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JP2003144172A - メチル化検出用オリゴヌクレオチド固定化基板 - Google Patents

メチル化検出用オリゴヌクレオチド固定化基板

Info

Publication number
JP2003144172A
JP2003144172A JP2001351938A JP2001351938A JP2003144172A JP 2003144172 A JP2003144172 A JP 2003144172A JP 2001351938 A JP2001351938 A JP 2001351938A JP 2001351938 A JP2001351938 A JP 2001351938A JP 2003144172 A JP2003144172 A JP 2003144172A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
oligonucleotide
immobilized
substrate
dinucleotide
capture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001351938A
Other languages
English (en)
Inventor
Osamu Suzuki
収 鈴木
Tatsuo Ichihara
竜生 市原
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nisshinbo Holdings Inc
Original Assignee
Nisshinbo Industries Inc
Nisshin Spinning Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nisshinbo Industries Inc, Nisshin Spinning Co Ltd filed Critical Nisshinbo Industries Inc
Priority to JP2001351938A priority Critical patent/JP2003144172A/ja
Priority to CA002407575A priority patent/CA2407575A1/en
Priority to EP02257873A priority patent/EP1312685A3/en
Priority to US10/294,171 priority patent/US20030096289A1/en
Publication of JP2003144172A publication Critical patent/JP2003144172A/ja
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＤＮＡ中のメチル化シトシンを迅速かつ簡便
に行うことができる手段を提供する。 【解決手段】 メチル化され得るＣと、その３’側のヌ
クレオチドからなるジヌクレオチド（ＣｐＮジヌクレオ
チド）を含む標的配列を含む試料ＤＮＡ中のＧの５’側
に位置するＣのメチル化の有無を、基材上に固定化さ
れ、前記標的配列のＣｐＮジヌクレオチドのＣ以外のＣ
をＴに置換した塩基配列に相補的又は同一の塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドと、前記標的配列のすべての
ＣをＴに置換した塩基配列に相補的又は同一の塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドを少なくとも含む複数のキ
ャプチャーオリゴヌクレオチドと、メチル化されていな
いシトシンを脱アミノ化してウラシルに変換させた試料
ＤＮＡ又はその増幅産物との間でハイブリダイゼーショ
ンを行い、前記ハイブリダイゼーションの結果によっ
て、判定する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ上のシトシ
ンのメチル化の検出用オリゴヌクレオチド固定化基板及
び方法に関するものである。詳しくは、遺伝子の発現な
どにおいて調節領域内にあり大量に見出されるメチル化
されたシトシンを検出することによって遺伝子異常がも
たらす疾病の原因を明らかにし、予後の施策をするため
の基板もしくは基材を提供する。
【０００２】
【従来の技術】DNAのメチル化は、DNAの複製や発現の調
節において重要な役割を果たしている。真核細胞のDNA
のメチル化は、Ｇ（グアニン）の５’側に位置するＣ
（シトシン）（以下、「CpGジヌクレオチド」という）
の５’位で生じることが多い。特に多くの遺伝子のプロ
モーター領域には多くのCpGジヌクレオチドが見られ、C
pGアイランドと呼ばれている（Bird, A., Cell, 70, 5-
8, 1992）。一般に、常染色体のこれらCpGアイランドの
大部分はメチル化されているが、プロモーター領域に密
集して存在するCpGアイランドはメチル化されていない
(Ng, H-H. et al.,Curr. Opin. Genet. Dev., 9, 158-1
63, 1999）。また、白血病や骨髄腫において、ガン抑制
遺伝子であるP16やP15のプロモーター領域のCpGアイラ
ンドがメチル化され、その結果これらの遺伝子が不活化
されるか発現量の変化によってガン化することが知られ
ている（Shu-Xia Gao et al., Leukemia Res., 24, 39-
46,2000; M. Gonzalez et al., Leukemia, 14, 183-18
7, 2000）。また、Ｇ以外のヌクレオチドの５’側に位
置するＣも、メチル化を受けることが報告されている
（Gruenbaum, H., et al 1981. Nature 292:860-6
2）。
【０００３】さらに、メチル化はエピジェネティックな
変化を司るDNAの修飾方法であり、ゲノムインプリンテ
ィングでは、発現抑制のために対立する遺伝子のどちら
かがメチル化されることで発現が抑制され、どちらかの
親由来の遺伝子が発現する機構がある。したがってメチ
ル化状態が変化すると胎生致死や遺伝病などの発症など
を引き起こすこともある（Li, E., et al., Cell, 69,
915-926, 1992; Okano, M., et al., Cell, 99, 247-25
7, 1999; Xu, G-L., Nature, 402, 187-191, 1999）。
