további előkezelését. A második változat azzal jellemezhető, hogy a DNS próba genom szélességű megsokszorozását olyan oligonukleotidokkal végezzük, amelyek a DNS végeihez ligáit, hidrogénszulfittál kezelt adapterekkel komplementerek, a ligációhoz szükség van a hasított DNS egyes fragmentumaihoz kapcsolódó ilyen adapterekre. Az adapterek rövid, kettős-szálú DNS molekulák, amelyek rendszerint az egyik végen egy egyszálú kiszögelléssel rendelkeznek. Ez a kiszögellés a hasított DNS próba végeivel komplementer úgy, hogy a próba DNS fragmentumának mindkét végére felvihető egy ilyen adapter megfelelő ligáz segítségével. Ehhez az adapterből olyan mennyiséget adunk, hogy arányaiban a fragmentum végek számához képest fölöslegben legyen. Az adaptereknek próba fragmentumokhoz történő ligációja azonban elvileg komplementer egyszálú kiszögellések nélkül is megoldható. Az egyes reakciók elve ismert a szakmában [ Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHLP (1989)], nem szükséges további kifejtése. Az adapterek ligációjának hidrogénszulfitos kezeléssel és azt követő genom szélességű sokszorozással való kombinációja elvében innovatív és sem az irodalomban, sem a találmányi irodalomban nem említik.

4.2. A hidrogénszulfitos módszer találmány szerinti módosításai

Minden találmány szerinti megvalósítási forma alapja egyszálú DNS hidrogénszulfittal történő módosításának módszere. Ahhoz, hogy néhány találmány szerinti megvalósítási formát lehetővé tegyünk, a hidrogénszulfitos módszer néhány módosítására van szükség .

Ennek a módszernek a fő változatai azon a tényen alapulnak, hogy nemcsak nagyon kis kiindulási anyagmennyiségeket kell használnunk (határesetben csak egy vagy néhány tíz sejtet), hanem néhány megvalósítási forma nagyon kicsi fragmentumok felhasználását is igényli. Másrészt a találmány szerinti eljárásnak a klinikai diagnosztikában való rutinszerű alkalmazásához szükség van minden eljárási lépés oly módon történő automatizálására, hogy a reprodukálhatóságnak lehetőség szerint magasabb fokát érjük el.

Ezért a hidrogénszulfitos módszer minden lépésének nagyon kis térfogatban, a „külvilág teljes kirekesztésével kell megtörténnie. A hidrogénszulfit reakciónak agaróz mátrixba történő bezárása ezen a területen - tekintettel a fragmentumok diffúziójára - már egy előrelépés, ennek ellenére a reakció még mindig • · · · · · · ·..· *..· ·.. · .· ··:· nagyon nagy térfogatú vizes hidrogénszulfit oldatban játszódik le. Ezáltal kicsi, fontos DNS fragmentumok az oldatba tudnak diffundálni és ily módon elvesznek a további analízis számára.

A találmány szerinti eljárás részét képezi a hidrogénszulfitos módszer kivitelezése nagy külső térfogatról való lemondással. A hidrogénszulfit reakciót például olaj alatt csupán 1-10 ml térfogatban végezzük el, így minden alkotórész egy robot által közvetlenül az olaj alá pipettázható és ott egyedi cseppeket formál, amelyekben minden további reakciólépés jól előrehalad. A technika mai szintjén szükséges koncentrációkkal rendelkező hidrogénszulfit oldat előállításának nehézségét és azt a tényt, hogy a technika mai szintjén ennek a dilemmának a feloldása alacsonyabb reakcióidő és kisebb hidrogénszulfit koncentráció alkalmazásával a DNS próba szignifikáns sérüléséhez vezet, a találmány szerinti eljárás megoldja.

Ez az eljárás azt a tényt használja fel, hogy a hidrogénszulfit reakció különböző reakciólépései egyensúlyi reakciók. Ezek az egyensúlyok a két fontos reakciólépésnél, a citozin szulfonálásánál és az azt követő dezaminálásnál állnak fenn. Különböző hőmérsékleteken a megfelelő (szulfonált vagy dezaminált) oldalon. Figyelembe véve a kinetikát, amelynek megfelelően a mindenkori egyensúlyok beállnak, szükségesnek bizonyul a hidrogénszulfit reakció ciklikus körülmények között, váltakozó hőmérsékleteken történő véghez vitele. Egy előnyben részesített megvalósítási formában a váltakozás 4 °C-ról (10 perc) 50 °C-ra (20 perc). Minden egyéb hőmérséklet és meghatározott hőmérsékletekhez tartozó reakcióidők a találmány szerinti

·..··..··..· ; *·ν eljárás oltalmi körébe tartoznak. Például meghatározott körülmények között előnyösnek bizonyulhat, ha lényegesen rövidebb reakcióidőket állítunk be. Az is hasznos és alapvetően újszerű, ha egy dezaminálási lépés (magas hőmérsékleten « 50 °C-on) és azt követő újabb szulfonálási lépés közé bevezetünk egy lépést, amelyben a vizsgálandó DNS-t újólag nagyon magas hőmérsékleten denaturáljuk. Nagymolekulájú DNS-ek denaturálási hőmérsékletei rendszerint 90 °C körül vannak, de az oltalom alatt álló eljáráson belül ez alatt is lehetnek. Ennek két oka van. Egyrészt léteznek olyan megvalósítási formák, amelyeknél nagyon rövid DNS fragmentumokat vizsgálunk. Másrészt a citozinoknak uracillá történő átalakulása következtében minden reakció-ciklusban csökken a szálak közötti komplementaritás. Ennélfogva egy ciklikus reakcióprotokoll nagyon komplex lehet. A denaturáció hőmérséklete az első ciklusokban lehet például 90 °C fölött, a későbbi ciklusokban azonban alacsonyabbra szabályozzuk. Többlépcsős reakciók minden vonatkozásban csak rendkívül költséges teszt sorozatokkal optimal!zálhatók. A javasolt védelem ezért általánosan ciklikusan vezetett hidrogénszulfit reakciókra vonatkozik.

A fent említett probléma egy további megoldása a technika mai szintjén az eljárás egy vagy több lépésének kapillárisba történő áthelyezésén alapul. Erre elvileg két változat létezik. A kapilláris lehet 1) vastag és 2) a szakmában ismert nagyon vékony, bizonyos oldószerekre nézve áteresztő dialízis tömlő.

Az 1) szerinti változatban a fent említett példákban leírt cseppet - a vizes oldatban DNS-sel, hidrogénszulfittál és gyökfogóval - kívülről fűthető és hűthető kapillárison vezetjük ke28 • « « « * · • · · · · · · • · · * · · · ··<» »* «· ·· · · resztül. A csepp a kapillárison belül folyadék- vagy gázfázis által izolálható. Minden reakció ezen a kapillárison belül zajlik, további reagensek torkolatokon keresztül adhatók hozzá. Mivel ez a kapilláris az 1) változat szerint kívülről teljesen lezárt, az ezután következő reakciólépésekhez természetesen mátrix oldatot kell hozzáadni, amely felveti a fent említett problémát és szükségessé válik a találmány szerinti megoldás.

A 2) változat szerint először csak a találmány szerint vagy más eljárási lépésekkel megfelelően előkezelt DNS oldatot vezetjük át a porózus kapillárison. A kapillárist magát a kapillárison belüli reakciólépésekhez szükséges oldatokat tartalmazó tartályon keresztül vezetjük át. Konkrétan ennél a változatnál a kapillárison belüli DNS oldatot először hidrogénszulfit oldaton vezetjük keresztül, amelyet vagy ciklikusan termosztálhatunk vagy állandó hőmérsékleten tarthatunk. Egy további lépésben a lejátszódott hidrogénszulfit reakció után a kapillárist dialízis oldaton, azután alkálikus oldaton majd végül egy további dialízis oldaton vezetjük keresztül. A kapillárisban elvégzett hidrogénszulfitos kezelés ezen lépései után - ezt egy további eljárás változatnak kell ismertetnie — ugyanabban a kapillárisban minden további PCR és primer extenziós lépés lejátszható. Abban az esetben, ha a különböző primereket a primer extenzióhoz a találmány szerint különleges kémiai módosítással jelöljük meg (markiért sind), akkor az összes PCR és primer extenziós lépésre közvetlenül elvégezhető ugyanazon kapilláris meghosszabbításában egy kapilláris elektroforézis. Ez hosszúság szerint bontja fel az extenziós termékeket, ezt követő tömegspektrometriás vagy kromatográfiás vagy optikai analízis azután a nagyság szerint összegyűjtött frakciókat kémiai jelölésük szerint választja szét és ezáltal a második analízis dimenzióban eredmény-spektrumot vagy eredmény-kromatogramot hoz létre.

Kapilláris alkalmazása a hidrogénszulfit és PCR és/vagy extenziós reakciókhoz egy másik, találmány szerinti kimutatási változat alkalmazását is megkönnyíti. A fragmentumok ugyanis közvetlenül a sokszorozás után egy kapillárisba vezethetők amely — mint az alábbiakban leírjuk — belső oldalán az egyes metilcitozinra specifikus oligonukleotidok számára hibridizációs partnert hordoz.

