HU226168B1 - Analogs of keratinocyte growth factor, nucleic acids coding thereof, process for production and use of the analogs - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás keratinocita növekedési fák- nak előállítására, amely analógok a kiindulási KGF-hez tor (KGF), amely a nem-fibroblaszt epiteliális sejtnöve- viszonyítva fokozott stabilitással rendelkeznek, kedésnek egy potens mitogénje, polipeptidanalógjaiHU 226 168 Β1

A leírás terjedelme 78 oldal (ezen belül 54 lap ábra)

HU 226 168 Β1

A jelen találmány tárgyát rekombináns DNS technológia és protein engineering képezi. Ez a bejelentés az 1995. október 12-én benyújtott PCT/IB95/00971-nek a 35 U.S.C. §371 benyújtása, ami részben folytatása az 1994. október 12-én benyújtott, 08/323,475 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli függő szabadalmi bejelentésnek, és részben folytatása az 1995. június 7-én benyújtott, 08/487,825 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli függő szabadalmi bejelentésnek, ami részben folytatása az 1994. október 13-án bejelentett, de azóta felhagyott, 08/323,340 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésnek. Pontosabban, rekombináns DNS technológiát alkalmazunk a keratinocita növekedési faktor (KGF), amely egy a nem-fibroblaszt epiteliális sejtnövekedésnek egy potens mitogénje, polipeptidanalógjainak előállítására, amely analógok a kiindulási KGF-hez viszonyítva fokozott stabilitással rendelkeznek.

A szövetgenerálás és -regenerálás komplex folyamatát számos fehérjefaktor befolyásolja, amelyeket lágyszövet növekedési faktoroknak neveznek. Ezeket a molekulákat általában egy sejttípus bocsátja ki, és úgy működnek, hogy befolyásolják más sejttípusok szaporodását [Rubin és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 802-806 (1989)]. Néhány lágyszövet növekedési faktort bizonyos sejttípusok bocsátanak ki, és befolyásolják a többsejtes szervezetek érésében szerepet játszó reagálósejtek szaporodását, differenciálódását és/vagy érését [Finch és munkatársai: Science 245, 752-755 (1989)]. A fejlődő szervezetekben játszott szerepük mellett néhányan fontosak az érettebb rendszerek folyamatos egészségében és fenntartásában. Például az emlősökben számos olyan rendszer van, ahol a sejtekben gyors anyagcsere játszódik le. Ilyen rendszer például a bőr és az emésztőrendszer, amelyek mind epiteliális sejteket tartalmaznak. A lágyszövet növekedési faktoroknak ebbe a csoportjába tartozik a fibroblaszt növekedési faktorok (FGF-ek) egy fehérjecsaládja.

Jelenleg nyolc ismert tagja van az FGF családnak, amelyeknek a primer szerkezete rokonságot mutat: bázikus fibroblaszt növekedési faktor, bFGF [Abraham és munkatársai: EMBO J. 5, 2523-2528 (1986)]; savas fibroblaszt növekedési faktor, a FGF [Jaye és munkatársai: Science 233, 541-545 (1986)]; int—2 géntermék, int—2 [Dickson és Peters: Natúré 326, 833 (1987)]; hst/KGF [Delli-Bovi és munkatársai: Cell 50, 729-737 (1987); Yoshida és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84, 7305-7309 (1987)]; FGF-5 [Zhan és munkatársai: Mól. Cell. Biology 8, 3487-3495 (1988)]; FGF-6 [Marics és munkatársai: Oncogene 4, 335-340 (1989)]; keratinocita növekedési faktor [Finch és munkatársai: Science 24, 752-755 (1989)]; és a hisactophilin [Habazzettl és munkatársai: Natúré 359, 855-858 (1992)].

A fehérjék FGF családjában a keratinocita növekedési faktor („KGF”) egy különleges effektora a mesenchyma szövetekből származó, nem-fibroblaszt epiteliális (különösen keratinocita) sejtszaporodásnak. A „természetes KGF” szakkifejezés jelentése egy természetes humán (hKGF) vagy rekombináns (rKGF) polipeptid (szignálszekvenciával vagy anélkül), amit a 2. számú szekvencián bemutatott aminosavszekvencia jellemez, vagy annak egy alléi variánsa. (Hacsak külön nem jelezzük, akkor a leírásban ismertetett molekuláknál az aminosavak számozása megfelel a természetes molekula érett formájának (azaz mínusz a szignálszekvencia), amit a 2. számú szekvencián a 32-194-es aminosavakkal lehet leírni.

A természetes KGF-et természetes humán forrásokból lehet izolálni (hKGF), vagy rekombináns DNS technikákkal lehet előállítani (rKGF) [Finch és munkatársai: Science 245, 752-755 (1989); Rubin és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 802-806 (1989); Ron és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 268(4), 2984-2988 (1993); Yan és munkatársai: In vitro Cell. Dev. Bioi. 27A, 437-438(1991)].

Az közismert, hogy a természetes KGF viszonylag instabil vizes közegben, és kémiai, valamint fizikai lebomláson megy át, ami a biológiai aktivitás elvesztését eredményezi a processzálás és tárolás során [Chen és munkatársai: Pharmaceutical Research 11, 1582-1589 (1994)]. A természetes KGF hajlamos az aggregációra magasabb hőmérsékleten, és inaktiválódik savas körülmények között [Rubin és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 802-806 (1989)]. A természetes KGF vizes oldatban való aggregálódása szintén inaktivált fehérjét eredményez. Ez azért előnytelen, mivel az aktivitás elvesztése gyakorlatilag értelmetlenné teszi a természetes KGF fehérjék vizes készítményeinek hosszú ideig való tárolását, vagy a fehérje hosszabb ideig tartó beadását. Emellett az különösen problematikus, ha gyógyászati készítményeket készítünk, mivel az aggregálódott fehérjékről ismertté vált, hogy immunogének [Cleland és munkatársai: Crit. Rév. Therapeutic Drug Carrier Systems 10, 307-377 (1993); Robbins és munkatársai: Diabetes 36, 838-845 (1987); Pinckard és munkatársai: Clin. Exp. Immunoi. 2, 331-340 (1967)].

A természetes KGF öt ciszteincsoportot tartalmaz, nevezetesen az 1-es, 15-ös, 40-es, 102-es és 106-os aminosavakat [Finch és munkatársai: Science 245, 752-755 (1989)]. Jóllehet a természetes KGF ciszteintartalmát leírták, azt nem írták le, hogy az aktivitás szempontjából a ciszteincsoportok milyen szerepet játszanak (azaz a biológiai aktivitáshoz nélkülözhetetlenül szükségesek-e), és milyen szerepet töltenek be a tercier struktúra kialakításában (azaz hajlamosak-e nem kívánt intermolekuláris vagy intramolekuláris diszulfidkötések kialakítására). Ennek megfelelően a szakirodalomban nincs információ arra vonatkozóan, hogy melyik ciszteincsoportra van szükség, ha egyáltalán valamelyikre szükség van, vagy melyik vesz részt nemkívánatos diszulfidhíd kialakításában, ezzel a fehérjét érzékennyé téve az aggregációra és/vagy instabillá téve a fehérjét.

Ahhoz, hogy megpróbáljuk a természetes KGF egy vagy több jellemzőjének a megjavítását vagy másképpen való megváltoztatását, protein engineeringet alkal2

HU 226 168 Β1 mázunk. A rekombináns DNS technológiát alkalmaztuk a természetes KGF szekvenciáinak módosítására.

Ron és munkatársai leírtak módosított KGF polipeptideket, amelyeknek az N-terminálisáról 3, 8, 27 vagy 49 aminosavat kivágtak [Ron és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 268(4), 2984-2988 (1993)]. Azok a fehérjék, amelyekről 3, 8 vagy 27 aminosav hiányzott, megtartották a heparinkötő képességüket, a többiek nem. Emellett azokról a peptidekről, amelyekről 3 és 8 aminosav hiányzott, leírták, hogy teljesen aktívak maradtak, míg az a forma, amelyikről 27 csoport hiányzott, 10-20-szor kevésbé mitogén volt, és az a forma, amelyről 38 vagy 49 aminosav hiányzott, egyáltalán nem rendelkezett mitogén aktivitással. A módosított KGF polipeptid stabilitását nem tárgyalták, illetve más módon sem közölték.

A publikált 90/08771 számú PCT bejelentésben is leírták, hogy kiméra fehérje keletkezik, amely a természetes KGF érett formája első 40 N-terminális aminosavát kombinálták az aFGF C-terminális részével (körülbelül 140 aminosav). A kiméráról leírták, hogy a KGF-hez hasonlóan a keratinocitákat célozza meg, de nincs meg a heparin-érzékenysége, ami jellemző az aFGF-re, de nem jellemző a KGF-re. A kiméra stabilitását nem tárgyalták, illetve más módon sem közölték.

Tehát a szakirodalomban nem írtak le olyan módosított KGF molekulát, amelynek jelentősen fokozott stabilitása van a természetes KGF-hez viszonyítva. Emellett a szakirodalomban nem közöltek elegendő információt vagy bizonyítékot arra, hogy ésszerűen várható legyen olyan KGF molekulák generálása, amelyek ezekkel a kívánatos jellemzőkkel rendelkeznek.

Általában bármilyen aminosavcserének a fehérje biológiai aktivitására gyakorolt hatása számos faktortól függ, beleértve a fehérje háromdimenziós szerkezetét, valamint attól, hogy a módosítások a fehérje elsődleges szerkezetében a receptorkötésért felelős régióban játszódnak le. Mivel a természetes KGF-nek sem a háromdimenziós szerkezetét, sem a primer szerkezet receptorkötésért felelős régióját nem közölték, ezért a szakirodalomban található ismeret nem teszi lehetővé az aminosavcseréknek a természetes KGF-re gyakorolt hatásának általánosítását, az aminosavmódosításoknak az általánosan jellemzett fehérjékre gyakorolt hatása alapján.

A jelen találmány tárgyát polipeptid molekuláknak olyan analógjai képezik, amelyek fokozott stabilitással rendelkeznek (azaz például ha tipikus pH-η, hőmérsékleti és/vagy tárolási körülmények között tartják) a természetes KGF-hez viszonyítva.

A jelen találmány tárgyát a KGF új, biológiailag aktív analógjai képezik. A jelen találmány szempontjából a „KGF szakkifejezés jelentése lehet a természetes KGF, valamint egy olyan peptidszekvenciával rendelkező fehérje, amely lényegében megegyezik a természetes KGF peptidszekvenciájával, amely megtartja a természetes KGF Cys¹ és Cys¹⁵ csoportjait (a 2. számú szekvenciában a Cys³² és Cys⁴⁶), és amelyik megtartja a természetes KGF biológiai aktivitását, vagy annak egy részét, különösen a fibroblaszt epiteliális sejtszaporodást. (Amikor a 4. ábrára, a 7-24-re és a 37-50-re, valamint a specifikus aminosavpozícióra hivatkozunk, akkor a szekvenciában a kiindulási metionin sorszámát 0-nak kell venni). Az „egy olyan peptidszekvenciával rendelkező fehérje, amely lényegében megegyezik a természetes KGF peptidszekvenciájával” szakkifejezés alatt egy olyan peptidszekvenciát értünk, amit egy olyan DNS-szekvencia kódol, amely képes az 1. számú szekvencia 201-684-es nukleotidjai között levő szekvenciával hibridizálódni, előnyösen szigorú hibridizálási körülmények között.

Két aminosavszekvencia között a megfelelő aminosavpozíciót úgy határozhatjuk meg, hogy a két szekvenciát úgy illesztjük egymáshoz, hogy maximalizáljuk az illeszkedéseket, beleértve az N-terminális és/vagy a C-terminális eltolását, ha szükséges, akkor lukak bevitelét és/vagy a jelölt molekulában inszertként jelen levő csoportok kivágását. Adatbázis-kutatások, szekvenciaelemzések és manipulációk végezhetők az egyik jól ismert szekvencia homológia/azonosság pásztázó algoritmus programmal [Pearson és Lipman: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 85, 2444-2448 (1988); Altschul és munkatársai: J. Mól. Bioi. 215, 403-410 (1990); Lipman és Pearson: Science 222, 1435 (1985); Devereux és munkatársai: Nucleic Acids Research 12, 387-395 (1984)].

A hibridizáció összefüggésében a szigorú körülmények a sókoncentráció, a szerves oldószerek és egyéb paraméterek szigorú, kombinált körülményei, amiket általában a hibridizációs reakciókban szabályoznak. A szigorú hibridizációs körülményekre egy példa lehet a következő: hibridizáció 4 x SSC-ben 62-67 °C-on, ezt követi a mosás 0,1*SSC-ben 62-67 °C-on, körülbelül egy óra hosszat. Egy másik változat a szigorú hibridizációs körülményekre a hibridizáció 45-55% formamid, 4*SSC-ben 40-45 °C-on [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 387-389. old.; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)].

Tehát a fehérjék közé tartoznak az allélvariációk vagy aminosavdeléció(k), helyettesítés(ek) vagy inszerciók, beleértve a természetes KGF fragmenseit, kiméra vagy hibrid molekulákat. A KGF-re példák lehetnek a töltésváltozott polipeptidek, amelyekben a természetes KGF 41-154-es aminosavcsoportjai közül egyet vagy többet (előnyösen az Arg⁴¹, Gin⁴³, Lys⁵⁵, Lys⁹⁵, Lys¹²⁸, Asn¹³⁷, Gin¹³⁸, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gin¹⁵², Lys¹⁵³ vagy Thr¹⁵⁴) kivágunk vagy egy semleges vagy negatívan töltött csoporttal helyettesítünk, amelyet úgy választhatunk meg, hogy a fehérjében csökkentsük a pozitív töltést (WO 96/11951 sz. nemzetközi közzétételi irat), amelyek közül a legfontosabb az R(144)Q, ami egy olyan KGF, amelyben a természetes KGF 144-es pozíciójában levő arginint glutaminra cserélünk. A KGF-re más példák lehetnek az olyan fehérjék, amelyeket úgy állítunk elő, hogy a természetes KGF Asn¹¹⁵-His¹¹⁶-Tyr¹¹⁷-Asn¹¹⁸-Thr¹¹⁹ hurokképző régiójában legalább egy aminosavat egy erősebb hurokképző tulajdonságokkal rendelkező aminosawal helyettesítünk (WO 96/11950 sz. nemzetközi közzétételi irat).

HU 226 168 Β1

Specifikusan idetartozik a H(116)G, egy olyan keratinocita növekedési faktor, amelyben a természetes keratinocita növekedési faktor 116-os pozíciójában levő hísztidint glicinnel helyettesítünk. Az egyéb példák közé tartoznak azok a fehérjék, amelyekben egy vagy több aminosavat helyettesítünk, kivágunk vagy beszúrunk a természetes KGF 123-133-as régiójába (a 2. számú szekvencián a 154-164-es aminosavak); ezeknek a fehérjéknek agonista vagy antagonista hatásuk lehet.

Meglepő módon azt a felfedezést tették, hogy ha egy keratinocita növekedési faktor molekulában (azaz a kiindulási molekulában), amelyben a természetes keratinocita növekedési faktor Cys¹ és Cys¹⁵ aminosavainak megfelelő (azaz a 2. számú szekvencián a 32-es és 34-es csoportok) ciszteincsoportokat (ezeket az előzőkben ismertetett technikákkal határozhatjuk meg) módosítjuk a megfelelő ciszteincsoportok helyettesítésével, akkor a kapott KGF-analógnak a kiindulási molekulával összehasonlítva megnő a stabilitása. Előnyösen, amellett, hogy megnőtt a stabilitásuk, a találmány tárgyát azok az analógok képezik, amelyek emellett teljes biológiai aktivitással is rendelkeznek (azaz legalább lényegében hasonló receptorkötő tulajdonsággal vagy affinitással rendelkezik) a természetes KGF-fel összehasonlítva.

A találmány tárgyát képezik továbbá a KGF különböző biológiailag aktív polipeptidanalógjait kódoló, tisztított és izolált nukleinsavmolekulák. Az egyik megvalósítási mód szerint ezek a nukleinsavmolekulák biológiailag működőképes plazmid vagy virális vektorokba kiónozott DNS-molekulákat tartalmaznak. Egy másik megvalósítási mód szerint a nukleinsavkonstrukciókat arra használhatjuk, hogy stabilan transzformáljunk velük egy prokarióta vagy eukarióta gazdasejtet. Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás, amelyben egy nukleinsavmolekulával stabilan transzformált prokarióta (előnyösen Escherichia coli) vagy egy eukarióta gazdasejtet növesztünk megfelelő tápláló körülmények között, olyan módon, hogy az lehetővé tegye a KGF-analóg expresszióját. Az expresszió után a kapott rekombináns polipeptidet izolálhatjuk és tisztíthatjuk.

A találmány tárgyát képezik továbbá azok a gyógyászati készítmények, amelyek egy KGF-analógból terápiásán hatékony mennyiséget, valamint egy elfogadható gyógyászati hordozót tartalmaznak. Ezek a készítmények jól használhatók epiteliális betegségekben és sérülésekben szenvedő betegek kezelésére.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.

Az 1 A. és 1B. ábrán a természetes KGF nukleotid (1. számú szekvencia) és aminosav (2. számú szekvencia) szekvenciája látható (a természetes KGF érett formáját kódoló nukleotidokat az 1. számú szekvencia 201-684-es bázisai mutatják, és a KGF érett formáját a 2. számú szekvencia 32-192-es aminosavcsoportjai mutatják).

A 2A„ 2B. és 2C. ábrán a pCFM1156, pCFM1656 és pCFM3102 plazmidok térképei láthatók.

A 3. ábrán az RSH-KGF konstrukció nukleotid- (3.

számú szekvencia) és aminosav- (4. számú szekvencia) szekvenciáját láthatjuk.

A 4. ábrán a KGF plazmidban levő konstrukció nukleotid- (5. számú szekvencia) és aminosav(6. számú szekvencia) szekvenciáját mutatja.

Az 5. ábrán a kémiai úton szintetizált oligonukleotidok láthatók (6. számú oligonukleotidtól a 11. számú oligonukleotidig, azaz a 12-17. számú szekvenciák), amiket arra lehet használni, hogy a KGF plazmidban levő konstrukció Kpnl és EcoRI hasítási helye között levő DNS-szekvenciát (a 6. számú szekvencia 46-85-ös aminosavpozíciói között) helyettesítsük, ezzel előállítva a KGF (dsd) plazmidban levő konstrukciót.

A 6. ábrán a kémiai úton szintetizált oligonukleotidok láthatók (12. számú oligonukleotidtól a 24. számú oligonukleotidig; azaz 18-30. számú szekvenciák), amiket a KGF készítéséhez használunk (kodonokra optimalizálva).

A 7. ábrán a C(1,15)S, egy olyan KGF-analóg, amelyben a természetes KGF 1-es és 15-ös aminosavpozíciójában levő ciszteint szerinnel helyettesítjük, nukleotid- (31. számú szekvencia) és aminosav- (32. számú szekvencia) szekvenciája látható.

A 8. ábrán a ÁN3/C(15)S, azaz egy olyan KGFanalóg, amelyből a természetes KGF N-terminálisa első 3 aminosavát kivágtuk, és a 15-ös aminosavpozíciójában levő ciszteint szerinre cseréltük, nukleotid- (33. számú szekvencia) és aminosav- (34. számú szekvencia) szekvenciáját mutatjuk be.

A 9. ábrán a AN3/C(15)-, azaz egy olyan KGF-analóg, amelyből a természetes KGF N-terminálisa első 3 aminosavát kivágtuk, és a 15-ös aminosavpozíciójában levő ciszteint kivágtuk, nukleotid- (35. számú szekvencia) és aminosav- (36. számú szekvencia) szekvenciáját mutatjuk be.

A 10. ábrán a áN8/C(15)S, azaz egy olyan KGFanalóg, amelyből a természetes KGF N-terminálisa első 8 aminosavát kivágtuk, és a 15-ös aminosavpozíciójában levő ciszteint szerinre cseréltük, nukleotid- (37. számú szekvencia) és aminosav- (38. számú szekvencia) szekvenciáját mutatjuk be.

A 11. ábrán a AN8/C(15)-, azaz egy olyan KGFanalóg, amelyből a természetes KGF N-terminálisa első 8 aminosavát kivágtuk, és a 15-ös aminosavpozíciójában levő ciszteint kivágtuk, nukleotid- (39. számú szekvencia) és aminosav- (40. számú szekvencia) szekvenciáját mutatjuk be.

A 12. ábrán a ΔΝ15, azaz egy olyan KGF-analóg, amelyből a természetes KGF N-terminálisa első 15 aminosavát kivágtuk, nukleotid- (41.

HU 226 168 Β1 számú szekvencia) és aminosav- (42. számú szekvencia) szekvenciáját mutatjuk be.

A 13. ábrán a ΔΝ16, azaz egy olyan KGF-analóg, amelyből a természetes KGF N-terminálisa első 16 aminosavát kivágtuk, nukleotid- (43. számú szekvencia) és aminosav- (44. számú szekvencia) szekvenciáját mutatjuk be.

A 14. ábrán a ΔΝ17, azaz egy olyan KGF-analóg, amelyből a természetes KGF N-terminálisa első 17 aminosavát kivágtuk, nukleotid- (45. számú szekvencia) és aminosav- (46. számú szekvencia) szekvenciáját mutatjuk be.

A 15. ábrán a ΔΝ18, azaz egy olyan KGF-analóg, amelyből a természetes KGF N-terminálisa első 18 aminosavát kivágtuk, nukleotid- (47. számú szekvencia) és aminosav- (48. számú szekvencia) szekvenciáját mutatjuk be.

A 16. ábrán a ΔΝ18, azaz egy olyan KGF-analóg, amelyből a természetes KGF N-terminálisa első 18 aminosavát kivágtuk, nukleotid- (49. számú szekvencia) és aminosav- (50. számú szekvencia) szekvenciáját mutatjuk be.

A 17. ábrán a ΔΝ20, azaz egy olyan KGF-analóg, amelyből a természetes KGF N-terminálisa első 20 aminosavát kivágtuk, nukleotid- (51. számú szekvencia) és aminosav- (52. számú szekvencia) szekvenciáját mutatjuk be.

A 18. ábrán a ΔΝ21, azaz egy olyan KGF-analóg, amelyből a természetes KGF N-terminálisa első 21 aminosavát kivágtuk, nukleotid- (53. számú szekvencia) és aminosav- (54. számú szekvencia) szekvenciáját mutatjuk be.

A 19. ábrán a ΔΝ22, azaz egy olyan KGF-analóg, amelyből a természetes KGF N-terminálisa első 22 aminosavát kivágtuk, nukleotid- (55. számú szekvencia) és aminosav- (56. számú szekvencia) szekvenciáját mutatjuk be.

A 20. ábrán a ΔΝ23, azaz egy olyan KGF-analóg, amelyből a természetes KGF N-terminálisa első 23 aminosavát kivágtuk, nukleotid- (57, számú szekvencia) és aminosav- (58. számú szekvencia) szekvenciáját mutatjuk be.

A 21. ábrán a ΔΝ24, azaz egy olyan KGF-analóg, amelyből a természetes KGF N-terminálisa első 24 aminosavát kivágtuk, nukleotid- (59. számú szekvencia) és aminosav- (60. számú szekvencia) szekvenciáját mutatjuk be.