以上のようなことから、シトシンのメチル化は、遺伝子
の発現制御で大きな役割を担い、そのメチル化パターン
の変化が疾病等を惹起させるといえる。したがって、メ
チル化パターンを明らかにすることは、疾病の治療およ
び予後を推し量る上で重要な情報である。
【０００４】メチル化されていないシトシンは、重亜硫
酸ナトリウムで脱アミノ化することによって容易にウラ
シルに変換される（Shapiro, R. et al., J. Amer. Che
m.,92, 422, 1970）。一方、メチル化されているシトシ
ンは、重亜硫酸ナトリウムで処理してもウラシルへは変
換されない。したがって、被検体由来のDNAを重亜硫酸
ナトリウムで処理し、メチル化されたシトシンだけがウ
ラシルに変換されたDNAを得ることができる。
【０００５】この重亜硫酸ナトリウムで処理した被検体
DNAを用いて、メチル化されたシトシンを検出するに
は、以下の（１）または（２）の方法が用いられてい
る。
【０００６】（１）シーケンス解析 被検体由来のゲノムを重亜硫酸ナトリウムで処理し、ポ
リメラーゼ・チェイン・リアクション（PCR）で増幅し
た後、シーケンス解析を行う方法（Marianne, F., et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1827-1831, 199
2）がある。また、増幅された領域をクローニングし
て、メチル化のマッピングを行うことも可能である。
【０００７】この手法の場合、メチル化シトシンのマッ
ピングには、シーケンス解析が必須の技術であるが、Cp
Gアイランドが存在する調節領域は１〜２キロベースで
あるため、複数回のシーケンス反応を行う必要があり、
容易な手段であるとはいいがたい。更に、高価な自動シ
ーケンサー又は危険な放射性同位体を用いるため、簡便
な方法とはいえない。また、シーケンス解析で多検体を
処理することは難しい。
【０００８】さらに、シーケンス解析に用いるプライマ
ーの３'末端が、対合するシトシンにメチル基修飾が行
われているかどうかの事前情報が必要である。したがっ
てCpGのシトシンがメチル化されているかを明らかにす
るためにいくつかの操作が必要となる。
【０００９】（２）メチレーション特異的PCR ３’末端にＡ（アデニン）またはＧ（グアニン）を持つ
PCRプライマーを調製し、重亜硫酸ナトリウムで処理し
たDNAを鋳型にしてPCRを行う（James G. H., et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 9821-9826, 1996）。
得られた増幅産物を電気泳動で分析する。この手法で
は、３’末端がＴのプライマーで増幅が確認できた場合
は、被検体DNAの前記Ｔに対応する位置のシトシンはメ
チル化されている。一方３’末端がＧのプライマーで増
幅が確認できた場合は、シトシンはメチル化されていな
いということになる。各々のCpGアイランドに対してこ
の手法を用いれば、メチル化シトシンのマッピングが可
能になる。
【００１０】この手法では、各々のCpGアイランドに対
して特異的なPCR用プライマーを用意する必要がある。
すなわち、１箇所のCpGについて、プライマーの３’末
端がＧ及びＡの２種類のプライマーと、逆方向のプライ
マーとの３種類のプライマーが少なくとも必要となる。
そのため、CpGリッチな調節領域のメチル化シトシンの
マッピングには膨大なPCR用プライマーを用意し、膨大
な数のPCR反応を行い、増幅された膨大な数のPCR産物を
電気泳動で解析する必要がある。更に複数の検体を調べ
ることは、計り知れないPCR反応回数になるため、この
手法では困難である。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＤＮＡ中の
メチル化シトシンを検出する方法であって、CpGリッチ
な調節領域のメチル化シトシンのマッピング等、多数の
ＤＮＡ試料又はＤＮＡ中の多数の部位でのメチル化シト
シンの検出を迅速かつ簡便に行うことができる方法を提
供することを課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を行った結果、試料ＤＮＡの
標的配列のうち、ＣｐＧジヌクレオチドのＣ以外のＣを
Ｔに置換した塩基配列に相補的又は同一の塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドと、前記標的配列のすべてのＣ
をＴに置換した塩基配列に相補的又は同一の塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドを固定化した基板を作製し、
基板上のオリゴヌクレオチドと、メチル化されていない
シトシンを脱アミノ化してウラシルに変換させた試料Ｄ
ＮＡをハイブリダイズさせることによって、ＣｐＧジヌ
クレオチドのＣのメチル化の有無を、簡便かつ迅速に検
出することができることを見出し、本発明を完成するに
至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。
【００１３】（１）試料ＤＮＡ中のＣのメチル化の有無
を検出するために用いられ、複数のキャプチャーオリゴ
ヌクレオチドが基材上に固定化された、オリゴヌクレオ
チド固定化基板であって、前記試料ＤＮＡは、メチル化
され得るＣと、その３’側のヌクレオチドからなるジヌ
クレオチド（以下、「ＣｐＮジヌクレオチド」という）
を含む標的配列を含み、前記キャプチャーオリゴヌクレ
オチドは、前記標的配列のＣｐＮジヌクレオチドのＣ以
外のＣをＴに置換した塩基配列に相補的又は同一の塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドと、前記標的配列のす
べてのＣをＴに置換した塩基配列に相補的又は同一の塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドを少なくとも含み、
メチル化されていないシトシンを脱アミノ化してウラシ
ルに変換させた試料ＤＮＡ又はその増幅産物とキャプチ
ャーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに
よって、前記メチル化の有無を検出する、オリゴヌクレ
オチド固定化基板。 （２）前記Ｃの３’側のヌクレオチドがＡ、Ｇ、又はＴ
である（１）のオリゴヌクレオチド固定化基板。 （３）前記Ｃの３’側のヌクレオチドがＧである(２)の
オリゴヌクレオチド固定化基板。 （４）前記キャプチャーオリゴヌクレオチドがカルボジ
イミド基を介して固定化された(１）〜（３）のいずれ