Erre egy további megvalósítási forma a nagy molaritású hidrogénszulfit oldat másfajta, nem dialízissel történő eliminálásán alapul. Ennek a változatnak az előnyei kiküszöbölik az eddig leírt változatok további hátrányát.

Minden agarózban végzett dialízisnél a folyamat egy része nagy térfogatú vizes oldatban történik. Itt fennáll a veszélye DNS fragmentumok diffúzió által történő elvesztésének. Kapillárisban végbemenő változatoknál probléma, hogy egy csekély, de nagyon kis DNS mennyiségeknél adott esetben a DNS fragmentumok szignifikáns százaléka hozzákötődik a kapilláris belső falához és így az analízis számára elveszhet.

Ezért a következő eljárást javasoljuk: a DNS extrakcióját — a leírtak szerint — nagyon kis térfogatban, olaj réteg alatt végezzük el. Az előnyben részesített megvalósítási formában 1 pl térfogatról van szó. Természetesen az eljárás kisebb vagy nagyobb térfogatok alkalmazásától lényegesen nem változik meg. Te hát ezek is a találmány oltalmi körébe tartoznak. A DNS-t denaturáljuk (a leírtak szerint). A szükséges hidrogénszulfit koncentrációt azután hidrogénszulfit oldat nagyobb térfogatának (például 4 pl) hozzáadásával biztosítjuk, amely kicsit nagyobb, mint amennyi a tulajdonképpeni kezeléshez kell, ezért a szükséges végső koncentrációt és pH-t automatikusan állítjuk be az olaj alatt. Ennek alapján végezzük el a leírt módok egyike szerint a hidrogénszulfit reakciót.

A következő eljárási lépésben (egy találmány szerint előnyben részesített megvalósítási formában) az oldathoz egy só, például bárium-hidroxid azonos moláris mennyiségét adjuk, amelynek kationja a hidrogénszulfittál oldhatatlan sót alkot és ezáltal kiválik az oldatból. Ennek az oldatnak a hozzáadása ezenkívül a pH-t olyan értékre emeli, amelynél lejátszódhat az első reakciólépésekben szulfonált és dezaminált citozin deszulfonálása. A nagyon gyorsan lejátszódó deszulfonálási reakció alatt a kivált hidrogénszulfit-só rövid centrifugálással elválasztható a vizes mintaoldattól. Előnyben részesítjük azonban egy olyan só használatát, amely a következő tulajdonságokkal rendelkezik. A kation a hidrogénszulfittál olyan sót képez, amely a sokszorozási reakció körülményei között szintén oldhatatlan marad és a sokszorozás folyamatát semmilyen módon károsan nem befolyásolja. A sokszorozás folyamatát azok közül az ionok közül sem zavarhatja egy sem, amelyek egy ilyen folyamatban - az ott jelen levő mennyiségben — nem válnak ki az oldatból. Ilyen sók lehetséges zavaró hatása a sokszorozási folyamatban azonban el is kerülhető azáltal, hogy rendkívül pontosan összeállított sóoldatokat használunk fel, amelyek ugyanilyen rendkívüli pontossággal pipettázhatók. Sók azonos mennyiségeinek felhasználása a potenciálisan zavaró ionok kvantitatív kiküszöböléséhez vezet. Kálium-hidrogénszulfit vagy más ellen-ionok — amelyek az utána következő amplifikációs pufferekkel komplementerek — alkalmazása megkönnyíti a sokszorozó (amplifikációs) reakció következőkben leírásra kerülő átpufferolását.

A következő eljárási lépésben azután egy olyan oldat további mennyiségét adjuk az olaj alá, amely a következő tulajdonságokkal bír. A sóösszetétel olyan, hogy a kezelt DNS olaj alatti oldatával történő összekeverésnél olyan sókoncentrációk és pH áll elő, amely enzimes sokszorozási folyamatot lehetővé tesz. Ennél bármilyen eredetű termostabil polimeráz alkalmazható. Az alkalmazott polimeráz fajtája lényegtelen, az uralkodó puffer körülményeknek megfelelően is változtatható és ennélfogva védelmet kell nyújtania minden ilyen polimeráz felhasználásához. Másodszor, ez az oldat tartalmaz egy ilyen polimerázt, minden nukleotidot és a szükséges oligonukleotid prímért. Ennek az oldatnak a hozzáadása után tehát közvetlenül ugyanabban a reakcióedényben lejátszódhat egy sokszorozás. Ily módon a teljes folyamat lejátszódása alatt lehetetlen bármilyen érintkezés a „külvilággal; még nagyon kis minta mennyiség sem veszhet kárba.

4.3. Hidrogénszulfittál kezelt DNS genom szélességű generikus megsokszorozása

Ezertől millióig terjedő metilcitozin hely kimutatásához minden esetben a próba genom minden lehetséges szekvenciája nagy százalékának megsokszorozására van szükség. A találmány szerinti .* *T eljárás ezen részét, ahogyan azt már az „előkezelés bekezdésben, két, elvében különböző változatra kell szétválasztani.

Ennek az eljárási lépésnek az első változata — a hidrogénszulfitos kezelést megelőzően - adaptereknek a fragmentált DNShez történő ligációján alapul. A legegyszerűbb változatban itt olyan oligonukleotidot használunk, amely az adapter-szekvenciákkal komplementer, úgy ahogyan azok a hidrogénszulfitos kezelés után rendelkezésre állnak. Emellett ez az oligonukleotid az adapter-szekvencia bármelyik kívánt területével képes hibridizálni. Ez ezekkel a komponensekkel végzett polimeráz láncreakció esetében elméletileg a mindkét végen adapterekkel rendelkező összes fragmentum megsokszorozásához vezet. Példának okáért ez lehet minden olyan fragmentum, amelynél egy korábbi restrikciós endonukleázos kezelés hasítást eredményezett. Néhány megvalósítási formában azonban, az ilyen sokszorozást eredményező egyedi fragmentumok korlátozott száma alapján, kevés számú amplifikációs ciklus után a reakciónak különböző részreakciókra történő felosztása szükséges. Ezek a részreakciók azután olyan oligonukleotidokkal végezhetők, amelyek a tulajdonképpeni adapter-szekvencián túl néhány — mégpedig 1-4 bázissal — behatolnak a különböző fragmentumok ismeretlen szekvenciájába. A különböző reakciók oligonukleotidjait úgy választjuk meg, hogy minden ilyen rész az összes lehetséges ismeretlen szekvenciát lefedje, hogy az ilyen oligonukleotidok összessége a különböző reakciókban minden olyan lehetséges szekvenciát lefedjen, amely elméletileg az ismert adapter-szekvenciák mögött előfordulhat. Például összeállíthatunk négy reakciót, ahol az első reakció '*** *·*, ’*·* ··*$ · * · * φ * f a *»· * *ι ' χ **t* oligonukleotidja 3' -végén az ismert, adapterrel komplementer szekvencia mögött adenint, a második citozint, a harmadik guanint és a negyedik timint tartalmaz. Ez az elv természetesen négynél több különböző reakcióval is elvégezhető, ahol azután az oligonukleotid 3' -végének szekvenciája egynél több bázist hordoz . Ezenkívül az oligonukleotid 3' -végén levő helyek lehetnek úgynevezett degenerált helyek is. Ez azt jelenti, hogy egy helyen több mint egy, hasonló hatékonyságú bázis kapcsolódik az oligonukleotidhoz, vagy két vagy több nem-degenerált szekvenciájú oligonukleotidot keverünk össze. Ezzel a reakciók összességében minden lehetséges szekvencia lefedésre kerül, amely nem négy hatványa.

Ezen az úton minden reakcióban megsokszorozható az összes fragmentumnak egy szubpopulációja, amely nagyobb megbízhatóságot és az egyes fragmentumok magasabb sokszorozási számát teszi lehetővé. Elvileg lehetséges a reakciók lépésenként! felosztása is oly módon, hogy az amplifikációs ciklusok első csoportját csak egy, minden szekvenciát lefedő oligonukleotiddal végezzük, a rákövetkező reakciót például négy reakcióra, reakciónként egy specifikus 3' -bázisra osztjuk és ezt néhány további, egy vagy több felosztással követő amplifikációs ciklus zárja le. Ezeknél lényeges pont a hozzáadott oligonukleotid mennyiségének pontos bemérése. Ideális esetben az amplifikációs ciklusok minden sorozatához olyan mennyiségű oligonukleotidot adunk, hogy az a reakció során teljesen vagy majdnem teljesen felhasználódjon. Ezután minden ciklus reakciókeveréke közvetlenül és automatikusan átvihető a további lépésekhez.

