DE69530403T2

DE69530403T2 - Analogen des keratinozytenwachstumfaktors

Info

Publication number: DE69530403T2
Application number: DE69530403T
Authority: DE
Inventors: Bao-Lu Chen; Eric W. Hsu; William C. Kenney; Charles F. Morris
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 2003-10-30
Anticipated expiration: 2015-10-13
Also published as: SK43197A3; PT785948E; BG101408A; NO971566L; EP0804479B1; ATE237633T1; DE69535264D1; WO1996011949A2; HUT78058A; AU681546B2; EP0785948A1; EP0804479A1; JPH10507193A; NO971568D0; SK45597A3; FI971420A0; HUT78050A; FI971536L; PT804479E; BR9509329A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die rekombinante DNA-Technologie und die Proteinentwicklung. Es wurden insbesondere rekombinante DNA-Methoden angewendet, um Polypeptidanaloga des Keratinozytenwachstumsfaktors (KGF), einem potenten Mitogen des Nicht-Fibrobiastenepithelzellwachstums, zu generieren, wobei die Analoga eine erhöhte Stabilität im Vergleich zu dem ursprünglichen KGF aufweisen.

Hintergrund der Erfindung

Das komplexe Verfahren der Gewebeausbildung und Regeneration wird durch eine Anzahl von Proteinfaktoren vermittelt, die manchmal als weiche Gewebewachstumsfaktoren bezeichnet werden. Diese Moleküle werden im Allgemeinen durch einen Zelltyp freigesetzt und wirken, um die Proliferation anderer Zelltypen zu beeinflussen (Rubin et al. (1989), Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 86: 802-806). Einige weiche Gewebewachstumsfaktoren werden durch bestimmte Zelltypen sezerniert und beeinflussen die Proliferation, Differenzierung und/oder Reifung darauf reagierender Zellen in der Entwicklung multizellulärer Organismen (Finch et, al. (1989), Science, 245: 752-755). Zusätzlich zu ihren Rollen in der Entwicklung von Organismen sind einige wesentlich für die Erhaltung der Gesundheit und die Aufrechterhaltung ausgereifter Systeme. Zum Beispiel gibt es in Säugetieren viele Systeme, bei denen ein schneller Zellumsatz vorkommt. Solche Systeme schließen die Haut und den gastrointestinalen Trakt ein, die beide aus Epithelzellen zusammengesetzt sind.
Auch umfasst von dieser Gruppe weicher Wachstumsfaktoren ist eine Proteinfamilie von Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs).
Es gibt derzeit acht bekannte FGF-Familienmitglieder, weiche eine Verwandtschaft zwischen den primären Strukturen aufweisen: der einfache Fibroblastenwachstumsfaktor, (basic fibroblast growth factor) bFGF (Abraham et al. (1986), EMBO J:; 5: 2523-2528); der saure Fibroblastenwachstumsfaktor (acidic fibroblast growth factor), aFGF (Jaye et al. (1986), Science, 233: 541-545); das int-2-Genprodukt, int-2 (Dickson & Peters (1987), Nature, 326: 833); der hst/kFGF (Delli-Bovi et al. (1987), Cell, 50: 729-737 und Yoshida et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7305-7309; der FGF-5 (Zhan et al. (1988), Mol. Cell. Biol., 8: 3487-3495); der FGF-6 (Marics et al. (1989), Oncogene, 4: 335-340); der Keratinozytenwachstumsfaktor (Finch et al. (1989), Science, 24: 752-755); und Hisactophilin (Habazzettl et al. (1992), Nature, 359: 855-858).
Innerhalb der FGF-Proteinfamilie ist der Keratinozytenwachstumsfaktor ("KGF") ein einzigartiger Effektor der Nicht-Fibroblastenepithel (insbesondere Keratinozyten)- Zellproliferation, der aus mesenchymalen Geweben abgeleitet ist. Der Begriff "nativer KGF" bezieht sich auf ein natürliches menschliches (hKGF) oder rekombinantes (rKGF) Polypeptid (mit und ohne Signalsequenz), wie durch die in SEQ ID NR: 2 gezeigte Aminosäuresequenz-dargestellt oder eine allele Variante davon. [Es sei denn, dieses wird anders angezeigt, soll die Nummerierung der Aminosäuren für die hierin beschriebenen Moleküle mit derjenigen korrespondieren, die für die reife Form des nativen Moleküls dargestellt wird (d. h., abzüglich der Signalsequenz), wie durch die Aminosäuren 32 bis 194 von SEQ ID NR: 2 gezeigt.]
Natives KGF kann aus natürlichen menschlichen Quellen (hKGF) isoliert werden oder durch rekombinante DNA-Techniken (rKGF) hergestellt werden (Finch et al. (1989), supra; Rubin et al. (1989), supra; Ron et al. (1993), The Journal of Biological Chemistry, 268(4): 2984-2988; und Yan et al. (1991), In Vitro Cell. Dev. Biol., 27A: 437-438).
Es ist bekannt, dass natives KGF relativ instabil in dem wässrigen Zustand ist und dass es einem chemischen und physikalischen Abbau unterliegt, der in einem Verlust der biologischen Aktivität während der Prozessierung und Lagerung resultiert (Chen et al. (1994), Pharmaceutical Research, 11: 1582-1589). Natives KGF ist auch anfällig für die Aggregation bei erhöhten Temperaturen und es wird unter sauren Bedingungen inaktiviert (Rubin et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 802-806). Die Aggregation von nativem KGF in wässriger Lösung resultiert auch in inaktiviertem Protein. Dies ist nachteilig, da ein solcher Verlust an Aktivität es unmöglich macht, wässrige Formulierungen von nativen KGF-Proteinen für längere Zeiträume aufzubewahren oder das Protein über längere Zeiträume zu verabreichen. Zudem ist dies besonders problematisch, wenn pharmazeutische Formulierungen hergestellt werden, da von aggregierten Proteinen bekannt ist, dass sie immunogen sind (Cleland et al. (1993), Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 10: 307-377; Robbins et al. (1987), Diabetes, 36: 838-845; und Pinckard et al. (1967), Clin. Exp, Immunol 2331-340).
Natives KGF umfasst fünf Cysteinreste, nämlich die Aminosäuren 1, 15, 40, 102 und 106 (Finch et al. (1989), Science, 24: 752-755). Obwohl der Cysteinanteil von nativem KGF berichtet worden war, gab es keinen Bericht über die Rollen, die diese Cysteinreste bezüglich der Aktivität (z. B. die Bedeutung für die biologische Aktivität) und die tertiäre Struktur (z. B., die Neigung unerwünschte intermolekulare oder intramolekulare Disulfidbindungen auszubilden). Somit gibt es keinerlei Lehre aus dem Stand der Technik, die besagt, welche, wenn überhaupt, Cysteinreste wesentlich sind oder involviert sind in der unerwünschten Ausbildung von Disulfidbindungen, die das Protein für eine Aggregation und/oder Instabilität anfällig machen.
Um eine Verbesserung oder anderweitige Änderung einer oder mehrerer der Eigenschaften von nativem KGF zu versuchen, kann die Proteinentwicklung eingesetzt werden. Es wurden die rekombinante DNA-Technologie eingesetzt, um die Sequenzen von nativem KGF zu modifizieren.
Ron et al. (1993), JJ Biol. Chem. 268 4: 2984-2988 berichteten von modifizierten KGF- Polypeptiden, bei denen 3, 8, 27, 38 oder 49 Aminosäuren aus dem N-Terminus deletiert waren. Diese Polypeptide, denen 3, 8 oder 27 N-terminale Reste fehlten, behielten die Fähigkeit zur Heparinbindung bei; die anderen jedoch nicht. Es wurde auch berichtet, dass die Polypeptide, denen 3 und 8 Reste fehlten, vollständig aktiv waren, während die Form, der 27 Reste fehlten, 10-20-fach weniger mitogen war und die Formen, denen 38 oder 49 Aminosäuren fehlten, keine mitogene Aktivität aufwiesen. Die Stabilität der modifizierten KGF-Polypeptide wurde nicht besprochen oder anderweitig berichtet.
Die veröffentlichte PCT-Anmeldung Nr. 90/08771, supra, berichtete auch von der Herstellung eines chimeren Proteins, bei dem ungefähr die ersten 40 N-terminalen Aminosäuren der reifen Form des nativen KGF mit dem C-ternninalen Anteil (ungefähr 140 Aminosäuren) von aFGF kombiniert wurden. Von dem Chimeren wurde berichtet, dass es auf Keratinozyten wie KGF zielt, aber die Anfälligkeit für Heparin fehlte, eine Eigenschaft von aFGF, aber nicht von KGF. Die Stabilität des Chimeren wurde weder diskutiert noch anderweitig berichtet.
WO 95/0 1434 lehrt eine trunkierte Form von KGF, der 23 N-terminale Aminosäuren fehlen, seine Verwendung zur Stimulierung von Zellen, seine DNA und die rekombinante Herstellung davon.
Die Literatur hat von keinem modifizierten KGF-Molekül berichtet, das eine wesentlich verbesserte Stabilität relativ zum nativen KGF aufweist. Zudem hat die Literatur von keinerlei ausreichenden Lehren oder Beweismitteln berichtet, um eine realistische Erwartung zur erfolgreichen Herstellung von KGF-Molekülen mit solchen wünschenswerten Eigenschaften zur Verfügung zu stellen.
Im Allgemeinen werden die Wirkungen eines Aminosäureaustausches in einem Protein auf die biologische Aktivität, abhängig von einer Anzahl von Faktoren, variieren, einschließlich der dreidimensionalen Struktur des Proteins, und ob oder ob nicht die Modifikationen in der Rezeptorbindungsregion der primären Sequenz des Proteins vorkommen. Da weder die dreidimensionale Struktur noch die Rezeptorbindungsregion auf der primären Struktur von nativem KGF publiziert war, erlaubte das Wissen auf diesem Gebiet keinerlei Verallgemeinerung bezüglich der Wirkungen von Aminosäuremodifikationen auf natives KGF, basierend auf den Wirkungen von Aminosäuremodifikationen auf typischen Proteinen dieser Kategorie.
Es ist die Aufgabe dieser Erfindung, Polypeptidmoleküle zur Verfügung zu stellen, die solche Analoga kodieren, die eine erhöhte Stabilität im Vergleich zu nativem KGF aufzeigen (z. B., wenn einem typischen pH, thermischen und/oder anderen Lagerungsbedingungen ausgesetzt).

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Polypeptidanalogon des als "KGF" bezeichneten Keratinozytenwachstumsfaktors zur Verfügung, wobei der native KGF mit der folgenden Sequenz korrespondiert
mit oder ohne einer Signalsequenz, wobei das Analogon die Aminosäuresequenz von KGF umfasst, die eine Deletion, Substitution und/oder Insertion von einer oder mehreren der Aminosäuren 1-24 umfasst, wobei der Cysteinrest in Aminosäureposition 1 und der Cysteinrest in Aminosäureposition 15 jeweils entweder deletiert oder mit einer anderen Aminosäure substituiert sind, das optional zusätzlich einen N-terminalen Methioninrest aufweist und/oder zusätzlich eine Ladungswechsel- Substitution an einer Aminosäureposition ausgewählt aus Arg (41), Glu (43), Cys (55), Cys (95), Asn (137), Glu (138), Cys (139), Arg (144), Cys (147), Glu (152), Cys (153) oder Thr (154) umfasst oder im Falle von nativem KGF, bei dem beide, Cys (1) und Cys (15) durch Ser substituiert sind, optional auch Cys (40) oder Cys (102) oder beide Cys (102) und Cys (106), die durch Ser substituiert sind, mit der Proviso, dass das Analogon nicht das Keratinozytenwachstumsfaktorprotein, bestehend aus den Aminosäuren 24-163, ist.
Überraschenderweise wurde herausgefunden, dass, wenn ein KGF-Molekül (d. h., ursprüngliches Molekül), das Cysteinreste aufweist, die mit (wie durch die oben beschriebenen Techniken bestimmt) Cys¹ und Cys¹&sup5; von nativem KGF (Cysteinreste 32 und 46 der SEQ ID NR: 2) korrespondieren, durch Ersetzen der korrespondierenden Cysteine modifiziert»wird, das resultierende KGF-Analogon eine verbesserte Stabilität im Vergleich zum ursprünglichen Molekül aufweist. Vorzugsweise ist die Erfindung zusätzlich zu dem Vorhandensein einer erhöhten Stabilität auf solche Analoga gerichtet, welche auch eine volle biologische Aktivität im Vergleich zu nativem KGF aufweisen (d. h., mindestens eine im Wesentlichen ähnliche Rezeptorbindung Qder Affinität).
In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden gereinigte und isolierte Nucleinsäuremoleküle, die verschiedene biologische aktive Polypeptideanaloga von KGF kodieren, beschrieben. In einer Ausführungsform umfassen solche Nucleinsäuren DNA-Moleküle, die in biologisch funktionelle Plasmid- oder virale Vektoren kloniert wurden. In einer anderen Ausführungsform können Nucleinsäurekonstrukte dann verwendet werden, um eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle stabil zu transformieren. In einer noch weiteren Ausführungsform involviert die Erfindung ein Verfahren, bei dem entweder eine prokaryontische (vorzugsweise E. coli) oder eukaryontische Wirtszelle, die stabil mit einem Nucleinsäuremolekül transformiert ist, unter geeigneten Nährstoffbedingungen in einer Weise wachsen gelassen wird, um die Expression des KGF-Analogons zu ermöglichen. Nach der Expression kann das resultierende rekombinante Polypeptid isoliert und aufgereinigt werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft pharmazeutische Formulierungen, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines KGF-Analogons und eines verträglichen pharmazeutischen Trägers. Solche Formulierungen werden nützlich zur Behandlung von Patienten sein, die durch epitheliale Krankheiten oder Verletzungen betroffen sind.
In diesem Sinne betrifft ein weiterer Aspekt die Verwendung eines KGF-Analogons zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von einer Krankheit, die die Stimulierung der Produktion von Nicht-Fibroblastenepithelzellen notwendig macht. Solche Epithelzellen umfassen verschiedene adnexale Zellen, Pankreaszellen, Leberzellen und Schleimhautepithel in den respiratorischen und gastrointestinalen Trakten.