かのオリゴヌクレオチド固定化基板。 （５）前記キャプチャーオリゴヌクレオチドが基材上に
ドット状で固定化され、各々のドットの占有面積が０．
１ｃｍ2以下である(１）〜（４）のいずれかのオリゴヌ
クレオチド固定化基板。 （６）前記キャプチャーオリゴヌクレオチドが３０ｍｅ
ｒ以下のオリゴヌクレオチドである(１）〜（５）のい
ずれかのオリゴヌクレオチド固定化基板。 （７）前記試料ＤＮＡは複数の標的配列を含み、各々の
標的配列に対応するキャプチャーオリゴヌクレオチドが
固定化された(１）〜（６）のいずれかのオリゴヌクレ
オチド固定化基板。 （８）ＣｐＮジヌクレオチドを含む標的配列を含む試料
ＤＮＡ中のＣｐＮジヌクレオチドのＣのメチル化の有無
を検出する方法であって、基材上に固定化され、前記標
的配列のＣｐＮジヌクレオチドのＣ以外のＣをＴに置換
した塩基配列に相補的又は同一の塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチドと、前記標的配列のすべてのＣをＴに置
換した塩基配列に相補的又は同一の塩基配列を有するオ
リゴヌクレオチドを少なくとも含む複数のキャプチャー
オリゴヌクレオチドと、メチル化されていないシトシン
を脱アミノ化してウラシルに変換させた試料ＤＮＡ又は
その増幅産物との間でハイブリダイゼーションを行い、
前記ハイブリダイゼーションの結果によって前記メチル
化の有無を判定することを特徴とする方法。 （９）試料ＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムで処理すること
によって、前記メチル化されていないシトシンを脱アミ
ノ化する、(８）の方法。 尚、本発明においては、便宜上ヌクレオチドを塩記名で
表すこととする。Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴは、それぞれアデニ
ン、グアニン、シトシン及びチミンを表す。
【００１４】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のオリゴヌクレオチド固定化基板は、試料ＤＮＡ
中のＣのメチル化の有無を検出するために用いられるも
のである。試料ＤＮＡはメチル化され得るＣと、その
３’側のヌクレオチドからなるジヌクレオチド（ＣｐＮ
ジヌクレオチド）を含む標的配列を含む。メチル化され
得るＣとは、通常はＧの５’側に位置するＣであるが、
Ａ、Ｇ又はＴのいずれかのヌクレオチドの５’側に位置
するＣがメチル化され得る場合は、そのＣを指す。標的
配列は、試料ＤＮＡにつき一個存在してもよく、複数存
在してもよい。また、１つの標的配列中にＣｐＮジヌク
レオチドは一個存在してもよく、複数存在してもよい。
前記Ｃの３’側のヌクレオチドとしては、Ａ、Ｇ、又は
Ｔが挙げられ、好ましくはＧが挙げられる。
【００１５】前記オリゴヌクレオチド固定化基板は、基
材と、同基材上に固定化された複数のキャプチャーオリ
ゴヌクレオチドからなる。キャプチャーオリゴヌクレオ
チドは、前記標的配列のＣｐＮジヌクレオチドのＣ以外
のＣをＴに置換した塩基配列に相補的又は同一の塩基配
列を有するオリゴヌクレオチド（以下、「Ｃ特異的オリ
ゴヌクレオチド」ともいう）と、前記標的配列のすべて
のＣをＴに置換した塩基配列に相補的又は同一の塩基配
列を有するオリゴヌクレオチド（以下、「Ｔ特異的オリ
ゴヌクレオチド」ともいう）を少なくとも含む。
【００１６】上記のようなキャプチャーオリゴヌクレオ
チドと、メチル化されていないＣを脱アミノ化してウラ
シルに変換させた試料ＤＮＡ又はその増幅産物との間で
ハイブリダイゼーションを行うと、標的配列中のＣｐＮ
ジヌクレオチドのＣがメチル化されている場合は、この
Ｃはウラシルに変換されず、ＣｐＮジヌクレオチドのＣ
以外のＣはウラシルに変換されるため、標的配列にＣ特
異的オリゴヌクレオチドはハイブリダイズするが、Ｔ特
異的オリゴヌクレオチドはハイブリダイズしない。一
方、標的配列中のＣｐＮジヌクレオチドのＣがメチル化
されていない場合は、このＣを含め、すべのＣがウラシ
ルに変換されるため、標的配列にＣ特異的オリゴヌクレ
オチドはハイブリダイズしないが、Ｔ特異的オリゴヌク
レオチドはハイブリダイズする。したがって、上記ハイ
ブリダイゼーションの結果から、ＣｐＮジヌクレオチド
のＣのメチル化の有無を検出することができる。
【００１７】図１に、ＣｐＮジヌクレオチドがＣｐＧで
ある場合のキャプチャーオリゴヌクレオチドと標的配列
の例を示す。配列番号５は、Ｃが脱アミノ化されていな
い試料ＤＮＡの塩基配列のモデルである。配列番号６
は、同試料ＤＮＡの全てのＣが脱アミノ化されてウラシ
ルに変換した塩基配列のモデルである。このモデルは、
Ｃのメチル化が起きていないＤＮＡを代表する。また、
配列番号７は、前記試料ＤＮＡに含まれる２箇所のＣｐ
ＧジヌクレオチドのＣはそのまま保存され、他の全ての
Ｃがウラシルに変換した塩基配列のモデルである。この
モデルは、ＣｐＧジヌクレオチドのＣがメチル化された
ＤＮＡを代表する。
【００１８】配列番号１及び２は、２つのＣｐＧジヌク
レオチドのうち５’末端側のＣｐＧジヌクレオチドを含
む標的配列に対応するキャプチャーオリゴヌクレオチド
であり、配列番号１はＣ特異的オリゴヌクレオチド、配
列番号２はＴ特異的オリゴヌクレオチドである。また、
配列番号３及び４は、２つのＣｐＧジヌクレオチドのう
ち３’末端側のＣｐＧジヌクレオチドを含む標的配列に
対応するキャプチャーオリゴヌクレオチドであり、配列
番号３はＣ特異的オリゴヌクレオチド、配列番号２はＴ
特異的オリゴヌクレオチドである。配列番号１及び配列
番号３のキャプチャーオリゴヌクレオチドは配列番号７
のＤＮＡの相補鎖に、配列番号２及び配列番号４のキャ
プチャーオリゴヌクレオチドは配列番号６のＤＮＡの相
補鎖に、各々ハイブリダイズする。
【００１９】試料ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡでも二本鎖Ｄ
ＮＡでもよい。一本鎖ＤＮＡの場合には、キャプチャー
オリゴヌクレオチドは、標的配列のＣｐＮジヌクレオチ
ドのＣ以外のＣをＴに置換した塩基配列に相補的な塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドと、前記標的配列のす
べてのＣをＴに置換した塩基配列に相補的な塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドである。一方、二本鎖ＤＮＡ
の場合は、標的配列を含む鎖と、それに対して相補的な