Az elvében másik változatban nincs szükség az előzőleg hasított DNS-hez adapterek ligációjára. A szakmában leírnak néhány olyan eljárást, amelyben több kevesebb sikerrel elérik DNS genom szélességű sokszorozását. Ezeket az eljárásokat mind módosítani kell a találmány szerinti eljáráshoz. Három különböző eljárás alkalmazását próbáltuk ki. Először és előnyben részesített változatként a már leírt „DOPE technika módosítását alkalmazzuk. Az irodalomban említett eljárással ellentétben minden egyes sokszorozásnál két vagy több olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amelyek két osztályba oszthatók. Ezeket az osztályokat aszerint jellemezzük, hogy az egyikben a guanin bázis, a másikban a citozin bázis nem, alig vagy csak 5' -régióban fordul elő. Ha ezek a bázisok egyáltalán előfordulnak ezeknek az oligonukleotidoknak a szekvenciájában, akkor normális esetben a szekvencia 5'-CpG-3' környezetében találhatók. Ennek az a célja, hogy az oligonukleotidok ezen osztályai vagy csak mindkét - a hidrogénszulfitos kezelés után — rendelkezésre álló (G-ben gazdag) szállal, illetve az ezekről a szálakról polimeráz láncreakcióval másolt (C-ben gazdag) szálakkal hibridizáljanak. Ennélfogva e két szekvencia-osztály képviselőinek kombinációján keresztül megvalósítható hidrogénszulfittal kezelt DNS megsokszorozása. Az 5' -CpG-3' szekvencián kívüli citozinoknak a templát DNS-ben a legtöbb esetben uracillá átalakított formában kell lenniük, ezért hatékony sokszorozáshoz a hidrogénszulfittal kezelt szállal hibridizáló oligonukleotidban nincs szükség guaninra. Az ellentétes szálon ez ehhez hasonlóan guaninra érvényes. Amennyiben az oligonukleotidok ezen osztályaiban guanin illetve citozin 5' -CpG-3' környezetben található, az azt eredményezi, hogy ezek az oligonukleotidok potenciálisan metilezett helyekkel is képesek hibridizálni. Ez a javasolt eljárás számára tulajdonképpen nem hasznos. Előfordulhat azonban, hogy a hátrányok anynyira csekélyek, hogy az eljárásnak lényeges részei ezen a módon is megvalósíthatók. Ezért ilyen oligonukleotidoknak is az oltalmi körbe kell tartozniuk. Ugyanígy elképzelhető — jóllehet elvileg inkább káros az eljárás hatékony megvalósítására nézve —, hogy egyes guaninok az 5' -CpG-3' környezeten kívüli helyeken fordulnak elő. Normális esetben ez az oligonukleotid és a cél DNS — sokszorozáshoz szükséges — hibridizációjánál bázispárosodás nélküli helyekhez vezet, amely a legtöbb esetben rontja a sokszorozás hatékonyságát, tehát nemkívánatos. Ennek ellenére a lehetséges a sokszorozás olyan oligonukleotidokkal, amelyek egy vagy kevés guanin bázist tartalmaznak erről a szálról, ha nem is ideális. Mivel egy ilyen sokszorozás még mindig teljesítené a találmány lényegét, olyan oligonukleotidok alkalmazásának is az oltalmi körbe kell tartoznia, amelyek néhány guanin felhasználása révén nem tartoznak szigorúan ebbe az osztályba. Különösen a második általunk alkalmazott technika teszi ezeket a fajta kivételeket szükségessé. Ennél olyan oligonukleotidokat használunk fel, amelyek elvben 3' -régiójukban a leírt szekvencia osztályok egyikébe tartoznak. Ezen oligonukleotidok 5'-régiójába pedig egy úgynevezett „szekvencia toldalékot viszünk be, amelyet a következő lépésekben további sokszorozáshoz használunk fel. Ebben a változatban a sokszorozás első ciklusaiban az oligonukleotidnak elvileg az osztályok valamelyikébe tartozó 3' régióját használjuk fel fragmentumok nagy spektrumának megsokszorozásához. Az ezt követő lépésekben minden eddig megsokszorozott fragmentum a 3' -végen egy a szekvencia toldaléknak megfelelő szekvenciát tartalmaz. Ezek most már - az adapterrel komplementer oligonukleotidokkal végzett sokszorozáshoz hasonlóan - felhasználhatók egy olyan oligonukleotid hibridizációs partnereként, amelyet további sokszorozásokhoz viszünk be. Ezeknek az első oligonukleotidoknak a szekvencia toldaléka természetesen a 3' -régiója szerint az első osztályba tartozó oligonukleotidokban az 5' -régióban guanint, a második osztályba tartozókban az 5' —régióban citozint tartalmazhat.

Oligonukleotidok vagy a 3' -régiójuk szerint a két osztály valamelyikébe tartozó oligonukleotidok lehetnek eltérő módon összeállítottak. Változatunk a DOPE eljárásra a két osztályba tartozó olyan oligonukleotidok kombinációját használja, amelyek 3' -régiójukban meghatározott bázissorrendet mutatnak. Ez a találmány szerinti eljárásban 2-20 bázis hosszúságú lehet. Ez előtt a szekvencia előtt található egy többnyire 5-20 bázis hosszúságú, az első osztályban ,, H—helyekből a második osztályban „D-helyekből álló szakasz. Ez azt jelenti, hogy ezeken a helyeken az oligonukleotid szintézisekor a „H osztály esetében az A, C vagy T bázisok valamelyikét, illetve a „D osztály esetében az A, G vagy T bázisok közül építünk be egyet (ahol a fent nevezett, a találmány lényegét nem érintő kivételeknek a találmány oltalmi körébe kell tartozniuk) . Ezen szakasz előtt (5' ) lehet (azonban nem feltétlenül kell) egy további, specifikus szekvenciájú szakasz. Amikor ezeket az oligonukleotidokat a

3Ί megfelelő körülmények között a hidrogénszulfittál kezelt DNS sokszorozására használjuk, a teljes genomnak az oligonukleotid specifikus területein túl definiálható frakciója reprodukálhatóan megsokszorozódik. Szekvencia toldalékok alkalmazása esetén az oligonukleotid 5'-régiója olyan meghatározott szekvenciát mutathat, amely mindkét szekvencia osztály definícióját áthágja. A teljes eljárásban történő alkalmazás céljából olyan oligonukleotidoknak is a találmány oltalmi körébe kell tartozniuk, amelyek a „H és „D területeket a 3' -régióban tartalmazzák vagy amelyekben a meghatározott bázisok helyei az ilyen „H vagy „D osztályokba tartozókkal valamilyen formában váltakoznak.

Továbbá szintén a találmány oltalmi körébe kell tartozniuk olyan, amplifikációs primerként felhasznált oligonukleotidoknak, amelyek a találmány teljes elgondolásán belül kerülnek felhasználásra és amelyek 5' -végükön úgynevezett „hajtű szerkezetűek, olyan molekulák, amelyek a fentiekben leírt implicit bázispárosodási viselkedéshez hasonló bázispárosodási sajátságot mutatnak, mint például PNA (protein-nucleic-acid = fehérjenukleinsav) alapú oligonukleotidok, kémiailag módosított oligonukleotidok és olyan módosított és nem—módosított oligonukleotidok, amelyeket másokkal természetes nukleotidokként szintetizáltunk.

4.4. CpG dinukleotidok metilezettség-állapotának kimutatása

4.4.1. Metilezett CpG dinukleotidok kimutatása DNS-chipeken A találmány szerinti eljárás végleges formájában lehetőség szerint DNS-chip felhasználásán alapul. DNS-chip felhasználása ezért előnyben részesített megvalósítási formát jelent. Elvben a hidrogénszulfittal kezelt DNS megsokszorozásáig minden leírt megvalósítási forma alkalmazható. Az eljárás megvalósításához felhasznált chip az előnyben részesített megvalósítási formában következő formával rendelkezik: Egy erre a célra kiválasztott felületre ismert úton-módon legalább ezer, rendszerint azonban több, mint százezer oligonukleotidot in situ szintetizálunk vagy mikro- vagy nanopipettával, pecséthez hasonló berendezéssel vagy mikro-folyadékhálózaton keresztül viszünk fel. Minden egyes oligonukleotid specifikus egy CpG helyre, ami azt jelenti, hogy csak akkor hibridizál a cél DNS-sel, ha az oligonukleotid által tartalmazott CpG hely metilezett, vagy csak akkor, ha ez a hely éppen nem-metilezett. Ennélfogva minden hely számára legalább (lásd az alábbiakban) két oligonukleotid vihető fel. A különböző oligonukleotidok száma fölfelé határtalan és a genomban található összes CpG dinukleotidnak akár a nyolcszorosát is túllépheti. A DNS-chip minden pontjáról pontosan ismert, hogy ott melyik oligonukleotid szekvencia található.

A találmány szerinti eljárás egy ilyen DNS-chip megszokott bevonásába lényeges változtatást vezet be. Egy ilyen DNS-chip felületén a technika mai szintjén olyan oligonukleotidok találhatók, amelyek genomiális vagy kifejeződött szekvenciákkal komplementerek. Ez azt jelenti, hogy minden oligonukleotid a bázisösszetétel átlagában egy szervezet genomiális DNS-ének vagy kifejeződött szekvenciáinak felel meg. Ezért a legtöbb oligonukleotid egy ilyen DNS-chip felületén tartalmazza mind a négy bázist, metszetében a guanin és citozin bázisok részaránya megfelel a genomiális és/vagy kifejeződött szekvenciáknak.