Kurze Beschreibung der Figuren

Wenn Bezug auf die Fig. 4, 7-24 und 37-50 und die spezifischen Aminosäurepositionen genommen wird, dann sollte das anfängliche Methionin in der Sequenz als Rest Nummer "0" angesehen werden.
Fig. 1 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 1)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 2)-Sequenzen des nativen KGF (die Nucleotide, die die reife Form des nativen KGF kodieren, werden durch die Basen 201 bis 684 von SEC ID NO: 1 dargestellt und die reife Form von KGF wird durch die Aminosäurereste 32 bis 194 von SEQ ID NO: 2 dargestellt).
Fig. 2A, 2B und 2C zeigen jeweils Plasmidkarten von pCFM1156, pCFM1656 und pCFM3102.
Fig. 3 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 3)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 4)-Sequenzen des Konstrukts RSH-KGF.
Fig. 4 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 5)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 6)-Sequenzen des Konstrukts, das in dem Plasmid KGF enthalten ist.
Fig. 5 zeigt die chemisch synthetisierten OLIGOs (OLIGO#6 bis OLIGO#11; jeweils SEQ ID NO: 12-17), die verwendet wurden, um die DNA-Sequenz zwischen einer KpnI-Stelle und einer EcoRI-Stelle (von den Aminosäurepositionen 46 bis 85 von SEQ ID NO: 6) in dem Konstrukt, das in Plasmid-KGF enthalten ist, zu substituieren, um das Konstrukt in Plasmid-KGF (dsd) herzustellen.
Fig. 6 zeigt die chemisch synthetisierten OLIGOs (OLIGO#12 bis OLIGO#24; jeweils SEQ ID NO: 18-30), die verwendet wurden, um das KGF (Kodon-optimiert) zu konstruieren.
Fig. 7 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 31)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 32)-Sequenzen von C(1,15)S, einem KGF-Analogon, das Substitutionen von Serin für Cystein in den Aminosäurepositionen 1 und 15 des nativen KGF aufweist.
Fig. 8 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 33)- und Aminosäure-(SEQ iD NO: 34)-Sequenzen von ΔN3/C(15)S, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten drei Aminosäuren des N-Terminus aufweist und eine Substitution von Serin für Cystein in der Aminosäureposition 15 des nativen KGF.
Fig. 9 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 35)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 36)-Sequenzen von ΔN3/C(15)-, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten drei Aminosäuren des N-Terminus aufweist und eine Deletion von Cystein in der Aminosäureposition 15 des nativen KGF.
Fig. 10 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 37)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 38)-Sequenzen von ΔN8/C(15)S, einen KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 8 Aminosäuren des N-Terminus aufweist und eine Substitution von Serin für Cystein in Aminosäureposition 15 des nativen KGF.
Fig. 11 zeigt die Nucleotid-(SEQ (D NO: 37)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 38)-Sequenzen von ΔN8/C(15)-, einen KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 8 Aminosäuren des N-Terminus aufweist und eine Deletion von Cystein in Aminosäureposition 15 des nativen KGF.
Fig. 12 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 41)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 42)-Sequenzen von ΔN15, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 15 Aminosäuren des N-Terminus des nativen KGF aufweist.
Fig. 13 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 43)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 44)-Sequenzen von ΔN16, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 16 Aminosäuren des N-Terminus des nativen KGF aufweist.
Fig. 14 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 45)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 46)-Sequenzen von ΔN17, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 17 Aminosäuren des N-Terminus von nativem KGF aufweist.
Fig. 15 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 47)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 48)-Sequenzen von ΔN18, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 18 Aminosäuren des N-Terminus von nativem KGF aufweist.
Fig. 16 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 49)- und Artiinosäure-(SEQ ID NO: 50)-Sequenzen von ΔN19, einem KGF-Analogon, das eine Deietion der ersten 19 Aminosäuren des N-Terminus von nativem KGF aufweist.
Fig. 17 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 51)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 52)-Sequenzen von ΔN20, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 20 Aminosäuren des N-Terminus von nativem KGF aufweist.
Fig. 18 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 53)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 54)-Sequenzen von ΔN21, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 21 Aminosäuren des N-Terminus von nativem KGF aufweist.
Fig. 19 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 55)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 56)-Sequenzen von ΔN22, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 22 Aminosäuren des N-Terminus von nativem KGF aufweist.
Fig. 20 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 57)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 58)-Sequenzen von ΔN23, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 23 Aminosäuren des N-Terminus von nativem KGF aufweist.
Fig. 21 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 59)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 60)-Sequenzen von ΔN24, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 24 Aminosäuren des N-Terminus von nativem KGF aufweist.
Fig. 22 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 61)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 62)-Sequenzen von C(1,15)S/R(144)E, einem KGF-Analogon, das Substitutionen von Serin für Cystein in den Aminosäurepositionen 1 und 15 und eine Substitution von Glutaminsäure für Arginin in der Aminosäureposition 144 von nativem KGF aufweist.
Fig. 23 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 63)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 64)-Sequenzen von C(1,15)S/R(144)Q, einem KGF-Analogon, das Substitutionen von Serin für Cystein an den Aminosäurepositionen 1 und 15 und eine Substitution von Glutaminsäure für Arginin in der Aminosäureposition 144 von nativem KGF aufweist.
Fig. 24 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 65)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 66)-Sequenzen von ΔN23/R(144)Q, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 23 Aminosäuren des N-Terminus und eine Substitution von Glutaminsäure für Arginin in der Aminosäureposition 144 des nativen KGF aufweist.
Fig. 25 zeigt die Menge des verbleibenden löslichen Proteins, wenn natives KGF und C(1,15)S in 20 mM NaPO&sub4;, 0,15 M NaCl, pH 7,0 bei 37ºC für 27 Std. gelagert wurden.
Fig. 26 zeigt die Menge des verbleibenden löslichen Proteins, wenn natives KGF und C(1,15)S in 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, 0,15 M NaCl, pH 7,0 bei 37ºC für 27 Std. aufbewahrt wurden.
Fig. 27 zeigt die Menge von verbleibendem löslichen Protein, wenn natives KGF und C(1,15)S in 50 mM NaPO&sub4;, 0,15 M NaCl, pH 7,0 bei 37ºC für 27 Std. aufbewahrt wurden.
Fig. 28 zeigt die Menge von löslichem Protein von nativem KGF, C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)E und C(1,15)S/R(144)Q, bestimmt durch Größenausschluss- HPLC als Funktion der Inkubationszeit bei 37ºC.
Fig. 29 zeigt die geschätzte Schmelztemperatur (Tm) als Funktion des pH für natives KGF, C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)Q und C(1,15)S/R(144)E.
Fig. 30 zeigt ein typisches Profil der mitogenen Aktivität von C(1,15)S, wie bestimmt durch die Messung der Aufnahme von [³H]-Thymidin während der DNA- Synthese durch Vergleich von dieser mit einer Standardkurve von nativem KGF.
Fig. 31 zeigt ein typisches Profil der mitogenen Aktivität von ΔN15, wie bestimmt durch die Messung der Aufnahme von [³H]-Thymidin während der DNA-Synthese und durch Vergleichen von dieser mit einer Standardkurve von nativem KGF.
Fig. 32 zeigt ein typisches Profil der mitogenen Aktivität von ΔN23, wie bestimmt durch die Messung der Aufnahme von [³H]-Thymidin während der DNA-Synthese und durch Vergleichen von dieser mit einer Standardkurve von nativem KGF.
Fig. 33 zeigt ein typisches Profil der mitogenen Aktivität von ΔN23/R(144)Q, wie bestimmt durch die Messung der Aufnahme von [³H]-Thymidin während der DNA- Synthese und durch Vergleichen von dieser mit einer Standardkurve von nativem KGF.
Fig. 34 zeigt ein typisches Profil der mitogenen Aktivität von C(1,15)S/R(144)Q, wie bestimmt durch die Messung der Aufnahme von [³H]-Thymidin während der DNA-Synthese und durch Vergleichen von dieser mit einer Standardkurve von nativem KGF.
Fig. 35 zeigt ein typisches Profil der mitogenen Aktivität von C(1,15)S/R(144)E, wie bestimmt durch die Messung der Aufnahme von [³H]-Thymidin während der DNA- Synthese und durch Vergleichen von dieser mit einer Standardkurve von nativem KGF.
Fig. 36 zeigt die Wirkungen von nativem (Wildtyp) KGF, ΔN15, CHO-abgeleitetem, C(1,15)S und ΔN23 auf die chemischen Serumzusammensetzungen.
Fig. 37 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 77)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 78)-Sequenzen von C(1, 15,40)S, einem KGF-Analogon, das Substitutionenen von Serin für Cystein in den Aminosäurepositionen 1, 15 und 40 des nativen KGF aufweist.
Fig. 38 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 79)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 80)-Sequenzen von C(1,15,102)S, einem KGF-Analogon, das Substitutionen von Serin für Cystein in den Aminosäurepositionen 1, 15 und 102 von nativem KGF aufweist.
Fig. 39 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 81)- und Aminosäure-(SEQ-ID NO: 82)-Sequenzen von C(1,15,102,106)S, einem KGF-Analogon, das Substitutionen von Serin für Cystein in den Aminosäurepositionen 1, 15 102 und 106 von nativem KGF aufweist.
Fig. 40 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 83)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 84)-Sequenzen von ΔN23/N(137)E, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 23 Aminosäuren des N-Terminus und eine Substitution von Glutaminsäure für Asparagin in der Aminosäureposition 137 von nativem KGF aufweist.
Fig. 41 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 85)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 86)-Sequenzen von ΔN23/K(139)E, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 23 Aminosäuren des N-Terminus und eine Substitution von Glutaminsäure für Lysin in der Aminosäureposition 139 von nativem KGF aufweist.
Fig. 42 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 87)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 88)-Sequenzen von ΔN23/K(139)Q, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 23 Aminosäuren des N-Terminus und einer Substitution von Glutaminsäure für Lysin in der Aminosäureposition 139 von nativem KGF aufweist.
Fig. 43 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 89)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 90)-Sequenzen von ΔN23/R(144)A, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 23 Aminosäuren des N-Terminus und einer Substitution von Alanin für Arginin in der Aminosäureposition 144 von nativem KGF aufweist.
Fig. 44 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 91)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 92)-Sequenzen von ΔN23/R(144)E, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 23 Aminosäuren des N-Terminus und eine Substitution von Glutaminsäure für Arginin in der Aminosäureposition 144 von nativem KGF aufweist.
Fig. 45 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 93)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 94)-Sequenzen von ΔN23/R(144)L, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 23 Aminosäuren des N-Terminus und einer Substitution von Leucin für Arginin in der Aminosäureposition 144 von nativem KGF aufweist.
Fig. 46 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 95)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 96)-Sequenzen von ΔN23/K(147)E, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 23 Aminosäuren des N-Terminus und eine Substitution von Glutaminsäure für Lysin in der Aminosäureposition 147 von nativem KGF aufweist.
Fig. 47 zeigt die Nucieotid-(SEQ ID NO: 97)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 98)-Sequenzen von ΔN23/K(147)Q, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 23 Aminosäuren des N-Terminus und einer Substitution von Glutaminsäure für Lysin in der Aminosäureposition 147 von nativem KGF aufweist.
Fig. 48 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 99)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 100)- Sequenzen von ΔN23/K(153)E, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 23 Aminosäuren des N-Terminus und einer Substitution von Glutaminsäure für Lysin in der Aminosäureposition 153 von nativem KGF aufweist.
Fig. 49 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 101)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 102)- Sequenzen von ΔN23/K(153)Q, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 23 Aminosäuren des N-Terminus und eine Substitution von Glutaminsäure für Lysin in der Aminosäureposition 153 von nativem KGF aufweist.
Fig. 50 zeigt die Nucleotid-(SEQ ID NO: 103)- und Aminosäure-(SEQ ID NO: 104)- Sequenzen von ΔN23/Q(152)E/K(153)E, einem KGF-Analogon, das eine Deletion der ersten 23 Aminosäuren des N-Terminus und eine Substitution von Glutaminsäure für Glutamin in der Aminosäureposition 152 von nativem KGF und von Glutaminsäure für Lysin in der Aminosäureposition 153 von nativem KGF aufweist.
Fig. 51 zeigt die Wirkung von ΔN23 auf Streptozotocin-induzierten Diabetes in Sprague- Dawley-Ratten.