配列を有する鎖を含んでおり、ＣｐＮジヌクレオチドは
各々の鎖で対称的であるから、キャプチャーオリゴヌク
レオチドは、一本鎖ＤＮＡの場合と同じオリゴヌクレオ
チドであってもよく、それらに相補的な塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００２０】キャプチャーオリゴヌクレオチドは、一塩
基の相違をハイブリダイゼーションにより検出できるも
のであれば、配列及び長さは特に制限されないが、通
常、１０〜３０ｍｅｒ、好ましくは１０〜２５ｍｅｒ、
特に好ましくは１３〜２５ｍｅｒの長さが好ましい。
【００２１】キャプチャーオリゴヌクレオチドとして用
いるオリゴヌクレオチドは、通常の固相合成法によっ
て、化学合成することができる。上記キャプチャーオリ
ゴヌクレオチドは、基板上に固定化される。一つの基板
には、少なくとも一つの標的配列に対応するキャプチャ
ーオリゴヌクレオチド対（Ｔ特異的オリゴヌクレオチド
及びＣ特異的オリゴヌクレオチド）が固定化されるが、
複数の標的配列に対応した複数のキャプチャーオリゴヌ
クレオチド対が固定化されてもよい。
【００２２】各々のオリゴヌクレオチドは、好ましくは
５’末端部分又は３’末端部分で、基材に固定化され
る。本発明で用いる基材は、物理的吸着又は化学結合に
よってオリゴヌクレオチドを固定化することができ、通
常のハイブリダイゼーションの条件に耐えうるものであ
れば特に制限されない。具体的には、オリゴヌクレオチ
ドの固定及びハイブリダイゼーション等に用いる溶剤に
不溶であり、かつ常温若しくはその付近の温度範囲内
（例えば０℃〜１００℃）で固体又はゲル状であるもの
が挙げられる。尚、基材が溶剤に不溶性であるとは、基
材に後述のようにしてカルボジイミド基等のオリゴヌク
レオチドに結合性を有する基材が胆持され、ついでオリ
ゴヌクレオチドが固定化され、その後、例えば、ＤＮＡ
チップ等として使用される際の各過程で用いられる水性
溶剤、有機溶剤等の各種溶剤に実質的に不溶性であるこ
とをいう。
【００２３】このような基材の材質として、具体的に
は、プラスチック、無機高分子、金属、天然高分子、セ
ラミック等が挙げられる。上記プラスチックとして具体
的には、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネー
ト、ポリプロピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エ
ポキシ樹脂、ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニ
ル、ポリフッ化ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリ
イミド及びアクリル樹脂等が挙げられる。
【００２４】また、無機高分子として具体的には、ガラ
ス、水晶、カーボン、シリカゲル及びグラファイト等が
挙げられる。また、金属として具体的には、金、白金、
銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石、パラマグネット及び
アパタイト等が挙げられる。
【００２５】また、天然高分子としては、ポリアミノ
酸、セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸及びそ
れら誘導体が挙げられる。また、セラミックとして具体
的には、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素及
び炭化ホウ素等が挙げられる。
【００２６】上記基材の形状としては、例えば、フィル
ム、平板、粒子、成形品（ビーズ、ストリップ、マルチ
ウェルプレートのウェルまたはストリップ、チューブ、
メッシュ、連続発砲フォーム、膜、紙、針、ファイバ
ー、プレート、スライド及び細胞培養容器等）、ラテッ
クス等を挙げることができる。また、それらの大きさに
ついては、特に制限は無い。
【００２７】上記基材にオリゴヌクレオチドを固定化す
るにあたって、基材にオリゴヌクレオチドを直接固定化
してもよく、担体を基材に担持させて、担体を介してオ
リゴヌクレオチドを基材に固定化してもよい。基材とし
ては、基材自体がオリゴヌクレオチドに結合性を有して
いてもよく、オリゴヌクレオチドに結合性を有するリガ
ンドを介してオリゴヌクレオチドを固定化できるもので
あってもよい。ここで、「担持」とは、基材にオリゴヌ
クレオチドを固定化する際や、オリゴヌクレオチド固定
化基材をＤＮＡチップ等として使用する際等に用いられ
る水溶性溶剤、有機溶剤等の各種溶剤中で、基材からオ
リゴヌクレオチドが実質的に脱離しないことを意味す
る。
【００２８】本発明に用いられる担体は、上記基材上に
担持される限り、単に物理的な接着性を利用して担持さ
れていてもよく、また、化学的に共有結合等を介して胆
持されていてもよい。また、上記担体は、必要に応じ、
基材上の全面において担持されても、また、その一部に
おいて胆持されてもよい。
【００２９】担体としては、有機低分子、プラスチッ
ク、無機高分子、金属、天然高分子、セラミック等が挙
げられる。上記有機低分子として具体的には、カルボジ
イミド基含有化合物、イソシアネート基含有化合物、窒
素イペリット基含有化合物、アルデヒド基含有化合物、
アミノ基含有化合物等が挙げられる。
【００３０】また、プラスチックとして具体的には、ポ
リエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプ
ロピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹
脂、ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフ
ッ化ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミド及び
アクリル樹脂等が挙げられる。
【００３１】また、無機高分子として具体的には、ガラ
ス、水晶、カーボン、シリカゲル及びグラファイト等が
挙げられる。また、金属として具体的には、金、白金、
銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石、パラマグネット及び
アパタイト等が挙げられる。
【００３２】また、天然高分子としては、ポリアミノ
酸、セルロース、キチン、キトサン及びそれらの誘導体
が挙げられる。また、セラミックとして具体的には、ア
ルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素及び炭化ホウ