Nem így a találmány szerinti eljárás keretein belül. Elvben minden, oligonukleotidok által lefedett szekvenciához oligonukleotidok nyolc osztályát szintetizálhatjuk. A hidrogénszulfitos kezelés következtében a DNS úgy módosul, hogy az eredetileg komplementer felső és alsó szál (Watson és Crick féle szálak, kódoló és templát szálként is nevezik) többé már nem lesz komplementer. Ez azt jelenti, hogy mindkét szálhoz szintetizálhatok oligonukleotidok. Ez kínálkozik, mivel a két szál ily módon egymás számára belső kontrollként használható. A két különböző szál hibridizációs viselkedése a mindenkori, hozzájuk illő oligonukleotidokkal a részben drasztikus szekvencia eltérés alapján különböző. Ez oda vezet, hogy ha mindkét szálon ugyanazt az eredményt érjük el, az egymástól függetlennek tekinthető. Mennyiségileg is meg kell határozni, hogy az egyes vizsgálandó helyeken milyen nagy a metilcitozin és citozin részaránya. Mindkét szál felhasználása lehetővé teszi a különböző hibridizációs eredmények értékelésén keresztül minden egyes egyedi CpG helyre az adatoknak az oligonukleotidok különböző hibridizációs paramétereitől független meghatározását. A háttérhibák így minimálisra csökkenthetők.

A hidrogénszulfitos kezelést követően nem csak a két szál különböző. A kezelés után minden esetben sokszorozást végzünk, amely mindkét szálnál magában foglalja újra egy komplementer ellentétes szál szintézisét. A két ellentétes szál ugyanolyan kevéssé komplementer, mint az eredeti szálak a hidrogénszulfitos kezelés után. A sokszorozás során újonnan szintetizált ellentétes szál az eredeti másik szállal (amelyhez nem szintetizáltuk)

sem komplementer. Tehát minden egyes erdeti CpG helyhez négy különböző hibridizációs cél keletkezik. E négy szál mindegyike (mi itt szimmetrikus, azaz mindkét szálon metilezett CpG helyekből indulunk ki) ugyanazt az információt tartalmazza, azonban egymástól eltérő szekvenciájú oligonukleotidokkal hibridizálnak. Tehát ily módon minden kívánt CpG helyet tartalmazó információ négyszeresen függetlenül kerül lefedésre. Ennek ellenére a négy különböző oligonukleotid jelerőssége nem hozható közvetlenül korrelációba (kivéve a tapasztalati értékeket, amelyeket a rendszer használata során nyerünk) egy hely metilezettségi fokával. Tudniillik, a különböző fragmentumok enzimes sokszorozás során szintén különböző hatékonysággal sokszorozódnak, ezért egy jel erőssége nem feltétlen a metilezettség fokával, hanem a CpG helyet tartalmazó fragmentum amplifikációs hatékonyságával is összefüggést mutathat. Ezért minden esetben mind a négy szálra mindkét lehetséges oligonukleotidot meg kell vizsgálni, egyikhez azt, amely csak akkor hibridizál, ha a vizsgálandó CpG hely metilezett (tehát CpG-t tartalmaz), másikhoz azt, amely csak nem-metilezett CpG hely esetében hibridizál, (tehát CpG-t nem tartalmaz). Egy DNS szál mindkét lehetséges változata — azaz a metilezett és nem-metilezett változat — messzemenően azonos hatékonysággal sokszorozódik, tehát lehetővé teszi az összehasonlítást. Miután már mind a négy szálra rendelkezésre állnak ezek a komplementer információk, mind a négy szál felhasználható az összesített eredmény megerősítésére is. A találmány szerinti eljárás keretei között a fő kritériumok, amelyek az oligonukleotidokat más eljárásoktól elhatárolják, hogy a ·»··<·**··· ♦ f négy bázis közül mindig csak hármat tartalmaznak. Azok az oligonukleotidok, amelyek az eredeti DNS szálakkal komplementerek, csak citozin bázist tartalmaznak, guanint azonban nem. Az összes ilyen oligonukleotidnak csak a felében található pontosan egy guanin, mégpedig CpG környezetben pontosan azon a helyen, amelyet metilezettség-állapotára nézve tesztelnünk kell. Ezzel ellentétbenaz oligonukleotidok második osztálya — amely az eredeti DNS-hez a sokszorozásnál létrehozott ellentétes szállal komplementer — citozin bázist csak azokon a helyeken tartalmaz, amelyeknek a metilezettség-állapotát vizsgálnunk kell. Azok az oligonukleotidok, amelyek csak akkor hibridizálnak a cél DNSsel, ha az általuk tesztelt hely nem-metilezett állapotban fordul elő, vagy citozint vagy guanint nem tartalmaznak (szálanként). A találmány szerinti eljárásban az oligonukleotidok leírt nyolc osztálya természetesen még más szempont szerint is változtatható. Egyidejűleg egy osztály több képviselője is bevethető minden egyes metilezhető hely vizsgálatára. Például nem minden esetben nyilvánvaló, hogy a potenciális metil-hely mindkét oldalán hány bázist foglalnak magukban az oligonukleotid szélei. A metilezhető helynek nem kell pontosan az oligonukleotid közepére kerülnie. Ennélfogva minden egyes tesztelendő hely esetében sok permutáció lehetséges.

Különleges esetekben a tesztelendő hely az oligonukleotid szélére esik vagy (mindazonáltal ez már egy további megvalósítási forma része) akár egy hellyel a 3' -vég mögé oly módon, hogy citozin vagy guanin jelenlétét (tehát az eredeti minta metilezettségét) egyszerű hibridizációval nem, hanem primer extenzió

kimutatásán keresztül bizonyítjuk. Ebben a megvalósítási formában módosított nukleotid-trifoszfátokat — mind a négy nukleotidra különböző jelzéssel ellátva - adunk a cél DNS-hez (jóllehet technikailag lehetséges egy ilyen nukleotid beépítése egy primer 3' -végére, ezen oligonukleotidon túl további hosszabítás azonban már nem; itt rendszerint a négy nukleotidtrifoszfát 2' ,3'-didezoxi-analógjait alkalmazzuk), amelyet azután a chip felületén az oligonukleotidokkal hibridizáltatunk. A hibridizáció közvetlen kimutatása helyett most egy polimerázt adunk hozzá és minden egyes helyen pontosan egy nukleotidot szintetizálunk az oligonukleotid 3'-végére. Az oligonukleotid 3' -végére beépített nukleotid komplementer nukleotid pontosan megfelel annak, amelyik — az oligonukleotiddal hibridizált — cél DNS-en egy hellyel 5' irányban az oligonukleotid előtt található. A találmány szerinti eljárásban ez a hely az egyik, amely az eredeti DNS-ben metilezhető. Tehát ha (szálanként) a DNS próbában a hely metilezett volt, akkor ezen a helyen citozin található; az oligonukleotidra tehát egy guanint „építünk. Amennyiben a dGTP-k (vagy e nukleotid analógjai) egyértelműen jelöltek, és (amely előfeltétel) az oligonukleotid szekvenciák minden helye ismert, akkor ebben az esetben guanin beépülésének kimutatása az eredeti próbában egy metilcsoport jelenlétének bizonyítását szolgálhatja. Ha ugyanazon oligonukleotidra egy adenint kapcsolunk, kimutathatjuk timin jelenlétét, tehát annak bizonyítékát, hogy a vizsgált hely nem-metilezett formában fordult elő. Ugyanez a bizonyítás, csak a jelölt citozin és timin ddNTP-k segítségével elvégezhető a sokszorozás során előállított ellentétes

szálakon. Ebben a megvalósítási formában mindkét szekvencia osztálybeli oligonukleotidok vagy citozint vagy guanint nem tartalmaznak. Ennek ellenére kivételes esetekben eltekinthetünk ettől a szabálytól, például ha egy hely mindig metilezettnek vagy mindig nem-metilezettnek ismert, vagy ha a hely metilezettségállapota az oligonukleotid hibridizációs viselkedésére nincs hatással. Továbbá az oligonukleotidon belüli egy vagy kevés „mismatch-pozíció adott esetben - elvben káros hatása ellenére is — teljesítheti az eljárás lényeges követelményeit. Az ilyen, a szekvencia osztályokba szigorúan be nem sorolható oligonukleotidoknak, amelyek lényeges eljárási részleteknek eleget tesznek, szintén a találmány oltalmi körébe kell tartozniuk. Ezenkívül az oligonukleotidok rögzítése a DNS-chipek felületére történhet az oligonukleotidokhoz kapcsolt olyan szekvencia toldalékokon keresztül, amelyek a felülethez rögzített oligonukleotidoknak egy generikus szekvenciájával komplementerek. Ilyen oligonukleotidok csak a DNS próba hibridizációjához rendelkezésre álló területeken (régiókban) tartoznak a definiált szekvencia osztályokba. Továbbá a találmány oltalmi körébe kell tartozniuk olyan, a DNSchipek felületén hibridizációs partnerként felhasznált oligonukleotidoknak, amelyek a fenti leírásban szereplő bázispárosodási sajátságokhoz hasonló bázispárosodási tulajdonságokkal rendelkeznek, például PNA (fehérje-nukleinsav) alapú oligonukleotidok, kémiailag módosított oligonukleotidok és olyan módosított és nem-módosított oligonukleotidok, amelyeket másokkal természetes nukleotidokként szintetizáltunk.