Detaillierte Beschreibung

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neue Analoga von KGF zur Verfügung gestellt. Es wurde nun festgestellt, dass vier der Cysteinreste von nativem KGF (Cys¹ und Cys¹&sup5;, und Cys¹&sup0;² und Cys¹&sup0;&sup6;) in der Ausbildung von zwei Disulfidbrücken involviert sind. Cys&sup4;&sup0; ist nicht in die intramolekulare Disulfidbildung involviert. Somit enthält KGF zwei kleine Disulfidschleifen, die durch fast 90 Aminosäuren getrennt sind. Basierend auf den ersten Ergebnissen, schlägt die Bestimmung, welche Cysteinreste in den Disulfidbrücken involviert sind, vor, welche Cysteine frei sind, um unerwünschte intermolekulare Quervernetzungen oder intramolekulare Bindungen auszubilden, die bewirken, dass das Protein eine unerwünschte Tertiärstruktur annimmt (z. B., eine Konformation, die die Aktivität des Proteins verringert).
Überraschenderweise wurde herausgefunden, dass das Modifizieren eines KGF durch Deletieren oder Substituieren von Aminosäureresten für die Cysteinreste, die mit den Positionen 1 und 15 von KGF (Position 32 und 46 von SEQ ID NO: 2) korrespondieren, ein KGF-Analogon produziert, das eine wesentlich verbesserte Stabilität aufweist (d. h., verringerte Probleme, die durch falsche Rückfaltung, intermolekulare Disulfidbildung und/oder Proteinaggregation bewirkt werden). Zum Beispiel werden die KGF-Analoga im Allgemeinen in einer größeren Ausbeute des löslichen korrekt gefalteten Proteins aufgereinigt werden. Zudem, sobald das Material aufgereinigt ist, wird es stabiler in Bezug auf den pH, die Temperatur etc. im Vergleich zur Stabilität des ursprünglichen Moleküls sein. Obwohl es nicht vorgesehen ist, durch eine Theorie eingeschränkt zu werden, wird angenommen, dass Cys¹ und Cys¹&sup5; von KGF zusätzlich zur Ausbildung einer intramolekularer Disulfidbrücke und einer N-terminalen Disulfidschleife unter bestimmten Bedingungen auch als freie Cysteine existieren, welche in der Lage sind, intermolekulare Disulfidbrücken auszubilden, die in einer Proteininstabilität und Aggregation resultieren. Zudem wurde festgestellt, dass die Deletion der N-terminalen Disulfidschleife für die Rezeptorbindung oder mitogene Aktivität nicht wichtig ist.
Wie in dieser Erfindung verwendet, soll ein "KGF-Analogon" oder "Polypeptidanalogon von KGF" jedes der beschriebenen natürlich oder nicht natürlich vorkommenden Polypeptide bedeuten, die sich in der Struktur von einem KGF durch das Vorhandensein von Modifikationen in der Peptidsequenz, die mit den 24 N-terminalen Aminosäuren von KGF korrespondiert, unterscheiden, wobei Cys¹ und Cys¹&sup5; des KGF ersetzt oder deletiert sind. Die Weise, in welcher die Cysteine ersetzt oder deletiert werden, ist nicht wesentlich und umfasst, z. B., Polypeptidanaloga, die eine oder mehrere Aminosäuredeletion und/oder -substitutionen beinhalten. Dementsprechend stellt die Erfindung eine Familie von neuen Keratinozytenwachstumsfaktoren zur Verfügung. Diese Familie umfasst verschiedene Gruppen von Proteinen.
Eine Gruppe von KGF-Analoga umfasst Moleküle, in welchen die Cysteine in den Positionen 1 und 15 eines KGF mit Aminosäuren ersetzt sind, einschließlich solcher, die nicht natürlicherweise in Proteinen vorkommen. Strategien zur Herstellung der Substitutionsanaloga umfassen die Verwendung positionsgerichteter Mutagenese (Ho et al. (1989), Gene, 77: 51-59; Innis et al. "PRC Protocols", Academic Press, Inc., San Diego, CA). [KGF-Analoga, die eine Aminosäuresubstitution umfassen, werden durch den Rest bezeichnet, der in dieser Position in dem reifen Protein (Minussignalsequenz) wie in SEQ ID NO: 2 dargestellt, zu finden ist, gefolgt von der Aminosäureposition in Klammem und der neuen Aminosäure. Zum Beispiel wird ein Analogon, umfassend eine Substitution eines Cysteins zu Serin in Aminosäureposition 15 von KGF als "C(15)S" bezeichnet.] Vorzugsweise wird das Cystein in eine neutrale Aminosäure, wie Glycin, Valin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Tyrosin, Phenylalanin, Histidin, Tryptophan, Serin, Threonin und Methionin umgewandelt, wobei Serin, Threonin und Alanin am meisten bevorzugt sind, bedingt durch deren chemische Ähnlichkeit mit Cystein. Beispiel 1 zeigt im Detail die Herstellung von C(1,15)S unter Verwendung einer Genteilsynthese (in Verbindung mit anderen rekombinanten Techniken), gefolgt von der rekombinanten Expression in einer stabil transformierten bakteriellen Wirtszelle.
Eine andere Gruppe von KGF-Analoga umfasst Moleküle, bei denen die Cysteine in den Positionen 1 und 15 aus KGF deletiert worden sind. Unterschiedliche Strategien können eingesetzt werden, um solche KGF-Analoga zu entwickeln, wie N-terminales Tirunkieren und positionsspezifische Deletionen oder eine Kombination von beidem.
Eine "N-terminale Trunkierung" bezieht sich auf eine Modifikation eines KGF, wobei 1 bis 24 N-terminale Aminosäurereste des KGF, einschließlich Cys¹ und Cys¹&sup5;, dleletiert wurden. [KGF-Analoga, die eine Trunkierung von Aminosäuren umfassen, wenden durch den Rest bezeichnet, der an dieser Position in dem reifen Protein (Minussignalsequenz), das in SEQ ID NO: 2 dargestellt wird, deletiert wird, beginnend mit der Position der Deletion und der Zahl der deletierten Reste. Zum Beispiel wird ein KGF-Analogon, das eine N-terminale Trunkierung von 24 Resten des KGF umfasst, als "ΔN24"-Analogon bezeichnet.] Insbesondere umfasst von dieser Gruppe sind AN23-Analoga von nativem KGF, bei denen ein oder mehrere der Aminosäurereste 41-154 mit einem neutralen Rest oder negativ geladenem Rest substituiert sind, die ausgewählt sind, um ein Protein mit einer verringerten positiven Ladung zu bewirken, ausgewählt aus Arg&sup4;¹, GIn&sup4;³, Lys&sup5;&sup5;, Lys&sup9;&sup5;, Lys¹²&sup8;, Asn¹³&sup7;, Gln¹³&sup8;, Lys¹³&sup9;, Arg¹&sup4;&sup4;, Lys¹&sup4;&sup7;, Gln¹&sup5;², Lysss oder Thr¹&sup5;&sup4;, wobei Gln¹³&sup8;, Lys¹³&sup9;, Arg¹&sup4;&sup4;, Lys¹&sup4;&sup7;, Gln¹&sup5;² oder Lys¹&sup5;³ und Arg¹&sup4;&sup4; am meisten bevorzugt sind. Auch umfasst von dieser Gruppe sind ΔN23-Analoga von nativem KGF, die eine Ladungswechselmodifikation des Aminosäurerests 116, mehr bevorzugt die Substitution von Gly in der Position 116 aufweist.
Beispiel 1 beschreibt im Detail die Ausbildung systematischer N-terminaler Trunkierungen, die unter Verwendung einer Genteilsynthese in Verbindung mit anderen rekombinanten Techniken, gefolgt durch die rekombinante Expression in einer stabil transformierten bakteriellen Wirtszelle, erreicht werden. Solche beispielhaft dargestellten N- terminalen Trunkierungen umfassen ΔN15 bis ΔN24. Zudem zeigt Beispiel 3 im Detail die Expression in Säugetierzellkulturzellen von DNA, die natives KGF kodiert und heterogene N-therminal glycosylierte Isoformen, die Aufreinigung von vorzugsweise einer glycosylierten lsoform mit einer N-terminalen Trunkierung der Aminosäuren 1-23 der reifen Form des nativen KGF.
Im Gegensatz dazu bezeichnet eine positionsspezifische Deletion eine Modifikation eines KGF, bei dem ein oder mehrere Aminosäurereste (z. B., Cys¹ oder Cys¹&sup5;) entfernt werden. Wenn ein Cys¹ oder Cys¹&sup5; des KGF spezifisch deletiert wird, dann ist das Analogon um eine Aminosäure kürzer als das KGF. [KGF-Analoga, die eine Aminosäuredeletion umfassen, werden durch den Rest, der an dieser Position in dem reifen Protein (minus Signalsequenz) zu finden ist, gefolgt durch die Aminosäureposition in Klammern und ein Minuszeichen, bezeichnet. Zum Beispiel wird ein Analogon innerhalb dieser Gruppe, das eine Deletion von Cystein in Position 15 des KGF umfasst, als "C(15)-" bezeichnet.] Die positionsspezifischen Deletionen können unter Verwendung positionsgerichteter Mutagenese, wie oben beschrieben, hergestellt werden.
Auch umfasst innerhalb dieser Gruppe sind Analoga, bei denen Cys¹ und Cys¹&sup5; eines KGF durch Trunkierung und Deletion entfernt sind. Beispielsweise umfassen repräsentative KGF-Analoga die Trunkierung der ersten drei aminoterminalen Reste (Cys-Asn- Asp) des KGF oder die Trunkierung der ersten acht Aminosäuren (Cys-Asn-Asp-Met- Thr-Pro-Glu-Gln) des KGF, die mit der Deletion von Cystein in der Aminosäureposition 15 des KGF gekoppelt ist (diese Analoga werden jeweils als ΔN3/C(15)- und ΔN8/C(15) -bezeichnet). Da ein Methioninrest natürlicherweise in der vierten und neunten Aminosäureposition in nativem KGF vorkommt, wird kein zusätzliches Met-Kodon benötigt, um die korrekte Translationsinitiierung zu ermöglichen.
Eine noch weitere Gruppe umfasst Moleküle, in welchen Cysteine in den Positionen 1 und 15 von KGF durch Trunkierung und Substitution ersetzt werden. Zum Beispiel sind repräsentative KGF-Analoga ΔN3/C(15)S und ΔN8/C(15)S, Solche Analoga umfassen die Trunkierung der ersten drei aminoterminalen Reste eines KGF oder die Deletion der ersten acht aminoterminalen Reste eines KGF, verbunden mit der Substitution mit Cystein in der Aminosäureposition 15 mit einer anderen Aminosäure, z. B., Serin.
Wenn die KGF-Analoga biologisch hergestellt werden, d. h., sie sind die Produkte einer zellulären Expression im Vergleich zu den Produkten einer Festphasensynthese, einer proteolytischen oder enzymatischen Derivatisierung natürlich vorkommender Produkte, etc., dann werden die Nucleinsäuren, die solche Polypeptide kodieren, sich in einem oder mehreren Nucleotiden, im Vergleich zu der Nucleotidsequenz der nativen KGF, unterscheiden. Solche Poly-Nucleotide können exprimiert werden und das resultierende Polypeptid wird durch jegliches einer Reihe rekombinanter Technologieverfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, gereinigt.
DNA-Sequenzen, die für den gesamten oder einen Teil der KGF-Analoga kodieren, können unter anderem die Aufnahme von Kodons umfassen, die für die Expression in den ausgewählten Wirtszellen "bevorzugt" sind (z. B., "E. coli-Expressionskodons"); das Zurverfügungstellen von Positionen zur Spaltung durch Restriktionsenzyme; und das Zurverfügungstellen zusätzlicher initiierender, terminierender oder intermedärer Nucleotidsequenzen (z. B., einen initiierenden Methionin-Aminosäurerest für die Expression in E. coli-Zellen), zur Erleichterung der Konstruktion leicht, exprimierbarer Vektoren.
Die vorliegende Erfindung stellt auch rekombinante Moleküle oder Vektoren zur Verwendung in dem Verfahren zur Expression der Polypeptide zur Verfügung. Solche Vektoren können aus DNA oder RNA bestehen, können zirkulär, linear, einzelsträngig oder doppelsträngig in ihrer Natur sein und können natürlich vorkommen oder ein Zusammenschluss einer Reihe von Komponenten, sei es natürlich vorkommende oder synthetische, sein.
Viele Beispiele solcher Expressionsvektoren sind bekannt. Die Komponenten der Vektoren (z. B. Replikone, Selektionsgene, Verstärker, Promotoren und Ähnliche können aus natürlichen Quellen erhalten werden oder durch bekannte Verfahren synthetisiert werden. In jedem Fall werden für diese Erfindung nützliche Expressionsvektoren mindestens ein Expressionskontrollelement enthalten, das funktionell mit dem eingefügten Nucleinsäuremolekül assoziiert ist, das das KGF-Polypeptidanalogon kodiert. Dieses Kontrollelement ist verantwortlich für die Regulierung der Polypeptidexpression aus den Nucleinsäuremolekülen der Erfindung. Nützliche Kontrollelemente umfassen, z. B., das lac-System, das trp-System, die Operatoren und Promotoren aus dem Phagen λ, einen glykolytischen Hefepromotor, einen Promotor aus dem Hefe Saure-Phosphatase-Gen, einen Hefe-alpha-Fortpflanzungsfaktor-Promotoren, und Promotoren, die aus Adenovirus, Epstein-Barr-Virus, Polyoma- und Simianvirus abgeleitet sind sowie solche aus verschiedenen Retroviren. Allerdings sind viele andere Vektoren und Kontrollelemente, die zur prokaryontischen oder eukaryontischen Expression geeignet sind, auf dem Gebiet bekannt und können in der Durchführung dieser Erfindung eingesetzt werden.
Beispiele geeigneter prokaryontischer Klonierungsvektoren können Plasmide aus E. coli (z. B. pBr322, col E1, pUC und den F-Faktor) umfassen, wobei die Plasmide pCFM1156 (ATCC 69702), pCFM1656 (ATCC 69576) und pCFM3102 (in dem Abschnitt der Beispiele unten beschrieben) bevorzugt sind. Andere geeignete Expressionsvektoren, von denen viele Arten auf dem Gebiet für eine Säugetier- Insekten-, Hefe-, Pilz- und bakterielle Expression bekannt ist, können auch für diesen Zweck verwendet werden. Die Transfektion dieser Vektoren in geeignete Wirtszellen kann in der Expression der KGF- Analogapolypetide resultieren.
Wirtszellmikroorganismen, die in dieser Erfindung nützlich sind, können entweder prokaryontisch oder eukaryontisch sein. Geeignete prokaryontische Wirtszellen umfassen verschiedene E. coli- (z. B., FMS, BH101, DH5α, DH10 und MC1061), Pseudornonas-, Bacillus- und Streptomyces-Stämme, wobei E. coli bevorzugt ist. Geeignete eukaryontische Wirtszellen umfassen Hefe und andere Pilz, Insektenzellen, Pflanzenzellen, tierische Zellen, wie COS (z. B., COS-1 und COS-7) und CV-1-Affenzelllinien, 3T3-Linien, die aus Swiss, Balb-c oder NIH-Zellen, HeLa- und L-929-Mauszellen abgeleitet sind und CHO-, BHK- oder HaK-Hamsterzellen. Abhängig von der eingesetzten Wirtszelle werden rekombinante Polypeptide, die in diesem Sinne hergestellt werden, mit Säugetier- oder anderen eukaryontischen Kohlenhydraten glykosyliert sein oder können nicht-glykosyliert sein.
Das bevorzugte Herstellverfahren wird abhängig von vielen Faktoren und Überlegungen variieren; das optimale Herstellungsverfahren für eine gegebene Situation wird den Fachleuten auf dem Gebiet durch minimales Experimentieren zu erkennen sein. Das resultierende Expressionsprodukt kann dann bis nahe an die Homogenität unter Verwendung von auf dem Gebiet bekannten Verfahren gereinigt werden. Ein typisches Aufreinigungsverfahren für die prokaryontische Zellproduktion involviert das Aufreißen der Zellwände durch Hochdruck oder andere Mittel, Zentrifugation oder Filtration, um zellulären Debris zu entfernen, gefolgt durch Ionenaustauschchromatografie des Zellüberstandes oder des Filtrats und letztendlich Chromatografie mittels hydrophober Wechselwirkung. Wenn das Analogon in unlöslicher Form exprimiert wird, involviert eine andere Aufreinigungstechnik zuerst das Solubilisieren der Einschlusskörper, die die Analoga enthalten, gefolgt durch Ionenaustauschchromatografie, dann das Rückfalten des Proteins und letztendlich eine hydrophobe Wechselwirkungschromatografie. Beispielhafte Aufreinigungstechniken werden in U.S.S.N. 08/323,339, angemeldet am 13. Oktober, 1994, gelehrt. Im Allgemeinen lehrt U.S.S.N. 08/323,339 ein Verfahren zur Aufreinigung eines Keratinozytenwachstumsfaktors umfassend: (a) die Gewinnung einer Lösung, die den KGF umfasst; (b) die Bindung des KGF aus der Lösung von Teil (a) an einen Kationenaustauschharz; (c) das Eluieren des KGF in einer Eluatlösung aus dem Kationenaustauschharz; (d) entweder das Passieren der Eluatlösung aus Teil (c) durch eine geeignete Molekulargewichtsausschlussmatrix oder das Durchführen einer hydrophoben Wechselwirkungschromatografie mit der Eluatlösung von Teil (c); und (e) die Rückgewinnung des KGF aus der Molekulargewichtsausschlussmatrix oder hydrophoben Wechselwirkungschromatografie.
Natürlich können die Analocia schnell auf ihre physikalischen Eigenschaften hin untersucht werden, um ihre physikalische Eigenschaften zu beurteilen. Der Abschnitt der Beispiele zeigt verschiedene wohlbekannte Stabilitätstests, obwohl der spezifische Assay, der zur Untersuchung des Analogons verwendet wird, nicht kritisch ist. Zudem kann die Menge an biologischer Aktivität (z. B., Rezeptorbindung und/oder Affinität, mitogene, zellproliferative und/oder in vivo Aktivität) durch Verwendung einer Reihe von Assays untersucht werden, von denen einige im Abschnitt der Beispiele aufgeführt sind. Viele Assays sind wohlbekannt und können verwendet werden, um die KGF-Analoga schnell zu untersuchen, um zu bestimmen, ob diese eine akzeptable biologische Aktivität besitzen oder nicht. Ein solcher Assay testet spezifisch die KGF-Analoga auf die Fähigkeit, den KGF-Rezeptor (KGFR) durch Kompetition mit der 1251-KGF-Bindung zu binden (Bottaro et al. (1990), J. Biol. Chem., 265: 12767-12770; Ron et al. (1993), J. BioL Chem., 268: 2984-2988). Ein alternatives Verfahren zur Untersuchung von KGFR/KGF- Analogon-Wechselwirkungen involviert die Verwendung von Techniken, wie der Echtzeit-biospezifischen Wechselwirkungsanalyse (biospecific interaction analysis, BIA) (Felder et al. (1993), Molecular & Cellular Biology, 13: 1449-1455). Zusätzlich kann ein mitogener Assay verwendet werden, um die Fähigkeit der KGF-Analoga zu untersuchen, die DNA-Synthese zu stimulieren (Rubin et al. (1989), supra). Schließlich können Zellproliferationsassay verwendet werden, um die Fähigkeit der KGF-Analoga zu untersuchen, die Zellproliferation stimulieren (Falco et al. (1988), Oncogene, 2: 573-578). Durch Verwendung eines der vorgenannten Testsysteme können KGF-Analoga rasch auf deren biologische Aktivität hin untersucht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf KGF-Analoga gerichtet, welche die volle (d. h., zumindestens im Wesentlichen ähnliche) in vitro oder in vivo biologische Aktivität des nativen KGF beibehalten. Beispielhafte KGF-Analoga mit diesen Eigenschaften, wie durch einen oder mehrere der oben genannten Tests bestimmt, sind C(1,15)S, ΔN3/C(15)S, ΔN3/C(15)-, ΔN8/C(15)S, ΔNB/C(15)-, ΔN/5, ΔN16, ΔN17, ΔN18, ΔN19, ΔN20, ΔN21, ΔN22, ΔN23, ΔN24 oder ΔN23/R(144)Q.
Die KGF-Analoga können weiterhin modifiziert werden, um zusätzliche chemische Bereiche zu enthalten, die normalerweise nicht Bestandteil des Peptids sind. Solche derivatisierten Bereiche können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit und Ähnliches der KGF-Analoga verbessern. Die Bereiche können alternativ dazu jegliche unerwünschten Nebenwirkungen des Proteins und Ähnliches eliminieren oder vermindern. Es werden Bereiche offenbart, die in der Lage sind, solche Wirkungen zu vermitteln, z. B. in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th ed. Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Es können kovalente Modifikationen in das Molekül eingeführt werden durch das Reagieren von gezielten Aminosäureresten des Peptids mit einem organischen derivatisierenden Mittel, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten zu reagieren (T. E. Creighton (1983), PROTEINS: STRUCTURE AND MOLECULE PROPERTIES, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79-86). Polyethylenglycol ("PEG") ist einer dieser chemischen Funktionsbereiche, das in der Herstellung therapeutischer Proteinprodukte verwendet worden ist. Für einige Proteine wurde gezeigt, dass die Bindung an Polyethylenglycol gegen Proteolyse schützt, Sada, et al. (1991), 1 Fermentation Bioengineering, 71: 137-139, und es sind Verfahren für die Bindung bestimmter Polyethylenglycolbereiche verfügbar. Siehe U.S. Patent-Nr. 4,179,337, Davis et al., "Non-Immunogenic Polypeptides", erteilt am 18. Dezember 1979; und U.S. Patent-Nr. 4,002,531, Royer, "Modifying enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby", erteilt am 11. Januar 1977. Für einen Überblick siehe Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs. (Holcerberg und Roberts, (eds.) S, 367- 383 (1981)). Für Polyethylenglycol wurde einen Reihe von Mitteln verwendet, um die Polyethylenglycolmoleküle an das Protein zu binden. Im Allgemeinen werden Polyethylenglycolmoleküle mit dem Protein über eine reaktive Gruppe, die auf dem Protein zu finden ist, verbunden. Aminogruppen, wie solche auf Lysinresten oder an dem IV- Terminus sind zur Verbindung gut geeignet. Zum Beispiel besagt Royer (U.S. Pat. Nr. 4,002,531, siehe oben), dass die reduktive Alkylierung verwendet wurde, um Polyethylenglycolmoleküle an ein Enzym zu binden. EP 0 539 167, veröffentlicht am 28. April 1993, Wright, "Peg Imidates and Protein Derivates Thereof" besagt, dass Peptide und organische Verbindungen mit freien Aminosäuregruppe(n) mit einem Imidatderivat von PEG oder verwandten wasserlöslichen organischen PoUymeren modifiziert werden. U.S. Patent-Nr. 4,904,584, Shaw, erteilt am 27. Februar 1990, betrifft die Modifikation der Anzahl der Lysinreste in Proteinen für die Verbindung von Polyethylenglycolmolekülen mittels reaktiver Amingruppen.
In einer noch weiteren Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf eine Einzeldosisverabreichungseinheit einer medizinischen Formulierung gerichtet, die sicher parenteral oder oral verabreicht werden kann, um eine Krankheit in einem warmblütigen Tier (wie einem Menschen) zu behandeln. Solch eine medizinische Formulierung kann in der Form eines lyophilisierten oder anderweitig dehydrierten Therapeutikums oder Diagnostikums vorliegen, welches durch den Zusatz eines physiologisch verträglichen Lösungsmittels rekonstituiert werden kann. Das Solvenz kann jegliches Medium sein wie steriles Wasser, physiologische Salzlösung, Glucoselösung oder andere wässrige Kohlenhydrate sein (z. B., Polyole, wie Mannitol, Xylitol oder Glycerin), das in der Lage ist, die getrocknete Zusammensetzung aufzulösen, das mit dem gewählten Verabreichungsweg kompatibel ist und das nicht negativ mit dem Wirkprinzip und den eingesetzten Rekonstitutionsstabilisierungsmitteln wechselwirkt. In einer spezifischen Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf einen Kit zur Herstellung einer Einzeldosisverabreichungseinheit gerichtet. Der Kit enthält sowohl einen ersten Behälter, der ein getrocknetes Protein aufweist und einen zweiten Behälter, der eine wässrige Formulierung aufweist, die ein Rekonstitutionsstabilierungsmittel umfasst. Bezüglich der Konzertration des Proteins in der Lösung, dem Lösungsvolumen, das in jeden Container gegeben wird und die Kapazität des Behälters (untereinander verwandte Parameter, die in geeigneter Weise modifiziert werden können, abhängig von der gewünschten Konzentration des aktiven Wirkstoffes in der endgültigen Dosierungseinheit) können diese innerhalb weiter Bereiche, die dem Fachmann wohlbekannt sind, variieren.
KGF-Analoga gemäß der Erfindung können als therapeutische und diagnostische Agenzien und als Forschungsreagenzien nützlich sein. Somit können die KGF-Analoga in in vitro und/oder in vivo diagnostischen Untersuchungen verwendet werden, um die Menge an KGF in einem Gewebe oder einer Organprobe zu quantifizieren oder Zellen zu bestimmen und/oder isolieren, die KGFR exprimieren (Bottaro et al. (1990), 1 Biol. Chem., 265: 12767-12770; Ron et al. (1993), 1 Biol. chem., 268: 2984-2988). In Gewebe- oder Organuntersuchungen wird es zu weniger Radioaktivität aus der ¹²&sup5;I-KGF-Analogonbindung an KGFR, im Vergleich zu einer standardisierten Bindungskurve des 125I-KGF- Analogons, kommen, bedingt durch die nicht markierte native KGF-Bindung an KGFR. In ähnlicher Weise kann die Venrwendung des ¹²&sup5;I-KGF-Analogons verwendet werden, um die Gegenwart von KGFR in verschiedenen Zelltypen nachzuweisen.
Diese Erfindung richtet sich auch auf die Verwendung eines KGF-Analogons in der Herstellung von Antikörpern, die gegen das Peptid gemacht werden, wobei diese Antikörper auch das native KGF binden. In dieser Ausführungsform sind die Antikörper monoklonal oder polyklonal in ihrer Herkunft und werden unter Verwendung eines KGF-Analogons hergestelt. Die resultierenden Antikörper binden vorzugsweise an natives KGF, vorzugsweise, wenn das Protein in seiner nativen (biologisch aktiven) Konformation vorliegt. Diese Antikörper können zur Nachweis oder zur Aufreinigung des nativen KGF verwendet werden.
Zudem richtet sich die Erfindung auf die Verwendung der KGF-Analoga in der Suche nach hoch affinen- oder gering affinen KGF-Bindungsmolekülen, die therapeutische Anwendungen aufweisen, z. B. als ein Weg zur effizienten KGF-Übermittlung oder als ein Inhibitor der KGF-Aktivität. Die thermische Stabilität der KGF-Analoga ist wichtig, um derartige Bindungsmoleküle unter physiologischen Bedingungen zu identifizieren (d. h., bei 37ºC), da deren Affinität für KGF stark temperaturabhängig sein könnte und nicht aus der Affinität, die bei 4ºC zu beobachten ist, voraussagbar ist.
Für in vivo-Verwendungen können die KGF-Analoga mit Zusatzstoffen zusammen formuliert werden. Solche Additive umfassen Puffer, Trägermittel, Stabilisierungsmittel, Hilfsmittel, Konservierungsmittel, tonizitätsverändernde Mittel, Antioxidationsmittel und Ähnliche (z. B. viskositätsanpassende Agenzien oder Streckmittel). Die Auswahl der spezifischen Additive wird von der Lagerungsform (d. h., Flüssigkeit oder lyophylisiert) und den Verabreichungsarten des KGF-Analogons abhängen. Geeignete Formulierungen, die auf dem Gebiet bekannt sind, sind in REMINGTON'S PHARMACEUTlCAL SCIENCES (letzte Ausgabe), Mack Publishing Company, Easton, PA, zu finden.
Die KGF-Analoga können in therapeutisch wirksamen Mengen zu Geweben gegeben werden, die spezifisch dahingehend charakterisiert worden sind, dass sie einen Schaden aufweisen in Bezug auf oder klinisch nicht ausreichende Mengen an Nicht- Fibroblastenepithelzellen aufweisen. Gebiete, in denen KGF-Analoga erfolgreich verabreicht werden können, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf die Stimulierung, Proliferation und Differenzierung von adnexalen Strukturen, wie Haarfollikel, Schweißdrüsen und Talgdrüsen in Patienten mit Verbrennungen oder anderen Teil- oder Gesamtdickenverletzungen; beschleunigte Reepithelialisierung von Läsionen, die durch Epidermolyse bullosa ausgelöst sind, welches ein Defekt in der Haftung der Epidermis an die darunterliegende Dermis ist, was in häufigen, offenen, schmerzvollen Blasen resultiert, die eine starke Morbidität bewirken können; das Verhindern Chemotherapieinduzierter Alopecia und die Behandlung von männlicher Musterglatzköpfigkeit oder des progressiven Verlusts von Haaren in Männern und Frauen; die Behandlung von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren; die Behandlung entzündlicher Darmkrankheiten, wie Crohn's-Krankheit (die primär den Dünndarm betrifft) und die geschwürartige Kollitis ) die primär den Dickdarm betrifft); das Verhindern oder Vermindern der Darmtoxizität in Strahlungs- oder Chemotherapiebehandlungsstrategien während der Behandlung (z. B., Vorbehandlung und/oder Nachbehandlung) zur Induktion einer cytoprotektiven Wirkung oder Regeneration oder beidem; die Stimulierung der Herstellung von Schleimhaut über den gesamten gastointestinalen Trakt; das Induzieren der Proliferation und Differenzierung von Typ II-Pneumocyten, was helfen kann, Krankheiten, wie die hyaline Membrankrankheit zu behandeln oder zu verhindern (d. h., Säuglingsatemnotstresssyndrom und bronchopulmonare Dysplasie) in Frühgeborenen; das Stimulieren der Proliferation und Differenzierung des bronchialen und/oder alveolaren Epithels bei akutem oder chronischem Lungenschaden oder -insuffizienz, bedingt durch Inhalationsverletzungen (einschließlich hoher Sauerstoffmengen), Emphysem, der Verwendung von lungenschädigenden Chemotherapeutika, Ventilatonstrauma oder anderen lungenschädigenden Umständen; das Erhöhen der Leberfunktion zur Behandlung oder Verhinderung der Leberzirrhose, fulminantes Leberversagen, ein Schaden, der durch akute virale Hepatitis und/oder toxische Angriffe auf die Leber bedingt ist; das Induzieren kornealer Zellregeneration, z. B. in der Behandlung kornealen Abriebs; das Induzieren der Epithelzellregeneration zur Behandlung progressiver Mundschleimhauterkrankungen; das Induzieren der Regeneration tympanischer Epithelzellen zur Behandlung eines Trommelfellschadens und der Behandlung oder Verhinderung des Einsetzens von Diabetes mellitus oder als unterstützendes Mittel in der Behandlung einer Insehzelltransplantation.
Einem Patient, der der Proliferation von Nicht-Fibroblastenepithelzellen bedarf, wird eine wirksame Menge eines KGF-Analogons verabreicht. Eine "wirksame Menge" ist die Menge des KGF-Analogons, die benötigt wird, um die gewünschte Antwort in einem Patienten, der behandelt wird, auszulösen und wird somit im Allgemeinen durch den betreuenden Arzt bestimmt. Faktoren, die die Menge des zu verabreichenden IKGF- Analogons beeinflussen, wären das Alter und der Allgemeinzustand des Patienten, die zu behandelnde Krankheit, etc., umfassen. Typische Dosierungen werden im Bereich von 0,001 mg/kg Körpergewicht bis 500 mg/kg Körpergewicht liegen.
Die KGF-Analoga können sicher parenteral (z. B. über IV-, IT-, IM-, SC- oder IP-Wege), oral oder topisch an warmblütige Tiere (wie Menschen) verabreicht werden. Die KGF- Analoga können einmalig verwendet werden oder wiederholt verabreicht werden, abhängig von der Krankheit und dem Zustand des Patienten. In einigen Fällen kann das KGF-Analogon als Begleitmittel für andere Therapien verabreicht werden und auch zusammen mit anderen pharmazeutischen Zubereitungen.
Die folgenden Beispiele sind beigefügt, um die vorliegende Erfindung vollständiger zu illustrieren.