素等が挙げられる。
【００３３】このような担体は、上記基材に対して高い
接着性を有するものであり、この接着性を利用して基材
に担持されるものである。尚、前記担体が基材上に物理
的な接着性を利用して担持される際の代表的な形態は皮
膜である。前記基材上に前記担体を皮膜で担持させる方
法としては、スプレー、浸漬、ブラッシング、スタン
プ、蒸着、フィルムコータを用いたコーティング等の公
知の方法を用いることができる。
【００３４】例えば、ガラス基材の表面全体にカルボジ
イミド基を有する樹脂を担持させるには、まず、３−ア
ミノプロピルトリエトキシシラン等のアミノ置換オルガ
ノアルコキシシランを適当な溶媒に溶解して得られた溶
液に、７０〜８０℃程度の温度条件下でガラス基材を概
ね２〜３時間程度浸漬したあと、これを取り出して溶液
を水洗し、さらに、１００〜１２０℃程度で約４〜５時
間加熱乾燥する。乾燥後、適当な溶媒中に浸し、カルボ
ジイミド樹脂を加え３０〜１７０℃程度の温度条件下で
１２時間程度攪拌し洗浄すれば良い。また、上記３−ア
ミノプロピルトリエトキシシランのアミノ基と窒素イペ
リット基のオリゴヌクレオチド結合基以外の官能基を適
当な溶媒を用いて反応させ、ガラス基材の表面に窒素イ
ペリット基を導入することもできる。
【００３５】また、ガラス基材にアミノ基以外の官能基
を存在する場合や、基材がガラス以外の材料からなる場
合においても、上記基材の説明で挙げた各種材料表面に
種々の官能基を導入することは、従来より一般的に行わ
れていることであり、その方法も公知であるので、この
ような公知の方法を用いて基材表面への官能基の導入を
行うことができる。
【００３６】さらに、上記で挙げた基材のプラスチック
基材の中には、基材表面に既に上記のような官能基を有
するものも有り、この場合には基材表面に官能基を導入
することなしに、これをそのまま基材の製造に用いるこ
とも可能である。また、このようなプラスチック基材で
あってもさらに官能基を導入して上記基材の製造に用い
ることも可能である。
【００３７】キャプチャーオリゴヌクレオチドは、上記
のような基材上に、５’末端部分又は３’末端部分で固
定化される。オリゴヌクレオチドの固定化の方法は、基
材、基材表面の官能基、リガンドの種類等に応じて、適
宜設定すればよい。
【００３８】キャプチャーオリゴヌクレオチドは、基材
に固定化する末端側に、３塩基又はそれ以上の長さのホ
モポリマーを結合させてもよい。特に、表面にカルボジ
イミド基を有する基材を用いる場合、ホモポリマーを有
するオリゴヌクレオチドは、基材により強固に固定化さ
れる。
【００３９】上記のようなオリゴヌクレオチドの末端に
ホモポリマーを結合する方法としては、公知の方法を用
いることができる。具体的には、例えば、市販されてい
る核酸合成器を用いて、オリゴヌクレオチドの末端に核
酸塩基が少なくとも３塩基以上重合するように、一体と
して合成する方法が挙げられる。また、ホモポリマー
を、オリゴヌクレオチドと化学的または酵素的な手法を
用いて結合する方法等が挙げられる。ホモポリマーを構
成する核酸塩基は、核酸がＤＮＡである場合はアデニ
ン、グアニン、シトシン又はチミンであり、ＲＮＡであ
る場合はアデニン、グアニン、シトシン又はウラシルで
ある。
【００４０】ホモポリマーの長さとしては、３塩基以上
１００塩基以下が好ましく、５塩基以上５０塩基以下が
より好ましく、１０塩基以上４０塩基以下が特に好まし
い。この塩基数が２塩基以下であると、十分な量の核酸
を基材上に固定できず、また、塩基数が１０１塩基以上
であると核酸製造工程で著しく収率が低下する。
【００４１】また、ホモポリマーは、ある塩基から構成
されるホモポリマーと、他の塩基から構成されるホモポ
リマーが連結したものであってもよい。また、オリゴヌ
クレオチドの５’末端は、アミノリンカーを介して固定
化してもよい。
【００４２】オリゴヌクレオチドを固定化するに際し、
基材上にオリゴヌクレオチドをドット状に固定すること
が好ましい。ドット状に固定するとは、基材の大きさに
対して、オリゴヌクレオチド固定部位が複数個所設けら
れる程度に充分小さいことをいう。前記ドットの形状
は、特に制限されないが、通常は円形が好ましい。キャ
プチャーオリゴヌクレオチドは、通常、基材上の複数個
所に固定化され、いわゆるＤＮＡアレイ又はＤＮＡチッ
プとして調製される。
【００４３】具体的には、例えば、オリゴヌクレオチド
と基材との接触反応において固定化されるオリゴヌクレ
オチドの活性が維持されるように、通常、オリゴヌクレ
オチドは水またはバッファー中に含まれる形で供給され
る。また、接触の際の温度としては固定化されるオリゴ
ヌクレオチドの活性が失われないように、概ね０〜１０
０℃とすることが好ましい。
【００４４】また、オリゴヌクレオチドと基材の接触後
にUV等の電磁波を照射することによって固定することも
できる。さらに、オリゴヌクレオチドとカルボジイミド
樹脂、窒素イペリット、ポリアミノ酸、ニトロセルロー
ル等の公知の化合物を化学的に結合又は物理的に結合し
た状態で、これら混合物と基材を接触させ固定させても
良く、また、このときUV等の電磁波を照射して固定して
も良い。
【００４５】本発明においてオリゴヌクレオチドを、通
常は、オリゴヌクレオチドを含有する水またはバッファ
ーを、基材にドット状に供給する手段として、ディスペ
ンサを用いる方法、ピンを用いる方法、バブルジェット
（登録商標）を用いる方法等があるが、本発明はこれら
に限定されるものではない。また、このように溶液を微
量に供給する装置は、一般に市販されており、本発明に
おいてもこれらを用いることが可能である。
【００４６】キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化
した基材は、試料ＤＮＡが非特異的に結合することを防
ぐため、上記のようにしてドット状にキャプチャーオリ
ゴヌクレオチドを基材に固定化した後に、過剰量のウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、サケ精子ＤＮＡ
等を接触させ、未反応部分をブロックしておくことが好
ましい。
【００４７】本発明は、上記キャプチャーオリゴヌクレ
オチドを固定化した基板を用い、キャプチャーオリゴヌ
クレオチドと試料ＤＮＡ、又は又はその増幅産物との間
でのハイブリダイゼーションを行う。
【００４８】試料ＤＮＡは、ＣｐＮジヌクレオチドを含
み、Ｃのメチル化の存在が予想されるものであれば特に
制限されず、目的に応じて、種々の生物由来のＤＮＡが
使用される。試料ＤＮＡは、微生物細胞、又は動物もし