Ez természetesen minden olyan megvalósítási formára érvé44

nyes, amely oligonukleotidoknak a tesztelendő hellyel történő közvetlen hibridizációján vagy csak egy bázison keresztüli primer extenzión alapul: rendszerint csak egy helyet vizsgálunk és ez a hely egy oligonukleotid teljes citozin illetve guanin tartalmát is kiteszi. Mindazonáltal ez alól a szabály alól egyedi esetekben lehetnek jelentéktelen kivételek, amelyek ugyanúgy a találmány tárgyát képezik.

A különböző jelzett nukleotid analógok kimutatása primer extenziós reakcióban DNS-chip felületén a legkülönbözőbb módokon valósítható meg. Előnyben részesített változat az önmagában ismert, CCD kamerával történő kimutatás, amely — a chipen bekövetkezett nukleotid (természetesen fluoreszcensen jelölt) kötődést jelző — fluoreszcencia szignálokat regisztrál. Ezenkívül a fent leírt megvalósítási formában a nukleotid analógok mindegyike különböző színnel jelzett oly módon, hogy minden hely kimutatható, ahová nukleotid beépült.

Az is egy fontos változat, amelyikben a négy nukleotid analóg mindegyikét kémiai molekulával jelöljük meg, amelyeket azután MALDI-TOF lézerrel történő belövéssel a nukleotidról fotokémiailag (vagy a keletkező hővel vagy hasonló folyamattal) leválasztunk és azután közvetlenül ionizálva molekulatömegükre nézve analizálunk. A MALDI-TOF berendezés lézere eközben a chip minden helyére pontosan ráirányítható, tehát a chipen levő összes olyan hely leválasztva meg is határozható, amelynél a megfelelő helyen tömegmódosulás található. Gyakran (mivel metilezett és nem-metilezett cél DNS-ek ebben a változatban ugyanazokkal az oligonukleotidokkal hibridizálnak és a metilezettség-állapotot a beépí tett nukleotid jelölése révén mutatjuk ki) minden helyen két jelölést detektálunk (természetesen csak fluoreszcens jelzésekre érvényes) és a két szignált mennyiségileg meghatározva és egymással összehasonlítva derítjük ki a metilezettség fokát.

A jelenleg előnyben részesített megvalósítási formában mindenesetre fluoreszcens detektálást alkalmazunk. Továbbá közvetlenül mutatunk ki hibridizációkat és nem végzünk primer extenziós reakciót.

4.4.2. Citozin metilezettségének kimutatása primer extenziós termékek tömegspektrometriás hosszúság mérésével

Olyan megvalósítási formát fejlesztettünk ki, amely lehetővé teszi különlegesen nagy számú citozin és/vagy guanin kimutatását hidrogénszulfittal kezelt DNS-ben tömegspektrometriás hosszúság méréssel MALDI tömegspektrométerben. Ennek a technológiának az alapját, amelyet ehhez az eljáráshoz módosítottunk, fent már leírtuk .

A javasolt eljárásban olyan oligonukleotidokat használunk, amelyek a már fent definiált két szekvencia osztály valamelyikéhez való tartozásuk folytán a hidrogénszulfittal kezelt DNS két szála közül legnagyobb valószínűséggel csak az egyik szállal hibridizálnak. Az ebben a megvalósítási formában felhasznált oligonukleotidokkal az összes fent említett sokszorozási módszer amplifikációs keverékéből megvalósítható citozin és/vagy guanin kimutatása. Ez azt jelenti, hogy elvben egyaránt használhatunk olyan oligonukleotidokat, amelyek a hidrogénszulfitos kezelés előtt a próba fragmentumaihoz ligáit adapterekkel komplementerek, és olyanokat, amelyek nem definiált helyeken a más módon

·..· ·.,· ·..· : ··*· megsokszorozott fragmentumokkal hibridizálnak.

Az előnyben részesített megvalósítási formák tartalmazzák olyan DNS próbák alkalmazását, amelyekhez restrikciós fragmentum adaptereket ligáltunk (és azután a hidrogénszulfitos kezelést követően megsokszorozzuk) vagy olyanokat, amelyeket — 5' régiójukban konstans szekvencia toldalékot tartalmazó — oligonukleotidokkal sokszoroztunk. Az erre a célra szolgáló adaptereket úgy szintetizáljuk, hogy hidrogénszulfitos kezelést követően a két szál — ez az eredeti, hidrogénszulfittál módosított és a sokszorozás során újonnan szintetizálódott szálat jelenti — citozin illetve guanin tartalom vonatkozásában olyannyira tér el egymástól, hogy primer extenziós reakcióhoz a két szál közül egyet specifikusan felismerő oligonukleotidok állíthatók elő. Ez azt jelenti, hogy ebben az esetben is az oligonukleotidok két szekvencia osztálya különböztethető meg. Az alkalmazott oligonukleotidok olyan tulajdonsággal rendelkeznek, hogy 3' -régiójuk az ismert adapter szekvencián és a restrikciós endonukleáz által felismert és ennélfogva ismert szekvencián túl a próba DNS ismeretlen területére benyúlik. Abban az esetben, ha a fent leírtak szerinti generikus sokszorozási lépésenként egyre hosszabb oligonukleotidokkal sorozatosan elosztva, egymástól elkülönülő reakciókban végezzük, akkor az itt definiált oligonukleotidok ebből az ismert területből ki is lógnak. Ezenkívül az oligonukleotidok 2-20 bázis között benyúlhatnak az ismeretlen területre. A fragmentumok keverékét az első generikus sokszorozásból szétosztjuk és minden (szub)reakcióhoz különböző oligonukleotidokkal keverjük össze. Ezenkívül minden szubreakcióban

·..· ·..· ·..· : “í* ismert, melyik oligonukleotid szekvenciát adjuk hozzá, a szubreakciók csak a hozzáadott oligonukleotid szekvenciájában különböznek egymástól. Ezenkívül nem lényeges, hogy az oligonukleotid szekvenciája pontosan definiált vagy egyes helyeket a fent definiált „H vagy „D degenerált nukleotid helyek foglalják el. Degenerált helyek alkalmazása lehetővé teszi az ismeretlen területre benyúló, hosszabb szakaszok felhasználását és adott esetben az ilyen reakcióban létrehozott extenziós fragmentumok számának és fajtájának pontosabb szabályozását és fokozatos csökkentését .

Minden egyes különböző szubreakcióval polimeráz reakciót végzünk a következő komponensekkel. Azok a reakciók, amelyek citozinban szegény szállal (a hidrogénszulfittál kezelt DNS eredeti szálainak megfelelően) hibridizáló oligonukleotidokat tartalmaznak, dATP, dCTP, dTTP nukleotidokat és bázispárosodási viselkedése szerint dGTP nukleotiddal analóg terminátort, mint például ddGTP-t vagy funkciójában ekvivalens nukleotidot tartalmaznak. A másik szekvencia osztályba tartozó oligonukleotidokkal való reakciók dATP-ből, dGTP-ből, dTTP-ből és és bázispárosodási viselkedése szerint dCTP nukleotiddal analóg terminátorból, mint például ddCTP-ből vagy funkciójában ekvivalens nukleotidból álló keveréket tartalmaznak. Tehát az oligonukleotidokból kiindulva polimeráz reakcióval az egyik szálon (citozinban szegényen) csak az első citozinig, illetve a másik szálon az első guaninig egy új DNS szálat szintetizálunk.

Tömegspektrometriás analízishez az is értelemszerű, hogy a természetben előforduló nukleotidok helyett ismert úton-módon • *· ·**» · ·» · ♦»·· *» «· * * kémiailag módosítottakat alkalmazzunk az extenziós termékek ezt követő tömegspektrometriás analízisének megkönnyítésére. Változatunkban ehhez a természetes nukleotidok foszfotioát analógjait használjuk fel. Ezek egy következő lépésben alkilezhetők a DNSgerinc töltésének eliminálására, amely emeli az anlízis minőségét és érzékenységét. De ezt a célt szolgáló egyéb módosításoknak is a találmány oltalmi körébe kell esniük. Továbbá az alkalmazott oligonukleotidok töltésének módosítása ezek hibridizációs sajátságait is megjavíthatja vagy módosíthatja.

Ennek a megvalósítási formának a célja az egyes reakciókban olyan fragmentum populációk előállítása, amelyek úgy és csak úgy komplexek, hogy ezek egymástól elkülönülten, gélelektroforézissel vagy éppen tömegspektrometriás hosszúság analízissel felbonthatók legyenek. Ehhez szükséges az oligonukleotidok ismeretlen szekvencia területre benyúló részét meghaladó hosszúságú, szintetizált fragmentumok számának és a degeneráció fokának oly módon történő beállítása, hogy ez reakciónként egy és alkalmasint néhány ezer különböző fragmentum közé essen.

Az egyes reakciókat az előnyben részesített megvalósítási formában elkülönülten, tömegspektrométer ionforrásának definiált koordinátáira visszük fel. A tömegspektrometriás analízis azután meghatározza a fragmentum-spektrumok egyedi koordinátáit. Egy tömegspektrométer ionforrásának néhány ezerig terjedő koordinátája és spektrumonként néhány száz fragmentum esetén — amelyek közül mindegyik egy citozin vagy guanin helyet a metilezettség indikátoraként ítél meg - tehát néhány százezerig terjedő egyedi CpG dinukleotid értékelhető.