Beispiele

Standardverfahren für viele der Prozeduren, die in folgenden Beispielen beschrieben werden oder geeignete dazu alternative Prozeduren werden in den weithin anerkannten Handbüchern der Molekularbiologie, wie z. B. Molecular Cloning, Zweite Ausgabe, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) und Current Protocols in Molecular Biology, Ausabel et al., Greene Publishing Associates/Wiley Interscience, New York (1990) zur Verfügung gestellt.

Beispiel 1: Herstellung einer DNA, die für KGF und KGF-Analoga kodiert

Die Klonierung des menschlichen KGF-Gens in voller Länge (kodierend für ein Polypeptid mit der Sequenz des nativen KGF) wurde sowohl durch Polymerasekettenreaktion (PCR) von RNA aus einer tierischen Zelle wie auch durch PCR von chemisch synthetisierten (E. coli-optimiertem Kodon) Oligonukleotiden ("OLIGOs") durchgeführt. Beide Verfahren werden im Folgenden beschrieben:
Es wurde eine PCR-Amplifikation unter Verwendung von RNA, die aus Zellen isoliert wurde, von denen bekannt ist, dass sie das Polypeptid herstellen, durchgeführt. Zuerst wurden die Zellen aus einer menschlichen Fibroblastenzellinie AG1523A (erhalten vom Human Genetic Mutant Cell Culture Repository Institue For Medical Research, Camden, New Jersey) mit Guanidiniumthiocyanat aufgeschlossen, gefolgt durch Extraküon (gemäß dem Verfahren von Chomyzinski et al. (1987), AnaL Biochem., 172: 156). Unter Verwendung eines Standard Reverse Transkriptase-Protokolls für Gesamt-RNA wurde die KGF-cDNA hergestellt. Eine PCR (PCR#1)-Amplifikation des KGF-Gens wurde unter Verwendung der KGF-cDNA als Template und den Primern OLIGO#1 und OLIGO#2 durchgeführt, die DNA-Sequenzen direkt 5' und 3' des KGF-Gens kodieren [Modell 9600 Thermocycler (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT); 28 Zyklen; jeder Zyklus besteht aus einer Minute bei 94ºC zur Denaturierung, zwei Minuten bei 60ºC für die Doppelstrangausbildung und drei Minuten bei 72ºC zur Verlängerung]. Eine kleine Probe des PCR#1-Produkts wurde dann als Template für eine zweite KGF-PCR (PCR#2)- Amplifikation verwendet, die identische zu den oben beschriebenen Zyklusbedingungen aufwies, außer einer 50ºC Doppelstrangausbildungstemperatur. Zur Expressionsklonierung des KGF-Gens wurden überlappende PCR-Primer verwendet, um gut handhabbare Restriktionsschnittstellen an beiden Enden des KGF-Gens herzustellen. OLIGO#3 und OLIGO#4 wurden verwendet, um das KGF-DNA-Produkt aus PCR#2 zu nnodifizieren, damit es jeweils Mlu-I und BamHI-Restriktionsschnittstellen an den 5'- und 3'-Enden des Gens umfasst [PCR#3; 30 Zyklen; jeder Zyklus besteht aus einer Minute bei 94ºC zur Denaturierung, zwei Minuten bei 60ºC für die Doppelstrangausbildung und drei Minuten bei 72ºC zur Verlängerung]. Diese DNA wurde anschließend mit MluI und BamHI geschnitten, phenolextrahiert und ethanolpräzipiziert. Sie wurde dann resuspendiert und (unter Verwendung von T4-Ligase) in ein pCFM1156-Plasmid ligiert (Fig. 2A), das eine "RSH"-Signalsequenz enthielt, um das Konstrukt RSH-KGF (Fig. 3) herzustellen.
Die Ligationsprodukte wurden in den E. coli-Stamm FM5 (ATCC: 53911) transformiert (gemäß dem Verfahren von Hanahan (1983), J. Mol. Biol., 166: 557) und auf LB+ Kanamycin bei 28ºC ausplattiert. Es wurden verschiedene Transformanten ausgewählt und in kleinen Flüssigkulturen, die 20 ug/ml Kanmycin enthalten, wachsen gelassen. Das RSH-KGF-Plasmid wurde aus den Zellen von jeder Kultur isoliert und DNA-sequenziert. Bedingt durch eine interne NdeI-Schnittstelle in dem KGF-Gen war es nicht möglich, die native Gensequenz direkt in den gewünschten Expressionsvektor mit den Restriktionsschnittstellen von NdeI und BamHI zu klonieren. Dieses wurde mittels einer Drei-Wege- Ligation erreicht. Plasmid RSH-KGF wurde an den einzeln vorkommenden Restriktionsschnittstellen von BsmI und SstI geschnitten und ein -3 kbp DNA-Fragment (enthaltend das 3'-Ende des KGF-Gens) wurde nach einer Elektrophorese durch ein 1%-iges Agarosegel isoliert. Eine PCR (PCR#4) wurde, wie für PCR#3 beschrieben, ausgeführt, außer der Substitution von OLIGO#5 für OLIGO#3. Das PCR-DNA-Produkt wurde dann mit NdeI und BsmI geschnitten-undein 3 tLbp-DNA-Fragment wurde nach Elelktrophorese durch ein 4%iges Agarosegel isoliert. Das dritte Stück der Ligation ist ein 1,8 kbp- DNA-Fragment von pCFM1156, geschnitten mit NdeI und SstI, das nach Elektrophorese durch ein 1%iges Agarosegel isoliert wird. Nach der Ligation (T4-Ligase), Transformation, Kanamycinselektion und DNA-Sequenzierung, wie oben beschrieben, wurde ein Klon gepickt, der das Konstrukt in Fig. 4 enthält und das Plasmid als KGF bezeichnet. Bedingt durch eine interne ribosomale Bindungsstelle, die trunkierte Produkte produzierte, wurde die KGF-DNA-Sequenz zwischen den einzeln vorkommenden KpnI- und EcoRI-Schnittstellen mit chemisch synthetisierten OLIGOs ersetzt (OLIGO#6 bis OLIGO#11), um die Verwendung der internen Startposition (Fig. 5) zu minimieren.
Die OLIGOs wurden mit T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert und dann hitzedenaturiert. Die einzelsträngigen (ss) OLIGOs wurden dann in ein ds-DNA-Fragment durch langsames Absenken lassen der Temperatur auf Raumtemperatur überführt. T4-Ligase wurde dann verwendet, um sowohl die internen OLIGO-klebrigen Enden wie auch das gesamte ds-OLIGO-Fragment mit dem KGF-Plasmid kovalent zu verbinden, das mit KpnI und EcoRI geschnitten worden war. Das neue Plasmid wurde KGF (dsd) bezeichnet.
Ein vollständig E. coli-kodonoptimiertes KGF-Gen wurde durch PCR-Amplifikation der chemisch synthetisierten OLIGOs#12 bis 24 konstruiert.
OLIGOs#12 bis 24 wurden so entwickelt, dass die gesamte DNA-Sequenz, die den nativen KGF kodiert, durch OLIGOs von entweder dem "Watson"- oder dem "Crick"-Strang dargestellt wurde und nach PCR-Amplifikation die gewünschte doppelsträngige DNA- Sequenz (Fig. 6) produzieren würde [PCR#5, Modell 9600 Thermocycler, Perkin-Elmer Cetus]; 21 Zyklen, jeder Zyklus bestand aus 31 Sekunden bei 94ºC zur Denaturierung, 31 Sekunden bei 50ºC zur Doppelstrangausbildung und 31 Sekunden bei 73ºC zur Verlängerung; nach den 21 Zyklen wurde die PCR mit einem abschließenden Verlängerungsschritt von 7 Minuten beendet]. Nach der PCR-Amplifikation wurde das DNA- Fragment mit XbaI und BamHI geschnitten und das 521 bp-Fragment in das Expressionsplasmid pCFM1156 ligiert, das mit den gleichen Enzymen geschnitten worden war. PCR#5 verwendete die Außenprimer (100 umol/100 ul rxn) OLIGO#12 und OLIIGO#13 und 1 ul/100 ul rxn eines KGF-Templates, das durch Ligation (durch T4-Ligase) von LOIGO#14 bis OLIGO#19 (OLIGO#15 bis OLIGO#18 wurden mit T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert) unter Verwendung von OLIGO#20 bis OLIGO#24 als Hilfsoligos (Jayaraman et al. (1992), Biotechniques, 12: 392) für die Ligation abgeleitet wurde. Das fertige Konstrukt wurde KGF genannt (kodonoptimiert).
Alle hierin beschriebenen KGF-Analoga sind teilweise aus den DNA-Sequenzen aufgebaut, die in KGF (dsd) oder KGF (kodonoptimiert) oder einer Kombination von den beiden zu finden sind. Die Sequenzen werden weiterhin durch das Einfügen in gut handhabbare Restriktionsschnittstellen von DNA-Sequenzen modifiziert, die die jeweiligen KGF-Analogonaminosäuren kodieren, die unter Verwendung einer oder mehrerer der oben beschriebenen Techniken für die DNA-Fragmentsynthese hergestellt wurden. Alle der Analoga können in ihrer Gesamtheit durch die oben beschriebenen Techniken hergestellt werden. Allerdings wurden als ein Teil der allgemeinen OLIGO-Entwicklung optimierte E. coll-Kodons verwendet, wo dieses angemessen war, obwohl die Gegenwart von E. coli-optimierten Kodons zum Teil oder in toto von einem der Gene, die untersucht wurden, die Ausbeute des Proteins nicht wesentlich erhöhte, die aus kultivierten bakteriellen Zellen erhalten werden konnten. Die Fig. 7 bis 24 und 37 bis 50 zeigen als handliche Beispiele bestimmte KGF-Analoganukleotid- und Aminosäuresequenzkonstruktionen: C(1,15)S (Fig. 7); ΔN3/C(15)S (Fig. 8); ΔN3/C(15)- (Fig. 9); ΔN8/C(15)S (Fig. 10); ΔN8/C(15)- (Fig. 11); ΔN15 (Fig. 12); ΔN16 (Fig. 13); ΔN17 (Fig. 14); ΔN18 (Fig. 15); ΔN19 (Fig. 16); ΔN20 (Fig. 17); ΔN21 (Fig. 18); ΔN22 (Fig. 19); ΔN23 (Fig. 20); ΔN24 (Fig. 21); C(1,15)S/R(144)E (Fig. 22); C(1,15)SIR(144)Q (Fig. 23); ΔN23/R(144)Q (Fig. 24); C(1,15,40)S (Fig. 37); C(1,15,102)S (Fig. 38); C(1,15,102,106)S (Fig. 39); ΔN23/N(137)E (Fig. 40); ΔN23/K(139)E (Fig. 41); ΔN23/K(139)Q (Fig. 42); ΔN23/R(144)A (Fig. 43); ΔN23/R(144)E (Fig. 44); ΔN23/R(144)L (Fig. 45); ΔN23/K(147)E (Fig. 46); ΔN23/K(147)Q (Fig. 47); ΔN23/K(153)E (Fig. 48); ΔN23/K(153)Q (Fig. 49) und ΔN23/Q(152)E/K(153)E (Fig. 50). Alle die hierin beschriebenen KGF- Analogonkonstruktionen wurden DNA-Sequenz-bestätigt.