くは植物の種々の組織から調製される。試料ＤＮＡの調
製は、通常の細胞からのＤＮＡの調製と同様にして行う
ことができる。また、試料ＤＮＡとしては、細胞から調
製したＤＮＡをそのまま使用することもできるが、ＰＣ
Ｒ法等によって標的配列又は標的配列を含む領域を増幅
したものを用いてもよい。
【００４９】従来のメチレーション特異的PCRでは、１
箇所のCpNについて少なくとも３種類のプライマーが必
要となるが、本発明においては２種類のプライマーで、
複数のCpNを含む領域の増幅を行うことができる。ま
た、メチレーション特異的PCRでは、プライマーの３'末
端がCpNのシトシンに対応するように設計されるため、C
pGアイランドのようにCpN配列が多数存在する場合は、
比較的狭い範囲のCpNのメチル化しか検出することがで
きない。一方、本発明においては、プライマーは、３'
末端にCpNのＣが対応しないようにプライマーを設計す
ればよく、CpNのＣがメチル化されているか否かにかか
わらず、PCR増幅が可能である。
【００５０】試料ＤＮＡ、又はその増幅産物は、ハイブ
リダイゼーションに先立ち、メチル化されていないＣを
脱アミノ化してウラシルに変換させる。この非メチル化
Ｃの選択的脱アミノ化は、試料ＤＮＡを重亜硫酸ナトリ
ウムで処理することによって行うことができる。具体的
には、試料ＤＮＡを含む溶液に重亜硫酸ナトリウム（pH
5）を2.5Ｍ〜3.0Ｍとなるように加え、50℃で16時間加
熱する（J. G. Hermanet al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 93, 9821-9826, 1996）。加熱反応後シリカベー
スの精製用フィルターに試料DNAを吸着させ重亜硫酸ナ
トリウムを除去する。除去後シリカベースのフィルター
より試料DNAを回収し、エタノール沈殿などで濃縮す
る。
【００５１】ハイブリダイゼーションの具体的方法は特
に制限されないが、例えば、キャプチャーオリゴヌクレ
オチドを固定化した基板を、試料ＤＮＡを含む溶液に浸
漬するか、基板上のキャプチャーオリゴヌクレオチドを
固定化した部分に試料ＤＮＡを含む溶液をスポットする
ことによって、行うことができる。また、基板上のキャ
プチャーオリゴヌクレオチドを固定化した部分を囲むよ
うに枠で覆い、その中に試料ＤＮＡを含む溶液を流し込
んでもよい。
【００５２】溶液は、ＤＮＡのハイブリダイゼーション
が可能であれば特に制限されず、各種緩衝液を用いるこ
とができる。例えば、pH6.5〜8程度のTris-HClが挙げら
れる。溶液は、通常、ＤＮＡやオリゴヌクレオチドの分
子内で形成される塩基対が解離する程度の温度、例えば
９０〜１００℃程度に高められた後、キャプチャーオリ
ゴヌクレオチドと試料核酸中の標的配列がアニールする
温度に調整される。具体的には、キャプチャーオリゴヌ
クレオチドの長さにもよるが、通常５〜８０℃であるこ
とが好ましい。
【００５３】ハイブリダイゼーションの検出の方法は特
に制限されないが、例えば、試料核酸を予め標識物質で
標識しておき、ハイブリダイゼーションに続いて基板を
洗浄た後に、標識を検出することによって、行うことが
できる。標識物質としては、特に制限されないが、通常
ハイブリダイゼーションの検出に用いられている物質、
例えば放射性同位元素、蛍光色素、ビオチン、ハプテ
ン、又は抗原等が挙げられる。例えば、標識物質として
ビオチンを用いた場合、ハイブリダイゼーション操作後
に、ビオチンに特異的に結合する蛋白質（アビジン又は
ストレプトアビジン）とこれに化学的に結合された酵素
の複合体を結合させ、更に同酵素によって分解されると
沈着性の色素を形成する化合物を加えて反応を行うと、
ハイブリダイゼーションの有無及び位置を容易に検出す
ることができる。
【００５４】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明する。以下の実施例では、本発明を説明するためモデ
ル系として、ヒトNF-IL6遺伝子（GenBank accession AF
350408）の配列を用いて検討を行った。しかしながら、
本発明はこの遺伝子のみに適用されるものではない。
【００５５】＜１＞オリゴヌクレオチドの合成 常法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Perkin-elmer
Applied biosystems）を用いて、５’末端にアミノ基
または水酸基を有するオリゴヌクレオチドを合成し、脱
保護を施した後、乾燥させた。このオリゴヌクレオチド
乾燥体を10mM Tris-HCl(pH7.5), 1mM EDTA緩衝液を用い
て溶解し、100pmol/μLのオリゴヌクレオチド溶液を調
製した。合成したオリゴヌクレオチドの配列は、配列表
の配列番号１〜４に示した。
【００５６】配列番号１ 5'-cctaaaccc gattatttat-3' 配列番号２ 5'-cctaaaccc aattatttat-3' 配列番号３ 5'-ctctaactcg ctaaaattt-3' 配列番号４ 5'-ctctaactca ctaaaattt-3'
【００５７】＜２＞支持体へのオリゴヌクレオチドのス
ポッティング（５’末端にアミノ基を有するオリゴヌク
レオチドを用いる場合） ５’末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチド溶液10
μLに対して、マイクロスポッティング溶液（TeleChem
International Inc.）を10μL混合し、マイクロタイタ
ープレート（Greiner Laboratory Ltd.）上に分注し
た。スポッティングマシンの所定の位置にシラン化スラ
イドグラス（Matsunami Glass Ind., Ltd.）を配置し、
スポッティングマシンを作動させた。スポッティング終
了後、スライドグラスに熱水からの蒸気を数秒間あて
た。その後、紫外線を30mJ照射した。再度蒸気を数秒間
曝露した後、ホットプレート上にスライドグラスを置い
て水分を除去した。0.1%硫酸ドデシルナトリウム水溶液
でスライドグラスを濯いだ後、蒸留水で濯いだ。スライ
ドグラスを3% BSA（ウシ血清アルブミン）を含む100mMT
ris-HCl(pH7.5), 100mM NaCl, 0.1% Triton X-100に室
温で30分間浸し、ブロッキングした。その後、室温で乾
燥させた後、10mM Tris-HCl(pH7.5), 1mM EDTA緩衝液で
洗浄した。スライドグラスを再度室温で乾燥させ、使用
するまで乾燥状態で冷暗所で保存した。