» · t · · · * »»!♦ Λ * «· t» * *

Ehhez hasonlóan olyan fragmentum-spektrumok kimutatása is elvégezhető, amelyek olyan fragmentum populációból származnak, amelyet adapterek ligációja nélkül, a fent leírt oligonukleotid primer segítségével sokszoroztunk meg. Ennél a változatnál lemondunk az adapterekkel komplementer szekvenciáról és ehelyett egy több degenerációs helyet tartalmazó 5' -szakaszt alkalmazunk.

Abban az esetben, ha a hidrogénszulfittál kezelt DNS-t ilyen — 3'-régiójukban a fent leírt (5'-)szekvencia toldalékot tartalmazó — oligonukleotidokkal elő-sokszorozzuk, ezek az adapter szekvenciákhoz hasonlóan konstans szakaszként használhatók oligonukleotidokkal történő hibridizációhoz, az ebben a fejezetben fentebb leírtak szerint.

4.4.3. Citozin metilezettség-állapotának kimutatása kémiailag módosított oligonukleotidok tömegspektrometriás kimutatásán keresztül

Egy további megvalósítási forma egy önmagában ismert olyan eljárást használ fel, amely bizonyos szekvenciák tömegspektrometriás azonosítását oligonukleotidra felvitt kémiai módosítások kimutatásán keresztül, közvetetten teszi lehetővé.

A fent leírt tömegspektrometriás kimutatási változatokban sok különböző primer extenziós reakciót végzünk mindenkor egy vagy kevés oligonukleotid szekvenciával. Elvben azután a különböző analizálható fragmentumok rendkívül nagy számát csak a sok különböző reakcióba (és egy MALDI ionforrás koordinátáira) történő szétosztás révén érjük el.

Amennyiben minden egymástól eltérő primer szekvenciát kémiai módosítással látunk el, akkor — nem kizárólag MALDI, hanem egy

másik analízis technika alkalmazása mellett — eltekinthetünk ettől a felbontástól.

Ez gyakorlatilag azt jelenti, hogy a felhasznált különböző primerek mindegyikét már a szintézis során vagy utólag olyan kémiai módosítással látjuk el, amely elvben két követelményt elégít ki. Először, nem akadályozhatja meg a keletkezett fragmentumok hosszúság szerinti felbontását. Másodszor, a módosítás módjának lehetővé kell tennie ezeknek a kapillár-elektroforézishez kapcsolódó második analízis lépésben történő megkülönböztetését. Ezért a módosítás módja a második lépésben történő analízis függvénye. Az előnyben részesített megvalósítási formában a primer 5' -végeit rövid peptid-szekvenciákkal látjuk el, amelyek egy következő lépésben sok használatos analitikai eljárással leválaszthatók. Egy ilyen megvalósítási forma nagy előnyeinek egyike, hogy az első nem-specifikus sokszorozási lépésben is lényegesen kisebb DNS összmennyiséget kell megsokszorozni, mivel ezt a mennyiséget nem kell még felosztani további reakciókra. Az elválasztás második dimenziója — amelyet a fent leírt változatokban egyedi reakciókba történő felosztás révén érünk el — a találmány szerinti eljárás előnyben részesített megvalósítási formájában azáltal érhető el, hogy a létrehozott fragmentumok elválasztása először kapillár- elektroforézissel történik. Ezenkívül megfelelő eredmény eléréséhez lényegtelen, hogy a fragmentumokon végzett kémiai módosítások befolyásolják-e a fragmentumok futási viselkedését vagy sem, amikor már csak egy hosszúság szerinti felbontás lehetősége marad. Minden egyes, a kapillárelektroforézis végét elérő „frakcióban sok olyan azonos »·»· , ·»·· *^S t » *·*··*» · * if»elektroforetikus futási viselkedésű fragmentum található, amelyek csak mindenkori 5' -szakaszukon (az extenziós reakcióhoz hozzáadott primer területén) levő kémiai módosításban különböznek egymástól. Ezeket az elektroforetikus futási viselkedésük alapján felbontott fragmentum populációkat azután egy második lépésben kémiai módosításukra nézve vizsgáljuk. Ennél előnyben részesített megvalósítási forma a kapillár-elektroforézis kilépő térfogatának közvetlen befecskendezése Fast-Atom-Bombardement (FAB-MS), Electron-Spray (ESI-MS) készülékbe, felvitele MALDI tömegspektrométerre vagy ezekkel ekvivalens analizáló készülékbe .

Egy ilyen változatot például a következők szerint végzünk el. DNS-t preparálunk sejtekből a leírtak szerint, restrikciós endonukleázzal hasítjuk, adapterekkel látjuk el és átvezetjük termosztálható, kis molekulák számára porózus kapillárison, amelyben a hidrogénszulfit-reakcióhoz a reagensek oda- és elvezetését dialízissel végezzük. A teljes reakció térfogata ennél nagyon csekély. A lejátszódott hidrogénszulfit-reakció után a kapillárist keresztezésekkel további, a sokszorozási reakcióhoz szükséges reagenseket hozzávezető kapillárisokkal kapcsolhatjuk és a sokszorozást ugyanabban a fűthető kapillárisban végezhetjük. A sokszorozást azonban nemcsak közvetlenül a kapillárisban, hanem egy ehhez a kapillárishoz csatlakozó edényben is végezhetjük. A genomiális fragmentumok generikus sokszorozásához kapcsolódik egy második, a leírtak szerinti lineáris meghosszabbítási lépés, amelyet kémiailag módosított és ezáltal tömegükben egymástól megkülönböztethető olyan oligonukleotidok keverékével végzünk, amelyek a hidrogénszulfittál módosított adapterekkel komplementerek. Ezt a kapilláris egy további szakaszában a meghosszabbított termékek hosszúság szerinti felbontása és adott esetben a tömegspektrometriás analízissel összeegyeztethető pufferrel — például ammónium-szulfáttal — szembeni további dialízis követi.

Minden egyes frakciót tömegspektrométer ionforrásának koordinátájára viszünk fel és azután minden koordinátát megvizsgálunk kémiai módosítások jelenlétére, amelyek tömegükben különböznek egymástól. Ennél a megvalósítási formánál műszerezettség szempontjából MALDI-TOF használatát részesítjük előnyben, amely nagyon nagy ionforrással rendelkezik, ezért gyors követéssel nagyon sok különböző koordináta analizálható.

További megvalósítási formák adódnak abból a tényből, hogy a leírt eljárás teljesen általánosan minden mérési pontot két dimenzióra hoz létre, ez szükségszerűség a mérési pontokból történő számadatok létrehozásánál, az itt leírtak szerint. DNS chip-eken ez a két dimenzió térben kijelölt ugyanúgy, mint egy MALDI-TOF ionforrásán történő egyedi „szubreakciók analízisének a leírt változatánál. A kapillár—elektroforézises változatnál a két dimenziót két, egymástól eltérő kritérium alapján elválasztó felbontási módszer egymás mögé történő kapcsolásával érjük el. Egy ilyen eljárásnak vannak még további változatai, amelyek mivel megfelelnek a találmány összkoncepciójának, az oltalmi körbe kell tartozzanak. A találmány szerinti eljárás keretein belül nagyon sok ponton történő mérésnél nem feltétlenül szükséges minden mé rési pont eredetének ismerete. A találmány szerinti eljárás sok alkalmazásánál elegendő, ha absztrakt adatok hatalmas mennyisége összefüggést mutat sejtek fenotipusos tulajdonságaival. Ebből adódik a lehetséges analitikai eljárások lényegesen nagyobb spektruma. Rendszerint szükség van kapillár-elektroforézisre minden olyan megvalósítási formában, amelyben egy bekövetkezett hibridizációs eredményt nem közvetlenül bizonyítunk (önmagában egy analízis dimenzió).

4.5. A létrehozott adatok analízise

A fő igénypontok általánosan az eljárásra, ilyen komplex metilezettség ujjlenyomatok előállítására és kiértékelő algoritmus segítségével a vizsgált sejtek fenotipikus jellegzetességeivel történő korrelációba állítására vonatkoznak. Az oltalmi körnek azonban — amennyiben az adatok létrehozása és felhasználása kombinációban a tényleges találmány szerinti szintet eléri - minden olyan eljárásra vonatkoznia kell, amely metilezettség adatok megszerzésére, ezeknek az adatoknak találmány szerinti kiértékelése céljából alkalmas.

Mindegyik fent leírt eljárási lépés végén mérési pontok hatalmas száma áll. Három különböző kiértékelési módra van lehetőség. Tiszta plusz-mínusz szignálok olyan helyzetekhez, amelyek vagy minden analizált kromoszómán metilezett vagy nemmetilezett formában találhatók, a kimutatható metilezhető helyeknek valószínűleg nem a szám szerint legnagyobb csoportját alkotják. Nagyon sok hely hoz létre olyan szignálokat, amelyeket a fent leírt módszerekkel mennyiségileg értékelni kell.