A 22. ábrán a C(1,15)S/R(144)E, azaz egy olyan KGF-analóg, amelyben a természetes KGF 1-es és 15-ös pozíciójában levő ciszteincsoportokat szerinre cseréltük, és a 144-es pozícióban levő arginint glutaminsavra cseréltük, nukleotid- (61. számú szekvencia) és aminosav- (62. számú szekvencia) szekvenciáját mutatjuk be.

A 23. ábrán a C(1,15)S/R(144)Q, azaz egy olyan KGF-analóg, amelyben a természetes KGF 1-es és 15-ös pozíciójában levő ciszteincsoportokat szerinre cseréltük, és a 144-es pozícióban levő arginint glutaminra cseréltük, nukleotid- (65. számú szekvencia) és aminosav- (64. számú szekvencia) szekvenciáját mutatjuk be.

A 24. ábrán a AN23/R(144)Q, azaz egy olyan KGFanalóg, amelyből a természetes KGF N-terminálisa első 23 aminosavát kivágtuk, és a 144-es aminosavpozíciójában levő arginint glutaminra cseréltük, nukleotid- (65. számú szekvencia) és aminosav- (66. számú szekvencia) szekvenciáját mutatjuk be.

A 25. ábrán a megmaradó oldódó fehérje mennyisége látható, ha a természetes KGF-et és a C(1,15)S analógot 20 mmol/l nátrium-foszfát, 0,15 mol/l nátrium-klorid (pH=7,0) összetételű oldatban 27 óra hosszat tároljuk 37 °C-on.

A 26. ábrán a megmaradó oldódó fehérje mennyisége látható, ha a természetes KGF-et, a AN15-öt és a C(1,15)S analógot 50 mmol/l nátrium-foszfát, 0,15 mol/l nátrium-klorid (pH=7,0) összetételű oldatban 27 óra hosszat tároljuk 37 °C-on.

A 27. ábra a természetes KGF, C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)E és C(1,15)S/R(144)Q oldódó fehérje mennyiségét mutatja, méretkizárásos HPLC-mérés alapján, a 37 °C-on végzett inkubálás időtartamának függvényében.

A 28. ábrán a becsült olvadáspont hőmérséklet (T_m) látható, a pH függvényében, a természetes KGF C(1,15)S, a C(1,15)S/R(144)Q és a C(1,15)S/R(144)E esetében.

A 29. ábrán a C(1,15)S mitogén aktivitásának tipikus profilját láthatjuk, amit úgy mérhetünk meg, hogy mérjük a [³H]-timidin beépülését a DNS-szintézis során, a természetes KGF-fel kapott standardgörbével összehasonlítva.

A 30. ábrán a ΔΝ15 mitogén aktivitásának tipikus profilját láthatjuk, amit úgy mérhetünk meg, hogy mérjük a [³H]-timidin beépülését a DNS-szintézis során, a természetes KGFfel kapott standardgörbével összehasonlítva.

A 31. ábrán a ΔΝ23 mitogén aktivitásának tipikus profilját láthatjuk, amit úgy mérhetünk meg, hogy mérjük a [³H]-timidin beépülését a DNS-szintézis során, a természetes KGFfel kapott standardgörbével összehasonlítva.

A 32. ábrán a AN23/R(144)Q mitogén aktivitásának tipikus profilját láthatjuk, amit úgy mérhetünk meg, hogy mérjük a [³H]-timidin beépülését a DNS-szintézis során, a természetes KGF-fel kapott standardgörbével összehasonlítva.

A 33. ábrán a C(1,15)S/R(144)Q mitogén aktivitásának tipikus profilját láthatjuk, amit úgy mérhetünk meg, hogy mérjük a [³H]-timidin beépülését a DNS-szintézis során, a termé5

HU 226 168 Β1 szetes KGF-fel kapott standardgörbével összehasonlítva.

A 34. ábrán a C(1,15)S/R(144)E mitogén aktivitásának tipikus profilját láthatjuk, amit úgy mérhetünk meg, hogy mérjük a [³H]-timidin beépülését a DNS-szintézis során, a természetes KGF-fel kapott standardgörbével összehasonlítva.

A 35. ábrán a természetes KGF, KGF-a, ΔΝ15, C(1,15)S és a ΔΝ23 hatásait látjuk a szérum kémiájára.

A 36. ábrán a C(1,15,40)S, azaz egy olyan KGFanalóg, amelyben a ciszteincsoportokat szerinre cseréltük a természetes KGF 1-es, 15-ös és 40-es pozícióiban, a nukleotid(77. számú szekvencia) és aminosav- (78. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 37. ábrán a C(1,15,102)S, azaz egy olyan KGFanalóg, amelyben a ciszteincsoportokat szerinre cseréltük a természetes KGF 1-es, 15-ös és 102-es pozícióiban, a nukleotid(79. számú szekvencia) és aminosav- (80. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 38. ábrán a C(1,15,102,106)S, azaz egy olyan KGF-analóg, amelyben a ciszteincsoportokat szerinre cseréltük a természetes KGF 1-es, 15-ös 102-es és 106-os pozícióiban, a nukleotid- (81. számú szekvencia) és aminosav (82. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 39. ábrán a ΔΝ23/Ν(137)Ε, azaz egy olyan KGFanalóg, amelyből az N-terminális első 23 aminosavát kivágtuk, és amelyben a természetes KGF 137-es pozíciójában levő aszparagint glutaminra cseréltük, nukleotid (83. számú szekvencia) és aminosav- (84. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 40. ábrán a ΔΝ23/Κ(139)Ε, azaz egy olyan KGFanalóg, amelyből az N-terminális első 23 aminosavát kivágtuk, és amelyben a természetes KGF 139-es pozíciójában levő lizint glutaminsavra cseréljük, nukleotid (85. számú szekvencia) és aminosav- (86. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 41. ábrán a ΔΝ23/Κ(139)Ο, azaz egy olyan KGFanalóg, amelyből az N-terminális első 23 aminosavát kivágtuk, és amelyben a természetes KGF 139-es pozíciójában levő lizint glutaminra cseréljük, nukleotid- (87. számú szekvencia) és aminosav- (88. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 42. ábrán a ΔΝ23/Ε(144)Α, azaz egy olyan KGFanalóg, amelyből az N-terminális első 23 aminosavát kivágtuk, és amelyben a természetes KGF 144-es pozíciójában levő arginint alaninra cseréljük, nukleotid- (89. számú szekvencia) és aminosav- (90. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 43. ábrán a AN23/R(144)E, azaz egy olyan KGFanalóg, amelyből az N-terminális első aminosavát kivágtuk, és amelyben a természetes KGF 144-es pozíciójában levő arginint glutaminsavra cseréljük, nukleotid (91. számú szekvencia) és aminosav- (92. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 44. ábrán a AN23/R(144)L, azaz egy olyan KGFanalóg, amelyből az N-terminális első 23 aminosavát kivágtuk, és amelyben a természetes KGF 144-es pozíciójában levő arginint leucinra cseréljük, nukleotid- (93. számú szekvencia) és aminosav- (94. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 45. ábrán a ΔΝ23/Κ(147)Ε, azaz egy olyan KGFanalóg, amelyből az N-terminális első 23 aminosavát kivágtuk, és amelyben a természetes KGF 147-es pozíciójában levő lizint glutaminsavra cseréljük, nukleotid (95. számú szekvencia) és aminosav- (96. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 46. ábrán a AN23/K(147)Q, azaz egy olyan KGFanalóg, amelyből az N-terminális első 23 aminosavát kivágtuk, és amelyben a természetes KGF 147-es pozíciójában levő lizint glutaminra cseréljük, nukleotid- (97. számú szekvencia) és aminosav- (98. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 47. ábrán a ΔΝ23/Κ(153)Ε, azaz egy olyan KGFanalóg, amelyből az N-terminális első 23 aminosavát kivágtuk, és amelyben a természetes KGF 153-as pozíciójában levő lizint glutaminsavra cseréljük, nukleotid (99. számú szekvencia) és aminosav- (100. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

A 48. ábrán a ΔΝ23/Κ(153)Q, azaz egy olyan KGFanalóg, amelyből az N-terminális első 23 aminosavát kivágtuk, és amelyben a természetes KGF 153-as pozíciójában levő lizint glutaminra cseréljük, nukleotid (101. számú szekvencia) és aminosav- (102. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

Az 49. ábrán a ΔΝ23/Ο(152)Ε/Κ(153)Ε, azaz egy olyan KGF-analóg, amelyből az N-terminális első 23 aminosavát kivágtuk, és amelyben a természetes KGF 152-es pozíciójában levő glutamint glutaminsavra, és a 153-as pozíciójában levő lizint glutaminsavra cseréljük, nukleotid (103. számú szekvencia) és aminosav- (104. számú szekvencia) szekvenciáit látjuk.

Az 50. ábrán a ΔΝ23 hatását látjuk sztreptozotocinnal indukált diabéteszre Sprague-Dawleypatkányokban.

A jelen találmány tárgyát új KGF-analógok képezik. Meghatároztuk, hogy a természetes KGF négy ciszteincsoportja (Cys¹ és Cys¹⁵, valamint a Cys¹⁰² és Cys¹⁰⁶) vesz részt két diszulfidhíd kialakításában. A Cys⁴⁰ nem vesz részt intramolekuláris diszulfidhíd kialakulásában. Tehát a KGF két kis diszulfidhidat tartalmaz, amelyeket majdnem 90 aminosav választ el egymástól. Annak meghatározásával, hogy melyik cisz6

HU 226 168 Β1 teincsoport vesz részt a diszulfidhidak kialakításában, azt tudjuk valószínűsíteni, hogy melyik ciszteincsoport szabad és képes nem kívánt intermolekuláris kötéseket létrehozni, amelyek a fehérjének azt a képességet adják, hogy nem kívánt tercier struktúrát vegyen fel (azaz egy olyan konformációt, amely csökkenti a fehérje aktivitását).

Meglepő módon azt találtuk, hogy ha egy KGF-et úgy módosítunk, hogy kivágjuk vagy más aminosavakkal helyettesítjük a KGF 1-es és 15-ös pozíciójában levő ciszteincsoportokat (32-es és 46-os pozíciók a 2. számú szekvencián), akkor olyan KGF-analógokat kapunk, amelyeknek lényegében megnőtt a stabilitásuk (azaz csökkennek azok a problémák, amiket a nem helyes térszerkezet kialakulása, intermolekuláris diszulfidképződés és/vagy fehérjeaggregáció okoz). Például a KGF-analógokat általában nagyobb kitermeléssel lehet tisztítani oldható, megfelelő térszerkezetű fehéije formájában. Emellett, ha az anyagot egyszer már tisztítottuk, akkor stabilabb lesz a pH a hőmérséklet- stb. változásokra, a kiindulási molekulával összehasonlítva. Jóllehet nem kötődünk elméletekhez, az a véleményünk, hogy a KGF Cys¹ és Cys¹⁵ csoportjai, amellett, hogy intramolekuláris diszulfidhidat és egy N-terminális diszulfidhurkot képeznek, bizonyos körülmények között szabad ciszteinként is léteznek, amelyek képesek intermolekuláris hidakat képezni, ami a fehérje instabilitását és aggregációját eredményezi. Azt azonban felfedezték, hogy az N-terminális diszulfidhurok nem lényeges a receptorkötéshez vagy a mitogén aktivitáshoz.

A továbbiakban a „KGF-analóg vagy a „KGF polipeptidanalógja szakkifejezés jelentése bármelyik természetes vagy nem természetes polipeptid, amelynek a struktúrája a KGF-étől abban tér el, hogy a KGF peptidszekvenciának a 24 N-terminális aminosavában (a 2. számú szekvencia 32-55 aminosavai) olyan módosításokat tartalmaz, miszerint a KGF Cys¹ és Cys¹⁵ csoportjait (32-es és 46-os aminosavak a 2. számú szekvencián) helyettesítjük vagy kivágjuk. Az nem lényeges, hogy miképpen helyettesítjük vagy vágjuk ki a ciszteincsoportokat, és idetartoznak azok a polipeptidanalógok, amelyekben egy vagy több aminosavat kivágtunk és/vagy helyettesítettünk. Ennek megfelelően a találmány tárgyát új keratinocita növekedési faktor fehérjék képezik. Ez a család számos fehérjecsoportot tartalmaz.

A KGF-analógok egy csoportja olyan molekulákat tartalmaz, amelyekben a KGF-1-es és 15-ös csoportjában levő ciszteineket más aminosavakkal helyettesítjük, beleértve az olyan aminosavakat is, amelyek a természetben nem fordulnak elő fehérjékben. A helyettesítési analógok előállításának stratégiája lehet a helyspecifikus mutagenezis alkalmazása [Ho és munkatársai: Gene 77, 51-59 (1989); Innis és munkatársai: „PCR Protocols” Academic Press, Inc., San Diego, CA]. [Az egy aminosavhelyettesítést tartalmazó KGFanalógokra annak alapján hivatkozunk, hogy az érett fehérje adott pozíciójában (mínusz szignálszekvencia) (2. számú szekvencia) milyen csoport található, majd megadjuk, hogy az adott pozícióban milyen új aminosav található. Például egy, a KGF 15-ös pozíciójában (46-os pozíció a 2. számú szekvencián) cisztein helyett szerint tartalmazó analógot a továbbiakban „C(15)Sként említjük.] A ciszteint előnyösen semleges aminosawá konvertáljuk, azaz például glicinné, valinná, alaninná, leucinná, izoleucinná, tirozinná, fenil-alaninná, hisztidinné, triptofánná, szerinné, treoninná és metioninná, amelyek közül legelőnyösebb a szerin, a treonin és az alanin, mivel kémiailag ezek hasonlítanak leginkább a szerinre. Az 1. példában leírjuk a C(1,15)S készítését, részleges génszintézis (valamint egyéb rekombináns technikák) alkalmazásával, amit egy stabilan transzformált bakteriális gazdasejtben való expresszió követ.

A KGF-analógoknak egy másik csoportját képezik azok a molekulák, amelyekből a KGF 1-es és 15-ös ciszteincsoportjait kivágtuk. Különböző stratégiák alkalmazhatók ilyen KGF-analógok kifejlesztésére, azaz például N-terminális csonkítás és helyspecifikus deléció, vagy a kettő kombinációja.

Az „N-terminális csonkítás” szakkifejezés jelentése a KGF-nek egy olyan módosítására utal, amely során a KGF 1-24 N-terminális aminosavát (32-55-ös aminosavak a 2. számú szekvencián), beleértve a Cys¹ és Cys¹⁵ csoportokat is, kivágjuk. [Az aminosavcsonkítást tartalmazó keratinocita növekedési faktor analógokat a továbbiakban úgy említjük, hogy megadjuk az érett fehérje adott pozíciójában (mínusz szignálszekvencia) kivágott csoportot (2. számú szekvencia), a deléció helyének és a kivágott csoportok számának megadásával. Például egy KGF-analógot, amelyből 24 aminosavat kivágtunk a KGF N-terminálisából (1-55-ös csoportok a 2. számú szekvencián) a továbbiakban „ΔΝ24 analóg.] Ebbe a csoportba tartoznak a természetes KGF ΔΝ23 analógjai, amelyekből a 41-154-es aminosavak közül (72-185-ös aminosavak a 2. számú szekvencián), pontosabban a 123-133-as aminosavak közül (154-164-es aminosavak a 2. számú szekvencián) egyet vagy többet kivágtunk, vagy egy semleges vagy negatív töltésű aminosawal helyettesítettünk, hogy ezzel csökkentsük a fehérje pozitív töltését. A módosításhoz előnyben részesítjük az Arg⁴¹, Gin⁴³, Lys⁵⁵, Lys⁹⁵, Lys¹²⁸, Asn¹³⁷, Gin¹³⁸, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gin¹⁵², Lys¹⁵³ vagy a Thr¹⁵⁴ aminosavakat, amelyek közül inkább előnyben részesítjük a Gin¹³⁸, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gin¹⁵² csoportokat, és legelőnyösebbnek tartjuk az Arg¹⁴⁴-et. Ebbe a csoportba tartoznak a természetes KGF-nek azok a ΔΝ23 analógjai, amelyekben hurokképző módosítások találhatók az Asn¹¹⁵-His¹¹⁶-Tyr¹¹⁷Asn¹¹⁸-Thr¹¹⁹ hurokképző régiójában (146-150-es aminosavak a 2. számú szekvencián), ezek előnyösen tartalmaznak egy töltésváltozást a 116-os aminosavcsoportban, illetve még előnyösebb, ha a 116-os csoportot Gly-re cseréljük ki. Emellett még ebbe a csoportba tartoznak a természetes KGF-nek azok a ΔΝ23 analógjai, amelyekben egy vagy több aminosavhelyettesítés, deléció vagy addíció található a KGF 123-133-as régiójában (154-166-os aminosavak a 2. számú szekvencián).

Az 1. példában részletesen leírjuk a szisztematikus N-terminális csonkítás végrehajtását, részleges gén7

HU 226 168 Β1 szintézist alkalmazva, egyéb rekombináns technikákkal kombinálva, majd rekombináns expressziét végezve egy stabilan transzformált bakteriális gazdaszervezetben. Ilyen N-terminális csonkítással kapjuk például a ΔΝ15-ΔΝ24 molekulákat. Továbbá a 3. példában részletesen leírjuk a természetes KGF-et vagy annak heterogén N-terminális glikozilezett izoformáit kódoló DNS-ek expresszióját emlőssejttenyészetekben, az előnyösen glikozilezett izoforma tisztítását, amelyből a természetes KGF érett formájához viszonyítva az 1-23-as aminosavak ki vannak vágva.

Ezzel szemben egy helyspecifikus deléció a KGFnek egy olyan módosítását jelenti, amely során egy vagy több aminosavat (azaz például a Cys¹ vagy Cys¹⁵) eltávolítunk. Ha a KGF-nek a Cys¹ vagy Cys¹⁵ aminosavait kivágjuk, akkor az analóg egy aminosavval rövidebb mint a KGF. [Azokat a KGF-analógokat, amelyekből egy aminosavat kivágtunk, annak alapján nevezzük el, hogy milyen csoport található az adott pozícióban az érett fehérjében (mínusz szignálszekvencia), amit a 2. számú szekvencián mutatunk be, ezt követi az aminosav pozíciójának megadása zárójelben, majd egy mínuszjel. Például egy ebbe a csoportba tartozó analógot, amelyből a KGF 15-ös pozíciójában levő ciszteint kivágtuk (36-os pozíció a 2. számú szekvencián) „C(15)-”-ként említünk.] A helyspecifikus deléclókat helyspecifikus mutagenezissel hozhatjuk létre, az előzőkben ismertetett módon.

Ebbe a csoportba tartoznak azok az analógok is, amelyekből a KGF Cys¹ és Cys¹⁵ csoportjait csonkolással és delécióval eltávolítjuk. A KGF-analógok jellemző példája lehet például a KGF első három N-terminális csoportjának (Cys-Asn-Asp), vagy a KGF első nyolc aminosavának (Cys-Asn-Asp-Met-Thr-Pro-GluGln) csonkolása, kapcsolva a csonkolást a KGF 15-ös pozíciójában levő cisztein kivágásával (ezeknek az analógoknak a jelzése AN3/C(15)- és AN8/C(15)-). Mivel a természetes KGF negyedik és kilencedik aminosavpozíciójában metionin található, ezért nincs szükség további metioninkodonra ahhoz, hogy ezzel lehetővé váljon transzlációs Iniciálása.

Egy újabb csoportba tartoznak azok a molekulák, amelyekben a KGF 1-es és 15-ös pozíciójában levő ciszteineket csonkítással és helyettesítéssel eltávolítjuk. Például jellemző analóg a AN3/C(15)S és AN8/(C15)S. Az ilyen analógokból a KGF első három N-terminális csoportját vagy első nyolc N-terminális csoportját vágjuk ki, ezt kapcsolva a 15-ös pozícióban levő ciszteinnek egy másik aminosawal, például szerinnel való helyettesítésével.

Ha a KGF-analógokat biológiai módszerekkel, azaz a termékek sejtben való expressziójával állítjuk elő, szemben a szilárd fázisú szintézissel, vagy a természetes termékek proteolitikus vagy enzimatikus emésztésével stb., az ilyen polipeptideket kódoló polipeptidek egy vagy több nukleotidban különböznek a természetes KGF nukleinsavszekvenciájától. Az ilyen polinukleotidok expresszálhatók, és a kapott polipeptidet a számos rekombináns technika közül bármelyikkel tisztíthatjuk, amelyek a szakterületen jártas szakember számára jól ismertek.

A KGF-analógokat vagy azok egy részét kódoló DNS-szekvenciák közé tartozhatnak egyebek között azok, amelyekbe beépítettük az expresszióhoz a kiválasztott gazdasejtek által „előnyben részesített” kodonokat (azaz például az „Escherichia coli expressziós kodonokat”); restrikciós enzimek hasítási helyeit, valamint további kezdő, lezáró vagy intermedier nukleotidszekvenciákat (azaz például egy indító metionin aminosavcsoportot Escherichia co//-sejtekben való expresszióhoz), hogy ezzel megkönnyítsük könnyen expresszálódó vektorok készítését.

A jelen találmány tárgyát képezik a polipeptidek expresszálásában alkalmazható rekombináns molekulák vagy vektorok. Ezek a vektorok lehetnek DNSvagy RNS-vektorok, és lehetnek cirkulárisak, lineárisak, egyszálúak vagy kétszálúak, lehetnek természetben előfordulóak vagy számos komponensből összeállítottak, amely komponensek lehetnek természetesek vagy szintetikusak.

Az ilyen expressziós vektorokra számos példa létezik. A vektorok komponenseit, azaz például a replikonokat, szelekciós géneket, fokozókat, promotereket és hasonlókat előállíthatjuk természetes forrásokból vagy ismert eljárásokkal szintetizálhatjuk. A jelen találmányban jól használható expressziós vektorok mindegyik esetben tartalmaznak legalább egy expressziós kontrollelemet, funkcionálisan hozzákapcsolva a KGF polipeptidanalógot kódoló, beszúrt nukleinsavmolekulához. Ez a kontrollelem felelős a polipeptid találmány szerinti nukleinsavmolekulákról való expressziójának szabályozásáért. A jól használható kontrollelemek közé tartozik például a lac rendszer, a trp rendszer, a λ fágból származó operátorok és promoterek, egy glikolitikus élesztő promoter, az élesztő savas foszfatáz génből származó promoter, egy élesztő α-mating faktor és az adenovírusból, Epstein-Barr-vírusból, poliómavírusból és majomvírusból, valamint különböző retrovírusokból származó kontrollelemek. Azonban számos egyéb, a szakirodalomban jól ismert, prokarióta és eukarióta expresszióhoz használható vektor és kontrollelem használható a jelen találmány gyakorlatában.

Az alkalmas prokarióta klónozóvektorok közé tartoznak az Escherichia coli plazmidok (azaz például pBR322, colE1, pUC és az F-faktor), az előnyben részesített plazmid a pCFM1156 (ATCC 69702), a pCFM1656 (ATCC 69576) és a pCFM3102 (az alább következő Példák részben ismertetjük). Más, az emlős, rovar, élesztő, gomba és bakteriális expresszióban használható ismert vektor, amelyeknek számos típusa ismert, szintén jól használható erre a célra. Ezeknek a vektoroknak a megfelelő gazdasejtekbe való transzfekciója eredményezheti a KGF-analóg polipeptid expresszióját.