【００５８】＜３＞支持体へのオリゴヌクレオチドのス
ポッティング（５’末端にOH基を有するオリゴヌクレオ
チドを用いる場合） ５’末端に水酸基を有するオリゴヌクレオチド溶液10μ
Lに対してスポッティング溶液（2M 塩化ナトリウム水溶
液）を10μL混合し、マイクロタイタープレート（Grein
er Laboratory Ltd.）上に分注した。スポッティングマ
シンの所定の位置にカルボジイミド基を有するスライド
グラスを配置し、スポッティングマシンを作動させた。
スポッティング終了後、スライドグラスを37℃の乾燥機
に30分間置いた。スポッティング終了後、スライドグラ
スを３% BSA（ウシ血清アルブミン）を含む100mM Tris-
HCl(pH7.5), 100mM NaCl, 0.1% Triton X-100に室温で3
0分間浸し、ブロッキングした。その後、室温で乾燥さ
せた後、10mM Tris-HCl(pH7.5), 1mM EDTA緩衝液で洗浄
した。スライドグラスを再度室温で乾燥させ、使用する
まで乾燥状態で冷暗所で保存した。
【００５９】＜４＞核酸プローブの調製 常法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Perkin-elmer
Applied biosystems）を用いて、５’水酸基を有する
オリゴヌクレオチドを合成し、脱保護を施した後乾燥さ
せた。このオリゴヌクレオチド乾燥体を10mM Tris-HCl
(pH7.5), 1mM EDTA緩衝液を用いて溶解し、100pmol/μL
のオリゴヌクレオチド溶液を調製した。合成したオリゴ
ヌクレオチドの配列は、配列表の配列番号５に示した。
【００６０】配列番号５に示したオリゴヌクレオチド10
μgを、CpGenome DNA ModificationKit（Intergen社）
を用いてメチル化し、配列中の全てのCをUに変換させた
オリゴヌクレオチド（配列番号６）を調製した。更に、
DNA合成機を用いて配列番号６に示す配列のオリゴヌク
レオチドを合成した。また、CpGのCのみがメチル化され
てUに変換されておらず、他のCは全てUに変換されたオ
リゴヌクレオチド（配列番号７）も、DNA合成機にて合
成した。更に、合成した後、定法に従いオリゴヌクレオ
チドの５'末端にビオチンを導入した。
【００６１】配列番号５ 5'-ccctt ataaataacc gggctc
agga gaaactttag cgagtcagag-3' 配列番号６ 5'-UUUtt ataaataaUU gggUtUagga gaaaUtt
tag UgagtUagag-3' 配列番号７ 5'-UUUtt ataaataaUc gggUtUagga gaaaUtt
tag cgagtUagag-3'
【００６２】＜５＞ハイブリダイゼーション 上記＜４＞で調製した配列番号５〜７の各々の核酸プロ
ーブ5μL（1pmol）を取り、1.5mL容チューブに加え、さ
らにUniHyb Hybridization solution（Telechem Intern
ational Inc.）20μLを加えて混合し、ハイブリダイゼ
ーション溶液を調製した。この溶液を70℃で５分間加熱
処理を行った後、氷中に５分間浸した。この核酸プロー
ブを、＜２＞および＜３＞で作製したオリゴヌクレオチ
ドをスポットした支持体に10μLのせ、その上にカバー
グラスを載せた。
【００６３】ハイブリカセット（Telechem Internation
al Inc.）に支持体を入れ、42℃の水槽につけ、遮光し
て１時間放置した。ハイブリカセットから支持体を取り
出し、室温の２×SSC（0.75M NaCl, 0.075M クエン酸ナ
トリウム）に浸してカバーグラスを除去した。支持体を
45℃の0.3×SSCに５分間浸す操作を２回行った。最後に
２×SSCの入った溶液に支持体を移した。
【００６４】＜６＞化学発色反応 容器から支持体を取り出し、オリゴヌクレオチドが固定
化されていない部分の水分をペーパータオルで拭い取
り、オリゴヌクレオチド固定化部分にはブロックエース
溶液（大日本製薬株式会社）を200μL載せた。室温で30
分間放置した後、分注機で溶液を吸い取った。5mLのTBS
T溶液（50mM Tris-HCl(pH7.5), 0.15M NaCl, 0.05% Twe
en 20）に、アビジンDHおよびビオチン化ペルオキシダ
ーゼ（Vector Laboratories, Inc.）を各々１滴加えて
混合した溶液200μLを、支持体上のオリゴヌクレオチド
固定化部分に載せ、室温で30分間放置した。分注機で溶
液を吸い取り、支持体をTBST溶液の入った容器に移し、
振とうさせながら室温で５分間洗浄した。溶液を一旦捨
てて、新しいTBST溶液を容器に加え振とうさせながら室
温で５分間洗浄した。支持体を容器から取り出し、オリ
ゴヌクレオチドが固定化されていない部分の水分をペー
パータオルで拭い取った。オリゴヌクレオチド固定化領
域にはTMB（Vector Laboratories, Inc.）を200μL載
せ、室温で20分間反応させた後支持体を脱イオン水で洗
浄し酵素反応を停止させた。
【００６５】＜７＞化学発色の検出 支持体上の発色画像を、OA用スキャナー（NEC Multirea
der 600SR）とフォトショップVer 5.0（アドビシステム
ズ株式会社）を用いて、コンピューター内にTIFF画像と
して保存した。結果を図２に示す。この画像中で、化学
発色によって形成した色素沈着がある場合は、支持体上
に固定化されたオリゴヌクレオチド（キャプチャーオリ
ゴ）と核酸プローブが完全な相補性を持ち、２本鎖を形
成したことを示す。
【００６６】
【発明の効果】本発明により、ＤＮＡ中のメチル化され
たシトシンとされていないシトシンの判別を、簡便かつ
迅速に行うことができる。
【００６７】
【配列表】SEQUENCE LISTING <110> Nisshinbo Industries, Inc. <120> メチル化検出用オリゴヌクレオチド固定化基板 <130> P-8937 <140> <141> 2001-11-16 <160> 7 <170> PatentIn version 3.0
【００６８】<210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial/Unknown
【００６９】 <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: capture oligonucleotide <400> 1 cctaaaccc gattatttat 19