Beispiel 2: Herstellung in E coli

A. Expression von KGF-ANALOGA

Es wurden drei verschiedene Expressionsplasmide in der Klonierung der KGF-Analogagene verwendet. Diese waren pCFM1156 (ATCC# 69702), pCFM1656 (ATCC# 69576) und pCFM3102 (jeweils die Fig. 2A, 2B und 2C). Das Plasmid p3102 kann aus dem Plasmid pCFM1656 abgeleitet werden durch Herstellen einer Serie von positionsgerichteten Base-Änderungen mit PCR-Überlappender-Oligomutagenese. Angefangen mit der BgIII-Schnittstelle (pCFM1656-Plasmid bp # 180), direkt 5' zum Plasmidreplikationspromotor, PcopB, und in Richtung der Plasmidreplikationsgene sind die Basenpaaränderungen wie folgt:
Wie oben zu sehen ist, sind pCFM1156, pCFM1656 und pCFM3102 zueinander sehr ähnlich und enthalten viele gleiche Restriktionsschnittstellen. Die Plasmide wurden aus Handhabungsgründen ausgewählt und die Vektor-DNA-Komponenten können leicht für den Zweck neuer Konstrukte ausgetauscht werden. Die für alle Klonierungen verwendete Wirtszelle war der E. coli-Stamm FM5 (ATCC: 53911) und die Transformationen wurden durchgeführt (gemäß dem Verfahren von Hanahan (1983), supra) oder durch Elektroelution mit einem Gene PulserTM-Transfektionsapparat (BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA) gemäß den Instruktionen des Herstellers.
Zuerst wurde ein kleines frisch kultiviertes Inokulum des gewünschten rekombinanten E. coli-Klons, der das gewünschte Konstrukt auf einem der drei pCFM-Vektoren enthält, durch Transferieren von 0,1 ml einer gefrorenen Glycerinstammlösung des geeigneten Stammess in ein 2 l-Gefäß, enthaltend 500 ml Luria-Brühe, gestartet. Die Kultur wurde bei 30ºC 16 Stunden geschüttelt, wonach die Kultur in einen 15 l-Fermentor transferiert wurde, der 8 l an sterilem Kesselmedium enthielt (Tsai et al. (1987), J. Industrial Microbiol., 2: 181-187).
Die Futterkesselfermentation fängt mit dem Füttern von Futter # 1-Medium (Tsai et al. (1987), supra) an. Wenn die OD600 35 erreichte, wurde die Expression des gewünschten KGF-Analogons durch schnelles Erhöhen der Kulturtemperatur auf 37ºC für zwei Stunden induziert, die dann auf 42ºC erhöht wurde, um den CI-Repressor zu denaturieren. Der Zusatz von Futter 1 wurde zugunsten von Futter 2 abgesetzt und die Zugabe von diesem wurde auf 300 ml/h angesetzt. Futter 2 enthielt 175 g/l Trypticase-pepton, 87,5 g/l Hefeextrakt und 260 g/l Glukose. Nach einer Stunde bei 42ºC wurde die Kulturtemperatur auf 36ºC verringert, wobei diese Temperatur dann für weitere 6 Stunden beibehalten wurde.
Die Fermentation wurde dann gestoppt und die Zellen wurden durch Zentrifugation in Plastiktüten geerntet, die in 1 l-Zentrifugenflaschen plaziert wurden. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 400 upm für 60 Minuten pelletiert, wonach die Zellüberstände entfernt wurden und die Zellpaste bei -90ºC eingefroren wurde.
Nach der Expression verschiedener KGF-Analoga in E. coli wurden native KGF-Proteine C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)E, C(1,15)S/R(144)Q, ΔN15, ΔN23ΔN und ΔN23/R(144)Q Proteine unter Verwendung des folgenden Verfahrens aufgereinigt. Die Zellpaste aus einer Fermentation mit hoher Zelldichte wurde bei 4ºC in 0,2 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, pH 7,5 als 10-20%ige-Lösung (Gewicht pro Volumen) unter Verwendung eines geeigneten hochscherenden Mischers suspendiert. Die suspendierten Zellen wurden dann lysiert durch dreimaliges Passieren der Lösung durch einen Homogenisator (APV Gaulin, Inc., Everett, MA). Das ausfließende Homogenat wurde auf 4-8ºC unter Verwendung eines geeigneten Hitzeaustauschers gekühlt. Zelltrümmer wurden dann durch Zentrifugation des Lysats in einer J-6BTM-Zentrifuge (Beckman Instruments, Inc., Brea, CA), die mit einem JS 4.2-Rotor ausgestattet war, bei 4,200 upm für 30-60 Min. bei 4ºC entfernt. Die Überstände wurden dann vorsichtig abgegossen und auf eine zuvor hergestellte 450 ml (5 cm · 23 cm)-Säule von S-Sepharose Fast FIowTM-Harz aufgetragen (Pharmacia, Piscataway, NJ), die mit 0,2 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, pH 7,5 bei 4ºC equilibriert worden war. Danach wurde die Säule mit fünf Säulenvolumen (2250 ml) 0,4 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, pH 7,5 bei 4ºC gewaschen. Das gewünschte Protein wurde durch Waschen der Säule mit 5 l 0,5 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, pH 7,5 gewaschen. 50 ml- Fraktionen wurden gesammelt und die A280 des Ausflusses wurde kontinuierlich beobachtet. Die bei A260 als Eluat enthaltendes Material identifizierten Fraktionen wurden dann durch SDS-PAGE durch 14% Gele analysiert, um die Anwesenheit des gewünschten Polypeptids zu bestätigen.
Die Fraktionen, die Proteine von Interesse enthalten, wurden dann zusammengefügt, gefolgt von dem Zusatz eines gleichen Volumens an destilliertem Wasser. Die verdünnte Probe wurde dann auf eine zuvor hergestellte 450 ml (5 cm · 23 cm)-Säule von S-Sepharose Fast Flow aufgetragen, die mit 0,4 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, pH 6,8 bei 4ºC equilibriert worden war. Die Säule wurde mit 2250 ml 0,4 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, pH 6,8 gewaschen und das Protein unter Verwendung eines 20fachen-Säulenvolumens eines linearen Gradienten im Bereich von 0,4 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, pH 6,8 bis 0,6 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, pH 6,8 eluiert. Wiederum wurden 50 ml-Fraktionen unter konstanter A&sub2;&sub8;&sub0;-Beobachtung des Ausflusses gesammelt. Die Fraktionen, die das Protein enthalten (bestimmt durch 14% SDS-PAGE) wurden dann zusammengeführt, gefolgt von einer Aufkonzentrierung durch eine YM-10-Membran (Ausschluss bei einem Molekulargewicht von 10.000) in einer 350 ml-Rührzelle (Amicon, Inc. Mayberry, MA) auf ein Volumen von 30-40 ml.
Das Konzentrat wurde dann auf eine zuvor hergestellte 1300 ml (4,4 cm · 85 cm)-Säule von Superdex-75TM-Harz (Pharmacia) aufgetragen, die mit Säulenpuffer equilibriert worden war, der 1 · PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, "D-PBS", Calcium- und Magnesium-frei) oder 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, pH 7,0 umfasst. Nachdem die Probe in die Säule hineinlaufen gelassen wurde, wurde das Protein aus der Gelfiltrationsmatrix unter Verwendung von Säulenpuffer eluiert. Danach wurden 10 ml-Fraktionen wiedergewonnen und diejenigen, die das Analogon (bestimmt durch 14% SDS-PAGE) enthalten, wurden zusammengeführt. Typischerweise lag die Proteinkonzentration bei 5-10 g/ml in dem resultierenden Pool. Alle die oben genannten Verfahren wurden bei 4-8ºC ausgeführt, es sei denn dieses wird anders spezifiziert.
Ein alternatives Aufreinigungsverfahren wurde verwendet, um natives KGF, C(1,15)S und ΔN23 aufzureinigen. Das Verfahren involviert die folgenden Schritte und, soweit dies nicht anders spezifiziert wird, wurden alle Verfahren, Lösungen und Materialien bei 23 ± 5ºC durchgeführt.
Nach dem Komplettieren der Produktionsphase einer bakteriellen Fermentation wurde die Zellkultur auf 4-8ºC gekühlt und die Zellen wurden durch Zentrifugation oder ein ähnliches Verfahren geerntet. Auf der Basis der erwarteten Ausbeute an Protein pro Gewichtseinheit Zellpaste und der Menge an benötigtem aufgereinigten Protein wurde eine geeignete Menge an Zellpaste nach Gewicht in einer milden Pufferlösung von 20 mM NaPO&sub4;, 0,2 M NaCl, pH 7,5 suspendiert, die ungefähr fünfmal das Gewicht der zu suspendierenden Zellpaste aufwies. Die Zellen wurden zu einer homogenen Lösung unter Verwendung eines hochscherenden Mischers dispergiert. Die Temperatur der Zellpastendispersion wurde während der Homogenisation bei 4-8ºC gehalten.
Die Zellen wurden dann durch Druck lysiert, z. B. durch zweimaliges Passieren der Zellpastendispersion durch einen geeignet dimensionierten Zellhomogenisator. Das Homogenisat wurde bei 5 ± 3ºC gekühlt gehalten. Um das Zelllysat aufzuklären, wurde ein zuvor hergestellter Tiefenfilterkasten (Cuno, Inc., Meriden, CT), der mit einem Filter, der eine geeignete Menge Filteroberfläche aufweist, und mit einem geeigneten Volumen von 0,2 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, pH 7,5 equilibriert worden war, eingesetzt. Das Equilibrieren und Klären wurde bei 5 ± 3ºC durchgeführt. Vor dem Klären wurde eine geeignete Menge eines geeigneten Filterhilfstoffes verwendet, um den Filter vorzubeschichten und ausgiebig mit dem Zelllysat vermischt, wonach das Lysat durch Passieren der Lösung durch den Filterapparat geklärt wurde. Der Filter wurde mit 0,2 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, pH 7,5 gewaschen. Das Filtrat und jede nachfolgende Waschlösung wurde in einem gekühlten Behälter von geeigneter Kapazität gesammelt, der während der gesamten Zeit die Temperatur unter 10ºC gehalten wurde.
Nach dem Klären wurde das Lysat dann durch eine zuvor hergestellte Säule von SP- Sepharose Fast Flow passiert, die mindestens 1 ml Harz pro 2 g Zellpaste enthält. Die Säule von SP-Sepharose Fast Flow wurde mit kaltem (5 ± 3ºC) 0,2 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, pH 7,5 equilibriert. Die Temperatur der Kolonne wurde bei weniger als 10ºC gehalten. Das geklärte Lysat (5 ± 3ºC) wurde dann auf die Ionenaustauschsäule geladen, wobei die Absorption des Eluats bei 280 nm (A280) kontinuierlich beobachtet wurde. Nach der Probenbeladung wurde die Säule mit kaltem 0,2 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, pH 7,5 gewaschen, gefolgt durch Waschen mit 0,3 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, pH 4,7 bei 23 ± 5ºC.
Um das gewünschte Protein zu eluieren, wurde ein linearer Gradient im Bereich von 0,2-1 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, pH 7,5 verwendet. Das Rohprodukt wurde in verschiedenen Fraktionen auf der Basis der A&sub2;&sub8;&sub0; des Eluats gesammelt. Nach der Elution wurden diese Fraktionen zusammengeführt und das Volumen rotiert.
Um freie Sulfhydrylgruppen zu oxidieren, wurde ein Oxidationsschritt durchgeführt. Für Proteine mit geänderten Cysteinmustern im Vergleich zu nativem KGF, wurde ein Oxidationsmittel (z. B. Cystamindihydrochlorid oder ein anderes geeignetes Oxidationsmittel, z. B., Cystein, oxidiertes Glutathion oder divalentes Kupfer) zu einer Endkonzentration von 1-20 mM hinzugefügt und der pH wurde auf 7,5 ± 0,5 angepasst, wobei ein pH von 9,0 ± 0,3 bevorzugt ist, wenn Cystamindihydrochlorid verwendet wurde. Die Oxidation wurde bei 10-30ºC für einen geeigneten Zeitraum durchgeführt. Für das native KGF-Protein, wurde die Oxidation durch das Hinzufügen einer geeigneten Menge (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, wie 1-2 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, Anpassen des pH auf 7,5 ± 0,5 und das Halten der Temperatur bei 23 ± 5ºC für einen geeigneten Zeitraum durchgeführt.
Nach der Oxidation wurde der pH der Lösung auf zwischen 6,5 und 9,5 angepasst. Wenn notwendig, wurde festes (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; zu der Lösung in einer Endkonzentration von 2 M hinzugefügt. Um Feststoffe zu entfernen, wurde die Lösung durch geeignete Klärfilter passiert.
Das filtrierte oxidierte Produkt wurde dann einer hydrophoben Wechselwirkungschromatografie (HIC) ausgesetzt. Die HIC-Matrize war Butyl-650M ToyopearlTM-Harz (Tosohaas, Inc., Montgomeryville, PA). Die proteinenthaltende Lösung wurde auf die Säule geladen, die zuvor mit 2 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, pH 7,0 equilibriert worden war. Nach der Probenbeladung wurde die Säule mit 2 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, pH 7,0 gewaschen. Das gewünschte Produkt wurde dann eluiert unter Verwendung eines sich verringernden linearen (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Gradienten im Bereich von 2-0 M, entwickelt in 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, pH 7,0. Wenn das gewünschte Protein zu eluieren begann, wie durch die Erhöhung in der A&sub2;&sub8;&sub0; des Eluats angezeigt, wurden Fraktionen gesammelt. Proben von jeder Fraktion wurden durch SDS-PAGE analysiert. Die Fraktionen, die das gewünschte Protein enthalten, wurden zusammengeführt, ausgiebig vermischt und das Volumen des Pools wurde bestimmt sowie die Konzentration des Proteins darin.
Das zusammengeführte HIC-Protein-enthaltende Eluat wurde dann aufkonzentriert und der Elutionspuffer ausgetauscht. Typischerweise wurden die Proteine auf 5,0-10,0 mg/ml konzentriert. Es wurde eine Ultrafiltration unter Verwendung eines Ultrafiltrationssystems durchgeführt, das mit einem PTGC PelliconTM-Kassettensystem (Millipore, Inc., Bedford, MA) mit einer geeignet dimensionierten Ausschlussmembran ausgestattet war.
Nach dem Konzentrieren wurde die Probe gegen geeigneten Puffer diafiltriert. Der Rückstand des Konzentrationsschrittes wurde gegen 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, pH 7,0 diafiltriert, bis die Leitfähigkeit des Rückstandes innerhalb von 5% der Leitfähigkeit der 0,15 M NaCl-, 20 mM NaPO&sub4;-, pH 7,0-Lösung lag.
Zusätzlich, um Präzipitate zu entfernen sowie bakterielles Endotoxin, das vorhanden sein könnte, wurde die konzentrierte diafiltrierte Protein-enthaltende Probe durch einen 0,1 um PosidyneTM-Filter (Pall, Inc., Cortland, NY) passiert. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration der Lösung und auf der Basis der gewünschten Konzentration in dem Endrohprodukt wurde die Lösung mit 0,15 M NaCl, 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0 auf die gewünschte Endkonzentration verdünnt. Eine abschließende aseptische Filtration durch einen 0,22 um-Filter wurde dann durchgeführt, wenn das endgültige Rohprodukt in einen pyrogenfreien Behälter zur Aufbewahrung (bei ungefähr 5ºC) zur weiteren Formulierung transferiert wurde.