A jelen találmányban jól használható mikroorganizmus lehet prokarióta vagy eukarióta. A megfelelő prokarióta gazdaszervezetek közé tartoznak a különböző Escherichia coli (azaz például FM5, HB101, DH5a, DH10 és MC1016), Pseudomonas, Bacillus és Streptomyces törzsek, amelyek közül az Escherichia coli törzseket részesítjük előnyben. Az alkalmas eukarióta

HU 226 168 Β1 gazdasejtek közé tartoznak az élesztők és egyéb gombák, a rovarsejtek, növényi sejtek és állati sejtek, azaz például a COS (úgymint a COS-1 és COS-7) és CV-1 majomsejtvonalak, Swiss, Balb-c vagy NIH sejtekből származó 3T3 vonalak, HeLa és L-929 egérsejtek, valamint CHO, BHK vagy HaK hörcsögsejtek. Az alkalmazott gazdaszervezettől függően a jelen találmány szerint előállított rekombináns polipeptidek lehetnek emlős vagy egyéb eukarióta szénhidrátokkal glikozilezve, vagy lehetnek glikozilezetlenek.

A előnyben részesített előállítási módszer számos különböző faktortól és megfontolástól függően változik; egy adott helyzetben az optimális előállítási eljárás nyilvánvaló a szakterületen jártas szakember számára, minimális kísérleti munka elvégzése után. A kapott expressziós terméket azután közel homogenitásig tisztítjuk, a szakterületen ismert eljárások alkalmazásával. Egy prokarióta sejt termékének tipikus tisztítási eljárása magában foglalja a sejtfalak feltörését magas nyomással vagy egyéb eszközökkel, centrifugálás alkalmazását a sejttörmelék eltávolítására, majd ioncserélő kromatográfia alkalmazását a felülúszóra vagy szűrletre, és végezetül hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia alkalmazását. Ha az analógot oldhatatlan formában expresszáljuk, akkor egy másik tisztítási technika magában foglalja azt a lépést, hogy először oldatba visszük az analógokat tartalmazó zárványtesteket, majd helyreállítjuk a fehérje térszerkezetét, és végezetül hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiát alkalmazunk. A tisztítási technikákat ismertetik az 1994. október 13-án benyújtott 08/323,339 számú amerikai egyesült államokbeli bejelentésben. A 08/323,339 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírnak egy eljárást egy keratinocita növekedési faktor tisztítására, ami a következő lépésekből áll: (a) KGF-et tartalmazó oldatot állítunk elő; (b) az (a) pontban kapott oldatból a KGF-et egy kationcserélő gyantára kötjük ki; (c) a KGF-et eluálóoldattal eluáljuk a kationcserélő gyantáról; (d) a (c) pontból származó eluátumot vagy átbocsátjuk egy megfelelő molekulasúly-kizárásos hordozón, vagy hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiát végzünk a (c) pontban kapott eluátumoldattal; és (e) kinyerjük a molekulasúly-kizárásos hordozón vagy hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiával kapott KGF-et.

Az analógokat természetesen gyorsan átvizsgálhatjuk, hogy megbecsüljük a fizikai tulajdonságaikat. A Példák részben számos jól ismert stabilitásesszét mutatunk be, jóllehet az analóg vizsgálatára használt specifikus esszé természete nem kritikus. Emellett a biológiai aktivitás szintje (azaz a receptorkötés és/vagy affinitás, mitogén, sejtszaporodási és/vagy in vivő aktivitás) is vizsgálható számos különböző teszt alkalmazásával, amelyek közül néhányat a Példák részben mutatunk be. Számos vizsgálat jól ismert, és arra használhatjuk, hogy gyorsan megvizsgáljuk, rendelkeznek-e elfogadható biológiai aktivitással vagy sem. Egy ilyen vizsgálatban specifikusan vizsgáljuk a KGF-analógoknak azt a képességét, hogy mennyire képesek kötődni a KGF receptorhoz (KGFR), a ¹²⁵l-KGF-fel versengve [Bottaro és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 265, 12 767-12 770 (1990); Ron és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 268, 2984-2988 (1993)]. Egy másik módszer a KGFR/KGF analóg kölcsönhatások vizsgálatára magában foglalja különböző technikák alkalmazását, azaz például a valós idejű biospecifikus kölcsönhatás-elemzést (BIA) [Felder és munkatársai: Molecular & Cellular Biology 13, 1449-1455 (1993)]. Emellett egy mitogén vizsgálat is használható arra, hogy vizsgáljuk a KGF-analógoknak azt a tulajdonságát, hogy mennyire képesek serkenteni a DNS-szintézisét [Rubin és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 802-806 (1989)]. Végezetül sejtszaporodási esszék is használhatók arra, hogy vizsgáljuk a KGF-analógoknak azt a képességét, mennyire képesek serkenteni a sejtszaporodást [Falco és munkatársai: Oncogene 2, 573-578 (1988)]. Az előzőkben említett esszérendszerek bármelyikét alkalmazva a KGF-analógoknak gyorsan átvizsgálható a biológiai aktivitása.

Egy előnyös megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgyát olyan KGF-analógok képezik, amelyek megtartják teljes (azaz legalább a természetes KGFhez lényegében hasonló) in vitro vagy in vivő biológiai aktivitásukat. Az előzőkben említett vizsgálatokkal meghatározva, az ezekkel a tulajdonságokkal rendelkező KGF-analógok a következők: C(1,15)S, ÁN3/C(15)S, ÁN3/C(15)-, AN8/C(15)S, AN8/C(15)-, ΔΝ15, ΔΝ16, ΔΝ17, ΔΝ18, ΔΝ19, ΔΝ20, ΔΝ21, ΔΝ22, ΔΝ23, ΔΝ24 vagy AN23/R(144)Q.

A KGF-analógok tovább módosíthatók, hogy olyan további kémiai egységeket tartalmazzanak, amelyek általában nem képezik részét a peptidnek. Az ilyen derivatizált egységek fokozhatják a KGF-analóg oldékonyságát, abszorpcióját, biológiai felezési idejét és hasonlókat. Az egységek emellett eliminálhatják vagy gyengíthetik a fehérje nem kívánt mellékhatását, és egyéb hasonló hatásuk is lehet. Az ilyen hatások kiváltására alkalmas egységeket leírnak a szakirodalomban [Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. kiadás, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)]. Kovalens módosításokat vihetünk be a molekulába, a peptid megcélzott aminosavcsoportjait egy szerves származékképző ágenssel reagáltatjuk, amely képes reagálni a kiválasztott oldalláncokkal vagy terminális csoportokkal [T. E. Creighton: Proteins: Structure and Molecule Properties; W. H. Freeman & Co., San Francisco, 79-86. old. (1983)]. A polietilénglikol (PEG) egy ilyen kémiai egység, amit a terápiás fehérjetermékek készítésére lehet használni. Néhány fehérje esetében a polietilénglikol kapcsolásáról kimutatták, hogy megvéd a proteolízissel szemben [Sada és munkatársai: J. Fermentation Bioengineering 71, 137-139 (1991)], és bizonyos polietilénglikol egységek kapcsolási módszerei is ismertek [Davis és munkatársai: „Non-lmmunogenic Polypeptides”, 4,179,337 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, kibocsátva 1979. december 18-án; Royer: „Modifying Enzimes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby”, 4,002,531 számú amerikai egyesült államokbeli szaba9

HU 226 168 Β1 dalmi bejelentés, kibocsátva 1977. január 11-én], A kérdésről összefoglaló is jelent meg a szakirodalomban [Abuchowski és munkatársai: Enzymes and Drugs, 367-382. old. in: Enzymes as Drugs, szerk.; Holcerberg és Roberts (1981)]. A polietilénglikol esetében számos különböző eszközt használnak a polietilénglikolnak a fehérjéhez való kapcsolására. Általában a polietilénglikol-molekulákat a fehérjéhez egy, a fehérjén levő reaktív csoporton keresztül kapcsolják a fehérjéhez. Az ilyen kapcsoláshoz jól használhatók a lizincsoportokon vagy az N-terminálison található aminocsoportok. Például Royerazt állítja, hogy reduktív alkilezés használható polietilénglikol-molekuláknak egy enzimhez való kapcsolására [Royer: „Modifying Enzimes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby, 4,002,531 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, kibocsátva 1977. január 11-én]. Wright azt állítja, hogy a szabad aminocsoportokkal rendelkező peptideket és szerves vegyületeket a PEG vagy rokon vízoldékony szerves polimerek imidátszármazékával lehet módosítani [Wright: „PEG Imidates and Protein Derivatives Thereof, EP 0 539 167, publikálva 1993. április 28-án], Shaw szabadalmi bejelentésében azt írja le. hogy a fehérjékben levő lizincsoportok módosíthatók a polietilénglikol-molekuláknak a kapcsolása céljából, a reaktív aminocsoportokon keresztül [Shaw, 4,904,584 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, kibocsátva 1990. február 27-én],

Egy megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgya egy gyógyászati készítmény egydózisos beadási egysége, amit biztonságosan be lehet adni parenterálisan vagy orálisan, a betegség egy meleg vérű állatban (azaz például emberben) való kezelésére. Az ilyen gyógyászati készítmény lehet liofilezett vagy egyéb módon dehidratált terápiás vagy diagnosztikai készítmény, amit fiziológiásán elfogadható oldószer hozzáadásával helyre lehet állítani. Az oldószer lehet bármilyen közeg, azaz például steril víz, fiziológiás sóoldat, glükózoldat vagy egyéb vizes szénhidrát (azaz például poliolok, úgymint mannit, xilit vagy glicerin), amely képes feloldani a szárított készítményt, amely kompatibilis a kiválasztott beadási úttal, és ami nem zavarja a hatóanyagot és a használt helyreállító stabilizálószert. Egy specifikus megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát egy egydózisos beadási egység előállítására alkalmas kit képezi. A kit tartalmaz egy első tartóedényt, amelyben a szárított fehérje van, valamint egy második tartóedényt, amelyben egy vizes készítmény van, amely egy helyreállítási stabilizálószert tartalmaz. Az oldatban levő fehérje koncentrációja, az egyes tartóedényekbe töltött oldat térfogata, valamint a tartóedények kapacitása (egymással kapcsolatban levő paraméterek, amelyek megfelelően módosíthatók, a végső kiszerelésben levő hatóanyag kívánt koncentrációjától függően), amik a szakterületen jártas szakember számára ismert széles tartományon belül változhatnak.

A találmány szerinti KGF-analógok jól használhatók terápiás és diagnosztikai ágensekként, valamint kutatási ágensekként. Tehát a KGF-analógok használhatók in vitro és/vagy in vivő diagnosztikai vizsgálatokban, amelyekben egy szövet- vagy szervmintában határozzuk meg a KGF mennyiségét, illetve használhatók KGFR-t expresszáló sejtek meghatározására és/vagy izolálására [Bottaro és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 265, 12 767-12 770 (1990); Ron és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 268, 2984-2988 (1993)]. A szövetek vagy szervek vizsgálatakor ¹²⁵l-KGF-analóg esetében kevesebb, KGFR-hez kötődő radioaktivitás lesz, ha a ¹²⁵l-KGF-analóggal kapott standardizált kötési görbével hasonlítjuk össze, a jelzetlen természetes KGF-nek a KGFR-hez való kötődése következtében. Hasonlóképpen, a ¹²⁵l-KGF-analóg arra is használható, hogy kimutassuk a KGFR jelenlétét különböző sejttípusokban.

A találmány tárgyát képezi a KGF-analógok alkalmazása a peptid elleni ellenanyagok előállításában, amely ellenanyagok kötődnek a természetes KGF-hez. Ebben a megvalósítási módban az ellenanyagok monoklonális vagy poliklonális eredetűek, és egy KGF-analóg felhasználásával állítjuk elő. A kapott ellenanyagok főleg a természetes KGF-hez kötődnek, előnyösen akkor, ha a fehérje természetes (biológiailag aktív konformációjában) van. Ezek az ellenanyagok használhatók a természetes KGF kimutatására vagy tisztítására.

A találmány tárgyát képezi emellett a KGF-analógok alkalmazása terápiás alkalmazhatósággal rendelkező, nagy affinitású vagy kis affinitású KGF-kötő molekulák felfedezésében, amiket például a KGF hatékony bejuttatására, vagy a KGF-aktivitás hatékony inhibitoraként lehet használni. A KGF-analógok hőstabilitása fontos az ilyen kötőmolekulák fiziológiás körülmények között (azaz 37 °C-on) való azonosításában, mivel a KGF-hez való affinitásuk erősen hőmérsékletfüggő, és nem jósolható meg a 4 °C-on megfigyelt affinitásukból.

Az in vivő alkalmazások során a KGF-analógokat adalék anyagokkal formulázhatjuk. Az ilyen adalék anyagok közé tartoznak a pufferek, hordozók, stabilizálószerek, töltőanyagok, konzerválószerek, tonicitást beállító szerek, antioxidánsok és hasonlók (azaz például a viszkozitást beállító szerek vagy töltőanyagok). A specifikus adalék anyagok kiválasztása függ a tárolási formától (azaz attól, hogy folyékony vagy liofilezett formában tároljuk), valamint a KGF-analóg beadási módjától. A megfelelő kiszerelési módok, amelyek ismertek a szakterületen, megtalálhatók a szakirodalomban [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. kiadás, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)].

A KGF-analógok terápiásán hatékony mennyiségben alkalmazhatók olyan szövetekre, amelyeket specifikusan az jellemez, hogy sérült vagy klinikailag elégtelen számú nem-fibroblaszt epitélium sejtekkel rendelkezik. Azok a területek, amelyekre a KGF-analógok sikeresen alkalmazhatók, a következők, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat: az adnexális struktúrák, azaz például a hajhagymák, izzadságmirigyek és faggyúmirigyek serkentése, szaporítása és differenciálódása égési sérülésekben, vagy egyéb, teljes mélységű sérülésekben szenvedő betegek kezelésében; az epidermolysis bullosa (ami az epidermisznek az alatta

HU 226 168 Β1 levő dermiszhez való tapadásának hibája, ami gyakran súlyos betegségeket okozó nyílt, fájdalmas hólyagok megjelenését eredményezi) által okozott léziók felgyorsult reepitelizációja;. a kemoterápia által indukált szőrhullás megelőzése és férfias típusú kopaszság kezelése, vagy a haj progresszív elvesztése férfiakban és nőkben; gyomor- és nyombélfekélyek kezelése; gyulladásos bélbetegségek, azaz például a Crohn-féle betegség (ami elsődlegesen a vékonybelet érinti) és a fekélyes kolitisz (ami elsődlegesen a vastagbelet érinti) kezelése; a béltoxicitás megakadályozása vagy csökkentése sugárzásos vagy kemoterápiás kezelések során (azaz például előkezelés és/vagy utókezelés), amely kezeléseket vagy citoprotektív hatás, vagy regeneráció, vagy mindkettő kiváltására használnak; nyálka termelésének indukálása az emésztőrendszerben; a ll-es típusú pneumociták szaporodásának és differenciálódásának indukálása, ami segíthet betegségek kezelésében vagy megelőzésében, mint például a fiatal gyermekek hialinmembrán-megbetegedésében (azaz például gyermek légzésinehézség-tünetek és bronchopulmonáris fejlődési rendellenesség); a bronchioláris és/vagy alveoláris epitélium szaporodásának és differenciálódásának serkentése belégzési sérülések (beleértve a magas oxigénkoncentrációt) miatt fellépő akut vagy krónikus tüdőkárosodás vagy tüdőelégtelenség esetében, emfizéma, tüdőkárosító kemoterápiás szerek alkalmazása, ventilátorsérülés vagy egyéb tüdőkárosító körülmények között; a máj működésének fokozására, máj zsugorodás, akut virális hepatitisz és/vagy a májnak okozott mérgezés által okozott heveny májkárosodás esetében; szaruhártyasejtek regenerálódásának indukálása, például a szaruhártya horzsolódása esetében; az epiteliális sejtregenerálódás indukciója „progresszív gumi” betegség kezelésére; dobhártya epiteliális sejtek regenerálódásának indukciója a dobhártya károsodásának kezelésére és a cukorbetegség fellépésének megakadályozására vagy kezelésére, vagy a hasnyálmirigy-szigetsejtek transzplantációjának beállításánál adalék anyagként.

A nem-fibroblaszt epiteliális sejtek szaporodását igénylő betegnek egy KGF-analógból hatékony mennyiséget adunk be. A „hatékony mennyiség jelentése a KGF-analógnak az a mennyisége, ami ahhoz szükséges, hogy kiváltsuk a kívánt választ a kezelt betegben, és ezért általában a kezelőorvos határozza meg. A beadott KGF-analóg mennyiségét befolyásoló faktorok közé tartozik a beteg kora és általános kondíciója, a kezelendő betegség stb. A tipikus dózisok 0,001 mg/testsúlykilogramm és 500 mg/testsúlykilogramm között változnak.

A KGF-analógot meleg vérű állatoknak (azaz például embereknek) biztonságosan beadhatjuk parenterálisan (azaz IV, IT, IM, SC vagy IP utakon), orálisan vagy topikálisan. A KGF-analógot használhatjuk egyszeri beadással, vagy ismételten is beadhatjuk, a betegségtől és a beteg állapotától függően. Néhány esetben a KGF-analógot más terápiát kísérő anyagként is beadhatjuk, illetve beadhatjuk egyéb gyógyászati készítményekkel együtt.

Az alábbi példákat a jelen találmány teljes illusztrálása céljából adjuk meg. Az nyilvánvaló, hogy az ismertetett eljárások módosíthatók, anélkül, hogy eltérnénk a találmány szellemétől.

Példák

Az alábbi példákban ismertetett eljárásokban szereplő standardmódszereket vagy megfelelő alternatív módszereket megtalálhatjuk a molekuláris biológia széles körben ismert kézikönyveiben [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Current Protocols in Molecular Biology, szerk.: Ausubel és munkatársai, Greene Publishing és WileyInterscience: New York (1990)].

1. példa

A KGF-et és KGF-analógokat kódoló DNS készítése

A teljes hosszúságú humán KGF gén (ami a természetes KGF szekvenciájával rendelkező polipeptidet kódol) klónozását elvégeztük egy állati sejtből származó RNS-en végzett polimeráz-láncreakcióval (PCR), illetve kémiailag szintetizált (Escherichia coli-ra optimalizált kodon) oligonukleotidokon végzett PCR-reakcióval. Mindegyik eljárást ismertetjük az alábbiakban.

Azokból a sejtekből, amelyekről ismert, hogy előállítják a polipeptidet, RNS-t izolálunk, majd ezen PCRamplifikálást végzünk. Először az AG1523A humán fibroblaszt sejtvonalból származó sejteket (beszerzési forrás: NIA Aging Cell Repository, Coriell Institute fór Medical Research Camden, New Jersey, USA) guanidiumizotiocianáttal elroncsoljuk, majd extraháljuk [Chomyzinski és munkatársai: Anal. Biochem. 172, 156 (1987)]. Standard reverz transzkriptáz protokollt használva az össz-RNS-re, előállítjuk a KGF cDNS-t. A KGF gén PCR- (PCR#1) amplifikálását a KGF cDNS-t templátként alkalmazva végezzük el, primerként az 1. számú és 2. számú oligonukleotidot használva, amelyek a KGF gén közvetlen 3’ és 5' szomszédságában levő DNSszekvenciákat kódolják [Model 9600 thermocycler (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT); 28 ciklus, mindegyik ciklus a következő lépésekből áll: egy perc 94 °C-on a denaturáláshoz, két perc 60 °C-on az illeszkedéshez, majd három perc 72 °C-on a hosszabbításhoz]. A PCR#1 terméknek egy kis alikvot részét használjuk azután templátként egy második KGF PCR (PCR#2) amplifikáláshoz, amiben az előzőkkel azonos ciklusokat alkalmazunk, azzal az eltéréssel, hogy illeszkedési hőmérsékletként 50 °C-ot használunk. A KGF gén expressziós klónozásához hálós PCR-primereket használunk arra, hogy kényelmesen használható restrikciós hasítási helyeket hozzunk létre a KGF gén végein. A 3. számú és 4. számú oligonukleotidot használjuk a PCR#2-ből származó KGF DNS-termék módosítására, hogy Miül és BamHI restrikciós hasítási helyeket vigyünk be a gén 3’ és 5' végére (PCR#3; 30 ciklus; az egyes ciklusokban alkalmazott lépések: egy perc 94 °C-on a denaturáláshoz, két perc 60 °C-on az illeszkedéshez, és három perc 72 °C-on a meghosszabbo11

HU 226 168 Β1 dáshoz). Ezt a DNS-t azután Miül és BamHI restrikciós endonukleázokkal hasítjuk, fenollal extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. Azután szuszpendáljuk, majd T4 ligázzal egy pCFM1156 plazmidba (2A. ábra) ligáljuk, amely tartalmaz egy „RSH” szignálszekvenciát, ezzel előállítva az RSH-KGF konstrukciót (3. ábra).

A ligálás termékét Escherichia coli FM5 törzsbe (ATCC: 53911) transzformáljuk [Hanahan: J. Mól. Bioi. 166, 557 (1983)], majd LB+kanamicinlemezre szélesztjük 28 °C-on. Számos transzformánst választunk ki, majd kis folyadéktenyészetekben szaporítjuk, amelyek 20 pg/ml kanamicint tartalmaznak. Az RSH-KGF plazmidot izoláljuk az egyes tenyészetek sejtjeiből, majd a DNS-t megszekvenáljuk. Mivel a KGF gén belsejében van egy Ndel hasítási hely, ezért nem lehet a természetes génszekvenciát közvetlenül a kívánt expressziós vektorba klónozni, amely a zárójelbe tett Ndel és BamHI hasítási helyeket tartalmazza. Ezt háromutas ligálással érjük el. Az RSH-KGF plazmidot a Bsml és Sstl egyedi restrikciós hasítási helyeken elvágjuk, majd egy 1%-os agarózgélen végzett elektroforézis után izolálunk egy körülbelül 3 kilobázispár méretű DNS-fragmenst (amely a KGF gén 3' végét tartalmazza). PCR-t végzünk (PCR#4) a PCR#3-ra leírt körülmények között, azzal az eltéréssel, hogy a 3. számú oligonukleotid helyett az 5. számú oligonukleotidot használjuk. A PCR-rel kapott DNS-terméket azután Ndel és Bsml restrikciós endonukleázzal hasítjuk, majd 4%-os agarózgélen végzett gélelektroforézis után egy 311 bázispár méretű DNS-fragmenst izolálunk. A ligálás harmadik darabja a pCFMH56 plazmidnak egy 1,8 kilobázispár méretű darabja, amit Ndel és Sstl restrikciós enzimekkel vágtunk ki, ezt egy 1%-os agarózgélen végzett gélelektroforézis után izoláltuk. Az előzőkben ismertetett ligálást (T4 ligázzal), transzformálást, kanamicinszelekciót és DNS-szekvenálást követően kiválasztunk egy olyan kiónt, amely tartalmazza a 4. ábrán látható konstrukciót és a KGF jelű plazmidot. Egy belső riboszomális kötőhely miatt, amely csonkított termékeket eredményez, az egyedi Kpnl és EcoRI hasítási helyek közötti KGF DNS-szekvenciát kémiai úton szintetizált oligonukleotidokkal (6. számú oligonukleotidtól a 11. számú oligonukleotidig) helyettesítjük, hogy minimalizáljuk a belső starthely használatát (5. ábra).