【００７０】 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: capture oligonucleotide <400> 2 cctaaaccca attatttat 19
【００７１】 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: capture oligonucleotide <400> 3 ctctaactcg ctaaaattt 19
【００７２】 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: capture oligonucleotide <400> 4 ctctaactca ctaaaattt 19
【００７３】<210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: probe oligonucleotide <400> 5 cccttataaa taaccgggct caggagaaac tttagcgagt cagag 45
【００７４】 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: probe oligonucleotide <400> 6 uuuttataaa taauugggut uaggagaaau tttagugagt uagag 45
【００７５】 <210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: probe oligonucleotide <400> 7 uuuttataaa taaucgggut uaggagaaau tttagcgagt uagag 45
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明のキャプチャーオリゴヌクレオチドと
標的配列の塩基配列の例を示す図。
【図２】 ハイブリダイゼーションの結果を示す図。Ａ
は、試料ＤＮＡのＣｐＧのＣがメチル化されていない場
合、Ｂはメチル化されている場合の結果を、各々示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA04 HA14 4B063 QA01 QA19 QQ42 QR55 QR82 QS34

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 試料ＤＮＡ中のＣのメチル化の有無を検
    出するために用いられ、複数のキャプチャーオリゴヌク
    レオチドが基材上に固定化された、オリゴヌクレオチド
    固定化基板であって、 前記試料ＤＮＡは、メチル化され得るＣと、その３’側
    のヌクレオチドからなるジヌクレオチド（以下、「Ｃｐ
    Ｎジヌクレオチド」という）を含む標的配列を含み、 前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、前記標的配列
    のＣｐＮジヌクレオチドのＣ以外のＣをＴに置換した塩
    基配列に相補的又は同一の塩基配列を有するオリゴヌク
    レオチドと、前記標的配列のすべてのＣをＴに置換した
    塩基配列に相補的又は同一の塩基配列を有するオリゴヌ
    クレオチドを少なくとも含み、 メチル化されていないシトシンを脱アミノ化してウラシ
    ルに変換させた試料ＤＮＡ又はその増幅産物とキャプチ
    ャーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに
    よって、前記メチル化の有無を検出する、オリゴヌクレ
    オチド固定化基板。
  2. 【請求項２】 前記Ｃの３’側のヌクレオチドがＡ、
    Ｇ、又はＴである請求項１記載のオリゴヌクレオチド固
    定化基板。
  3. 【請求項３】 前記Ｃの３’側のヌクレオチドがＧであ
    る請求項２記載のオリゴヌクレオチド固定化基板。
  4. 【請求項４】 前記キャプチャーオリゴヌクレオチドが
    カルボジイミド基を介して固定化された請求項１〜３の
    いずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド固定化基板。
  5. 【請求項５】 前記キャプチャーオリゴヌクレオチドが
    基材上にドット状で固定化され、各々のドットの占有面
    積が０．１ｃｍ2以下である請求項１〜４のいずれか一
    項に記載のオリゴヌクレオチド固定化基板。
  6. 【請求項６】 前記キャプチャーオリゴヌクレオチドが
    ３０ｍｅｒ以下のオリゴヌクレオチドである請求項１〜
    ５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド固定化基
    板。
  7. 【請求項７】 前記試料ＤＮＡは複数の標的配列を含
    み、各々の標的配列に対応するキャプチャーオリゴヌク
    レオチドが固定化された請求項１〜６のいずれか一項に
    記載のオリゴヌクレオチド固定化基板。
  8. 【請求項８】 ＣｐＮジヌクレオチドを含む標的配列を
    含む試料ＤＮＡ中のＣｐＮジヌクレオチドのＣのメチル
    化の有無を検出する方法であって、 基材上に固定化され、前記標的配列のＣｐＮジヌクレオ
    チドのＣ以外のＣをＴに置換した塩基配列に相補的又は
    同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、前記標
    的配列のすべてのＣをＴに置換した塩基配列に相補的又
    は同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを少なく
    とも含む複数のキャプチャーオリゴヌクレオチドと、メ
    チル化されていないシトシンを脱アミノ化してウラシル
    に変換させた試料ＤＮＡ又はその増幅産物との間でハイ
    ブリダイゼーションを行い、 前記ハイブリダイゼーションの結果によって前記メチル
    化の有無を判定することを特徴とする方法。
  9. 【請求項９】 試料ＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムで処理
    することによって、前記メチル化されていないシトシン
    を脱アミノ化する、請求項８記載の方法。
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