B. Analyse

Eine Analyse wurde unter Verwendung von E. coli-abgeleitetem nativen KGF; C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)Q; ΔN15; Δ23 UND ΔN23/R(144)Q durchgeführt.

Konformelle Stabilität

Die Polypeptide wurden auf ihre Lagerstabilität, thermische Entfaltungsübergangstemperaturen (Tm) und die Stabilität in einem weiten Bereich von pH-Bedingungen hin verglichen.

Lagerstabilität

Natives KGF und C(1,15)S wurden bei 37ºC für ungefähr 24 h inkubiert und das verbleibende lösliche Protein bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Fig. 24 bis 26 zusammengefasst.
Fig. 25 vergleicht natives KGF und C(1,15)S, wenn bei 20 mM NaPO&sub4;, 0,15 M NaCl, pH 7,0 bei 37ºC für 27 h aufbewahrt. C(1,15)S zeigte eine wesentlich erhöhte Menge an löslichem Protein relativ zu nativem KGF.
Fig. 26 vergleicht natives KGF und C(1,15)S, gelagert in 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO&sub4;, 0,15 M NaCl, pH 7,0, wenn bei 37ºC gelagert. Hier ergab wiederum sich für C(1,15)S eine erhöhte Stabilität im Vergleich zu nativem KGF.
Fig. 27 vergleicht die Stabilität von nativem KGF, ΔN15 und C(1,15)S in PBS und in 50 mM NaPO&sub4;, 0,15 M NaCl, pH 7,0, wenn bei 37ºC für 18 h gelagert. Die Rückgewinnung löslichen Proteins ist erheblich höher in hohem Phosphatpuffer im Vergleich zu PBS (100 gegen 65%). ΔN15 (Daten werden nicht gezeigt) sowie C(1,15)S zeigten eine wesentlich erhöhte Stabilität im Vergleich zu nativem KGF. ΔN15 und C(1,15)S ergaben auch -100% Rückgewinnung in hohem Phosphat, wie aus dem Ergebnis von nativem KGF zu erwarten war.
Es wurde jedoch ein einzelnes vorläufiges vergleichendes Beispiel der Lagerstabilität zwischen C(1,15,40)S und C(40)S durchgeführt (welches durch die Basen 201 bis 684 von SEQ ID NO: 1 kodiert wird, außer dass Ser&sup4;&sup0; durch AGA codiert ist); und zwischen C(1,15,102) und C(102)S (welches durch die Basen 201 bis 684 von SEQ ID NO: 1 kodiert wird, außer dass Ser¹&sup0;² durch AGG kodiert wird). Die Ergebnisse (nicht gezeigt) deuten eine verringerte Stabilität an (d. h., weniger lösliches Protein, nachdem bei 37ºC gelagert wurde). Allerdings war die Menge an löslichem, korrekt gefaltetem C(1,15,40)S- Protein, das aus dem Kulturmedium aufgereinigt worden war, erheblich höher als die von C(40)S, was anzeigt, dass C(1,15,40)S tatsächlich stabiler sein kann und dass die Ergebnisse aus dem vergleichenden Beispiel nicht schlüssig sind. Die vorliegende Erfindung umfasst vorzugsweise einen KGF-Analogon, das andere Substitutionen als nur Cys&sup4;&sup0;, Cys¹&sup0;², Cys¹&sup0;&sup6; aufweist und mehr bevorzugt nimmt C(1,15,40)S, C(1,15,102)S und C(1,15,40,102,106) aus.
Die Fähigkeit von nativem KGF, C(1,15)S, ΔN23, C(1,15)S/ R(144)E, C(1,15)S/ R(144)Q und ΔN23/R(144)Q, eine Aggregation bei erhöhten Temperaturen zu verhindern wurde auch untersucht. Es wurden Proben in D-PBS hergestellt, die 0,5 mg/ml an Protein enthalten. 0,5 ml von jeder Probe wurden in 3 ml-Typ-1-Glasgefäße verteilt. Die Gefäße wurden dann mit Gummistopfen versiegelt und 13 mm Aluminiumsiegel wurden aufgeklemmt. Diese Gefäße wurden dann in einen 37ºC-Inkubator plaziert. In vorgegebenen Zeitintervallen wurden die Gefäße entnommen und auf den Verlust an löslichem Protein analysiert. Sichtbare Präzipitate wurden durch Zentrifugation von 250 ul von jeder Probe durch eine 0,22 um Spin-XTM-Filtereinheit (Costar, Cambridge, MA) entfernt. Lösliches Protein in den filtrierten Lösungen wurde anschließend durch Größenausschluss-HPLC analysiert. Die Menge an löslichem Protein wurde durch Integrieren der HPLC- Spitzenfläche bestimmt und das Auftragen des Ergebnisses als Funktion der Inkubationszeit bei 37ºC. Die Ergebnisse für natives KGF, C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)E und C(1,15)S/R(144)Q werden in Fig. 28 gezeigt. Die Ergebnisse für ΔN23 und ΔN23/R(144)Q werden nicht gezeigt.
Die Halbwertszeiten für den Verlust an löslichem monomeren Protein wurde dann aus diesen kinetischen Kurven abgeschätzt. Tabelle 1 zeigt die Halbwertszeit für diese Proteine für verbleibendes lösliches KGF nach der Lagerung bei 37ºC.

Tabelle 1

Halbwertszeit für den Verlust an löslichen monomeren Proteinen

Protein / t1/2 (Tag)
Natives KGF 0,6
ΔN23 1,1
C(1,15)S 1,2
C(1,15)S/R(144)Q 13,3
ΔN23/R144Q 22,3
C(1,15)S/R(144)E 38,0
Wie in Tabelle 1 oben zu sehen ist und in Fig. 28 aggregiert das native KGF am schnellsten mit einer Löslichkeitshalbwertszeit von 0,6 Tagen. C(1,15)S/R(144)Q, ΔN23/R(144)Q und C(1,15)S/R(144)E zeigten jeweils wesentliche Erhöhungen in der Löslichkeitshalbwertszeit von 13,3, 22,3 und 38 Tagen.

Thermales Entfalten

Thermales Entfalten wurde durch zirkulären Dichroismus (CD) bei 230 nm unter Verwendung eines J-720TM-Spektropolarimeters (Jasco, Inc., Easton, MD), ausgestattet mit einem PCT-343 Peltier-Typ-Temperaturkontrollsystem, beobachtet. Zur CD-Analyse wurden separate Proben, enthaltend 0,1 mg/ml des Polypeptids, das zu analysieren ist, in D-PBS (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) hergestellt. Für jede Probe wurden ungefähr 2,5 ml in eine Fluoreszenzzelle (Hellma Cells, Inc., Jamaica, NY) aus rechteckigem SuprasilTM-Quarz (Heraeus Quarzschmelze, GmbH, Hanau, Deutschland) mit einer 10 mm-Weglänge geladen. Die Zelle wurde dann in das Peltier-Typtemperaturkontrollsystem in dem Spektropolarimeter plaziert. Das thermale Entfalten wurde bei einer Geschwindigkeit von 50ºC/h durchgeführt. Änderung in der Ellipsität wurden bei 230 nm verfolgt, um die Entfaltung anzuzeigen. Die Tm von jeder Probe wurde durch dass Identifizieren einer Temperatur geschätzt, bei der 50% der Proteinmoleküle in der Lösung entfaltet waren (Biophysical Chemistry, Cantor und Schimmel (eds), W. H. Freeman and Co, San Francisco (1980). Die geschätzte Tm für jede der drei Proteine wird in Tabelle 2 aufgelistet.

Tabelle 2

Geschätzte Schmelztemperaturen

Protein / Tm (ºC)
natives KGF 54,0
ΔN15 55,0
C(1,15)S 55,0
ΔN23 56,0
C(1,15)S/R(144)Q 62,5
ΔN23/R144Q 63,0
C(1,15)S/R(144)E 63,5
Wie diese Ergebnisse zeigen, haben C(1,15)S und ΔN15 eine 1ºC-Erhöhung in der Tm im Vergleich zu nativem KGF. Das ΔN23 hat einen zusätzlichen Grad an Erhöhung in der Tm. Jedoch fügt die Substitution von R144Q zu C(1,15)S/R(144)Q oder ΔN23 eine mehr als 6ºC-Erhöhung in der Tm und mehr als 7ºC um Vergleich zu nativem KGF hinzu. Zudem ist C(1,15)S/R(144)E mehr als 9ºC stabiler als natives KGF.

pH

Die Säurestabilitäten von C(1,15)S/R(144)Q und C(1,15)S/R(144)E wurden auch mit denen des nativen KGF durch das Anpassen von D-PBS auf verschiedene pH-Werte verglichen durch das Hinzufügen konzentrierter HCl oder NaOH. Ungefähr 2,35 ml D- PBS bei verschiedenen pH-Werten wurden mit 100 ul an 2,45 mg/ml KGF-Protein in einer Quarzzelle vermischt. Diese Proben wurden thermisch bei einer Geschwindigkeit von 50ºC/h entfaltet und durch CD bei 230 nm verfolgt. Fig. 29 zeigt die Tm als eine Funktion des pH für natives KGF, C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)Q und C(1,15)S/R(144)E. In dem getesteten pH-Bereich haben die C(1,15)S, C(1,15)SIR(144)Q und C(1,15)S/R(144)E immer eine höhere Tm als das native KGF.

In vitro biologische Aktivität

Es wurde auch die in vitro mitogene Aktivität von C(1,15)!!8, ANIS, ΔN15, ΔN23, ΔN23/R(144)Q, C(1,15)S/R(144)Q und C(1,15)S/R(144)E als Funktion der Proteinkonzentration bestimmt und die halbmaximalen Konzentrationen durch Messung der [³H]-Thymidinaufnahme durch Balb/MK-Zellen (gemäß den Verfahren von Rubin et al. (1989) supra). Im Allgemeinen wurden die Konzentrationen von jedem der KGF-Analoga relativ zu einem bekannten standard-nativem KGF unter Verwendung eines in vitro biologischen Assays bestimmt. Jedes KGF-Analogon wurde dann verdünnt und auf biologische Aktivität hin unter Verwendung eines Balb/MK-mitogenen Assays untersucht. Die Proben wurden zuerst in einem Bioassaymedium verdünnt, das aus 50% angepasstem Eagle's MEM, 50% angepasstem F12, 5 ug/ml Transferrin, 5 ng/ml Natriumselenit, 0,0005% HSA und 0,005% Tween 20 besteht. Die KGF-Proben wurden dann in Falcon Primeria 96-iger Platten gegeben, die mit Balb/MK-Zellen ausgesät waren. Es wurde die Aufnahme von [³H]-Thymidin während der DNA-Synthese gemessen und in die native KGF- Eingangskonzentration durch Vergleich mit einer nativen KGF-Standardkurve umgerechnet. Die Ergebnisse werden in den Fig. 30 bis 35 dargestellt. Wie in den Figuren zu sehen ist, haben die in den Fig. 29 bis 34 beschriebenen KGF-Analoga eine mit nativem KGF vergleichbare Aktivität.