1. számú oligonukleotid (7. számú szekvencia): 5’-CAATGACCTAGGAGTAACAATCAAC-3’

2. számú oligonukleotid (8. számú szekvencia): 5’-AAAACAAACATAAATGCACAAGTCCA-3'

3. számú oligonukleotid (9. számú szekvencia): 5’-ACAACGCGTGCAATGACATGACTCCA-3’

4. számú oligonukleotid (10. számú szekvencia): 5’-ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA-3’

5. számú oligonukleotid (11. számú szekvencia): 5’-ACACATATGTGCAATGACATGACTCCA-3’

6. számú oligonukleotid (12. számú szekvencia): 5’-CTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCC-3'

7. számú oligonukleotid (13. számú szekvencia): 5’-AAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTT-3’

8. számú oligonukleotid (14. számú szekvencia): 5’-GCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTG-3’

9. számú oligonukleotid (15. számú szekvencia): TCTTGGGTGCCCTTGACTTTGCCGCGTTTGTCGATACGCAGGTAC-3’

10. számú oligonukleotid (16. számú szekvencia): 5'-ACAGCAACAGTACGGATTTCCATAATATTGTAGTTGTTTTTCATC-3'

11. számú oligonukleotid (17. számú szekvencia): 5'-AATTCAGATTCAACACCTTTGATTGCAACGATACCA-3’.

Az oligonukleotidokat T5 polinukleotid-kinázzal foszforilezzük, majd hővel denaturáljuk. Az egyszálú (ss) oligonukleotidokat azután, hagyjuk, hogy kétszálú DNS-fragmenseket képezzenek, oly módon, hogy hagyjuk hogy a hőmérséklet lassan szobahőmérsékletre csökkenjen. Ezután T4 ligázt használunk arra, hogy mind a belső oligonukleotid tapadó végeit, mind a teljes kétszálú oligonukleotid-fragmenst kovalens kötéssel a Kpnl és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztett KGF plazmidhoz kössük. Az új plazmid jelzése KGF(dsd).

Egy olyan KGF gént készítünk PCR-amplifikálással, a 12-24. számú oligonukleotidok felhasználásával, amelynek a kodonjai teljesen Escherichia coli-ra vannak optimalizálva.

12. számú oligonukleotid (18. számú szekvencia): 5'-AGTTTTGATCTAGAAGGAGG-3'

13. számú oligonukleotid (19. számú szekvencia): 5’-TCAAAACTGGATCCTATTAA-3’

14. számú oligonukleotid (20. számú szekvencia): 5’-AGTTTTGATCTAGAAGGAGGAATAACATATGTGCAACGACATG

ACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTGCTCCAGCCCGGAACGT-3'

15. számú oligonukleotid (21. számú szekvencia): 5'-CACACCCGTAGCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGT

GTTCGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAA-3’

16. számú oligonukleotid (22. számú szekvencia): 5’-CGTGGTAAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGCAAAAACAACTACAACATC

ATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTCGAATCAAA-3’

17. számú oligonukleotid (23. számú szekvencia): 5’-GGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACT

GTACGCAAAAAAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAA-3'

18. számú oligonukleotid (24. számú szekvencia): 5’-CTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGAC

CCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGT-3'

19. számú oligonukleotid (25. számú szekvencia): 5’-ATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTC

ACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAATAGGATCCAGTTTTGA-3’

HU 226 168 Β1 vait kódolják, és amelyeket úgy állítottunk elő, hogy egy vagy több, a DNS-fragmensek szintézisére használt technikák közül egyet vagy többet használunk. Bármelyik analóg teljes mértékben előállítható az előzőkben ismertetett technikák alkalmazásával. Ahol ez alkalmaz20. számú oligonukleotid (26. számú szekvencia): 5’-TACGGGTGTGACGTTCCGGG-3’

21. számú oligonukleotid (27. számú szekvencia): 5'-CTTTACCACGTTTGTCGATA-3’

22. számú oligonukleotid (28. számú szekvencia): 5

5’-ATTCAACACCTTTGATTGCA-3’

23. számú oligonukleotid (29. számú szekvencia): 5’-CCAGGATCAGTTCTTTGAAG-3’

24. számú oligonukleotid (30. számú szekvencia):

5’-GAACCGGGATACCTTTCTGG-3' 10

A 12-24. számú oligonukleotidokat úgy terveztük meg, hogy a természetes KGF-et kódoló teljes DNSszekvenciát oligonukleotidok képezik, vagy a „Watson vagy a „Crick” szálról, és PCR-amplifikálással a kívánt kétszálú DNS-szekvenciát kapjuk (6. ábra) [PCR#5, 15 Model 9600 thermocycler, Perkin-Elmer Cetus; 21 ciklus, mindegyik ciklus a következő lépésekből áll:

másodperc 94 °C-on denaturáláshoz, 31 másodperc 50 °C-on illesztéshez, és 31 másodperc 73 °C-on a meghosszabbodáshoz: a 21 ciklust követően a 20 PCR-t egy végső, hét percig tartó hosszabbítási lépéssel zárjuk lej. PCR-amplifikálás után a DNS-fragmenst Xbal és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd az 521 bázispár méretű fragmenst a pCFM1156 expressziós plazmidba ligáljuk, amit előzőleg ugyanazok- 25 kai az enzimekkel hasítottunk. A PCR#5-ben külső primerekként (100 pmol/100 μΙ rxn) a 12. számú és 13. számú oligonukleotidot, valamint 1 μΙ/100 μΙ rxn KGFtemplátot használjuk, ami a 14-19. számú oligonukleotidokkal végzett ligálásból származik (T4 ligázzal) (a 30 15-19. számú oligonukleotidokat foszforilezzük T4 polinukleotid-kinázzal), a 20-24. számú oligonukleotidokat használva sávsegítő oligonukleotidokként [Jayaraman és munkatársai: Biotechniques 12, 392 (1992)] a ligáláshoz. A végső konstrukció jelzése KGF(optimali- 35 zált kodonok).

Az alábbiakban ismertetett összes KGF kodon részben a KGF(dsd)-ben, részben a KGF(optimalizált kodonok)-ban található DNS-szekvenciákból, vagy a kettő kombinációjából áll. A szekvenciákat a továbbiakban to- 40 vább módosítjuk a DNS-szekvenciákban található megfelelő restrikciós hasítási helyekbe olyan szekvenciák beépítésével, amelyek az adott KGF-analóg aminosaható volt, ott az Escherichia coli kodonokra optimalizált oligonukleotidokat használtuk, jóllehet az Escherichia coli-ra optimalizált kodonok részben vagy teljes egészben való jelenléte bármelyik vizsgált génben nem növelte szignifikánsan a tenyésztett bakteriális sejtekben előállított fehérje mennyiségét. A 7-24. és 36-50. ábrákon KGF-analóg nukleotid- és aminosavszekvencia-konstrukciókat mutatunk be: C(1,15)S (7. ábra), AN3/C(15)S (8. ábra); AN3/C(15)- (9. ábra); AN8/C(15)S (10. ábra); AN8/C(15)- (11. ábra): ΔΝ15 (12. ábra); ΔΝ16 (13. ábra); ΔΝ17 (14. ábra); ΔΝ18 (15. ábra); ΔΝ19 (16. ábra); ΔΝ20 (17. ábra); ΔΝ21 (18. ábra); ΔΝ22 (19. ábra); ΔΝ23 (20. ábra); ΔΝ24 (21. ábra); C(1,15)S/R(144)E (22. ábra); C(1,15)S/R( 144)Q (23. ábra); AN23/R(144)Q (24. ábra); C(1,15,40)S (36. ábra); C(1,15,102)S (37. ábra); C(1,15,102,106)S (38. ábra); ΔΝ23/Ν(137)Ε (39. ábra); ΔΝ23/Κ(139)Ε (40. ábra); ΔΝ23/Κ(139)Ο (41. ábra); AN23/R(144)A (42. ábra) AN23/R(144)E (43. ábra); AN23/R(144)L (44. ábra); ΔΝ23/Κ(147)Ε (45. ábra); AN23/K(147)Q (46. ábra) ΔΝ23/Κ(153)Ε (47. ábra); AN23/K(153)Q (48. ábra) és AN23/Q(152)E/K(153)E (49. ábra). Mindegyik, ismertetett KGF-analóg konstrukciónak a DNSszekvenciáját ellenőriztük.

2. példa

KGF-analógok expressziója

Előállítás Escherichia co//-ban

Három különböző expressziós plazmidot használunk a KGF-analóg gének klónozásában. Ezek a következők: PCFM1156 (ATCC# 69702), pCFM1656 (ATCC# 69576) és pCFM3102 (2A„ 2B. és 2C. ábra). A p3102 plazmid a pCFM1656 plazmidból származik, egy sorozat helyspecifikus báziscserét hajtva végre PCR átfedő oligonukleotid mutagenezissel. A Bglll hasítási hellyel (pCFM1656 plazmid 180# bázispár) kezdve közvetlenül a plazmid replikációs promoterétől (P^b) 5’ irányban, az elvégzett báziscserék a következők:

PCFM1656 bp#	bp a pCFM1656-ban	Megváltoztatott bázispárok a pCFM3102-ben
#204	T/A	C/G
#428	A/T	G/C
#509	G/C	A/T
#617	—	két G/C bp beszúrása
#677	G/C	T/A
#978	T/A	C/G
#992	G/C	A/T
#1002	A/T	C/G
#1005	C/G	T/A
#1026	A/T	T/A
#1045	C/G	T/A
#1176	G/C	T/A
#1464	G/C	T/A
#2026	G/C	bp deléció
#2186	C/G	T/A

HU 226 168 Β1

#2479	A/T	T/A
#2498-2501	AGTC TCAC	GTCA CAGT
#2641-2647	TCCGAGC AGGCTC	bp deléció
#3441	G/C	A/T
#3452	G/C	A/T
#3649	A/T	T/A
#4556	--	bázispárok beszúrása

(67. számú szekvencia) 5’-GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG-3’ (68. számú szekvencia) 3’-CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC-5’

Amint az az előzőkből látható, a pCFM1156, pCFM1656 és pCFM3102 plazmidok nagyon hasonlítanak egymásra, és számos azonos restrikciós hasítási helyet tartalmaznak. A plazmidot egyszerűségi szempontok alapján választottuk ki, és a vektor DNS-komponensei könnyen megváltoztathatók az új konstrukcióknak megfelelően. Az összes klónozáshoz az Escherichia coli FM5 törzset használjuk (ATCC: 53911), és a transzformációkat vagy Hanahan módszerével [Hanahan: J. Mól. Bioi. 166, 557 (1983)] vagy elektroelúcióval végezzük, egy Gene Pulser transzfekciós berendezést használva erre a célra (BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA), a gyártó előírásai szerint.

Először kis mennyiségű, frissen tenyésztett inokulummal kezdünk, amit a három pCFM vektor közül az egyikben levő kívánt konstrukciót hordozó rekombináns Escherichia coli klónból készítünk. Az inokulumot úgy állítjuk elő, hogy a megfelelő törzs mélyhűtött glicerines tenyészetéből 0,1 ml-t viszünk át egy kétliteres lombikba, ami 500 ml Luria-táptalajt tartalmaz. A tenyészetet 16 óra hosszat rázatjuk 30 °C-on, majd a tenyészetet egy 15 literes fermentorba visszük át, ami 8 liter steril táptalajt tartalmaz [Társai és munkatársai: J. Industrial Microbiol. 2, 181-187 (198)].

A rátáplálásos fermentáció az 1. számú táptalaj beadásával indul [Társai és munkatársai: J. Industrial Microbiol. 2, 181-187 (198)]. Amikor az OD eléri a 35-ös értéket, akkor a kívánt KGF-analóg expresszióját azzal indukáljuk, hogy a tenyészet hőmérsékletét gyorsan megemeljük 37 °C-ra, két óra hosszat itt tartjuk, majd 42 °C-ra emeljük, hogy denaturáljuk a Cl represszort. Az 1. számú táptalaj adagolását leállítjuk, és megkezdjük 300 ml/óra sebességgel a 2. számú táptalaj adagolását. A 2. számú táptalaj összetétele: 175 g/l triptikáz/pepton, 87,5 g/l élesztőkivonat és 260 g/l glükóz. Egy óra hosszat 42 °C-on tartjuk, majd a tenyészet hőmérsékletét 36 °C-ra csökkentjük, és ezt a hőmérsékletet tartjuk további 6 óra hosszat.

A fermentációt leállítjuk, majd a sejteket centrifugálással 1 literes centrifugapalackokba tett műanyag zacskókba gyűjtjük. A sejteket centrifugálással ülepítjük (400/perc, 60 perc), majd a felülúszókat eltávolítjuk, és a sejttömeget -90 °C-ra hűtjük.

A különböző KGF-analógok Escherichia co//-ban való expresszióját követően a természetes KGF, C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)E, C(1,15)S/R(144)Q, ΔΝ15, ΔΝ23 és AN23/R(144)Q fehérjéket az alábbi eljárással tisztítjuk. A nagy sejtsűrűségű fermentációból származó sejttömeget 4 °C-on szuszpendáljuk 0,2 mol/l nátrium-klorid, 20 mmol/l nátrium-foszfát (pH=7,5) összetételű oldatban, 10-20 (tömeg/térfogat)%-os oldat formájában, megfelelő keverő alkalmazásával. A szuszpendált sejteket azután feltárjuk, az oldatot háromszor átbocsátva egy homogenizálón (APV Gaulin, Inc., Everett, MA). A kifolyó homogenizátumot 4-8 °C-ra hűtjük, megfelelő hőcserélővel. A törmeléket azután eltávolítjuk, oly módon, hogy, hogy a lizátumot egy J-6B centrifugában (Beckman Instruments, Inc., Brea, CA), egy JS 4.2 rotorral 4200/perc fordulatszámmal, 30-60 percig 4 °C-on centrifugáljuk. A felülúszókat azután óvatosan dekantáljuk, majd egy korábban elkészített 450 ml-es (5*23 cm) oszlopba töltött Sepharose Fást Flow gyantára (Pharmacia, Piscataway, NJ) töltjük, amit 0,2 mol/l nátrium-klorid, 20 mmol/l nátriumfoszfát (pH=7,5) összetételű oldattal hoztunk egyensúlyba 4 °C-on. Ezután az oszlopot öt oszloptérfogatnyi (2250 ml) oldattal (0,4 mol/l nátrium-klorid, 20 mmol/l nátrium-foszfát, pH=7,5) mossuk 4 °C-on. A kapott fehérjét eluáljuk, az oszlopot 5 liter 0,5 mol/l nátrium-klorid, 20 mmol/l nátrium-foszfát (pH=7,5) összetételű oldattal mosva. 50 ml-es frakciókat szedünk, és az elfolyó oldat A₂8o értékét folyamatosan ellenőrizzük. Azután 14%-os gélen SDS-PAGE-val elemezzük azokat a frakciókat, amelyekről az A₂₈₀ érték alapján kiderült, hogy eluált anyagot tartalmaznak, ezzel igazolva, hogy a keresett polipeptid jelen van.

Ezután a számunkra érdekes fehérjéket tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd azonos térfogatú desztillált vizet adunk hozzá. A hígított mintát azután egy korábban elkészített 450 ml térfogatú (5*23 cm) Sepharose Fást Flow oszlopra visszük, amit előzőleg 0,4 mol/l nátrium-klorid, 20 mmol/l nátrium-foszfát (pH=6,8) oldattal hoztunk egyensúlyba 4 °C-on. Az oszlopot azután 2250 ml térfogatú, 0,4 mol/l nátrium-klorid, 20 mmol/l nátrium-foszfát (pH=6,8) összetételű oldattal mossuk, majd a fehérjét 20 oszloptérfogatnyi lineáris gradienssel eluáljuk (a gradiens összetétele 0,4 mol/l nátriumklorid, 20 mmol/l nátrium-foszfát (pH=6,8)-tól 0,6 mol/l nátrium-klorid, 20 mmol/l nátrium-foszfát (pH=6,8) között változik). Ismét 50 ml-es frakciókat szedünk, az elfolyó oldatot folyamatosan ellenőrizve az A₂₈₀ alapján. Azután a fehérjéket tartalmazó frakciókat (14%-os SDS-PAGE-val meghatározva) egyesítjük, majd egy YM-10 membránon (10 000-es vágási érték) keresztül 30-40 ml-re koncentráljuk 350 ml-es kevertetett cellában (Amicon, Inc., Mayberry, MA).

A koncentrátumot azután egy korábban elkészített, 1300 ml (4,4*85 cm) térfogatú oszlopba töltött Superdex-75 gyantára (Pharmacia) töltjük, amit oszloppufferrel hoztunk egyensúlyba. Az oszloppuffer összetéte14

HU 226 168 Β1 le: 1*PBS (Dulbecco-féle foszfáttal puffereit sóoldat, „D-PBS, kalcium- és magnéziummentes), vagy 0,15 mol/l nátrium-klorid, 20 mmol/l nátrium-foszfát (pH=7,0). Miután hagytuk a mintát az oszlopon futni, a fehérjét eluáljuk a gélszűrő anyagról, az oszloppuffert használva erre a célra. Ezután 10 ml-es frakciókat szedünk, majd az analógot tartalmazó frakciókat (14%-os SDS-PAGE alapján meghatározva) egyesítjük. Tipikus esetben a fehérjekoncentráció körülbelül 5-10 mg a kapott egyesített oldatban. Az összes előzőleg említett eljárást 4-8 °C-on hajtjuk végre, hacsak külön nem említjük.

Egy másik tisztítási eljárást használunk a természetes KGF, a C(1,15)S és a ΔΝ23 tisztítására. Az eljárás az alábbi lépésekből áll, és hacsak külön nem említjük, akkor minden eljárást, oldatot és anyagot 23±5 °C hőmérsékleten végzünk, illetve tartunk.

A bakteriális fermentáció termelési fázisának befejezése után a sejttenyészetet 4-8 °C-ra hűtjük, majd a sejteket centrifugálással vagy hasonló eljárással gyűjtjük össze. A sejttömegegységre várt fehérjemennyiség és a fehérje szükséges tisztított mennyisége alapján megfelelő mennyiségű sejttömeget szuszpendálunk egy enyhe pufferoldatban [20 mmol/l nátrium-foszfát, 0,2 mol/l nátrium-klorid (pH=7,5)j, aminek tömege körülbelül ötszöröse a szuszpendálandó sejttömegnek. A sejteket homogén oldattá diszpergáljuk egy erős keverő alkalmazásával. A sejttömeg diszperziójának hőmérsékletét 4-8 °C-on tartjuk a homogenizálás során.

A sejteket azután magas nyomással feltárjuk, például úgy, hogy a sejttömeget kétszer bocsátjuk át egy megfelelő méretű sejthomogenizátoron. A homogenizátumot azután 5±3 °C-on tartjuk. A sejtlizátum tisztítására egy korábban előkészített mélységi szűrőházat használunk (Cuno, Inc., Meriden, CT), amit megfelelő szűrőfelülettel rendelkező szűrővel láttunk el, és 0,2 mol/l nátrium-klorid, 20 mmol/l nátrium-foszfát (pH=7,5) összetételű oldattal hoztunk egyensúlyba. Az egyensúlyba hozást és a feltisztítást 5±3 °C-on hajtjuk végre. A feltisztítás előtt megfelelő mennyiségű szűrési segédanyagot használunk a szűrő előre való befedésére, amit alaposan összekeverünk a sejtlizátummal, majd a lizátumot feltisztítjuk, az oldatot a szűrőberendezésen bocsátva át. A szűrőt 0,2 mol/l nátrium-klorid, 20 mmol/l nátrium-foszfát (pH=7,5) összetételű oldattal mossuk. A szűrletet, valamint minden ezt követő mosófolyadékot egy megfelelő kapacitású, hűtött tárolóedényben gyűjtünk össze, aminek hőmérsékletét ezalatt az idő alatt 10 °C-on tartjuk.

A feltisztítást követően a lizátumot egy korábban elkészített SP-Sepharose Fást Flow oszlopon bocsátjuk át, amely minden 2 g sejttömegre számítva legalább 1 ml gyantát tartalmaz. Az SP-Sepharose Fást Flow oszlopot hideg (5±3 ’C), 0,2 mol/l nátrium-klorid, 20 mmol/l nátrium-foszfát (pH=7,5) összetételű oldattal hozzuk egyensúlyba. Az oszlop hőmérsékletét 10 °C alatt tartjuk. A feltisztított lizátumot (5±3 ’C) azután ioncserélő oszlopra visszük, és az eluátum abszorbanciáját (A₂8o) folyamatosan ellenőrizzük. A minta felvitele után az oszlopot hideg, 0,2 mol/l nátrium-klorid,

0 mmol/l nátrium-foszfát (pH=7,5) összetételű oldattal mossuk, majd 0,3 mol/l nátrium-klorid, 20 mmol/l nátrium-foszfát (pH=7,5) összetételű oldattal mossuk,

23±5 ’C-on.

A kívánt fehérje eluálására lineáris gradienst használunk, a gradiens összetétele 0,2-1 mol/l nátrium-klorid, 20 mmol/l nátrium-foszfát (pH=7,5) között változik. A nyersterméket számos frakcióban szedjük, az eluátum A₂₈₀ értéke alapján. Az eluálást követően ezeket a frakciókat egyesítjük, és feljegyezzük a térfogatukat.

A szabad szulfhidrilcsoportok oxidálására egy oxidációs lépést iktatunk be. A természetes KGF-hez viszonyítva megváltozott ciszteinmintázattal rendelkező fehérjékhez egy oxidálóágenst (azaz például ciszteamin-dihidrokloridot vagy más megfelelő oxidálóágenst, például cisztint, oxidált glutatlont vagy kétértékű rezet) adunk 1-20 mmol/l végkoncentrációban, majd a pH-t 7-9,5-re állítjuk. Ciszteamin-dihidroklorid alkalmazása esetén a pH-értéke előnyösen 9,0±0,3. Az oxidációt 10-30 ’C-on végezzük, megfelelő ideig. A természetes KGF fehérje esetében az oxidációt megfelelő mennyiségű ammónium-szulfát, azaz például 1-2 mol/l ammónlum-szulfát hozzáadásával végezzük, a pH-értékét 7,5±0,5 között tartva, majd a hőmérsékletet 23±5 ’C-on tartjuk, megfelelő időtartamig.

Oxidálás után az oldat pH-ját 6,5 és 9,5 közé állítjuk. Ha szükséges, akkor szilárd ammónium-szulfátot adunk az oldathoz 2 mol/l végkoncentrációban. A lebegő szilárd anyagok eltávolítása céljából az oldatot megfelelő feltisztítószűrőkön bocsátjuk át.