Elvben a tiszta plusz-mínusz szignálok analízise lényegesen egyszerűbb. Az analízis stratégiája a következő. Sok különböző, ismert eredetű DNS próbából (például azonos fenotípus antitesttel jelölt és immunfluoreszcensen izolált sejtjeiből) hozunk létre nagy számú kísérleti adatot és megvizsgáljuk ezek reprodukálhatóságát. Azokat a helyzeteket, amelyek nem reprodukálható eredményeket szolgáltatnak, a többitől logikusan elválasztjuk, mivel először nem ítélhető meg vajon ilyen eltérések az egyes helyzeteknél biológiailag szignifikánsak-e. Ezeket a teszt sorozatokat különböző típusú sejteken kell elvégezni. Ezeknek a teszt sorozatoknak az eredménye CpG dinukleotidok nagy, ma még ismeretlen száma kell legyen, amely sejttípusok kívánt párjának • összehasonlításánál metilezettség-állapot tekintetében reprodukálható különbséget eredményez. Nem mindegyik, két sejttípus közvetlen összehasonlításában különbözőnek mutatkozó helyzet informatív az összes ilyen összehasonlításban. Ha minden olyan helyzetet megvizsgálunk, amelyek legalább egy sejttípus összehasonlításban különbözőek, akkor minden egyes vizsgált sejttípusra egy jellegzetes mintát állíthatunk fel. Ennek alapján ismeretlen eredetű DNS próba hozzárendelhető egy sejttípushoz. Ezek a minták nem feltétlenül állandóak minden megvizsgált helyen. Pillanatnyilag nem ítélhető meg (a találmány szerinti eljárásnak először sikerült egy ilyen megítélés alapjait leraknia) milyen erősen tér el egy sejttípus metilezettség-mintázata egy jellegzetes egyedi próbától. Ideális esetben a létrehozott mintázatok sejttípusonként és egyedenként annyira állandóak, hogy ilyen szövet azonosítása nagy ráfordítás nélkül megoldható. Egy definiált jellemző szignál koordinátákkal rendelkező, előre meghatá55

rozott matrica azután közvetlenül szolgálhatja a próbának egy sejttípushoz történő hozzárendelését. A legbonyolultabb esetben szignáloknak nem egy egyedi, definiálható mintázata jellemez egy sejttípust, hanem sok ilyen minta, amelyek jóllehet alapjában véve jellemzőek, de mint ilyenek nyilvánvalóan nem azonosíthatók. Az ugyanis előfordulhat — a technika mai szintjén a metilezettség analízisnél levezethető -, hogy látszólag nagyon különböző mintázatok nagyon hasonló funkciókat takarnak. Most azonban még nem rendelkezhetünk megállapításokkal e nehézség fokát illetően, mivel a találmány szerinti eljárás az első lehetőség egy ilyen szituáció megítélésének közreadásában. Előfordulhat az is, hogy hagyományos módszerekkel, úgymond „szemmel, egy próba semmilyen eredethez nem rendelhető hozzá. Ebben az esetben a javasolt eljárás tartalmazza egy úgynevezett „neuron hálózat-nak (neuronales Netzwerk = NN) a teszt sorozatokban kiderített adatokkal való „trenírozása lehetőségét. Ez úgy néz ki a gyakorlatban, hogy sejt-DNS próbákkal nagyon sok teszt sorozatot végzünk és az NN beadási területére betápláljuk. A próba metilezettség adataival egyidejűleg információt nyújtunk az NN-nek a próba eredetét illetően. Neuron hálózatok elegendő számú kísérlet után úgyszólván képesek megtanulni, melyik minta melyik sejttípushoz tartozik. Ily módon osztályozhatók olyan különösen komplex és nyilvánvalóan áttekinthetetlen mintázatok, amelyek az emberi értelem és hagyományos algoritmusok számára teljesen kaotikusnak tűnnek.

Még beláthatatlan, milyen komplexen és látszólag kaotikusán jelennek meg a létrehozott mintázatok. A leírtak közül minden <· ·..* ^r eset lehetséges. Ennélfogva a találmány tárgyát képezi minden olyan eljárás, amely komplex metilezettség-mintázatok ismert eredetű sejttípusokhoz történő hozzárendelését hasznosítja és ezáltal alkalmassá válik ismeretlen eredetű sejttípusok osztályozására .

Bonyolultabb a rendellenes eredetű sejtek vizsgálatánál az adatok biztonságos analízise. A találmány szerinti eljárás célja, hogy lehetővé tegye ismeretlen, megbetegedett sejttípusok osztályozását. A megvizsgált próbák metilezettség adataival együtt ezért a vizsgált sejtek fenotípusos paramétereit a teszt sorozatok során fel kell kínálni NN-nek és/vagy más kiértékelési rendszernek, ahol először még nem világos, ezen fenotípusos adatok közül melyiknek kell korrelálnia a metilezettség-mintázattal és egy ilyen korreláció keretei között értelmes adatokat szolgáltatnia. Ezekben az esetekben többszörösen érvényesek azok a nehézségek, amelyek látszólag kaotikus, de mégis alapjában véve osztályozható adattömegből keletkeznek. Előfordulhat, hogy elfajult sejtek esetében különböző epigenotípusos állapotok hasonló fenotípusos jellegekhez vezetnek. Ilyen szituációk különösen NNek által jól felismerhetők és azután új, pontosabban differenciált fenotípusokhoz vezethetnek, amely a javasolt eljárás egyik fő célját képezi. Ezért kívánatos a különböző fajta neuron hálózatok — a metilezettség-mintázatnak a fenotípusos adatokkal való korrelációba állítása céljából a metilezettség adatok analízisénél történő — alkalmazásának explicit bevonása az oltalmi körbe. Azonban az egyszerűbb szituációk is teljesíthetik a találmány lényegét és ezért nem vehetők ki az oltalmi körből.

Claims (22)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás szövetek és sejttípusok jellemzésére, osztályozására és megkülönböztetésére, szövetek és sejtcsoportok viselkedésének előrejelzésére és kifejeződésükben megváltozott gének azonosítására, azzal jellemezve, hogy egy kívánt szövetmintából kinyert kezeletlen, elvágott vagy restrikciós endonukleázzal hasított genomiális DNS-ben a citozint — 5 metilcitozint azonban nem — önmagában ismert útonmódon hidrogénszulfit oldattal uracillá alakítjuk, az így kezelt genomiális DNS frakcióit megsokszorozzuk vagy nagyon rövid vagy degenerált oligonukleotidok, vagy olyan oligonukleotidok alkalmazásával, amelyek a hidrogénszulfitos kezelés előtt az elhasított DNS végeihez ligáit adapter oligonukleotidokkal komplementerek, a megsokszorozott frakciókból a guaninban gazdag DNS szálon megmaradó citozinoknak és/vagy a citozinban gazdag DNS szálon levő guaninoknak összesen olyan mennyiségét mutatjuk ki hibridizációval vagy polimeráz láncreakcióval, hogy egy ilyen vizsgálatban keletkezett és automatikusan egy feldolgozó algoritmusra átvitt adatok az analizált sejt fenotípusára visszakövetkeztetést tegyenek lehetővé.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fenotípusosan azonos vagy hasonló sejtekből vagy szövetekből