Beispiel 3: Herstellung in Säugetierzellkultur

Dieses Beispiel beschreibt die Expression, Isolierung und Charakterisierung von zwei biologisch aktiven rekombinanten KGF (rKGF)-Formen, die in einem Säugerexpressionssystem hergestellt werden.
Das menschliche KGF-Gen wurde durch PCR-Amplifikation von cDNA isoliert, die aus normalen dermalen menschlichen Fibroblastenzellen (Clontec, Inc., San Diego, CA) isoliert wurden. Nach dem Herstellen der cDNA durch reverse Transkriptase wurde eine PCR verwendet, um das KGF-Gen zu amplifizieren. OLIGO#25 und OLIGO#26 wurden verwendet, um das Gen aus der cDNA zu amplifizieren und OLIGO#27 und OLIGO#28 wurden verwendet, um HindIII- und BgIII-Restriktionsschnittstellen an die Fragmientenden durch eine zweite PCR-Amplifikation zu plazieren, wie in Fig. 1 dargestellt.
OLIGO#25 (SEQ ID NO: 69): 5'-CAATCTACAATTCACAGA-3'
OLIGO#26 (SEQ ID NO: 70): 5'-TTAAGTTATTGCCATAGG-3'
OLIGO#27 (SEQ ID NO: 71): 5'-AACAAAGCTTCTACAATTCACAGATAGGA-3'
OLIGO#28 (SEQ ID NO: 72): 5'-AACAAGATCTTAAGTTATTGCCATAGG-3'
Nach der Klonierung und DNA-Sequenzbestätigung wurde die KGF-Gen-DNA dann verwendet. Die Amplifikation wurde unter Verwendung von OLIGO#29 und OLIGO#30 durchgeführt.
OLIGO#29 (SEQ ID NO: 73):
5'-CGGTCTAGACCACCATGCACAAATGGATACTGACATGG-3'
OLIGO#30 (SEQ ID NO: 74):
5'-GCCGTCGACCTATTAAGTTATTGCCATAGGAAG-3'
Der Sense-Primer OLIGO#29 umfasste eine XbaI-Schnittstelle und eine Konsensus- Kozak-translationssequenz (5'-CCACC-3') stromaufwärts des Startcodons ATG. Der Antisense-Primer, OLIGO#30, umfasste eine Sall-Klonierungsstelle und ein zusätzliches Stoppcodon. Nach 18 Zyklen PCR-Amplifikation (30 s Denaturierung bei 94ºC, 40 s Doppelstrangausbildung bei 55ºC und 40 s Verlängerung bei 72ºC) wurde das Produkt mit XbaI und SalI verdaut und mit einer ähnlich verdauten DNA von pDSRα2 (gemäß den Verfahren von Bourdrel et al. (1993), Protein Exp. & Purif., 4: 130-140 und Lu et al. (1992), Arch. Biochem. Biophys., 298: 150-158) ligiert. Dieses resultierte in dem Plasmid KGF/pDSRα2, das das menschliche KGF-Gen zwischen den SV40 frühen Promotor und die α-FSH-Polyadenylierungssequenzen plazierte. Zwei Klone wurden gepickt und eine DNA-Sequenzanalyse bestätigte die Konstruktion des gewünschten Vektors.
Zwei Mikrogramm von KGF/pDSRα2-DNA wurden dann mit Pvul linearisiert. Chinesische Hamsterovar(CHO)-Zellen, die am Tag zuvor bei 0,8 · 10&sup6;-Zellen/60 mm pro Kulturschale ausgesät worden waren, wurden dann mit der behandelten DNA unter Verwendung einer Standard-Kalciumphosphat-Präzipitationsmethode (Bourdrel et al., supra) transfiziert. Zwei Wochen später wurden einzelne Kolonien gepickt und in Platten mit 24 Vertiefungen transferiert. Die konditionierten Medien wurden als Serum-frei betrachtet, wenn die Zellen die Konfluenz erreichten und Proben davon wurden durch Western Blotting unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchenantiserums analysiert, das gegen E. coli-exprimiertes menschliches KGF reaktiv ist.
Western Blots wurden durch Laufenlassen der Proben durch 12,5% (w/v) SDS- Polyacrylamidgele durchgeführt, gefolgt von Elektroblotten für 1 h bei 400 mA auf Nitrozellulosemembranen unter Verwendung eines halbtrockenen Transfergeräts (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA). 20 mM Tris, 150 mM Glycin, 20% Methanol dienten als Transferpuffer. Die Nitrozelluloselagen wurden durch Inkubation mit 10% normalem Ziegenserum in PBS blockiert. Kaninchenantiserum, das gegen E. coliabgeleitetes KGF gebildet wurde, wurde als primärer Antikörper verwendet. Zur Verwendung wurde es 1/10.000 in 1% normalem Ziegenserum in PBS verdünnt und mit den blockierten Nitrozelluloselagen für 12 h bei Raumtemperatur inkubiert, wonach der Überschuss an Antikörper durch drei 30-minütige Waschungen in PBS entfernt wurde. Die Nitrozellulosemembranen wurden dann in 100 mli % normalem Ziegenserum in PBS, das VectastainTM-biotinylierten Ziegen-anti-Kaninchen-IgG enthält (sekundärer Antikörper; Vector Labs, Burlingame, CA) für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach drei 10-minütigen Waschungen in PBS wurde eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur in einer 100 ml-Lösung von 1% normalem Ziegenserum durchgeführt, die Streptavidin und biotinylierte Peroxidase enthält, die gemäß den Anweisungen des Herstellers (Vector Labs) hergestellt worden waren. Nach drei Waschungen in PBS wurde KGF-kreuzreaktives Material durch Inkubation in einer Mischung von 60 ul von 30% (w/v) H&sub2;O&sub2; in 100 ml PBS und 50 mg 4-Chlornaphthol in 20 ml Methanol visualisiert. Die Reaktion wurde durch Abwaschen in Wasser nach 10 Minuten gestoppt.
Die Analyse der Blots zeigte, dass der KGF-spezifische Antikörper mit drei unterschiedlichen Proteinbanden assoziiert, wobei zwei nahe verwandt sind mit Molekulargewichten von ungefähr 25-29 kDa und eine mit einem geschätzten Molekulargewicht von ungefähr 17 kDa im Vergleich zu dem erwarteten Molekulargewicht von ungefähr 18,8 des reifen 163 Aminosäure-Proteins. Zusätzlich wurden einige hochexprimierende Klone, die mehr als 2,0 mg des rKGF pro Liter sezernierten, durch Westernanalyse beurteilt, ausgewählt und in Rollflaschen (gemäß dem Verfahren von Lu et al., supra) expandiert, um große Volumen serumfreies konditioniertes Medium für die Aufreinigung von KGF durch kationische Austauschchromatografie und Gelfiltration, wie unten gezeigt, zu generieren.
KGF aus 3 l serumfreien konditioniertem Medium wurde unter Auftrag des Mediums direkt auf eine Kationenaustauschsäule (5 · 24 cm), gepackt mit 450 ml Sulfoethyl einer Säule von S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia), die mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,5 vorequilibriert war, aufgereinigt. Nach Waschen mit fünf Säulenvolumina an 20 mM Natriumphosphat, 0,2 M NaCl, pH 7,5 wurde rKGF eluiert unter Verwendung eines 20fachen Säulenvolumens eines linearen Gradienten von 0,2 bis 1,0 M NaCl in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,5. 50 ml-Fraktionen wurden gesammelt unter kontinuierlicher A280-Beobachtung. KGF-Protein wurde durch Analyse von Proben jeder Fraktion durch SDS-PAGE nachgewiesen. SDS-PAGE wurde auf einem Elektrophoresesystem (Novex, San Diego, CA) durchgeführt unter Verwendung von vorgegossenen 14% Tris-Glycin "precast"-Gelen (gemäß dem Verfahren von Laemmli (1970), Nature, 227: 680-685). Die Proben wurden mit nicht-reduzierendem SDS-Probenpuffer vermischt, ohne Erhitzen vor der Beladung. Die Proteine wurden entweder durch Coomassieblau oder Silberfärbung nachgewiesen. Von zwei spät eluierenden Spitzen wurden festgestellt, das sie Proteinbanden enthalten, die mit den 25-29 kDa- und 17 kDa-Banden, die durch Westernblots zu sehen waren, korrespondierten. Die Fraktionen, die jede dieser Spitzen enthalten, wurden separat auf ein Volumen von weniger als 1,0 ml aufkonzentriert und einer Gelfiltration ausgesetzt.
Die Gelfiltrationen verwendeten Säulen mit Superdex-75TM-Harz (HR 10/30, Pharmacia), der mit PBS, pH 7,2 equilibriert worden war und mit den folgenden bekannten Molekulargewichtsstandards kalibriert waren (BioRad, San Francisco, CA): Thyroglobulin (670 kDa), g-Globulin (158 kDa), Ovalbumin (44 kDa), Myoglobin (17 kDa) und Vitamin B-12 (1,4 kDa). Diese Aufreinigungsschritte resultierten in einer ungefähr 2000-fachen Aufreinigung von rKGF, das spezifisch ein 17 kDa- und ein 30 kDa-Material enthielt, wie durch Silberfärbung abgeschätzt.
Im Falle des höher molekulargewichtigen Materials wurde rKGF als ein großes symmetrisches Peak (durch A280) eluiert, welches KGF-a genannt wurde. Nach SDS-PAGE- Analyse einer kleineren Menge dieses Materials, 3 ug/Bahn gegen 6 ug/Bahn, wurden zwei Banden mit einer 1-2 kDa-Molekulargewichtsdifferenz aufgelöst. In dem Fall des geringer molekulargewichtigen Materials, das KGF-b bezeichnet wurde, resultierte eine Gelfiltration in einer Proteinpräparation mit der erwarteten Mobilität. Für beide, KGF-a und KGF-b, betrug die Gesamtausbeute nach der Aufreinigung ungefähr 30-40%.
Es wurden auch Aminosäuresequenzen von KGF-a und KGF-b analysiert. Diese Analysen wurden auf einem automatischen Sequenzierer (Modell 477A oder 470A, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA), der mit einem Modell 120A online PTH-Aminosäureanalysator und einem Modell 900A-Datensammelsystem (gemäß dem Verfahren von Lu et al. (1991), J. Biol. Chem., 266: 8102-8107) ausgestattet war, durchgeführt. Edman- Sequenzanalyse von KGF-a zeigte eine größere N-terminale Sequenz von X&sub1;-N-D-M-T- P-E-Q-M-A-T-N-V-X&sub2;-X&sub3;-S- [SEQ ID NO: 75]. Eine kleinere Sequenz, angefangen von der dritten N-terminalen Aminosäure aus, Asparaginsäure, war auch in 1,6% des gesamten sequenzierbaren Proteins vorhanden. X&sub1;, X&sub2; und X&sub3; waren nicht bezeichnet bedingt durch die Abwesenheit des Phenylthiohydantoinyl(PHT)-Aminosäuresignals während der Sequenzanalyse. Eine N-terminale Aminosäuresequenz von KGF, die aus der cDNA-Sequenz vorausgesagt wurde, zeigt, dass X&sub1; und X&sub3; Cysreste sind und X&sub2; Asparagin ist. Die Abwesenheit von X&sub1; und X&sub3; deutet an, dass diese Cysteine Disulfidbrücken bilden könnten. Auf der Basis der Konsensus-N-gebundenen Glycosylierungssequenz Asn-X-Ser zeigt die Abwesenheit des vorausgesagten Asn-Rests, der mit X&sub2; korrespondiert, dass es eine potenzielle N-gebundene Glycosylierungsstelle ist.
Interessanterweise zeigte die N-terminale Sequenzanalyse von KGF-b eine N-terminale Aminosäuresequenz von S-Y-D-Y-M-E-G-G-D-I-R-V- (SEQ ID NO: 76), was anzeigt, dass es eine N-terminal trunkierte Form des KGF ist, die proteolytisch an der Arg²³-Ser²&sup4;-Peptidbindung gespalten wurde.
Um aufgereinigtes KGF-a und KGF-b weiterhin zu charakterisieren, wurde das Protein Glycosidasen ausgesetzt (Neuraminidase, O-Glycanase und/oder N-Glycanase) unter Verwendung bekannter Techniken (Sasaki et al. (1987), J. Biol. Chem., 262: 12059-12076; Takeuchi et al. (1988), J. Biol. Chem., 263: 3657-3663; Zsebo et al. (1990), Cell, 63: 195-201). Diese Ergebnisse deuten an, dass KGF-a N- und O-gebundene Kohlenhydrate enthält, obwohl die geringer molekuiargewichtige Form von KGF-a wahrscheinlich nur N-gebundenen Zucker enthält. Die Glycosidase-Behandlung bewirkte keine Molekulargewichtsverringerung für KGF-b, was anzeigt, dass das Molekül nicht glycosyliert ist.
Das Glycosylierungsmuster von KGF-a wurde des Weiteren durch Massenspelctroskopie der oben beschriebenen Endoproteinase Glu-C-generierten Peptide charakterisiert. Die Bestimmung der Kohlenhydratstruktur von Glycopeptiden durch das schrittweise Öffnungsverfahren der massenspektroskopischen Analyse wurde erfolgreich auf andere Proteine angewendet (Huddleston et al. (1993), Anal. Chem., 65: 877-884; Carr et al. (1993), Prot. Sci., 2: 183-196). Wie durch die Isolierung eines nicht glycosylierten Peptids bestätigt, scheint Th62 teilweise glycosyliert zu sein. Eine ähnliche massenspektroskopische Analyse von Asn¹&sup4; suggeriert eine Mikroheterogenität in der Glycosylierung mit bi-, tri- und tetra-antennenartigen Strukturen mit variierenden Graden der Sialylisierung.
Tabelle 3A fasst die KGF-Konzentration zur Stimulation der [³H]-Thymidinaufnahme von Keratinozyten bei der halbmaximalen Geschwindigkeit zusammen (gemäß dem Verfahren von Rubin et al. (1989), supra). Die Wechselwirkung mit dem KGF-Rezeptor wurde unter Verwendung isolierter KGF-Rezeptormembranpräparationen untersucht, die aus Balb/MK-mausepidermalen Keratinozyten hergestellt wurden (durch das von Massague beschriebene Verfahren (1983), J Biol. Chem., 258: 13614-13620). Speziell wurden verschiedene Formen von KGF mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, enthaltend 0,2% Rinderserumalbumin, auf einen Konzentrationsbereich von 0,8 ng bis 100 ng pro 50 ul verdünnt. Diese wurden einzeln mit der Membranpräparation (75 ng/ml)) und ¹²&sup5;I-markiertem E. coli-abgeleitetem KGF (1,5 ng) inkubiert. Es wurden Rezeptorbindungs- und Kompetitionsexperimente bei 4ºC für 16 h durchgeführt, nach welchem Zeitraum Proben genommen wurden, zentrifugiert und zweimal mit dem oben genannten Verdünnungspuffer gewaschen wurde, um nicht gebundenes und nicht spezifisch gebundenes markiertes KGF zu entfernen.
Die Proben wurden dann auf die verbleibende Radioaktivität hin gezählt. Kompetitionskurven für die Rezeptorbindung zwischen KGF-Proben und markiertem KGF wurden konstruiert durch das Auftragen der Prozent-Nichtkompetition gegen die Konzentrationen von jeder KGF-Probe. Die Tabelle 3B fasst die KGF-Konzentration zusammen, die benötigt wird, um eine 60%-Nichtkompetition gegen das markierte E. coli-abgeleitete KGF zu erzielen, wie ausgedrückt als ng/ml.

Tabelle 3A

KGF-Konzentration zur Stimulation der [³H]-Thymidinaufnahme von Keratinozyten bei halbmaximaler Geschwindigkeit

Formen / ng/ml
E. coli-KGF 10
KGF-a 30
KGF-b 30

Tabelle 3B

KGF-Konzentration zur Kompetition der Rezeptorbindung mit I¹²&sup5;-markiertem KGF bei einer 60%-Nichtkompetitionsgeschwindigkeit

Formen / ng/ml
E. coli-KGF 65,8
KGF-a 93,5
KGF-b 89,1
Wie in Tabelle 3A gezeigt wird, stimulieren KGF-a und KGF-b eine vergleichbare [³H]- Thymidinaufnahme mit einer halbmaximalen Geschwindigkeit, die bei ungefähr 30 ng/ml von jedem Analogon stimuliert wird. Somit reduziert die Trunkierung nicht die biologische Aktivität des Moleküls.
Jedoch haben beide Analoga eine ungefähr 3-fach geringere Aktivität als das E. coli-abgeleitete KGF in Gesamtlänge. Wie in Tabelle 3B gezeigt, bedeutet die Radiorezeptorassaynichtkompetition, dass E. coli-abgeleitetes KGF, KGF-a und KGF-b eine ähnliche Rezeptorbindungsaktivität aufweisen.

Beispiel 4: In vivo biologischer Assay von KGF-Polypeptiden, die in E. coli- und Säugerzellkulturen hergestellt sind

Es wurde gezeigt, dass eine einzelne subkutane Dosis von KGF in einer dosisabhängigen Erhöhung in Serumcholesterin in Mäusen innerhalb von 24 Stunden resultiert. Natives KGF, KGF-a, C(1,15)S, ΔN15 und ΔN23 wurden auch auf die Fähigkeit, die Serumcholesterinmenge in einer dosisabhängigen Weise zu erhöhen untersucht.
Jede Behandlungsgruppe enthielt fünf weibliche Balb/c-Mäuse (18-20 g), die von CRL erhalten wurden. Das Protein wurde mit 0,9%iger Salzlösung verdünnt, um ein endgültiges Injektionsvolumen von 100 pl/Maus zu erzielen. Jeder Maus wurde eine einzelne subkutane Injektion mit den folgenden Dosierungen verabreicht:
Vierundzwanzig Stunden nach der Injektion wurden die Mäuse geopfert und durch Herzpunktion ausgeblutet. Die Blutproben wurden für die Bestimmung von Serumcholesterin prozessiert.
Wie in Fig. 35 gezeigt, wurde festgestellt, dass jedes getestete KGF-Analogon Serumcholesterin in einer dosisabhängigen Weise erhöht. Auch gab es keine augenscheinliche Differenz in der Bioaktivität zwischen den untersuchten KGF-Analoga.