A megszűrt, oxidált terméket azután hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiának (HIC) vetjük alá. A HIC mátrix Butyl-650M Toyopearl gyanta (Tosohaas, Inc., Montgomeryville, PA). A fehéijetartalmú oldatot felvisszük az oszlopra, amit előzőleg 2 mol/l ammónium-szulfát, 0,15 mol/l nátrium-klorid, 20 mmol/l nátrium-foszfát (pH=7,0) összetételű oldattal hoztunk egyensúlyba. A minta felvitele után az oszlopot 2 mol/l ammónium-szulfát, 0,10 mol/l nátrium-klorid, 20 mmol/l nátrium-foszfát összetételű oldattal mossuk. A kívánt fehérjét azután eluáljuk, csökkenő lineáris ammóniumszulfát-gradienst használva, aminek a koncentrációja 2-0 mol/l között változik, 0,15 mol/l nátrium-klorid, 20 mmol/l nátrium-foszfát (pH=7,0) összetételű oldatban kifejlesztve. Amikor a kívánt fehérje elkezd eluálódni, amit az eluátum A₂₈₀ értékének növekedése jellemez, elkezdünk frakciókat szedni. A kívánt fehérjéket tartalmazó frakciókat egyesítjük, alaposan összekeverjük, meghatározzuk az egyesített oldat térfogatát, csakúgy, mint a bennük levő fehérje koncentrációját.

Az egyesített HIC fehérjetartalmú eluátumot azután töményítjük, és az elúciós puffért lecseréljük. A fehérjéket tipikus esetben 5,0-10,0 mg/ml koncentrációra töményítjük. Ultraszűrést végzünk egy PTGC Pellicon kazettarendszerrel (Millipore, Inc., Bedford, MA) ellátott ultraszűrő rendszerrel, amely megfelelő vágási értékű membránt tartalmaz.

A betöményítés után a mintát ismét diaszűrjük egy megfelelő pufferrel szemben. A koncentrációs lépés után keletkező visszamaradt oldatot 0,15 mol/l nátrium15

HU 226 168 Β1 klorid, 20 mmol/l nátrium-foszfát (pH=7,0) összetételű oldattal szemben diaszűrjük, addig, amíg a visszamaradt oldat vezetőképessége a 0,15 mol/l nátrium-klorid, 20 mmol/l nátrium-foszfát (pH=7,0) összetételű oldat vezetőképességének 5%-án belül nincs.

Emellett az esetleg jelen levő csapadékok és bakteriális endotoxinok eltávolítására a betöményített, diaszűrt, fehérjetartalmú mintát egy 0,1 pm-es Posidyne szűrőn (Pali, Inc., Cortland, NY) bocsátjuk át. Az oldat fehérjekoncentrációjának meghatározása után, valamint a nyers végtermék kívánt koncentrációja alapján az oldatot 0,15 mol/l nátrium-klorid, 20 mmol/l nátriumfoszfát (pH=7,0) összetételű oldattal hígítjuk a kívánt végkoncentrációra. Ezután egy végső aszeptikus szűrést végzünk egy 0,22 μιτι-es szűrőn keresztül, majd a végterméket pirogénmentes tartóedénybe tesszük (körülbelül 5 °C-on), a további kiszereléshez.

B. Elemzés

Az elemzést Escherichia coli-bó\ származó, természetes KGF; C(1,15)S; C(1,15)S/R(144)Q; ΔΝ15; ΔΝ23 és AN23/R(144)Q mintákkal végezzük.

Konformációs stabilitás

A polipeptideket a tárolási stabilitásuk, a hőmérséklet-változás hatására lejátszódó térszerkezet-változás hőmérséklete (T_m), és a széles pH-tartományban mérhető stabilitásuk alapján hasonlítjuk össze.

Tárolási stabilitás

A 25. ábrán a természetes KGF-et és a C(1,15)S-t hasonlítjuk össze, ha 20 mmol/l NaPO₄, 0,15 mol/l nátrium-klorid (pH=7,0) összetételű oldatban tároljuk 37 °C-on 27 óra hosszat. A C(1,15)S jelentősen megnövekedett mennyiségű oldható fehérjét mutat a természetes KGF-fel összehasonlítva.

A 26. ábrán a természetes KGF, a ΔΝ15 és a C(1,15)S stabilitását hasonlítjuk össze, ha PBS-ben, valamint 50 mmol/l nátrium-foszfát, 0,15 mol/l nátriumklorid (pH=7,0) összetételű oldatban tároljuk 37 °C-on 18 óra hosszat. Sokkal több oldható fehérje nyerhető ki a magasabb foszfáttartalmú oldatból, mint a PBS-ből. ΑΔΝ15, valamint a C(1,15)S sokkal nagyobb stabilitást mutat a természetes KGF-fel összehasonlítva (nem közölt adatok). A ΔΝ15 és a C(1,15)S szintén 100%-ban nyerhető ki a magas foszfátkoncentrációjú oldatból, amint az a természetes KGF-fel kapott eredményekből várható.

Azonban a tárolási stabilitásra egyetlen összehasonlító kísérletet végeztünk a C(1,15,40)S és a C(40)S között (ez utóbbit az 1. számú szekvencia 201-684-es bázispárjai kódolják, azzal az eltéréssel, hogy a Ser^-et AGA kódolja); valamint a C(1,15,102) és a C(102)S között, (az utóbbit az 1. számú szekvencia 201-684-es bázispárjai kódolják, azzal az eltéréssel, hogy a Ser¹⁰²-t AGG kódolja). Az itt nem közölt eredmények csökkent stabilitást mutatnak (azaz kevesebb oldható fehérje marad 37 °C-on való tárolás után). Azonban a tenyészközegből kinyert, oldott, megfelelő természetes térszerkezetű C(1,15,40)S fehérje mennyisége nagyobb, mint a C(40)S mennyisége, mutatva ezzel, hogy a C(1,15,40)S valójában stabilabb, és az összehasonlító kísérletből kapott eredmények nem alkalmasak következtetések levonására. A jelen találmány tárgyát képezi előnyösen egy olyan KGF-analóg, amely más helyettesítőket tartalmaz a Cys⁴⁰, Cys¹⁰² és Cys¹⁰⁶ pozícióban, és még előnyösebb, ha kizárjuk a C(1,15,40)S, C(1,15,102)S és a 0(1,15,40,102,106) analógokat.

A természetes KGF, C(1,15)S, DN23,

C( 1,15)S/R( 144)E, C(1,15)S/R(144)Q és a AN23/R(144)Q analógoknak azt a képességét is vizsgáljuk, hogy megakadályozzák a magas hőmérsékleten való aggregációt. 0,5 mg/ml fehérjét tartalmazó mintákat készítünk D-PBS-ben. Az egyes mintákból 0,5 ml-t osztunk szét aliquot részekre 3 ml-es, 1-es típusú üvegküvettában. A küvettákat gumidugókkal zárjuk le, majd 13 mm-es lepattanó alumínium pecséteket préselünk rájuk. Ezeket a küvettákat azután egy 37 °C-os inkubátorba tesszük. A küvettákat előre meghatározott időpontokban kivesszük, és vizsgáljuk, hogy mennyi az oldhatófehérje-veszteség bennük. A látható csapadékot az egyes minták 250 μΙ-es aliquot részének egy 0,22 pm-es Spin-X™ szűrőegységen (Costar, Cambridge, MA) át való centrifugálásával távolítjuk el. A megszűrt oldatban levő oldható fehérjét azután méretkizárásos HPLC-vel elemezzük. Az oldható fehérje mennyiségét a HPLC-csúcs területének integrálásával határozzuk meg, majd az eredményeket a 37 °C-on való inkubálás idejének függvényében ábrázoljuk. A természetes KGF-re, a C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)E-re és a C(1,15)S/R(144)Q-ra vonatkozó eredményeket a 27. ábrán mutatjuk be (a AN23-ra és a AN23/R(144)Q-ra vonatkozó eredményeket nem közöljük).

Azután megbecsüljük az oldható, monomer fehérje veszteségének felezési idejét. Az 1. táblázatban a megmaradt oldható KGF felezési idejét láthatjuk, ezeknek a fehérjéknek 37 °C-on való tárolása után.

1. táblázat

Az oldható, monomer fehérjék veszteségének felezési ideje

Fehérje	ti/2 (nap)
Természetes KGF	0,6
ΔΝ23	1,1
C(1,15)S	1,2
C(1,15)S/R(144)Q	13,3
AN23/R(144)Q	22,3
C(1,15)S/(144)E	38,0

Amint az a fenti 1. táblázatból és a 27. ábráról látható, a természetes KGF aggregálódik leggyorsabban, az oldhatóság felezési ideje 0,6 nap. A C(1,15)S/R(144)Q, a AN23/R(144)Q és a C(1,15)S/R(144)E analógok lényegesen nagyobb felezési idővel rendelkeznek, azaz 13,3, 22,3 és 38 nappal.

A természetes térszerkezet elvesztése a hőmérséklet-emelés hatására

A természetes térszerkezet hőmérséklet-emelkedés hatására való elvesztését cirkuláris dikroizmussal

HU 226 168 Β1 (CD) vizsgáljuk 230 nm-en, egy J-720™ spektropolarimétert használva (Jasco, Inc., Easton, MD), amit egy PTC-343 Peltier típusú hőmérséklet-szabályozó rendszerrel szereltünk fel. A CD-elemzéshez 0,1 mg/ml elemzendő polipeptidet tartalmazó mintákat készítünk D-PBS-ben (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY). Mindegyik mintából körülbelül 2,5 ml-t teszünk egy 10 mm-es úthosszú Suprasil™ kvarc (Heraeus Quarzschmelze, GmbH, Hanau, Németország) fluoreszcenciacellába (Hellma Cells, Inc., Jamaica, NY). A cellákat azután a spektropolariméterben levő Peltier típusú hőmérséklet-szabályozó rendszerbe tesszük. A természetes térszerkezet hőmérséklet-emelkedés hatására való elvesztését 50 °C/óra sebességgel vizsgáljuk. A térszerkezet elvesztésének jelzésére az ellipticitás változását követjük 230 nm-en. Az egyes minta T_m értékét úgy becsüljük meg, hogy azonosítjuk azt a hőmérsékletet, amelynél az oldatban levő fehérjék 50%-a elvesztette a természetes térszerkezetét [Biophysical Chemistry; szerk.: Cantor és Schimmel; W. H. Freeman and Co., San Francisco (1980)]. A három fehérje becsült T_m értékét a 2. táblázatban mutatjuk be.

2. táblázat

Becsült olvadási hőmérsékletek

Fehérje	Tm CC)
Természetes KGF	54,0
ΔΝ15	55,0
C(1,15)S	55,0
ΔΝ23	56,0
C(1,15)S/R(144)Q	62,5
AN23/R(144)Q	63,0
C(1,15)S/R(144)E	63,5

Amint ezek az eredmények mutatják, a C(1,15)Snek és a ΔΝ 15-nek 1 °C-kal magasabb a T_m értéke a természetes KGF-hez viszonyítva. A AN23-nak további egy fokkal nőtt a T_m értéke. Azonban az R(144)Q-hoz viszonyítva a C(1,15)S/R(144)Q-nak vagy AN23-nak több mint 6 °C-kal magasabb a T_m értéke, és több mint 7 °C-kal magasabb mint a természetes KGF-é. Emellett a C(1,15)S/R(144)E T_m értéke több mint 9 °C-kal magasabb mint a természetes KGF-é, azaz ennyivel stabilabb.

pH

A C(1,15)S/R(144)Q és a C(1,15)S/R(144)E savstabilitását is összehasonlítjuk a természetes KGF savstabilitásával, a D-PBS pH-ját különböző értékekre állítva be, tömény sósavat vagy nátrium-hidroxidot adva hozzá. Körülbelül 2,35 ml, különböző pH-jú D-PBS-t keverünk össze 100 μΙ, 2,45 mg/ml KGF fehérjével egy kvarc cellában. Ezekben a mintákban a fehérje természetes térszerkezetét a hőmérséklet emelésével megbontjuk, 50 °C/óra sebességgel, majd CD-vel követjük 230 nm-en. A 28. ábrán a T_m-et a természetes KGF, a C(1,15)S, a C(1,15)S/R(144)Q és a C(1,15)S/R(144)E pH-jának függvényében mutatjuk be. A vizsgált pH-tartományban a C(1,15)S-nek, a C(1,15)S/R(144)Q-nak és a C(1,15)S/R(144)E-nek magasabb a T_m értéke mint a természetes KGF-nek.

In vitro biológiai aktivitás

A C(1,15)S, a ΔΝ15, a ΔΝ23, a AN23/R(144)Q, a C(1,15)S/R(144)Q és a C(1,15)S/R(144)E in vitro mitogén aktivitását is meghatározzuk a fehérjekoncentráció függvényében, valamint meghatározzuk a maximális koncentráció felét, a Balb/MK sejtek [³H]-timidin-felvétele alapján [Rubin és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 802-806 (1989)]. Az egyes KGF-analógok koncentrációját az ismert standard természetes KGF-hez viszonyítva határozzuk meg, egy in vitro biológiai esszét használva. Azután mindegyik KGF-analógot meghígítjuk, és vizsgáljuk a biológiai aktivitását, egy Balb/MK mitogén esszét használva. A mintákat először egy biológiai vizsgálóközegben hígítjuk, ami 50%, a felhasználó által készített Eagle-féle MEM-et, 50%, a felhasználó által készített F12-t, 5 pg/ml transzferrint, 5 ng/ml nátrium-szelenitet, 0,0005% HSA-t és 0,005% Tween 20-at tartalmaz. A KGF-mintákat azután Falcon Primeria 96-lyukas lemezekre visszük, amiket Balb/MK sejtekkel oltunk be. Mérjük a [³H]-beépülését a DNS-szintézise során, majd bevitt, természetes KGF-koncentrációvá alakítjuk, természetes KGF standardgörbével összehasonlítva. Az eredményeket a 29-34. ábrán mutatjuk be. Amint az az ábrákról látható, a 28-33. ábrán leírt, vizsgált KGFanalógok a természetes KGF-ével összehasonlítható aktivitással rendelkeznek.

3. példa

Előállítás emlőssejttenyészetben

Ebben a példában két emlős expressziós rendszerben előállított, biológiailag aktív rekombináns KGF (rKGF) forma expresszióját, izolálását és jellemzését írjuk le.

A humán KGF gént normális dermális humán fibroblaszt sejtekből (Clontech, Inc., San Diego, CA) előállított cDNS PCR-amplifikálásával izoláljuk. A cDNS reverz transzkriptázzal való elkészítése után PCR-t használunk a KGF gén amplifikálására. A 25. számú oligonukleotidot és a 26. számú oligonukleotidot használjuk a génnek a cDNS-ről való amplifikálására, és a 27., valamint a 28. számú oligonukleotidot használjuk arra, hogy Hindlll és Bglll restrikciós hasítási helyet vigyünk be a fragmens végeire egy második PCRampiifikálás során, amint azt az 1A. és 1B. ábrán bemutatjuk.

25. számú oligonukleotid (69. számú szekvencia): 5'-CAATCTACAATTCAC AGA-3'

26. számú oligonukleotid (70. számú szekvencia): 5'-TTAAGTTATTGCCATAGG-3’

27. számú oligonukleotid (71. számú szekvencia): 5’-AACAAAGCTTCTACAATTCACAGATAGA-3’

28. számú oligonukleotid (72. számú szekvencia): 5’-AACAAGATCTTAAGTTATTGCCATAGG-3’.

A klónozást és a DNS-szekvencia ellenőrzését követően a KGF gén DNS-ét használjuk. Az amplifikálást a 29. és 30. számú oligonukleotiddal végezzük.

HU 226 168 Β1

29. számú oligonukleotid (73. számú szekvencia): 5’-CGGTCTAGACCACCATGCACAAATGGATACTGACATGG-3’

30. számú oligonukleotid (74. számú szekvencia): 5'-GCCGTCGACCTATTAAGTTATTGCCATAGGAAG-3’.

Az értelmes primer, a 29. számú oligonukleotid tartalmaz egy Xbal hasítási helyet és egy konszenzus Kozák szekvenciát (5’-CCACC3-3’), az ATG startkodon előtt. Az antiszensz primer, a 30. számú oligonukleotid tartalmaz egy Sáli hasítási helyet és egy további stopkodont. 18 PCR-amplifikálási ciklus után (30 másodperc denaturálás 94 °C-on, 40 másodperc illesztés 55 °C-on és 40 másodperc hosszabbítás 72 °C-on) a terméket Xbal és Sáli restrikciós endonukleázokkal emésztjük, majd egy hasonlóképpen emésztett pDSRa2 DNS-sel ligáljuk, Bourdrel és munkatársai, valamint Lu és munkatársai módszerét alkalmazva [Bourdrel és munkatársai: Protein Exp. & Purif. 4, 130-140 (1993); Lu és munkatársai: Arch. Biochem. Biophys. 298, 150-158 (1992)]. Ily módon kapjuk a KGF/pDSRa2 plazmidot, amelyben a humán KGF gén az SV40 korai promotere és az α-FSH poliadenilezési szekvencia között van. Két kiónt izolálunk, majd a DNS-szekvencia ellenőrzésével megerősítjük a kívánt vektor szerkezetét.

Azután két pg KGF/pDSRa2 DNS-t linearizálunk Pvul restrikciós endonukleázzal. A kezelt DNS-sel azután aranyhörcsög petefészek (CHO) sejteket (amiket az előző napon 0,8*10® sejt/60 mm-es tenyésztőlemez koncentrációban leoltottunk) transzfektálunk, egy standard kalcium-foszfát-csapadékos módszer alkalmazásával [Bourdrel és munkatársai: Protein Exp. & Purif. 4, 130-140 (1993)]. Két héttel később egyedi telepeket izolálunk, majd 24-lyukas lemezekre visszük át. A kondicionált közeget szérummentesnek tekintjük, amikor a sejtek a növekedés során egybenőnek, majd ezeknek aliquot részeit Westem-blottal vizsgáljuk, Escherichia coli-ban expresszált humán KGF elleni poliklonális nyúl antiszérumot használva.

A Western-blottokat úgy végezzük, hogy a mintákat 12,5 tömeg/térfogat%-os SDS poliakrilamidgélen futtatjuk, majd 1 óra alatt 400 mA áramerősséggel elektroblottoljuk nitrocellulóz membránokra, félszáraz transzferberendezést használva erre a célra (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA). Transzferpufferként 20 mmol/l TRISZ, 150 mmol/l glicin, 20% metanol összetételű oldatot használunk. A nitrocellulóz lapokat PBS-ben készített 10%-os normál kecskeszérummal blokkoljuk. Primer ellenanyagként Escherichia coli eredetű KGF elleni nyúl antiszérumot használunk. A használathoz 1/10 000 arányban hígítjuk PBS-ben készített 1%-os normál kecskeszérummal, majd a blokkolt nitrocellulóz lapokkal 12 óra hosszat inkubáljuk szobahőmérsékleten, és ezután a fölöslegben levő ellenanyagot 30 perces PBS-es mosással eltávolítjuk. A nitrocellulóz membránokat azután szobahőmérsékleten 30 percig inkubáljuk 100 ml, PBS-ben készített 1%-os normál kecskeszérummal, ami Vectastatin™ biotinilezett kecske anti-nyúl IgG-t tartalmaz (szekunder ellenanyag, Vector Labs, Burlingame, CA). Három tízperces PBS mosás után harminc percig szobahőmérsékleten inkubáljuk a lapokat sztreptavidint és biotinilezett peroxidázt tartalmazó 1%-os normál kecskeszérumban, amit a gyártó (Vector Labs) utasításai szerint készítettünk el. Három PBS-ben végzett mosás után a KGF-fel keresztreakciót adó anyagot láthatóvá tesszük, 60 pl 30% tömeg/térfogat%-os hidrogén-peroxid 100 ml PBS-ben készült oldatával és 50 pg 4-klór-naftol 20 ml metanolban készített oldatával inkubálva. A reakciót úgy állítjuk le, hogy 10 percig vízzel mossuk.

A biottok elemzéséből kiderült, hogy a KGF-specifikus ellenanyag kapcsolódik három különböző fehérjecsíkhoz, amelyek közül kettő szoros kapcsolatban van egymással, molekulasúlyuk körülbelül 25-29 kDa, a harmadiknak a becsült molekulasúlya pedig körülbelül 17 kDa, a 163 aminosavból álló érett fehérje várt 18,8-es molekulasúlyával szemben. Emellett számos erősen expresszáló kiónt, amelyek a Western-blot elemzés alapján több mint 2,0 mg/liter rKGF-et szekretálnak, kiválasztunk, és Lu és munkatársai módszerével forgatott palackban elszaporítunk [Lu és munkatársai: Arch. Biochem. Biophys. 298,150-158 (1992)], így állítunk elő nagy térfogatú szérummentes kondicionált közeget a KGF kationcserélő kromatografiával és gélszűréssel végzett tisztításához, amint azt az alábbiakban részletesen ismertetjük.

Három liter szérummentes kondicionált közegből származó KGF-et tisztítunk, a közeget közvetlenül felvive egy kationcserélő oszlopra (5*24 cm), amit 450 ml-rel töltünk meg egy S-Sepharose Fást Flow töltet (Pharmacia) szulfo-etil-származékával, és előzetesen egyensúlyba hozzuk 20 mmol/l nátrium-foszfáttal (pH=7,5). Öt oszloptérfogatnyi 20 mmol/l nátrium-foszfát, 0,2 mol/l nátrium-klorid (pH=7,5) összetételű oldattal való mosás után az rKGF-et 10 oszloptérfogatnyi lineáris nátrium-klorid-gradienssel eluáljuk [0,2-1,0 mol/l nátrium-klorid 20 mmol/l nátrium-foszfátban (pH=7,5)]. 50 ml-es frakciókat szedünk, az A₂₈₀ folyamatos monitorozásával. A KGF fehérjét az egyes frakciók SDS-PAGE-elemzésével mutatjuk ki. Az SDS-PAGE-t egy elektroforézis-rendszerrel végezzük (Novex, San Diego, CA), előre kiönött 14%-os TRIS-glicin gélt használva [Laemmli: Natúré 227, 680-685 (1970)]. A mintákat nemredukáló SDS mintapufferrel keverjük össze, anélkül, hogy a felvitel előtt felmelegítenénk őket. A fehérjéket vagy Coomassie blue-val vagy ezüstfestéssel mutatjuk ki. Két későn eluálódó csúcs tartalmaz olyan fehérjecsíkokat, amelyek megfelelnek a Western-blottal kimutatott 25-29 kDa-os csíkjainak. Az ezeket a csúcsokat külön-külön kisebb mint 1 ml térfogatra töményítjük, majd gélszűrésnek vetjük alá.

A gélszűréshez Superdex™ gyantaoszlopokat (HR 10/30, Pharmacia) használunk, amiket előzőleg egyensúlyba hoztunk PBS-sel (pH=7,2), majd az alábbi, ismert molekulasúlyú standardokkal kalibráltunk (BioRad, San Francisco, CA); tiroglobulin (670 kDA), g-globulin (158 kDA), ovalbumin (44 kDa), mioglobin (17 kDa) és B-12 vitamin (1,4 kDa). Ezekkel a tisztítási lépésekkel az rKGF körülbelül 2000-szeres tisztítása

HU 226 168 Β1 érhető el, specifikusan beleértve egy 17 kDa-os és egy 30 kDa-os anyagot, az ezüstfestés alapján becsülve.

A nagyobb molekulasúlyú anyag esetében az rKGF egy fő szimmetrikus csúcsként eluálódik (az A₂₈₀ alapján), amit KGF-a-nak nevezünk. Ebből az anyagból kisebb mennyiséget elemezve SDS-PAGE-val (azaz 3 pg/sáv a 6 pg/sáv-val ellentétben) két csúcsot lehet kapni, amelyeknek a molekulasúlya 1-2 kDa-nal tér el. A kisebb molekulasúlyú anyag esetében (ezt nevezzük KGF-b-nek) a gélszűréssel a várt mobilitású anyagot kapjuk. Mind a KGF-a mind a KGF-b esetében a tisztítás utáni teljes kitermelés körülbelül 30-40%.