   származó DNS próbákra elvégzett több vagy sok ilyen kísérletnek ebből az analízisből nyert adatait tréning-fázisban egy neuron hálózaton vagy más kiértékelő algoritmusokon keresztül korrelációba állítja azoknak a sejteknek a fenotípusával, amelyeknek a DNS-ét vizsgáljuk, az ennél a tréning-fázisnál a kiértékelő algoritmusba a fenotípus és metilezettség-mintázat közötti összefüggésről felvett adatokat ahhoz használjuk fel, hogy egy ismeretlen eredetű DNS próba metilezettség-mintázatának rendszerezése által levezessük azoknak a sejteknek a fenotípusát, amelyeknek DNS-ét vizsgáljuk, vagy az ennél a tréning-fázisnál a kiértékelő algoritmusba egy ismert sejttípus DNS-ének metilezettség-mintázatáról felvett adatokat ahhoz használjuk fel, hogy olyan citozin helyeket azonosítsunk, amelyek a vizsgált DNS-ben a tréning-fázisban megállapított metilezettség-állapottól eltérnek.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-t a hidrogénszulfitos kezelés előtt olyan restrikciós endonukleázokkal hasítjuk, melyeknek felismerési szekvenciájában a citozin 5' -CpG-3' környezetben található és a DNS-t ezen felismerési szekvenciák közül csak azokban hasítják, amelyekben a citozin 5' -CpG-3' környezetben, az 5' -helyzetben nem-metilezett állapotban fordul elő.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mielőtt a genomiális DNS-t önmagában ismert úton-módon hidrogénszulfit oldattal módosítjuk, ezt a genomiális DNS-t restrikciós endonukleázzal hasítjuk, a keletkezett végeket ligációs reakcióval ismert, rövid és kétszálú - adapternek is nevezett - DNS szekvenciákkal látjuk el, a hidrogénszulfittál kezelt adapterekkel komplementer oligonukleotidokat arra használjuk, hogy minden így keletkezett DNS fragmentumot vagy minden így keletkezett fragmentum összességéből szub-populációkat hidrogénszulfitos kezelést követően megsokszorozzunk .
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy genomiális DNS próba hidrogénszulfit oldattal történő reakciója - citozinok uracilokká való átalakítása céljából, metilcitozinok egyidejű megtartásával — 0 °C és 100 °C közé eső reakció-hőmérséklet ciklikus változtatása mellett játszódik le.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidrogénszulfitos kezelés előtt a DNS próbákat egy termosztálható, csak kis molekulákat átengedő porózus kapillárison vezetjük át, amelyben a hidrogénszulfitos kezelés következő reakciólépéseit, a reagensek oda- és elvezetését dialízissel valósíthatjuk meg.
7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidrogénszulfitos kezelés előtt a DNS próbákat egy termosztálható, kis molekulák számára nem áteresztő kapillárison vezetjük át, amelyben a hidrogénszulfitos kezelés következő reakciólépéseit, a reagensek oda- és elvezetését hozzákapcsolt kapillárison keresztül valósíthatjuk meg.
8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidrogénszulfitos kezeléshez kapcsolódó polimeráz láncreakció kát ugyanabban a kapillárisban, mint a hidrogénszulfitos kezelést, vagy ehhez a kapillárishoz kapcsolódó kapillárisban, vagy ehhez a kapillárishoz kapcsolt tartályban végezzük el.
9. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy kapillárisban, amelyben a hidrogénszulfittal kezelt DNS próbával polimeráz láncreakciót végzünk, a keletkezett fragmentum populáció hosszúság szerinti elválasztását is elvégezzük.
10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidrogénszulfit kicsapása révén attól egy kezelt DNS elválasztható .
11. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidrogénszulfittal kezelt genomiális DNS próbák megsokszorozásához két osztályba tartozó oligonukleotidokat kombinálunk, ahol az első osztályba tartozó oligonukleotidok citozin bázist vagy annak analógját nem - kivéve 5' -CpG-3' környezetben nagyon csekély mennyiségben vagy az oligonukleotidnak csak a sokszorozás szempontjából lényegtelen területein — tartalmazzák, és ahol a második osztályba tartozó oligonukleotidok guanin bázist vagy annak analógját nem - kivéve 5' -CpG-3' környezetben nagyon csekély mennyiségben vagy csak a sokszorozás szempontjából lényegtelen, például az oligonukleotid 5' -régiójában — tartalmazzák, és ahol mindkét osztálybeli oligonukleotidok vagy

    a) olyan rövidek, hogy mindkét osztálynak csak egy-egy képviselőjével történő sokszorozásnál több, mint száz különböző fragmentum sokszorozódik, vagy

    b) ezek az oligonukleotidok olyan sok úgynevezett degenerált helyet tartalmaznak, hogy mindkét osztálynak csak egy-egy

    ·.? Ο ··> ·’ képviselőjével történő sokszorozásnál több, mint száz különböző fragmentum sokszorozódik, vagy

    c) mindkét osztálybeli oligonukleotidból olyan sok képviselőt alkalmazunk a sokszorozásnál, hogy több, mint száz különböző fragmentum sokszorozódik.
12. 12. A 4. vagy 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelt és megsokszorozott DNS-t egymástól elválasztott tételekben polimeráz láncreakció céljából minden egyes reakcióban különböző oligonukleotidokkal keverjük össze, amelyek 5' -végükön az adapterekhez vagy általánosan a hidrogénszulfittál kezelt oligonukleotid sokszorozásához komplementerek, amelyek 3' -végükön minden reakcióban különbözőek és amelyeknek változó 3' -végei az ismert adapter—szekvencia vagy oligonukleotid-szekvencia mögött kezdődnek és amelyeknek változó 3' -végei az ismert adapter-szekvencián keresztül két és tizenkét nukleotid között az ismeretlen templát DNS szekvenciába benyúlnak.
13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan reakciók, amelyekben polimeráz láncreakciót a hidrogénszulfittal kezelt DNS-sel komplementer oligonukleotidokkal indítunk, a három nukleotidon — dATP, dTTP és dCTP — és ezen három nukleotid analógjain kívül citozin bázissal komplementer nukleotid analógot tartalmaznak, amely a polimeráz segítségével történő beépülést követően minden további szálhosszabbítást megakadályoz, vagy egyáltalán nem tartalmaznak citozin bázissal komplementer

    nukleotidot vagy nukleotid analógot.
14. 14. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan reakciók, amelyekben polimeráz láncreakciót a hidrogénszulfittal kezelt DNS komplementer DNS-ével komplementer oligonukleotidokkal indítunk, a három nukleotidon — dATP, dTTP és dGTP — és ezen három nukleotid analógjain kívül guanin bázissal komplementer nukleotid analógot tartalmaznak, amely a polimeráz segítségével történő beépülést követően minden további szálhosszabbitást megakadályoz, vagy egyáltalán nem tartalmaznak guanin bázissal komplementer nukleotidot vagy nukleotid analógot.
15. 15. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polimeráz láncreakció terminációja azokon a helyeken, amelyeken a DNS próba előzőleg metilcitozint tartalmazott, olyan terminátorokkal megy jól végbe, amelyek maguk is olyan útonmódon módosítottak, hogy lehetővé teszik a specifikusan terminált polimeráz reakciótermékek kimutatását.
16. 16. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a különböző, a 3-15. igénypontok megfelelő kombinációjából eredményül kapott egyes reakciós tételek fragmentum keverékeit MALDI-TOF vagy más tömegspektrométer ionforrásának egyedi pontjaira visszük fel és az egyes reakciók fragmentum-összetételét az összes DNS fragmentum tömegének meghatározása révén állapítjuk meg.
17. 17. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a különböző, a 3-15. igénypontok megfelelő kombinációjából eredményül kapott egyes reakciós tételek fragmentum keverékeit gélelektroforézis egyedi pályáira visszük fel és az egyes reakciók fragmentum-összetételét az összes DNS fragmentum hosszúságának megmérésével határozzuk meg.
18. 18. A 4. vagy 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 12. igénypontban definiált oligonukleotidokat — amelyekkel a polimeráz láncreakciókat indítjuk — olyan, különböző szekvenciájú oligonukleotidonként különböző kémiai jelzésekkel kapcsoljuk, hogy ezek kémiai és/vagy fizikai sajátságai a különböző jelzéseknek a használatos kromatográfiás vagy tömegspektrometriás eljárásokkal való kimutatását és megkülönböztetését tegyék lehetővé.
19. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó, hidrogénszulfittál kezelt DNS első sokszorozási lépésben előállított fragmentum frakcióját egyidejűleg két vagy több, kémiailag eltérően jelzett oligonukleotiddal keverjük össze, ezeket az oligonukleotidokat egy reakció-összetételben a polimeráz láncreakció primereként használjuk fel, a fragmentumok előállott komplex keverékét első analitikai lépésben elektroforézissel történő, hosszúság szerinti felbontásnak vetjük alá és az elektroforézissel kapott fragmentum keverékek egyes hoszszúság szerinti frakcióit kromatográfiás vagy tömegspektrometriás analízisnek vetjük alá, amely minden hosszúság szerinti frakcióban detektálja az oligonukleotidokat jellemző kémiai jelzések jelenlétét vagy hiányát.
20. 20. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy

    .... .... ·.·» _t , ’·« * ' * * * * * felületre viszünk fel oligonukleotidokat, amelyek vagy citozin bázist vagy annak analógját nem — csak 5' -CpG-3' környezetben vagy csak próba DNS-sel való hibridizációhoz lényegtelen területeken — tartalmazzák, vagy guanin bázist nem — csak 5' -CpG-3' környezetben vagy csak próba DNS-sel való hibridizációhoz lényegtelen területeken — tartalmaznak.
21. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidrogénszulfittal kezelt és vagy a 4. vagy a 11. igénypont szerint megsokszorozott próba DNS-t felületen rögzített oligonukleotidokkal hibridizáltatunk, amelyeket önmagában ismert úton-módon úgy rögzítettünk ehhez a felülethez, hogy a felület minden pontjáról tudható, melyik oligonukleotid-szekvencia található pontosan azon a ponton; a megsokszorozott próba DNS és a rögzített oligonukleotidok között akkor következik be hibridizáció illetve megfelelő mosási lépések után akkor marad meg, ha az oligonukleotidok és a próba DNSek a hibridizáció szempontjából lényeges területeken teljes mértékben egymás komplementerei.
22. 22. Az 1-21. igénypontokban foglaltak megvalósítását szolgáló kit, amely a fenti igénypontokban definiált komponensek közül legalább kettőt (például hidrogénszulfittal kezelt DNS sokszorozásához való oligonukleotidok és — a kimutatáshoz mátrixon rögzített oligonukleotidok kombinációját) a DNS-nek hidrogénszulfittal való kezeléséhez, e kezelt DNS sokszorozásához és azt követően egy emlős genom több, mint száz CpG dinukleotidjának metilezettség-állapot felméréséhez - egyetlen reakcióban úgy

    kombinál, hogy egy rákbetegség klinikailag releváns diagnózisa felállítható legyen.

    A meghatalmazott:

    m Gaborné

    M sza&dahni ügyvivő az S.B.G. & K- Nemzetközi

    H- 1062 Budapest, Andrássy út 1 13. TOefon: 34-24-950, Fax: 34-24-323