In vivo-Modell für Diabetes

Es wurden chemisch induzierte Diabetes mellitus-Modelle in verschiedenen Tierspezies im klassischen Sinne verwendet, um die Krankheit und seine Behandlung zu untersuchen. Streptozotocin induziert Diabetes in der Maus, Ratte, Hamster, Hund und dem Affen, obwohl Studien in Ratten und Mäuse am häufigsten verwendet werden. Junod et al. Proc. Soc. Exp. Pio. Med. 126: 210&supmin;²&sup0;5 (1967); Rerup, Pharm. Rev. 22: 485-518 (1970); Rossini et al., P.N.A.S. 74: 2485-2489 (1977); und Ar'Rajab und Ahren, Pancreas 8;50-57 (1993). In Ratten induzieren Dosierungen von Streptozotocin von 45 bis 70 mg/kg als einzelne intravenöse Dosierung eine stabile Krankheit. Dosierungen unter 45 mg/kg induzieren einen transienten Krankheitszustand, der umkehrbar ist. Innerhalb eines Tages der Streptozotocinjektion wird ein hyperglycämischer Zustand induziert. Blutinsulinmengen verbleiben im Wesentlichen unverändert im Vergleich zu normalen Ratten; allerdings ist der Gesamtanteil an Insulin und C-Peptid in dem Pankreas erheblich verringert. Ratten manifestieren die klassischen Zeichen und Symptome von Diabetes in Menschen: erhöhte Blutglucosemengen (Hyperglycämie), Glucose im Urin (Glucosurie), erhöhter Durst (Polydipsie), vermehrtes Urinieren (Polyurie), erhöhter Appetit (Hyperphagie).
Die in dieser Offenbarung beschriebenen Studien wurden mit dem Streptozotocin-induziertem Diabetesmodell in Sprague-Dawley-Ratten ausgeführt. Männliche Ratten, die 200-260 Gramm bei Studienbeginn wogen, wurden verwendet. Diabetes wurde durch eine einzelne intravenöse Injektion von Streptotozotocin bei 50 mg Streptozotocin in Natriumcitratpuffer pro kg Körpergewicht induziert. Nicht diabetische Kontrollratten erhielten eine einzelne intravenöse Injektion des Natriumcitratpuffers für Kontrollzwecke. KGF wurde täglich als subkutane Injektion verabreicht. Die KGF-Dosis betrug abhängig von dem jeweiligen Experiment 3 oder 5 mg/kg/Tag. In dem ersten Experiment wurde die KGF-Therapie zwei Tage bevor der Diabetes induziert wurde begonnen und nach der Induktion von Diabetes für insgesamt acht Injektionen fortgesetzt. In den zweiten und dritten Experimenten wurde die subkutan verabreichte KGF-Therapie einen Tag nach der Induktion von Diabetes mit Streptozotocin begonnen. In dem vierten Experiment wurde eine 7 Tage dauernde KGF-Therapie 7 Tage nach Streptozotocinbehandlung begonnen und die Tiere wurden dann für weitere 12 Wochen begleitet. In allen Experimenten, außer dem vierten Experiment, wurden Blutglucosemengen, Uringlucosemengen und Urinvolumen als Endpunkte zur Analyse verwendet. Zusätzlich wurde die Wasseraufnahme, Urin-C-Peptidmengen oder Gesamtpankreasinsulin und C-Peptidgehalt in einigen Experimenten gemessen. In dem vierten Experiment war der einzig untersuchte Endpunkt die Blutglucose. Da ein großer Teil an Insulin aus der Zirkulation durch die Leber entfernt wird, reflektiert die Messung der peripheren Insulinkonzentrationen eher posthepatische Metabolismusvorgänge als die Insulinsekretion aus dem Pankreas. Daher werden Messungen des C-Peptids oft durchgeführt und als peripherer Marker der Insulinsekretion verwendet. C-Peptid wird bei der Prozessierung von Pro-Insulin zu Insulin hergestellt. Insulin und C-Peptid werden aus Betazellen in äquimolaren Mengen sezerniert und nur eine kleine Menge an C-Peptid wird durch die Leber extrahiert.
Diese Studie untersuchte die Wirkung von rKGF auf Streptozotocin-induzierten Diabetes in Sprague-Drawley-Ratten. Am Tage 0 wurden Gruppen von Ratten entweder 45 oder 50 mg/kg Streptozotocin (STZ) ausgesetzt. Diesen Behandlungen nachfolgendl wurden nicht-fastende Blutglucosemengen täglich untersucht, um die Schwere der Inselzellenverletzung zu beurteilen. Am Tag 5 wurden STZ-behandelten Tiere in eine der zwei Gruppen (20/Gruppe), abhängig von der Schwere der Hyperglykämie, plaziert. Der Trennpunkt wurde bei einer Blutglucosemenge von 300 mg/dl angesetzt. Eine Gruppe nicht-STZ-behandelter Tiere diente als Kontrolle. Am Tag 7 wurden 10 Tieren aus jeder hyperglycämischen Gruppe ΔN23 (3 mg/kg/Tag) oder PBS durch subkutane Injektion für 7 Tage verabreicht. Die Blutglucosemengen wurden dann täglich untersucht, jeden anderen Tag oder wöchentlich und werden in Fig. 51 gezeigt. Es ist bemerkenswert, dass STZ-behandelte Tiere aus beiden Gruppen, die ΔN23 erhielten, eine wesentliche Verringerung der Blutglucose während dem ΔN23-Dosierungszeitraum aufwiesen. Wichtig ist, dass sich der Blutglucoseabfall, der bei den STZ-behandelten Tieren aus der < 300 mg/dl-Ausgangsblutglucosegruppe vorkam bei ungefähr 150 mg/dl stabilisierte, während der Blutglucoseabfall, der in der > 300 mg/dl-Ausgangsblutglucosegruppe nur transient war. Es wird betont, dass die Tagesskala nicht linear ist.

Claims

1. Ein Polypeptidanalogon des als "KGF" bezeichneten nativen Keratinocytenwachstumsfaktors, wobei der native KGF mit der folgenden Sequenz korrespondiert

mit oder ohne einer Signalsequenz, wobei das Analogon die Aminosäuresequenz von KGF umfasst, die eine Deletion, Substitution und/oder Insertion von einer oder mehreren der Aminosäuren 1-24 umfasst, wobei der Cysteinrest in Aminosäureposition 1 und der Cysteinrest in Aminosäureposition 15 jeweils entweder deletiert oder mit einer anderen Aminosäure substituiert sind, das optional zusätzlich einen N-terminalen Methioninrest aufweist und/oder zusätzlich eine Ladungswechsel- Substitution an einer Aminosäureposition ausgewählt aus Arg (41), Glu (43), Cys (55), Cys (95), Asn (137), Glu (138), Cys (139), Arg (144), Cys (147), Glu (152), Cys (153) oder Thr (154) umfasst, oder im Falle von Δ23-KGF eine Ladungswechselmodifikation von His (116) aufweist, oder im Falle von nativem KGF, bei dem beide, Cys (1) und Cys (15) durch Ser substituiert sind, optional auch Cys (40) oder Cys (102) oder beide, Cys (102) und Cys (106), durch Ser substituiert sind, mit der Proviso, dass das Analogon nicht das Keratinocytenwachstumsfaktorprotein, bestehend aus den Aminosäuren 24-163, ist.

2. Das Analogon gemäß Anspruch 1, wobei der Cysteinrest in Aminosäureposition 1 und der Cysteinrest in Aminosäureposition 15 deletiert sind.

3. Das Analogon gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäuren 1-24 deletiert sind.

4. Das Analogon gemäß Anspruch 1, wobei der Cysteinrest in Aminosäureposition 1 deletiert ist und der Cysteinrest in Aminosäureposition 15 mit einer anderen Aminosäure substituiert ist.

5. Das Analogon gemäß Anspruch 1, wobei mindestens eine Aminosäure der Aminosäuren 1 bis 24 deletiert ist und der Cysteinrest in Aminosäureposition 15 mit einer anderen Aminosäure substituiert ist.

6. Das Analogon gemäß Anspruch 1, wobei der Cysteinrest in Aminosäureposition 1 und der Cysteinrest in Aminosäureposition 15 mit einer anderen Aminosäure substituiert sind.

7. Das Analogon gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei ein Aminosäurerest, ausgewählt aus Alanin, Leucin oder Serin für einen Cysteinrest substituiert ist.

8. Das Analogon gemäß Anspruch 7, wobei ein Serinrest für einen Cysteinrest substituiert ist.

9. Das Analogon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend eine Ladungswechsel-Substitution an einer Aminosäureposition, ausgewählt aus dem Argininrest in der Aminosäureposition 41, den Glutaminrest in der Aminosäureposition 43, dem Lysinrest in der Aminosäureposition 55, dem Lysinrest an der Aminosäureposition 95, dem Asparaginrest in der Aminosäureposition 137, dem Glutaminrest in der Aminosäureposition 138, dem Lysinrest in der Aminosäureposition 139, dem Argininrest in der Aminosäureposition 144, dem Lysinrest in der Aminosäureposition 147, dem Glutaminrest in der Aminosäureposition 152, dem Lysinrest in der Aminosäureposition 153 oder dem Threoninrest in der Aminosäureposition 154.

10. Das Analogon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend eine Ladungs- Wechsel-Modifikation des Histidinrests in der Aminosäureposition 116.

11. Das Analogon gemäß Anspruch 10, wobei der Histidinrest durch einen Glycinrest ersetzt wird.

12. Das Analogon gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die Aminosäuren 1- 24 deletiert sind.

13. Das Analogon gemäß Anspruch 1, wobei das Analogon C(1,15)S, C(1,15,40)S, C(1,15,102)S, C(1,15,102,106)S, ΔN15; ΔN16; ΔN17; ΔN18; ΔN19; ΔN20; ΔN21; ΔN22; ΔN23; ΔN24; ΔN3/C(15)S, ΔN3(C(15)-; ΔN8/C(15)S, ΔN8/C(15)- und ΔN23/H(116)G ist, welches zu den Aminosäuren 23-163 korrespondiert, wobei der Histidinrest in Aminosäureposition 116 mit einem Glycin substituiert ist.

14. Das Analogon gemäß Anspruch 13, wobei besagtes Analogon ΔN16 ist.

15. Das Analogon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei besagtes Analogon eine Signalsequenz oder einen aminoterminalen Methioninrest aufweist.

16. Das Analogon gemäß Anspruch 15, wobei besagte Signalsequenz die Aminosäuren 1-31 von Fig. 1 ist.

17. Das Analogon gemäß einem der Ansprüche 1-16, wobei besagtes Analogon kovalent an Polyethylenglycol oder ein verwandtes wasserlösliches organisches Polymer gebunden ist.

18. Das Analogon gemäß Anspruch 17, wobei das Analogon an Polyethylenglycol gebunden ist.

19. Ein Analogon gemäß Anspruch 1, wobei besagtes Analogon ΔN23 ist, das kovalent an Polyethylenglycol oder verwandte wasserlösliche organische Polymere gebunden ist.

20. Das Analogon gemäß Anspruch 19, wobei das Analogon an Polyethylenglycol gebunden ist.

21. Das Analogon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei besagtes Analogon lyophilisiert ist.

22. Eine pharmazeutische Formulierung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Analogons von KGF gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

23. Ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das ein Analogon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 kodiert.

24. Ein biologisch funktioneller Vektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 23.

25. Eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 23 oder einen biologisch funktionellen Vektor gemäß Anspruch 24.

26. Eine prokaryontische Wirtszelle gemäß Anspruch 25, die E. coli ist.

27. Eine eukaryontische Wirtszelle gemäß Anspruch 25, die eine Säugetierzelle ist, vorzugsweise eine Chinesische Hamsterovarzelle.

28. Ein Verfahren für die Herstellung eines Analogons von KGF, wobei das Verfahren das Wachsen einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 25 bis 27 unter geeigneten Nährstoffbedingungen in einer Weise umfasst, die die Expression des kodierten Analogons erlaubt und das Isolieren des so hergestellten Analogons.

29. Eine Verwendung einer wirksamen Menge des Analogons von KGF gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulation der Produktion von Nicht-Fibroblastenepithelzellen.

30. Die Verwendung gemäß Anspruch 29, wobei besagte Nicht-Fibroblastenepithelzellen ausgewählt sind aus adnexalen Strukturen, Leberzellen, Mukosaepithel in den respiratorischen und gastrointestinalen Trakten, Korneazellen oder tympanische Epithelzellen.

31. Eine Verwendung einer wirksamen Menge des Analogons von KGF gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 für die Herstellung eines Medikaments zur Stimulation der Produktion von Nicht-Fibroblastenepithelzellen in einem Patienten für die Verhinderung oder Behandlung eines Zustands, wobei besagter Zustand ausgewählt ist aus Verbrennungen und anderen Verletzungen teilweiser oder vollständiger Dicke; Epidermolyse bullosa; Chemotherapie-induzierte Alopecia; männliche Musterglatzköpfigkeit; progressiver Verlust der Haare in Männern und Frauen; Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüre; entzündliche Darmkrankheiten wie Crohn's Krankheit und geschwürartiger Darmkatarrh; Darmtoxizität bei Bestrahlungs- und chemotherapeutischen Behandlungen; hyaline Membranerkrankung; akuter oder chronischer Lungenschaden; Leberzirrhose; fulminantes Leberversagen; akute virale Hepatitis; toxische Angriffe auf die Leber; Korneaabrieb; progressive Mundschleimhauterkrankung oder Trommelfellschaden.

32. Ein In-vitro-Verfahren zur Stimulierung der Produktion von Nicht-Fibroblastenepithelzellen, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Analogons von KGF gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung von Anspruch 22.

33. Die Verwendung von Anspruch 29, wobei die Nicht-Fibroblastenepithelzellen in einem Patienten, der dessen bedarf, stimuliert werden.

34. Das Verfahren von Anspruch 32, wobei besagte Nicht-Fibroblastenepithelzellen ausgewählt sind aus adnexalen Strukturen, Leberzellen, Mukosaepithel in den respiratorischen und gastrointestinalen Trakten, Korneazellen oder tympanischen Epithelzellen.

35. Verwendung einer wirksamen Menge von ΔN23 für die Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung der Produktion von Nicht-Fibroblastenepithelzellen in einem Patienten, der dessen bedarf, wobei die Nicht-Fibroblastenepithelzellen ausgewählt sind aus adnexalen Strukturen, Leberzellen, Mukosaepithel in dem respiratorischen Trakt oder tympanische Epithelzellen.

36. Ein In-vitro-Verfahren zur Stimulation der Produktion von Nicht-Fibroblastenepithelzellen, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge von ΔN23 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung davon, wobei die Nicht-Fibroblastenepithelzellen ausgewählt sind aus adnexalen Strukturen, Leberzellen, Mukosaepithel aus dem Atemwegstrakt oder tympanischen Epithelzellen.

37. Verwendung einer wirksamen Menge von ΔN23 für die Herstellung eines Medikaments zur Stimulation der Produktion von Nicht-Fibroblastenepithelzellen in einem Patienten für die Verhinderung oder Behandlung eines Zustands, wobei besagter Zustand ausgewählt ist aus Verbrennungen und anderen Verletzungen teilweiser oder vollständiger Dicke; Epidermolyse bullosa; Chemotherapie-induzierte Alopecia; männliche Musterglatzköpfigkeit; progressiver Verlust der Haare in Männern und Frauen; Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüre; entzündliche Darmkrankheiten wie Crohn's Krankheit und geschwürartiger Darmkatarrh; Darmtoxizität bei Bestrahlungs- und chemotherapeutischen Behandlungen; hyaline Membranerkrankung; akuter oder chronischer Lungenschaden; Leberzirrhose; fulminantes Leberversagen; akute virale Hepatitis; toxische Angriffe auf die Leber; Korneaabrieb; progressive Mundschleimhauterkrankung oder Trommelfellschaden.

38. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 29, 30, 31, 33, 35 und 37, wobei besagtes Analogon von KGF mittels IV, IT, IM, SC oder IP verabreicht wird.

39. Ein Kit, umfassend ein Analogon von KGF gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 oder eine pharmazeutische Formulierung von Anspruch 22.