Elemezzük a KGF-a és a KGF-b aminosavszekvenciáját is. Ezeket az elemzéseket egy automatikus szekvenálóberendezéssel végezzük (Model 477A vagy 470A, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) amit egy Model 120A on-line PTH-aminosav analizátorral és egy Model 900A adatgyűjtő rendszerrel láttunk el, Lu és munkatársai módszerre szerint [Lu és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 266, 8102-8107 (1991)]. A KGF-a Edman lebontásos elemzéséből kiderült, egy fő N-terminális szekvencia (75. számú szekvencia): X₁-N-D-M-T-P-E-Q-M-A-T-N-V-X₂-X₃-S van jelen. A összes szekvenálandó fehérje 1,6%-ában egy minor szekvencia van jelen, ami a harmadik N-terminális aminosavnál, azaz az aszparaginsavnál kezdődik. X_1t X₂ és X₃ nem volt meghatározható, mivel a szekvenciaelemzés során nem volt fenil-tiohidantoin (PHT) aminosav jel. A cDNS-szekvencia alapján egy megjósolt N-terminális szekvencia szerint Xj és X₃ ciszteincsoport, míg az X₂ aszparagin. Az X₁ és X₂ hiánya arra utal, hogy ezek a ciszteinek diszulfidhidat képeznek. A konszenzus lekapcsolt glikozilezési szekvencia, azaz az Asn-X-Ser alapján az X₂-nek megfelelő, megjósolt Asn csoport hiánya arra utal, hogy ez egy potenciális N-kapcsolt glikozilezési hely.

A KGF-b N-terminális szekvenciaelemzése érdekes módon kiderítette, hogy van egy S-Y-D-Y-M-E-G-G-Dl-R-V- (76. számú szekvencia) N-terminális szekvencia, jelezve, hogy ez a KGF-nek egy N-terminálison csonkított formája, ami az Arg²³-Ser²⁴ peptidkötésnél van elhasítva.

A KGF-a és KGF-b további jellemzéséhez a fehérjét glikozidázokkal kezeltük (neuraminidáz, O-glikanáz és/vagy N-glikanáz), ismert technikákat alkalmazva [Sasaki és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 262, 12 059-12 076 (1987); Takeuchi és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 263, 3657-3663 (1988); Zsebo és munkatársai: Cell 63, 195-201 (1990)]. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a KGF-a Νέε O-kapcsolt szénhidrátokat tartalmaz, jóllehet a KGF-a kis molekulasúlyú formája valószínűleg csak N-kapcsolt cukrot tartalmaz. A glikozidázos kezelés nem okozza a KGF-b molekulasúlyának csökkenését, jelezve, hogy a molekula nincs glikozilezve.

A KGF-a glikozilezési mintázatát tovább jellemezzük az előzőkben ismertetett, a Glu-C endopeptidáz által generált peptidek tömegspektrometriájával. A glikopeptidek szénhidrátstruktúrájának a mozgó ablak tömegspektrometriai módszerével való vizsgálatát sikeresen alkalmazták más fehérjékre [Huddleston és munkatársai: Anal. Chem. 65, 877-884 (1993); Carr és munkatársai: Prot. Sci. 2, 183-196 (1993)]. Egy nemglikozilezett peptid izolálásával megerősítettük, hogy a Thr²² részlegesen glikozilezettnek tűnik. Az Asn¹⁴ hasonló tömegspektrometriai elemzése mikroheterogenitást sugall a glikozilezésben, bi-, tri- és tetraantennás struktúrákkal, különböző mértékű szialilezéssel.

A 3A. táblázatban összefoglaljuk azokat a KGFkoncentrációkat, amik a [³H]-timidinnek a keratinocitákba való beépülését fél-maximális sebességgel serkentik, Rubin és munkatársai módszerét alkalmazva [Rubin és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 802-806 (1989)]. Vizsgáltuk a KGF-receptorral való kölcsönhatást, Balb/MK epidermális keratinocitákból izolált KGF-receptor membránkészítménnyel, Massague eljárását alkalmazva [Massague: Journal of Biological Chemistry 258, 13 614-13 620 (1983)]. Specifikus módon a KGF különböző formáit 50 mmol/l TRISZ-HCI-lel (pH=7,5) hígítjuk, ami 0,2% szarvasmarha-szérumalbumint tartalmaz, és a KGF koncentrációja 0,8 ng/50 μΙ és 100 ng/50 μΙ között változik. Ezeket egyenként inkubáljuk a membránkészítménnyel (75 ng/ml), valamint 1,5 ng ¹²⁵l-jelzett Escherichia co//-eredetű KGF-fel. A receptorkötési és kompetíciós kísérleteket 4 °C-on végezzük 16 óra hosszat, azután a mintákat centrifugáljuk, kétszer mossuk az előzőkben említett hígítópufferrel, hogy eltávolítsuk a megkötetlen és nemspecifikusan kötött, jelzett KGF-et. Megmérjük a minták megmaradt radioaktivitását. A KGF-minták és a jelzett KGF receptorkötési kompetíciós görbéit úgy határozzuk meg, hogy a nem-kompetíció százalékát ábrázoljuk az egyes KGF-minták koncentrációjával szemben. A 3B. ábrán azt a KGF-koncentrációt határozzuk meg, amivel 60%-os nem-kompetíciót lehet elérni a jelzett Escherichia coli eredetű KGF-fel szemben, ng/ml-ben kifejezve.

3A. táblázat

KGF-koncentráció a [³H]-timidin keratinocitákba félmaximális sebességgel való beépülésének serkentésére

Formák	ng/ml
Escherichia coli KGF	10
KGF-a	30
KGF-b	30

3B. táblázat

KGF-koncentráció a ¹²⁵l-jelzett KGF-fel való receptorkötés 60%-os nem-kompetíciós sebességgel való kompetíciójánál

Formák	ng/ml
Escherichia coli KGF	65,8
KGF-a	93,5
KGF-b	89,1

HU 226 168 Β1

Amint az a 3A. táblázatból látható, a KGF-a és a KGF-b összehasonlítható mértékben serkenti a [^-beépülést, a fél-maximális sebességet mindegyik analóg körülbelül 30 ng/ml koncentrációnál serkenti. Tehát a csonkítás nem csökkenti a molekula biológiai aktivitását. A két analógnak azonban körülbelül háromszor kisebb az aktivitása mint az Escherichia coli eredetű, teljes hosszúságú KGF-nek. Amint az a 3B. táblázatból látható, a radioaktív esszé nem-kompetíciós kísérlet azt mutatja, hogy az Escherichia coli eredetű KGF, a KGF-a és a KGF-b hasonló receptorkötési aktivitással rendelkezik.

4. példa

Az Escherichia co//-ban és emlössejttenyészetekben előállított KGF polipeptidek in vivő biológiai vizsgálata A KGF-nek egyetlen szubkután dózisáról kimutatták, hogy egerekben 24 órán belül a szérum-koleszterinszint dózisfüggő emelkedését okozza. A természetes KGF-nek, a KGF-a-nak, a C(1,15)S-nek, a ΔΝ15nek és AN23-nak is kiértékeltük azt a képességét, hogy mennyire képes dózisfüggő módon emelni a szérum koleszterinszintjét.

Mindegyik kezelési csoportban öt nőstény Balb/c egér van (18-20 g, a CRL-től beszerezve). A fehérjét 0,9% sóoldattal hígítjuk, hogy a 100 μΙ/egér végső injekciótérfogatot elérjük. Mindegyik egérnek egyetlen szubkután injekciót adunk be, az alábbi dózisokban.

Csoport	Kezelés	Dózis (mg/kg)
1	Természetes KGF	0,1
	Természetes KGF	0,25
	Természetes KGF	0,5
	Természetes KGF	1
	Természetes KGF	5
2	C(1,15)S	0,1
	C(1,15)S	0,25
	C(1,15)S	0,5
	C(1,15)S	1
	C(1,15)S	5
3	ΔΝ15	0,25
	ΔΝ15	0,5
	ΔΝ15	1
	ΔΝ15	5
4	ΔΝ23	0,1
	ΔΝ23	0,5
	ΔΝ23	1
	ΔΝ23	5
5	KGF-a	0,01
	KGF-a	0,05
	KGF-a	0,1
	KGF-a	0,5
6	Sóoldatkontroll	-

Az injekciózás után 24 órával az egereket leöltük, és szívpunkcióval kivéreztettük. A vérmintákat feldolgoztuk a szérum-koleszterinszint meghatározására.

Amint az a 35. ábrán látható, mindegyik KGF-analógról kiderült, hogy dózisfüggő módon megemeli a szérum koleszterinszintjét. Emellett nem volt látható különbség egyik vizsgált KGF-analóg biológiai aktivitása között sem.

A cukorbetegség in vivő modellje

Az egyes állatfajokban kémiailag indukált cukorbetegség-modelleket klasszikus módon használták a betegség és kezelésének tanulmányozására. A sztreptozotocln cukorbetegséget indukál egérben, patkányban, hörcsögben, kutyában és majomban, jóllehet a vizsgálatokban leginkább patkányokat és egereket használnak [Junod és munkatársai: Proc. Soc. Exp. Pio. Med. 126, 210-205 (1967); Rerup: Pharm. Rév. 22,485-518 (1970); Rossini és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 74, 2485-2489 (1977); Ar'Rajab és Ahren: Pancreas 8, 50-57 (1993)]. A patkányokban a sztreptozotocin 45-70 mg/kg dózisban, egyetlen intravénás injekcióval stabil betegséget indukál. A 45 mg/kg alatti dózis tranziens kóros állapotot indukál, ami visszafordítható. A sztreptozotocin injekció után egy nappal indukálódik a hiperglikémlás állapot. A vér inzulinszintje a normális patkányokkal összehasonlítva lényegében változatlan; azonban a hasnyálmirigyben az inzulin és a C-peptid össztartalma jelentősen lecsökken. A patkányokban megjelennek a cukorbetegségnek az emberekre jellemző klasszikus tünetei: megnőtt vércukorszint (hiperglikémia), glükóz a vizeletben (glükozúria), megnőtt szomjúság (polidipszia), fokozott vizelés (poliuria) és megnőtt étvágy (hiperfágia).

Az ebben a leírásban ismertetett vizsgálatokat Sprague-DawIey-patkányokban sztreptozotocinnal indukált cukorbetegség-modellen végeztük. A hím patkányok súlya 200-260 g volt a vizsgálat kezdetekor. A cukorbetegséget egyetlen intravénás sztreptozoticin injekcióval (50 mg sztreptozotocin nátrium-citrát-pufferben, testsúlykilogrammra számítva) indukáljuk. A nem cukorbeteg kontrollpatkányok egyetlen intravénás nátrium-citrát-puffer injekciót kapnak kontrolicélokra. A KGF-et naponta adjuk be szubkután injekció formájában. A KGF dózis 3-5 mg/kg/nap, a kísérlettől függően. Az első kísérletben a KGF-terápiát két nappal a cukorbetegség indukálása előtt indukáljuk, és a cukorbetegség indukciója után összesen nyolc injekciót adunk be. A második és harmadik kísérletben a szubkután KGF-terápiát egy nappal a cukorbetegség sztreptozotocinnal való indukciója után kezdjük. A negyedik kísérletben a KGF hétnapos terápiáját hét nappal a sztreptozotocinkísérlet megkezdése után indítjuk, és az állatok állapotát még 12 hétig követjük. Mindegyik kísérletben, a negyedik kísérlet kivételével, a vér glükózszintjét, a vizelet glükózszintjét és a vizelet mennyiségét használjuk az elemzés végpontjaként. Emellett néhány kísérletben a vízfelvételt, a vizelet C-peptid-szintjét vagy a hasnyálmirigy összes inzulinés C-peptid-tartalmát is mérjük. A negyedik kísérletben

HU 226 168 Β1 az egyetlen követett végpont a vér glükózszintje. Mivel a keringésből az inzulin nagy részét a máj eltávolítja, ezért a perifériális inzulinkoncentráció mérése inkább poszthepatikus metabolizmus eseményeket tükröz mint az inzulinnak a hasnyálmirigyből való szekrécióját. Ezért gyakran a C-peptid mérését használják az inzulinszekréció perifériális markereként. A C-peptid a proinzulinnak inzulinná való átalakulásakor keletkezik. Az inzulin és a C-peptid ekvimoláris mennyiségben szekretálódik a béta-sejtekből, és a máj a C-peptidnek csak kis mennyiségét vonja ki.

Ezzel a vizsgálattal az rKGF-nek Sprague-Dawleypatkányokban indukált cukorbetegségre gyakorolt hatását vizsgáljuk. A 0. napon a patkánycsoportoknak 45 vagy 50 mg/kg sztreptozotocint (STZ) adunk be. Ezeket a kezeléseket követően naponta követjük a nem-éheztetett vérglükózszintet, hogy megbecsüljük a szigetsejtek sérülésének mértékét. Az 5. napon az STZ-vel kezelt állatokat két csoportra osztjuk (20/csoport), a hiperglikémia nagyságrendje alapján. A szétválasztás szintje 300 mg/dm³ vérglükózszintre van állítva. Az STZ-vel nem kezelt állatok szolgálnak kontrollként. A 7. napon az egyes hiperglikémiás csoportból 10 állatnak 7 napig AN23-at adunk (3 mg/kg/nap), vagy PBS-t, szubkután injekció formájában. A vér glükózszintjét naponta, minden második nap vagy hetente követjük, és az 50. ábrán mutatjuk be. Meg kell jegyeznünk, hogy mindkét ÁN23-at kapó csoportban az STZvel kezelt állatoknak jelentősen csökkent a vérglükózszintje a dozírozás periódusában. Lényeges, hogy a <300 mg/dm³ kiindulási glükózszintű csoportban az STZ-vel kezelt állatoknál az átlagos glükózszintcsökkenés körülbelül 150 mg/dm³-nél stabilizálódott, míg a >300 mg/dm³ kiindulási glükózszintű csoportban megfigyelt vérglükózszint-csökkenés csak átmeneti volt. Meg kell még jegyeznünk, hogy a napokban megadott időskála nem lineáris.

Jóllehet a jelen találmányt az előzőkben mind általánosan, mind az előnyös megvalósítási módok szerint ismertettük, az nyilvánvaló, hogy más variációk és módosítások is nyilvánvalóak a szakterületen jártas szakember számára, az előzőekben ismertetettek fényében.

Claims (50)

1. A természetes keratinocita növekedési faktor egy analógja, ahol is az analóg a KGF aminosavszekvenciáját tartalmazza, a 2. számú szekvencia 32-55-ös aminosavai közül egy vagy több ki van vágva, vagy egy másik aminosawal van helyettesítve, és/vagy az említett aminosavak közé egy vagy több további aminosav van beillesztve, ahol is a 2. számú szekvencia 32-es pozíciójában levő ciszteincsoport, valamint a 2. számú szekvencia 46-os pozíciójában levő ciszteincsoport vagy ki van vágva, vagy egy másik aminosawal van helyettesítve, azzal a feltétellel, hogy nem a keratinocita növekedési faktor fehérje, amely a 2. számú szekvencia 55-194-es aminosavait tartalmazza.

2. Az 1. igénypont szerinti analóg, amelyből a 2. számú szekvencia 32-es pozíciójában levő ciszteincsoportot és a 2. számú szekvencia 46-os pozíciójában levő ciszteincsoportokat kivágtuk.

3. Az 1. igénypont szerinti analóg, amelyből a 2. számú szekvencia 32-55-ös aminosavait kivágtuk.

4. Az 1. igénypont szerinti analóg, amelyből a 2. számú szekvencia 32-es pozíciójában levő ciszteincsoportot kivágtuk, a 2. számú szekvencia 46-os pozíciójában levő ciszteincsoportot pedig egy másik aminosawal helyettesítettük.

5. Az 1. igénypont szerinti analóg, amelyből az első tizennégy N-terminális aminosavat kivágtuk, és a 2. számú szekvencia 46-os aminosavpozíciójában levő ciszteincsoportot egy másikkal helyettesítettük.

6. Az 1. igénypont szerinti analóg, amelyben a 2. számú szekvencia 32-es pozíciójában levő ciszteincsoportot és a 2. számú szekvencia 46-os pozíciójában levő ciszteincsoportot egy másik aminosawal helyettesítettük.

7. A 4., 5. vagy 6. igénypont szerinti analóg, amelyben a ciszteint vagy alaninnal, vagy leucinnal, vagy szerinnel helyettesítettük.

8. A 7. igénypont szerinti analóg, amelyben a ciszteint szerinnel helyettesítettük.

9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti analóg, amely tartalmaz még egy töltésváltoztató helyettesítést, egy olyan aminosavpozícióban, amely pozíciót az alábbiak közül választhatjuk ki: arginincsoport a 2. számú szekvencia 74-es aminosavpozíciójában, lizincsoport a 2. számú szekvencia 86-os aminosavpozíciójában, lizincsoport a 2. számú szekvencia 126-os aminosavpozíciójában, aszparagincsoport a 2. számú szekvencia 168-as aminosavpozíciójában, glutaminsavcsoport a 2. számú szekvencia 169-es aminosavpozíciójában, lizincsoport a 2. számú szekvencia 170-es aminosavpozíciójában, arginincsoport a 2. számú szekvencia 175-ös aminosavpozíciójában, lizincsoport a 2. számú szekvencia 178-as aminosavpozíciójában, lizincsoport a 2. számú szekvencia 184-es aminosavpozíciójában, vagy a treonincsoport a 2. számú szekvencia 185-ös aminosavpozíciójában.

10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti analóg, amelyben az eddigiek mellett a 2. számú szekvencia Asn¹⁴⁶-Thr¹⁵⁰-es, hurkot képező szekvenciájában legalább egy aminosavat egy másik, jobb hurokképző tulajdonságokkal rendelkező aminosawal helyettesítünk.

11. A 9-10. igénypontok bármelyike szerinti analóg, amiből a 2. számú szekvencia 32-54-es aminosavait kivágtuk.

12. Az 1. igénypont szerinti analóg, ahol is az analóg a C(1,15)S (amely megfelel a 32. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); C(1,15,40)S (amely megfelel a 78. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); C(1,15,102)S; (amely megfelel a 80. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); C(1,15,102,106)S (amely megfelel a 82. számú szek21

HU 226 168 Β1 venciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); ΔΝ15 (amely megfelel a 42. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); ΔΝ16 (amely megfelel a 44. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); ΔΝ17 (amely megfelel a 46. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); ΔΝ18 (amely megfelel a 48. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); ΔΝ19 (amely megfelel az 50. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); ΔΝ20 (amely megfelel az 52. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); ΔΝ21 (amely megfelel az 54. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); ΔΝ22 (amely megfelel az 56. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); ΔΝ24 (amely megfelel a 60. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); AN3/C(15)S (amely megfelel a 34. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); AN3/C(15)- (amely megfelel a 36. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); AN8/C(15)S (amely megfelel a 38. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); ΔΝ8/Ό(15)- (amely megfelel a 40. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); C(1,15)S/R(144)E (amely megfelel a 62. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); C(1,15)S/R(144)Q (amely megfelel a 64. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, es jelenléte opcionális); AN23/H(116)G (amely megfelel a 2. számú szekvencia 54-192-es aminosavainak), és a 147-es aminosavpozicióban levő hisztidint glicinnel helyettesítettük; ΔΝ23/Ν(137)Ε (amely megfelel a 84. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); ΔΝ23/Κ(139)Ε (amely megfelel a 86. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); ΔΝ23/Κ(139)Ο (amely megfelel a 88. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); ΔΝ23/Κ(144)Α (amely megfelel a 90. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); AN23/R(144)E (amely megfelel a 92. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); AN23/R(144)L (amely megfelel a 86. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális);

ΔΝ23/Κ(147)Ε (amely megfelel a 96. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); AN23/K(147)Q (amely megfelel a 98. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); ΔΝ23/Ν(153)Ε (amely megfelel a 100. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); ΔΝ23/ΝΚ(153)Ο (amely megfelel a 102. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); ΔΝ23/Ο(152)Ε/Κ(153)Ε (amely megfelel a 86. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális); vagy AN23/R(144)Q (amely megfelel a 66. számú szekvenciának, amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális).

13. A 12. igénypont szerinti analóg, amelyben az említett analóg a ΔΝ16 (amely megfelel a 44. számú szekvenciának, és amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális).

14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti analóg, amelyben az említett analóg szignálszekvenciával vagy egy N-terminális metionincsoporttal rendelkezik.

15. A 14. igénypont szerinti analóg, ahol is az említett szignálszekvencia a 2. számú szekvencia 1-31-es aminosavaiból áll.

16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti analóg, ahol is az említett analóg kovalens kötéssel kapcsolódik egy kémiai csoporthoz.

17. A 16. igénypont szerinti analóg, amelyben az említett kémiai csoport polietilénglikol.

18. A természetes keratinocita növekedési faktor egy analógja (amely megfelel a 2. számú szekvencia 32-194-es aminosavainak, szignálszekvenciával vagy anélkül), ezt „KGF”-nek nevezzük, ahol is az említett analóg a ΔΝ23 (amely megfelel az 58. számú szekvenciának, és amelyben a kezdő metionint „O-dik” csoportnak nevezzük, és jelenléte opcionális).

19. A 18. igénypont szerinti analóg, amelyben az említett kémiai csoport polietilénglikol.

20. Az 1-19. igénypontok bármelyike szerinti analóg, ahol is az említett analóg liofilezve van.

21. Gyógyászati készítmény, amely terápiásán hatásos mennyiséget tartalmaz az 1-20. igénypontok bármelyike szerinti KGF-analógból, valamint tartalmaz egy gyógyászatilag elfogadható hordozót.

22. Rekombináns nukleinsavmolekula, amely az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti analógot kódol.

23. Biológiailag működőképes vektor, amely a 22. igénypont szerinti nukleinsavmolekulát tartalmaz.

24. Egy prokarióta vagy eukarióta gazdasejt, amely egy, a 22. igénypont szerinti nukleinsavmolekulát, vagy a 23. igénypont szerinti, biológiailag működőképes vektort tartalmaz.

25. A 24. igénypont szerinti prokarióta gazdasejt, amely Escherichia coli.

26. A 24. igénypont szerinti eukarióta gazdasejt, amely egy emlőssejt, előnyösen egy aranyhörcsög petefészek sejt.

HU 226 168 Β1

27. Eljárás egy KGF-analóg előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 24-26. igénypontok bármelyike szerinti eukarióta vagy prokarióta gazdasejtet megfelelő körülmények között szaporítunk, oly módon, hogy a kódolt analóg expresszálódjon, majd izoláljuk az így előállított analógot.

28. Az 1-20. igénypontok bármelyike szerinti KGFanalóg hatásos mennyiségének alkalmazása egy olyan gyógyszerkészítmény előállítására, amivel serkenteni lehet a nem-fibroblaszt epiteliális sejteket.

29. A 28. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az említett nem-fibroblaszt epiteliális sejteket az alábbiak közül választjuk ki: adnexális struktúrák, hasnyálmirigysejtek, májsejtek, nyálkahártya-epitélium a légzési vagy emésztési rendszerben, szemlencsesejtek, dob epiteliális sejtek.

30. Az 1-20. igénypontok bármelyike szerinti KGFanalóg hatásos mennyiségének alkalmazása egy olyan gyógyszerkészítmény előállítására, amivel egy betegben a nem-fibroblaszt epiteliális sejtek termelését lehet serkenteni egy adott állapot megelőzésére vagy kezelésére, amely állapotot az alábbiak közül választhatjuk ki: égési sérülések vagy egyéb, teljes mélységű sérülések; az epidermolysis bullosa; a kemoterápia által indukált szőrhullás megelőzése és férfias típusú kopaszság, vagy a haj progresszív elvesztése férfiakban és nőkben; gyomor- és nyombélfekélyek; gyulladásos bélbetegségek, azaz például a Crohn-féle betegség (amely elsődlegesen a vékonybelet érinti) és a fekélyes kolitisz (amely elsődlegesen a vastagbelet érinti); a béltoxicitás megakadályozása vagy csökkentése sugárzásos vagy kemoterápiás kezelések során; hialinmembrán-betegség; akut vagy krónikus tüdőkárosodás; májcirrózis; heves májkárosodás; akut vírusos hepatitisz, a máj toxikus sérülése; szaruhártya-sérülés; progresszív „gum” betegség; dobhártya-károsodás vagy cukorbetegség.

31. Kit, amely az 1-20. igénypontok bármelyike szerinti KGF-analógot vagy a 21. igénypont szerinti gyógyászati készítményt tartalmazza.

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

1A. ábra humán KGF (+ szignálszekvencia) |—OLIGO#25-----1 |-------OLIGOfl---------1

5'-CAATCTACAATTCACAGA-3’ 5'-CAATGACCTAGGAGTAACAATCAAC-3'

5' -CAATCTACAATTCACAGATAGGAAGAGGTCAATGACCTAGGAGTAACAATCAACTCAAGA---------+---------₊---------+---------+---------+---------₊ 5Q

-TTCATTTTCATTATGTTATTCATGAACACCCGGAGCACTACACTATAATGCACAAATGGA—------+.........+---------+---------+---------+---------+ 120

Μ Η K W I

-TACTGACATGGATCCTGCCAACTTTGCTCTACAGATCATGCTTTCACATTATCTGTCTAG---------+---------+---------₊---------+---------+---------+ 180

LTWILPTLLYRSCFHIICLV

-TGGGTACTATATCTTTAGCTTGCAATGACATGACTCCAGAGCAAATGGCTACAAATGTGA---------+---------+---------₊---------+---------+---------+ 240

GTISLACNDMTPEQMATNVN

-ACTGTTCCAGCCCTGAGCGACACACAAGAAGTTATGATTACATGGAAGGAGGGGATATAA---------+---------+---------₊---------+---------+---------+ 300

CSSPERHTRSYDYMEGGDIR

-GAGTGAGAAGACTCTTCTGTCGAACACAGTGGTACCTGAGGATCGATAAAAGAGGCAAAG---------+---------+---------₊---------+---------+---------+ 360

VRRLFCRTQWYLRIDKRGKV

-TAAAAGGGACCCAAGAGATGAAGAATAATTACAATATCATGGAAATCAGGACAGTGGCAG---------+---------+---------₊---------+---------+---------₊ 420

KGTQEMKNNYNIMEIRTVAV

-TTGGAATTGTGGCAATCAAAGGGGTGGAAAGTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAG---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480

GIVAIKGVESEFYLAMNKEG

-GAAAACTCTATGCAAAGAAAGAATGCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGG---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540

KLYAKKECNEDCNFKELILE

-AAAACCATTACAACACATATGCATCAGCTAAATGGACACACAACGGAGGGGAAATGTTTG—------+---------+---------+---------+---------+—-—--+ 600

NHYNTYASAKWTHNGGEMFV

-TTGCCTTAAATCAAAAGGGGATTCCTGTAAGAGGAAAAAAAACGAAGAAAGAACAAAAAA---------+---------+---------+---------₊---------+---------₊ 660

ALNQKGIPVRGKKTKKEQKT

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

1B. ábra

CAGCCCACTTTCTTCCTATGGCAATAACTTAATTGCATATGGTATATAAAGAACCCAGTT ---------₊---------₊---------+---------₊---------+---------+ 720

AHFLPMAIT*

3’-GGATACCGTTATTGAATT-5' |——OLIGO#26----1

CCAGCAGGGAGATTTCTTTAAGTGGACTGTTTTCTTTCTTCTCAAAATTTTCTTTCCTTT ---------₊---------+---------₊---------+---------+---------+ γόο

TAITrTTTAGTAATCAAGAAAGGCTGGAAAAACTACTGAAAAACTGATCAAGCTGGACTT ---------+---------+---------+---------₊---------+---------+ 840

3'-ACCTGAAGTGCATTTATGTTTGTTTTAAG-3'

........-+---------+- 862

CACGTAAATACAAACAAAA-5’ —OLIGO#2........1

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

2A. ábra

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

2B. ábra

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

2C. ábra

BstEir

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

3A. ábra

RSH-KGF plazmid DNS Clal Xbal Ndel szekvencia 5'-ATCGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGAAAAAG- 40 Μ K K

RSH szignálszekvencia Miül

-CX3CGCACGTGCTATCGCCATTGCTGTGGCTCTGGCAGGTTTCGCAACTAGTGCACA-3' RARAIAIAVALAGFATSAHA-96

Miül

5' -CGCGTGCAATGACATGACTCCAGAGCAAATGGCTACAAATGTGAACTGTTCCAGCCCTGA---------+---------+---------+---------₊---------+---------+ 156

-CNDMTPEQMATNVNCSSPE

-GCGACACACAAGAAGTTATGATTACATGGAAGGAGGGGATATAAGAGTGAGAAGACTCTT---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 216

RHTRSYDYMEGGDIRVRRLF

KpnI Clal

-CTGTCGAACACAGTGGTACCTGAGGATCGATAAAAGÁGGCAAAGTAAAAGGGACCCAAGA---------+---------+---------₊---------+---------+---------+ 276

CRTQWYLRIDKRGKVKGTQE

-GATGAAGAATAATTACAATATCATGGAAATCAGGACAGTGGCAGTTGGAATTGTGGCAAT---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 336

MKNNYNIMEIRTVAVGIVAI

ECORI

-CAAAGGGGTGGAAAGTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAGGAAAACTCTATGCAAA---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 396

KGVESEFYLAMNKEGKLYAK

Bsml

-GAAAGAATGCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGGAAAACCATTACAACAC---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 456

KECNEDCNFKELILENHYNT

Ndel

-ATATGCATCAGCTAAATGGACACACAACGGAGGGGAAATGTTTGTTGCCTTAAATCAAAA---------+---------+---------+_.....___+......—+___....._+ 516

YASAKWTHNGGEMFVALNQK

-GGGGATTCCTGTAAGAGGAAAAAAAACGAAGAAAGAACAAAAAACAGCCCACTTTCTTCC---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 576

GIPVRGKKTKKBQKTAHFLP

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

3B. ábra

BamHI

TATGGCAATAACTTAATAG-3'

.........+.........+— 595

MAIT**

-plazmid DNS -szekvencia

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

4. ábra

Ndel

5' ~TATGTGCAATGACATGACTCCAGAGCAAATGGCTACAAATGTGAACTGTTCCAGCCCTGA---------+---------₊---------₊---------+---------+---------+ go

MCNDMTPEQMATNVNCSSPE

-GCGACACACAAGAAGTTATGATTACATGGAAGGAGGGGATATAAGAGTGAGAAGACTCTT---------+---------₊---------₊---------+---------+---------+ 120

RHTRSYDYMEGGDIRVRRLF

KpnI Clal

-CTGTCGAACACAGTGGTACCTGAGGATCGATAAAAGAGGCAAAGTAAAAGGGACCCAAGA---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180

CRTQWYLRIDKRGKVKGTQE

-GATGAAGAATAATTACAATATCATGGAAATCAGGACAGTGGCAGTTGGAAITGTGGCAAT---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240

MKNNYNIMEIRTVAVGIVAI

EcoRI

-CAAAGGGGTGGAAAGTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAGGAAAACTCTATGCAAA---------+---------+---------₊---------+---------+---------+ 300

KGVESEFYLAMNKEGKLYAK

BsmI

-GAAAGAATGCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGGAAAACCATTACAACAC---------+---------₊---------+---------+---------+---------+ 360

KECNEDCNFKELILENHYNT

Ndel

-ATATGCATCAGCTAAATGGACACACAACGGAGGGGAAATGTTTGTTGCCTTAAATCAAAA*---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420

YASAKWTHNGGEMFVALNQK

-GGGGA1TCCTGTAAGAGGAAAAAAAACGAAGAAAGAACAAAAAACAGCCCACTTTCTFCC---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480

GIPVRGKKTKKEQKTAHFLP

BamHI

-TATGGCAATAACTTAATAG-3'

---------+.........₄— 503

MAIT*

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

5. ábra

A KpnI szekvencia helyettesítése EcoRI szekvenciával, a KGF(dsd) előállítására

KpnI | —.........OLIGOI6-----------------11------OLIGOI7--------5¹ -CTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAAT3' -CATGGACGCATAGCTGTTTGCGCCGTTTCAGTTCCCGTGGGTTCTCTACTTTTTGTTGATGTTA|...............OLIGO#9---------------------11 — OLIGOIIO........

-LRIDKRGKVKGTOEMKNNYNEcoRI — ------------------1|---------OLIGOÍ8-------------------1

5' -ATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTG-3'

3 ’ -TAATACCTTTAGGCATGACAACGACAACCATAGCAACGTTAGTTTCCACAACTTAGACTTAA-5'

- ........................||----OLIGOtll......................|

IMEIRTVAVGIVAIKGVESE32

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

6. ábra

KGF (kodon optimalizált)

Xbal

----OLIGOI12-----1

AGTTTTGATCTAGAAGGAGG-3

.........-.......-.......-OLIGO#14------------------------5' -AGTTTTGATCTAGAAGGAGGAATAACATATGTGCAACGACATGACTCCGGAACAGATGGCT

-----------------------------Π—...........OLIGO#15-.......

-ACCAACGTTAACTGCTCCAGCCCGGAACGTCACACCCGTAGCTACGACTACATGGAAGGTG

3'-GGGCCTTGCAGTGTGGGCAT-5' |-----OLIGO#20-----1

......................OLIGOÍ15......-...........-.........||-GTGACATCCGTGTTCGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACG 3'-ATAGCTGTTTGC

I-OLIGOI21—

.........-.....-......OLIGO#16—............................

-TGGTAAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGAAAAACAACTACAACATCATGGAAATCCGTACT

-ACCATTTC-5'

--------------------------1|.............ÖLI GO# 17............

-GTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACA 3’-ACGTTAGTTTCCACAACTTA-5' |-----OLIGO#22-----1

------------------ÖLIGO#17.............................1|----AAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGAT 3’-GAAGTTTCTTGACTA |—OLIGOÍ23—

----------------------OLIGOI18-------------------------------CCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATG

-GGACC-5' —---------------------||.......-...........OLIGO#19---------TTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGA

3'-GGTCTTTCCATAGGGCCAAG-5'

OLIGO#24

-------0LIG0I19----------------------4-í----------1

-AAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTA|tAÖÖÁTCCAGTTTTGA-3'

3' -AATTAT&TAGGTCAAAACT-5 ’ |-—OÜGO#13------1

BamHI

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

7. ábra

KGF C(1,15)S

5' -ATGTCTAATGATATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTCCTCCTCCCCGGAA---------+---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ βθ

MSNDMTPEQMATNVNSSSPE

-CGTCACACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTC---------+---------₊---------+---------+---------+---------+ 120

RHTRSYDYMEGGDIRVRRLF

-TGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAG---------+---------+---------+---------+---------₊---------+ igo

CRTQWYLRIDKRGKVKGTQE

-ATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATC---------+---------₊---------+---------₊---------+---------+ 240

MKNNYNIMEIRTVAVGIVAI

-AAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAA---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300

KGVESEFYLiAMNKEGKLYAK

-AAAGAATGCAACGAAGACTOCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACC---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 35Q

KECNEDCNFKELILENHYNT

-TACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGCTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAA---------+---------+---------+---------+---------₊---------+ 420

YASAKWTHNGGEMFVALNQK

-GGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCG---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480

GIPVRGKKTKKEQKTAHFLP

-ATGGCAATCACTTAA-3'

---------+-----495

MAIT*

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

8. ábra

KGF AN3/C915)S

5' -ATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTCCTCCTCCCCGGAACGTCACACGCGT---------+---------+---------+---------+---------₊---------₊ go

MTPEQMATNVNSSSPERHTR

-TCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAG---------+---------+---------+---------+---------₊---------₊ 120

SYDYMEGGDIRVRRLFCRTQ

-TGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAAC---------₊---------♦---------₊---------₊---------+---------₊ 180

WYLRIDKRGKVKGTQEMKNN

-TACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAA---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240

YNIMEIRTVAVGIVAIKGVE

-TCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAAC---------+---------+---------₊---------+---------+---------+ 3Q0

SEFYLAMNKEGKLYAKKECN

-GAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCT---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360

EDCNFKELILENHYNTYASA

-AAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCOGGTT---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420

KWTHNGGEMFVALNQKGI PV

-CGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACT---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480

RGKKTKKEQKTAHFLPMAIT

-TAA-3' — 483 *

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

9. ábra

KGF AN3/C(15)---------₊---------+---------₊---------₊---------₊---------+ gQ

MTPEQMATNVNSSPERHTRS

-TACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGG---------+---------₊---------+---------₊---------+---------₊ i20

YDYMEGGDIRVRRLFCRTQW

-TACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTAC---------+---------+---------+---------₊--------->---------₊ i3Q

YLRIDKRGKVKGTQEMKNNY

-AATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCT---------+---------+---------₊---------+---------+---------₊ 240

NIMEIRTVAVGIVAIKGVES

-GAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAA---------+---------+---------₊---------₊---------₊---------₊ 3QQ

EFYLAMNKEGKLYAKKECNE

-GACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAA---------+---------+---------₊---------₊---------₊---------₊ 360

DCNFKELILENHYNTYASAK

-tcgacccacaacggtggtcaaatgttcgttgctctgaaccagaaaggtatcccggttcgt---------₊---------₊---------₊---------+---------₊---------+ 420

WTHNGGEMFVALNQKGIPVR

-GGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAA-3'

---------+---------+---------₊---------₊---------₊---------₊ 430

GKKTKKEQKTAHFLPMAIT*

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

10. ábra

KGF ŰN8/C(15)S

5 ’ -ATGGCTACTAATGTTAACTCCTCTTCTCCTGAACGTCATACGCGTTCCTACGACTACATG---------+---------+---------+---------+---------+---------+ go

MATNVNSSSPERHTRSYDYM

-GAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATC---------+---------4.---------+---------+---------+---------+ 120

EGGDIRVRRLFCRTQWYLRI

-GACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAA---------+---------4.---------+---------+---------+---------+ 180

DKRGKVKGTQEMKNNYNIME

-ATCCGTACTGTTGCTKnTCGTATCGTIXXAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTG---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240

IRTVAVGIVAIKGVESEFYL ’GCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTC--------+---------+---—-—+-------—+—-———-+--——---+ 300

AMNKEGKLY'AKKECNEDCNF

-AAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAAC---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 350

KELILENHYNTYASAKWTHN

-GGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACC--------_+---------+_____-_—+_——+ 420

GGEMFVALNQKGIPVRGKKT

-AAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAA-3'

---------+---------+---------+---------+-----— 458

KKEQKTAHFLPMAIT*

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

11. ábra

KGF 4N8/C155 ’ -ATGGCTACTAATGTTAACTCTTCTCCTGAACGTCATACGCGTTCCTACGACTACATGGAA---------4---------+---------₊---------₊---------₊---------+ βθ

MATNVNSSPERHTRSYDYME

-GGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGAC---------4---------+---------+---------₊---------4---------₄ 120

GGDIRVRRLFCRTQWYLRID

-AAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATC---------4---------4---------4---------4---------4---------4 180

KRGKVKGTQEMKNNYNIMEI

-CCTACTGTTGCPGlTOGTATOíTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCA---------+---------₊---------+---------₊---------+---------₊ 240

RTVAVGIVAIKGVESEFYLA

-ATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAA---------+---------4---------4---------4---------4---------4 300

MNKEGKLYAKKECNEDCNFK

-GAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGT---------4---------4---------4---------4---------4---------+ 360

ELILENHYNTYASAKWTHNG

-GGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAA---------4---------4---------4---------4---------4---------4 420

GEMFVALNQKGIPVRGKKTK

-AAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAA-3'

---------4---------4---------4---------4-----465

KEQKTAHPLPMAIT*

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

12. ábra

KGF ΔΝ15

5-ATGTCTTCTCCTGAACGTCATACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGC---------+---------+---------+---------+---------₊---------+ go

MSSPERHTRSYDYMEGGDIR

-GTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAWjTC---------+---------+---------+---------₊---------+---------+ 120

VRRLFCRTQWYLRIDKRGKV

-AAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTT---------₊---------+---------+---------₊---------+---------+ 130

KGTQEMKNNYNIMEIRTVAV

-GGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGT---------+---------+---------₊---------+---------+---------+ 240

GIVAIKGVESEFYLAMNKEG

-AAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAA---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300

KLYAKKECNEDCNFKELILE

-AACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTT---------+---------4---------+---------+---------+---------+ 350

NHYNTYASAKWTHNGGEMFV

-GCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACC---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420

ALNQKGIPVRGKKTKKEQKT

-GCTCACTTCCTGCCGAlGGCAATCACTTAA-3'

---------+.........₊---------+ 450

AHFLPMAIT*

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

13. ábra

KGF ΔΝ16

5' -ATGTCTCCTGAACGTCATACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTA---------+---------+---------+---------+---------+---------+ go

MSPERHTRSYDYMEGGDIRV

-CGTCGTCTGTTCTCCCXnACCCAGTGGTACX?rGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAG---------+---------₊---------+---------+---------+---------+ 120

RRLFCRTQWYLRIDKRGKVK

-GGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGT---------+---------+---------₊---------+---------+---------+ 180

GTQEMKNNYNIMEIRTVAVG

-ATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAA---------+---------+---------+---------₊---------+---------+ 240

IVAIKGVESEFYLAMNKEGK

-CTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAAC---------+---------+-----₇—+---------+---------+---------+ 300

LYAKKECNEDCNFKBLILEN

-CACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCT---------+---------+---------+---------+—-------+---------+ 360

HYNTYASAKWTHNGGBMFVA

-CTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCT---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420

LNQKGIPVRGKKTKKEQKTA

-CACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAA-3 ’

---------+.........+-------447

HFLPMAIT*

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

14. ábra

KGF ΔΝ17

5 ' -ATGCCTGAACGTCATACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGT---------+---------+---------+---------₊---------₊---------₊ gQ

MPERHTRSYDYMEGGDIRVR

-CGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGC---------+---------+---------₊---------₊---------₊---------₊ 120

RLFCRTQWYLRIDKRGKVKG

-ACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATC---------+---------₊---------+---------₊---------+---------₊ i30

TQEMKNNYNIMEIRTVAVGI

-GTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTG---------+---------+---------₊---------+---------+---------₊ 240

VAIKGVESEFYLAMNKEGKL

-TACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCAC---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 30Q

YAKKECNED C'N FKELILENH

-TACJU^CAfXTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTG---------+---------₊---------₊---------+---------₊---------₊ 350

YNTYASAKWTHNGGEMFVAL

-AACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCAC---------₊---------+---------+---------₊---------+---------₊ 420

NQKGIPVRGKKTKKEQKTAH

-TTCCTGCCGATGGCAATCACTTAA-3'

---------+-—-----4---- 444

FLPMAIT*

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

15. ábra

KGF ΔΝ18

5' -ATGGAACGTCATACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGT---------+---------+---------₊---------₊---------4---------₊ go

MERHTRSYDYMEGGDIRVRR

-CTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACC---------₊---------+---------4---------4---------4---------+ 120

LFCRTQWYLRIDKRGKVKGT

-CAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGFTGGTATCGTT---------4---------4---------4---------4---------4---------4 180

QEMKNNYNIMEIRTVAVGIV 'GCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTAC---------4.........4---------4---------4---------4---------4 240

AIKGVESEFYLAMNKEGKLY

-GCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTAC---------4---------4---------4---------₊---------4---------4 300

AKKECNEDCNFKELILENHY

-AACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAAC---------4---------4---------+---------4---------4---------4 3go

NTYASAKWTHNGGEMFVALN

-CAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTC---------4---------4---------4---------4---------4---------₊ 420

QKGIPVRGKKTKKEQKTAHP

-CTGCCGATGGCAATCACTTAA-3'

---------+---------+_ 44i

Ii P M A I T *

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

16. ábra

KGF ΔΝ19

5' -ATGCGTCATACGCGTTCCTACGACTAÍ^TGGAAQGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTG---------₊---------+---------+---------+---------+---------+ go

MRHTRSYDYMEGGDIRVRRL

-TTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAA---------+---------+---------+---------+---------₊---------+ 120

FCRTQWYLRIDKRGKVKGTQ

---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180

EMKNNYNIMEIRTVAVGIVA

-ATCAAAGGTGTTGAATCTCAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCA---------+---------+---------+---------₊---------♦---------+ 240

IKGVBSBFYLAMNKEGKLYA

-AAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAAC---------₊---------+---------+---------+---------+---------+ 300

KKECNEDCNFKELILENHYN

-ACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAG---------+---------+-----+---------+---------+---------+ 350

TYASAKWTHNGGEMFVALNQ

-AAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTG---------₊---------+---------+---------+---------+---------+ 420

KGIPVRGKKTKKEQKTAHFL

-CCGATGGCAATCACTTAA-3'

---------+--------438

P Μ A I T *

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

17. ábra

KGF ΔΝ20

5' -ATGCATACTCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTC---------+---------₊---------₊---------₊---------+---------₊ gQ

MHTRSYDYMEGGDIRVRRLF

-TGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAG---------+---------+---------₊---------₊---------₊---------+ i20

CRTQWYLRIDKRGKVKGTQE

-ATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATC---------+---------₊---------₊---------₊---------+---------₊ i3Q

MKNNYNIMEIRTVAVGIVAI

-AAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAA---------+---------+---------₊---------+---------+---------+ 240

KGVESEFYLAMNKEGKLYAK

-AAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTX»TCCTGGAAAACCACTACAACACC---------+---------₊---------₊---------₊---------+---------+ 300

KECNEDCNFKELILENHYNT

-TACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAA---------+---------₊---------+1--------₊---------+---------₊ 350

YASAKWTHNGGEMFVALNQK

-GGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCG---------+---------+---------₊---------₊---------+---------₊ 420

GIPVRGKKTKKEQKTAHFLP

-ATGGCAATCACTTAA-3'

---------+-----435

MAIT*

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

18. ábra

KGF ΔΝ21

5' -ATGACTCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGC---------+---------+---------₊---------+---------+---------₊ gQ

MTRSYDYMEGGDIRVRRLFC

-CGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATG---------₊---------+---------₊---------+---------₊---------+ i20

RTQWYLRIDKRGKVKGTQEM

-AAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAA---------+---------♦---------+---------+---------+---------+ 180

KNNYNIMEIRTVAVGIVAIK

-GGTGTTCAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAA---------+---------+---------₊---------+---------+---------+ 240

GVESEFYLAMNKE G K L Y A K K

-GAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTAC---------+---------+---------₊---------₊---------₊---------+ 3oo

ECNEDCNFKELILENHYNTY

-GCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGT---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3go

ASAKWTHNGGEMFVALNQKG

-ATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATG---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420

IPVRGKKTKKEQKTAHFLPM

-GCAATCACTTAA-3'

---------+„ 432

A I T *

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

19. ábra

KGF ΔΝ22

5' -ArcCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGT---------+---------+---------+---------+---------+---------₊ θο

MRSYDYMEGGDIRVRRLFCR

-ACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAA---------+---------+---------+---------₊---------+---------₊ 120

TQWYLRIDKRGKVKGTQEMK

-AAGAACTACAATATTATCGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGT---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180

NNYNIMEIRTVAVGIVAIKG

-GTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAA---------+---------+---------+-------·—+---------+---------+ 240

VESEFYLAMNKEGKLYAKKE

-TGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCA---------+---------₊---------+---------+---------₊---------₊ 300

CNEDCNFKELILENHYNTYA

-TCTGCTAAATGGACCCACAACGGTCGTGAAATGTTCGTTCXrrCTGAACCAGAAAGGTATC---------+---------+---------+---------+---------₊---------+ 35o

SAKWTHNGGEMFVALNQKGI

-CCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCA---------+---------+---------+---------+---------+---------₊ 420

PVRGKKTKKEQRTAHFLPMA

-ATCACTTAA-3'

........- 429

I T *

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

20. ábra

KGF ΔΝ23

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC---------+---------+---------₊---------₊---------+---------₊ go

MSYDYMBGGDIRVRRLFCRT

-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN

-AACTACAATA’nATOGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT---------+---------+---------+---------+---------+---------+ {go

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV

-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240

ESEFYLAHNKEGKLYA KKEC

-AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS

-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCG ---------+---------+---------₊---------₊---------+---------₊ 360

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP

-GTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC---------+---------+---------+.---------+---------₊---------₊ 420

VRGKKTKKEQKTAHFLPMAI

-ACTTAA-3’

------ 426

T *

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

21. ábra

KGF ΔΝ24

5' -ATGTACGACTACATCGAAGGTGGTGACATCCGCGTAÖ3TCGTCTGTTCTGCCCTACCCAG”

---------+---------₊---------+---------₊---------+---------₊ βθ

MYDYMEGGDIRVRRLFCRTQ

-TGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAAC---------+---------₊---------+---------+---------+---------+ i20

WYLRIDKRGKVKGTQEMKNN

-TACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAA---------+---------+---------₊---------+---------+---------+ i8o

YNIMEIRTVAVGIVAIKGVE

-TCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAAC---------+---------+---------₊---------₊---------₊---------+ 240

SEFYLAMNKEGKLYAKKECN

-GAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCT---------+---------+---------₊---------+---------+---------+ 300

EDCNFKELILENHYNTYASA

-AAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTT---------+---------+---------₊---------+---------+---------+ 350

KWTHNGGEMFVALNQKGIPV

-CGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACT---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420

RGKKTKKEQKTAHFLPMAIT

-TAA-3' — 423 *

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

22. ábra

C(1,15)S/R(144)E

5' -ATGTCTAATGATATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTCCTCCTCCCCGGAA---------+---------+.---------+---------₊---------₊---------+ 60

MSNDMTPEQMATNVNSSSPE

-CGTCACACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTC---------₊---------+---------+---------₊---------+---------+ 120

RHTRSYDYMEGGDIRVRRLF

-TGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAG---------+---------+---------+---------+------~~+---------+ 180

CRTQWYLRIDKRGKVKGTQE

-ATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATC---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240

MKNNYNIMEIRTVAVGIVAI

-AAAGGTGTTGAATCTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAGGAAAACTCTATGCAAAG---------+---------+---------₊---------₊---------₊---------+ 300

KGVESEFYLAMNKEGKLYAK

-AAAGAATGCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGGAAAACCATTACAACACA---------+---------+---------+---------+---------₊---------+ 360

KECNEDCNFKELILENHYNT

-TATGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAA---------+---------+---------₊---------+---------₊---------+ 420

YASAKWTHNGGEMFVALNQK

-GGTATCCCTGTTGAAGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCG---------+---------+---------₊---------₊---------₊---------+ 480

GIPVEGKKTKKEQKTAHFLP

-ATGGCAATCACTTAA-3'

---------+-----495

MAIT*

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

23. ábra

KGF C(1,15)S/R(144)Q

5 ’ -ATCTCTAATGATATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTCCTCCTCCCCGGAA---------+---------+---------₊---------₊---------₊---------₊ go

MSNDMTPEQMATNVNSSSPE

-CGTCACACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTC-.......-+-.....—+---------+---------+---------+---------+ 120

RHTRSYDYMEGGDIRVRRLF

-TGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAG---------+---------+---------+---------₊---------₊---------+ 180

CRTQWYLRIDKRGKVKGTQE

-ATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATC---------+---------+---------₊---------+---------₊---------₊ 240

MKNNYNIMEIRTVAVGIVAI

-AAAGGTGTTGAATCTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAGGAAAACTCTATGCAAAG---------+---------+---------₊---------₊---------₊---------₊ 300

KGVESEFYLAMNKEGKLYAK

-AAAGMTGCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGGAAAACCATTACAACACA---------+---------+---------₊---------₊---------₊---------+ 350

KECNEDCNFKELILENHYNT

-TATGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTOCTCTGAACCAGAAA---------+---------+---------+---------+---------₊---------+ 420

YASAKWTHNGGEMFVALNQK

-GGTATCCCTGTTCAAGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCG---------+---------+---------+---------+---------₊---------+ 480

GIPVQGKKTKKEQKTAHFLP

-ATGGCAATCACTTAA-3’

---------+-----495

MAIT*

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

24. ábra

KGF AN23/R(144)Q

5' -ATCTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC---------+---------+---------+---------₊---------₊---------+ go

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT

-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC---------+---------+---------₊---------+---------+---------₊ 120

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN

-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT---------₊---------+---------+---------₊---------+---------₊ 180

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV

-GAATCTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAGGAAAACTCTATGCAAAGAAAGAATGC---------+---------+---------₊---------+---------4.---------+ 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-AATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGGAAAACCATTACAACACATATGCATCT---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS

-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCOCT---------+---------₊---------+---------+---------+---------+ 3go

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP

-GTTCAAGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC---------+---------+---------₊---------₊---------+---------+ 420

VQGKKTKKBQKTAHFLPMAI

-ACTTAA-3'

------426

T *

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

HU 226 168 B1

Int. Cl.: C07K 14/50

125 a

i

C(1,15)8 foszfátban óidbató fahárj·

HU 226 168 B1

Int. Cl.: C07K 14/50

27. ábra oldható rhKGF %54

HU 226 168 B1

Int. Cl.: C07K 14/50

28. ábra λ teznészetes KGT analógok természetes társzerkezetének elvesztése hőmérsékletemelés hatására

Látszólagos Tm (Celsius fok)

PH sKGFC(1,15)S/R(144)E ^AKGFC(1,15)S/R(144)Q °KGFC(1,15)S

ÁrbKGF

HU 226 168 B1

Int. Cl.: C07K 14/50

CPM lóg ng/luk «— rhKGF o— KGFC(1,15)S

HU 226 168 B1

Int. Cl.: C07K 14/50

30. ábra

CPM «— rhKGF <3— KGFAN15

HU 226 168 B1

Int. Cl.: C07K 14/50

31. ábra

Vad típus - delta 1123

CPM lóg ng/al a— rhKGF α— KGFAN23

HU 226 168 B1

Int. Cl.: C07K 14/50

32. ábra

Vad típus - delta N23/R144Q

CPM lóg ng/ml a— rtiKGF o— KGF ÁN23/R(144)Q

HU 226 168 B1

Int. Cl.: C07K 14/50

33. ábra

Vad típus - C1,15S/R144Q

CPM lóg ng/ml «— rhKGF o— KGFC(1,15)S/R(144)Q

HU 226 168 B1

Int. Cl.: C07K 14/50

34. ábra

Vad típus - C1,15S/R144E

CPM lóg ng/ml rhKGF

KGFC(1,15)S/R(144)E

HU 226 168 B1

Int. Cl.: C07K 14/50

35. ábra λ KGF hatása a szérum koleszterinszintjére

Kölesztérin (mg/dm3)

160

140

120

100

0.00 0.01 0.10 1.00 10.00 Dózis (mg/kg) • rhKGF KGFC(1,15)S

A KGFÁN15 γ KGFÁN23 ♦ CHO

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

36. ábra

KGF Cl,15,40S

5' -CTAGAAGGAGGAATAACATATGTCTAATGATATGACTCOGGAACAGATOGCTACCAACGT

---------₊---------+---------₊---------₊---------₊---------₊ gQ

MSNDMTPEQMATNV

TAACTCCTCCTCCCC&iMCGKACAC&XTrKttACGACTACATGGAAGGTQGTGACAT

---------+---------₊---------₊---------₊---------+---------₊ 120

NSSSPERHTRSYDYNEGGDI

CCGCGTACYXXX5TTTGTTCTCTCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAA

---------+---------4---------4---------+---------+---------4 180

RVRRLFSRTQWYLRIDKRGK

AGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTOC

---------4---------+---------+---------+---------+---------+ 240

VKGTQEMKNNYNIMEIRTVA

TGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGA ---------4---------4---------+---------+---------+---------4 3oo

VGIVAIKGVESEFYLAMNKE

AGGAAAACTOTATGCAAAGAAAGAATGCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCT

---------₊---------+---------₊---------4---------4---------4 360

GKLYAKKECNEDCNFKELIL

GGAAAACCATTACAACACATATGCATCAGCTAAATGGAGACACAACGGAGGQGAAATGTT

---------₊---------4---------4---------4---------4---------4 420

ENHYNTYASAKWTHNGGEMF

TCTTGCCTTAAATCAAAAGGGGATTCCTGTAAGAGGAAAAAAAACGAAGAAAGAACAAAA

---------4---------4---------4---------4---------4---------₊ 480

VALNQKGIPVRGKKTKKBQK

AACAGC(XACTTTCTTCCTATGGCAATAACTTAATAG-3'

---------+---------+---------+---------+_ 521

TAHFLPMAIT* *

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

37. ábra

KGF Cl,15,102S

5' -CTAGAAGGAGGAATAACATATGTCTAATGATATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGT

---------+---------4---------+---------4---------4---------4 go

MSNDMTPEQMATNV

TAACTCCTCCTCCCCGGAACGTCACACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACAT ---------4---------4---------4---------4---------₊---------4 120

NSSSPERHTRSYDYMEGGDI

---------4---------4---------4---------4---------4---------4

RVRRLFCRTQWYLRIDKRGK

AGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGC

---------4---------4---------4---------4---------4---------4

VKGTQEMKNNYNIMEIRTVA

TGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCTATGAACAAAGA

---------4---------4---------4---------4---------4---------4

VGIVAIKGVESEFYLAMNKE

AGGTAAACTGTACGCTAAAAAAGAATCCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCT

---------4---------4---------+---------4---------4---------4

GKLYAKKBSNBDCNFKELIL

GGAAAACCATTACAACACATATGCATCAGCTAAATGGACACACAACGGAGGGGAAATGTT

---------4---------4---------4---------4---------4---------4

ENHYNTYASAKWTHNGGEMF

TGTTGCCTTAAATCAAAAGGGGATTCCTGTAAGAGGAAAAAAAACGAAGAAAGAACAAAA

---------4---------4---------4---------4---------4---------4

VALNQKGIPVRGKKTKKEQK

AACAGCCCACTTTCTTCCTATGGCAATAACTTAATAG-3 *

.........+---------+---------+---------+- 521

TAHPLPMAIT* *

180

240

300

360

420

480

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

38. ábra

KGF Cl, 15, 102, 106S

5¹ -CTAGAAGGAGGAATAACATATGTCTAATGATATGACTTCGGAACAGATGGCTACCAACGT

---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

MSNDMTPEQMATNV

TAAcrccrccTccccxxsAACGTCA&RxxsTTccTAftSAcrACATGGAAGGTGXiTGACAT

NSSSPERHTRSYDYMBGGDI

CCG(CTACG7CGTCTGTTCTGGCCTACCCAGTOGTA(CTGCGTA^<rcGACAAAGGCGQCAA

4·—————180 RVRRLFCRTQWYLRIDKRGK

AGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGC

---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240

VKGTQEMKNNYNIMEIRTVA

TGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCTATGAACAAAGA

---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300

VGIVAIKGVBSBFYLAMNKE

AGGTAAACTGTACGCTAAAAAAGAATCCAATGAAGATTCTAACTTCAAAGAACTAATTCT

---------+---------+—-------+---------+---------360

GKLYAKKBSNBDSNFKELIL

GGAAAACCATTACAACACATATGCATCAGCTAAATGGACACACAACGGAGGGGAAATGTT

---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420

BNHYNTYASAKWTHNGGEMF

TGTTGCCTTAAATCAAAAGGGGATTCCTGTAAGAGGAAAAAAAACGAAGAAAGAACAAAA

---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4so

VALNQKGIPVRGKKTKKEQK

AACAGCCCACTTTCTTCCTATGGCAATAACTTAATAG-3 '

---------+---------+---------+---------+- 521

TAHFLPMAIT* *

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

39. ábra

ΔΝ23 /N(137)E

5' -ATGTCXTTACX^CTACATGGAAGGTGGTCACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC+---------₊---------₊---------+---------+---------+--------- go

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRTd)AGT(X}TkCCT(XXHkTCGACAMC(XXX3CAMGTCMGGGCACCCMG&GA7GAAMAC+---------+---------+—-------₊---------₊---------+--------- i20

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAA'KXGTACTGTKXTrcTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT+---------+---------₊---------+---------+---------+--------- 180

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC+———_+---------+---------₊---------₊---------₊--------- 240

ESEPYLAMNKEGKLYAKKEC-AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCTTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT+---------₊---------+---------₊---------+---------+--------- 300

NEDCNFKELILBNHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGGAACAGAAW3GTATCCCT+---------+---------+—-------+---------+------—+--------- 360

AKWTHNGGEMFVALEQKGIP-GTTCGTGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACraCTCACTTCCTQCCGATGGCAATC+---------₊---------+---------+---------+---------+--------- 420

VRGKKTKKEQKTAHFLPMAI-ACTTAA-3’ ♦----- 426

T *

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

40. ábra

ΔΝ23 /K(139)E +---------+---------+---------+---------+---------+--------- go

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC +---------+---------+---------+---------+---------+--------- 120

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT+---------+---------+---------+---------+---------+--------- 180

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV*<NUlTCTGAATTCTACCTQGCAATGAACAAAGAAGGrAAACTGTACGCAAAAAAAeAATGC+---------+---------+---------+---------+---------+--------- 240

ESEFYLAMNKBGKLYAKKBC-AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT +---------+---------♦---------+---------+___------+--------- 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS+---------+---------+---------+__-------₊---------₊--------- 360

AKWTHNGGEMFVALNQEGIP-GTTCGTGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTrcCTGCCGATGGCAATC+---------+---------+---------+---------4---------4--------- 420

VRGKKTKKEQKTAHFLPMAI-ACTTAA-3' +----- 426

T *

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

41. ábra

ΔΝ23 /K(139)Q

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC+---------+---------₊---------₊---------₊---------₊--------- go

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CABftttACCTGC(?rW(X!A(MACeCQ(X£MffKMG(XSCA(XXMGN3XKlMAMC+---------+---------₊---------₊---------+---------₊--------- i20 qwylridkrgkvxgtqemkn-AACTACAATATTATQGAAATCCX3TACTGTO5CTGTTGGTATOGTTQCAATCAAAGGTGTT+---------+---------+---------₊---------+---------₊--------- i80

NYNIMEIRTVAVGIVAIXGV-GAATCRaAATTCTAOCftSCAASGMCAAMSAAGGTAAACTCTACGQUUUUUUkGAAIGC-------+—— 240

ESEFYLAMNKEGKLYAXKEC-AACGAAGACTGCAACTTCAAAŰAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT+---------+---------+---------+---------+---------+--------- 3Q0

NEDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTQGTGAAATGTTCGTTQCTCTGAAOCAGCAAGGTATCCCT+---------+---------4----------------+---------+--------- 360

AKWTHNGGEMFVALNQQGIP-GTTCGTGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC+---------+---------♦---------₊---------₊---------♦--------- 420

VRGXXTXXBQXTAHFLPMAI-ACTTAA-3' ♦----- 426

T *

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

42. ábra

ΔΝ23 /R(144)A

5 ’ -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC-

+- M S Y —4--- D Y M ---4— E G G D -+- I R V —4--- R R L ---4— F C R T - -CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC- 0 w Y L R I D X R G X V X G T Q Ε M X N - N Y N I M E I R T V A V G I V A I X G V -

-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC♦---------+—------+---------₊---------₊---------4--------- 240

ESEFYLAMNXEGXLYAXXEC-AAQUAGACTSCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACISK^UICAOCTACGCATCT** +---------+---------4---------4---------4---------4--------- 300

NBDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACXJGTGGTGAAATGTrcGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCT4-------4---------4---------4---------4---------4--------- 350

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP-GrTGCrGffrAAGAMACCMGAMGMCAGMMCCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 420

VAGKKTKKEQKTAHFLPMAI-AOTAA-3’

4----- 426

T ♦

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

43. ábra

ΔΝ23 /R(144)E +---------₊---------₊---------4---------₊---------₊--------- 60

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC+---------4.---------+---------+---------+---------4--------- 120

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTQGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT+---------4---------4---------₊---------+---------4--------- 130

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAArTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAGGAAAACTCTATGCAAAGAAAGAATGC4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-AATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGGAAAACCATTACAACACATATGCATCT4---------4_---—---4---------4---------4---------4--------- 3QQ

NBDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCT₊---------4---------4---------4---------4---------4_---—--- 360

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP-GTTGAAGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 420

VEGKKTKKEQKTAHFLPMAI-ACTTAA-3' +----- 426

T *

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

44. ábra

ΔΝ23 /R(144)L

5 ’ -ATCTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC+---------+---------₊---------₊---------₊---------₊--------- gQ

MSYDYMBGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC+---------₊---------4---------4---------4---------4--------- 120

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTrGCAATCAAAQGTGTT4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 130

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 240

BSEFYLAMNREGKItYAKREC-MÍXMGKmCMCITCAM^^

4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 300

NBDCNFKBLILENHYNTYAS-GCTAAAT(X2ACCCJtf^UkC&3TIK»TGftMT(3nC&FTGC7nGAACUGAAAGGTATCCCT4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 3g0

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP-GTTCTGGGTAAGAAAMXAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 420

VLGKKTKKEQKTAHFLPltAI-ACTTAA-3’ +----- 426

T *

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

45. ábra

ΔΝ23 /K(147)E

5¹ -ATGrCCTAC&WACMGGJW&JXXTKA^ +---------+---------+---------+---------+---------+--------- go

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-cagtggtacctgcgtatcgacaaacgcggcaaagtcaagggcacccaagagatgaaaaacQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN+---------+---------+---------+---------+---------+--------- 180

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC+---------+---------+---------+---------+---------+--------- 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-MCXSMGkCVXMmCMWi^^ +---------♦---------+---------+---------₊---------+--------- 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCAC^ACXXnGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATTCCT+---------+---------+---------+---------+---------+--------- 360

AKWTHNGGEMFVALNQXGIP'

-GTTCGTGGTAAGGAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC+---------+---------+---------+---------+---------+--------- 420

VRGKBTKKEQKTAHFLPMAI-ACTTAA-3’ +----- 426

T ♦

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

46. ábra

ΔΝ23 /K(147)Q

5 ’ dLTGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCOGOGTAaS^^ +---------₊---------»---------₊---------+---------₊--------- go

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-Í^GTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC+---------+---------+---------₊---------+---------₊--------- i20

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTQGTATCGTIGCAATCAAAGGTGTT+---------+---------+--------~+---------+---------+--------- 180

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC+---------+---------+---------+---------₊---------+--------- 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT+---------+---------+---------₊---------+---------₊--------- 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAAOTGTGGTGAAATGTTCGTTQCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCT+---------4---------+---------+---------+---------₊--------- 350

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP-GTTCGTGGTAAGCAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC₊---------4---------4---------4---------4---------4--------- 420

VRGKQTKKEQKTAHFLPMAI-ACTTAA-3 ’

4----- 426

T *

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

47. ábra

ΔΝ23 /K(153)E

5' -ATGT(X7DLCXjACTACATGGAAG(yKXnGACATCCGCGTAOG^,KX7KnX3TTCTGCCGTACC+---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊--------- go

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT+---------+---------+---------+---------+---------+--------- 120

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATAmTGGAAATCCGTACTGTTCCTGTTGGTATTOTTGCAATCAAAGGTGTr+---------₊---------+---------4----------+---------+--------- 180

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC+---------*---------+---------+---------+---------+--------- 240

ESEPYLAMNKEGKLYAKKEC-AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATOTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT+---------+-———4.---------+---------4.---------4.--------- 300

NEDCNFKBLILENHYNTYA5-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCT4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------*--------- 350

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP-GTTCXnGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGGAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 420

VRGKKTKKEQETAHFLPMAI -ACTTAA-3' +----- 426

T *

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

48. ábra

ΔΝ23 /K(153)Q

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTQGTGACATCCGCGTACGTCGTCTG'ITCTGCCGTACC+---------+---------+---------4---------₊---------₊--------- 50

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT- CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC+---------+---------+---------4---------4---------4--------- 120

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTQGTATOGTTGCAATCAAAGGTGTT4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 180

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC4---------₊---------4---------4---------4---------4--------- 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-mcgmgactgcaacttcamgmctgatcctqgmmccáctacmcacctacgca.tct4---------4---------4---------₊_---—---4---------₊--------- 3Q0 nbdcnfkelilenhyntyas-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAŰGTATCCCT4---------+---------+---------4---------+---------+--------- 360

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP-GTTCGTCXJrAAGAAAACCAAGAAAGAACAGCAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 420

VRGKKTKKEQQTAHFLPMAI -ACTTAA-3' +----- 426

T * 75

HU 226 168 Β1

Int. Cl.: C07K 14/50

49. ábra

ΔΝ23 /Q(152)E/K(153)E +---------+---------₊---------₊---------₊---------₊--------- go

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC+---------+---------+---------₊---------₊---------₊--------- i2o

QWYLRIDKRGKVKGTQBMKN-AACTACAATATTATGGAAATCXX?TACTXynOCTGTrcGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT+---------₊---------+---------+---------₊---------₊--------- 180

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC+---------+---------+---------+---------₊---------+--------- 240

ESBFYLAMNKBGKLYAKKEC-MCGMeMX&atCTTCAMGMCmTCC^ +---------+---------+---------+---------+---------₊--------- 300

NEDCNFKBLILBNHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGITCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCT♦—----—4---------4---------4---------4-------->4--------- 360

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP*

-GTTCGTGGTAAGAAAACCAAGAAAGAAGAGGAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 420

VRGKKTKKEBETAHFLPMAI-ACTTAA-3' +----- 426

T *

HU 226 168 B1

Int. Cl.: C07K 14/50

50. ábra

STZ+RGF(B6 »300) v s in

CM

Map (Cwp/fim) xja V